WO2022202312A1 - 不溶性粒子、標的抗原測定用又は標的抗体測定用キット、標的抗原又は標的抗体の測定方法及び不溶性粒子を製造する方法 - Google Patents

不溶性粒子、標的抗原測定用又は標的抗体測定用キット、標的抗原又は標的抗体の測定方法及び不溶性粒子を製造する方法 Download PDF

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康幸 池永
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to insoluble particles, kits for measuring target antigens or target antibodies, methods for measuring target antigens or target antibodies, and methods for producing insoluble particles.
  • a method for measuring a target antigen using an immune reaction there is a method using a granular carrier such as latex (for example, Patent Document 1).
  • Insoluble particles having a particulate carrier and an antibody recognizing a target antigen supported by the particulate carrier generate an antigen-antibody reaction when the target antigen is present. Then, due to their specificity and affinity, they bridge the target antigens and bind to each other, causing the insoluble particles to aggregate. The presence or absence and abundance of the target antigen are determined by the presence or absence of the resulting aggregates and the degree of aggregation.
  • the presence and abundance of the target antibody is determined.
  • the ⁇ -position amino group of the N-terminal amino acid residue of the antibody or antigen can be the amino group that forms a covalent bond with the carboxyl group on the surface of the particulate carrier.
  • the antigen-binding site of the antibody conforms to the N-terminal side. If an antibody is supported on a particulate carrier via the ⁇ -amino group of the terminal amino acid residue, the reaction between the antigen-binding site and the antigen may be sterically inhibited.
  • steric hindrance may occur when the density of the antigen supported on the granular carrier is high. may be less reactive with the target antibody.
  • the amino group of the side chain (4-aminobutyl group) of the lysine residue can also be an amino group that reacts with the carboxyl group on the surface of the particulate carrier.
  • carboxyl A problem arises that the position of the amino group forming a covalent bond with the group cannot be controlled.
  • the present inventors selectively protected the amino group of the N-terminal amino acid residue of a protein or peptide, and subjected the protected protein or peptide to a reaction with a granular carrier, whereby the protein or peptide and the granular carrier Based on the idea that the binding position can be controlled, the present invention was completed. In addition, it is believed that the insoluble particles obtained by such a method do not cause the problem of steric hindrance when reacting with the target substance.
  • One aspect of the present invention is an insoluble particle containing a granular carrier and a protein or peptide supported by the granular carrier, wherein the ⁇ -amino group of at least one N-terminal amino acid residue of the protein or peptide is an insoluble particle in which the nucleophilic and/or electron-donating properties of the ⁇ -amino group are protected.
  • Another aspect of the present invention is a target antigen measurement kit or target antibody measurement kit containing the insoluble particles.
  • kits for target antigen measurement or target antibody measurement comprising a granular carrier for preparing the insoluble particles and a protein or peptide.
  • Another aspect of the present invention is a method for measuring a target antigen using the insoluble particles.
  • Another aspect of the present invention is a method for measuring a target antibody using the insoluble particles.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing the insoluble particles.
  • the position of the amino group of the protein or peptide that forms a covalent bond with the carboxy group of the granular carrier can be controlled.
  • FIG. 1 shows a graph representing the results of Example 1.
  • An insoluble particle contains a granular carrier and a protein or peptide supported by the granular carrier, and the ⁇ -amino group of at least one N-terminal amino acid residue of the protein or peptide is the The ⁇ -amino group is protected so as to lose its nucleophilicity and/or electron-donating properties.
  • Granular carriers include particles such as latex particles, ceramic particles, alumina particles, silica-alumina particles, and carbon black particles. Latex particles are preferred among these particles. Examples of latex materials include polystyrene and divinylbenzene, and polystyrene is preferred.
  • the average particle size of the granular carrier can be from 0.05 to 5 ⁇ m.
  • the average particle size of the granular carrier can be measured by a dynamic light scattering method. As used herein, the term "average particle size" refers to the particle size when the integrated value from the small particle size reaches 50% of the total in the volume-based particle size distribution curve obtained by the dynamic light scattering method. (median diameter).
  • a protein or peptide is a polymer compound in which a plurality of amino acids are linked in a chain.
  • a substance having more than about 50 constituent amino acids is understood as a protein, and a substance having 50 or less amino acids is understood as a peptide. be.
  • Amino acids constituting proteins or peptides include alanine (Ala), cysteine (Cys), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), phenylalanine (Phe), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), Lysine (Lys), Leucine (Leu), Methionine (Met), Asparagine (Asn), Proline (Pro), Glutamine (Gln), Arginine (Arg), Serine (Ser), Threonine (Thr), Valine (Val), There are 20 types of tryptophan (Trp) and tyrosine (Tyr). Amino acids may be L-amino acids or D-amino acids.
  • the protein or peptide carried on the granular carrier is not particularly limited as long as it can specifically bind to the target substance to be detected by the insoluble particles.
  • insoluble particles containing particulate carriers carrying antigens, antigen fragments containing epitopes, or haptens can be used as reagents for detecting antibodies or antibody fragments.
  • insoluble particles containing particulate carriers carrying antibodies or antibody fragments having a paratope can be used as reagents for detecting antigens, antigen fragments containing epitopes, or haptens.
  • Antigens supported on granular carriers or antigens recognized by antibodies supported on granular carriers include, for example, CRP (C-reactive protein), prostate-specific antigen, ferritin, ⁇ -2 microglobulin, myoglobin, hemoglobin, albumin, Protein markers such as creatinine, immunoglobulins such as IgG, IgE, IgA, and IgM, various tumor markers, lipoproteins such as LDL, HDL, and TG, influenza A virus, influenza B virus, respiratory syncytial virus (RSV), rhinovirus , rotavirus, norovirus, adenovirus, astrovirus, HAV, HBs, HCV, HIV, viral antigens such as EBV, Chlamydia trachomatis, Streptococcus, Pertussis, Helicobacter pylori, Leptospira, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, Bacterial antigens such as Borrelia,
  • An epitope is a specific structural unit of an antigen that is recognized and bound by an antibody, and a hapten is a substance that has the ability to bind to an antibody but does not show immunogenicity by itself.
  • a paratope refers to a portion of an antibody that recognizes and binds to an antigen.
  • the antibody is not particularly limited as long as it can specifically bind to the antigen, and can be IgG, for example.
  • IgG is composed of two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains).
  • a heavy chain is composed of a variable region (VH), a first constant region (CH1), a second constant region (CH2) and a third constant region (CH3) in order from the N-terminus.
  • a light chain is composed of a variable region (VL) and a constant region (CL) in order from the N-terminus.
  • the portion composed of CH2 and CH3 is the Fc region.
  • One heavy chain and one light chain are linked by a disulfide bond between a cysteine residue present in CH1 and a cysteine residue present in CL.
