WO2020175680A1 - タンパク質及び／又はペプチド修飾用分子 - Google Patents

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高史 林
晃 小野田
井上　望
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a protein and/or peptide modifying molecule and the like.
  • the technology for linking another molecule/substance to a protein and/or peptide includes antibody-drug conjugates, protein reagents labeled with fluorescent probes, Protein immobilization is an important technology in the production of inorganic materials. For example, modification of azido group on proteins and the like is a technique for enabling introduction of various functional molecules by alkyne-azide cycloaddition reaction (CuAAC), and has bioorthogonality. Widely applied in fields such as bioimaging.
  • CuAAC alkyne-azide cycloaddition reaction
  • Non-Patent Document 1 MetaL-free and pH-contro L Led introduction of azides in p rote i ns, Sanne SchoffeLen, Mark B. van ELdijk, Bart Roo i jakkers, Rein out Ra I jmakers, Albert JR Heck and Jan CM van Hest, Chemical Science, 2011, 2, 701
  • Non-Patent Document 2 Selective N-terminal acylation of peptides and proteins with a GLy-His tag sequence, M. C. Martos-Ma Ldonado, C. T. Hjuler, K.
  • Non-Patent Document 3 Modification of N-Terminal a -Ami no Groups of Peptides a nd ProteinsUsing Ketenes, A. 0. -Y. Chan, C. -M. Ho, H. -C. Chong, Y. -C. Leung, J. -S. Huang, M.-K ⁇ Wong, C.-M ⁇ Che, Journal of American Chemical Society, 2012, 134, 2589. ⁇ 0 2020/175 680 2 (: 17 2020/008357 Invention Summary
  • the first point is that the 1 ⁇ 1 terminus is a position that all monomeric proteins have only one and serves as a universal modification base point.
  • the second point is that the 1 ⁇ 1 terminus is rarely involved in the protein active site (molecular binding site/catalytic reaction center) or protein functional site, and it is thought that the influence of structural changes due to modification is small. ..
  • the third point is that the 1 ⁇ 1 end is unlikely to compete with other amino acid residues (lysine, cysteine, glutamine, etc.) due to the difference in the reaction, while (: Therefore, it is considered that it is difficult to express reaction selectivity based on this.Therefore, the present inventor has focused on the 1 ⁇ 1 end of protein etc. as a position for connecting other molecules/substances.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 Although various methods for linking other molecules/substances to the 1 ⁇ 1 end of proteins and the like have been reported so far (Non-Patent Documents 1 to 3), these methods are simple, or It was considered that the end modification selectivity was insufficient.
  • the chemical binding method or lipid modification enzyme method that recognizes a specific amino acid sequence,! ⁇ !
  • the amide bond formation reaction using activated ester or ketene is simple in operation and can be applied to natural proteins, but side reactions with lysine residues may proceed. Therefore, other molecules/substances cannot be introduced specifically at the 1 ⁇ 1 end.
  • the present invention aims to provide a technique capable of easily and efficiently linking other molecules/substances to the 1 ⁇ 1 end of all proteins and/or peptides with higher selectivity.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the compound according to Item 1 which is a compound represented by: or a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof.
  • Item 3 The compound according to Item 1 or 2, wherein the organic group is a group derived from an organic molecule or an organic molecule complex, and the organic molecule or organic molecule complex is a functional substance. Or a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof.
  • the functional substance is a pharmaceutical compound, a luminescent molecule, a polymer compound, or a riga ⁇ 0 2020/175680 4
  • Item 5 The compound according to any one of Items 1 to 4, wherein the inorganic material is an electrode material, metal fine particles, metal oxide fine particles, semiconductor particles, or magnetic particles, or a salt thereof, or a hydrate thereof. Substance or solvate.
  • Item 6 A reagent containing the compound according to any one of Items 1 to 5, or a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof.
  • Item 7 The reagent according to Item 6, which is a reagent for protein and/or peptide modification.
  • Item 8. represents an organic group or a group derived from an inorganic material.
  • 1 X represents a halogen atom
  • 1 8 ( ⁇ 2 , 1 8 (0(3 ⁇ 4 5 1 ) 2 (represents the same or different and represents a hydrocarbon group, provided that two are bonded together. , May form a ring together with adjacent oxygen atoms.), or 1! V]
  • a method for producing a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof is a method for producing a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof.
  • Item 6 A method for producing the compound according to any one of Items 1 to 5, or a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof, which comprises a step of reacting with the compound represented by.
  • a double line consisting of a dotted line and a solid line indicates a single bond or a double bond.
  • Is the 1 ⁇ 1 terminal amino acid residue from the protein or peptide and its adjacent represents a group excluding. Indicates the side chain of the 1 ⁇ 1 terminal amino acid residue of the protein or peptide.
  • Item 12 The method according to Item 1 including the step of reacting the protein and/or peptide with the compound according to any one of Items 1 to 5, or a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof. A method for producing the compound according to 1, or a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof.
  • FIG. 1 1 Compound 1 Jour (3 ⁇ 4 scan Bae spectrum (400 11 / ⁇ , 01 ⁇ 0 6) shows a. ⁇ 02020/175680 7
  • FIG. 19 shows the reaction scheme and results of the 1 ⁇ 1 terminal modification reaction of angiotensin I (Example 8).
  • FIG. 24 [Reaction scheme and result of modification of azido group to ⁇ 336 octane (Example 11 -4)]
  • FIG. 25 shows a reaction scheme and results of modification of a fluorescent dye by a strain-promoting alkyne-azide cycloaddition reaction (Example 11-5).
  • FIG. 26 shows a reaction scheme and results of modification of the distorted alkyne site with RNase A (Example 11_6 ).
  • FIG. 28 shows a compound 27 and a resin on which the compound 27 is immobilized (Example 12).
  • FIG. 29 shows a synthetic scheme of 27/PS res in (Example 12-2).
  • FIG. 30 shows the results of resin identification using infrared spectroscopy (Example 12-3). The enlarged image on the right.
  • FIG. 31 Shows the results of LC/MS analysis of RNase A with N-terminal modification by a continuous reaction using a resin (27/PSresin) on which a reagent was immobilized (Example 12-4).
  • FIG. 32 shows a synthetic scheme of 27/PS res in (Example 12-5).
  • FIG. 33 shows the 1 H NMR spectrum (400 MHz, DMS ⁇ -d 6 ) of compound 28.
  • FIG. 35 A scheme of N-terminal modification by a continuous reaction using a reactant-immobilized resin (27/PSresin) (Example 12-6).
  • FIG. 36 The results of LC-MS analysis of RNase A, which was N-terminal modified by a continuous reaction using a resin (27/PSresin) on which a reagent was immobilized (Example 12-6).
  • the peaks corresponding to the modified proteins are indicated by circles, and the peaks corresponding to the unmodified proteins are indicated by circles.
  • FIG. 37 A scheme of preparation of triazole carboxaldehyde using D i mroth rearrangement reaction in a homogeneous system and application to protein modification (Example 13).
  • FIG. 39 Structure of acid catalyst in D im rot h rearrangement reaction using compound 10 (Example 13-2) 0 ⁇ 0 2020/175 680 9 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • the results of 1_01 ⁇ analysis of a protein modification reaction followed by preparation of a 1 ⁇ 1 terminal modifying agent by a rearrangement reaction are shown (Example 13-3).
  • the peaks corresponding to the modified proteins are indicated by ⁇ , and the peaks corresponding to the unmodified proteins are indicated by ⁇ .
  • Fig. 41 shows a scheme of preparation of 81 and protein modification reaction (Example 14-2
  • Fig. 42 shows the results of !_01 ⁇ analysis of 1 ⁇ 336-8 1 ⁇ 1 terminal modification using -8 using diamine as a precursor (Example 14-2). The structure of the precursor diamine and the modification rate calculated from !_0! ⁇ are shown.
  • FIG. 43 A scheme for introducing a functional molecule into the 1 ⁇ 1 end of protein through oxime formation is shown (Example 14-3).
  • FIG. 50 shows the reaction scheme and results of the 1 ⁇ 1 terminal modification reaction of human serum-derived albumin (Example 16-2).
  • Fig. 51 shows a cysteine residue modification reaction scheme and results of human serum-derived albumin (Example 17-2).
  • FIG. 52 shows the 1 ⁇ 1 terminal modification reaction scheme and results of cysteine residue-modified human serum-derived albumin (Example 17-3).
  • FIG. 67 Shows the reaction scheme of 1 ⁇ 1 terminal modification of ⁇ 336-8 and the results (Example 21)).
  • FIG. 68 shows a scheme and results of introducing an acetyl group and an azido group into ⁇ 336 octane (Example 22-1).
  • FIG. 69 shows the modification and the result of the fluorescent dye by the strain-promoting alkyne_azide cycloaddition reaction (Example 22-2).
  • the present invention relates to a compound represented by, or a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof (in the present specification, these may be collectively referred to as “the modified molecule of the present invention”). This will be described below.
  • the organic group is not particularly limited as long as it is a group derived from an organic molecule or an organic molecule composite, for example, a group obtained by removing one atom or a plurality of atoms from the organic molecule or organic molecule composite.
  • the organic molecule is not particularly limited, and may be natural or synthetic/artificial.
  • the organic molecule complex is not particularly limited, but includes, for example, a complex (or an organism) formed by linking a plurality of molecules including an organic molecule.
  • the mode of the connection is not particularly limited, and examples thereof include hydrogen bond, electrostatic force, van der Waalsca, hydrophobic bond, covalent bond, and coordinate bond. These bonds may be carried out via a linker (for specific examples, see the linker described below).
  • the organic molecule or organic molecule complex is preferably a functional substance, and specific examples thereof include pharmaceutical compounds, luminescent molecules, macromolecular compounds, ligands, ligand binding target molecules, antigen proteins, antibodies, and proteins. , Nucleic acids, sugars, lipids, cells, viruses, labels (eg, radioisotope labels), force-carbon electrodes, force-carbon nanomaterials, linkers, spacer molecules (eg, polyethylene glycol or its derivatives, peptides (for example, cells (cells)) Peptides containing an amino acid sequence that is cleaved by an enzyme in), etc.), complexes thereof, linking molecules and the like.
  • one or two or more modifying molecules of the present invention may be linked as a partial structure in the organic group (for example, at the terminal).
  • [ ⁇ 3 is the same as above. [ ⁇ 3 is the same or different in each occurrence.
  • the inorganic material is a material containing or not containing a metal atom, and is not particularly limited.
  • the inorganic material include electrode materials, metal fine particles, metal oxide fine particles, semiconductor particles, magnetic particles and the like.
  • the inorganic material may hold an organic molecule or an organic molecular complex.
  • the group derived from the organic group or the inorganic material may have a reactive group.
  • another substance can be further linked via the reactive group.
  • the reactive group include an ethynyl group, an ethynylene group, a vinyl group, an azido group, an epoxy group, an aldehyde group, an oxylamino group and a halogen atom. It is known that an ethynyl group and an ethynylene group form a 1,2,3-triazole ring by a 1,3-dipolar cycloaddition reaction with an azido group. Vinyl groups react with thiol groups to form bonds.
  • Epoxy groups react with amino groups and thiol groups to form bonds.
  • the aldehyde group reacts with the amino group to form a Schiff base, which is reduced to form a bond.
  • the oxylamino group reacts with a ketone group or an aldehyde group to form an oxime. It is known that an azido group forms a 1,2,3-triazole ring through a 1,3-dipolar cycloaddition reaction with an alkynyl group. ⁇ 0 2020/175 680 14 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • [0052] represents a hydrogen atom, an organic group, or a group derived from an inorganic material.
  • the organic group and the inorganic material are the same as the organic group and the inorganic material shown above.
  • the group derived from an organic group or an inorganic material preferably has a reactive group. In this case, as described above, another substance can be further linked via the reactive group.
  • [ ⁇ 3 is a hydrogen atom.
  • the general formula (1) is, for example, the general formula (13), (18), or (183).
  • the compound represented by the general formula (1) includes stereoisomers and optical isomers, and these are not particularly limited.
  • the salt of the compound represented by the general formula (1) is not particularly limited.
  • an acidic salt or a basic salt can be adopted.
  • acidic salts include inorganic salts such as hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, nitrates, perchlorates and phosphates; acetates, propionates, tartrates, fumarates, maleates.
  • Organic acid salts such as phosphates, malates, citrates, methanesulfonates, and paratoluenesulfonates are listed, and examples of basic salts include alkali metals such as sodium salts and potassium salts.
  • Salts and alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; salts with ammonia; morpholine, piverine, pyrrolidine, monoalkylamines, dialkylamines, trialkylamines, mono(hydroxyalkyl)amines, di(hydroxyalkyl)s ) Amine, salts with organic amines such as tri(hydroxyalkyl)amine, and the like.
  • the compound represented by the general formula (1) may be a hydrate or a solvate. Melting ⁇ 0 2020/175 680 15 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • Examples of the medium include organic solvents (eg ethanol, glycerol, acetic acid, etc.) and the like.
  • the compound represented by the general formula (1) can be synthesized by various methods.
  • the compound represented by the general formula (1) is represented by the general formula (2) [Wherein: is the same as above. Is 1 ⁇ 1 3 , 1 X (X represents a halogen atom.), 1 8 ( ⁇ 2 , ( ⁇ ⁇ 1 ) 2 (( ⁇ are the same or different and represent a hydrocarbon group. However, two may be bonded together to form a ring with an adjacent oxygen atom.
  • [0060] is the same as above. 1 ⁇ , [ ⁇ 7 and [ ⁇ 8 are the same or different and each represents an alkyl group. "" indicates a reactive group. ]
  • Examples of the halogen atom represented by X include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom and the like, and a bromine atom is preferable.
  • hydrocarbon group represented by examples include alkyl group, cycloalkyl group and the like.
  • the alkyl group represented by includes both linear and branched ones.
  • the carbon number of the alkyl group is not particularly limited and is, for example, 1-8.
  • Specific examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n_propyl group, ⁇ 0 2020/175 680 16 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • Isopropyl group, door-butyl group, isobutyl group examples thereof include a butyl group, 360-butyl group, n_pentyl group, neopentyl group, n_hexyl group, 3-methylpentyl group, door-heptyl group, door-octyl group and the like.
  • the carbon number of the cycloalkyl group represented by is not particularly limited and is, for example, 3 to 10, preferably 4 to 10.
  • Specific examples of the cycloalkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, a cyclooctyl group and the like.
  • the ring formed by bonding two oxygen atoms together with the adjacent oxygen atom may be substituted with an alkyl group or the like.
  • alkyl group represented by 1 ⁇ and a linear lower alkyl group is usually adopted, and an ethyl group is preferably adopted.
  • the reactive group represented by “" is the same as the reactive group which may be contained in the above-mentioned group derived from an organic group or an inorganic material.
  • the amount of the compound represented by the general formula (2) used is represented by the general formula (3) as the number of moles of the functional group (in this case, an azide group) to be reacted, from the viewpoint of yield and the like.
  • the functional group in this case, an azide group
  • 0.1 to 5 mol is preferable, and 0.3 to 2 mol is more preferable, relative to 1 mol of the compound.
  • This reaction is usually performed in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, methanol, tetrahydrofuran, dioxane, dimethyl sulfoxide and the like.
  • the solvent may be used alone or in combination of two or more.
  • a buffering agent such as a phosphate buffering agent to the solvent.
  • the reaction is preferably around neutral, specifically 6 to 8.5 is preferable, 6.5 to 8 is more preferable, and 7 to 7.5 is further preferable. ⁇ 0 2020/175 680 17 ⁇ (: 171? 2020/008357
  • This reaction is preferably carried out in the presence of a suitable catalyst.
  • a suitable catalyst include a copper catalyst.
  • the copper catalyst include divalent copper such as copper sulfate and monovalent copper such as copper iodide.
  • a reducing agent eg, hydroquinone, sodium ascorbate
  • a ligand and the like can also be used.
  • the amount of the copper catalyst used is usually preferably 0.1 to 5 mol per 1 mol of the azido group-containing protein or peptide of the present invention.
  • an additive may be appropriately used within a range not significantly impairing the progress of the reaction.
  • the reaction temperature can be any of heating, normal temperature, and cooling, and is usually a temperature at which the azido group-containing protein or peptide of the present invention is not significantly denatured, for example, 0 to 45 ° ⁇ ( It is particularly preferable to carry out at 0 to 40 ° ⁇ ).
  • the reaction time is not particularly limited and can be usually 30 minutes to 3 hours, particularly 1 hour to 2 hours.
  • the progress of the reaction can be monitored by a usual method such as chromatography. After completion of the reaction, the solvent is distilled off, and if necessary, the product can be isolated and purified by a usual method such as a chromatography method or a recrystallization method. In addition, the structure of the product is Analysis, 1 (3 ⁇ 4 analysis, -It can be identified by using a mask.
  • This case is the same as case 1, except that an azidating agent for converting into the azido group is added to the reaction system.
  • azidating agent examples include inorganic azides such as sodium azide, sulfonyl azides, silyl azides, phosphoric acid azides, and alkyl ammonium azides.
  • the amount of the azidating agent to be used is usually 0.1 to 5 mol, and preferably 0.3 to 1 mol of the compound represented by the general formula (2). ⁇ 2 moles more preferred ⁇ 0 2020/175 680 18 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • the usage of the compound represented by the general formula (2) is represented by the general formula (4) as the number of moles of the functional group (in this case, an azide group) to be reacted, from the viewpoint of yield and the like. Usually, 0.1 to 5 mol is preferable, and 0.3 to 2 mol is more preferable, relative to 1 mol of the compound.
  • any solvent may be used as long as it does not adversely affect the reaction, and examples thereof include water, alcohol solvents (eg, methanol, ethanol, isopropanol, hydrogen butanol, trifluoroethanol, ethylene glycol, etc.), keton solvents.
  • alcohol solvents eg, methanol, ethanol, isopropanol, hydrogen butanol, trifluoroethanol, ethylene glycol, etc.
  • Solvents eg, acetone, methyl ethyl ketone, etc.
  • ether solvents eg, tetrahydrofuran, dioxane, diethyl ether, dimethoxyethane, diglyme, etc.
  • ester solvents eg, methyl acetate, ethyl acetate, etc.
  • aprotic polar Solvent eg acetonitrile, 1 ⁇ 1, dimethyl ⁇ 0 2020/175 680 19 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • Formamide dimethylsulfoxide, etc.
  • halogenated hydrocarbon solvents eg, methylene chloride, ethylene chloride, etc.
  • mixed solvents thereof Preferred is a mixed solvent of water and an aprotic polar solvent (particularly dimethylformamide).
  • Step 1 is usually performed in the presence of a base.
  • a base for example, an organic base can be used.
  • the organic base include trialkylamine (eg, trimethylamine, triethylamine, 1 ⁇ 1, 1 ⁇ 1-diisopropylethylamine, etc.), pyridine, quinoline, piperidine, imidazole, picoline, 4-dimethylaminopyridine, 1 ⁇ 1, 1 ⁇ 1 _Dimethylaniline, 1 ⁇ 1 _Methylmorpholine, 1,5-diazabicyclo [4.3.0] Noner 5-ene 81 ⁇ , 1,4-diazabicyclo [2.2.2] Octane 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undeca 7-en Etc.
  • the base may be used alone or in combination of two or more.
  • the base is preferably piperidine.
  • the amount thereof used is usually 0.05 to 1 mol, preferably 0.1 to 0.5 mol, relative to 1 mol of the compound represented by the general formula (4). ..
  • the reaction temperature is not particularly limited, and the reaction is usually performed under cooling, at room temperature, or under heating.
  • the reaction is preferably carried out at a temperature of 50 to 100 ° C, more preferably 70 to 90 ° C for 1 to 30 hours.
  • the solvent can be distilled off, and the product can be isolated and purified by a usual method such as a chromatography method or a recrystallization method.
  • the structure of the product is analysis, 130 (It can be identified by 3 ⁇ 4 etc.
  • step 2 the compound represented by the general formula (1′′) is reacted in the presence of a reducing agent and an appropriate amount of a salt group.
  • Examples of the reducing agent include sodium borohydride, zinc borohydride (anion) 2 ), triacetoxy tetramethylammonium borohydride, tritium ⁇ 0 2020/175 680 20 boxes (: 171? 2020/008357
  • Examples include 60-butyllithium borohydride, borane, borane ⁇ 1# complex, borane ⁇ dimethyl sulfide complex, lithium aluminum hydride, diisoeptyl aluminum hydride, lithium borohydride and the like. These reducing agents may be used alone or in combination of two or more. Preferred is sodium borohydride.
  • the amount of the reducing agent used is usually 1 to 15 mol, preferably 3 to 10 mol, based on 1 mol of the compound represented by the general formula (1′′′′).
  • an inorganic base can be used.
  • the organic base include alkali metal (eg, sodium and potassium), hydrogen carbonate, alkali metal (eg, lithium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, etc.), alkali metal hydroxide (eg, lithium hydroxide).
  • the base may be used alone or in combination of two or more.
  • the base is preferably an alkali metal lower (01 -04) alkoxide (especially sodium methoxide).
  • any solvent may be used as long as it does not adversely influence the reaction, and examples thereof include water, alcohol solvents (eg, methanol, ethanol, isopropanol, hydrogen butanol, trifluoroethanol, ethylene glycol, etc.), keton solvents.
  • alcohol solvents eg, methanol, ethanol, isopropanol, hydrogen butanol, trifluoroethanol, ethylene glycol, etc.
  • Solvents eg, acetone, methyl ethyl ketone, etc.
  • ether solvents eg, tetrahydrofuran, dioxane, diethyl ether, dimethoxyethane, diglyme, etc.
  • ester solvents eg, methyl acetate, ethyl acetate, etc.
  • aprotic polar Solvents eg, acetonitrile, 1 ⁇ 1, 1 ⁇ 1_ dimethylformamide, dimethylsulfoxide, etc.
  • halogenated hydrocarbon solvents eg, methylene chloride, ethylene chloride, etc.
  • mixed solvents thereof ⁇ 0 2020/175 680 21 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • Alcohol-based solvents particularly methanol are preferred.
  • the reaction temperature is not particularly limited, and the reaction is usually performed under cooling, at room temperature, or under heating. It is preferable to carry out the reaction for 1 to 30 hours under a temperature condition of preferably 0 to 60 ° , more preferably 10 to 40 ° .
  • the solvent can be distilled off, and the product can be isolated and purified by a usual method such as a chromatography method or a recrystallization method.
  • the structure of the product is analysis, 130 (It can be identified by 3 ⁇ 4 etc.
  • step 3 the compound represented by the general formula (1') is reacted in the presence of an oxidizing agent.
  • the oxidizing agent for example, manganese dioxide can be used.
  • selenium dioxide or 2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidine 1-year-old xyl (Ding £ ⁇ 0) and 2-azaadamantane-1 ⁇ 1-oxyl It is also possible to use nitroxyl radicals and the like.
  • the oxidizing agents may be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of the oxidizing agent used is usually 3 to 20 mol, preferably 5 to 15 mol, per 1 mol of the compound represented by the general formula (1').
  • any solvent which does not adversely influence the reaction may be used, and examples thereof include a ketonic solvent (eg, acetone, methyl ethyl ketone, etc.), an ether solvent (eg, tetrahydrofuran, dioxane, diethyl ether, dimethoxyethane).
  • a ketonic solvent eg, acetone, methyl ethyl ketone, etc.
  • an ether solvent eg, tetrahydrofuran, dioxane, diethyl ether, dimethoxyethane.
  • ester solvents eg, methyl acetate, ethyl acetate, etc.
  • aprotic polar solvents eg, acetonitrile, 1 ⁇ 1, 1 ⁇ 1-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, etc.
  • halogenated carbonization examples thereof include hydrogen-based solvents (eg, chloroform, methylene chloride, ethylene chloride, etc.) or mixed solvents thereof.
  • a halogenated hydrocarbon solvent particularly chloroform is preferable.
  • the reaction temperature is not particularly limited, and is usually under cooling, at room temperature, or under heating. ⁇ 0 2020/175 680 22 ⁇ (: 171? 2020/008357
  • the reaction is preferably carried out under the temperature condition of 0 to 60°, more preferably 10 to 40° for 1 to 30 hours.
  • the solvent can be distilled off, and the product can be isolated and purified by a usual method such as a chromatography method or a recrystallization method.
  • the structure of the product is analysis, 130 (It can be identified by 3 ⁇ 4 etc.
  • the compound represented by the general formula (1) after reacting the compound represented by the general formula (2) with the compound represented by the general formula (9), the compound represented by the general formula (1) is converted to the compound represented by the general formula (1) through several steps. Can be composed.
  • the compound represented by the general formula (1) can be synthesized by the ski ski below.
  • Step 4 can be performed according to or in accordance with Case 1 above.
  • Step 6 can be carried out according to or in accordance with Step 3 above.
  • Step 5 can be carried out by reacting the compound represented by the general formula (1**) with the compound represented by the general formula (10) ( ⁇ 3 _).
  • halogen for example, 18 (O 2) can be adopted as the group.
  • the reaction conditions in Step 5 are based on known information depending on the group and the group. Can be set. ⁇ 0 2020/175 680 23 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • the compound represented by the general formula (1) may be, for example, a compound represented by the general formula (5): (5) [wherein: is the same as above. 9 (and are the same or different and each represents a hydrogen atom or an alkyl group).
  • the alkyl group is not particularly limited and can be, for example, a lower alkyl group such as a methyl group or an ethyl group. And are preferably both hydrogen atoms.
  • the electron withdrawing group is not particularly limited, but for example, 1 ⁇ 10 2 , _de, 0 de 3 ,
  • the position of the electron-withdrawing group is preferably the para position in the case of 1 ⁇ 10 2 , for example, and the gent position and the meta position in the case of 0 and 3. preferable. In the latter case, more preferably the para position is 0 ⁇ 1.
  • [0109] 111 is preferably 1 if the electron-withdrawing group is 1 ⁇ 10 2 , for example, ⁇ 0 2020/175 680 24 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • the reaction can be sufficiently advanced even under relatively low temperature conditions (preferably 20 to 60°, more preferably 25 to 40°).
  • the linker is not particularly limited as long as it can connect the carrier to the benzene ring, and examples thereof include a linker having the following partial structure in the main chain.
  • the number of atoms constituting the main chain of the linker is, for example, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 20, or 1 to 10. ⁇ 0 2020/175 680 25 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • the carrier is not particularly limited.
  • the average particle size of the carrier particles is not particularly limited, but is preferably such a size that it can be easily precipitated in a solution.
  • it is 1 to 1 1, and preferably 10 to 100 111.
  • the material of the carrier particles is not particularly limited, and examples thereof include metal particles such as gold, silver, copper, iron, aluminum, nickel, manganese, titanium and oxides thereof; polystyrene, latex and the like. Resin particles; silica particles and the like can be mentioned.
