JP5881509B2 - アゾベンゼン化合物 - Google Patents

Description

本発明は、アゾベンゼン化合物に関する。

アゾベンゼンは、近紫外光（３２０ｎｍ付近）の照射を受けてトランス体からシス体へと幾何異性化し、可視光（４４０ｎｍ付近）の照射を受けてシス体からトランス体へと異性化することが知られている。このような光照射に応答して化学構造を異性化させるフォトスイッチング機能は、有機材料（液晶材料や記憶素子）等に応用できるフォトクロミック分子として注目されている。近年、アゾベンゼンのフォトスイッチング機能を生化学分野へと応用し、細胞内へのイオン内流出（例えば、非特許文献１及び２参照）や、ＤＮＡの転写反応を制御する研究が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。

しかしながら、アゾベンゼン骨格のトランス体をシス体へと異性化させるために照射される紫外光は、組織、細胞等への浸透性が低く、更に短時間で細胞に重篤な障害をもたらすという問題がある。そのため、可視光に応答するアゾベンゼン誘導体の開発が進められている。しかしながら、可視光応答性のアゾベンゼン誘導体の合成には、複雑な有機合成反応を介してアゾベンゼンに芳香族性置換基を導入し、π電子共役系を拡張する必要であった。このようなアゾベンゼン誘導体は、水にきわめて難溶であり、生体機能制御用研究ツールとして、ペプチド、ペプチド核酸等に導入することが困難であった。

これまでに、アゾベンゼンのアゾ部位から芳香環を挟んでパラ位に窒素原子が導入されたアミノアゾベンゼンのトランス体の吸収極大波長は、無置換アゾベンゼンのトランス体に比べて約１００ｎｍ〜１５０ｎｍ、長波長側の約４００ｎｍ〜５００ｎｍに特徴的な吸収スペクトルを示すことが知られている。このような、可視光に吸収スペクトルを持つアミノアゾベンゼンは、その約２倍の波長光であり生体透過性に優れる近赤外領域（８００ｎｍ〜１０００ｎｍ）の同時二光子吸収を吸収することが報告されている（例えば、非特許文献４及び５参照）。

しかしながら、非特許文献４や非特許文献５に開示されるアミノアゾベンゼンは、光照射によるシス異性化能が低いという問題があった。

"Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｎ ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｓｗｉｔｃｈ"、Ｍ．Ｖｏｌｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００６），Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．１，４７−５１． "Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ"，Ｐ．Ｇｏｒｏｓｔｉｚａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，（２００７），Ｖｏｌ．１０４，Ｎｏ．２６，１０８６５−１０８７０． "Ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ−ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｈｏｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ"，Ｍ Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（２００６），１２８，１００９−１０１５． "Ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ａｚｏａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ"，Ｌ．Ｄ．Ｂｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，（２００２），３６１，２０９−２１３． "Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｉｎ ａｚｏａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ"，Ｌ．Ｄ．Ｂｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，（２００５），６，１１２１−１１２５．

フォトクロミック分子であるアゾベンゼン化合物が有するフォトスイッチング機能を、生体機能制御用研究ツールとして用いるには、生体内に類似した環境下において、可視領域の光での光応答性の獲得すること等が必要である。本発明の課題は、特に、生体機能制御用研究ツールとして有用なアゾベンゼン化合物を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、新規アゾベンゼン化合物が、水溶性を有し、また可視領域の光に対して光応答性を有することから、生体機能制御用の研究ツールとして優れた作用を発揮することを見出した。本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、下記に示す態様の発明を広く包含するものである。

項１ 下記化学式（１）にて示されるアゾベンゼン化合物；

（式（１）中、
Ｘは硫黄原子、酸素原子、−ＣＨ_２−、又は直接結合であり、
Ｙは低級アルキレン基、低級アルケニレン基、又は低級アルキニレン基であり、
Ａは保護基、水素原子、Ｎ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ａ１）、又はＮ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ａ２）であり、
該アミノ酸残基（ａ１）とはペプチドが有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基であり、
該ペプチド核酸残基（ａ２）とはペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基であり、
Ｂは保護基、ヒドロキシル基、Ｃ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ｂ１）、又はＣ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ｂ２）であり、
該アミノ酸残基（ｂ１）とはペプチドが有するペプチド主鎖のＮ末端のアミノ基からＨを除いた基であり、
該ペプチド核酸残基（ｂ２）とはペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＮ末端のアミノ基からＨを除いた基である。）。

項２ 前記Ｘが硫黄原子であり、且つ前記Ｙが−ＣＨ_２−である、上記項１に記載のアゾベンゼン化合物。

項３ 下記化学式（１）

（式（１）中、
Ｘは硫黄原子、酸素原子、−ＣＨ_２−、又は直接結合であり、
Ｙは低級アルキレン基、低級アルケニレン基、又は低級アルキニレン基であり、
Ａは保護基、水素原子、Ｎ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ａ１）、又はＮ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ａ２）であり、
該アミノ酸残基（ａ１）とはペプチドが有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基であり、
該ペプチド核酸残基（ａ２）とはペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基であり、
Ｂは保護基、ヒドロキシル基、Ｃ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ｂ１）、又はＣ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ｂ２）であり、
該アミノ酸残基（ｂ１）とはペプチドが有するペプチド主鎖のＮ末端のアミノ基からＨを除いた基であり、
該ペプチド核酸残基（ｂ２）とはペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＮ末端のアミノ基からＨを除いた基である。）。
にて示されるアゾベンゼン化合物の製造方法であって、
（ｉ）下記化学式（２）

（式（２）中、Ｙは前記式（１）と同じであり、Ａ′は保護基である。）
にて示されるアニリン化合物を、酸化剤を用いて反応させる工程１、
（ｉｉ）工程１によって得られる下記化学式（３）

（式（３）中、Ｙ及びＡ′は前記式（２）と同じである。）
にて示されるニトロソ化合物と、下記化学式（４）

（式（４）中、Ｘは前記式（１）と同じであり、Ｂ′は保護基又はヒドロキシル基である。）
にて表されるアニリン化合物を混合して反応させ、下記化学式（５）

（式（５）中、Ｙ及びＡ′は前記式（２）と同じであり、Ｘ及びＢ′は前記式（４）と同じである。）
にて示される、アゾベンゼン化合物を得る工程２、
（ｉｉｉ）必要に応じて上記化学式（５）で示されるアゾベンゼン化合物におけるＡ′及び／又はＢ′の保護基を脱保護する工程３、
及び、
（ｉｖ）必要に応じて上記工程２又は工程３で得られるアゾベンゼン化合物を固相合成法に供する工程４、
を含む製造方法。

項４ 前記Ｘが硫黄原子であり、且つ前記Ｙが−ＣＨ_２−である、上記項３に記載の製造方法。

項５ 生体機能制御のための研究ツールとして用いられる上記項１に記載のアゾベンゼン化合物。

本発明のアゾベンゼン化合物は、それ自身がペプチド、並びにペプチド核酸といったアミド結合により主鎖骨格をなす分子に導入できるため、生体機能を光に制御するツールとして、並びにそれを作成する原料として有用である。