  • Antibodies may be fragments of IgG in which heavy chains are present, may be rIgG (reduced IgG) composed of one heavy chain and one light chain, It may be a fragment composed of a single heavy chain.
  • the manner in which the protein or peptide and the particulate carrier are supported is a covalent bond, such as an amide bond and a disulfide bond.
  • An amide bond is preferably formed between the amino group of the side chain of the lysine residue and the carboxyl group on the surface of the particulate carrier when the protein or peptide has a lysine residue.
  • the ⁇ -amino group of at least one N-terminal amino acid residue of the protein or peptide is protected so that the nucleophilicity and/or electron-donating properties of the ⁇ -amino group are lost. Since the ⁇ -amino group of the N-terminal amino acid residue is nucleophilic and/or electron-donating, that is, has high reactivity, ⁇ - An amino group can be a reaction point. Therefore, it is possible to obtain insoluble particles in which a protein or peptide is supported on a particulate carrier via the ⁇ -amino group of its N-terminal amino acid residue.
  • the ⁇ -amino group of the N-terminal amino acid residue is protected so that the nucleophilicity and/or electron-donating property of the ⁇ -amino group is lost. does not act as a reaction point. Therefore, insoluble particles are obtained in which the protein or peptide is carried on the granular carrier at desired positions.
  • the second amino acid residue from the N-terminus of the protein or peptide is an amino acid other than proline, i.e., alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, glutamine, It can be an amino acid selected from the group consisting of arginine, serine, threonine, valine, tryptophan and tyrosine.
  • the ⁇ -amino group of at least one N-terminal amino acid residue may be protected, but the target substance and From the viewpoint of high binding efficiency of , it is preferred that the ⁇ -amino groups of all N-terminal amino acid residues are protected.
  • the protein supported on the particulate carrier is IgG
  • IgG has four N-terminal amino acid residues.
  • the ⁇ -amino group of at least one N-terminal amino acid residue may be protected, but the ⁇ -amino groups of two or three N-terminal amino acid residues are protected. preferably, the ⁇ -amino groups of the four N-terminal amino acid residues are protected.
  • a protecting group for protecting the ⁇ -amino group of the N-terminal amino acid residue so that the nucleophilicity and/or electron-donating property of the ⁇ -amino group is lost is generally used as a protecting group for the amino group. and protecting groups described herein. Such protecting groups are well known to those skilled in the art, and reference can be made to Wuts and Greene, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley-Interscience, 2006 April, etc. to select suitable protecting groups.
  • the protected protein or peptide has formula (1): It is a compound represented by In formula (1), R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, an organic group, or a group derived from an inorganic material, and R 2 represents an ⁇ -amino group of at least one N-terminal amino acid residue from the protein or peptide. indicates the group from which is removed.
  • the protected protein or peptide has formula (2): It is a compound represented by In formula (2), R 3 and R 4 represent a hydrogen atom, a hydroxy group, an organic group, or a group derived from an inorganic material, and R 5 represents at least one N-terminal amino acid residue from the protein or peptide and adjacent thereto. and R 6 represents the side chain of said at least one N-terminal amino acid residue of said protein or peptide.
  • the protected protein or peptide has the formula (3): It is a compound represented by In formula (3), R 4 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, an organic group or a group derived from an inorganic material, and one of R 7 and R 8 is -N(-R 9 )- (R 9 is hydrogen an atom , a hydroxy group, an organic group or a group derived from an inorganic material; Denoting the removed group, R6 represents the side chain of said at least one N - terminal amino acid residue of said protein or peptide.
  • the compound represented by formula (3) may be either a compound represented by formula (3a) or a compound represented by formula (3b), preferably a compound represented by formula (3a) be.
  • the organic group for R 1 , R 3 , R 4 and R 9 is a group derived from an organic molecule or organic molecule complex, for example, a group obtained by removing one or more atoms from an organic molecule or organic molecule complex. As long as there is, it is not particularly limited.
  • Organic molecules are not particularly limited, and may be natural, synthetic or artificial.
  • Examples of the organic molecule complex include, but are not particularly limited to, a complex (or organism) in which a plurality of molecules including organic molecules are linked.
  • the form of the linkage is not particularly limited, but examples thereof include hydrogen bonding, electrostatic force, van der Waals force, hydrophobic bonding, covalent bonding, coordinate bonding and the like.
  • the organic molecule or organic molecule complex is preferably a functional substance, and specific examples thereof include pharmaceutical compounds, light-emitting molecules, polymer compounds, ligands, ligand binding target molecules, antigen proteins, antibodies, proteins, nucleic acids, Sugars, lipids, cells, viruses, labels (e.g. radioactive isotope labels), carbon electrodes, carbon nanomaterials, linkers, spacer molecules (e.g. polyethylene glycol or derivatives thereof, peptides (e.g. amino acids cleaved by enzymes in cells) peptides containing sequences), complexes thereof, linking molecules and the like.
  • pharmaceutical compounds light-emitting molecules, polymer compounds, ligands, ligand binding target molecules, antigen proteins, antibodies, proteins, nucleic acids, Sugars, lipids, cells, viruses, labels (e.g. radioactive isotope labels), carbon electrodes, carbon nanomaterials, linkers, spacer molecules (e.g. polyethylene glycol or derivatives thereof, peptide
  • the inorganic materials for R 1 , R 3 , R 4 and R 9 are not particularly limited and may or may not contain metal atoms.
  • examples of inorganic materials include electrode materials, metal fine particles, metal oxide fine particles, semiconductor particles, and magnetic particles.
  • the inorganic material may hold organic molecules or organic molecular complexes.
  • the organic group for R 1 , R 3 , R 4 and R 9 is selected from substituent group B or a C 1-6 alkyl group optionally having one or more substituents selected from substituent group B It can be a 6-10 membered aryl group optionally having one or more substituents, wherein substituent group A consists of a halogen atom and a 6-10 membered aryl group, and substituent group B consists of a halogen atom, a nitro group, a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 alkoxy group, a carboxy group and a di(C 1-6 alkyl)amino group.
  • the organic groups for R 1 , R 3 , R 4 and R 9 are preferably methyl group, trifluoromethyl group, phenyl group, tolyl group, nitrophenyl group, carboxyphenyl group, dicarboxyphenyl group, diethylaminophenyl group, a methoxyphenyl group, a benzyl group or a naphthylmethyl group;
  • a halogen atom is a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.