  • the shape of the carrier particles is not particularly limited, and examples thereof include a sphere, a rectangular parallelepiped, a cube, a triangular pyramid, and the like, or shapes close to these.
  • the carrier particles may have a substance for facilitating the binding of another substance (for example, the binding substance 2 or the like) and/or making it stronger on the surface.
  • Examples of such a substance include substances having a reactive group such as an epoxy group, an amino group, a carboxy group, and an azide group; and an affinity for other molecules such as avidin, protein-8, protein-8 and the like.
  • Examples include substances.
  • the carrier particles may further contain a labeling substance.
  • the carrier particles may be only one kind or a combination of two or more kinds.
  • the amount of the compound represented by the general formula (5) is usually 0.1 to 1 mol based on 1 mol of the compound represented by the general formula (6). 5 mol is preferable, and 0.3-2 mol is more preferable.
  • any solvent which does not adversely influence the reaction may be used, and examples thereof include water, alcohol solvents (eg, methanol, ethanol, isopropanol, hydrogen butanol, trifluoroethanol, ethylene glycol, etc.), keton.
  • alcohol solvents eg, methanol, ethanol, isopropanol, hydrogen butanol, trifluoroethanol, ethylene glycol, etc.
  • -Based solvents eg, acetone, methyl ethyl ketone, etc.
  • ether-based solvents eg, tetrahydrofuran, dioxane, diethyl ether, dimethoxyethane, diglyme, etc.
  • ester-based solvents eg, methyl acetate, ethyl acetate, etc.
  • aprotic Examples include polar solvents (eg, acetonitrile, 1 ⁇ 1, 1 ⁇ 1 _dimethylformamide, dimethylsulfoxide, etc.), halogenated hydrocarbon solvents (eg, methylene chloride, ethylene chloride, etc.), or mixed solvents thereof.
  • a mixed solvent of water and an alcohol solvent is preferable.
  • the acid catalyst is not particularly limited, and examples thereof include acetic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) % 4-(2-hydroxyethyl). )-1-Piperazineethanesulfonic acid (HEPES), N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid (TAPS) and the like.
  • good buffer agents such as MES, MOPS, HEPES, and TAPS are preferable from the viewpoint of not inhibiting the subsequent protein modification reaction.
  • the reaction temperature is not particularly limited, and the reaction is usually performed under cooling, at room temperature, or under heating. It is preferable to carry out the reaction for 10 minutes to 30 hours under a temperature condition of about 20 to 100 ° C.
  • the solvent can be distilled off, and the product can be isolated and purified by a usual method such as a chromatography method or a recrystallization method.
  • the structure of the product can be identified by elemental analysis, MS (ESI-MS) analysis, IR analysis, ] H-NMR, 13 C-NMR and the like.
  • the compound represented by can be easily removed by a precipitation operation using a carrier. Therefore, the present invention, in one aspect thereof, is represented by the general formula (6′): ⁇ 0 2020/175 680 27 ⁇ (: 17 2020/008357
  • the modified molecule of the present invention is a compound or a compound represented by the following general formula (7) for linking another molecule/substance to the 1 ⁇ 1 end of a protein or peptide, or It is useful for producing a salt thereof, or a hydrate or solvate thereof. Therefore, the modifying molecule of the present invention can be suitably used as a reagent, particularly as an active ingredient of a reagent for modifying proteins and/or peptides.
  • the reagent is not particularly limited as long as it contains the modifying molecule of the present invention, and may further contain other components as necessary.
  • components are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable components, and examples include bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders. , Disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, fragrances, chelating agents and the like.
  • the present invention in one aspect thereof, is represented by the general formula (7)
  • 1 ⁇ 3 represents a group formed by removing a 1 ⁇ 1 terminal amino acid residue and one adjacent thereto from a protein or peptide.
  • the protein or peptide is particularly preferable as long as it is a protein or peptide in which the 1 ⁇ 1 terminal amino group is unmodified, and the second amino acid residue from the 1 ⁇ 1 terminal is an amino acid residue other than proline. Not limited.
  • the protein or peptide may have various modifications other than at the 1 ⁇ 1 end (eg, cysteine residue).
  • amino acid residue may be a natural amino acid residue or a synthetic amino acid residue.
  • an amino acid residue having a basic side chain such as lysine, arginine, or histidine; an acid side chain such as aspartic acid or glutamic acid.
  • the protein or peptide is not particularly limited, and may be natural or synthetic/artificial.
  • the protein or peptide may be chemically modified.
  • the protein or peptide may have any of (: a terminal of a carboxyl group (one ( ⁇ ⁇ ⁇ , carboxylate (-000-), an amide (1 ⁇ 2 ) or an ester (1 ⁇ 0).
  • the ester include, for example, ( ⁇ _ 6 alkyl groups such as methyl, ethyl, propopropyl, isopropyl, n-butyl; _ 8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl; for example, phenyl, "- naphthyl etc.
  • aryl group for example, benzyl, such as phenethyl Hue sulfonyl _ ( ⁇ _ 2 alkyl group; (3 ⁇ 4 _ naphthylmethyl etc. (such as 3 ⁇ 4 _ Nafuchiru ( ⁇ _ 2 alkyl Le group _ 14 aralkyl group; a bivaloyloxymethyl group is used, etc.
  • carboxyl group (or carboxylate) other than the terminal may be amidated or esterified. Examples of the tel include the above-mentioned terminal ester, etc.
  • substituents on the side chains of amino acids in the molecule for example, -0 ⁇ -5 ⁇ amino group, imidazole group, indole group
  • substituents on the side chains of amino acids in the molecule for example, -0 ⁇ -5 ⁇ amino group, imidazole group, indole group
  • Guanidino group, etc. are suitable protecting groups (eg formyl group, acetyl group, etc. ( ⁇ _ 6 alkanoyl) ⁇ 0 2020/175 680 30 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • the protein or peptide may be post-translationally modified, or post-translationally modified by artificial enzyme treatment or chemical modification.
  • Post-translational modifications include phosphorylation, 1 ⁇ 1-glycosylation, ⁇ -glycosylation, ⁇ glycosylation, phosphoglycosylation, glypision, Trosylation, methylation, 1 ⁇ 1-acetylation, Ristoylation, 3-prenylation, Examples include palmitoylation.
  • the protein or peptide may be a known protein tag, a protein or peptide such as a signal sequence, or a protein to which a labeling substance is added.
  • protein tags for example, Piotin, tags, do!_80 tags, 10 tags, tags, Examples include tags, 5 tags, 8 tags, and 3 tags.
  • Examples of the signal sequence include a nuclear localization signal and the like.
  • the protein or peptide may be present as a single molecule alone, or may be linked to another molecule to form a complex.
  • the protein or peptide can be a protein or peptide present on the cell surface, a protein or peptide in the cell lysate, or a protein or peptide carried on some substance.
  • the mode of the connection is not particularly limited, but examples thereof include hydrogen bond, electrostatic force, van der Waalsca, hydrophobic bond, covalent bond, and coordinate bond.
  • the protein or peptide may be fragmented by an enzyme or a chemical reaction as long as it has a 1 ⁇ 1 end.
  • the 1 ⁇ 1 terminal may be demodified by an enzyme or a chemical reaction.
  • the compound represented by the general formula (7) includes stereoisomers and optical isomers, and these are not particularly limited.
  • the salt of the compound represented by the general formula (7) is not particularly limited.
  • an acidic salt or a basic salt can be adopted.
  • acidic salts include inorganic salts such as hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, nitrates, perchlorates and phosphates; acetates, propionates, tartrates, fumarates, maleates. ⁇ 0 2020/175 680 31 ⁇ (: 171? 2020/008357
  • Organic acid salts such as phosphates, malates, citrates, methanesulfonates, and paratoluenesulfonates are listed, and examples of basic salts include alkali metals such as sodium salts and potassium salts. Salts; and alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; salts with ammonia; morpholine, piverine, pyrrolidine, monoalkylamines, dialkylamines, trialkylamines, mono(hydroxyalkyl)amines, di(hydroxyalkyl)s ) Amine, salts with organic amines such as tri(hydroxyalkyl)amine, and the like.
  • the compound represented by the general formula (7) may be a hydrate or a solvate.
  • the solvent include organic solvents (eg ethanol, glycerol, acetic acid, etc.) and the like.
  • the compound represented by the general formula (7) can be synthesized by various methods.
  • the compound represented by the general formula (7) can be produced by a method including a step of reacting a protein or peptide with the modified molecule of the present invention.
  • This reaction may be a continuous reaction with the synthetic reaction of the modified molecule of the present invention (particularly preferably, the reaction of the above-mentioned "1-2. Synthetic method 2").
  • the reaction mixture obtained in the synthesis reaction of the modified molecule of the present invention can be diluted with the solvent used in this reaction before the present reaction.
  • the amount of the modified molecule of the present invention to be used is usually preferably 5 to 400 mol per 1 mol of the protein or peptide.
  • This reaction is usually performed in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent is not particularly limited, and examples thereof include water.
  • the solvent may be used alone or in combination of two or more. Further, it is preferable to add a buffering agent such as a phosphate buffering agent to the solvent.
  • a buffering agent such as a phosphate buffering agent to the solvent.
  • this reaction is preferably around neutral, specifically 6 to 8.5, more preferably 6.5 to 8, and 7 ⁇ 7.5 is more preferable.
  • an additive may be appropriately used within a range that does not significantly impair the progress of the reaction. ⁇ 0 2020/175 680 32 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • the reaction temperature can be any of heating, normal temperature and cooling, and is usually a temperature at which the protein or peptide is not significantly denatured, for example, 0 to 45° ⁇ (particularly 0 to 40° ⁇ ). ) Is preferable.
  • the reaction time is not particularly limited,
  • the progress of the reaction can be followed by a conventional method such as chromatography. After completion of the reaction, the solvent is distilled off, and if necessary, the product can be isolated and purified by a usual method such as a chromatography method or a recrystallization method. In addition, the structure of the product is Analysis, 1 (3 ⁇ 4 analysis, -It can be identified by using a checker.
  • a compound represented by In this case, an organic molecule or the like can be linked by further forming an oxime with hydroxylamine. That is, the compound represented by the general formula (1 88) and the general formula (8) [In the formula
  • a compound represented by can be synthesized.
  • the conditions and the like of this synthetic reaction can be determined according to or in accordance with the known reaction conditions for forming an oxime with hydroxylamine starting from an aldehyde.
  • This reaction can be applied to protein modification because it proceeds in water under mild conditions.
  • the complex substance of the present invention has a structure in which another substance is linked to a protein or peptide, and in various fields depending on the substance to be linked, for example, antibody-drug conjugate, It can be used as a labeled protein reagent, a protein-immobilized inorganic material, a fusion protein in which proteins are linked, a protein in which nucleic acids are fused, and the like.
  • the substance linked to the protein or peptide can be designed to gradually dissociate. Therefore, for example, after administering the complex substance of the present invention in which a drug is linked to a protein or peptide to a living body, the drug is gradually dissociated from the complex substance of the present invention in the living body, It is possible to gradually release the drug in the living body.
  • the composite substance of the present invention has a reactive group (for example, [ ⁇ 3 has a reactive group
  • a reactive group for example, [ ⁇ 3 has a reactive group
  • other substances for example, organic molecules, organic molecule composites
  • azido groups eg, Hyusugen cycloaddition reaction, strain-promoted azide-alkyne cycloaddition reaction, Staud Inger-Bertozz i ligation. It is useful for connecting body, inorganic material, etc.).
  • the nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum was measured using a Bruker AVANCE III HD nuclear magnetic resonance apparatus, and the chemical shift was calculated using the residual signal of the measurement solvent as an internal standard.
  • a Bruker micrOTOF focus III mass spectrometer was used for time-of-flight mass spectrometry (ESI-TOF MS) by electrospray ionization, and methanol or acetonitrile (both HPLC grade) was used as the mobile phase.
  • FT-IR Fourier transform infrared absorption
  • Compound 1 was synthesized according to the following scheme.
  • Compound 2 (yellow solid) was synthesized by using Method A using 4-azidobenzoic acid as a precursor in the same manner as in Example 1-3-1.
  • Figure 1 shows the 1 H NMR spectrum.
  • a mixed solution of an aqueous solution (7.5 mL) of copper (II) sulfate pentahydrate (47.8 mg, 0.19 mmol) and t-butyl alcohol (7.5 mL) was cooled to 0 °C and stirred under nitrogen atmosphere.
  • Sodium chloride (103 mg, 1.6 mmol) was added.
  • benzyl bromide (179 ML, 1.5 mmol) and propargyl aldehyde diethyl acetal (240 fxl 1.7 mmo ⁇ ) were added to the mixture, and the mixture was allowed to stand at 70°C for 24 hours at room temperature in air.
  • Compound 8 (white solid) was synthesized by using Method B in the same manner as in Example 2-1 using 2-(bromomethy l)naphthalene as a precursor.
  • Figure 1 shows the 1 H NMR spectrum.
  • the reaction solution was air-cooled to room temperature, diluted with saturated aqueous sodium chloride solution (40 mL), and extracted with ethyl acetate (50 mL X 3).
  • the obtained organic layer was dried over magnesium sulfate, the solid was filtered off, and the filtrate obtained was evaporated under reduced pressure to dissolve the crude product in chloroform (3 mL), and then pure water (3 mL) and trifluoroacetic acid ( 3 mL) was added, and the mixture was vigorously stirred at room temperature.
  • the mixture was diluted with saturated aqueous sodium chloride solution (30 mL), and the organic layer was extracted with chloroform (30 mL X 3).
  • Phenyl azide 120 11 ⁇ , 1.0 11111100 dimethylformamide (100!), pure water mixed with ethyl acetoacetate (1.5 11111100 and piperidine (20 0.2).
  • the equipment, reagents, solvents, etc. used are the same as in Example 1.
  • the reaction precursor used was purchased or appropriately synthesized.
  • Compound 18 (white solid) is 1 ⁇ 1-(2-(2-(2-(2-(2-(2--3 ⁇ ⁇ 1 ⁇ 61;11 ⁇ ) 61;11 ⁇ ) 61;11 ⁇ ).
  • 61;11 1111 ' ⁇ 3 ⁇ ⁇ 1-4- 1) was synthesized by using the same method as in Example 1-3-1 (1 ⁇ ⁇ 018) with the precursor of 6 ⁇ 6 ⁇ 3 ⁇ 8111.1 ⁇ 16 as a precursor.
  • Figure 1 shows the 1 H screen (3 ⁇ 4 spectrum).
  • Compound 21 (yellow oil) was prepared using 1-az id ⁇ -2-(2-(2-(2-az idoethoxy)ethoxy) eth oxy)ethane as a precursor and was the same as Example 1-3-1. It was synthesized using the method (Method A). Figure 17 shows the i H NMR spectrum.
  • the ultrapure water used was purified by MiUipore Integra 13. Other reagents As the solvent, a commercially available product was used as it was.
  • N-terminal of the peptide is targeted.
  • Peptides that can be used are those in which the N-terminal amino group is unmodified, and the second amino acid residue from the N-terminus is an amino acid other than proline.
  • N-terminal modification of angiotensin I is shown.
  • Figure 20 shows the results of the 1 H screen (3 ⁇ 4 spectrum) of compound 25 in deuterated acetonitrile.
  • Bovine spleen-derived ribonuclease 8 (1 ⁇ 336) was purchased from ( ⁇ 0 ( ⁇ 6 company. The ultrapure water used was purified by 1 ⁇ _
  • the protein 1 ⁇ 1 end is targeted.
  • Proteins that can be used are those in which the 1 ⁇ 1 terminal amino group is unmodified, and the second amino acid residue from the 1 ⁇ 1 terminal is an amino acid other than proline.
  • the 1 ⁇ 1 terminal modification of bovine spleen-derived ribonuclease (1 ⁇ 336) is shown.
  • Bovine spleen-derived ribonuclease A (RNase) was purchased from Roche. The ultrapure water used was purified by MiUipore Integra 13. Other reagents ⁇ Commercially available products were used as solvents.
  • a fluorescent dye here, a fluorescein molecule
  • a fluorescein molecule was modified at the N-terminal of the protein by the same method as in Example 10-2.
  • the results of LC/MS analysis of the product are shown in Figure 23.
  • the modification rate of the fluorescent dye moiety was calculated to be 73%.
  • the fluorescent dye was modified by strain-promoting alkyne-azide cycloaddition reaction with respect to 1 ⁇ 336 modified with an azido group prepared in Example 11-4.
  • Compound 26 a fluorescein having a dibenzocyclooctyne moiety as an alkyne substrate, was used in the reaction.
  • Figure 25 shows the scheme and results.
  • the modification rate of the fluorescent dye moiety was calculated to be 55%.
  • Compound 22 was used as a modifier, and the distorted alkyne site at the protein 1 ⁇ 1 terminal end was modified in the same manner as in Example 10-2.
  • Product Figure 26 shows the results of the analysis. The modification rate of the cyclooctyne site was calculated to be 40%.
  • Azido/PS resin (220 mg) was swollen with a DMF/water mixed solution (6:1, 7 mL), and then copper (II) sulfate pentahydrate (25 mg, 0.1 mmol) and ascorbine were added.
  • Sodium acid salt 40 mg, 0.2 mmol
  • propargyl aldehyde diethylacetate 356 ML, 2.5 mmol
  • the resin was filtered and washed with dimethylformamide, pure water, chloroform, methanol, and acetone in this order.
  • N-terminal modifying agent Using the prepared reactive agent-immobilized resin (27/PS resin), an N-terminal modifying agent was prepared and a continuous protein N-terminal modification was performed. As a specific example, N-terminal modification of ribonuclease A (RNase A) is shown.
  • RNase A ribonuclease A
  • 27/PS resin (5 mg) was added, and the mixture was heated at 100 °C for 90 minutes using a heat block. After air-cooling to room temperature, dilute the supernatant (10 ML, 1 Mmol) with phosphate buffer solution (10 mM, pH 7.5, 85), and add RNase A solution (1 mM, 5 mM) to it. 5 nmol) was added, and the mixture was shaken at 37°C for 16 hours. After the reaction, modification evaluation using LC/MS was performed. Even when the reagent immobilized with the reactant (27/PS resin) was used, the same modification rate (75%) was obtained as when using the isolated and purified N-terminal modifier. Based on the above, a method for protein N-terminal modification by a continuous reaction using a reagent-immobilized resin (27/PS resin) was demonstrated. The results are shown in Figure 31.
  • Example 12-3 in the protein-modified sample, a product in which oxygen was added to the protein was found. This is probably because the copper catalyst used for resin synthesis remained on the resin. Therefore, 27/PS resin was created under a new synthetic scheme and applied to protein modification. Specifically, 27/PS resin was prepared according to the scheme shown in Fig. 32.
  • Aminomethyl polystyrene resin (8111_1 ⁇ 011161;11 /?3 " ⁇ , 200 (After being dispersed in 5, shaken for 1 hour to swell. In the dispersion liquid of resin, 30 (150 1119, 0 4211111101) and 1 ⁇ 1, 1 ⁇ 1'-isopropylcarbodi (146 ⁇ ,1, 0 8411111101) was added and shaken overnight. The resin after the reaction was filtered, washed with dimethylformamide-pure water ⁇ chloroform and acetone in this order, and dried under reduced pressure.
  • Example 13 Synthesis of protein modifier using 0_1111" ⁇ 11 rearrangement reaction in homogeneous system and continuous protein modification
  • Example 12 Construction of a new 1 ⁇ 1 terminal selective modifier by rearrangement reaction between compound 10 and amine precursor shown in Example 6 is useful as a clean reaction without using copper catalyst.
  • 01 11 “ ⁇ rearrangement reaction was shown in a heterogeneous system to simplify the removal of by-products.
  • mixing of the by-product aniline derivative does not pose a problem. Therefore, in this section, we show the synthesis of a carboaldehyde derivative by the _1111 " ⁇ rearrangement reaction in a homogeneous system and continuous protein modification. The scheme is shown in Fig. 37.
  • Bovine spleen-derived ribonuclease 8 (1 ⁇ 336) was purchased from [3 ⁇ 40 ( ⁇ 6 company.
  • Figure 38 shows the reaction mechanism of the rearrangement reaction. Since this reaction has imine formation in the first stage, the addition of acid catalyst can be expected to improve the reaction efficiency. Therefore, in the presence of various acid catalysts, benzylamine was used as a model substrate for rearrangement reaction with compound 10.
  • Protein functional modifiers were prepared using various functional amine precursors such as alkyne, azido, and fluorescent dyes, and the introduction at the 1 ⁇ 1 end of protein was achieved.
  • a modification rate similar to that obtained by using the isolated and purified 1 ⁇ 1 terminal modifying agent was obtained. Based on the above, we demonstrated a protein 1 ⁇ 1 terminal modification method by a continuous reaction using the 01 (11" 0 rearrangement reaction in the homogeneous system.
  • Example 14.8 Function by molecular modification of protein ! ⁇ ! end and oxime formation
  • a diamine having amino groups at both ends as a precursor in the transposition a molecule (hereinafter referred to as “8 _ 13 -Choyo 4 (:”) in which the Chodai site is introduced at both ends is obtained.
  • Protein 1 ⁇ 1 terminal modification using this Choho An aldehyde site can be introduced at the 1 ⁇ 1 end of protein.
  • An aldehyde-based chemical modification reaction includes oxime formation with hydroxyxylamine.This reaction also proceeds in water under mild conditions. Therefore, it is also applicable to protein modification.Because the oxime bond is a dynamic bond, it is possible to remove a functional molecule as necessary.
  • the protein modification reaction was performed by _1111 “ ⁇ 1;11 rearrangement reaction using compound 10.
  • Bovine spleen-derived ribonuclease 8 (1 ⁇ 336) was purchased from [3 ⁇ 40 ( ⁇ 6 company.
  • the oxime formation reaction was carried out starting from the aldehyde site introduced at the 1 ⁇ 1 end of the protein by 8 ⁇ 3-Chohei 4 (:.
  • the reaction was carried out according to the procedure shown in Fig. 43 with reference to 98 6 ( ⁇ 6111. 2013, 24, 333-342). As an example, fluorescent dye and polyethylene glycol modification are shown.
  • triazolecarboaldehyde 40 having a 4-cyanotetrafluorophenyl group is shown.
  • Acetonitrile solution (100!) containing sodium (260 1 ⁇ , 4.0 1111110 1) was stirred for 16 hours at 60 ° in a nitrogen atmosphere. Subsequently, under a nitrogen atmosphere, propargyl aldehyde di-ethyl acetal (570 1x1, 4. 0 1111110 1 ) and copper (I) iodide and (76 1119, 0 ⁇ 4 1111110 [) was added and 16 h at room temperature. After air-cooling the reaction solution to room temperature, saturated sodium chloride aqueous solution It was diluted with and extracted with ethyl acetate (50 1111_X3).
  • HSA human serum albumin
  • HSA Human serum-derived albumin
  • the N-terminal of the protein is targeted.
  • the target proteins are those in which the second amino acid residue from the N-terminal is an amino acid other than proline.
  • N-terminal modification of albumin derived from human serum (HSA) is shown.
  • the protein N-terminal was modified in the same manner as in Example 10-2.
  • the results of LC/MS analysis of the product are shown in Figure 50.
  • the modified protein is designated as HSA1.
  • the modification rate under this reaction condition was calculated to be 99% or more. If necessary, the products after the reaction were purified by size exclusion chromatography.
  • Example 17-2 The HSA2 produced in Example 17-2 was subjected to protein N-terminal modification with Compound 7.
  • Figure 52 shows the scheme and results. ⁇ 0 2020/175 680 65 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • Phosphate buffer solution containing 82 (82 concentration 200 Final concentration 50 To the buffer solution concentration of 10 1 ⁇ , pH 7.5, 19 !7), add a solution of compound 7 in dimethyl sulfoxide 1!/1 ⁇ ) (200 (1 ⁇ , 1 final concentration 10 1 ⁇ ), and add 37 ° C . It was shaken for 16 hours at ⁇ . The modified protein is indicated as 83. The modification rate under this reaction condition was calculated to be 72%.
  • Example 18 Stability of modified protein at the ! ⁇ ! end#
  • Buffer solution concentration 100 11 ⁇ , pH 7.0, 10) The mixture was diluted with pH 7.0, 90 1_) and allowed to stand at 37 ° for 12 hours, 24 hours, and 48 hours, respectively. For example, after standing for 24 hours The results of the analysis are shown in Figure 53.
  • Buffer solution concentration 100 11 ⁇ , pH 7.0, 10 !...) so that each becomes 4, 5, 6, 7, 8 It was diluted with 90 !.) and left at 37 ° for 12 hours each.
  • ⁇ ⁇ 82% (3 ⁇ 4 (400 1 ⁇ , 01 ⁇ 0 6 ): 3 ,7.42-7.33 (111, 3 ,7.24-7.
  • Compound 45 (pale yellow solid) was synthesized by using 4-methoxyphenylboronic acid as a precursor in the same manner as in Example 19-1-2.
  • Figure 59 shows a 1-section (3 ⁇ 4 spectrum.
  • Compound 50 (pale yellow solid) is compound 49 and 2-(4-(3 ⁇ ⁇ 1116 4 6 1)-4, 4, 5, 5-shi 61; ⁇ 811161; 11 1-1, 3, 2-6 ⁇ 0X81)0" was carried out on a precursor by the same method as in 19-1 -2.
  • Figure 64 shows the 1 H spectrum (3 ⁇ 4 spectrum).
  • the peptide N-terminal modification was carried out with reference to a previous report (I. MacDonald, H. K. Munch, T. Moore, M. B. Francis, Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 326-331). The specific experimental terms are shown below.
  • Example 22 Function on the end of protein ! ⁇ !#Molecular modification
  • Double-modifying the acetyl group and the azido group to the protein 1 ⁇ 1 terminal was performed by the same method as in Example 21, using compound 51 as a modifier.
  • Product Figure 68 shows the result of the analysis. The modification rate of acetyl group and azido group was calculated to be 28%.
  • the fluorescent dye was modified by strain-promoting alkyne-azide cycloaddition reaction with respect to 1 ⁇ 336 modified with an azido group prepared in Example 22-1.
  • Compound 26 a fluorescein having a dibenzocyclooctyne moiety as an alkyne substrate, was used in the reaction.
  • Figure 69 shows the scheme and results.
  • the modification rate of the fluorescent dye moiety was calculated to be >99%.
  • Example 23 Introduction of polymer molecule into the end of protein ! ⁇ !
  • Polyethylene glycol 54 having a triazolecarbaldehyde moiety introduced was synthesized. Previous report (See. .8 ⁇ ⁇ ,8 ⁇ ⁇ . ⁇ ! ⁇ 1 ⁇ 1; ⁇ £ ⁇ !., 2015, 54, 15739-15743 and 1 ⁇ £ 1 ⁇ 1.1 ⁇ ,
  • Polyethylene glycol was modified at the N-terminus of the protein using Compound 54. Examples using ribonuclease as a substrate are shown below.