本発明のアゾベンゼン化合物の可視光に対する光応答性を示す実験結果。 本発明のアゾベンゼン化合物の可視光に対する光応答性を示す実験結果。 本発明のアゾベンゼン化合物を用いて作製した細胞導入剤を用いた実験結果。図中の（ａ）〜（ｃ）は本発明のアゾベンゼン化合物に代わってアミノエチルエトキシアセテートを示し、（ｄ）〜（ｆ）は本発明のアゾベンゼン化合物のシス体とトランス体の混合物を示し、（ｇ）〜（ｉ）は、本発明のアゾベンゼン化合物のシス体とトランス体の混合物を示す。また、図中の（ａ）、（ｄ）、及び（ｇ）はＴＡＭＲＡの蛍光を観察した像であり、図中の（ｂ）、（ｅ）、及び（ｈ）はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８の蛍光を観察した像とＴＡＭＲＡの蛍光を観察した像を合わせたものであり、図中の（ｃ）、（ｆ）、及び（ｉ）は位相差にて観察した像である。 本発明のアゾベンゼン化合物を用いて作製した細胞導入剤を用いた実験結果。図中の（ａ）〜（ｃ）は本発明のアゾベンゼン化合物のトランス体を示し、（ｄ）〜（ｆ）は本発明のアゾベンゼン化合物のシス体とトランス体の混合物を示す。また、図中の（ａ）及び（ｄ）はＴＡＭＲＡの蛍光を観察した像であり、図中の（ｂ）及び（ｅ）はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８の蛍光を観察した像とＴＡＭＲＡの蛍光を観察した像を合わせたものであり、図中の（ｃ）及び（ｆ）は位相差にて観察した像である。 本発明のペプチド核酸結合型アゾベンゼン化合物と、ＤＮＡとの結合実験結果。

以下に、本発明について説明する。本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては公知の文献等に基づいて当業者であれば容易、且つ確実に実施可能である。

本発明のアゾベンゼン化合物
本発明のアゾベンゼン化合物は、下記化学式（１）にて表される。

上記化学式（１）におけるＸは、硫黄原子、酸素原子、−ＣＨ_２−、又は直接結合である。中でも、上記化学式（１）にて示すアゾベンゼン化合物の、視光応答性、シス体の熱安定性等の観点から、Ｘは硫黄原子であることが最も好ましい。

上記化学式（１）におけるＹは、低級アルキレン基、低級アルケニレン基、又は低級アルキニレン基である。例えば、低級アルキレン基とは、炭素数が１個〜８個であることを意味する。より好ましくは炭素数が１個〜６個であり、更に好ましくは炭素数が１個〜４個である。

また、低級アルケニレン基及び低級アルキニレン基の場合は、炭素数が３個〜８個であることを意味する。より好ましくは炭素数が３個〜６個であり、更に好ましくは炭素数が３個又は４個である。

Ｙの中でも、上記化学式（１）にて示すアゾベンゼン化合物の、紫外光照射に対するシス異性化能等の観点から、−ＣＨ_２−が最も好ましい。

上記化学式（１）におけるＡは、保護基、水素原子、Ｎ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ａ１）、又はＮ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ａ２）である。

保護基とは、フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−Ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル基（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｚ、Ｃｂｚ）基、トリチル基（Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ ｍｅｔｈｙｌ；Ｔｒｉｔｙｌ）基等が挙げられ、特に限定はされないが、アミノ基を保護することに鑑みて、常法に基づいて選択すればよい。特に、本発明のアゾベンゼン化合物を生体機能制御用研究ツールとして有用に用いるという観点からすると、ペプチド合成、固相ペプチド合成法に適したＦｍｏｃ基又はＢｏｃ基が好ましい。

アミノ酸残基（ａ１）とは、ペプチドが有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基である。

当該ペプチドを構成するアミノ酸は、ペプチド結合が可能となるアミノ基及びカルボキシル基を有する化合物であればよく、天然アミノ酸であっても、非天然アミノ酸であってもよい。また、光学活性体としてＤ体であっても、Ｌ体であってもよい。そしてアミノ酸とは、αアミノ酸に限定されず、例えば、３−アミノプロピオン酸（β−アラニン）等のようなカルボキシル基とアミノ基との間の炭素鎖が２個の炭素からなるβアミノ酸であっても、４−アミノブタン酸（γ−アミノ酪酸：ＧＡＢＡ）、５−アミノ吉草酸等のような、カルボキシル基とアミノ基との間の炭素鎖が３個の炭素からなるγアミノ酸であってもよく、通常は１個〜６個の炭素からなる炭素鎖を有するアミノ酸とすればよい。

また、アミノ酸残基（ａ１）は、それが有するペプチド主鎖のＮ末端に保護基を有していてもよい。これは、後述する化学式（１）に示される本発明のアゾベンゼン化合物を固相合成法に供する際に、反応基としてペプチド主鎖のＮ末端に存在するアミノ基が反応しないようにする際に有用である。なお、ここで保護基とは、特に限定されるものではなく、上述したＡにおける保護基を適宜採用すればよい。

ペプチド核酸残基（ａ２）とは、ペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基である。

ペプチド核酸とは、例えば、下記化学式（６）

（式（６）中、
Ｂａｓｅは核酸塩基を示し、それぞれ同一であっても異なってよく、ｎは０以上２５以下、好ましくは３〜２３の整数である。）
に示すように、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンがペプチド結合によって重合した構造を有し、その主鎖をペプチド主鎖とする。斯かるペプチド主鎖において、アミド基を有する末端をＮ末端とし、カルボキシル基を有する末端をＣ末端とする。

また、ペプチド核酸は、その繰り返し単位であるＮ−（２−アミノエチル）グリシン当たりに１つ塩基が結合している。具体的な塩基は、特に限定されることは無く、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル等といった天然に存在する塩基のみならず、ジアミノプリン、チオウラシル等といった天然に存在する塩基に改変を加えた非天然の塩基であってもよい。

上記ペプチド核酸とは、上記ペプチド核酸のＮ末端及び／又はＣ末端に１以上のアミノ酸がペプチド結合した構造、或いは上記ペプチド核酸内部のペプチド結合の何れか１ヵ所以上に、１以上のアミノ酸が、ペプチド結合を維持した形で挿入された構造を有するペプチド核酸であってもよい。ここで、アミノ酸とは上述のようなアミノ基及びカルボキシル基を有する化合物とすればよい。

また、ペプチド核酸残基（ａ２）は、それが有するペプチド主鎖のＮ末端に保護基を有していてもよい。これは、後述する化学式（１）に示される本発明のアゾベンゼン化合物を固相合成法に供する際に、反応基としてペプチド主鎖のＮ末端に存在するアミノ基が反応しないようにする際に有用である。なお、ここで保護基とは、特に限定されるものではなく、上述したＡにおける保護基を適宜採用すればよい。

上記化学式（１）におけるＢは、保護基、ヒドロキシル基、Ｃ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ｂ１）、又はＣ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ｂ２）である。