  • C 1-6 alkyl groups include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, s-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group, s-pentyl group, t-pentyl group, 2-methylbutyl group, 1-methylbutyl group, 2-methylbutyl group, neopentyl group, 1,1-dimethylpropyl group, 1,2-dimethylpropyl group, 1-ethylpropyl group, n-hexyl group, isohexyl group, 4-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 2-methylpentyl group, 1-methylpentyl group, 3,3-dimethylbutyl group, 2,2-dimethylbutyl group, 1, 1-dimethylbutyl group, 1,2-dimethylbutyl group, 1,3-d
  • C 1-6 alkoxy group for example, methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, butoxy group, isobutoxy group, s-butoxy group, t-butoxy group, pentoxy group, isopentoxy group, 2-methylbutoxy group , neopentoxy group, hexyloxy group, 4-methylpentoxy group, 3-methylpentoxy group, 2-methylpentoxy group, 3,3-dimethylbutoxy group, 2,2-dimethylbutoxy group, 1,1-dimethyl Linear or branched ones such as butoxy, 1,2-dimethylbutoxy, 1,3-dimethylbutoxy or 2,3-dimethylbutoxy can be mentioned.
  • a C 1-6 alkoxy group is preferably a methoxy, ethoxy, propoxy or isopropoxy group, more preferably a methoxy or ethoxy group.
  • a 6- to 10-membered aryl group means an aromatic hydrocarbon cyclic group having 6 to 10 carbon atoms (in the case of fused ring, at least one of the rings should exhibit aromaticity).
  • 6-10 membered aryl groups include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, indenyl, indanyl, azulenyl or heptalenyl groups.
  • the 6-10 membered aryl group is preferably a phenyl group, a 1-naphthyl group or a 2-naphthyl group, more preferably a phenyl group.
  • the protected protein or peptide is preferably a compound represented by formula (3a).
  • the compound represented by the above protein or peptide and the formula (4) It can be produced by reacting a compound represented by
  • the compound represented by formula (4) is dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and added to an aqueous solution containing the protein or peptide to react the two to produce a compound represented by formula (1). can do.
  • the aqueous solution may be a buffer containing no primary or secondary amines, and the buffer has a pH of 4.5 to 9.0, preferably 7.0 to 8.0.
  • the compound represented by formula (4) can be used in an equimolar amount or more relative to the number of moles of the protein or peptide.
  • the reaction temperature may be 4° C. to 37° C., and the reaction time may be 30 minutes or longer.
  • Formula (2) The compound represented by the above protein or peptide and the formula (5): It can be produced by reacting a compound represented by Reaction conditions are described, for example, in Onoda et al., "Triazolecarbaldehyde Reagents for One-Step N-Terminal Protein Modification", Chembiochem. 2020 May 4;21(9):1274-1278. The reaction can be carried out under the specified reaction conditions.
  • Formula (3) The compound represented by the above protein or peptide and the formula (6): It can be produced by reacting a compound represented by Reaction conditions are described, for example, in Onoda et al., "Triazolecarbaldehyde Reagents for One-Step N-Terminal Protein Modification", Chembiochem. 2020 May 4;21(9):1274-1278. The reaction can be carried out under the specified reaction conditions.
  • the insoluble particles have the ⁇ -amino group of at least one N-terminal amino acid residue of the protein or peptide deprotected.
  • the above protein or peptide in which the ⁇ -amino group of the N-terminal amino acid residue is deprotected is likely to retain its original function and structure. Therefore, such an insoluble particle is an insoluble particle in which a protein or peptide in which the ⁇ -amino group of the N-terminal amino acid residue is protected is carried on a granular carrier. higher efficiency.
  • Such insoluble particles are obtained by carrying on a granular carrier a protein or peptide in which the ⁇ -amino group of the N-terminal amino acid residue is protected, and the ⁇ -amino acid residue of at least one N-terminal amino acid residue of the protein or peptide contained in the insoluble particles. It can be produced by deprotecting the amino group.
  • the reaction conditions for deprotection may be reaction conditions generally used for deprotection of a protected amino group. Such reaction conditions are well known to those skilled in the art, and reference can be made to Wuts and Greene, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley-Interscience, 2006 April., etc. to select appropriate reaction conditions.
  • the target antigen measurement kit or target antibody measurement kit contains the insoluble particles.
  • the target antigen measurement kit or target antibody measurement kit is used to qualitatively evaluate the presence or absence of the target antigen or target antibody in the test sample, or to quantitatively evaluate the concentration of the target antigen or target antibody in the test sample. More specifically, it can be used in the following methods for measuring target antigens or target antibodies.
  • a target antigen measurement kit or target antibody measurement kit includes a particulate carrier for preparing insoluble particles and a protein or peptide.
  • the insoluble particles are prepared by binding the protein or peptide and the granular carrier at the time of measurement.
  • the kit for target antigen measurement or target antibody measurement may further contain a target antigen or target antibody for use in creating a positive control or standard curve, a buffer solution for diluting the test sample, insoluble particles and the test sample and a buffer for binding the protein or peptide to the particulate carrier.
  • the method for measuring a target antigen uses the insoluble particles.
  • Such measurement methods can be used to qualitatively evaluate the presence or absence of the target antigen in the test sample, or to quantitatively evaluate the concentration of the target antigen in the test sample.
  • a method for measuring a target antigen includes the steps of contacting the insoluble particles with a test sample that may contain the target antigen, and antigen-antibody reaction between the antibody or antibody fragment contained in the insoluble particles and the target antigen. measuring the agglutination reaction of the insoluble particles by.
  • the above insoluble particles may be prepared, or may be prepared by binding a particulate carrier to an antibody or antibody fragment for measurement.
  • the insoluble particles and the test sample that may contain the target antigen can be brought into contact.
  • the insoluble particles aggregate due to the interaction between the target antigen contained in the test sample and the antibody or antibody fragment contained in the insoluble particles, and the absorbance of the suspension changes.
  • the amount of change in absorbance (endpoint method) or rate of change (rate method) is measured. Nephelometric or colorimetric methods are preferably used for the measurement.
  • light in the visible to near-infrared region usually 300 nm to 1000 nm, preferably 500 nm to 900 nm, is irradiated from the outside of the cell, and a change in absorbance or a change in intensity of scattered light is detected to determine the agglutination reaction of the insoluble particles. is measured.
  • the time for the agglutination reaction can be 1 minute to 30 minutes, preferably 1 minute to 10 minutes, but is not limited to these.
  • the temperature at which the agglutination reaction is performed can be 35°C to 40°C, and can also be 36°C to 38°C, but is not limited thereto.
  • a calibration curve is drawn by plotting the concentration of the antigen to be measured in the standard sample on the horizontal axis and the amount or rate of change in the measured absorbance on the vertical axis.
  • the target antigen in the test sample can be quantitatively evaluated by measuring the amount or rate of change in absorbance for an unknown test sample by the same method and applying the measurement results to the above calibration curve.
  • a threshold for the amount or rate of change in absorbance is set in advance, and when the threshold is exceeded, the presence of the target antigen in the test sample can be qualitatively evaluated.
  • test sample is not particularly limited as long as it can contain the target antigen. Blood, serum, plasma, urine, feces, cerebrospinal fluid or dilutions thereof are preferred.