  • Bovine spleen-derived ribonuclease A (RNase) was purchased from Roche. The ultrapure water used was purified by MiUipore Integra 13. Other reagents ⁇ Commercially available products were used as solvents. ⁇ 0 2020/175 680 76 ⁇ (: 171? 2020 /008357
  • the protein 1 ⁇ 1 terminal end was modified with polyethylene glycol in the same manner as in Example 10-2.
  • Product The results of the analysis are shown in Figure 72.
  • the modification rate of the polyethylene glycol moiety was calculated to be 50%.
  • Compound 54 was used as a modifier, and polyethylene glycol modification was carried out to the end of the protein ! ⁇ ! of 82 by the same method as in Example 17-3.
  • the compound (26) was used to prepare a strain-promoting alkyne_azide compound for the 8 (denoted as 84) in which the cysteine residue was modified with an azido group and the 1 ⁇ 1 end was modified with polyethylene glycol.
  • the fluorescent dye was modified by a cycloaddition reaction.
  • the modified protein is indicated as 85.

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Abstract

天然のタンパク質等に対しても、N末端に対してより選択性に他分子／物質を簡便且つ効率的に連結することができる技術を提供することを課題とし、該課題を、一般式（1）で表される化合物、若しくはその塩、又はこれらの水和物若しくは溶媒和物と、タンパク質及び／又はペプチドとを反応させること、により解決する。

Description

明 細 書
発明の名称 ： タンパク質及び/又はペプチド修飾用分子
技術分野
[0001] 本発明は、 タンパク質及び/又はペプチド修飾用分子等に関する。
背景技術
[0002] タンパク質及び/又はペプチド （以下、 「タンパク質等」 と示すこともあ る。 ） に対して他分子/物質を連結させる技術は、 抗体ードラッグコンジュ ゲート、 蛍光プローブをラベリングしたタンパク質試薬、 タンパク質固定化 無機材料等の作製において重要な技術である。 例えば、 タンパク質等に対す るアジド基修飾は、 アルキンーアジド環化付加反応 （CuAAC） による様々な機 能性分子の導入を可能にするための技術であり、 生体直交性を有しているた め、 バイオイメージング等の分野で広く応用されている。
先行技術文献
非特許文献
[0003] 非特許文献 1 : MetaL-free and pH-contro L Led introduction of azides in p rote i ns, Sanne SchoffeLen, Mark B. van ELdijk, Bart Roo i jakkers, Rein out Ra I jmakers, Albert J. R. Heck and Jan C. M. van Hest, Chemical Sc ience, 2011, 2, 701
非特許文献 2 : Selective N-terminal acylation of peptides and proteins with a GLy-His tag sequence, M. C. Martos-Ma Ldonado, C. T. Hjuler, K.
K. Sorensen, M. B. Thygesen, J. E. Rasmussen, K. Vi lladsen, S. R. Mi dtgaard, S. KoL, S. SchoffeLen, K. J. Jensen, Nature Communication, 2 018, 9, 3307.
非特許文献 3 : Modification of N-Terminal a -Ami no Groups of Peptides a nd ProteinsUsing Ketenes, A. 0. -Y. Chan, C. -M. Ho, H. -C. Chong, Y. -C. Leung, J. -S. Huang, M.-K· Wong, C.-M· Che, Journal of American Chemi cal Society, 2012, 134, 2589. \¥0 2020/175680 2 卩（：17 2020 /008357 発明の概要
発明が解決しようとする課題
[0004] タンパク質等に他分子/物質を連結する場合の導入位置について検討を進 める中で、 本発明者は次の 3点に着目した。 1点目は、 1\1末端は全ての単量体夕 ンパク質が 1つのみ有する位置であり、 普遍的な修飾基点となる点である。 2 点目は、 タンパク質活性部位 （分子結合部位 ·触媒反応中心） やタンパク質 機能部位に 1\1末端が関わることは少なく、 修飾に伴った構造変化などによる影 響が小さいと考えられる点である。 3点目は、 1\1末端は、 卩 の差異から他のア ミノ酸残基 （リシン、 システイン、 グルタミン等） と反応が競合しにくいと 考えられる一方、 （：末端では、 このような に基づく反応選択性の発現が困難 であると考えられる点である。 そこで、 本発明者は、 他分子/物質を連結す る位置として、 タンパク質等の 1\1末端に着目した。
[0005] これまでにもタンパク質等の 1\1末端に他分子/物質を連結する手法が各種報 告されているものの （非特許文献 1〜 3） 、 これらはその簡便性、 又は 1\1末端 修飾選択性において不十分であると考えられた。 例えば、 特定のアミノ酸配 列を認識した化学結合法あるいは脂質修飾酵素法では、 ！\!末端特異的に他分子 /物質を導入できるものの、 特殊なアミノ酸配列又は特殊なアミノ酸残基が揷 入されたタンパク質等を用いる必要があるので、 その調製に労力を要し、 ま た天然のタンパク質等に対して適用することができない。 また、 活性化エス テルやケテンを用いたアミ ド結合形成反応は、 操作は簡便であり、 天然の夕 ンパク質等に対しても適用できるものの、 リジン残基等との副反応が進行し うるため、 1\1末端特異的に他分子/物質を導入することができない。
[0006] そこで、 本発明は、 すべてのタンパク質及び/又はペプチドの 1\1末端に対し てより選択性に他分子/物質を簡便且つ効率的に連結することができる技術 を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、 一般式 （1） で表され る化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物と、 タン \¥0 2020/175680 3 卩（：171? 2020 /008357
パク質及び/又はべプチドとを反応させることにより、 上記課題を解決でき ることを見出した。 この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、 本発明が 完成した。
[0008] 即ち、 本発明は、 下記の態様を包含する。
[0009] 項 1 . _般式 （1） :
[0010] [化 1 ]
Figure imgf000004_0001
[001 1 ]
Figure imgf000004_0002
Vの内、 一方は一 （一 一 は有機基、 又は無機材料由来 の基を示す。 ） を示し、 他方は = 1\1 _を示す。 は水素原子、 有機基、 又は無 機材料由来の基を示す。 ]
で表される化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物
[0012] 項 2 . 前記化合物が、 一般式 （1八）
[0013] [化 2]
Figure imgf000004_0003
[0014] は前記に同じである。 ]
で表される化合物である、 項 1 に記載の化合物、 若しくはその塩、 又はこれ らの水和物若しくは溶媒和物。
[0015] 項 3 . 前記有機基が有機分子又は有機分子複合体由来の基であり、 且つ 該有機分子又は有機分子複合体が機能性物質である、 項 1又は 2に記載の化 合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物。
[0016] 項 4 . 前記機能性物質が、 医薬化合物、 発光分子、 高分子化合物、 リガ \¥0 2020/175680 4 卩（：171? 2020 /008357
ンド、 リガンド結合対象分子、 抗原タンパク質、 抗体、 タンパク質、 核酸、 糖類、 脂質、 細胞、 ウイルス、 標識、 力ーボン電極、 力ーボンナノ材料、 リ ンカー、 若しくはスぺーサー分子、 又はこれらの複合体若しくは連結分子で ある、 項 3に記載の化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは 溶媒和物。
[0017] 項 5 . 前記無機材料が電極材料、 金属微粒子、 金属酸化微粒子、 半導体 粒子、 又は磁性粒子である、 項 1〜 4のいずれかに記載の化合物、 若しくは その塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物。
[0018] 項 6 . 項 1〜 5のいずれかに記載の化合物、 若しくはその塩、 又はこれ らの水和物若しくは溶媒和物を含有する、 試薬。
[0019] 項 7 . タンパク質及び/又はペプチド修飾用試薬である、 項 6に記載の 試薬。
[0020] 項 8 . —般式 （2）
Figure imgf000005_0001
[式中： は有機基又は無機材料由来の 基を示す。
Figure imgf000005_0002
一X （Xはハロゲン原子を示す。 ） 、 一 8 （〇 2、 一8 （0（¾ 51） 2 （ は同一又は異なって、 炭化水素基を示す。 但し、 2つの は共に結合 して、 隣接する酸素原子と共に環を形成していてもよい。 ） 、 又は一! Vを示 す。 ] で表される化合物又はその塩と、 一般式 （3） で表される化合物、 一般 式 （4） で表される化合物、 又は一般式 （9） で表される化合物：
[0021 ] [化 3]
Figure imgf000005_0003
[0022] [式中：
Figure imgf000005_0004
は水素原子、 有機基、 又は無機材料由来の基を示す。 （^、
Figure imgf000005_0005
は同一又は異なって、 アルキル基を示す。 丫は反応性基を示す。 ]
とを反応させる工程を含む、 項 1〜 5のいずれかに記載の化合物、 若しくは \¥0 2020/175680 5 卩（：171? 2020 /008357
その塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物を製造する方法。
［0023］ 項 9 . 一般式 （5） : （5） ［式中： は有機基又は無機材料由来の 基を示す。
Figure imgf000006_0001
基を示す。 ） を示す。 ］ で表される化合物と、 _般式 （6） :
[0024] [化 4]
Figure imgf000006_0002
［0025］ ［式中、
Figure imgf000006_0003
は単結合又はリンカ —を示す。 1^2は担体を示す。 ） を示す。 门は 0又は 1を示す。 （11は 1〜 5の整数を 示す。 ］
で表される化合物とを反応させる工程を含む、 項 1〜 5のいずれかに記載の 化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物を製造する 方法。
[0026] 項 1 0 . -般式 （6’ ）
[0027] [化 5]
Figure imgf000006_0004
［0028］ ［式中、
Figure imgf000006_0005
は電子求引性基を示す。 は単結合又はリンカーを示す。 1^2は担 体を示す。 111は 1〜 5の整数を示す。 ］
で表される化合物。 \¥0 2020/175680 6 卩（：17 2020 /008357
[0029] 項 1 1 一般式 （7）
[0030] [化 6]
Figure imgf000007_0001
[0031 ]
Figure imgf000007_0002
Vの内、 一方は一 （一 一 は有機基、 又は無機材料由来 の基を示す。 ） を示し、 他方は = 1\1 _を示す。 は水素原子、 有機基、 又は無 機材料由来の基を示す。 点線と実線とからなる二重線は単結合又は二重結合 を示す。
Figure imgf000007_0003
はタンパク質又はべプチドから 1\1末端アミノ酸残基及びそれに隣接 する一
Figure imgf000007_0004
が除かれてなる基を示す。
Figure imgf000007_0005
は前記タンパク質又はべプチドの 1\1末 端アミノ酸残基の側鎖を示す。 ]
で表される化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物
[0032] 項 1 2 . タンパク質及び/又はペプチドと、 項 1〜 5のいずれかに記載 の化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物とを反応 させる工程を含む、 項 1 1 に記載の化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの 水和物若しくは溶媒和物を製造する方法。
発明の効果
[0033] 本発明によれば、 天然のタンパク質等に対しても、 1\1末端に対してより選択 性に他分子/物質を簡便且つ効率的に連結することができる技術を提供する ことができる。
図面の簡単な説明
[0034] [図 1 ]化合物 1の1 關（¾スぺクトル （400 11/^, 01^0 6） を示す。 \¥02020/175680 7 卩（：171? 2020 /008357
［図 2］化合物 2の 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0001
を示す。
［図 3］化合物 3の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0002
を示す。
［図 4］化合物 4の 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0003
00013) を示す。
［図 5］化合物 5の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0004
01^0 6) を示す。
［図 6］化合物 6の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0005
01^0 6) を示す。
［図 7］化合物 7の 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0006
01^0 6) を示す。
［図 8］化合物 8の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0007
00013) を示す。
［図 9］化合物 9の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0008
01^0 6) を示す。
［図 10］化合物 10の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0009
01^0 6) を示す。
［図 11］化合物 13の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0010
01^0 6) を示す。
［図 12］化合物 16の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0011
01^0 6) を示す。
［図 13］化合物 17の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0012
003〇\1) を示す。
［図 14］化合物 18の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0013
003〇\1) を示す。
［図 15］化合物 19の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0014
003〇\1) を示す。
［図 16］化合物 20の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0015
0030〇 を示す。
［図 17］化合物 21の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0016
0030〇 を示す。
［図 18］化合物 22の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0017
003〇\1) を示す。
［図 19］アンジオテンシン I の 1\1末端修飾反応の反応スキーム及び結果を示す (実施例 8) 。
［図 20］化合物 25の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000008_0018
003〇\1) を示す。
［図 21］［^336 八の!\!末端修飾反応の反応スキーム及び結果を示す (実施例 10)
［図 22］［^336 八へのピオチン修飾の反応スキーム及び結果を示す (実施例 11 -2
［図 23］［^336 八への蛍光色素修飾の反応スキーム及び結果を示す (実施例 11 -3
［図 24］［^336 八へのアジド基の修飾の反応スキーム及び結果を示す (実施例 11 -4) 〇 ［図 25］ひずみ促進型アルキンーアジド環化付加反応による蛍光色素の修飾の 反応スキーム及び結果を示す （実施例 1 1 -5） 。
［図 26］RNase Aへのひずんだアルキン部位の修飾の反応スキーム及び結果を示 す （実施例 1 1 _6） 。
［図 27］種々のカルボアルデヒド前駆体を樹脂あるいは固体材料上に固定化す ることで、 反応後生じる副生物 （アニリン誘導体） の除去を簡便にし、 反応 後の溶液をタンパク質 N末端修飾に直接利用する手法の概要を示す （実施例 12
［図 28］化合物 27および化合物 27を固定化した樹脂を示す （実施例 12） 。
［図 29］27/PS res i nの合成スキームを示す （実施例 12-2） 。
［図 30］赤外分光法を用いた樹脂の同定結果を示す （実施例 12-3） 。 右は、 拡 大図。
［図 31］反応剤固定化樹脂 （27/PS res i n） を用いた連続反応による N末端修飾 を行った RNaseAの LC/MS解析結果を示す （実施例 12-4） 。
［図 32］27/PS res i nの合成スキームを示す （実施例 12-5） 。
［図 33］化合物 28の1 H NMRスぺク トル （400 MHz, DMS〇-d6） を示す。
［図 34］化合物 30の1 H NMRスぺク トル （400 MHz, DMS〇-d6） を示す。
［図 35］反応剤固定化樹脂 （27/PS res i n） を用いた連続反応による N末端修飾 のスキームを示す （実施例 12-6） 。
［図 36］反応剤固定化樹脂 （27/PS res i n） を用いた連続反応による N末端修飾 を行った RNaseAの LC-MS解析結果を示す （実施例 12-6） 。 修飾されたタンパク 質に対応するピークを·、 また未修飾のタンパク質に対応するピークに〇で 示す。
［図 37］均一系での D i mroth転位反応を用いたトリアゾールカルボアルデヒド調 製とタンパク質修飾への応用のスキームを示す （実施例 13） 。
［図 38］D i mr〇th転位反応の反応機構を示す （実施例 13-2） 。
［図 39］化合物 10を用いた D i m rot h転位反応における酸触媒の構造を示す （実施 例 13-2） 0 \¥0 2020/175680 9 卩（：171? 2020 /008357
Figure imgf000010_0001
転位反応による 1\1末端修飾剤調製と連続したタンパク質修飾反 応の 1_01^解析結果を示す （実施例 13-3） 。 修飾されたタンパク質に対応する ピークを·、 また未修飾のタンパク質に対応するピークに〇で示す。
［図 41］ 81 丁八 の調製とタンパク質修飾反応のスキームを示す （実施例 14-2
［図 42］ジアミンを前駆体とした -丁八 による 1^336八 1\1末端修飾の !_01^解 析結果を示す （実施例 14-2） 。 前駆体となったジアミンの構造と !_0!^から算 出した修飾率を示す。
［図 43］オキシム形成を介したタンパク質 1\1末端への機能性分子の導入スキーム を示す （実施例 14-3） 。
Figure imgf000010_0004
転位反応スキームを示す （実施例 15-2） 。
Figure imgf000010_0002
化合物 7の収率を示す （実施例 15-2） 。 収率 は1 關（¾測定から算出した。
［図 50］ヒト血清由来アルブミンの 1\1末端修飾反応の反応スキーム及び結果を示 す （実施例 16-2） 。
［図 51］ヒト血清由来アルブミンのシステイン残基修飾反応スキーム及び結果 を示す （実施例 17-2） 。
［図 52］システイン残基修飾ヒト血清由来アルブミンの 1\1末端修飾反応スキーム 及び結果を示す （実施例 17-3） 。
Figure imgf000010_0003
分析結果を示す （実施例 18-2） 。 ［図 54］（^336_7の時間経過に伴う修飾剤の放出率変化を示す （実施例 18-2） 。 ［図 55］（^336_7の pH変化に伴う修飾剤の放出率変化を示す （実施例 18-3） 。 \¥0 2020/175680 10 卩（：171? 2020 /008357
［図 56］化合物 42の1 關(¾スぺクトル 01^0 6) を示す。
［図 57］化合物 43の1 關(¾スぺクトル 00013) を示す。
［図 58］化合物 44の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000011_0001
00013) を示す。
［図 59］化合物 45の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000011_0002
00013) を示す。
［図 60］化合物 46の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000011_0003
00013) を示す。
［図 61］化合物 47の 關(¾スペクトル
Figure imgf000011_0004
00013) を示す。
［図 62］化合物 48の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000011_0005
00013) を示す。
［図 63］化合物 49の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000011_0006
00013) を示す。
［図 64］化合物 50の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000011_0007
00013) を示す。
［図 65］化合物 51の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000011_0008
00013) を示す。
［図 66］アンジオテンシン Iの 1\1末端修飾反応スキーム及び結果を示す (実施例 2
0) 〇
［図 67］(^336 八の1\1末端修飾反応スキーム及び結果を示す (実施例 21 ) 。
［図 68］(^336 八へのアセチル基およびアジド基の導入スキーム及び結果を示す (実施例 22-1 ) 。
［図 69］ひずみ促進型アルキン _アジド環化付加反応による蛍光色素の修飾及 び結果を示す (実施例 22-2) 。
［図 70］化合物 52の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000011_0009
01^0 6) を示す。
［図 71］化合物 53の1 關(¾スぺクトル
Figure imgf000011_0010
00013) を示す。
［図 72］［^336 八へのポリエチレングリコールの修飾スキーム及び結果を示す ( 実施例 23-2-2) 。
［図 73］ 八2への 1\1末端修飾反応および 26の修飾反応のスキームおよび結果を示 す (実施例 23-2-3)
発明を実施するための形態
［0035］ 本明細書中において、 「含有」 及び 「含む」 なる表現については、 「含有 」 、 「含む」 、 「実質的にからなる」 及び 「のみからなる」 という概念を含 む。
［0036］ 1 . タンパク質及び/又はべプチド修飾分子 \¥02020/175680 11 卩（：171? 2020 /008357
本発明は、 その _態様において、 _般式 （1）
[0037] [化 7]
Figure imgf000012_0001
[0038]
Figure imgf000012_0002
Vの内、 一方は一 （一 一 は有機基、 又は無機材料由来 の基を示す。 ） を示し、 他方は =1\1_を示す。 は水素原子、 有機基、 又は無 機材料由来の基を示す。 ]
で表される化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物 （本明細書において、 これらを総称して、 「本発明の修飾分子」 と示すこと もある。 ） に関する。 以下に、 これについて説明する。
[0039] <1-1. 化合物 >
及び [^2の内、 一方は一 N （- ^） - （ は有機基、 又は無機材料由来の基を 示す。 ） を示し、 他方は =1^1_を示す。 点線と実線とからなる二重線は単結合 又は二重結合を示し、 及び の内のどちらが一 N （-^） —であるか或いは = 1\1 _であるかに応じて、 単結合であるか二重結合であるかが決定される。
[0040] すなわち、 一般式 （1） は、 が一 N （-^） -であり且つ が =|\|-である場 合は一般式 （1八） ：
[0041] [化 8]
Figure imgf000012_0003
（1八）
[0042]
Figure imgf000012_0004
は前記に同じである。 ]
であり、
Figure imgf000012_0005
り且つ が一 N （-^） -である場合は一般式 （ ）
[0043] \¥0 2020/175680 12 卩（：171? 2020 /008357
[化 9]
Figure imgf000013_0001
[0044]
Figure imgf000013_0002
は前記に同じである。 ]
である。
[0045] 本発明においては、 が一 N （- ^） -であり且つ が = 1\1 -である場合 （す なわち、 一般式 （1） が一般式 （1八） である場合） が好ましい。
[0046] 有機基としては、 有機分子又は有機分子複合体由来の基、 例えば有機分子 又は有機分子複合体から 1つの原子又は複数の原子が除かれてなる基である限 り、 特に制限されない。 有機分子は、 特に制限されず、 天然のものであって も、 合成 ·人工のものであってもよい。 有機分子複合体としては、 特に制限 されないが、 例えば有機分子を含む複数の分子が連結してなる複合体 （或い は生命体） が挙げられる。 該連結の態様は、 特に制限されないが、 例えば水 素結合、 静電気力、 ファンデルワールスカ、 疎水結合、 共有結合、 配位結合 等が挙げられる。 これらの結合は、 リンカー （具体例としては後述のリンカ —参照） を介して行われていてもよい。 有機分子又は有機分子複合体は、 機 能性物質であることが好ましく、 その具体例としては、 医薬化合物、 発光分 子、 高分子化合物、 リガンド、 リガンド結合対象分子、 抗原タンパク質、 抗 体、 タンパク質、 核酸、 糖類、 脂質、 細胞、 ウイルス、 標識 （例えば放射性 同位元素標識） 、 力ーボン電極、 力ーボンナノ材料、 リンカー、 スぺーサー 分子 （例えば、 ポリエチレングリコール又はその誘導体、 ペプチド （一例と して細胞内で酵素により切断されるアミノ酸配列を含むペプチド） 等） 、 こ れらの複合体、 連結分子等が挙げられる。
[0047] 本発明の一態様において、 有機基内の部分構造として （例えば末端に） 、 1 つ又は 2つ以上の本発明の修飾分子が連結されていてもよい。 この場合の本発 明の修飾分子の一例として、 一般式 （ ） ·· \¥0 2020/175680 13 卩（：171? 2020 /008357
[0048] [化 10]
Figure imgf000014_0001
[0049] [式中： [^3は前記に同じである。 [^3は各出現において同一又は異なっている。
は二価の有機基を示す。 ]
で表される化合物が挙げられる。
Figure imgf000014_0002
には本発明の修飾分子の部分構造が含ま れていてもよい。