保護基とは、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、Ｃｂｚ基、Ｔｒｉｔｙｌ基、メチル基（Ｍｅｔｈｙｌ：Ｍｅ）、ベンジル基（Ｂｅｎｚｙｌ：Ｂｎ）等；スクシンイミドやチオール等の活性エステル等、アルコール、アミン、チオール等とのエステル縮合反応に用いられる活性エステル中間体等が挙げられ、特に限定はされないが、カルボキシル基を保護することに鑑みて、常法に基づいて選択すればよい。特に、本発明のアゾベンゼン化合物を生体機能制御用研究ツールとして有用に用いるという観点からすると、ペプチド合成、固相ペプチド合成法に適したＦｍｏｃ基又はＢｏｃ基が好ましい。

アミノ酸残基（ｂ１）とは、ペプチドが有するペプチド主鎖のＮ末端のアミド基からＨを除いた基である。ペプチドとは、上記のＡでアミノ酸残基（ａ１）ついて定義したペプチドと同じである。

また、アミノ酸残基（ｂ１）は、それが有するペプチド主鎖のＣ末端に保護基を有していてもよい。これは、後述する化学式（１）に示される本発明のアゾベンゼン化合物を固相合成法に供する際に、反応基としてペプチド主鎖のＣ末端に存在するカルボキシル基が反応しないようにする際に有用である。なお、ここで保護基とは、特に限定されるものではなく、上述したＢにおける保護基を適宜採用すればよい。

ペプチド核酸残基（ｂ２）とは、ペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＮ末端のアミド基からＨを除いた基である。ペプチド核酸とは、上記のＡでペプチド核酸残基（ｂ２）について定義したペプチド核酸と同じである。

また、アミノ酸残基（ｂ２）は、それが有するペプチド主鎖のＣ末端に保護基を有していてもよい。これは、後述する化学式（１）に示される本発明のアゾベンゼン化合物を固相合成法に供する際に、反応基としてペプチド主鎖のＣ末端に存在するカルボキシル基が反応しないようにする際に有用である。なお、ここで保護基とは、特に限定されるものではなく、上述したＢにおける保護基を適宜採用すればよい。

上記化学式（１）にて示される本発明のアゾベンゼン化合物における好ましい置換基の組み合わせとしては、
上記Ｘが硫黄原子であり、且つ上記Ｙが−ＣＨ_２−である組み合わせ、
上記Ｘが酸素原子あり、且つ上記Ｙが−ＣＨ_２−である組み合わせ、
上記Ｘが−ＣＨ_２−であり、且つ上記Ｙが−ＣＨ_２−である組み合わせ、等が挙げられ、視光応答性、シス異性体の熱安定性等の観点から上記Ｘが硫黄原子であり、且つ上記Ｙが−ＣＨ_２−である組み合わせが最も好ましい。

なお、上記Ａ及びＢは、本発明のアゾベンゼン化合物を生体機能制御用研究ツールとして用いる際の具体的な用途に合わせて適宜設定すればよく、特に限定されるものではない。例えば、特定の核酸に対して結合するような塩基配列となるペプチド核酸、特定の機能を有するアミノ酸配列を有するペプチド等が挙げられる。

上記化学式（１）にて示される本発明のアゾベンゼン化合物は、可視光に対して優れた光応答性を示す。具体的には、４１０ｎｍ付近の可視光に応答して、シス−トランス異性化が生じる。

従って、上記化学式（１）にて示される本発明のアゾベンゼン化合物において、アミノ酸残基又はペプチド核酸を含む場合、それを生体内に導入した後に、生体外から上述のような波長範囲の可視光を照射することにより、斯かるアゾベンゼン化合物のシス−トランス異性化と共に、それに結合するアミノ酸残基又はペプチド核酸の生体内における立体配置を変化させることが可能となる。

このことは、生体に対して影響が少ない可視光にて反応性を有するという観点からすると、上記化学式（１）にて示されるアゾベンゼン化合物が、生体機能制御用研究ツールとして非常に有用であることを示している。

なお、上記化学式（１）にて示されるアゾベンゼン化合物は、生体機能制御研究用ツールとして有用であることから、化合物を生体内に導入した際の検出対象となるような標識化処理が施されていてもよい。

このような標識は、既に生体機能検出制御研究用ツールとして多用されているものを適宜採用すればよく、例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、各種Ｃｙ色素、ビオチン、金コロイド、量子ドット、抗体等が挙げられる。このような標識化は、上記化学式（１）にて示されるアゾベンゼン化合物のアゾベンゼン骨格に対して施されるよりも、Ａ又はＢにて規定するアミノ酸残基又はペプチド核酸残基に施されるほうが好ましい。

本発明のアゾベンゼン化合物の製造方法
本発明の下記式（１）

（式（１）中、
Ｘは硫黄原子、酸素原子、−ＣＨ_２−、又は直接結合であり、
Ｙは低級アルキレン基、低級アルケニレン基、又は低級アルキニレン基であり、
Ａは保護基、水素原子、Ｎ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ａ１）、又はＮ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ａ２）であり、
該アミノ酸残基（ａ１）とはペプチドが有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基であり、
該ペプチド核酸残基（ａ２）とはペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基であり、
Ｂは保護基、ヒドロキシル基、アミノ酸残基（ｂ１）、又はペプチド核酸残基（ｂ２）であり、
該アミノ酸残基（ｂ１）とはペプチドが有するペプチド主鎖のＮ末端のアミノ基からＨを除いた基であり、
該ペプチド核酸残基（ｂ２）とはペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＮ末端のアミノ基からＨを除いた基である。）
にて示されるアゾベンゼン化合物の製造方法は、以下の工程１〜４を含むものである。

＜工程１＞
本発明のアゾベンゼン化合物の製造方法における工程１は、下記化学式（２）

（式（２）中、Ｙは前記式（１）と同じであり、Ａ′は保護基である。）
にて示されるアニリン化合物を、酸化剤を用いて反応させる工程である。

工程１を経ることによって、下記化学式（３）

（式（３）中、Ｙ及びＡ′は前記式（２）と同じである。）
にて示されるニトロソ化合物が得られる。

工程１において使用する酸化剤は、特に限定はされないが、モノ過硫酸水素カリウム、過酢酸、過安息香酸等が挙げられる。反応操作の容易性、水溶液にして使用できること等の観点から、モノ過硫酸水素カリウムが好ましい。酸化剤の使用量は、特に限定はされないが、上記アニリン化合物に対してに対して通常は１．５重量部〜３．０重量部程度である。

反応温度は、特に限定はされないが、通常は室温で行えばよい。反応時間も特に限定はされないが、通常は３０分〜４８時間程度とすればよい。反応後は、適宜公知の精製、濃縮等の工程に供し、水相画分から上記化学式（３）にて示されるニトロソ化合物を単離すればよい。

なお、上記化学式（２）にて示される保護基を有するアニリン化合物は、適宜購入して入手することも可能である。また、公知の製造方法によって製造して入手することも可能である。例えば、以下に示す製造方法が挙げられる。