  • the method for measuring the target antibody uses the insoluble particles. Such measurement methods can be used to qualitatively evaluate the presence or absence of target antibodies in a test sample, or to quantitatively evaluate the concentration of target antibodies in a test sample.
  • a method for measuring a target antibody includes the steps of contacting a test sample that may contain the target antibody with the insoluble particles, and antigens of the antigen, antigen fragment or hapten contained in the insoluble particles and the target antibody. measuring the agglutination reaction of the insoluble particles by the antibody reaction.
  • the above-mentioned insoluble particles may be prepared, or may be prepared by binding a particulate carrier to an antigen, antigen fragment or hapten for measurement.
  • Measurement of agglutination reaction of insoluble particles, conditions for agglutination reaction, quantitative or qualitative evaluation method of target antibody, and test sample in the target antibody measurement method are the same as those described in the target antigen measurement method.
  • Example 1 Preparation of influenza virus test reagent by latex agglutination method (1-1) N-terminal protection of anti-type A influenza virus antibody 1H-1,2,3-triazole-4-carbaldehyde: Dilute dimethyl sulfoxide (DMSO) aqueous solution (200 mM) with phosphate buffer (10 mM, pH 7.5) to a final concentration of 20 mM, and add anti-influenza A virus antibody to a final concentration of 2 mg/mL. and shaken at 37° C. for 16 hours. After the reaction, the solution was replaced with 5 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer (pH 5.0) by centrifugal ultrafiltration. The resulting antibody is hereinafter referred to as N-terminally protected anti-type A antibody.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • phosphate buffer 10 mM, pH 7.5
  • N-terminally protected anti-A antibody prepared in 1-1 was diluted with MES buffer (pH 5.0) to 0.5 mg/mL, and the latex particles were was added to 0.25% (w / v), and after stirring, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride was added to 1% (w / v), and further Stirred. The supernatant was removed by centrifugation, resuspended in 5 mM trishydroxymethylaminomethane (Tris) buffer (pH 8.8), 0.01% (w/v) casein, and bound to N-terminally protected anti-influenza A virus antibody. Latex particles (hereinafter referred to as N-terminal protected anti-type A antibody-bound latex) were obtained.
  • Tris trishydroxymethylaminomethane

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Abstract

粒状担体と、上記粒状担体に担持されたタンパク質又はペプチドと、を含有する不溶性粒子であって、上記タンパク質又はペプチドの少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が、該α－アミノ基の求核性及び／又は電子供与性が消失するように保護されている、不溶性粒子を開示する。かかる不溶性粒子は、標的物質と反応する際に立体障害の問題が生じない。

Description

不溶性粒子、標的抗原測定用又は標的抗体測定用キット、標的抗原又は標的抗体の測定方法及び不溶性粒子を製造する方法
　本発明は、不溶性粒子、標的抗原測定用又は標的抗体測定用キット、標的抗原又は標的抗体の測定方法及び不溶性粒子を製造する方法に関する。
　免疫反応を利用した標的抗原の測定方法として、ラテックスなどの粒状担体を利用する方法がある（例えば特許文献１）。粒状担体と粒状担体に担持された標的抗原を認識する抗体とを有する不溶性粒子は、標的抗原が存在すると、抗原抗体反応を生じる。そして、その特異性及び親和力により、標的抗原を橋渡しにして互いに結合し、不溶性粒子は凝集する。生じた凝集塊の有無及び凝集の程度により、標的抗原の有無及び存在量が測定される。同様に、粒状担体と粒状担体に担持された標的抗体によって認識される抗原とを有する不溶性粒子を利用することで、標的抗体の有無及び存在量が測定される。
　抗体又は抗原を粒状担体へ担持させる場合、抗体又は抗原のアミノ基と粒状担体表面のカルボキシ基との間で共有結合を形成させる手法が広く用いられている。抗体又は抗原のＮ末端アミノ酸残基のα位のアミノ基が、粒状担体表面のカルボキシ基と共有結合を形成するアミノ基となり得る。
特開２０１７－８３４４０号公報
　粒状担体と粒状担体に担持された標的抗原を認識する抗体とを有する不溶性粒子を用いて標的抗原を測定する場合、抗体の抗原結合部位はＮ末端側に配座しているため、抗体のＮ末端アミノ酸残基のα位のアミノ基を介して抗体が粒状担体に担持されていると、抗原結合部位と抗原との間の反応が立体的に阻害される場合があり得る。粒状担体と粒状担体に担持された標的抗体によって認識される抗原とを有する不溶性粒子を用いて標的抗体を測定する場合、粒状担体に担持される抗原の密度が高い場合にはその立体障害のために標的抗体との反応性が低くなる場合があり得る。
　これらの立体障害の問題点を回避するための手段として、粒状担体に担持される抗体又は抗原の密度の低い不溶性粒子を使用することが考えられる。しかし、そのような不溶性粒子を使用すると、標的抗原又は抗体の測定感度（Ｓ／Ｎ比）が低下する。したがって、立体障害と測定感度はトレードオフの関係にある。
　これらの立体障害の問題点を回避するための別の手段として、粒状担体のカルボキシ基と抗体又は抗原のＮ末端アミノ酸残基のα位のアミノ基との間にスペーサーを挿入することが考えられる。しかし、スペーサーに対して抗体又は抗原が非特異的に結合する可能性がある。また、抗体及び／又は抗原の種類に応じてスペーサー長の最適化を行う必要があるため汎用性に乏しいという欠点もある。
　抗体又は抗原がリシン残基を有する場合は、リシン残基の側鎖（４－アミノブチル基）のアミノ基も、粒状担体表面のカルボキシ基と反応するアミノ基となり得る。Ｎ末端アミノ酸残基のα位のアミノ基及びリシン残基の側鎖のアミノ基の一方のアミノ基が保護されていない抗体又は抗原を粒状担体との担持反応に使用すると、粒状担体表面のカルボキシ基と共有結合を形成するアミノ基の位置を制御することができないという問題点が生じる。
　本願発明の課題は、粒状担体上に担持されたタンパク質又はペプチドを有し、標的物質と反応する際に立体障害の問題が生じない不溶性粒子を提供することにある。また、本願発明の課題は、タンパク質又はペプチドを粒状担体に担持させる際に、粒状担体のカルボキシ基と共有結合を形成するタンパク質又はペプチドのアミノ基の位置を制御する方法を提供し、その方法により得られる不溶性粒子を提供することにある。