[0050] 無機材料としては、 金属原子を含む又は含まない材料であって、 特に制限 されるものではない。 無機材料としては、 例えば電極材料、 金属微粒子、 金 属酸化微粒子、 半導体粒子、 磁性粒子等が挙げられる。 無機材料は、 有機分 子又は有機分子複合体を保持するものであってもよい。
[0051 ] 有機基又は無機材料由来の基は、 反応性基を有していてもよい。 この場合 、 反応性基を介して、 さらに他の物質を連結することができる。 反応性基と しては、 例えばエチニル基、 エチニレン基、 ビニル基、 アジド基、 エポキシ 基、 アルデヒ ド基、 オキシルアミノ基、 ハロゲン原子等が挙げられる。 エチ ニル基及びエチニレン基は、 アジド基と 1 , 3 -双極子付加環化反応することに より、 1 , 2, 3 -トリアゾール環を形成することが知られている。 ビニル基は、 チオール基と反応して結合を形成する。 エポキシ基はアミノ基やチオール基 と反応し結合を形成する。 アルデヒド基はアミノ基と反応し、 シッフ塩基を 形成し、 それを還元すると結合を形成する。 オキシルアミノ基はケトン基、 アルデヒド基と反応し、 オキシムを形成する。 アジド基は、 アルキニル基と 1 , 3 -双極子付加環化反応することにより、 1 , 2, 3 -トリアゾール環を形成する ことが知られている。 \¥0 2020/175680 14 卩（：171? 2020 /008357
[0052] は水素原子、 有機基、 又は無機材料由来の基を示す。 有機基及び無機材料 については、 上記 で示される有機基及び無機材料と同様である。 [^3が有機基 又は無機材料由来の基である場合、 有機基又は無機材料由来の基は、 反応性 基を有することが好ましい。 この場合、 上記したように、 反応性基を介して 、 さらに他の物質を連結することができる。
[0053] 本発明の一態様においては、 [^3は水素原子である。 この場合、 一般式 （1） は、 例えば一般式 （13） 、 （1八3） 、 又は （183） である。
[0054] [化 1 1 ]
Figure imgf000015_0001
[0055] [式中、 （^、 （^、 及び は前記に同じである。 ]
_般式 （1） で表される化合物には、 立体異性体及び光学異性体が含まれ、 これらは特に限定されるものではない。
[0056] 一般式 （1） で表される化合物の塩は、 特に制限されるものではない。 該塩 としては、 酸性塩、 塩基性塩のいずれも採用することができる。 酸性塩の例 としては、 塩酸塩、 臭化水素酸塩、 硫酸塩、 硝酸塩、 過塩素酸塩、 リン酸塩 等の無機酸塩； 酢酸塩、 プロピオン酸塩、 酒石酸塩、 フマル酸塩、 マレイ ン酸塩、 リンゴ酸塩、 クエン酸塩、 メタンスルホン酸塩、 パラトルエンスル ホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、 塩基性塩の例としては、 ナトリウム塩、 及びカリウム塩等のアルカリ金属塩； 並びにカルシウム塩、 マグネシウム 塩等のアルカリ土類金属塩； アンモニアとの塩； モルホリン、 ピベリジ ン、 ピロリジン、 モノアルキルアミン、 ジアルキルアミン、 トリアルキルア ミン、 モノ （ヒドロキシアルキル） アミン、 ジ （ヒドロキシアルキル） アミ ン、 トリ （ヒドロキシアルキル） アミン等の有機アミンとの塩等が挙げられ る。
[0057] 一般式 （1） で表される化合物は水和物、 溶媒和物とすることもできる。 溶 \¥0 2020/175680 15 卩（：171? 2020 /008357
媒としては、 例えば有機溶媒 （例えばエタノール、 グリセロール、 酢酸等） 等が挙げられる。
[0058] <1 -2. 合成方法 1 >
—般式 （1） で表される化合物は、 様々な方法で合成することができる。 一 例として、 一般式 （1） で表される化合物は、 一般式 （2）
Figure imgf000016_0001
[式 中： は前記に同じである。
Figure imgf000016_0002
は一 1\13、 一X （Xはハロゲン原子を示す。 ） 、 一 8 （〇 2、
Figure imgf000016_0003
（〇^1） 2 （（^は同一又は異なって、 炭化水素基を示す。 但し、 2 つの は共に結合して、 隣接する酸素原子と共に環を形成していてもよい。
） 、 又は一! \12 +を示す。 ] で表される化合物又はその塩と、 一般式 （3） で表さ れる化合物及、 _般式 （4） で表される化合物、 又は一般式 （9） で表される 化合物：
[0059] [化 12]
Figure imgf000016_0004
[0060] は前記に同じである。 1^、 [^7及び [^8は同一又は異なって、 アルキル 基を示す。 丫は反応性基を示す。 ]
とを反応させる工程を含む方法によって、 合成することができる。
[0061 ] Xで示されるハロゲン原子としては、 例えばフッ素原子、 塩素原子、 臭素原 子、 ヨウ素原子等が挙げられ、 好ましくは臭素原子が挙げられる。
[0062] で示される炭化水素基としては、 例えばアルキル基、 シクロアルキル基 等が挙げられる。
[0063] で示されるアルキル基としては、 直鎖状、 又は分岐鎖状のいずれのもの も包含される。 該アルキル基の炭素数は、 特に制限されず、 例えば 1〜 8であ る。 該アルキル基の具体例としては、 メチル基、 エチル基、 n _プロピル基、 \¥0 2020/175680 16 卩（：171? 2020 /008357
イソプロピル基、 门_ブチル基、 イソブチル基、
Figure imgf000017_0001
ブチル基、 360—ブチ ル基、 n _ペンチル基、 ネオペンチル基、 n _ヘキシル基、 3—メチルペンチル 基、 门ーヘプチル基、 门ーオクチル基等が挙げられる。
[0064] で示されるシクロアルキル基の炭素数は、 特に制限されず、 例えば 3〜 10 、 好ましくは 4〜 10である。 該シクロアルキル基の具体例としては、 シクロプ ロピル基、 シクロブチル基、 シクロペンチル基、 シクロヘキシル基、 シクロ ヘプチル基、 シクロオクチル基等が挙げられる。
[0065] 2つの が共に結合して隣接する酸素原子と共に形成する環はアルキル基等 で置換されていてもよい。
[0066] 1^、 及び で示されるアルキル基としては、 通常、 直鎖状の低級アルキル 基が採用され、 好ましくはエチル基が採用される。
[0067] 丫で示される反応性基については、 上記した有機基又は無機材料由来の基が 含んでいてもよい反応性基と同様である。 丫は好ましくはハロゲン原子 （丫’
） である。
[0068] 以下に、 使用する材料の種類別に詳述する。
[0069] <1 -2-1 . ケース 1 （（^が一 1\13であり、 且つ一般式 （3） で表される化合物を 使用する場合） >
—般式 （2） で表される化合物の使用量は、 反応させる官能基 （本ケースで は、 アジド基） のモル数として、 収率などの観点から、 一般式 （3） で表され る化合物の 1モルに対して、 通常、 0. 1〜 5モルが好ましく、 0. 3〜 2モルがより 好ましい。
[0070] 本反応は、 通常、 反応溶媒の存在下で行われる。 反応溶媒としては、 特に 制限されないが、 例えば水、 メタノール、 テトラヒドロフラン、 ジオキサン 、 ジメチルスルホキシド等が挙げられる。 溶媒は単独で使用してもよく、 ま た、 複数併用してもよい。 また、 溶媒には、 リン酸緩衝剤等の緩衝剤を添加 することが好ましい。 水を使用する場合、 本反応の は、 中性付近が好まし く、 具体的には 6〜 8. 5が好ましく、 6. 5〜 8がより好ましく、 7〜 7. 5がさらに 好ましい。 \¥0 2020/175680 17 卩（：171? 2020 /008357
[0071 ] 本反応は、 好ましくは適当な触媒の存在下で行うことが好ましい。 触媒と しては、 例えば銅触媒が挙げられる。 銅触媒としては、 例えば硫酸銅などの 2 価の銅、 ヨウ化銅等の 1価の銅等が挙げられる。 本反応においては、 さらに還 元剤 （例えばヒドロキノン、 アスコルビン酸ナトリウム） 、 配位子等を使用 することもできる。
[0072] 銅触媒の使用量は、 収率などの観点から、 本発明のアジド基含有タンパク 質又はペプチドの 1モルに対して、 通常、 0. 1〜 5モルが好ましい。
[0073] 本反応においては、 上記成分以外にも、 反応の進行を著しく損なわない範 囲で、 適宜添加剤を使用することもできる。
[0074] 反応温度は、 加熱下、 常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、 通 常、 本発明のアジド基含有タンパク質又はペプチドが著しく変性しない程度 の温度、 例えば 0〜 45°〇 （特に 0〜 40°〇） で行うことが好ましい。 反応時間は 特に制限されず、 通常、 30分間〜 3時間、 特に 1時間〜 2時間とすることができ る。
[0075] 反応の進行は、 クロマトグラフィーのような通常の方法で追跡することが できる。 反応終了後、 溶媒を留去し、 必要に応じて生成物をクロマトグラフ ィー法、 再結晶法等の通常の方法で単離精製することができる。 また、 生成 物の構造は、 元素分析、
Figure imgf000018_0001
分析、 1（¾分析、
Figure imgf000018_0002
-關[¾等により 同定することができる。
[0076] <1 -2-2. ケース 2 （（^が一 1\13以外であり、 且つ一般式 （3） で表される化合 物を使用する場合） >
本ケースは、 反応系内に、 をアジド基に変換するためのアジド化剤を添加 する以外は、 ケース 1と同様である。
[0077] アジド化剤としては、 例えばアジ化ナトリウム等の無機アジド、 スルホニ ルアジド、 シリルアジド、 リン酸アジド、 アルキルアンモニウムアジド等が 挙げられる。
[0078] アジド化剤の使用量は、 収率などの観点から、 一般式 （2） で表される化合 物の 1モルに対して、 通常、 0. 1〜 5モルが好ましく、 0. 3〜 2モルがより好まし \¥0 2020/175680 18 卩（：171? 2020 /008357
い。
[0079] <1 -2-3. ケース 3 （—般式 （4） で表される化合物を使用する場合） > 本ケースでは、 一般式 （2） で表される化合物と一般式 （4） で表される化 合物との反応後、 いくつかの段階を経て、 一般式 （1） で表される化合物を合 成することができる。 例えば、 本ケースでは、 以下のスキームによって、 一 般式 （1） で表される化合物を合成することができる。
[0080] [化 13]
Figure imgf000019_0001
[0081 ] [式中、 1^、 1^、 1^、 1^、 1^、 及び は前記に同じである。 ]
（工程 1）
—般式 （2） で表される化合物の使用量は、 反応させる官能基 （本ケースで は、 アジド基） のモル数として、 収率などの観点から、 一般式 （4） で表され る化合物の 1モルに対して、 通常、 0. 1〜 5モルが好ましく、 0. 3〜 2モルがより 好ましい。
[0082] 溶媒としては、 反応に悪影響を及ぼさないものであればよく、 例えば、 水 、 アルコール系溶媒 （例えば、 メタノール、 エタノール、 イソプロパノール 、 门ーブタノール、 トリフルオロエタノール、 エチレングリコール等） 、 ケト ン系溶媒 （例えば、 アセトン、 メチルエチルケトン等） 、 エーテル系溶媒 （ 例えば、 テトラヒドロフラン、 ジオキサン、 ジエチルエーテル、 ジメ トキシ エタン、 ジグライム等） 、 エステル系溶媒 （例えば、 酢酸メチル、 酢酸エチ ル等） 、 非プロトン性極性溶媒 （例えば、 アセトニトリル、 1\1, ジメチル \¥0 2020/175680 19 卩（：171? 2020 /008357
ホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシド等） 、 ハロゲン化炭化水素系溶媒 （例 えば、 塩化メチレン、 塩化エチレン等） 、 或いはこれらの混合溶媒等が挙げ られる。 好ましくは、 水及び非プロトン性極性溶媒 （特にジメチルホルムア ミ ド） の混合溶媒である。
[0083] 工程 1は、 通常、 塩基の存在下で行われる。 塩基としては、 例えば有機塩基 を使用することができる。 有機塩基としては、 例えばトリアルキルアミン （ 例えば、 トリメチルアミン、 トリエチルアミン、 1\1, 1\1—ジイソプロピルエチ ルアミン等） 、 ピリジン、 キノリン、 ピペリジン、 イミダゾール、 ピコリン 、 4—ジメチルアミノビリジン、 1\1, 1\1 _ジメチルアニリン、 1\1 _メチルモルホ リン、 1 , 5 -ジアザビシクロ [4. 3. 0] ノナー 5 -エン 81\〇 、 1 , 4 -ジア ザビシクロ [2. 2. 2] オクタン
Figure imgf000020_0001
1 , 8 -ジアザビシクロ [5. 4. 0 ] ウンデカー 7—エン
Figure imgf000020_0002
等が挙げられる。 また、 これらの塩基が液状の 場合、 溶媒として兼用することができる。 塩基は、 1種単独で又は 2種以上混 合して使用される。 塩基は、 好ましくはピペリジンである。
[0084] 塩基を使用する場合、 その使用量は、 一般式 （4） で表される化合物 1モル に対して、 通常 0. 05〜 1モル、 好ましくは 0. 1〜 0. 5モルである。
[0085] 反応温度は特に限定されず、 通常、 冷却下、 室温下及び加熱下のいずれで も反応が行われる。 好ましくは 50〜 100°〇、 より好ましくは 70〜 90°〇程度の温 度条件下に 1〜 30時間反応させるのがよい。
[0086] 反応終了後、 溶媒を留去し、 生成物をクロマトグラフィー法、 再結晶法等 の通常の方法で単離し、 精製することができる。 また、 生成物の構造は、 元 素分析、
Figure imgf000020_0003
分析、
Figure imgf000020_0004
130關（¾等により同定することが できる。
[0087] （工程 2）
工程 2では、 一般式 （1’ ’ ） で表される化合物を、 還元剤、 及び適量の塩 基の存在下で反応させる。
[0088] 還元剤としては、 例えば、 水素化ホウ素ナトリウム、 水素化ホウ素亜鉛 （å 门 ） 2） 、 トリアセトキシ水素化ホウ素テトラメチルアンモニウム、 トリ \¥0 2020/175680 20 卩（：171? 2020 /008357
60—ブチル水素化ホウ素リチウム、 ボラン、 ボラン · 1 #錯体、 ボラン ·ジメ チルスルフィ ド錯体、 水素化アルミニウムリチウム、 水素化ジイソプチルア ルミニウム、 水素化ホウ素リチウム等が挙げられる。 これらの還元剤は、 1種 単独で又は 2種以上混合して使用される。 好ましくは水素化ホウ素ナトリウム である。
[0089] 還元剤の使用量は、 一般式 （1’ ’ ） で表される化合物 1モルに対して、 通 常 1〜 15モル、 好ましくは 3〜 10モルである。
[0090] 塩基としては、 例えば無機塩基を使用することができる。 有機塩基として は、 例えば、 アルカリ金属 （例えば、 ナトリウム、 カリウム等） 、 炭酸水素 アルカリ金属 （例えば、 炭酸水素リチウム、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸水素 カリウム等） 、 アルカリ金属水酸化物 （例えば、 水酸化リチウム、 水酸化ナ トリウム、 水酸化カリウム、 水酸化セシウム等） 、 炭酸アルカリ金属 （例え ば、 炭酸リチウム、 炭酸ナトリウム、 炭酸カリウム、 炭酸セシウム等） 、 ア ルカリ金属低級 （01 -04） アルコキシド （例えば、 ナトリウムメ トキシド、 ナトリウムエトキシド、 カリウムターシヤリーブトキシド等） 、 アルカリ金 属水素化物 （例えば、 水素化ナトリウム、 水素化カリウム等） 等が挙げられ る。 塩基は、 1種単独で又は 2種以上混合して使用される。 塩基は、 好ましく はアルカリ金属低級 （01 -04） アルコキシド （特に、 ナトリウムメ トキシド ） である。
[0091 ] 溶媒としては、 反応に悪影響を及ぼさないものであればよく、 例えば、 水 、 アルコール系溶媒 （例えば、 メタノール、 エタノール、 イソプロパノール 、 门ーブタノール、 トリフルオロエタノール、 エチレングリコール等） 、 ケト ン系溶媒 （例えば、 アセトン、 メチルエチルケトン等） 、 エーテル系溶媒 （ 例えば、 テトラヒドロフラン、 ジオキサン、 ジエチルエーテル、 ジメ トキシ エタン、 ジグライム等） 、 エステル系溶媒 （例えば、 酢酸メチル、 酢酸エチ ル等） 、 非プロトン性極性溶媒 （例えば、 アセトニトリル、 1\1, 1\1 _ジメチル ホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシド等） 、 ハロゲン化炭化水素系溶媒 （例 えば、 塩化メチレン、 塩化エチレン等） 、 或いはこれらの混合溶媒等が挙げ \¥0 2020/175680 21 卩（：171? 2020 /008357
られる。 好ましくは、 アルコール系溶媒 （特にメタノール） である。
[0092] 反応温度は特に限定されず、 通常、 冷却下、 室温下及び加熱下のいずれで も反応が行われる。 好ましくは 0〜 60°〇、 より好ましくは 10〜 40°〇程度の温度 条件下に 1〜 30時間反応させるのがよい。
[0093] 反応終了後、 溶媒を留去し、 生成物をクロマトグラフィー法、 再結晶法等 の通常の方法で単離し、 精製することができる。 また、 生成物の構造は、 元 素分析、
Figure imgf000022_0001
分析、
Figure imgf000022_0002
130關（¾等により同定することが できる。
[0094] （工程 3）
工程 3では、 一般式 （1’ ） で表される化合物を、 酸化剤の存在下で反応さ せる。
[0095] 酸化剤としては、 例えば二酸化マンガンを使用することができる。 その他 にも、 例えば二酸化セレンあるいは、 2, 2, 6, 6 -テトラメチルピぺリジン 1 -才 キシル （丁£1^0） や 2 -アザアダマンタン- 1\1 -オキシル
Figure imgf000022_0003
などニトロキシ ルラジカル等を使用することもできる。 酸化剤は、 1種単独で又は 2種以上混 合して使用される。
[0096] 酸化剤の使用量は、 一般式 （1’ ） で表される化合物 1モルに対して、 通常 3 〜 20モル、 好ましくは 5〜 15モルである。
[0097] 溶媒としては、 反応に悪影響を及ぼさないものであればよく、 例えば、 ケ トン系溶媒 （例えば、 アセトン、 メチルエチルケトン等） 、 エーテル系溶媒 （例えば、 テトラヒドロフラン、 ジオキサン、 ジエチルエーテル、 ジメ トキ シエタン、 ジグライム等） 、 エステル系溶媒 （例えば、 酢酸メチル、 酢酸エ チル等） 、 非プロトン性極性溶媒 （例えば、 アセトニトリル、 1\1, 1\1 -ジメチ ルホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシド等） 、 ハロゲン化炭化水素系溶媒 （ 例えば、 クロロホルム、 塩化メチレン、 塩化エチレン等） 、 或いはこれらの 混合溶媒等が挙げられる。 好ましくは、 ハロゲン化炭化水素系溶媒 （特に、 クロロホルム） である。
[0098] 反応温度は特に限定されず、 通常、 冷却下、 室温下及び加熱下のいずれで \¥0 2020/175680 22 卩(：171? 2020 /008357
も反応が行われる。 好ましくは 0〜 60°〇、 より好ましくは 1 0〜 40°〇程度の温度 条件下に 1〜 30時間反応させるのがよい。
[0099] 反応終了後、 溶媒を留去し、 生成物をクロマトグラフィー法、 再結晶法等 の通常の方法で単離し、 精製することができる。 また、 生成物の構造は、 元 素分析、
Figure imgf000023_0001
分析、
Figure imgf000023_0002
130關（¾等により同定することが できる。
[01 00] < 1 -2-4. ケース 4 （（^が一 1\13であり、 且つ一般式 （9） で表される化合物を 使用する場合） >
本ケースでは、 一般式 （2） で表される化合物と一般式 （9） で表される化 合物との反応後、 いくつかの段階を経て、 一般式 （1） で表される化合物を合 成することができる。 例えば、 本ケースでは、 以下のスキー厶によって、 一 般式 （1） で表される化合物を合成することができる。
[01 01 ] [化 14]
Figure imgf000023_0003
[01 02] 工程 4は上記ケース 1に従って又は準じて行うことができる。 工程 6は上記エ 程 3に従って又は準じて行うことができる。 工程 5は、 一般式 （1 **） で表され る化合物と一般式 （1 0） （^3 _ åで表れる化合物とを反応させることにより行う ことができる。 åは、 丫と反応する反応性基であり、 丫がハロゲンである場合は 、 åとして例えば一 8 （〇 2を採用することができる。 工程 5の反応条件は、 丫 及び åの種類に応じて、 公知の情報に基づいて設定することができる。 \¥0 2020/175680 23 卩（：171? 2020 /008357
[0103] <1 -3. 合成方法 2>
一般式 （1） で表される化合物は、 上記合成方法 1以外にも、 例えば、 一般 式 （1） で表される化合物は、 一般式 （5） :
Figure imgf000024_0001
（5） [式中： は前記に同 じである。
Figure imgf000024_0002
9 （ 及び は同一又は異なって水素原子又はアルキル 基を示す。 ） を示す。 ] で表される化合物と、 _般式 （6） :
[0104] [化 15]
Figure imgf000024_0003
[0105] [式中、
Figure imgf000024_0004
は単結合又はリンカ —を示す。 1^2は担体を示す。 ） を示す。 门は 0又は 1を示す。 （11は 1〜 5の整数を 示す。 ]
で表される化合物とを反応させる工程を含む方法によって、 合成することが できる。
[0106] また、 一般式 （5） で表される化合物として、 一般式 （5’ ） :
Figure imgf000024_0005
（
5’ ） [式中：
Figure imgf000024_0006
及び は前記に同じである。 ] で表される化合物を使用する ことにより、 一般式 （1八八） で表される化合物を合成することができる。
[0107] アルキル基は、 特に制限されず、 例えばメチル基、 エチル基等の低級アル キル基であることができる。 及び は好ましくは共に水素原子である。
[0108] 電子求引性基としては、 特に制限されないが、 例えば一 1\102、 _ド、 0ド3、
1\1、 一¥01^等が挙げられる。 電子求引性基の位置としては、 例えば一 1\102の場 合であればパラ位であることが好ましく、 例えば 及び 0ド3の場合であれば才 ルト位及びメタ位であることが好ましい。 後者の場合において、 より好まし くは、 さらにパラ位が一 0\1である。
[0109] 111は、 例えば電子求引性基が一 1\102の場合であれば 1が好ましく、 例えば 及 \¥0 2020/175680 24 卩（：171? 2020 /008357
び〇ド3の場合であれば 4〜 5が好ましく、 オルト位及びメタ位の全てが [^0で置換 されていることがより好まく。 後者の場合において、 さらに好ましくは、 さ らにパラ位が一 0\1である。
[01 1 0] オルト位及びメタ位が全てード又は 0ド3 （好ましくはード） であり且つパラ位 が一 0\1である場合、 一般式 （5） で表される化合物との反応において、 比較的 低温条件 （好ましくは 20〜 60°〇、 より好ましくは 25〜 40°〇） であっても十分 に反応を進行させることができる。
[01 1 1 ] リンカーは、 担体をベンゼン環に連結することができるものである限り、 特に制限されるものではないが、 例えば主鎖中に以下の部分構造を含むリン 力一が挙げられる。
[01 12] [化 16]
Figure imgf000025_0001
[01 13] リンカーの主鎖を構成する原子数は、 例えば 1〜 1 00、 1〜 50、 1〜 20、 1〜 1 0 である。 \¥0 2020/175680 25 卩（：171? 2020 /008357
[01 14] 担体は、 特に制限されるものではない。
[01 15] 担体粒子の平均粒子径は特に限定されないが、 好ましくは、 溶液中で容易 に沈殿させることができる程度の大きさである。 例えば 1 ~ 1 1ä、 好まし くは 10 ~ 100 111である。
[01 16] 担体粒子の材質としては、 特に限定されず、 例えば金、 銀、 銅、 鉄、 アル ミ、 ニッケル、 マンガン、 チタン、 これらの酸化物等の金属製粒子； ポリ スチレン、 ラテックス等の樹脂製粒子； シリカ粒子等が挙げられる。 担体 粒子の形状としては、 特に制限されないが、 例えば球体、 直方体、 立方体、 三角錐等、 又はこれらに近い形状が挙げられる。 担体粒子は、 他の物質 （例 えば、 結合性物質 2等） の結合をより容易に及び/又はより強固にするための 物質を表面に有するものであってもよい。 このような物質としては、 例えば 、 エポキシ基、 アミノ基、 カルボキシ基、 アジド基等の反応性基を有する物 質； アビジン、 プロテイン八、 プロテイン 8等の、 他の分子に親和性を有す る物質等が挙げられる。 担体粒子は、 標識物質をさらに含むものであっても よい。 担体粒子は、 1種のみであってもよいし、 2種以上の組み合わせであっ てもよい。
[01 17] —般式 （5） で表される化合物の使用量は、 収率などの観点から、 一般式 （ 6） で表される化合物の 1モルに対して、 通常、 0. 1〜 5モルが好ましく、 0. 3〜 2モルがより好ましい。
[01 18] 溶媒としては、 反応に悪影響を及ぼさないものであればよく、 例えば、 水 、 アルコール系溶媒 （例えば、 メタノール、 エタノール、 イソプロパノール 、 门ーブタノール、 トリフルオロエタノール、 エチレングリコール等） 、 ケト ン系溶媒 （例えば、 アセトン、 メチルエチルケトン等） 、 エーテル系溶媒 （ 例えば、 テトラヒドロフラン、 ジオキサン、 ジエチルエーテル、 ジメ トキシ エタン、 ジグライム等） 、 エステル系溶媒 （例えば、 酢酸メチル、 酢酸エチ ル等） 、 非プロトン性極性溶媒 （例えば、 アセトニトリル、 1\1, 1\1 _ジメチル ホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシド等） 、 ハロゲン化炭化水素系溶媒 （例 えば、 塩化メチレン、 塩化エチレン等） 、 或いはこれらの混合溶媒等が挙げ られる。 好ましくは、 水とアルコール系溶媒との混合溶媒である。
[01 19] 本反応においては、 収率などの観点から、 酸触媒を使用することが好まし いい。 酸触媒としては、 特に制限されないが、 例えば酢酸、 メタンスルホン 酸、 p-トルエンスルホン酸、 2 -モルホリノエタンスルホン酸 （MES） 、 3- モルホリノプロパンスルホン酸 （MOPS） % 4- （2 -ヒドロキシエチル） -1 -ピぺ ラジンエタンスルホン酸 （HEPES） 、 N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル- 3- アミノプロパンスルホン酸 （TAPS） 等が挙げられる。 これらの中でも、 後続 するタンパク質修飾反応をより阻害しないという観点から、 MES、 MOPS、 HEPE S、 TAPS等のグッ ド緩衝剤が好ましい。
[0120] 反応温度は特に限定されず、 通常、 冷却下、 室温下及び加熱下のいずれで も反応が行われる。 好ましくは 20〜 100°C程度の温度条件下に 10分間〜 30時間 反応させるのがよい。
[0121 ] 反応終了後、 溶媒を留去し、 生成物をクロマトグラフィー法、 再結晶法等 の通常の方法で単離し、 精製することができる。 また、 生成物の構造は、 元 素分析、 MS （ESI-MS） 分析、 IR分析、 ]H-NMR、 13C-NMR等により同定することが できる。
[0122] 一般式 （6） で表される化合物が担体を含む場合 （すなわち、 R”が一 Rm— R1 2である場合） 、 精製操作を簡便に行うことができる。 すなわち、 反応により 生じた副生物 （アニリン誘導体） である一般式 （6x） :
[0123] [化 17]
Figure imgf000027_0001
で表される化合物を、 担体を利用した沈殿操作等により、 容易に除去するこ とができる。 このため、 本発明は、 その一態様において、 一般式 （6’ ） ： \¥0 2020/175680 27 卩（：17 2020 /008357
[0125] [化 18]
Figure imgf000028_0001
[0126] [式中、 （^、 （^、 （^、 及び 111は前記に同じである。 ]
で表される化合物に関する。
[0127] <1 -4. 用途 >
本発明の修飾分子は、 タンパク質又はべプチドの 1\1末端に他分子/物質を連 結するために、 例えば後述の本発明の複合物質 （一般式 （7） で表される化合 物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物） を製造するた めに有用である。 このため、 本発明の修飾分子は、 試薬として、 特にタンパ ク質及び/又はべプチド修飾用試薬の有効成分として好適に利用することが できる。 該試薬は、 本発明の修飾分子を含有する限りにおいて特に制限され ず、 必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。 他の成分としては、 薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、 例えば基 剤、 担体、 溶剤、 分散剤、 乳化剤、 緩衝剤、 安定剤、 賦形剤、 結合剤、 崩壊 剤、 滑沢剤、 増粘剤、 保湿剤、 着色料、 香料、 キレート剤等が挙げられる。