〔保護化アニリン化合物の製造方法〕
下記化学式（７）

（式中、Ｙは上記化合物（２）と同様である。）
にて示すアニリン化合物と、保護基を付与する化合物を反応させればよい。

保護基を付与する化合物とは、特に限定はされないが、例えば、９−塩化フルオレニルメチルオキシカルボニル（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）：Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、（９Ｈ−フルオレン−９イル）メチル２，５−ジオキソピロリドン−１−イル カーボネート（（９Ｈ−ｆｌｕｏｒｅｎ−９−ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ ２，５−ｄｉｏｘｏｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ ｃａｒｂｏｎａｔｅ：Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ、）等が挙げられ、特に限定はされないが、一級アミンへの選択的反応の観点から、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ等が好ましい。

上記化学式（２）にて示す保護基を有するアニリン化合物を製造する際の反応温度は、特に限定はされないが、通常は室温で行えばよい。反応時間も特に限定はされないが、通常は０℃〜室温程度とすればよい。また、反応環境は特に限定されないが、一級アミノ基の反応性を高める観点から塩基性環境下とすることが好ましい。

反応後は、適宜公知の精製、濃縮等の工程に供し、有機相画分から上記化学式（２）にて示される保護化アニリン化合物を単離すればよい。

＜工程２＞
本発明のアゾベンゼン化合物の製造方法における工程２は、上記工程１にて得られる下記化学式（３）

（式（３）中、Ｙ及びＡ′は前記式（２）と同じである。）
にて示されるニトロソ化合物と、下記化学式（４）

（式（４）中、Ｘは前記式（１）と同じであり、Ｂ′は保護基又はヒドロキシル基である。）
にて表されるアニリン化合物を混合して反応させる工程である。

工程２を経ることによって、下記化学式（５）

（式（５）中、Ｙ及びＡ′は前記式（２）と同じであり、Ｘ及びＢ′は前記式（４）と同じである。）
にて示される、アゾベンゼン化合物が得られる。

上記化学式（４）におけるＢ′の保護基とは、Ｂｏｃ基、Ｔｒｉｔｙｌ基、メチル基（Ｍｅｔｈｙｌ：Ｍｅ）、ベンジル基（Ｂｅｎｚｙｌ：Ｂｎ）等；スクシンイミドやチオール等の活性エステル等、アルコール、アミン、チオール等とのエステル縮合反応に用いられる活性エステル中間体等が挙げられ、特に限定はされない。

工程２における反応温度は、特に限定はされないが、通常は室温で行えばよい。反応時間も特に限定はされないが、通常は１２時間〜４８時間程度とすればよい。

また、工程２における反応は、酸の存在下で行ってもよい。具体的な酸は、特に限定はされないが、例えば酢酸等が挙げられる。酸の使用量は、特に限定はされないが、化学式（４）に示すアニリン化合物に対して通常は１等量〜３等量程度である。

工程２における反応後は、適宜公知の精製、濃縮、再結晶等の工程に供し、有機相画分ら上記化学式（５）にて示されるアゾベンゼン化合物を単離すればよい。

＜工程３＞
本発明のアゾベンゼン化合物の製造方法における工程３は、上記工程２にて得られる上記化学式（５）にて示されるアゾベンゼン化合物に対して脱保護の処理に供する工程であり、上記化学式（１）にて示されるアゾベンゼン化合物において、Ａを水素原子及び／又はＢをヒドロキシ基とするアゾベンゼン化合物を製造する場合に必要となる工程である。

具体的な脱保護の方法は、公知の方法を採用すればよく、具体的には、保護基がＦｍｏｃ基である場合にはピペリジンを採用すればよい。保護基がＢｏｃ基である場合にはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を採用すればよい。

また、Ａが保護基である場合には、上記のＦｍｏｃ固相合成法、またはＢｏｃ固相合成法を採用すればよい。Ｂが保護基である場は、Ｂｏｃ基、メチル基のエステル等でも構わない。

上記化学式（５）のＡの保護にＦｍｏｃ基を用いた場合、通常２０％〜４０％程度のピペリジン／ＤＭＦ溶液を、上記化学式（５）にて示すアゾベンゼン化合物に対して通常２〜５等量程度加え、室温で５〜３０分程度反応させればよい。上記化学式（５）のＡの保護にＢｏｃ基を用いる場合は、通常１０〜１００％のＴＦＡ／ジクロロメタン溶液中、室温で３０分〜２時間反応させればよい。

一方、Ｂの保護基にＢｏｃ基を用いた場合は、酢酸及び臭化水素存在下で、通常０℃〜室温程度で３０分〜２４時間程度反応させればよく、Ｂの保護基がメチルエステルの場合は、通常はｔ−ブトキシカリウム／水溶液＝４：１程度の溶液中、０℃〜室温で２〜４８時間程度反応させればよい。

＜工程４＞
本発明のアゾベンゼン化合物の製造方法における工程４は、上記化学式（１）において、Ａ及び／又はＢをアミノ酸残基又はペプチド核酸残基とするアゾベンゼン化合物を製造する場合に必要となる工程であり、上記工程２又は工程３にて得られたアゾベンゼン化合物を固相合成法に供する工程である。

具体的には、上記工程２によって得られた上記化学式（５）にて示すアゾベンゼン化合物において、Ａ′又はＢ′のうちの何れか１つが保護基であるアゾベンゼン化合物、又は上記工程（３）において得られる上記化合物（１）にて示されるアゾベンゼン化合物において、Ａ又はＢのうちの何れか１つが保護基であるアゾベンゼン化合物を出発原料とした固相合成法に供すればよい。

固相合成法に供することによって、上記化学式（１）におけるＡ及び／又はＢを、所望の塩基配列、アミノ酸配列、又はこれらを組み合わせた配列を有するアミノ酸残基又はペプチド核酸残基とすることができる。

具体的には、上記出発原料に、アミノ酸、ペプチド核酸、又はそれらがペプチド結合したものを所望の配列順となるように固相合成法に供する公知の方法を採用すればよく、固相合成法にて用いる樹脂、カップリング試薬、ＨＰＬＣシステム等も、特に限定されることは無く、通常用いられるものを適宜採用すればよい。

なお、Ａ及び／又はＢにて規定するアミノ酸残基及び／又はペプチド核酸残基のそれぞれの末端に保護基を有する場合は、それぞれ保護を所望する末端が、アミド基であるかカルボキシル基であるかという点等に鑑みて、公知の方法を採用すれば合成が可能である。

上記化学式（１）にて示される本発明のアゾベンゼン化合物は、上述のように標識化されていても良い。具体的な標識化方法は、公知の方法を採用すればよく、例えば標識化キットに付随する製造元から提供されるプロトコルなどを参照すればよい。

合成例１：２−（４−（（４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）メチル）フェニル）ジアゼニル）フェニルチオ）酢酸
＜２−（４−（（４−（（（（９Ｈ−ｆｌｕｏｒｅｎ−９−ｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ）ｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｄｉａｚｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：化合物Ｉ＞
下記の化学式（８）に示すスキームにて合成を行った。