　本発明者らは、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基を選択的に保護し、保護されたタンパク質又はペプチドを粒状担体との反応に供することで、タンパク質又はペプチドと粒状担体との結合位置を制御できると考え、本発明を完成するに至った。また、かかる方法により得られる不溶性粒子は標的物質と反応する際に立体障害の問題が生じないと考えられる。
　本発明の一側面は、粒状担体と、上記粒状担体に担持されたタンパク質又はペプチドと、を含有する不溶性粒子であって、上記タンパク質又はペプチドの少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が、該α－アミノ基の求核性及び／又は電子供与性が消失するように保護されている、不溶性粒子である。
　本発明の他の一側面は、上記不溶性粒子を含む標的抗原測定用又は標的抗体測定用キットである。
　本発明の他の一側面は、上記不溶性粒子を調製するための粒状担体とタンパク質若しくはペプチドとを含む、標的抗原測定用又は標的抗体測定用キットである。
　本発明の他の一側面は、上記不溶性粒子を用いる標的抗原の測定方法である。
　本発明の他の一側面は、上記不溶性粒子を用いる標的抗体の測定方法である。
　本発明の他の一側面は、上記不溶性粒子を製造する方法である。
　本発明によれば、タンパク質又はペプチドを粒状担体に担持させる際に、粒状担体のカルボキシ基と共有結合を形成するタンパク質又はペプチドのアミノ基の位置を制御することができる。また、本発明によれば、粒状担体上に担持されたタンパク質又はペプチドを有し、標的物質と反応する際に立体障害の問題が生じない不溶性粒子を提供することができる。
図１は、実施例１の結果を表すグラフを示す。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
　一実施形態に係る不溶性粒子は、粒状担体と、上記粒状担体に担持されたタンパク質又はペプチドと、を含有し、上記タンパク質又はペプチドの少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が、該α－アミノ基の求核性及び／又は電子供与性が消失するように保護されている。
　粒状担体は、ラテックス粒子、セラミック粒子、アルミナ粒子、シリカ－アルミナ粒子、カーボンブラック粒子等の粒子が挙げられる。これらの粒子の中ではラテックス粒子が好ましい。ラテックスの材質は、例えば、ポリスチレン、ジビニルベンゼン等が挙げられ、ポリスチレンであることが好ましい。粒状担体の平均粒径は０．０５～５μｍとすることができる。なお、粒状担体の平均粒径は、動的光散乱法によって測定することができる。本明細書において「平均粒径」とは、動的光散乱法によって得られた体積基準の粒径の分布曲線において、小粒径からの積算値が全体の５０％に達した時の粒径（メディアン径）を意味する。
　タンパク質又はペプチドは複数のアミノ酸が鎖状に連結した高分子化合物であり、一般的に、構成アミノ酸の数がおよそ５０を超える物質はタンパク質と理解され、５０個以下である物質はペプチドと理解される。タンパク質又はペプチドを構成するアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リシン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の２０種類である。アミノ酸はＬ－アミノ酸でもＤ－アミノ酸でもよい。
　粒状担体に担持されるタンパク質又はペプチドは特に制限されず、不溶性粒子により検出したい標的物質と特異的に結合し得る物質であればよい。例えば、抗原、エピトープを含む抗原断片又はハプテンを担持した粒状担体を含有する不溶性粒子は、抗体又は抗体断片を検出するための試薬として利用することができる。また、例えば、抗体又はパラトープを有する抗体断片を担持した粒状担体を含有する不溶性粒子は、抗原、エピトープを含む抗原断片又はハプテンを検出するための試薬として利用することができる。
　粒状担体に担持される抗原又は粒状担体に担持される抗体により認識される抗原は、例えば、ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白質）、前立腺特異抗原、フェリチン、β－２マイクログロブリン、ミオグロビン、ヘモグロビン、アルブミン、クレアチニン等のタンパク質マーカー、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の免疫グロブリン、各種腫瘍マーカー、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＴＧ等のリポ蛋白、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、ＨＡＶ、ＨＢs、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、レジオネラ属菌、炭疽菌、ＭＲＳＡ等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗原、ヒト絨毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタグランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、農薬、環境ホルモン等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　エピトープとは、抗体が認識して結合する抗原の特定の構造単位をいい、ハプテンとは、抗体との結合能を有するが単独では免疫原性を示さない物質をいう。また、パラトープとは、抗原を認識して結合する抗体の一部をいう。
　抗体は、抗原に特異的に結合し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＩｇＧとすることができる。ＩｇＧは２本の重鎖（Ｈ鎖）及び２本の軽鎖（Ｌ鎖）から構成される。重鎖はＮ末端から順に、可変領域（ＶＨ）、第一定常領域（ＣＨ１）、第二定常領域（ＣＨ２）及び第三定常領域（ＣＨ３）から構成されている。軽鎖はＮ末端から順に、可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）から構成されている。ＣＨ２及びＣＨ３から構成される部分がＦｃ領域である。１本の重鎖と１本の軽鎖は、ＣＨ１に存在するシステイン残基及びＣＬに存在するシステイン残基のジスルフィド結合により結合している。また、重鎖同士は、ＣＨ１とＣＨ２の間に位置するヒンジ領域に存在するシステイン残基同士のジスルフィド結合により結合している。抗体は、重鎖が存在するＩｇＧの断片であってもよく、１本の重鎖及び１本の軽鎖から構成されるｒＩｇＧ（還元型ＩｇＧ）であってもよく、２本の重鎖から構成される断片であってもよく、１本の重鎖から構成される断片であってよい。
　上記タンパク質又はペプチドと上記粒状担体と担持の様式は、共有結合であって、アミド結合、ジスルフィド結合などが挙げられる。アミド結合は、好ましくは、上記タンパク質又はペプチドがリシン残基を有し、リシン残基の側鎖のアミノ基と上記粒状担体の表面上のカルボキシ基との間に形成される。
　上記タンパク質又はペプチドの少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が、該α－アミノ基の求核性及び／又は電子供与性が消失するように保護されている。Ｎ末端アミノ酸残基のα－アミノ基は求核性及び／又は電子供与性がある、すなわち反応性が高いため、タンパク質又はペプチドを粒状担体に担持させる際に、Ｎ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が反応点となり得る。そのため、タンパク質又はペプチドがそのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基を介して粒状担体上に担持された不溶性粒子が得られる可能性がある。本実施形態の不溶性粒子では、Ｎ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が、該α－アミノ基の求核性及び／又は電子供与性が消失するように保護されているため、担持反応の際に反応点とならない。そのため、タンパク質又はペプチドを所望の位置で粒状担体上に担持した不溶性粒子が得られる。
　上記タンパク質又はペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸残基は、プロリン以外のアミノ酸、すなわち、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群から選択されるアミノ酸とすることができる。
　タンパク質又はペプチドが多量体を形成するなどして、複数のＮ末端アミノ酸残基が存在する場合、少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が保護されていればよいが、標的物質との高い結合効率という観点からは、すべてのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が保護されていることが好ましい。例えば、粒状担体に担持されるタンパク質がＩｇＧである場合、ＩｇＧは４つのＮ末端アミノ酸残基が存在する。ＩｇＧの４つのＮ末端アミノ酸残基のうち少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が保護されていればよいが、２つ又は３つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が保護されていてもよく、４つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が保護されていることが好ましい。