[0128] 2. 複合物質
本発明は、 その一態様において、 一般式 （7）
[0129] \¥0 2020/175680 28 卩(：171? 2020 /008357
[化 19]
Figure imgf000029_0001
[0130] [式中： 1^、 1^、 1^、 及び は前記に同じである。 13はタンパク質又はべプチ ドから 1\1末端アミノ酸残基及びそれに隣接する一 _が除かれてなる基を示す 。 は前記タンパク質又はペプチドの 1\1末端アミノ酸残基の側鎖を示す。 ] で表される化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物 （本明細書において、 これらを総称して、 「本発明の複合物質」 と示すこと もある。 ） に関する。 以下に、 これについて説明する。
[0131 ] 1^3はタンパク質又はべプチドから 1\1末端アミノ酸残基及びそれに隣接する一 が除かれてなる基を示す。
[0132] タンパク質又はペプチドは、 1\1末端アミノ基が未修飾であり、 且つ 1\1末端か ら 2番目のアミノ酸残基がプロリン以外のアミノ酸残基であるタンパク質又は ぺプチドである限り特に制限されない。 タンパク質又はべプチドにおいては 、 1\1末端以外 （例えば、 システイン残基） において、 各種修飾が施されていて もよい。 このようなタンパク質又はペプチドとしては、 一般式 （73） で表さ れるタンパク質又はべプチドが挙げられる。
[0133] [化 20]
Figure imgf000029_0002
\¥0 2020/175680 29 卩（：171? 2020 /008357
[0134] は上記タンパク質又はべプチドの 1\1末端アミノ酸残基の側鎖を示す。 アミ ノ酸残基としては、 天然アミノ酸残基、 合成アミノ酸残基のいずれでもよく 、 例えば、 リシン、 アルギニン、 ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するア ミノ酸残基； アスパラギン酸、 グルタミン酸といった酸性側鎖を有するア ミノ酸残基； グリシン、 アスパラギン、 グルタミン、 セリン、 スレオニン 、 チロシン、 システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基； アラニン、 パ'リン、 ロイシン、 イソロイシン、 プロリン、 フエニルアラニ ン、 メチオニン、 トリブトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基 ; スレオニン、 バリン、 イソロイシンといった/ 3 -分枝側鎖を有するアミ ノ酸残基； チロシン、 フエニルアラニン、 トリブトファン、 ヒスチジンと いった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基等が挙げられる。
[0135] タンパク質又はペプチドは、 特に制限されず、 天然のものであっても、 合 成 ·人工のものであってもよい。
[0136] タンパク質又はペプチドは、 化学修飾されたものであってもよい。 タンパ ク質又はペプチドは、 （：末端がカルボキシル基 （一（^〇〇 、 カルボキシレート （-000-） 、 アミ ド （一 ¥ 2） またはエステル （一 ¥0 の何れであっても よい。 ここでエステルにおける としては、 例えば、 メチル、 エチル、 门ープ ロピル、 イソプロピル、 n -ブチルなどの（^ _6アルキル基；例えば、 シクロぺ ンチル、 シクロヘキシルなどの _8シクロアルキル基；例えば、 フエニル、 《 -ナフチルなどの（：6- 12アリール基；例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ ニル _（^ _2アルキル基； （¾ _ナフチルメチルなどの（¾ _ナフチルー（^_2アルキ ル基などの _14アラルキル基； ビバロイルオキシメチル基などが用いられる。 タンパク質又はペプチドは、 （：末端以外のカルボキシル基 （またはカルボキシ レート） が、 アミ ド化またはエステル化されていてもよい。 この場合のエス テルとしては、 例えば上記した 末端のエステルなどが用いられる。 さらに、 タンパク質又はペプチドには、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば -0^ - 5^ アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グアニジノ基など ） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 アセチル基などの（^ _6アルカノイル \¥0 2020/175680 30 卩（：171? 2020 /008357
基などの（^ _6アシル基など） で保護されているものも包含される。
[0137] タンパク質又はペプチドは、 翻訳後修飾されたもの、 あるいは、 人工的な 酵素処理や化学修飾によって、 翻訳後修飾されたものであったもよい。 翻訳 後修飾には、 リン酸化、 1\1-グリコシル化、 〇-グリコシル化、 〇グリコシル化 、 ホスホグリコシル化、 グリピエーシヨン、
Figure imgf000031_0001
トロシル化、 メチル化、 1\1- アセチル化、
Figure imgf000031_0003
リストイル化、 3 -プレニル化、
Figure imgf000031_0002
パルミ トイル化等が挙げ られる。 タンパク質又はペプチドは、 公知のタンパク質タグ、 シグナル配 列等のタンパク質又はべプチドや、 標識物質が付加されたものであってもよ い。 タンパク質タグとしては、 例えばピオチン、 タグ、 ド!_八0タグ、 1〇夕 グ、 タグ、
Figure imgf000031_0004
タグ、 5タグ、 八タグ、 3丫タグ等が挙げられる。 シグナル配列としては、 例えば核移行シグナル等が挙げられる。
[0138] タンパク質又はペプチドは、 一分子単独で存在するものであってもよいし 、 他の分子と連結して複合体を形成しているものであってもよい。 例えば、 タンパク質又はべプチドは、 細胞表面に存在するタンパク質又はペプチド、 細胞破砕液中のタンパク質又はペプチド、 何らかの物質に担持された状態の タンパク質又はペプチドであることができる。 該連結の態様は、 特に制限さ れないが、 例えば水素結合、 静電気力、 ファンデルワールスカ、 疎水結合、 共有結合、 配位結合等が挙げられる。
[0139] タンパク質又はべプチドは、 酵素や化学反応により断片化されたものであ っても、 1\1末端が存在するものであればよい。 また、 タンパク質又はペプチド は、 1\1末修飾されている場合には酵素あるいは化学反応により、 1\1末端を脱修 飾化したものでもよい。
[0140] _般式 （7） で表される化合物には、 立体異性体及び光学異性体が含まれ、 これらは特に限定されるものではない。
[0141 ] 一般式 （7） で表される化合物の塩は、 特に制限されるものではない。 該塩 としては、 酸性塩、 塩基性塩のいずれも採用することができる。 酸性塩の例 としては、 塩酸塩、 臭化水素酸塩、 硫酸塩、 硝酸塩、 過塩素酸塩、 リン酸塩 等の無機酸塩； 酢酸塩、 プロピオン酸塩、 酒石酸塩、 フマル酸塩、 マレイ \¥0 2020/175680 31 卩（：171? 2020 /008357
ン酸塩、 リンゴ酸塩、 クエン酸塩、 メタンスルホン酸塩、 パラトルエンスル ホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、 塩基性塩の例としては、 ナトリウム塩、 及びカリウム塩等のアルカリ金属塩； 並びにカルシウム塩、 マグネシウム 塩等のアルカリ土類金属塩； アンモニアとの塩； モルホリン、 ピベリジ ン、 ピロリジン、 モノアルキルアミン、 ジアルキルアミン、 トリアルキルア ミン、 モノ （ヒドロキシアルキル） アミン、 ジ （ヒドロキシアルキル） アミ ン、 トリ （ヒドロキシアルキル） アミン等の有機アミンとの塩等が挙げられ る。
[0142] 一般式 （7） で表される化合物は水和物、 溶媒和物とすることもできる。 溶 媒としては、 例えば有機溶媒 （例えばエタノール、 グリセロール、 酢酸等） 等が挙げられる。
[0143] 一般式 （7） で表される化合物は、 様々な方法で合成することができる。 一 例として、 一般式 （7） で表される化合物は、 タンパク質又はペプチドと本発 明の修飾分子とを反応させる工程を含む方法によって、 製造することができ る。 本反応は、 本発明の修飾分子の合成反応 （特に好ましくは、 上記 「1 -2. 合成方法 2」 の反応） との連続反応であってもよい。 この場合、 例えば本発明 の修飾分子の合成反応で得られた反応混合物を、 本反応で使用する溶媒で希 釈してから、 本反応を行うことができる。
[0144] 本発明の修飾分子の使用量は、 収率などの観点から、 タンパク質又はぺプ チドの 1モルに対して、 通常、 5〜 400モルが好ましい。
[0145] 本反応は、 通常、 反応溶媒の存在下で行われる。 反応溶媒としては、 特に 制限されないが、 例えば水等が挙げられる。 溶媒は単独で使用してもよく、 また、 複数併用してもよい。 また、 溶媒には、 リン酸緩衝剤等の緩衝剤を添 加することが好ましい。 水を使用する場合、 本反応の は、 1\1末端選択性の観 点から、 中性付近が好ましく、 具体的には 6〜 8. 5が好ましく、 6. 5〜 8がより 好ましく、 7〜 7. 5がさらに好ましい。
[0146] 本反応においては、 上記成分以外にも、 反応の進行を著しく損なわない範 囲で、 適宜添加剤を使用することもできる。 \¥0 2020/175680 32 卩（：171? 2020 /008357
［0147］ 反応温度は、 加熱下、 常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、 通 常、 タンパク質又はペプチドが著しく変性しない程度の温度、 例えば 0〜 45°〇 （特に 0〜 40°〇） で行うことが好ましい。 反応時間は特に制限されず、 通常、
8時間〜 36時間、 特に 12時間〜 24時間とすることができる。
［0148］ 反応の進行は、 クロマトグラフィーのような通常の方法で追跡することが できる。 反応終了後、 溶媒を留去し、 必要に応じて生成物をクロマトグラフ ィー法、 再結晶法等の通常の方法で単離精製することができる。 また、 生成 物の構造は、 元素分析、
Figure imgf000033_0001
分析、 1（¾分析、
Figure imgf000033_0002
-關［¾等により 同定することができる。
［0149］ 本発明の修飾分子として一般式 （1八八） で表される化合物を使用した場合、 上記反応により、 一般式 （7八八） ：
［01 50］ ［化 21］
Figure imgf000033_0003
［01 51］ ［式中 ： 1^、 1^、 及び 14は前記に同じである。 ］
で表される化合物が得られる。 この場合は、 さらにヒ ドロキシルアミンとの オキシム形成することにより、 有機分子等を連結することができる。 すなわ ち、 一般式 （1八八） で表される化合物と一般式 （8）
Figure imgf000033_0004
［式中
: は前記に同じである。 ］ で表される化合物とを反応させることにより、 一 般式 （7八八八） ： \¥02020/175680 33 2020/008357
[0152] [化 22]
Figure imgf000034_0001
［0153］ ［式中： 1^、 1^、 1^、 及び 1^4は前記に同じである。 ］
で表される化合物を合成することができる。 この合成反応の条件等について は、 アルデヒドを起点としたヒドロキシルアミンとのオキシム形成の公知の 反応条件に従って又は準じて決定することができる。 この反応は、 温和な条 件下、 水中においても進行することからタンパク質修飾にも適用可能である
［0154］ 本発明の複合物質は、 タンパク質又はべプチドに他の物質が連結されてな る構造を有しており、 連結対象の物質に応じて多様な分野において、 例えば 抗体ードラッグコンジュゲート、 標識したタンパク質試薬、 タンパク質固定 化無機材料、 タンパク質を連結した融合タンパク質、 核酸を融合したタンパ ク質等として、 利用することができる。
［0155］ 本発明の複合物質の一態様においては、 タンパク質又はべプチドに連結さ れている物質を徐々に解離するように設計することができる。 このため、 例 えばタンパク質又はべプチドに薬剤が連結してなる本発明の複合物質を生体 に投与後、 生体内で、 本発明の複合物質から徐々に薬剤が解離することを利 用して、 生体内で薬剤を徐々に放出させることが可能である。
［0156］ 本発明の複合物質が反応性基を有する場合 （例えば、 ［^3が反応性基を有する 場合） 、 その反応性基を利用して、 さらに他の物質を連結することも可能で ある。 例えば、 アジド基を利用した反応 （例えば、 ヒユスゲン環化付加反応 、 歪み促進型アジド -アルキン環化付加反応、 Staud i nger-Bertozz iライゲー シヨン） により他の物質 （例えば、 有機分子、 有機分子複合体、 無機材料等 ） を連結させるために、 有用である。
実施例
[0157] 以下に、 実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらの 実施例によって限定されるものではない。
[0158] 実施例 1 . 化合物の合成 1 （Method A）
<1 -1 . 使用機器 >
核磁気共鳴 （NMR） スぺクトルは Bruker AVANCE III HD 核磁気共鳴装置を 用いて測定し、 測定溶媒の残存シグナルを内部基準に化学シフトを算出した 。 エレクトロスプレーイオン化法による飛行時間型質量分析（ESI-TOF MS） には Bruker m i crOTOF focus III 質量分析装置を使用し、 移動相にメタノー ルもしくはアセトニトリル （ともに HPLCグレード） を用いた。 フーリエ変換 型赤外吸収 （FT-IR）スペクトルは Jasco FT/IR-4000 フーリエ変換型赤外分光 光度計を使用し、 ダイアモンドあるいはガリウムプリズムを用いた ATRモード で測定を行った。
[0159] <1 -2. 試薬 ·溶媒等 >
合成に用いた試薬 ·溶媒は、 市販品をそのまま用いた。 前駆体となるアジ ド化合物は既報 （Y. Zhao, P. Gong, B i oorg. Med. Chem. , 2014, 22, 6438- 6452） を参考に合成したものを用いた。
[0160] <1 -3-1 . 1 -（3-carboxypheny 1）-1 H-1 , 2, 3-t r i azo le-4-carba Idehyde （1）の 合成 >
化合物 1は以下のスキームに従い合成した。
[0161 ] [化 23]
Figure imgf000036_0001
1
[0162] 化合物 1は既報 (T. A. Bakka, M. B. Strom, J. H. Anderson, 0. R. Gaut un, Bioorg. Med. Chem. Lett. , 2017, 27, 1119-1123および丄 T. F Letcher , J. A. Cristensen, E. M. Vi l Ira, Tetrahedron Lett. , 2017, 58, 4450-4 454) を参考に合成した。 以下に具体的な合成項および化合物同定の結果を示 す。
[0163] 硫酸銅 (II)五水和物 (38 mg, 0.15 mmol)の水溶液 (7.5 mL)と t-プチルア ルコール (7.5 mL)の混合液に窒素雰囲気下、 アジド化合物 (0.60 mmol)およ びプロパルギルアルデヒドジエチルアセタール (115 !_, 0.80 mmol), アス コルビン酸ナトリウム (60 mg, 0.30 mmol)を加え、 70°Cで 24時間、 空気中室 温で 1時間攪拌した。 得られた懸濁液を飽和塩化ナトリウム水溶液 (10 mL)で 希釈し、 酢酸ェチル (50 mL X 3)で抽出後、 飽和塩化ナトリウム水溶液 (20 m L x 2)で洗浄した。 得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、 濾別した ろ液の溶媒を減圧留去した。 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに よって精製し、 化合物 1 (黄色固体)を得た。 図 1に1 H NMRスペクトルを示す。
[0164] Yield 48%; 'H NMR (400 MHz, DMS0-d6) : 510.12 (s, 1H), 9.67 (s, 1H),
8.48 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7. 72 (t, J = 7.8 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMS〇-d6) : 5184.9, 167.0, 147 .6, 136.0, 130.1, 130.0, 126.6, 124.0, 121.3; ESI-TOF MS (positive mo de) m/z calcd. for C10H7NaN3O3 [M+Na]+ 240.04, found 240.04; FT-IR (ATR mode, Ge prism), v cm-1: 3128, 2923, 1697, 1263, 1230, 1184, 757, 673 , 647。
[0165] <1-3-2. 1-(4-carboxypheny 1)-1 H-1 , 2, 3-tr i azo le-4-carba Idehyde (2)の 合成＞
[0166] [化 24]
Figure imgf000037_0001
[0167] 化合物 2 (黄色固体) は 4-azidobenzoic acidを前駆体に実施例 1-3-1と同様 に Method Aを用いて合成した。 図 2に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0168] Yield 63%; 'H NMR (400 MHz, DMS0-d6) : 510.13 (s, 1H), 9.69 (s, 1H),
8.18-8.12 (m, 4H) ; ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for C10H7NaN3 03 [M+Na]+ 240.04, found 240.04; FT-IR (ATR mode, Ge prism), v err1: 3 110, 1695, 1683, 1605, 1429, 1319, 1294, 1264, 989, 945, 864, 773, 70 2, 688。
[0169] <1-3-3. 1-(3, 5-d i carboxypheny 1)-1 H-1 , 2, 3-t r i azo le-4-carba Idehyde (
3) の合成 >
[0170] [化 25]
Figure imgf000037_0002
[0171] 化合物 3 (黄色固体) は 5-azidoisophthaUc acidを前駆体に実施例 1-3-1と 同様に Method Aを用いて合成した。 図 3に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0172] Yield 10 %; 'H NMR (400 MHz, DMS〇-d6) : 510.12 (s, 1H), 9.81 (s, 1H) , 8.65 (s, 2H), 8.56 (s, 1 H) ; FT-IR (ATR mode, Ge prism), v cm-1: 313 3, 1697, 1296, 1281, 1247, 1049, 830, 757, 678, 666, 566, 527。
[0173] <1-3-4. 1-(4-(d i ethy Lami no)pheny 1)-1 H-1 , 2, 3-t r i azo le-4-carba Idehyd
0 (4) の合成＞
[0174] [化 26]
Figure imgf000038_0001
4
[0175] 化合物 4 (茶色固体)
Figure imgf000038_0002
1と同様に 1^ 〇〇1 八を用いて合成した。 図 4に1 H 關(¾スぺクトルを示す。
[0176] 丫 ^ 60 %;
Figure imgf000038_0003
00013)： 510.12 ( ， ^), 8.36 ( ， ^),
Figure imgf000038_0006
,
[0177] <1-3-5. 1-(4-11161; 110
Figure imgf000038_0004
(5) の 合成 >
[0178] [化 27]
Figure imgf000038_0005
5
[0179] 化合物 5 (白色固体) は 1-azid〇-4-methoxybenzeneを前駆体に実施例 1-3-1 と同様に Method Aを用いて合成した。 図 5に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0180] Yield 68 %; 'H NMR (400 MHz, DMS0-d6) : 510.12 (s, 1H), 8.43 (s, 1H)
, 7.66 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.06 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H) ; 13
C NMR (100 MHz, DMS0-d6) : 5185.0, 159.9, 147.5, 129.3, 125.9, 122.4,
115.0, 55.7; ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for C10H9NaN3O-2 [M+N a]+ 226.06, found 226.06。
[0181 ] <1-3-6. 1 -pheny 1-1 H-1 , 2, 3-t r i azo le-4-carba Idehyde (6) の合成 >
[0182] [化 28]
Figure imgf000039_0001
&
[0183] 化合物 6 (茶色固体) は azidobenzeneを前駆体に実施例 1-3-1と同様に Metho d Aを用いて合成した。 図 6に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0184] Yield 9%; 'H NMR (400 MHz, DMS0-d6) : 510.11 (s, 1H), 9.57 (s, 1H), 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.66-7.54 (m, 3H)。
[0185] 実施例 2. 化合物の合成 2 (Method B)
使用機器、 試薬、 溶媒等は実施例 1と同様である。
[0186] <2-1. 1-benzy 1-1 H-1 , 2, 3-t r i azo le-4-carba Idehyde (7) の合成 >
[0187] [化 29]
Figure imgf000039_0002
[0188] 化合物 7は既報 (丄 T. Fletcher, Tetrahedron Lett., 2017, 58, 4450-44 54) を参考に合成した。 以下に具体的な合成項および化合物同定の結果を示 す。
[0189] 硫酸銅 (II)五水和物 (47.8 mg, 0.19 mmol)の水溶液 (7.5 mL)と t-プチル アルコール (7.5 mL)の混合液を 0 °Cに冷却し、 窒素雰囲気下、 アジ化ナトリ ウム (103 mg, 1.6 mmol)を加えた。 1 0分間室温で携拌したのち、 混合液に 臭化ベンジル (179 ML, 1.5 mmol), プロパルギルアルデヒドジエチルアセ タール (240 fxl 1.7 mmo〇を加え、 70°Cで 24時間、 空気中室温で 1時間攪拌 した。 反応溶液を室温まで空冷後、 飽和塩化ナトリウム水溶液 (5 mL)で希釈 し、 酢酸エチル (30 mL X 3)で抽出した。 得られた有機層を硫酸マグネシウ ムで乾燥させ、 固体を濾別して得られたろ液を減圧留去した粗生成物をシリ カゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 2:1) により精製 して化合物 7 (白色固体) を得た。 図 7に iH NMRスぺクトルを示す。
[0190] Yield 46%; 'H NMR (400 MHz, DMS0-d6) : 510.00 (s, 1H), 8.95 (s, 1H),
7.41-7.32(m, 5H), 5.69 (s, 2H) ;
Figure imgf000040_0001
DMS0-d6) : 5185.0, 1 47.0, 135.3, 128.9, 128.4, 128.3, 128.1, 53.2; ESI-TOF MS (positive m ode) m/z calcd. for C10H9NaN3O [M+Na] + 210.06, found 210.06; FT-IR (ATR mode, Ge prism), v cm-1 : 1694, 1535, 1237, 1165, 1052, 877, 796, 767, 714, 701, 565, 556, 543, 532, 515, 505。
[0191 ] <2-2. 1 -(naphtha len-2-y Ime thy 1)-1 H-1 , 2, 3-t r i azo le-4-carba Idehyde (
8) の合成 >
[0192] [化 30]
Figure imgf000040_0002
[0193] 化合物 8 (白色固体) は 2-(bromomethy l)naphthaleneを前駆体に実施例 2-1 と同様に Method Bを用いて合成した。 図 8に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0194] Yield 20%; 'H-NMR (400 MHz, CDCl3)： 510.13 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7 .90-7.80 (m, 4H), 7.57-7.53 (m, 2H), 7.38-7.35 (m, 1H) 5.75 (s, 2H) ; ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for C14H”NaN30 [M+Na]+ 260.08, fo und 260.08; FT-IR (ATR mode, Ge prism), v cm-1 : 3121, 1709, 1538, 1239 , 1177, 1052, 1026, 866, 835, 792, 761, 563, 553, 527, 511。
[0195] 実施例 3. 化合物の合成 3 (Method C)
使用機器、 試薬、 溶媒等は実施例 1と同様である。
[0196] <3-1. 1-(p-to ly 1)-1 H-1 , 2, 3-t r i azo le-4-carba Idehyde (9) の合成 >
[0197] [化 31]
Figure imgf000040_0003
[0198] 化合物 9は既報 (0.-å. 13〇, X. (: ， 丄 じ 八- X· じ ， ！_ じ ， 〇 -X· 〇リ o, Tetrahedron Lett. , 2007, 48, 3525-3529) を参考に合成した。 以下に具 体的な合成項および化合物同定の結果を示す。
[0199] 4-methy Ipheny Iboron i c acid (136 mg, 1.0 mmo l)とアジ化ナトリウム (98 mg, 1.5 mmol) を含むメタノール溶液 (5 mL) に硫酸銅 (II)五水和物 (47.8 mg, 0.19 mmol)を含む純水 (5 mL)を加え空気下 5時間撹拌した。 続いて、 窒 素雰囲気下、 アスコルビン酸ナトリウム (79 mg, 0.4 mmol) およびプロパル ギルアルデヒドジエチルアセタール (286 ML, 1.7 mmol)を加え、 70°Cで 24 時間、 空気中室温で 1時間攪拌した。 反応溶液を室温まで空冷後、 飽和塩化ナ トリウム水溶液 (40 mL)で希釈し、 酢酸エチル (50 mL X 3)で抽出した。 得 られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、 固体を濾別して得られたろ液 を減圧留去した粗生成物をクロロホルム (3 mL) に溶解し、 純水 (3 mL) お よびトリフルオロ酢酸 (3 mL) を添加し、 室温で強く撹拌した。 飽和塩化ナ トリウム水溶液 (30 mL)で希釈し、 有機層をクロロホルム (30 mL X 3)で抽出 した。 得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、 固体を濾別して得ら れたろ液を減圧留去した粗生成物を再沈殿 (ヘキサン：クロロホルム) により 精製して化合物 9 (白色固体) を得た。 図 9に1 H NMRスペクトルを示す。
[0200] Yield 71%; 'H NMR (400 MHz, CDCl3)： 510.2 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 7.