３８０ｍｇ（２．９μｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミン及び１．０ｇ（２．９μｍｏｌ）の４−アミノベンジルアミン＜４−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ：化合物ＩＩ＞を含む、０℃の１５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に、３．３ｇ９．８μｍｏｌの（９Ｈ−フルオレン−９イル）メチル２，５−ジオキソピロリドン−１−イル カーボネート＜（９Ｈ−ｆｌｕｏｒｅｎ−９−ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ ２，５−ｄｉｏｘｏｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ ｃａｒｂｏｎａｔｅ：Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ＞を混合し、室温にて１２時間撹拌の後、０．１Ｍの硫酸水素カリウムで洗浄した。有機相を分離し、ＤＣＭを用いて水相を抽出した。一体化した有機相抽出画分を硫酸マグネシウム上で乾燥させ蒸発させた。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィーを用いて精製し、２５ｇの（９Ｈ−フルオレン−９イル）メチル４−アミノベンジルカルバミン酸＜（９Ｈ−ｆｌｕｏｒｅｎ−９−ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ ４−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ：化合物ＩＩＩ＞を得た。

収率は８７％であり、得られた生成物のＮＭＲデータ及び質量分析データは以下の通りである。

^１ＨＮＭＲ（ＣＨＣｌ_３，４００ ＭＨｚ）：δ７．７６（ｄ，Ｊ＝７．５６，２Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝７．２６，２Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．５，２Ｈ），７．３０（ｔ，Ｊ＝７．５，２Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝７．７，２Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝８．３，２Ｈ），４．９４（ｓ，１Ｈ），４．４３（ｄ，Ｊ＝６．９，２Ｈ），４．２６（ｄ，Ｊ＝５．５，２Ｈ），４．２２（ｔ，Ｊ＝７．０，１Ｈ），３．６６（ｓ，２Ｈ）．^１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，６００ ＭＨｚ）：δ１５６．３３，１４５．９０，１４４．０２，１４１．３５，１２８．９６，１２８．２６，１２７．６４，１２７．０３，１２５．０５，１１９．９５，１１５．２２，６６．６３，４７．３５，４４．８１．ＥＳＩ ＨＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｎａ）＋ｃａｌｃｄ ３６７．１４２３，ｆｏｕｎｄ ３６７．１４４６。

次いで、得られた化合物ＩＩＩを原料に、下記化学式（９）に示すスキームにて合成を行った。

５００ｍｇ（１．５μｍｏｌ）の上記化合物ＩＩＩが溶解した３０ｍＬのＤＣＭに、１．８ｍｇ（３μｍｏｌ）の酸化剤（デュポン（株））を混合し、化合物ＩＩＩが更なる変化を生じなくなるまでＴＬＣでモニタリングしながら、室温で混合した。次いで、相分離の後、ＤＣＭを用いて水相の抽出を二回行った。一体化した有機相抽出画分を硫酸マグネシウム上で乾燥させ蒸発させた。粗生成物６０ｍＬの酢酸に懸濁させ、その後完全に溶解させた。そこに、２７４ｍｇ（１．５μｍｏｌ）の２−（４−アミノフェニルチオ）酢酸＜２−（４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：化合物ＩＶ＞を混合し、室温で４８時間混合した。

生成物に水を加えて沈殿させた後、水で分離し且つ洗浄した。その後、水−エタノール溶媒を用いて再結晶させ、４３５ｍｇの上記化合物Ｉを得た。

合成例２：２−（（４−（（４−（アミノメチル）フェニル）ジアゼニル）フェニルチオ）酢酸＜２−（（４−（（４−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｄｉａｚｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：化合物Ｖ＞
Ｔｅｎｔａｇｅｌ ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ （０．２４ｍｍｏｌ／ｇ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）に上記化合物Ｉを結合させ、その後、上記化合物Ｉに対して２０％〜４０％のピペリジン／ＤＭＦ溶液を２〜５等量加え、室温で５〜３０分反応させた。次いで、２Ｎの塩酸にて中和、減圧濃縮し、ジクロロメタンによるデカンテーションで脱離後のFmoc基を除去し、Ｆｍｏｃを上記のピペリジンによる脱保護と同様に行い樹脂をＤＭＦにて洗浄した。

続いて、２０％のｍ−ｃｒｅｓｏｌ／ＴＦＡ溶液を用い上記樹脂から化合物Ｖを切り出し、これにジエチルエーテルを加えることで化合物Ｖの沈殿を得た。その後、遠心分離を行い、エーテル上清をデカンテーションにて除去して、下記化学式（１０）にて示される化合物Ｖを得た。

収率は９５％であり、得られた生成物のＮＭＲデータは以下の通りである。

Ｈ−ＮＭＲ，ｓｏｌｖｅｎｔ：ＤＭＳＯ，４００ ＭＨｚ ７．３８（２Ｈ，ｂｒ），７．１１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４），７．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ−８．４），６．８４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），６．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８），３．３３（２Ｈ，ｂｒ），２．９４（２Ｈ，ｓ）。

合成例３：２−（４−（（４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）メチル）フェニル）ジアゼニル）フェニル）プロパン酸＜３−（４−（（４−（（（（（９Ｈ−ｆｌｕｏｒｅｎ−９−ｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ）ｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｄｉａｚｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ：化合物ＶＩ）＞
下記の化学式（１１）に示すスキームにて合成を行った。

１０００ｍｇ（２．９ｍｍｏｌ）の上記化合物ＩＩＩが溶解した５０ｍＬのＤＣＭに、２７００ｍｇ（８．７１ｍｍｏｌ）の酸化剤を混合し、化合物ＩＩＩが更なる変化を生じなくなるまでＴＬＣでモニタリングしながら、室温で混合し、ニトロソ化反応を確認した。次いで、相分離の後、ＤＣＭを用いて水相の抽出を二回行った。一体化した有機相抽出画分を硫酸マグネシウム上で乾燥させ定量的に目的物を得た。７００ｍｇの粗生成物（１．９ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの酢酸に完全に溶解させた。そこに、３８７．２ｍｇ（２．３４ｍｍｏｌ）の４−アミノフェニルけい皮酸（４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）。：化合物ＶＩＩ＞を混合し、室温で４８時間混合した。

生成物に水を加えて目的物を沈殿させた後、水で分離し且つ洗浄した。その後、水−エタノール溶媒を用いて再結晶させ、７１３ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）の上記化合物ＶＩを得た。

収率は７２％であり、得られた生成物のＮＭＲデータは以下の通りである。

Ｈ−ＮＭＲ，ｓｏｌｖｅｎｔ：ＤＭＳＯ，４００ ＭＨｚ ７．８６（６Ｈ，ｍｕｌｔｉ），７．７１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２），７．４３（６Ｈ，ｍｕｌｔｉ），７．３６（２Ｈ，ｍｕｌｔｉ），４．３８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８），４．２７（３Ｈ，ｍｕｌｔｉ），２．９２（２Ｈ，ｔ），２．６０（２Ｈ，ｔ）。