　Ｎ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が、該α－アミノ基の求核性及び／又は電子供与性が消失するように保護するための保護基は、アミノ基の保護基として一般的に使用されている保護基が挙げられる。そのような保護基は当業者にとって周知であり、Wuts and Greene, “Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, Wiley-Interscience, 2006 April.などを参照して、適切な保護基を選択することができる。
　一実施形態において、上記保護されたタンパク質又はペプチドは、式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 で表される化合物である。式（１）中、Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示し、Ｒ２は、上記タンパク質又はペプチドから上記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が除かれた基を示す。
　一実施形態において、上記保護されたタンパク質又はペプチドは、式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 で表される化合物である。式（２）中、Ｒ３及びＲ４は、水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示し、Ｒ５は上記タンパク質又はペプチドから上記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基及びそれに隣接する－ＮＨ－が除かれた基を示し、Ｒ６は上記タンパク質又はペプチドの上記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基の側鎖を示す。
　一実施形態において、保護されたタンパク質又はペプチドが、式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 で表される化合物である。式（３）中、Ｒ４は、水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示し、Ｒ７及びＲ８のうち、一方は－Ｎ（－Ｒ９）－（Ｒ９は水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示し、他方は＝Ｎ－を示し、Ｒ５は、上記タンパク質又はペプチドから上記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基及びそれに隣接する－ＮＨ－が除かれた基を示し、Ｒ６は上記タンパク質又はペプチドの上記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基の側鎖を示す。
　式（３）で表される化合物は、式（３ａ）で表される化合物及び式（３ｂ）で表される化合物のいずれであってもよく、好ましくは式（３ａ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ９における有機基は、有機分子又は有機分子複合体由来の基、例えば有機分子又は有機分子複合体から１つの原子又は複数の原子が除かれてなる基である限り、特に制限されない。有機分子は、特に制限されず、天然のものであっても、合成・人工のものであってもよい。有機分子複合体としては、特に制限されないが、例えば有機分子を含む複数の分子が連結してなる複合体（或いは生命体）が挙げられる。該連結の態様は、特に制限されないが、例えば水素結合、静電気力、ファンデルワールス力、疎水結合、共有結合、配位結合等が挙げられる。これらの結合は、リンカー（具体例としては後述のリンカー参照）を介して行われていてもよい。有機分子又は有機分子複合体は、機能性物質であることが好ましく、その具体例としては、医薬化合物、発光分子、高分子化合物、リガンド、リガンド結合対象分子、抗原タンパク質、抗体、タンパク質、核酸、糖類、脂質、細胞、ウイルス、標識（例えば放射性同位元素標識）、カーボン電極、カーボンナノ材料、リンカー、スペーサー分子（例えば、ポリエチレングリコール又はその誘導体、ペプチド（一例として細胞内で酵素により切断されるアミノ酸配列を含むペプチド）等）、これらの複合体、連結分子等が挙げられる。
　Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ９における無機材料としては、金属原子を含む又は含まない材料であって、特に制限されるものではない。無機材料としては、例えば電極材料、金属微粒子、金属酸化微粒子、半導体粒子、磁性粒子等が挙げられる。無機材料は、有機分子又は有機分子複合体を保持するものであってもよい。
　Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ９における有機基は、置換基群Ａから選択される１以上の置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基又は置換基群Ｂから選択される１以上の置換基を有していてもよい６－１０員アリール基とすることができ、ここで、置換基群Ａは、ハロゲン原子及び６－１０員アリール基からなり、置換基群Ｂは、ハロゲン原子、ニトロ基、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６アルコキシ基、カルボキシ基及びジ（Ｃ１－６アルキル）アミノ基からなる。
　Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ９における有機基は、好ましくは、メチル基、トリフルオロメチル基、フェニル基、トリル基、ニトロフェニル基、カルボキシフェニル基、ジカルボキシフェニル基、ジエチルアミノフェニル基、メトキシフェニル基、ベンジル基又はナフチルメチル基である。
　ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。
　Ｃ１－６アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、n－プロピル基、イソプロピル基、n－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓ－ペンチル基、ｔ－ペンチル基、２－メチルブチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ネオペンチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、４－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、１－メチルペンチル基、３，３－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、１－エチルブチル基、２－エチルブチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、１，２，２，－トリメチルプロピル基、１－エチル－１－メチルプロピル基又は１－エチル－２－メチルプロピル基等の直鎖又は分枝鎖のものを挙げることができる。Ｃ１－６アルキル基は、好ましくは、メチル基、エチル基又はｔ－ブチルであり、より好ましくは、メチル基又はエチル基である。
　Ｃ１－６アルコキシ基として、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、ペントキシ基、イソペントキシ基、２－メチルブトキシ基、ネオペントキシ基、ヘキシルオキシ基、４－メチルペントキシ基、３－メチルペントキシ基、２－メチルペントキシ基、３，３－ジメチルブトキシ基、２，２－ジメチルブトキシ基、１，１－ジメチルブトキシ基、１，２－ジメチルブトキシ基、１，３－ジメチルブトキシ基又は２，３－ジメチルブトキシ基等の直鎖又は分枝鎖のものを挙げることができる。Ｃ１－６アルコキシ基は、好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基又はイソプロポキシ基であり、より好ましくはメトキシ又はエトキシ基である。
　６－１０員アリール基は、炭素数６～１０の芳香族性の炭化水素環式基（縮環の場合、少なくとも環の１つが芳香族性を示せばよい）であることを意味する。６－１０員アリール基として、例えば、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、インデニル基、インダニル基、アズレニルまたはヘプタレニル基等が挙げられる。６－１０員アリール基は、好ましくは、フェニル基、１－ナフチル基又は２－ナフチル基であり、より好ましくは、フェニル基である。
　上記保護されたタンパク質又はペプチドは、好ましくは、式（３ａ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　式（３ａ）で表される化合物における、Ｒ４及びＲ９の好ましい組み合わせは、以下の表１のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　式（２）で表される化合物における、Ｒ４及びＲ９の好ましい組み合わせは、以下の表２のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 で表される化合物は、上記タンパク質又はペプチドと、式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 で表される化合物とを反応させることで製造することができる。例えば、式（４）で表される化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、それを上記タンパク質又はペプチドを含む水溶液に加えることで両者を反応させ、式（１）で表される化合物を製造することができる。水溶液は、１級又は２級アミンを含有しない緩衝液であればよく、緩衝液のｐＨは４．５から９．０、好ましくは７．０から８．０である。式（４）で表される化合物は、上記タンパク質又はペプチドのモル数に対して等モル量以上用いることができる。反応温度は４℃から３７℃であればよく、反応時間は３０分以上であればよい。