64 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H) ; 13C NM R (100 MHz, CDClg)： 5185.3, 148.2, 140.3, 134.0, 130.7, 123.2, 120.9, 21.3; ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for C10H9N3ONa [M+Na]+ 210. 06, found 210.06〇
[0201] 実施例 4. 化合物の合成 4 (Method D)
使用機器、 試薬、 溶媒等は実施例 1と同様である。
[0202] <4-1. 1-(4-n i t ropheny 1)-1 H-1 , 2, 3-t r i azo le-4-carba Idehyde (10) の合 成 >
[0203] [化 32]
Figure imgf000042_0001
[0204] 化合物 10は既報 (丄 T. Fletcher, J. E. ReiUy, Tetrahedron Lett., 20 11, 52, 5512-5515) を参考に合成した。 以下に具体的な合成項および化合物 同定の結果を示す。
[0205] アジ化ナトリウム (358 mg, 5.5 mmol) の水溶液 (25 mL)と t-プチルアル コール (25 mL)の混合液を 0 °Cに冷却し、 n i t robenzened i azon i um tetraf luo roborate (1.18 g, 5.0 mmo l)を少量ずつ加え、 その後 1時間強く携拌した。 続いて、 窒素雰囲気下、 プロパルギルアルデヒドジエチルアセタール (783 fjil, 5.5 mmol)およびアスコルビン酸ナトリウム (396 mg, 2 mmol) を加え 、 70 °Cで終夜撹拌した。 反応溶液をろ過し、 ろ液を酢酸エチル (50 mL X 3) で抽出した。 有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、 溶媒を減圧留去し、 粗生 成物を再沈殿 (ヘキサン：酢酸エチル) により精製して化合物 10 (黄色固体) を得た。 図 10に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0206] Yield 62%; 】H NMR (400 MHz, DMS0-d6) : 510.15 (s, 1H), 9.78 (s, 1H),
8.49 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 8.32 (d, J = 9.2 Hz, 2H) ;
Figure imgf000042_0002
DMS0-d6) : 5185.0, 147.8, 147.4, 140.3, 126.9, 125.6, 121.5; ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for CgH6N403Na [M+Na]+ 241.03, found 241.0 3〇
[0207] 実施例 5. 化合物の合成 5 (Method E)
使用機器、 試薬、 溶媒等は実施例 1と同様である。
[0208] <5-1. 5-methy l-1-pheny 1-1 H-1 , 2, 3-t r i azo le-4-carba Idehyde (13) の合 成 >
化合物 13は既報 (丄 Zhang, G. Jin, S. Xiao, J. Wu, S. Guo, Tetrahedr on 2013, 69, 2352-2356と I. Ibnusaud, B. Singaram, J. Org. Chem. , 2018 , 83, 1431-1440および T. Ismai l, S. Shafi, I. Hyder, T. Sidiq, A. Khaj \¥02020/175680 42 卩(：17 2020 /008357
Figure imgf000043_0001
015, 348, 796-807) を参考に、 以下のスキームで合成した。
[0209] [化 33]
Figure imgf000043_0002
[0210] <5-1-1■ 61:11 I 5-（1161:1^ 1-1- 116门 1-1 N-1 , 2, 3-1: .18 〇 16-4-08 13〇乂 1^士6 （1
1） の合成 >
フエニルアジド （120 11^, 1.0 11111100のジメチルホルムアミ ド（10 〇!）、 純 水 混合液にアセト酢酸エチル （1.5 11111100とピペリジン （20 0.2
1111110〇を加え、 80°〇で 24時間攪拌した。 この溶液に水 （20 〇!）を加えて反応 を止めた後、 ジエチルエーテル （20 1111_ X 5）で抽出し、 得られた有機層を水 （20 «!!_ X 2）で洗浄した。 有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、 濾別して得られ たろ液の溶媒を減圧留去した。 得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマ トグラフィー （ヘキサン： 酢酸エチル）により精製し化合物 11（白色固体）を得 た。
[0211] 丫 ^ 27 %; （400 1^ ， 00013） : 57.61-7.55 （111, 3 ， 7.47-7.44 （111, 2 , 4.47
Figure imgf000043_0003
」 = 7.1 ， 2 , 2.60 （ ， 3 , 1.46 （士， 」 = 7.1 ，
3
[0212] <5-1-2. （5-11161;11 1-1-卩116 1-11"1-1 , 2, 3-1;「 .1 〇 1-4- 1）11161;113门〇 I （12） の 合成 >
化合物 11 （0■ 12 11111100およびナトリウムメ トキシド （1 1^, 2 〇〇のメ タノール （1
Figure imgf000043_0004
溶液に、 窒素雰囲気下、 水素化ホウ素ナトリウム （29 1119, 0 .77 111（1100を加え、 室温で 3時間攪拌した。 反応溶液に過剰のメタノールを加 え反応を停止させ、 減圧下で濃縮し、 残渣を飽和塩化ナトリウム水溶液 （5 «1 \¥02020/175680 43 卩（：171? 2020 /008357
!_）で希釈した。 これをジエチルエーテル （20 111 X 3）で抽出し、 飽和塩化ナ トリウム水溶液 （5 «!!_ X 2）で洗浄した。 得られた有機層を硫酸ナトリウムで 乾燥後ろ過、 ろ液の溶媒を減圧下で濃縮して得られた粗生成物をシリカゲル カラムクロマトグラフィー （ヘキサン： 酢酸エチル = 2:1）で精製し、 化合物 12 （白色固体） を得た。 図 11に1 關（¾スペクトルを示す。
[0213] 丫 ^ 37 %; 關（¾ （400 1^ ， 00013）： 57.58-7.52 （111, 3 ， 7.48-7.46
（111, 2 , 4.83 （ 」 = 6.0 ， 2 , 2.37 （ ， 2 , 1.96 （士， 」 = 6.0 ，
[0214] <5-1-3. 5-11161;11 1-1 -卩116 1-11"1-1 , 2, 3-1;「 .1 〇 16-4-031^31〇1611 〇16 （13） の 合成 >
化合物 12 （0.16 11111100のクロロホルム （5 〇!）溶液に、 活性二酸化マンガン（1 41 1119, 1.6 1^〇1）を加え、 窒素雰囲気下、 室温で 24時間攪拌した。 反応混合 物をろ過、 得られたろ液の溶媒を減圧下で留去して化合物 13（白色固体）を得 た。
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
[0226] 化合物 16 (白色固体) は化合物 15を前駆体に実施例 5-1-3と同様の手法で合 成した。 図 12に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0227] Yield 75 %; 'H NMR (400 MHz, DMS〇-d6) : 510.21 (s, 1H), 7.74-7.66 (m , 5H)0
[0228] 実施例 6. 化合物の合成 6 (Method F)
使用機器、 試薬、 溶媒等は実施例 1と同様である。
[0229] <6-1 1-(2-(2-(prop-2-yn-1-y loxy)ethoxy)e thy 1)-1 H-1 , 2, 3-tr iazo le-4
-carba Idehyde (17) の合成 >
[0230] \¥02020/175680 45 卩（：17 2020 /008357
[化 37]
Figure imgf000046_0001
[0231 ] 化合物 10 （109 1119, 0.5 11111101） および 2-（2-（2-卩「〇卩 1〇 ）61;11（« ]61;11 111_1门6 （72 1_, 0.5 111111〇1）を純水 （1 〇!）、 1;-ブチルアルコール （1 〇!）の混合 液に分散させ、 窒素雰囲気下、 60°〇で終夜撹拌した。 反応溶液を 0 °〇まで冷 却後、 0, 1 11/1
Figure imgf000046_0002
39. （50
Figure imgf000046_0003
を加え反応を停止させ、 酢酸エチル （20 1111_ X
3）で抽出した。 有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、 溶媒を減圧留去し、 粗 生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ヘキサン：酢酸エチル = 0 ~ 60%） により精製して化合物 17 （黄色オイル） を得た。 図 13に1 H 關（¾スペクト ルを示す。
[0232] 丫 ^ 70%; 關（¾ （400 1^ ， 003〇\1） : 510.04 （$, ^）, 8.42 （ ， ^）, 4
.59 （士， 」 = 5.1 ， 2 ， 4.11 （ 」 = 2.4 ， 2 ， 3.87 （t, J = 5.1 H å
Figure imgf000046_0004
1 .3; （pos.i
Figure imgf000046_0005
干〇 。10^1131\13〇3 [11/1+ ]+ 246.0
8, 干〇 〇1 246.08〇
[0233] 実施例 7. 化合物の合成 7: 機能#分子の合成
使用機器、 試薬、 溶媒等は実施例 1と同様である。 反応前駆体は、 購入ある いは適宜合成したものを用いた。
[0234] <7-1■ 1\1-（2-（2-（2-（2-（4-'（:〇「11^ 1-1 N-1 , 2, 3-1;「 .1 〇 1-1 - 1）61; 110乂 ） 61; 110乂 ）
61; 110乂 ） 61; 11
Figure imgf000046_0006
门士8 111_1〇16 （18） の合成 >
[0235] \¥02020/175680 46 卩（：171? 2020 /008357
[化 38]
Figure imgf000047_0001
18
[0236] 化合物 18 （白色固体） は、 1\1-（2-（2-（2-（2 - 3å丨〇1〇61;11〇乂 ）61;11〇乂 ）61;11〇乂 ）61;11
Figure imgf000047_0002
1111'^3å〇 1-4- 1）卩6门士3门8111.1〇16 を前駆体に実施例 1-3-1と同様の手法 （1^ 〇〇1 八） を用いて合成した。 図 14に1 H 關（¾スぺク トルを示す。
[0237] 丫_16^ 23%; （¾ （400 1^ ，
Figure imgf000047_0004
510.0 （$,
Figure imgf000047_0003
, 8.47 （8, ⑻， 6.49 （8, ⑻， 5.17 （ ， ⑻， 4.98 （ ， ⑻， 4.60 （ 」
= 5.0 ， 2 ， 4.42-4.38 （ ， ^）, 4.24-4.21 （111, ^）, 3.88 （士， 」 = 5.0 ， 2 ， 3.59-3.55 （ ， 2 ， 3.54 （〇1, 6 ， 3.45 （士， 」 = 5.6 ， 2 ， 3.27 （士， 」 = 5.6 ， 2 ， 3.17-3.12 （111, ^）, 2.88 （（^, 」 = 5.0, 12.6 ， ^）, 2.63 （ 」 = 5.0, 12.6 ， ^）, 2.12 （士， 」 = 7.3 ， 2^, 1. 63-1.49 （111, 41·!）, 1.41-1.34 （111, 21·!）;
Figure imgf000047_0005
1〇 干〇「 02/341\1606 ［11/1+ ］+ 521.1, 干〇 521.10
[0238] <7-2. 1-（3' , 6' -〇1111 〇1「（^-3-〇 〇-31'1-3 I「〇［ I 〇^门 〇干 1_1「8门-1 , 9’ - 8门1;116门 ］-5- 1）-1 ^1-1 , 2, 3-1;「丨 〇 16-4-031^31〇161^〇16 （19） の合成 >
[0239] ［化 39］
Figure imgf000047_0006
[0240] 化合物 19 （オレンジ色固体） は、 5-8å'^〇-3, , 6' -〇11 hydroxy-3H-spi ro［isob ㊀门 〇·!111「8 1 , 9’ -乂8^;116 -3-〇 を前駆体に実施例 1-3-1と同様の手法 （1^1:110 を用いて合成した。 図 15に1 關（¾スぺクトルを示す。 [0241] Yield 47%; 'H NMR (400 MHz, DMS〇-d6) : 510.19 (s, 2H), 10.15 (s, 1H)
, 9.80 (s, 1H), 8.60 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.43 (dd, J = 2.0, 8.3 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.71-6.67 (m, 4H), 6.57 (dd, J = 2.2, 8.7 Hz, 2H); 'SC NMR (100 MHz, CDCl3): 5185.0, 167.5, 159.7, 152.6, 15 1.9, 147.7, 137.4, 129.2, 128.0, 127.9, 126.8, 126.0, 116.7, 112.7, 1 08.9, 102.3, 83.6; ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for C23H14N306 [M+H] + 428.09, found 428.10。
[0242] <7-3. Polyethylene glycol-tethered t r i azo le-4-carba Idehyde (MW.
4 kDa) (20) の合成 >
[0243] [化 40]
Figure imgf000048_0001
20
[0244] 化合物 20 (褐色固体) は、 既報 (M· B· van ELdijk, F. C. M. Smit, N· V ermue, M. F. Debets, S. Schof fe Len, J. C. M. van Hest, B i omacromo Lecu les, 2014, 15, 2751-2759) を参考に分子量約 4 kDaの Po Lyethy Lene Glycol Monomethyl Ether (東京化成工業株式会社製) を出発原料に、 実施例 1-3-1 と同様の手法を用いて合成した。 精製は、 ジエチルエーテルによる再沈殿に より行った。 図 16に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0245] Yield 50%; 'H NMR (400 MHz, CDCl3)： 510.14 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 4 .63 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.91-3.45 (m, 366H)。
[0246] <7-4. 1-(2-(2-(2-(2-az i doe thoxy)ethoxy)ethoxy)e thy 1)-1 H-1 , 2, 3-tr ia zo le-4-carba Idehyde (21) の合成 >
[0247] [化 41]
Figure imgf000048_0002
21 [0248] 化合物 21 (黄色オイル) は、 1-az id〇-2-(2-(2-(2-az idoethoxy) ethoxy) eth oxy)ethaneを前駆体に実施例 1-3-1と同様の手法 (Method A) を用いて合成し た。 図 17に iH NMRスぺクトルを示す。
[0249] Yield 27% ; 'H NMR (400 MHz, CDCl3)： 510.1 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 4 .62 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.68 (m, 4H), 3.65 -3.63 (m, 6H), 3.38 (t, J = 5.0 Hz,
Figure imgf000049_0001
CDCl3)： 518 5.4, 148.0, 126.9, 70.7 (two signal were marged), 70.7 (two signals w ere merged), 70.2, 69.0, 50.8, 50.7; ESI-TOF MS (positive mode) m/z c alcd. for CnH18N604Na [M+Na]+ 321.1, found 321.10
[0250] <7-5. 化合物 22 の合成 >
[0251] [化 42]
Figure imgf000049_0002
[0252] 化合物 22 (黄色固体) は、 N-(3-aminopropionyl)-5, 6-d i hydro-11, 12-dide hydrodibenz[b, f]azocineを前駆体に実施例 6と同様の手法 (Method F) を用 いて合成した。 図 18に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0253] Yield 75%; 'H NMR (400 MHz, CD3CN) : 59.89 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.
62 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.45-7.43 (m, 4H), 7.39-7.32 (m, 2H), 7.22 (d d, J = 1.4, 7.4 Hz, 1H), 5.06 (d, J = 14 Hz, 1H), 4.45 (m, 2H), 3.66 (d, J = 14 Hz, 1H), 2.90 (td, J = 6.0, 17 Hz, 1H), 2.35 (td, J = 6.0, 17 Hz, 1 H) ; ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for CnH18N6〇4Na [M+N a]+ 321 1, found 321 1。
[0254] 実施例 8. ペプチド N末端修飾 1
<8-1. 試薬 ·溶媒等 >
超純水は MiUipore Integra 13により精製したものを用いた。 その他の試薬 溶媒は、 市販品をそのまま用いた。
[0255] <8-2. ペプチド N末端修飾 >
本手法では、 ペプチド N末端を標的としている。 対象となりうるペプチドは N末端アミノ基が未修飾であること加え、 N末端から 2番目のアミノ酸残基がプ ロリン以外のアミノ酸であるものである。 具体的な実施例として、 アンジオ テンシン Iの N末端修飾について示す。
[0256] アンジオテンシン Iのアミノ酸配列を示す。
DRVYIHPFHL (配列番号 1) 。
[0257] ペプチド N末端修飾は、 既報 (丄 I. MacDonald, H. K. Munch, T. Moore,
M. B. Francis, Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 326-331) を参考に行った。 以 下に具体的な実験項を示す。
[0258] 化合物 7のジメチルスルホキシド (DMS0)溶液 (200 mM, 1 ^L, 0.2 ^mol, 終濃度 10 mM) をリン酸カリウム緩衝液 (10 mM, pH 7.5, 17 ML) で希釈し 、 ここにペプチド水溶液 (1 mM, 2 ML, 2 nmol, 終濃度 100 MM) を加え、 3 7°Cで 4時間振とうした。 LC/MSを用いて、 修飾率 [=修飾ペプチド/ (総ぺプ チド量) ] について、 質量スペクトルにおけるピーク強度から評価を行った 。 結果を図 19に示す。 本反応条件における修飾率は 89%と算出された。 以上の 結果より本化合物群がタンパク質修飾剤として機能することが確かめられた
[0259] 実施例 9. ペプチド N末端修飾 2
試薬 ·使用機器、 溶媒等については実施例 8と同様である。 化合物 24は既報 (H. Hagiwara, S. Okada, Chem. Commun. , 2016, 52, 815-818) に従って合 成したものを用いた。
[0260] <9-1. ペプチド N末端修飾 >
モデルべプチドを基質とし、 本修飾反応における生成物の構造解析を行った 。 具体的な実施例として以下のスキームに示す反応を行った。
[0261] \¥02020/175680 50 卩（：171? 2020 /008357
[化 43]
Figure imgf000051_0001
[0262] 化合物 23 （11 1^, 0.04111111〇〇のリン酸カリウム緩衝液 （10 1^, pH 7.5, 1 .8 111）に化合物 24 （441^, 0.4111111〇1） のジメチルホルムアミ
Figure imgf000051_0002
200 ^1） を加え、 37°◦で 16時間振とうした。 溶媒を減圧留去し、 得られた粗 生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （酢酸エチル： アセトニトリ ル： 水 = 95: 5: 0 - 0: 95: 5） により精製し、 化合物 25を得た。
[0263] <9-2. 化合物 25の1 H關[¾解析 >
重アセトニトリル中での化合物 25の1 H關（¾スぺクトルの帰属結果を図 20に示 す。
[0264] 5.7 卩 111の 2本のピークは 4 -イミダゾリジノン環の 2位に特有のプロトン に 帰属されるので、 本反応によって、 ペプチド 1\1末端における 4 -イミダゾリジノ ン環形成が進行することが確認された。 なお、 2つのピークは、 4 -イミダゾ リジノン環の 2位を不斉点とするアイソマーに由来する。
[0265] 実施例 10. タンパク質 !\!末端修飾 1
<10-1. 試薬 ·溶媒等 >
ウシ脖臓由来リボヌクレアーゼ八 （1^336）は（^0（^6社より購入した。 超純水 は1^_|11 〇「6 1^691^13により精製したものを用いた。 その他の試薬 ·溶媒は 、 市販品をそのまま用いた。
[0266] <10-2. タンパク質修飾 >
本手法では、 タンパク質 1\1末端を標的としている。 対象となりうるタンパク 質は 1\1末端アミノ基が未修飾であること加え、 1\1末端から 2番目のアミノ酸残基 がプロリン以外のアミノ酸であるものである。 具体的な実施例として、 ウシ 脖臓由来リボヌクレアーゼ （1^336）の1\1末端修飾について示す。
Figure imgf000051_0003
KETAAAKFER QHMDSSTSAA SSSNYCNQMM KSRNLTKDRC KPVNTFVHE SLADVQAVCS QKNV ACKNGO TNCYOSYSTM SITDCRETGS SKYPNCAYKT TQANKHIIVA CEGNPYVPVH FDASV （ 配列番号 2） 。
[0268] タンパク質 N末端修飾は、 既報 （丄 I. MacDonald, H. K. Munch, T. Moore , M. B. Francis, Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 326-331） を参考に行った。 以下に具体的な実験項を示す。
[0269] 化合物 7のジメチルスルホキシド （DMS0）溶液 （200 mM, 2.5
Figure imgf000052_0001
0.5 ^mo し 終濃度 10 mM） をリン酸カリウム緩衝液 （10 mM, pH 7.5, 45 ML） で希釈 し、 ここに RNase超純水溶液 （1 mM, 2.5 ML, 2.5 nmol, 終濃度 50 /xM） を 加え、 37°Cで 16時間振とうした。 LC/MSを用いて、 修飾率 [=修飾された RNas e/ （総 RNase童） ] について、 質童スぺクトルにおけるピーク強度から評価 を行った。 結果を図 21に示す。 本反応条件における修飾率は 88%と算出された 。 必要に応じて、 反応後の生成物をサイズ排除クロマトグラフィーにより精 製した。
[0270] 実施例 11. タンパク質 N末端への機能#分子修飾
<11-1. 試薬 ·溶媒等 >
ウシ脖臓由来リボヌクレアーゼ A （RNase）は Roche社より購入した。 超純水 は MiUipore Integra 13により精製したものを用いた。 その他の試薬 ·溶媒は 、 市販品をそのまま用いた。
[0271] <11-2. タンパク質 N末端へのピオチンの修飾 ñ
化合物 18を修飾剤に用い、 実施例 10-2と同様の手法により、 タンパク質 N末 端へのピオチン修飾を行った。 生成物の LC/MS分析の結果を図 22に示す。 ピオ チン部位の修飾率は 79%と算出された。
[0272] <11-3. タンパク質 N末端への蛍光色素の修飾 >
化合物 19を修飾剤に用い、 実施例 10-2と同様の手法により、 タンパク質 N末 端への蛍光色素 （ここではフルオレセイン分子） 修飾を行った。 生成物の LC/ MS分析の結果を図 23に示す。 蛍光色素部位の修飾率は 73%と算出された。
[0273] <11-4. タンパク質 N末端へのアジド基の修飾 > \¥0 2020/175680 52 卩（：171? 2020 /008357
化合物 21を修飾剤に用い、 実施例 10-2と同様の手法により、 タンパク質 1\1末 端へのアジド基修飾を行った。 生成物の
Figure imgf000053_0001
分析の結果を図 24に示す。 アジ ド基の修飾率は 79%と算出された。
[0274] <1 1 -5. タンパク質 1\1末端に修飾されたアジド基を起点とした機能性分子修 飾 >
実施例 1 1 -4にて作製したアジド基が修飾された 1^336に対して、 ひずみ促進 型アルキンーアジド環化付加反応による蛍光色素の修飾を行った。 アルキン 基質としてジベンゾシクロオクチン部位を有するフルオレセイン、 化合物 26 を反応に用いた。 図 25にスキームおよび結果を示す。
[0275] を含むリン酸緩衝溶液
Figure imgf000053_0002
120
Figure imgf000053_0003
終濃度 20
Figure imgf000053_0004
緩衝溶液濃度 10 11^, pH 7. 5, 82. 3 ^1） に対し、 化合物 26のジメチルスルホ キシド 1^0）溶液 （101^, 1 終濃度 100
Figure imgf000053_0005
を加え、 4 °〇で 16時間静 置した。 蛍光色素部位の修飾率は 55%と算出された。
[0276] <1 1 -6. タンパク質 1\1末端への歪んだアルキン部位の修飾 >
化合物 22を修飾剤に用い、 実施例 10-2と同様の手法により、 タンパク質 1\1末 端へのひずんだアルキン部位の修飾を行った。 生成物の
Figure imgf000053_0006
分析の結果を図 26に示す。 シクロオクチン部位の修飾率は 40%と算出された。
[0277] 実施例 12. 不均一反応に向けた、 反応剤因定化樹脂の合成
実施例 6に示した化合物 10とアミン前駆体間の転位反応による新たな 1\1末端 選択的修飾剤の構築は銅触媒を用いないクリーンな反応として有用である。 そこで種々のカルボアルデヒド前駆体を樹脂あるいは固体材料上に固定化す ることで、 反応後生じる副生物 （アニリン誘導体） の除去を簡便にし、 反応 後の溶液をタンパク質 !\!末端修飾に直接利用する手法を図 27に示す。
[0278] <12-1 . 使用機器、 試薬 ·溶媒等 >
使用機器および試薬 ·溶媒は実施例 1および 8と同様である。 アミノメチル ポリスチレン樹脂は東京化成工業株式会社より購入したものを用いた。
[0279] <12-2. 反応剤固定化樹脂の合成 >
具体的な実施例として、 化合物 27を固定化したポリスチレン樹脂の合成に ついて図 28に示す。 図 29に示したスキームに従って合成を行った。
[0280] アミノメチルポリスチレン樹脂 (Ami nomethyl/PS resin, 200 mg) を DMF ( 30 mL) に分散後、 10分間振とうし、 膨潤した。 樹脂の分散液中に、 5-azido- 2-mtrobenzoic acid (208 mg, 1.0 mmol) と 1-hydroxybenzotr i azo le monoh ydrate (200 mg, 1.3 mmol) および N, N’ -di isopropylcarbodi imide (156 /JLL , 1.0 mmol) を加え、 終夜振とうした。 反応後の樹脂をろ過し、 ジメチルホ ルムアミ ド ·純水 · クロロホルム、 アセトンの順で洗浄し減圧下で乾燥した 。 続いて、 未反応アミノ基を不活性化するため、 無水酢酸 (1 mL) クロロホ ルム (4 mL) 混合溶液で 30分処理を行い、 クロロホルム · メタノール、 アセト ンで洗浄し、 減圧下で乾燥し、 アジド基を修飾したポリスチレン樹脂 (Azido /PS resin) を得た。
[0281] Az ido/PS resin (220 mg) を DMF/水混合溶液 (6:1, 7 mL) にて膨潤した 後に、 硫酸銅 (II)五水和物 (25 mg, 0.1 mmol)、 アスコルビン酸ナトリウ ム (40 mg, 0.2 mmol) およびプロパルギルアルデヒドジエチルアセタ _ル ( 356 ML, 2.5 mmol)を樹脂分散液に加え、 室温下で 12時間振とうした。 反応 後の樹脂をろ過し、 ジメ トルホルムアミ ド ·純水 · クロロホルム、 メタノー ル、 アセトンの順で洗浄した。 続いて、 12%アンモニア水溶液 (5 mL) で 10分 間処理し、 ろ過後、 純水で洗浄して、 樹脂表面に残存する銅触媒を除去した 。 最後に、 塩酸水溶液/テトラヒドロフラン混合溶液 (1:1, 5 mL) で各 2分間 、 計 3回処理し、 ろ過後、 純水およびアセトンで洗浄することにより、 アセタ —ル保護基の脱保護を行い、 化合物 27が固定化された樹脂 (27/PS resin) を 得た。
[0282] <12-3. 樹脂の同定 >
化合物 27が固定化された樹脂 (27/PS resin) の表面上の化学種を赤外分光 法により同定した。 図 30に結果を示す。 アジド基が修飾された樹脂 (Azido/P S resin) では 2115 cm-Uこアジド基に特徴的な伸縮振動が観察された。 次に Cu AAC反応によるトリアゾール環の形成後の樹脂 (27/PS resin) ではアジド基 の伸縮振動のピークが消失し、 新たにアルデヒド基の伸縮振動に由来する 169 9 cm の吸収が観測された。 以上の結果から、 CuAAC反応によるアルデヒド基 の修飾を支持するものであり、 27/PS resinが調製できたことが明らかとなっ た。
[0283] <12-4. タンパク質 N末端修飾 >
作製した反応剤固定化樹脂 (27/PS resin) を用いた、 N末端修飾剤の調製 ならびに連続したタンパク質 N末端修飾を行った。 具体的な実施例として、 リ ボヌクレアーゼ A (RNase A) N末端修飾について示す。
[0284] ベンジルアミンのジメチルスルホキシド溶液 (100 mM, 50 !_,
Figure imgf000055_0001
27/PS resin (5 mg) を加え、 ヒートブロックを用いて 100 °Cで 90分間加熱し た。 室温まで空冷したのち、 上澄み液 (10 ML, 1 Mmol) をリン酸緩衝溶液 (10 mM, pH 7.5, 85 し) で希釈し、 ここに RNase A溶液 (1 mM, 5
Figure imgf000055_0002
5 nmol) を加え、 37°Cで 16時間振とうした。 反応後、 LC/MSを用いた修飾評価を 行った。 反応剤固定化樹脂 (27/PS resin) を用いた場合においても、 単離精 製した N末端修飾剤を用いた場合と同程度の修飾率 (75%) が得られた。 以上 より、 反応剤固定化樹脂 (27/PS resin) を用いた連続反応によるタンパク質 N末端修飾法を実証した。 結果を図 31に示す。
[0285] <12-5. 反応剤固定化樹脂の合成法の改善 >
実施例 12-3において、 タンパク質修飾を行ったサンプルでは、 タンパク質 に対し酸素が付加したような生成物が見られた。 これは、 樹脂合成に用いた 銅触媒が樹脂上に残留したためと考えられる。 そこで、 新たな合成スキーム のもと 27/PS resinを作成し、 タンパク質修飾に適用した。 具体的には、 図 32 に示すスキーム従って 27/PS resinを調製した。
[0286] <12-5-1. 5-Az i do-2-n i t robenzo i c Acid (28) の合成 >
[0287] [化 44]
Figure imgf000055_0003
28 [0288] 5-am i no-2-n i t robenzo i c acid (1.60 g, 8.9 mmol) を含む濃 HC l/Et0H/H20 混合溶媒 (2:1:2, total 43 mL)に対して亜硝酸ナトリウム (727 mg, 10.5 m mol) の水溶液 (6 mL) を添加し 0 °Cで 1 時間撹拌した。 続いてアジ化ナト リウム (868 mg, 13.4 mmol) を少量ずつ添加し、 その後溶液を 0 °C で 1 時 間激しく撹拌し、 続いて室温で 1時間撹拌した。
[0289] 反応溶液を超純水で希釈し、 ろ過したのち超純水 (20 mL X 2)で洗浄した 。 減圧下で乾燥することで化合物 28 (淡黄色固体)を得た。 図 33に1 H NMRスぺ クトルを示す。
[0290] Yield 37 %; 'H NMR (400 MHz, DMS0-d6) : 8, 8.1 (d, J = 9.4 Hz, 3H), 7.43-7.41 (m, 2H) ; 13C NMR (100 MHz, DMS0-d6) : 8, 165.8, 145.3, 143.4, 130.8, 126.2, 121.7, 119.6; ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. fo r C7H4NaN404 [M+Na]+231 012, found 231.011。
[0291 ] <12-5-2. 2, 5-Di oxopyrro l id i n-1-y l-5-(4-f ormy 1-1 H-1 , 2, 3-tr iazo l-1-y l)-2-ni trobenzoate (30)の合成 >
[0292] [化 45]
Figure imgf000056_0001
[0293] 化合物 28 （1.75 9, 8.411111101） および 3, 3 -〇1_161;11（« 卩「〇卩-1 - （1.2 〇11_ 1.