実験例１：化合物Ｉの光異性化測定
ＤＭＳＯ溶媒にパラ位に硫黄を持つアゾベンゼンアミノ酸（化合物Ｉ）を終濃度２０μｍｏｌ／ｌとなるように溶解し、９５℃で５分加熱したものをトランス体として、キセノンランプ光源（朝日分光（株）製：ハイパワーキセノン光源Ｍａｘ−３０２，３００Ｗ）を利用して３６０±１０ｎｍ（長波長カットフィルター導入）にて４１０±１０ｎｍの可視光を表示時間照射し、シス体への光異性化を紫外−可視吸収スペクトルにて評価した（図１）。

その結果、パラ位に硫黄原子をもつ化合物Ｉは、パラ位に炭素原子をもつ化合物ＶＩに比べてトランス体の極大吸収波長が４０ｎｍほど長波長シフトした３７２ｎｍであることがわかった。

実験例２：化合物ＶＩの光異性化測定
ＤＭＳＯ溶媒にパラ位に炭素を持つアゾベンゼンアミノ酸（化合物ＶＩ）を終濃度２０μｍｏｌ／ｌとなるように溶解し、９５℃で５分加熱したものをトランス体とした。その後、上述のキセノンランプ光源の光を化合物ＩＶに表示時間照射し、シス体への光異性化を紫外−可視吸収スペクトル（ＵＶ−１７００，ＳＨＩＭＡＤＺＵ）にて評価した（図２）。

図２に示す結果から、化合物ＶＩの極大吸収波長は３３０ｎｍであり、紫外光（３６０±１０ｎｍ）に応答して、シス体へ異性化することが確認された。

合成例４：ペプチド結合型アゾベンゼン化合物
ペプチド結合型アゾベンゼン化合物として、上記アゾベンゼン化合物ＶのＮ末端及びＣ末端に核内移行シグナルペプチドを有するアゾベンゼン化合物を作製した。

Ｔｅｎｔａｇｅｌ ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ （０．２４ｍｍｏｌ／ｇ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を用いたＦｍｏｃ固相合成法により合成を行った。 Ｂａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎとして、０．３Ｍの２，６−ｌｕｔｉｄｉｎｅ、０．２ＭのＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ溶媒を準備した。また、ｃａｐｐｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎとして５％の無水酢酸、６％の２，６−ｌｕｔｉｄｉｎｅ／ＤＭＦ溶液を準備し、ｄｅｂｌｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎとして４０％のｐｙｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＤＭＦ溶媒を準備した。

２００ｍｇ（４８ｎｍｏｌ）のＴｅｎｔａｇｅｌ ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎをＤＭＦで膨潤させた。その後、ＤＭＦを取り除き、ｄｅｂｌｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（４０％のｐｙｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＤＭＦ溶媒）１ｍｌを加え５ｍｉｎ攪拌し、ＤＭＦで１０回洗浄した。

１）カップリング過程
アミノ酸（Ｋ：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ＝６７．５ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ、Ｐ：Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ＝４８．６ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）、Ｒ：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ＝９７．５ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）、Ｖ：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ＝４８．９ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ））、ＡＥＥＡ（Ｆｍｏｃ−２（２−ａｍｉｎｏ ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）＝５５．５ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）、及び上記アゾベンゼン化合物Ｉ＝５０．２ｍｇ（０．０９６ｍｍｏｌ）をｂａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２００μｌ、ＤＭＦ２００μｌに溶かした溶液に、Ｏ−（７−ａｚａｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３，−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＡＴＵ）＝２７３ｍｇ（０．７２ｍｍｏｌ）を加えた後、ｒｅｓｉｎに加え、２ｈ攪拌した。また合成の際、ＡＥＥＡ、アゾベンゼン化合物Ｉ以降の合成についてはカップリング操作を二回行った。

２）キャッピング過程
溶媒を取り除き、ＤＭＦで５回洗浄した後、ｃａｐｐｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１ｍｌ加えて５分間攪拌した。その後、溶媒を取り除き、ｒｅｓｉｎをＤＭＦで１０回洗浄した。

３）脱保護過程
Ｄｅｂｌｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１ｍｌ加え、５分間攪拌した後、溶媒を取り除き、ＤＭＦで１０回洗浄した。またこのときの脱保護後の溶媒をＤＭＦで希釈し、３００ｎｍの紫外−可視吸収スペクトルを測定することで合成効率を確認した。

１）、２）、及び３）の過程を繰り返して伸長反応を行い、上述した目的配列の各種化合物を合成した。

合成終了後、ジクロロメタンで洗浄し、ｒｅｓｉｎを乾燥させた後、１０％ｍ−ｃｒｅｓｏｌ／ＴＦＡを１ｍｌ加え、１２時間、攪拌することでｒｅｓｉｎからの切り出しを行った。切り出した溶媒を１５ｍｌのファルコンチューブに回収し、ジエチルエーテルを加えて−８０℃で１０分間冷却し目的物を析出させた後４４００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心を行い、目的物を沈殿させた。溶媒を取り除き、ジエチルエーテルで二回洗浄を行い、溶媒を取り除きｒｅｓｉｎを乾燥させた。ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３，２０×２５０ｍｍ^２，０％〜５０％ｆｏｒ １２０ｍｉｎ，ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０．１％ＴＦＡａｔ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製を行いそれぞれの目的物を得た。また、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチド（以後ＮＬＳとする。）も同様にして製造した。得られたこれらの目的物を５／６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（ＴＡＭＲＡ−ＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、プロトコルに従って修飾を行った。

それぞれの目的物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ、Ｓｈｉｍａｚｕ）を用いて同定を行った。

得られたペプチド結合型アゾベンゼン化合物の情報について、下記表１に示す。

なお、表中のサンプルＮＬＳ-ＡＥＥＡ-ＮＬＳにおいて、ＡＥＥＡとはアミノエチルエトキシアセテートを示し、そのアミノ基が配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端のバリン（Ｖ）のカルボキシル基とペプチド結合しており、ＡＥＥＡのカルボキシル基は、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるＮ末端のプロリン（Ｐ）のイミノ基とペプチド結合している。

そして、なお、表中のサンプルＮＬＳ-ＡＺＯ-ＮＬＳにおいて、ＡＺＯとは上記アゾベンゼン化合物Ｖを示し、そのアミノ基が配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端のバリン（Ｖ）のカルボキシル基とペプチド結合しており、上記アゾベンゼン化合物Ｖのカルボキシル基は、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるＮ末端側のプロリン（Ｐ）のイミノ基とペプチド結合している。

また、それぞれの化合物の濃度については５４６ｎｍの吸光度からＴＡＭＲＡのモル吸光係数（４．７×１０^４Ｍ^−１ｃｍ^−１）により算出した。

実験例３：ペプチド結合型アゾベンゼン化合物を用いた細胞導入実験
Ｈｅｌａ細胞に上記ＮＬＳ−ＡＥＥＡ−ＮＬＳ及びＮＬＳ−ＡＺＯ−ＮＬＳのシス体並びにシス／トランス体を作用させて、斯かる細胞の核内に移行するかどうかを検討した。