　式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 で表される化合物は、上記タンパク質又はペプチドと、式（５）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 で表される化合物とを反応させることで製造することができる。反応条件は、例えば、Onoda et al., “Triazolecarbaldehyde Reagents for One‐Step N‐Terminal Protein Modification”, Chembiochem. 2020 May 4;21(9):1274-1278.及び国際公開第２０２０／１７５６８０号に記載された反応条件にて反応させることができる。
　式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 で表される化合物は、上記タンパク質又はペプチドと、式（６）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 で表される化合物とを反応させることで製造することができる。反応条件は、例えば、Onoda et al., “Triazolecarbaldehyde Reagents for One‐Step N‐Terminal Protein Modification”, Chembiochem. 2020 May 4;21(9):1274-1278.及び国際公開第２０２０／１７５６８０号に記載された反応条件にて反応させることができる。
　一実施形態において、上記不溶性粒子は、上記タンパク質又はペプチドの少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が脱保護されている。Ｎ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が脱保護された上記タンパク質又はペプチドは、本来の機能及び構造を保持する可能性が高い。そのため、かかる不溶性粒子は、Ｎ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が保護されたタンパク質又はペプチドを粒状担体上へ担持した不溶性粒子である為、従来の技術と比較して、標的物質との結合効率がより高くなる。かかる不溶性粒子は、Ｎ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が保護されたタンパク質又はペプチドを粒状担体上へ担持した不溶性粒子に含有されるタンパク質又はペプチドの少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基を脱保護することで、製造することができる。脱保護の反応条件は、保護されたアミノ基の脱保護として一般的に使用されている反応条件でよい。そのような反応条件は当業者にとって周知であり、Wuts and Greene, “Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, Wiley-Interscience, 2006 April.などを参照して、適切な反応条件を選択することができる。
　一実施形態において、標的抗原測定用又は標的抗体測定用キットは、上記不溶性粒子を含む。標的抗原測定用又は標的抗体測定用キットは、被験試料中の標的抗原又は標的抗体の有無を定性的に評価するため、又は被検試料中の標的抗原又は標的抗体の濃度を定量的に評価するために用いることができ、より具体的には、下記の標的抗原又は標的抗体の測定方法に用いることができる。
　一実施形態において、標的抗原測定用又は標的抗体測定用キットは、不溶性粒子を調製するための粒状担体とタンパク質若しくはペプチドとを含む。本実施形態にかかる標的抗原測定用又は標的抗体測定用キットは、測定に際して上記タンパク質若しくはペプチド及び上記粒状担体を結合させて上記不溶性粒子を調製する。
　標的抗原測定用又は標的抗体測定用キットは、さらに、陽性対照又は検量線作成に用いるための標的抗原又は標的抗体を含んでいてもよく、被験試料を希釈する緩衝液、不溶性粒子と被検試料とを混合するための緩衝液、タンパク質若しくはペプチドと粒状担体とを結合させるための緩衝液などを含んでいてもよい。
　一実施形態において、標的抗原の測定方法は、上記不溶性粒子を用いる。かかる測定方法は、被験試料中の標的抗原の有無を定性的に評価するために、又は被検試料中の標的抗原の濃度を定量的に評価するために行うことができる。
　一実施形態において、標的抗原の測定方法は、上記不溶性粒子と標的抗原を含有し得る被験試料を接触させる工程、並びに上記不溶性粒子に含有される抗体又は抗体断片と上記標的抗原との抗原抗体反応による上記不溶性粒子の凝集反応を測定する工程、を含む。上記不溶性粒子は、調製済みのものを用いてもよく、測定に際して、粒状担体と抗体又は抗体断片とを結合させることにより調製してもよい。
　上記不溶性粒子を含む懸濁液と被検試料とを混合することで、上記不溶性粒子と標的抗原を含有し得る上記被験試料を接触させることができる。両者を接触させると、上記被検試料中に含まれる標的抗原と上記不溶性粒子に含まれる抗体又は抗体断片との間の相互作用によって上記不溶性粒子が凝集し、懸濁液の吸光度が変化する。この吸光度の変化量（エンドポイント法）又は変化率（レート法）を測定する。測定は、比濁法又は比色法が好適に用いられる。例えば、セル外部より可視光から近赤外域の光、通常３００ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ～９００ｎｍの光を照射し、吸光度変化又は散乱光の強度変化を検出することにより、上記不溶性粒子の凝集反応が測定される。
　凝集反応を行う時間は、１分～３０分とすることができ、好ましくは１分～１０分であるが、これらに限られない。凝集反応を行う温度は、３５℃～４０℃とすることができ、３６～３８℃とすることもできるが、これらに限られない。
　測定すべき標的抗原を種々の既知濃度で含む複数の標準試料を準備し、それらについて上記方法により吸光度の変化量又は変化率を測定する。標準試料中の測定すべき抗原の濃度を横軸、測定された吸光度の変化量又は変化率を縦軸にプロットして検量線を描く。未知の被検試料についても同じ方法により吸光度の変化量又は変化率を測定し、測定結果を上記検量線に当てはめることにより、被検試料中の標的抗原を定量的に評価することができる。また、あらかじめ吸光度の変化量又は変化率の閾値を設定しておき、閾値を超えた場合に被験試料中に標的抗原が存在すると定性的に評価することができる。
　被験試料は、標的抗原を含有し得るものであれば特に限定されないが、血液、血清、血漿、尿、便、唾液、組織液、髄液、ぬぐい液等の体液等又はその希釈物が挙げられ、血液、血清、血漿、尿、便、髄液又はこれらの希釈物が好ましい。
　一実施形態において、標的抗体の測定方法は、上記不溶性粒子を用いる。かかる測定方法は、被験試料中の標的抗体の有無を定性的に評価するために、又は被検試料中の標的抗体の濃度を定量的に評価するために行うことができる。
　一実施形態において、標的抗体の測定方法は、上記不溶性粒子と標的抗体を含有し得る被験試料を接触させる工程、並びに上記不溶性粒子に含有される抗原、抗原断片又はハプテンと上記標的抗体との抗原抗体反応による上記不溶性粒子の凝集反応を測定する工程、を含む。上記不溶性粒子は、調製済みのものを用いてもよく、測定に際して、粒状担体と抗原、抗原断片又はハプテンとを結合させることにより調製してもよい。
　標的抗体の測定方法における、不溶性粒子の凝集反応の測定、凝集反応を行う条件、標的抗体の定量的又は定性的な評価方法及び被験試料は、標的抗原の測定方法における説明と同様である。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
　実施例１：ラテックス凝集法によるインフルエンザウイルス検査試薬の作製
（１－１）抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体のＮ末端保護
　１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－カルボアルデヒド：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液（２００ｍＭ）を終濃度２０ｍＭとなるようにリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で希釈し、ここに抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を終濃度２ｍｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で１６時間振とうした。反応後の溶液は、遠心限外濾過により５ｍＭ　２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ５．０）に置換した。得られた抗体を、以下、Ｎ末端保護抗Ａ型抗体と呼ぶ。
（１－２）抗体結合ラテックス粒子の調製