08 9, 8.4111111〇1）を純水 （21 〇!）、 士 -ブチルアルコール （21 〇!）の混合液に分 散させ、 硫酸銅（II）五水和物 （419 1^, 1.68 1111110し 20 〇1〇 ）およびアスコル ビン酸ナトリウム（666 1119, 3.36
Figure imgf000056_0002
40 〇1〇 ）を添加し、 窒素雰囲気下、 7 0 で終夜撹拌した。 反応溶液を室温まで冷却後、 飽和食塩水を加え反応を停 止させ、 酢酸エチル （20 1111_ X 3）で抽出した。 有機層を硫酸ナトリウムで乾 燥させ、 溶媒を減圧留去し、 化合物 29を含む粗生成物を得た。 精製操作を省 略し、 次の反応にそのまま用いた。
[0294] 粗生成物を含む
Figure imgf000056_0003
（7641119, 6.64111111 〇1）を添加し、 室温で 10分携拌した。 次に、 1\1,1\1’-〇1_10 〇1〇116乂 03「130〇1_1_1111_1〇16 \¥02020/175680 56 卩（：171? 2020 /008357
（1.149, 5.5 |^〇〇を加え、 反応混合溶液を終夜撹拌した。 沈殿物を濾別し たのち、 ろ液を減圧下で乾燥し、 溶媒を除いた。 残渣を酢酸エチル（50
Figure imgf000057_0001
に 溶解し、 生じた沈殿物を再び濾別した。 得られたろ液を飽和食塩水（20 «!!_ X 2）で洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、 溶媒を減圧留去し、 化合 物 29を含む粗生成物を得た。 シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精 製により、 化合物 30 （淡黄色固体）を得た。 図 34に 關（¾スペクトルを示す。
[0295] 丫 ^ 18 % （3 6「 2 3士6卩3）; （¾ （400 1^ ， 01^0 6）:
Figure imgf000057_0002
10.15 （ ，
^）, 9.91 （8, ^）, 8.64-8.61 （ ， 2 , 8.57-8.55 （111, ^）, 2.91 （ ，
, 1
Figure imgf000057_0006
[0296] <12-5-3. 27/9$ ^3丨门の合成2>
アミノメチルポリスチレン樹脂 （八111_1门 011161;11 /?3 「㊀ 丨门， 200
Figure imgf000057_0003
（ 5 に分散後、 1時間振とうし、 膨潤させた。 樹脂の分散液中に、 30 （150 1119, 0 4211111101） および 1\1, 1\1’- isopropylcarbodi
Figure imgf000057_0004
（146 ^,1, 0 8411111101 ） を加え、 終夜振とうした。 反応後の樹脂をろ過し、 ジメチルホルムアミ ド -純水 · クロロホルム、 アセトンの順で洗浄し減圧下で乾燥した。 続いて、 未反応アミノ基を不活性化するため、 無水酢酸（1
Figure imgf000057_0005
クロロホルム（41111_） 混合溶液で 30分処理を行い、 クロロホルム · メタノール、 アセトンで洗浄し 、 減圧下で乾燥し、 27^ 「63 を得た。
[0297] <12-6. タンパク質 1\1末端修飾 >
新たに作製した反応剤固定化樹脂 （21^ 「634） を用いた、 1\1末端修飾剤 の調製ならびに連続したタンパク質 1\1末端修飾を行った。 具体的な実施例とし て、 リボヌクレアーゼ八 （1^336 八） 1\1末端修飾について示す。 スキームを図 35 に^^す。
[0298] ベンジルアミンのジメチルスルホキシド溶液（1001^, 40 4 〇〇に
21/?$ 「63_ （5 1^） を加え、 ヒートブロックを用いて 100 °〇で 90分間加熱し た。 室温まで空冷したのち、 上澄み液 （10 1 11100 をリン酸緩衝溶 \¥0 2020/175680 57 卩（：171? 2020 /008357
液 （10 11111/1, pH 7. 5, 85 し） で希釈し、 ここに 1^336 八溶液 （1 1^, 5 5 〇〇 を加え、 37°〇で 16時間振とうした。 反応後、 ！_01^を用いた修飾評価 を行った。 結果を図 36に示す。 反応剤固定化樹脂
Figure imgf000058_0001
「634） を用いた場 合においても、 単離精製した 1\1末端修飾剤を用いた場合と同程度の修飾率 （82 %） が得られた。 さらに、 種々の機能性アミン化合物に関しても同様の手法に より、 タンパク質 1\1末端特異的な修飾が可能であることを実証した。
[0299] 実施例 13. 均一系での 0 _1111「〇 11転位反応を用いたタンパク質修飾剤の合成と 連続したタンパク質修飾
実施例 6に示した化合物 10とアミン前駆体間の転位反応による新たな 1\1末端 選択的修飾剤の構築は銅触媒を用いないクリーンな反応として有用である。 実施例 12では副生成物の除去を簡便にするため不均一系での 01（11「〇 転位反応 を示した。 一方、 タンパク質修飾において、 副生成物であるアニリン誘導体 の混在が問題とならない場合も想定される。 そこで本項では、 均一系での _1111 「〇 転位反応によるカルボアルデヒド誘導体の合成と連続したタンパク質修 飾について示す。 スキームを図 37に示す。
[0300] <13-1 . 試薬 ·溶媒等 >
使用機器および試薬 ·溶媒は実施例 1および 8と同様である。 ウシ脖臓由来 リボヌクレアーゼ八 （1^336）は[¾0（^6社より購入した。 超純水は
Figure imgf000058_0002
Figure imgf000058_0003
[0301 ] <13-2.
Figure imgf000058_0004
転位反応の条件最適化 >
転位反応の反応機構を図 38に示す。 本反応は、 イミン形成を第一段 階に有するため、 酸触媒の添加により反応効率の向上が期待できる。 そこで 、 種々の酸触媒存在下、 ベンジルアミンをモデル基質に用い、 化合物 10との 転位反応を実施した。
[0302] ベンジルアミンのジメチルスルホキシド溶液（200 1^, 20 4 〇〇に 化合物 10のジメチルスルホキシド溶液（200 1^, 20 4 〇〇および酸水 溶液 （200 11^ 〇「 400 11^, 1 5 〇1〇1% 〇「 10 1110 1%）を加え、 匕一トブロッ クを用いて 100 °〇で 30分間加熱した。 室温まで空冷したのち、 反応混合物 1 !_をリン酸緩衝溶液 （100 11^, pH 7. 0, 200 ^1） で希釈、 96穴プレートに 移し、 紫外可視吸収測定を行った。 生成物である
Figure imgf000059_0001
に特徴的な 3 80 の吸収強度をもとに作成した標準曲線から、 反応の転換率を算出した。 図 39に用いた酸触媒の構造を示し、 得られた転換率を表 1に示す。
[0303] 表 1中、 3転換率は副生成物である -1\14「〇3 1丨 の吸収強度をもとに算出し た。 また、 〇 の添加量を 101110 1%とした。
[0304] [表 1 ]
Additive  ：0: 61^0 (%)
Figure imgf000059_0002
none 58
2 AcOH 84
3 ivlsOH 85
4 TsOH 85
5 yES 86
6 MOPS 36
7 HEPES 85
8 TAPS 81
9 MOPS 91
[0305] 酸触媒の添加に伴い、 転換率が向上することが示された。 特にスルホン酸 の添加が有効であることが示唆される。 加えて、 600（^' 8
Figure imgf000059_0003
として機能 することが知られる種々のスルホン酸塩についても反応効率を向上させるこ とが明らかとなった。 一般に、 これらのスルホン酸塩はタンパク質機能や構 造に大きく影響しないため、 後続するタンパク質修飾反応に対して直接 011^0
Figure imgf000059_0004
〇 〇 ac \ d
Figure imgf000059_0005
を酸触媒に選び以降の実験を行った。
[0306] <13-3. タンパク質 1\1末端修飾 >
ベンジルアミンのジメチルスルホキシド溶液（200 11^, 20 1_, 4 111〇〇に 化合物 10のジメチルスルホキシド溶液（200 1^, 20 4 〇〇および 水溶液 （200 11^ 〇「 400 11^, 5 〇1〇1% 〇「 10 1110 1%）を加え、 匕一トブロ ックを用いて 100 °〇で 30分間加熱した。 室温まで空冷したのち、 反応混合液（ \¥0 2020/175680 59 卩（：171? 2020 /008357
5 !·）をリン酸緩衝溶液 （10 1^, pH 7. 5, 42. 5 ^1） で希釈し、 ここに
Figure imgf000060_0001
6 八溶液
Figure imgf000060_0002
2. 5 5 〇〇 を加え、 37°〇で 16時間振とうした。 反応 後、 ！_01^を用いた修飾評価を行った。 図 40に !_01^解析の結果を示す。
[0307] アルキン · アジド ·蛍光色素など種々の機能性アミン前駆体を用い、 タン パク質修飾剤の調製をし、 タンパク質 1\1末端への導入を達成した。 加えて 1\1末 端修飾剤調製とタンパク質修飾反応連続して行った場合においても、 単離精 製した 1\1末端修飾剤を用いた場合と同程度の修飾率が得られた。 以上より、 均 一系における 01（11「 0 転位反応を用いた連続反応によるタンパク質 1\1末端修飾 法を実証した。
[0308] 実施例 14. 8丨
Figure imgf000060_0003
分子を用いたタンパク質 !\!末端修飾とオキシム形成によ る機能#分子導入
両末端にアミノ基を有するジアミンを前駆体と
Figure imgf000060_0004
転位では、 両末 端に丁八 部位が導入された分子 （以下” 8 _1 3-丁八4（：” と呼称する） が得られる 。 この -丁八 を用いたタンパク質 1\1末端修飾では、 タンパク質 1\1末端へアル デヒド部位を導入できる。 アルデヒドを起点とした化学修飾反応として、 ヒ ドロキシルアミンとのオキシム形成が挙げられる。 本反応は、 温和な条件下 、 水中においても進行することからタンパク質修飾にも適用可能である。 ま た、 オキシム結合は動的な結合であるため必要に応じて機能性分子を外すこ とも可能である。 そこで、 種々のジアミンを前駆体として、 化合物 10を用い た _1111「〇1;11転位反応を行い、 タンパク質修飾反応を実施した。
[0309] <14-1 . 試薬 ·溶媒等 >
使用機器および試薬 ·溶媒は実施例 1および 8と同様である。 ウシ脖臓由来 リボヌクレアーゼ八 （1^336）は[¾0（^6社より購入した。 超純水は
Figure imgf000060_0005
Figure imgf000060_0006
[0310] <14-2. 8丨3-丁八4（：の調製とタンパク質修飾反応 >
ジアミン 31 -36のジメチルスルホキシド溶液（100 11^, 20 1_, 2 〇1〇〇に 化合物 10のジメチルスルホキシド溶液（200 1^, 20 4 〇〇および酸水 溶液 （200 11^ 〇「 400 11^, 1 5 〇1〇1% 〇「 10 1110 1%）を加え、 匕一トブロッ \¥02020/175680 60 卩（：171? 2020 /008357
クを用いて 90 °〇で 60分間加熱した。 室温まで空冷したのち、 反応混合液（5
Figure imgf000061_0001
pH 7.5, 42.5 ^1） で希釈し、 ここに 1^336 八溶液 （1 1^, 2.5 5 〇〇 を加え、 37°〇で 16時間振とうした。 反応後 、 ！_01^を用いた修飾評価を行った。 図 41にスキーム、 図 42にタンパク質修飾 の結果について示す。
[0311] アルキル鎖あるいはオリゴエチレングリコール鎖をリンカーとする 84-丁八4 では 60~82%と良好なタンパク質修飾体が得られた。 対して、 アニリンのよう な芳香族骨格を含む -丁八 では修飾反応が進行しなかった。 これは 13_丁八4 〇の溶解性が著しく低いためと考えられる。 従って水溶性を向上させる部位の 導入により反応収率の改善が期待できる。
[0312] ＜14-3. 8丨3-丁八4（：により修飾されたタンパク質に対するオキシム形成を介 した機能性分子の導入＞
8丨3-丁八4（：によりタンパク質 1\1末端に導入されたアルデヒド部位を起点とした オキシム形成反応を実施した。 具体的には、 既報 （1
Figure imgf000061_0002
11100 ， （¾■ 311311, 丄
Figure imgf000061_0003
1^9门6「， 11/1· · 0.13士6干3门〇, 8.10。0门』11
98士6 （^6111. 2013, 24, 333-342）を参考に、 図 43に示す手順で反応を行った。 例として、 蛍光色素およびポリエチレングリコール修飾を示す。
[0313] 化合物 35を前駆体に調製した -丁八 を用いて修飾した 1^336 八 （60
Figure imgf000061_0004
8.3 （^1, 0.5 〇1）をリン酸緩衝溶液 （50 1^, pH 7.0, 35.7 し） で希釈し 、 ここにヒドロキシルアミン 37を含むジメチルスルホキシド溶液 （5 11^, 1 ^1, 5 门 11100 および触媒として 111-フヱニレンジアミン（111 0八）水溶液（50 1^, 5 ^1, 0.25 ＞11〇〇を加え、 4°〇で 6時間振とうした。 反応後、 1_01^を用い た修飾評価を行った。 図 44にタンパク質修飾の結果について示す。 一部、 触 媒である |11-?0八の付加体が見られるものの、 良好な収率でオキシム付加体へと 変換できていることが明らかとなった。
[0314] 化合物 35を前駆体に調製した -丁八 を用いて修飾した 1^336 八 （60
Figure imgf000061_0005
8.3 （^1, 0.5 〇1）をリン酸緩衝溶液 （50 1^, pH 7.0, 35.7 し） で希釈し 、 ここにヒドロキシルアミン 38 （2 1^, 500 nmol） および触媒として〇!-フエ \¥0 2020/175680 61 卩（：171? 2020 /008357
ニレンジアミン (111 0八)水溶液 (50 1^, 5 0. 25 〇〇を加え、 室温で 16 時間振とう した。 反応後、 を用いた修飾評価を行った。 図 45にタン パク質修飾の結果について示す。
[031 5] 比較として、 未修飾のタンパク質あるいはヒ ドロキシル基を有するポリエ チレングリコールを基質とした実験も行った。 タンパク質 1\1末端にアルデヒ ド 基およびポリエチレングリコールにヒ ドロキシルアミン部位が存在する組み 合わせでのみ、
Figure imgf000062_0001
上でのバンドのシフ トが観察されたことから、 オキ シム形成によるポリエチレングリコールの導入を確認した。
[0316] 実施例 1 5. 温和な条件下での
Figure imgf000062_0002
転位反応
実施例 13および 14に示した、 均一系での 01111「〇 転位反応による 1\1末端修飾 剤の調製では、 90 00°〇と高い反応温度を必要とする。 従って熱耐性の低い 基質への適応にはさらなる前駆体構造 ·反応条件の改善が求められる。 そこ で、 より低い温度での反応を達成するため、 前駆体である化合物 1 0の構造改 変を実施した。 特に、 ニトロフエニル基部位をより電子求引性の高い置換基 へ変更した化合物は、 中間体の安定化や逆反応が進行しにくいことなどから 有用な前駆体として機能すると期待できる。 本項では、 本戦略に沿った化合 物の合成ならびに
Figure imgf000062_0003
転位反応へ適用した実施例について示す。
[0317] ＜1 5-1 . 化合物合成＞
具体的な構造例として、 4 -シアノテトラフルオロフエニル基を有する トリア ゾールカルボアルデヒ ド 40の合成について示す。
[0318] [化 46]
Figure imgf000062_0004
[0319] <15-1 -1 . 4-（4-（〇1 161; 110乂 11161;11¥ 1）-11_1-1 , 2, 3-1;「 .1 〇 1-1 -V 1）-2, 3, 5, 6-士61;「 干 111〇「〇66^(^丨 1;「丨 4 (39)の合成＞
卩6门士31: 111〇「〇66门 〇门_1 丨 4 541 1^1, 4. 4 1111110 1)とアジ化ナトリウ \¥0 2020/175680 62 卩（：171? 2020 /008357
ム （260 1^, 4. 0 1111110 1） を含むアセトニトリル溶液 （10 〇!） を窒素雰囲気下 60 °〇で 16時間撹拌した。 続いて、 窒素雰囲気下、 プロパルギルアルデヒドジ エチルアセタール （570 1x1, 4. 0 1111110 1）およびヨウ化銅（I） （76 1119, 0■ 4 1111110 【）を加え、 室温で 16時間した。 反応溶液を室温まで空冷後、 飽和塩化ナトリ ウム水溶液
Figure imgf000063_0001
で希釈し、 酢酸エチル （50 1111_ X 3）で抽出した。 得られ た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、 固体を濾別して得られたろ液を減 圧留去し粗生成物を得た。 シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製 により、 化合物 39 （白色固体）を得た。 図 46に1 H 關（¾スペクトルを示す。
[0320] 丫 ^ 86%; -關（¾ （400 1^ ， 00013）： 5 7. 97 （ ， ^）, 5. 82 （ ， ^）, 3
■ 79-3. 64 （111, ）， 1 . 28 （士， 」 = 7. 1 ， 6 。
Figure imgf000063_0002
〇门丨 1;「丨 4 （40）の合成 >
化合物 39 （688 1^, 2. 0 111111〇 I）をクロロホルム （4〇!） に溶解し、 トリフル オロ酢酸 （2 «!!_） を添加し、 室温で 16時間撹拌した。 減圧留去により溶媒お よびトリフルオロ酢酸を除き、 粗生成物を得た。 再沈殿 （ヘキサン：クロロホ ルム） により精製して化合物 40 （白色固体） を得た。 図 47に 關（¾スペクトル を示す。
[0322] 丫 ^ 78%; -關（¾ （400 1^ ， 00013）： 5 10. 26 （ ， ^）, 8. 50 （ ， ^）〇
[0323] <15-2. 化合物
Figure imgf000063_0003
転位反応 >
化合物 40の反応性を評価するため、 ベンジルアミンを基質にした
Figure imgf000063_0004
位反応を実施した。
[0324] ベンジルアミンのジメチルスルホキシド溶液（100 1^, 40 4 〇〇に 化合物 40のジメチルスルホキシド溶液（100 1^, 40 4 〇〇および 水溶液 （200 11^, 2
Figure imgf000063_0005
を加え、 ヒートブロックを用いて 40 °〇で 1 2時間加熱した。 室温まで空冷したのち、 反応混合物を重ジメチルスルホキシ ド（310 1£）で希釈し、 内部標準として 1 , 3, 5 -トリメ トキシベンゼンの重ジメ チルスルホキシド溶液（400 11^, 10 4 1110 0を添加し、 1 H 關[¾測定を行つ た。 内部標準の積分値を基準として、 生成物である化合物 7のベンジル位のプ ロトンに相当するピークの積分値から収率を算出した。 スキームを図 48に、 結果を図 49に示す。
[0325] 化合物 10を用いた場合と比較して、 化合物 40を用いた場合、 低温において D i mroth転位反応が良好な収率で進行していることが明らかとなった。 従って 、 トリアゾール環 N1位への電子求引性置換基の導入が D i mroth転位反応への反 応性向上に大きく寄与することが示された。
[0326] 実施例 16. タンパク質 N末端修飾 2
タンパク質基質として、 一般に広く用いられるヒト血清由来アルブミン （H SA）への N末端修飾反応を実施した。
[0327] <16-1 . 試薬 ·溶媒等 >
ヒト血清由来アルブミン （HSA）は Merck社より購入した。 超純水は M i U i por e Integ ra lにより精製したものを用いた。 その他の試薬 ·溶媒は、 市販品を そのまま用いた。 HSAは、 生体中ですでに修飾を受けた HSAとの混合物を使用 した。 HSAの修飾体は、 既報により同定されている （A. Kawakam i , K. Kubota , N. Yamada, U. Tagam i , K. i.akehana, I. Sonaka, E. buzuk i , K. H i ray am a, FEBS J. , 2006, 273, 3346-3357.） 0
[0328] <16-2. タンパク質修飾 >
本手法では、 タンパク質 N末端を標的としている。 対象となりうるタンパク 質は N末端アミノ基が未修飾であることに加え、 N末端から 2番目のアミノ酸残 基がプロリン以外のアミノ酸であるものである。 具体的な実施例として、 ヒ 卜血清由来アルブミン （HSA）の N末端修飾について示す。
[0329] HSAのアミノ酸配列を示す（PDB : 1 A06）。
DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE NCD KSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNE CFLQHKDDNP NLPRLVRPEV DVMCTA FHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCO AADKAACLLP KLDELRDEG K ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTK VHTECCHGDL L ECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA DLPSLAADFV ESKD
VCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSVVLLLRLA KTYETTLEKC CAAADPHECY AKVFDEF KPL VEEPQNLIKO NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH EAKRMPCAE DYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFN AETFTFH ADICTLSEKE RQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKET CFAE EGKKLVAASO AALGL （配列番号 3）。
[0330] 化合物 7を修飾剤に、 HSAを標的タンパク質に用い、 実施例 10-2と同様の手 法により、 タンパク質 N末端修飾を行った。 生成物の LC/MS分析の結果を図 50 に示す。 修飾されたタンパク質を HSA1と表記する。 本反応条件における修飾 率は 99%以上と算出された。 必要に応じて、 反応後の生成物をサイズ排除クロ マトグラフィーにより精製した。
[0331] 実施例 17. タンパク質 N末端とシステイン残甚を標的としたタンパク質の二 重修飾
<17-1. 試薬 ·溶媒等 >
使用機器、 試薬、 溶媒等は実施例 16と同様である。
[0332] <17-2. タンパク質のシステイン残基修飾 >
タンパク質のシステイン残基修飾は、 既報 （X. Chen, H. Wu, C. -M. Park, T. H. Poole, G. Keceli, N. 0. Devar i e-Baez, A. W. Tsang, W. T. Lowth er, L. B. Poole, S. B. King, M. Xian, C. M. Furdui, ACS Chem. Biol., 2017, 12, 2201-2208） を参考に行った。 以下に具体的な実験項を示す。
[0333] 化合物 41の DMS0/水（1 :1）混合溶液 （25 mM, 40 ML, 1 ^mol, 終濃度 500 MM）をリン酸緩衝液 （100 mM, pH 7.0, 1.86 mL）で希釈し、 ここに HSA超純水 溶液 （1 mM, 100 ML, 100 nmol, 終濃度 50 MM）を加え、 4 °Cで 12時間静置 した。 反応後、 LC/MSを用いた修飾評価を行った。 結果を図 51に示す。 修飾さ れたタンパク質を HSA2と表記する。 本反応条件における修飾率は 99%以上と算 出された。 必要に応じて、 反応後の生成物をサイズ排除クロマトグラフィー により精製した。
[0334] <17-3. システイン残基が修飾されたタンパク質の N末端修飾 >
実施例 17-2にて作製した HSA2に対して、 化合物 7によるタンパク質 N末端修 飾を行った。 図 52にスキームおよび結果を示す。 \¥0 2020/175680 65 卩（：171? 2020 /008357
[0335] 八2を含むリン酸緩衝溶液 （ 八2 濃度 200
Figure imgf000066_0002
終濃度 50
Figure imgf000066_0001
緩衝溶 液濃度 10 1^, pH 7. 5, 19 !·）に対し、 化合物 7のジメチルスルホキシド 1!/1 〇）溶液（200 （1^, 1 終濃度 10 1^）を加え、 37 °〇で 16時間振とうした。 修飾されたタンパク質を 八3と表記する。 本反応条件における修飾率は 72%と 算出された。
[0336] 実施例 18. !\!末端へ修飾したタンパク質の安定#
<18-1 . 試薬 ·溶媒等 >
使用機器、 試薬、 溶媒等は実施例 10と同様である。
[0337] <18-2. 時間経過に伴う修飾したタンパク質の安定性 >
Figure imgf000066_0003
緩衝 溶液濃度 100 11^, pH 7. 0, 10 し）をリン酸緩衝液
Figure imgf000066_0004
pH 7. 0, 90 1_）で希釈し、 37 °〇でそれぞれ 12時間、 24時間、 48時間静置した。 例として 24 時間静置後の
Figure imgf000066_0005
分析の結果を図 53に示す。
[0338] 1\1末端における 4 -イミダゾリジノン環の形成を経る本修飾反応は平衡反応で ある。
Figure imgf000066_0006
解析の結果から、 1\1末端へ修飾したタンパク質は逆反応である 4- イミダゾリジノン環の加水分解により、 未修飾のタンパク質および修飾剤が 再生すると考えられる。 質量スぺクトルにおけるピーク強度から算出した放 出率 [=1 _（静置後の修飾された 1^336/総 1^336量）/（静置前の修飾された 1^336 /総（^836量）]を縦軸に、 静置した時間を横軸にしたグラフを図 54に示す。
[0339] <18-3. pH変化に伴う修飾したタンパク質の安定性 >
Figure imgf000066_0007
緩衝 溶液濃度 100 11^, pH 7. 0, 10 !·）をそれぞれ が 4, 5, 6, 7, 8になるよう に緩衝液
Figure imgf000066_0008
90 !·）で希釈し、 37 °〇でそれぞれ 12時間静置した。 pH
4, 5の条件では酢酸緩衝液、 pH 6, 7, 8の条件ではリン酸緩衝液を用いて希 釈した。 放出率の結果を図 55に示す。
[0340] 実施例 19. 化合物の合成 8 （1位と 5位に置換甚を有するトリアゾールカル ボアルデヒドの合成）
合成に用いた試薬 ·溶媒は、 市販品をそのまま用いた。 前駆体となるアジ ド化合物、 アルキン化合物およびボロン酸ピナコールエステルは既報 (L. S . C. -Verduyn, L. Mirfeizi, R. A. Dierckx, P. H. ELsinga, B. L. Fering a, Chem. Commun. , 2009, 16, 2139-2140、 E· Jahnke, J. Weiss, S. Neuhau s, T. N. Hoheisel H. Frauenrath, Chem. Eur. 丄， 2009, 15, 388-404、 丄 C. Pieck, D. Kuch, F. Grolle, U. Linne, C. Haas, T. CareLL, J. Am. C hem. Soc. , 2006, 128, 1404-1405と丄 Schmidt, M. Rotter, T. Weiser, S· Wi ttmann, L. WeizeL, A· Kaiser, J. Heering, T· Goebel, C. Angioni, M . WurgUcs, A· Paulke, G. GeissUnger, A· Kahnt, D. Ste i nh i Lber, E. P roschak, D. Merk, J. Med. Chem. , 2017, 60, 7703-7724および丄 R· White , G. J. Price, S. Schiffers, P. R.Raithby, P. K.PLucinski, C. G. Fros t, Tetrahedron Letters, 2010, 51, 3913-3917) を参考に合成したものを用 いた。
[0341 ] <19-1. 1-benzy L-5-pheny L-1 H-1 , 2, 3-tr iazo Le-4-carba Ldehyde (44) の 合成 >
化合物 44は既報 (K. Yamamoto, T. a Bruun, J. Y. Kim, L. Zhang, M. La utens, Org. Lett., 2016, 18, 2644-2647および丄 Deng, Y.-M. Wu, O.-Y. Chen, Synthesis, 2005, 16, 2730-2738) を参考に、 以下のスキー厶に従い 合成した。
[0342] [化 47]
Figure imgf000067_0001
[0343] <19-1-1. 〇- ㊀门 1-5-1〇〇1〇-1 N-1 , 2, 3-1: .18 〇 1-4- 1)(1161: !^门〇 I (42) の合 成＞ \¥02020/175680 67 卩（：171? 2020 /008357
ベンジルアジド （0.67 9, 5.0 11111101）、 3 -丨〇〇1〇卩「〇卩-2- 门-1-〇1 （0.91 9, 5.