トランス体は、ＮＬＳ−ＡＺＯ−ＮＬＳを超純水に溶解させ、次いで９５℃で１０分間加熱した後に、室温にて徐々に冷却して作製した。シス／トランス体は、ＮＬＳ−ＡＺＯ−ＮＬＳを超純水に溶解させ、上述のキセノンランプ光源の光を照射して作製した。なお、ＮＬＳ−ＡＥＥＡ−ＮＬＳは、上記トランス体と同様の処理を施した、
これらのサンプルをそれぞれ終濃度が１２０ｎＭとなるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭに溶解させた後にＨｅｌａ細胞に添加した後、９０〜１８０分インキュベートした後に、ＴＡＭＲＡに基づく蛍光を、蛍光顕微鏡にて観察した。インキュベーション開始から９０分後の蛍光顕微鏡写真を図３に、１８０分後の蛍光顕微鏡写真を図４に示す。

図３の結果から、トランス体のＮＬＳ−ＡＺＯ−ＮＬＳは、シス／トランス体のＮＬＳ−ＡＺＯ−ＮＬＳよりも、ＮＬＳ−ＡＥＥＡ−ＮＬＳよりも核内に多く局在していることが明らかとなった。この様な効果は、図４に示すインキュベート開始から１８０分後であっても同様の傾向がみられた。

以上のことから、例えば細胞内にＮＬＳ−ＡＺＯ−ＮＬＳを導入し、次いで可視光を照射することによって、トランス体からシス体へ光異性化を細胞内にて生じさせることによって、ＮＬＳ−ＡＺＯ−ＮＬＳが核内に移行するように制御することが可能である。

合成例５：ペプチド核酸結合型アゾベンゼン化合物
ペプチド結合型アゾベンゼン化合物として、上記アゾベンゼン化合物ＶのＮ末端及びＣ末端にペプチド核酸及びアミノ酸を有するアゾベンゼン化合物を作製した。

具体的には上述の合成例４と同様にＦｍｏｃ固相合成法に供して作製した。なお、アゾベンゼン化合物としては、上記アゾベンゼン化合物Ｉを原料にした。各種塩基を有するペプチド核酸として、ＣはＦｍｏｃ−Ｃ（Ｂｈｏｃ）−ａｇｅ−ＯＨ（以後、ＰＮＡ〔Ｃ〕とする；Ｐａｎａｇｅｎｅ社）、そしてＴはＦｍｏｃ−Ｔ−ａｇｅ−ＯＨ（以後、ＰＮＡ〔Ｔ〕とする。Ｐａｎａｇｅｎｅ)を用いた。なお、ａｇｅとはアミノエチルグリシンを表す。

得られたペプチド核酸結合型アゾベンゼン化合物の情報について、下記表２に示す。

なお、表中Ｋとはリジンを表し、Ｋ_３とはリジンが３つ、ペプチド結合していることを示す。また、ＡＺＯとは上記アゾベンゼン化合物Ｖを示す。そして、Ｃ３はグリシン、Ｃ４はβアラニン、Ｃ５は４−アミノブチル酸（４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、Ｃ６は５−アミノ吉草酸（５−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）である。

（サンプルＡＺＯ Ｃ０について）
塩基配列がＣＣＴＣＴであるペプチド核酸のＮ末端（５’末端）のＰＮＡ〔Ｃ〕のアミド基が、上述の３つのリジンがペプチド結合したペプチドのＣ末端のリジン残基のカルボキシル基とペプチド結合しており、塩基配列がＣＣＴＣＴであるペプチド核酸のＣ末端（３’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のカルボキシル基が、上記アゾベンゼン化合物のＮ末端とペプチド結合している。また、塩基配列がＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＴ（配列番号２）であるペプチド核酸のＮ末端（５’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のアミド基が、上記アゾベンゼン化合物Ｖのカルボキシル基とペプチド結合しており、配列番号２に示す塩基配列からなるペプチド核酸のＣ末端（３’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のカルボキシル基がリジンのアミド基とペプチド結合している。

（サンプルＡＺＯ Ｃ３について）
塩基配列がＣＣＴＣＴであるペプチド核酸のＮ末端（５’末端）のＰＮＡ〔Ｃ〕のアミド基が、上述の３つのリジンがペプチド結合したペプチドのＣ末端のリジン残基のカルボキシル基とペプチド結合しており、塩基配列がＣＣＴＣＴであるペプチド核酸のＣ末端（３’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のカルボキシル基が、グリシンのアミノ基とペプチド結合している。また、上記アゾベンゼン化合物Ｖのアミド基は、グリシンのカルボキシル基とペプチド結合しており、上記アゾベンゼン化合物Ｖのカルボキシル基は、配列番号２に示す塩基配列からなるペプチド核酸のＮ末端（３’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のアミド基とペプチド結合している。そして、配列番号２に示す塩基配列からなるペプチド核酸のＣ末端（５’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のカルボキシル基とリジンのアミド基がペプチド結合している。

（サンプルのＡＺＯ Ｃ４について）
塩基配列がＣＣＴＣＴであるペプチド核酸のＮ末端（５’末端）のＰＮＡ〔Ｃ〕のアミド基が、上述の３つのリジンがペプチド結合したペプチドのＣ末端のリジン残基のカルボキシル基とペプチド結合しており、塩基配列がＣＣＴＣＴであるペプチド核酸のＣ末端（３’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のカルボキシル基が、βアラニンのアミノ基とペプチド結合している。また、上記アゾベンゼン化合物Ｖのアミド基は、βアラニンのカルボキシル基とペプチド結合しており、上記アゾベンゼン化合物Ｖのカルボキシル基は、配列番号２に示す塩基配列からなるペプチド核酸のＮ末端（３’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のアミド基とペプチド結合している。そして、配列番号２に示す塩基配列からなるペプチド核酸のＣ末端（５’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のカルボキシル基とリジンのアミド基がペプチド結合している。

（サンプルのＡＺＯ Ｃ５について）
塩基配列がＣＣＴＣＴであるペプチド核酸のＮ末端（５’末端）のＰＮＡ〔Ｃ〕のアミド基が、上述の３つのリジンがペプチド結合したペプチドのＣ末端側のカルボキシル基とペプチド結合しており、塩基配列がＣＣＴＣＴであるペプチド核酸のＣ末端（３’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のカルボキシル基が、４−アミノブチル酸のアミド基とペプチド結合している。また、上記アゾベンゼン化合物Ｖのアミド基は、４−アミノブチル酸のカルボキシル基とペプチド結合しており、上記アゾベンゼン化合物Ｖのカルボキシル基は、配列番号２に示す塩基配列からなるペプチド核酸のＮ末端（３’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のアミド基とペプチド結合している。そして、配列番号２に示す塩基配列からなるペプチド核酸のＣ末端（５’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のカルボキシル基とリジンのアミド基がペプチド結合している。