　１－１で調製したＮ末端保護抗Ａ型抗体を０．５ｍｇ／ｍＬとなるようにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈し、ここにラテックス粒子を０．２５％（ｗ／ｖ）となるように加え、撹拌後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を１％（ｗ／ｖ）となるように加え、さらに撹拌した。遠心操作により上清を除き、５ｍＭ　トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ８．８）、０．０１％（ｗ／ｖ）カゼインに再浮遊し、Ｎ末端保護抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体結合ラテックス粒子（以下、Ｎ末端保護抗Ａ型抗体結合ラテックスと呼ぶ）を得た。
（１－３）Ａ型インフルエンザウイルス抗原の検出
　１－２で調製したＮ末端保護抗Ａ型抗体結合ラテックス又は抗体未結合ラテックスを終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるように反応液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００）で希釈し、Ａ型インフルエンザウイルス抗原を濃度１１３．４ｐｆｕ／ｍＬで含有する反応液と等量混合した。反応液に６３５ｎｍの波長の光を照射し、散乱光を１分おきに１５分間測定することでラテックスの凝集性を評価した。散乱光のシグナルがプラトーに達した６分時点までのプロットの傾きを算出することで試料間の比較を行った。上記散乱光の測定は比濁測定リーダーＮＥＰＨＥＬＯｓｔａｒ　Ｐｌｕｓ（ＢＭＧ　ＬＡＢＴＥＣＨ社）を用いて行った。結果を図１に示す。

Claims (24)

  1. 　粒状担体と、前記粒状担体に担持されたタンパク質又はペプチドと、を含有する不溶性粒子であって、前記タンパク質又はペプチドの少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が、該α－アミノ基の求核性及び／又は電子供与性が消失するように保護されている、不溶性粒子。
  2. 　前記タンパク質又はペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸残基がプロリン以外のアミノ酸である、請求項１記載の不溶性粒子。
  3. 　前記タンパク質又はペプチドが、抗原、エピトープを含む抗原断片又はハプテンである、請求項１又は２に記載の不溶性粒子。
  4. 　前記タンパク質又はペプチドが、抗体又はパラトープを有する抗体断片である、請求項１又は２に記載の不溶性粒子。
  5. 　前記タンパク質又はペプチドが、共有結合により前記粒状担体に担持されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の不溶性粒子。
  6. 　保護されたタンパク質又はペプチドが、式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で表される化合物［式（１）中、Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示し、Ｒ２は、前記タンパク質又はペプチドから前記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が除かれた基を示す。］である、請求項１～５のいずれか一項に記載の不溶性粒子。
  7. 　保護されたタンパク質又はペプチドが、式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表される化合物［式（２）中、Ｒ３及びＲ４は、水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示し、Ｒ５は前記タンパク質又はペプチドから前記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基及びそれに隣接する－ＮＨ－が除かれた基を示し、Ｒ６は前記タンパク質又はペプチドの前記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基の側鎖を示す。］である、請求項１～５のいずれか一項に記載の不溶性粒子。
  8. 　保護されたタンパク質又はペプチドが、式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で表される化合物［式（３）中、Ｒ４は、水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示し、Ｒ７及びＲ８のうち、一方は－Ｎ（－Ｒ９）－（Ｒ９は水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示し、他方は＝Ｎ－を示し、Ｒ５は、前記タンパク質又はペプチドから前記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基及びそれに隣接する－ＮＨ－が除かれた基を示し、Ｒ６は前記タンパク質又はペプチドの前記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基の側鎖を示す。］である、請求項１～５のいずれか一項に記載の不溶性粒子。
  9. 　前記タンパク質又はペプチドのすべてのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が保護されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の不溶性粒子。
  10. 　前記粒状担体がラテックス粒子である、請求項１～９のいずれか一項に記載の不溶性粒子。
  11. 　前記抗体又は抗体断片がＩｇＧ又はその断片である、請求項４～１０のいずれか一項に記載の不溶性粒子。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の不溶性粒子に含有されるタンパク質又はペプチドの少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基が脱保護されている、不溶性粒子。
  13. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の不溶性粒子を含む、標的抗原測定用又は標的抗体測定用キット。
  14. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の不溶性粒子を調製するための粒状担体とタンパク質若しくはペプチドとを含む、標的抗原測定用又は標的抗体測定用キット。
  15. 　請求項４～１２のいずれか一項に記載の不溶性粒子を用いる、標的抗原の測定方法。
  16. 　請求項３及び５～１２のいずれか一項に記載の不溶性粒子を用いる、標的抗体の測定方法。
  17. 　請求項４～１２のいずれか一項に記載の不溶性粒子と標的抗原を含有し得る被験試料を接触させる工程、並びに前記不溶性粒子に含有される抗体又は抗体断片と前記標的抗原との抗原抗体反応による前記不溶性粒子の凝集反応を測定する工程、を含む、標的抗原の測定方法。
  18. 　請求項３及び５～１２のいずれか一項に記載の不溶性粒子と標的抗体を含有し得る被験試料を接触させる工程、並びに前記不溶性粒子に含有される抗原、抗原断片又はハプテンと前記標的抗体との抗原抗体反応による前記不溶性粒子の凝集反応を測定する工程、を含む、標的抗体の測定方法。
  19. 　被験試料中の標的抗原の有無を定性的に評価するための、又は被検試料中の標的抗原の濃度を定量的に評価するための、請求項１５又は１７に記載の方法。
  20. 　被験試料中の標的抗体の有無を定性的に評価するための、又は被検試料中の標的抗体の濃度を定量的に評価するための、請求項１６又は１８に記載の方法。
  21. 　タンパク質又はペプチドと、式（４）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     で表される化合物［式（４）中、Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示す。］とを反応させる工程を含む、請求項６に記載の不溶性粒子を製造する方法。
  22. 　タンパク質又はペプチドと、式（５）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     で表される化合物［式（５）中、Ｒ３ならびにＲ４は、水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示す。］とを反応させる工程を含む、請求項７に記載の不溶性粒子を製造する方法。
  23. 　タンパク質又はペプチドと、式（６）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     で表される化合物［式（６）式中、Ｒ４は、水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基の何れかを示し、Ｒ７及びＲ８のうち、一方は－Ｎ（－Ｒ９）－（Ｒ９は水素原子、ヒドロキシ基、有機基又は無機材料由来の基を示す。）を示し、他方は＝Ｎ－を示す。］とを反応させる工程を含む、請求項８に記載の不溶性粒子を製造する方法。
  24. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の不溶性粒子に含有されるタンパク質又はペプチドの少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基のα－アミノ基を脱保護する工程を含む、請求項１２に記載の不溶性粒子を製造する方法。
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