0 11111101）、 ヨウ化銅 （I） （95 1119, 0.50 11111101）、
Figure imgf000068_0001
0.50 111111〇1） および酢酸カリウム （1.5 9, 15 1^〇1） の混合物に窒素雰囲気下、 丁# （89 111 !） を加え、 室温で終夜攪拌した。 反応混合物の溶媒を減圧留去し、 水 （30 «1 1_） と酢酸エチル （30
Figure imgf000068_0002
で希釈後、 酢酸エチル （30 1111_ X 3） で抽出した。 得られた有機層を飽和食塩水 （30 «!!_ X 2） で洗浄し、 硫酸ナトリウムで乾燥 させ、 濾別したろ液の溶媒を減圧留去した。 残渣をシリカゲルカラムクロマ トグラフィー （ヘキサン：酢酸エチル） によって精製し、 化合物 42 （白色固 体） を得た。 図 56に1 關（¾スぺクトルを示す。
[0344] 丫 ^ 82%: （¾ （400 1^ ， 01^0 6） : 3 , 7.42-7.33 （111, 3 , 7.24-7.
22 （111, 2 , 5.65 （ ， 2 , 5.27 （士， 」 = 5.6 ， ^）, 4.47 （ 」 = 5.6 ， 2 ： 130 （¾ （100
Figure imgf000068_0003
151.30, 135.52, 128.89, 128.20
, 127.54, 83.79, 54.99, 53.25: ト丁〇ド
Figure imgf000068_0004
〇〇1. 干〇「 （^#1011\13 〇 [11/1+ ]+337· 976, 干〇 （^ 337.977。
[0345] <19-1-2. 〇- ㊀门 1-5-卩116 1-11"1-1 , 2, 3-1;「丨 〇 1-4- 1）11161;113门〇 I （43） の 合成 >
化合物 42 （0.249, 0.75 〇1111〇1）、 フエニルボロン酸 （0.18 9, 1.5 111111〇〇、 炭酸カリウム （0.21 9, 1.5
Figure imgf000068_0005
および酢酸パラジウム （17 1^, 0.075 111 11101） の混合物に純水 （2.4
Figure imgf000068_0006
を加えた後、 窒素雰囲気下、 丁# （9.6 111）を 加え、 70°◦で終夜攪拌した。 反応混合物の溶媒を減圧留去し、 水 （30 «!!_） と 酢酸エチル （30
Figure imgf000068_0007
で希釈後、 酢酸エチル （30 1111_ X 3） で抽出した。 得ら れた有機層を飽和食塩水 （30 1111_ X 2） で洗浄し、 硫酸ナトリウムで乾燥させ 、 濾別したろ液の溶媒を減圧留去した。 残渣をフラッシュカラムクロマトグ ラフィー （ヘキサン：酢酸エチル） によって精製し、 化合物 43 （淡黄色固体） を得た。 図 57に 關（¾スぺクトルを示す。
[0346] 丫 ^ 54%: 關（¾ （400 1^ ， 00013）： 8, 7.49-7.42 （111, 3 ， 7.29-7.23
（111, 5 , 7.06-7.04 （111, 2 , 5.48 （ ， 2 , 4.68 （ 」 = 6.0 ， 2 ,
Figure imgf000068_0008
6H15N3NaO [M+Na] + 288.111, found 288.112。
[0347] <19-1-3. 1-benzy l-5-pheny 1-1 H-1 , 2, 3-tr i azo le-4-carba Idehyde (44) の合成 >
化合物 43 (50 mg, 0.19 mmol) の 1,4 -ジオキサン溶液 (10 mL) に、 活性二 酸化マンガン (163 mg, 1.9 mmol) を加え、 室温で終夜攪拌した。 反応混合 物をろ過し、 得られたろ液の溶媒を減圧留去した後、 粗生成物をフラッシュ カラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル) によって精製し、 化 合物 44 (油状) を得た。 図 58に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0348] Yield 91%: 'H NMR (400 MHz, CDCl3)： S, 10.14 (s, 1H), 7.56-7.46 (m,
3H), 7.31-7.27 (m, 5H), 7.07-7.05 (m, 2H), 5.49 (s, 2H) : ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for C16H13NaN30 [M+Na]+ 286.095, found 286.09 3〇
[0349] <19-1-4. (1-benzy 1-5- (4-methoxypheny 1)-1 H-1 , 2, 3-tr i azo l-4-y l)metha no l (45) の合成 >
[0350] [化 48]
Figure imgf000069_0001
[0351] 化合物 45 （淡黄色固体） は 4 -メ トキシフエニルボロン酸を前駆体に実施例 19-1-2と同様の手法で合成した。 図 59に1 關（¾スぺクトルを示す。
[0352] 丫 ^ 97%:
Figure imgf000069_0002
00013）： 5, 7.29-7.27 （111, 3 ， 7.17 （
」 = 8.8 ， 2 ， 7.08-7.07 （111, 2 ， 6.95 （ 」 = 8.8 ， 2 ， 5.46 （ , 2 ， 4.67 （ 」 = 6.0 ， 2 ， 3.85 （ ， 3 ， 2.09 （士， 」 = 6.0 ， 1
1
Figure imgf000069_0003
318.121〇 [0353] <19-1-5.
Figure imgf000070_0001
-11161; 110
Figure imgf000070_0002
|1 〇16 （46） の合成＞
[0354] [化 49]
Figure imgf000070_0003
[0355] 化合物 46 (油状) は化合物 45を前駆体に実施例 19-1-3と同様の手法で合成 した。 図 60に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0356] Yield 91%: 'H NMR (400 MHz, CDCl3)： S, 10.14 (s, 1H), 7.32-7.30 (m,
3H), 7.23 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.10-7.08 (m, 2H), 6.99 (d, J = 8.8 H z, 2H), 5.49 (s, 2H), 3.87 (s, 3H) : 13C NMR (100 MHz, CDCl3)： S, 184.6 8, 161.42, 143.49, 140.76, 134.72, 131.23, 129.04, 128.59, 127.44 , 11 6.48, 114.54, 55.49, 51.85: ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for C17H15N3Na02 [M+Na]+ 316.106, found 316.104。
[0357] <19-1-6. (1-benzy 1-5- (4-n i tropheny 1)-1 H-1 , 2, 3-tr iazo l-4-y Omethano
I (47) の合成 >
[0358] [化 50]
Figure imgf000070_0004
[0359] 化合物 47 （褐色固体） は 4 -ニトロフエニルボロン酸を前駆体に実施例 19-1 -2と同様の手法で合成した。 図 61に1 H 關（¾スぺクトルを示す。
[0360] 丫 ^ 58%:
Figure imgf000070_0005
00013）： 5, 8.28 （ 」 = 8.8 ， 2 ， 7.
46 （ 」 = 8.8 ， 2 , 7.31-7.29 （111, 3 , 7.05-7.03 （111, 2 , 5.52 （ , 2 ， 4.69 （6. 」 = 6.0 ， 2 ， 2.14 （士， 」 = 6.0 . 1 ： ％ （10 0 MHz, CDCl3): 8, 148.56, 145.90, 134.85, 134.12, 133.18, 130.84 , 129 22, 128.77, 127.25, 124.22, 55.83, 52.74: ESI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for C16H14N4Na03 [M+Na]+ 333.096, found 333.095。
[0361 ] <19-1-7. 1-benzy 1-5- (4-n i tropheny 1)-1 H-1 , 2, 3-tr iazo le-4-carba Idehy de (48) の合成 >
[0362] [化 51]
Figure imgf000071_0001
[0363] 化合物 48 (黄色固体) は化合物 47を前駆体に実施例 19-1-3と同様の手法で 合成した。 図 62に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0364] Yield 93%: 'H NMR (400 MHz, CDCl3)： S, 10.20 (s, 1H), 8.31 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.33-7.28 (m, 3H), 7.04-7.02 ( m, 2H), 5.52 (s, 2H) : 13C NMR (100 MHz, CDCl3): 8, 185.02, 149.11, 144 27, 137.67, 133.99, 131.05, 129.37, 129.15, 127.45, 124.07, 52.64: E SI-TOF MS (positive mode) m/z calcd. for C16H12N4Na03 [M+Na]+331.080, fo und 331.082。
[0365] <19-1-8. 1-(4-((4-(hydroxymethy l)-5-i odo-1 H-1 , 2, 3-tr iazo l-1-y l)met hy l) phenyl) ethan-1 -one (49) の合成 >
[0366] [化 52]
Figure imgf000071_0002
49
[0367] 化合物 49 （白色固体）
Figure imgf000071_0003
に実施例 19-1-1と同様の手法で合成した。 図 63に1 關（¾スペクトルを示す。 [0368] Yield 40%: 】H NMR (400 MHz, CDCl3): 8, 7.94 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7. 33 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.65 (s, 2H), 4.74 (s, 2H), 2.59 (s, 3H), 2.1 5 (s, 3H); 'SC NMR (100 MHz, CDCl3): 8, 197.5, 151.5, 139.1, 137.4, 12 9.1, 128.1, 78.9, 56.8, 53.9, 26.8: ESI-TOF MS (positive mode) m/z ca led. for C12H12IN3Na02 [M+Na] + 379.987, found 379.987。
[0369] <19-1-9. 1-(4-((5-(4-(az idomethy Opheny l)-4-(hydroxymethy 1)-1 H-1 , 2
, 3-t r i azo l-1-y l)methy Opheny l)ethan-1-〇ne (50) の合成 >
[0370] [化 53]
Figure imgf000072_0001
[0371] 化合物 50 (淡黄色固体) は化合物 49および 2-(4-(3å^〇1116 4 6 1)-4, 4, 5, 5-士61;「811161; 11 1-1 , 3, 2-6 \ 0X81)0「〇 を前駆体に実施 19-1 -2と同様の手法 で合成した。 図 64に1 H 關(¾スぺクトルを示す。
[0372] 丫 ^ 71%:
Figure imgf000072_0002
00013)： 5, 7.87 ( 」 = 8.0 ， 2 ， 7.
40 ( 」 = 8.0 ， 2 , 7.26 ( 」 = 8.0 ， 2 , 7.13 ( 」 = 8.0 , 2 5.54 (8, 2 4.69 ( 」 = 5.8 ， 2 4.42 ( ， 2 2.57 ( ， 3 ， 2.17 ( 」 = 5.8 ， 1 ；
Figure imgf000072_0003
00013)： 5, 197.5, 14
5.4, 140.3, 137.5, 137.1, 135.6, 130.2, 129.1, 128.9, 127.5, 126.3 , 5 5.9, 54.4, 51.9, 26.8:
Figure imgf000072_0004
1110
Figure imgf000072_0005
1\16 02 [11/1+ ]+ 385.138, 干〇 385.138。
[0373] <19-1-10.
Figure imgf000072_0006
Figure imgf000072_0007
の合成 >
[0374] [化 54]
Figure imgf000073_0001
[0375] 化合物 51 (透明、 油状) は化合物 50を前駆体に実施例 19-1-3と同様の手法 で合成した。 図 65に1 H NMRスぺクトルを示す。
[0376] Yield 85%: 'H NMR (400 MHz, CDCl3)： S, 10.17 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.14 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.55 (s, 2H), 4.45 (s, 2H), 2.58 (s, 3H) ; 13C NM R (100 MHz, CDClg)： S, 197.4, 184.7, 143.9, 140.0, 139.3, 138.6, 137. 4, 130.1, 129.1, 128.7, 127.7, 124.6, 54.3, 51.7, 26.8: ESI-TOF MS (p ositive mode) m/z calcd. for C19H16N6Na02 [M+Na]+ 383.123, found 383.123
[0377] 実施例 20. ペプチド N末端修飾 3
ペプチド N末端修飾は、 既報 (丄 I. MacDonald, H. K. Munch, T. Moore, M. B. Francis, Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 326-331) を参考に行った。 以下に具体的な実験項を示す。
[0378] 化合物 44のジメチルスルホキシド (DMS0) 溶液 (200 mM, 2 ^L, 0.4 ^ mol, 終濃度 10 mM) をリン酸緩衝液 (10 mM, pH 7.5, 34 ML) で希釈し、 ここにペプチド水溶液 (1 mM, 4 ML, 4 nmol, 終濃度 100 ^M) を加え、 37 °Cで 16時間振とうした。 LC/MSを用いて、 修飾率 [= (修飾ペプチド量) / (総 ペプチド量)]について、 質量スぺクトルにおけるピーク強度から評価を行っ た。 結果を図 66に示す。 本反応条件における修飾率は＞99%と算出された。
[0379] 実施例 21. タンパク質 N末端修飾 4
タンパク質 N末端修飾は、 既報 (丄 I. MacDonald, H. K. 11/111门〇11, 丁· ¾/1〇〇 e, M. B. Francis, Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 326-331 ) を参考に行った \¥0 2020/175680 73 卩（：171? 2020 /008357
。 以下に具体的な実験項を示す。
[0380] 化合物 44のジメチルスルホキシド 1^0） 溶液 （200 1^, 5 ^1, 1 . 0 ^
1110 1, 終濃度 10 1^） をリン酸緩衝液 （10 11^, pH 7. 5, 90 1~） で希釈し、 ここに（^836超純水溶液 （1 1^, 5 1_, 5 〇し 終濃度 50 11/1） を加え、 37 °〇で 16時間振とうした。
Figure imgf000074_0001
を用いて、 修飾率 [= （修飾された 1^336 / （総 36量）]について、 質量スぺクトルにおけるピーク強度から評価を行った。 結果を図 67に示す。 本反応条件における修飾率は 48%と算出された。
[0381 ] 実施例 22. タンパク質 !\!末端への機能#分子修飾
<22-1 . タンパク質 1\1末端へのアセチル基およびアジド基の二重修飾 >
化合物 51を修飾剤に用い、 実施例 21と同様の手法により、 タンパク質 1\1末端 へのアセチル基およびアジド基の二重修飾を行った。 生成物の
Figure imgf000074_0002
分析の結 果を図 68に示す。 アセチル基 · アジド基の修飾率は 28%と算出された。
<22-2. タンパク質 1\1末端に修飾されたアジド基を起点とした機能性分子修飾
>
実施例 22-1にて作成したアジド基が修飾された 1^336に対して、 ひずみ促進 型アルキンーアジド環化付加反応による蛍光色素の修飾を行った。 アルキン 基質としてジベンゾシクロオクチン部位を有するフルオレセイン、 化合物 26 を反応に用いた。 図 69にスキームおよび結果を示す。
[0382] を含むリン酸緩衝溶液
Figure imgf000074_0003
終濃度 20
Figure imgf000074_0004
緩衝溶液濃度 10 11^, pH 7. 5, 19 ^1） に対し、 化合物 26のジメチルスルホキ シド 1^0） 溶液 （8 11^, 1 終濃度 400
Figure imgf000074_0005
を加え、 室温で 6時間静 置した。 蛍光色素部位の修飾率は >99%と算出された。
[0383] 実施例 23. タンパク質 !\!末端へのポリマー分子の導入
<23-1 . トリアゾールカルボアルデヒド部位を有するポリエチレングリコ —ルの合成 >
トリアゾールカルボアルデヒド部位を導入したポリエチレングリコール 54 の合成を実施した。 既報 （し.
Figure imgf000074_0006
. 8〇门丨干 丨 , 八叩㊀ . ㊀!!· 1门1;· £〇!. , 2015, 54, 15739-15743および 1 门 £ 1〇1 . 1<,
Figure imgf000075_0001
^31:, 8_1〇（113〇「〇［11〇16〇1|163, 2014, 15, 2751-2759） を参考に以下に示すスキ —厶に従って合成した。
[0384] [化 55]
Figure imgf000075_0002
54
[0385] <23-1-1. 4-((4-formy L-1 H-1 , 2, 3-tr iazo L-1-y L)methy L)benzo i c acid (5
2)の合成 >
化合物 52 (白色固体)は (4-azidomethyl)benzoic acidを前駆体に、 実施例 1 -3-1と同様の手法 (Method A) を用いて合成した図 70に1 H NMRスぺクトルを示 す。
[0386] Yield 71 %;
Figure imgf000075_0003
DMS0-d6) : 5, 10.02 (s, 1H), 9.00 (s, 1 H), 7.94 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.79 (s, 2H) ;
13C NMR (100 MHz, DMS0-d6) : 5, 185.0, 166.9, 147.1, 140.1, 130.7, 129 .9, 128.7, 128.2, 52.8; ESI-TOF MS (positive mode) m/z caLcd. for C^Hg N303Na [M+Na]+ 254.054, found 254.053
[0387] <23-1-2. 2, 5-d i oxopyr ro Li d i n-1-y L 4-((4-formy L-1H-1, 2, 3-tr iazo L-1- y L)methy L)benzoate (53)の合成 > 52 (231 mg, 1.0 mmol) を含む THF溶液 (10 mL) に N-hydroxysuccinimide (138 mg, 1.2 mmol) および N,N’ -d i eye lohexy lcarbod i imide (206 mg, 1.0 mmol) を添加し 0 °C 、 窒素雰囲気 24時間撹拌した。 沈殿物を濾別したのち
、 ろ液を酢酸エチル (50 mL)で希釈し， 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (20 m L X 2)および飽和食塩水 (20 mL X 2)で洗浄した。 有機層を硫酸ナトリウ ムで乾燥させ、 溶媒を減圧留去し、 粗生成物を得た。 シリカゲルカラムクロ マトグラフィーによる精製により、 化合物 53 (白色固体)を得た。 図 71に iH NM Rスぺクトルを示す。
[0388] Yield 71 %; 'H NMR (400 MHz, CDCl3)： S, 10.15 (s, 1H), 8.16 (d, J =
8.5 Hz, 2H), 8.07 (s, 1H), 7.42 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.70 (s, 2H), 2 .91 (s, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)： S, 185.0, 169.1, 161.3, 148.4, 140.5, 131.7, 128.5, 126.3, 125.4, 54.1, 25.8; ESI-TOF MS (positive m ode) m/z calcd. for C15H12N405Na [M+Na]+351 070, found 351.069。
[0389] <23-1-2. Polyethylene glycol-tethered t r i azo le-4-carba Idehyde (54) の合成 >
53 (53 mg, 0.16 mmol) を含む塩化メチレン (15 mL) に、 末端にアミノ基 を有するポリエチレングリコール (分子童：約 4000、 400 mg, 0.1 mmol) お よびトリエチルアミン (45 L, 0.32 mmol) を添加し、 窒素雰囲気下 24時間撹 拌した。 溶媒を減圧留去したのち、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ ィーにより精製した。 得られたオイル上の粗生成物を再沈殿 (ジエチルエー テル/塩化メチレン) により精製し、 化合物 54 (白色固体) を得た。
[0390] <23-2. 化合物 54を用いたタンパク質 N末端修飾 >
化合物 54を用いたタンパク質 N末端へのポリエチレングリコールの修飾を実 施した。 以下にリボヌクレアーゼを基質とした実施例を示す。
[0391] <23-2-1. 試薬 ·溶媒等 >
ウシ脖臓由来リボヌクレアーゼ A (RNase)は Roche社より購入した。 超純水 は MiUipore Integra 13により精製したものを用いた。 その他の試薬 ·溶媒は 、 市販品をそのまま用いた。 \¥0 2020/175680 76 卩（：171? 2020 /008357
[0392] <23-2-2. タンパク質 1\1末端へのポリエチレングリコールの修飾 >
化合物 54を修飾剤に用い、 実施例 10-2と同様の手法により、 タンパク質 1\1末 端へのポリエチレングリコール修飾を行った。 生成物の
Figure imgf000077_0001
分析の結果 を図 72に示す。 ポリエチレングリコール部位の修飾率は 50%と算出された。
[0393] <23-2-3. システイン残基が修飾されたタンパク質の 1\1末端へのポリマーの 修飾 >
化合物 54を修飾剤に用い、 実施例 17-3と同様の手法により、 八2のタンパ ク質 !\!末端へのポリエチレングリコール修飾を行った。 反応によって得られた 、 システイン残基にアジド基が、 1\1末端にポリエチレングリコールが修飾され た 八 （ 八4と表記する。 ） に対して、 化合物 26を用いてひずみ促進型アルキ ン_アジド環化付加反応による蛍光色素の修飾を行った。 修飾されたタンパ ク質を 八5と表記する。
[0394] 八4を含むリン酸緩衝溶液 （ 八4濃度 62 !^1, 終濃度 10
Figure imgf000077_0002
緩衝溶液 濃度 10 1^. pH 7. 5, 19 !·）に対し、 化合物 26のジメチルスルホキシド （011/1 〇）溶液 （6 11^, 1 終濃度 300
Figure imgf000077_0003
を加え、 4 °〇で 6時間静置した。 八
、 八2に対しても同様の操作を行い、 生成物を
Figure imgf000077_0004
を用いて解析を行っ た。 スキーム及び結果を図 73に示す。
[0395] 化合物 41を修飾し、 アジド基を導入した 八2および 八4のレーンにのみ化 合物 26を反応させたとき蛍光が観察された。 加えてポリエチレングリコール 誘導体である化合物 54を修飾した 八4のレーンにのみ分子量の増加に伴った 新しいバンドが出現した。 以上の結果よりタンパク質のポリエチレングリコ —ル修飾と蛍光色素修飾が進行したことが確かめられた。

Claims

\¥0 2020/175680 77 卩（：171? 2020 /008357 請求の範囲
［請求項 1］ 一般式 （1）
［化 1］
Figure imgf000078_0001
［式中： 及び［^2の内、 一方は一 N （- 一 は有機基、 又は無機 材料由来の基を示す。 ） を示し、 他方は = 1\1 _を示す。
Figure imgf000078_0002
は水素原子 、 有機基、 又は無機材料由来の基を示す。 ］
で表される化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶 媒和物。
［請求項 2］ 前記化合物が、 一般式 （1八）
［化 2］
Figure imgf000078_0003
［式中： 1^4は前記に同じである。 ］
で表される化合物である、 請求項 1 に記載の化合物、 若しくはその塩 、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物。
［請求項 3］ 前記有機基が有機分子又は有機分子複合体由来の基であり、 且つ該有 機分子又は有機分子複合体が機能性物質である、 請求項 1又は 2に記 載の化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物
［請求項 4］ 前記機能性物質が、 医薬化合物、 発光分子、 高分子化合物、 リガンド 、 リガンド結合対象分子、 抗原タンパク質、 抗体、 タンパク質、 核酸 \¥0 2020/175680 78 卩（：171? 2020 /008357
、 糖類、 脂質、 細胞、 ウイルス、 標識、 力ーボン電極、 力ーボンナノ 材料、 リンカー、 若しくはスぺーサー分子、 又はこれらの複合体若し くは連結分子である、 請求項 3に記載の化合物、 若しくはその塩、 又 はこれらの水和物若しくは溶媒和物。
［請求項 5］ 前記無機材料が電極材料、 金属微粒子、 金属酸化微粒子、 半導体粒子 、 又は磁性粒子である、 請求項 1〜 4のいずれかに記載の化合物、 若 しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物。
［請求項 6］ 請求項 1〜 5のいずれかに記載の化合物、 若しくはその塩、 又はこれ らの水和物若しくは溶媒和物を含有する、 試薬。
［請求項 7］ タンパク質及び/又はべプチド修飾用試薬である、 請求項 6に記載の 試薬。
［請求項 8］ _般式 （2） :
Figure imgf000079_0001
（2） ［式中： は有機基又は無機材料由来の基 を示す。
Figure imgf000079_0002
一X （Xはハロゲン原子を示す。 ） 、 一 8 （〇 2、
- 3 （〇^1） 2 （（^は同一又は異なって、 炭化水素基を示す。 但し、 2つ の は共に結合して、 隣接する酸素原子と共に環を形成していてもよ い。 ） 、 又は一! \12 +を示す。 ］ で表される化合物又はその塩と、 一般式 （3） で表される化合物、 _般式 （4） で表される化合物、 _般式 （9 ） で表される化合物：
［化 3］
Figure imgf000079_0003
［式中：［^3は水素原子、 有機基、 又は無機材料由来の基を示す。 （^、 （^ 7及び［^8は同一又は異なって、 アルキル基を示す。 丫は反応性基を示す
Figure imgf000079_0004
\¥0 2020/175680 79 卩(：171? 2020 /008357
化合物とを反応させる工程を含む、 請求項 1〜 5のいずれかに記載の 化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物を製 造する方法。
［請求項 9］ _般式 （5） :
Figure imgf000080_0001
（5） ［式中： は有機基又は無機材料由来の基 を示す。
Figure imgf000080_0002
（ 及び は同一又は異なって水素原子又はア ルキル基を示す。 ） を示す。 ］ で表される化合物と、 一般式 （6） : ［化 4］
Figure imgf000080_0003
［式中、
Figure imgf000080_0004
は電子求引性基を示す。
Figure imgf000080_0005
は単結合又は リンカーを示す。 1^2は担体を示す。 ） を示す。 门は 0又は 1を示す。 ！ 11は 1〜 5の整数を示す。 ］
で表される化合物とを反応させる工程を含む、 請求項 1〜 5のいずれ かに記載の化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶 媒和物を製造する方法。
［請求項 10］ -般式 （6’ ） ：
［化 5］
Figure imgf000080_0006
\¥0 2020/175680 80 2020 /008357
［式中、
Figure imgf000081_0001
は電子求引性基を示す。
Figure imgf000081_0002
は単結合又はリンカーを示す 。
Figure imgf000081_0003
は担体を示す。 111は 1〜 5の整数を示す。 ］
で表される化合物。
［請求項 1 1］ 一般式 （7） :
［化 6］
Figure imgf000081_0004
［式中： 及び［^2の内、 一方は一 N （- 一 は有機基、 又は無機 材料由来の基を示す。 ） を示し、 他方は = 1\1 _を示す。
Figure imgf000081_0005
は水素原子 、 有機基、 又は無機材料由来の基を示す。 点線と実線とからなる二重 線は単結合又は二重結合を示す。
Figure imgf000081_0006
はタンパク質又はべプチドから 末端アミノ酸残基及びそれに隣接する一 _が除かれてなる基を示す 。 14は前記タンパク質又はべプチドの 1\1末端アミノ酸残基の側鎖を示 す。 ］
で表される化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶 媒和物。
［請求項 12］ タンパク質及び/又はペプチドと、 請求項 1〜 5のいずれかに記載の 化合物、 若しくはその塩、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物とを 反応させる工程を含む、 請求項 1 1 に記載の化合物、 若しくはその塩 、 又はこれらの水和物若しくは溶媒和物を製造する方法。
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