（サンプルのＡＺＯ Ｃ６について）
塩基配列がＣＣＴＣＴであるペプチド核酸のＮ末端（５’末端）のＰＮＡ〔Ｃ〕のアミド基が、上述の３つのリジンがペプチド結合したペプチドのＣ末端側のカルボキシル基とペプチド結合しており、塩基配列がＣＣＴＣＴであるペプチド核酸のＣ末端（３’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のカルボキシル基が、５−アミノ吉草酸のアミド基とペプチド結合している。また、上記アゾベンゼン化合物Ｖのアミド基は、５−アミノ吉草酸のカルボキシル基とペプチド結合しており、上記アゾベンゼン化合物Ｖのカルボキシル基は、配列番号２に示す塩基配列からなるペプチド核酸のＮ末端（３’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のアミド基とペプチド結合している。そして、配列番号２に示す塩基配列からなるペプチド核酸のＣ末端（５’末端）のＰＮＡ〔Ｔ〕のカルボキシル基とリジンのアミド基がペプチド結合している。

実験例４：ペプチド核酸結合型アゾベンゼン化合物とＤＮＡの結合実験
上述のペプチド核酸結合型アゾベンゼン化合物に含まれるペプチド核酸が有する塩基配列と、相同性を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を用いて、結合実験を行った。

具体的なｓｓＤＮＡの配列は、５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号３）であり、３’末端側にＣｙ３色素が結合しているものを用いた。

上記各種ペプチド核酸結合型アゾベンゼン化合物と上述のｓｓＤＮＡをそれぞれ終濃度が１μＭとなるように２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で混合し、室温にて１５分間インキュベートした。その後、電気泳動に供した。結果を図５に示す。

ｓｓＤＮＡのみの場合、図５のｓｓＤＮＡにて示すように一つのバンドしか観察されなかったが、各種ペプチド核酸結合型アゾベンゼン化合物と混合させることによって両者が結合してｓｓＤＮＡとペプチド核酸結合型アゾベンゼン化合物に含まれる二か所のペプチド核酸との間で三重鎖構造を形成し、ｓｓＤＮＡよりも上部にバンドが表れていることが明らかとなった。ただし、ＡＺＯ Ｃ０では不完全な三重鎖構造となっており、ＡＺＯ Ｃ３では、三重鎖構造を形成しにくいことが明らかである。これは、ｓｓＤＮＡを示すバンドが濃いことからも明らかである。この様な傾向は、ＡＺＯ Ｃ６でも見られる。

一方で、ＡＺＯ Ｃ４及びＡＺＯ Ｃ５では、他のペプチド核酸結合型アゾベンゼン化合物と比較して、ｓｓＤＮＡを示すバンドも薄く、不完全な三重鎖構造もほとんど見受けられないことから、ｓｓＤＮＡと結合し、安定な三重鎖構造をとっているものと考えられる。

これは、上記ペプチド核酸結合型アゾベンゼン化合物に含まれる二か所のペプチド核酸の間に存在する上記アゾベンゼン化合物Ｖ近傍に、長さの異なるアミノ酸残基を配置したことに基づくものである。すなわち、ＡＺＯ Ｃ４及びＡＺＯ Ｃ５にてアゾベンゼン化合物Ｖの近傍に配置したアミノ酸の主骨格が、グリシン、アラニンのように短いものであっても、５−アミノ吉草酸であっても対象となる核酸と結合する際に、強固で安定な結合となる三重鎖構造はとりにくいことになる。

Claims (4)

1. 下記化学式（１）にて示されるアゾベンゼン化合物；
   

   

   （式（１）中、
   Ｘは硫黄原子であり、
   Ｙは炭素数が１〜８個の低級アルキレン基、炭素数が３〜８個の低級アルケニレン基、又は炭素数が３〜８個の低級アルキニレン基であり、
   Ａは保護基、水素原子、Ｎ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ａ１）、又はＮ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ａ２）であり、
   該アミノ酸残基（ａ１）とはペプチドが有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基であり、
   該ペプチド核酸残基（ａ２）とはペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基であり、
   上記Ａ中の保護基はアミノ基の保護基であり、
   Ｂは保護基、ヒドロキシル基、Ｃ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ｂ１）、又はＣ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ｂ２）であり、
   該アミノ酸残基（ｂ１）とはペプチドが有するペプチド主鎖のＮ末端のアミノ基からＨを除いた基であり、
   該ペプチド核酸残基（ｂ２）とはペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＮ末端のアミノ基からＨを除いた基であり、
   上記Ｂ中の保護基はカルボキシル基の保護基である。）。
2. 前記Ｙが−ＣＨ_２−である、請求項１に記載のアゾベンゼン化合物。
3. 下記化学式（１）
   

   

   （式（１）中、
   Ｘは硫黄原子であり、
   Ｙは炭素数が１〜８個の低級アルキレン基、炭素数が３〜８個の低級アルケニレン基、又は炭素数が３〜８個の低級アルキニレン基であり、
   Ａは保護基、水素原子、Ｎ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ａ１）、又はＮ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ａ２）であり、
   該アミノ酸残基（ａ１）とはペプチドが有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基であり、
   該ペプチド核酸残基（ａ２）とはペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＣ末端のカルボキシル基からＯＨを除いた基であり、
   上記Ａ中の保護基はアミノ基の保護基であり、
   Ｂは保護基、ヒドロキシル基、Ｃ末端に保護基を有していてもよいアミノ酸残基（ｂ１）、又はＣ末端に保護基を有していてもよいペプチド核酸残基（ｂ２）であり、
   該アミノ酸残基（ｂ１）とはペプチドが有するペプチド主鎖のＮ末端のアミノ基からＨを除いた基であり、
   該ペプチド核酸残基（ｂ２）とはペプチド核酸が有するペプチド主鎖のＮ末端のアミノ基からＨを除いた基であり、
   上記Ｂ中の保護基はカルボキシル基の保護基である。）。
   にて示されるアゾベンゼン化合物の製造方法であって、
   （ｉ）下記化学式（２）
   

   

   （式（２）中、Ｙは前記式（１）と同じであり、Ａ′はアミノ基の保護基である。）
   にて示されるアニリン化合物を、酸化剤を用いて反応させる工程１、
   （ｉｉ）工程１によって得られる下記化学式（３）
   

   

   （式（３）中、Ｙ及びＡ′は前記式（２）と同じである。）
   にて示されるニトロソ化合物と、下記化学式（４）
   

   

   （式（４）中、Ｘは前記式（１）と同じであり、Ｂ′はカルボキシル基の保護基又はヒドロキシル基である。）
   にて表されるアニリン化合物を混合して反応させ、下記化学式（５）
   

   

   （式（５）中、Ｙ及びＡ′は前記式（２）と同じであり、Ｘ及びＢ′は前記式（４）と同じである。）
   にて示される、アゾベンゼン化合物を得る工程２、
   （ｉｉｉ）必要に応じて上記化学式（５）で示されるアゾベンゼン化合物におけるＡ′及び／又はＢ′の保護基を脱保護する工程３、
   及び、
   （ｉｖ）必要に応じて上記工程２又は工程３で得られるアゾベンゼン化合物を固相合成法に供し、化学式（１）にて示されるアゾベンゼン化合物とする工程４、
   を含む製造方法。
4. 前記Ｙが−ＣＨ_２−である、請求項３に記載の製造方法。

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