JP3800245B2 - 新規な機能性ペプチド核酸およびその製法 - Google Patents
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Description
従来のDNAを媒体にしていた技術をPNA化することにより、これまで克服できなかったDNAの欠点を補うことが可能となった。例えば、遺伝情報の体系的な解析を高速に且つ大量に行うための「DNAマイクロアレイ技術」および塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出できるプローブとして最近開発された「モレキュラービーコン」に応用することが可能である。これらはいずれも酵素耐性に乏しいDNAを媒体とするため、これらの技術を用いるに際しては厳密なサンプリングが要求される。この要求を満たすことが、前記の技術を高度化する上での鍵となっている。
一方PNAは酔素に対し完全な耐性を持つので、DNAマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコンにおいてPNAをDNAに代用することによって、前記技術の欠点が克服され、さらに長所が引き出されるものと期待されている。
DNAマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコン以外にもPNA化することにより発展が期待される分野は数多いが、それらにおいてはPNAの効率的な機能化、すなわちPNAモノマーへの機能性分子の効率的な導入による新規なPNAモノマーの設計が必要である。
PNAオリゴマーの合成方法には通常の固相ペプチド合成法を用いるので、PNAモノマーユニットをPNAの背骨構造によって分類すると、Fmoc型PNAモノマーユニットとBoc型PNAモノマーユニットの2種類が含まれる(図2)。
Fmoc型PNAモノマーユニットの合成方法は既に確立されており、しかもそのオリゴマーの合成は一般的なDNA自動合成機によって可能であるため、下記のルート
によって、少量スケールでの合成が可能となっている。
なお、Fmocとは9−Fluorenylmethoxycarbonyl、BocとはtButoxycarbonyl、AllocとはAllyloxycarbonylを指す。
当初PNAには下記のようなBoc型PNAモノマーユニット
しかし、グアニン・チミン・シトシン・アデニン4種類の核酸塩基以外の機能性分子を導入する際、例えば光機能性分子を導入する際には、導入する機能性分子がアルカリ条件に不安定な場合が多いので、アルカリ条件を使用しないBoc型PNA背骨構造の有用性は高い。「t−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン及びアミノ酸誘導体の製造方法」に関しては、本発明者らが特願2000−268638として既に特許出願中である。
これ以外にも、光機能性オリゴPNAのモノマーユニットの合成例は過去に5例が知られている。これら全てが上記ルートを用いているが、その収率については記載がないか、または極めて低いものでしかない(Peter E.Nielsen,Gerald Haaiman,Anne B.Eldrup PCT Int.Appl.(1998)WO 985295 A1 19981126,T.A.Tran,R.−H.Mattern,B.A.Morgan(1999)J.Pept.Res,53,134−145,Jesper Lohse et al.(1997)Bioconjugate Chem.,8,503−509,Hans−georg Batz,Henrik Frydenlund Hansen,et al.Pct Int.Appl.(1998)WO 9837232 A2 19980827,Bruce Armitage,Troels Koch,et al.(1998)Nucleic Acid Res.,26,715−720)。また、用いられる化合物の構造がアルカリ性条件に比較的安定であることが特徴的であるため、アルカリ性条件に不安定な発色団が付くと、前記従来法と類似の方法、すなわち下記ルートA
したがって、一般に光機能性分子等の機能性分子は高価な場合が多いため、より合目的的な機能性PNAの合成方法、すなわち、▲1▼機能性PNAモノマーユニットの設計における、機能性分子のPNA背骨構造への効率的な導入、▲2▼コストパフォーマンスを考えた合成ルート、および▲3▼遺伝子診断薬としての応用へ適応させるための、これらの機能性分子を超高速に導入する方法が探求された。
上記課題に鑑み、本発明者らは、機能性PNAモノマーの新規製造方法として、下記ルートB
また、本発明者らは、機能性PNAモノマーを合成する別法として、PNA背骨構造に上記t−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体6の代わりにベンジルオキシカルボニル−ω−アミノ酸誘導体を用いる方法(ルートC)を見出した。これらの方法については、既に特許出願がなされている。
したがって、最終的に機能性PNAを合成するための方法として、上記ルートBおよびルートCのいずれかを用いる方法によって機能性PNAモノマーを合成した後に、それらを重合する方法が工業的にも確立されつつある。すなわち、現在までの機能性PNAの合成法によってPNAブロープとして用いられる機能性PNAを工業的に大量合成することは可能になりつつある。
一方、コストパフォーマンスの向上および機能性分子を超高速に導入することを目的とした、機能性PNAを合成方法の改良もなされている。例えば、前記機能性PNAモノマーユニットを用いる方法とは異なるアプローチとして、下記の前駆体的PNAモノマーユニットを利用することによって、ポスト合成的に機能性分子をPNAオリゴマーに導入する方法が報告されている(Oliver Seitz;Tetrahedron Letters 1999,40,4161−4164.)。
しかし、当該方法においては、導入できる機能性分子の種類が限定される等の欠点がある。
例えば、下図に示すように、市販されている光機能性分子のsuccinimideエステルを導入することはできず、導入するためにはFmoc−Gly等のリンカーをまず導入する必要があるが、結果として上記化合物は使用しにくいものになっている。
すなわち、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するPNAモノマーユニットを、下図に示すFmoc−ω−アミノ酸−BocPNA−OH(IV)と反応させてPNAオリゴマーを合成した後、該PNAオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子をポスト合成的に導入することに成功した。
前記合成方法は、機能性分子を導入した後に、さらに別異の機能性分子の導入を行うことができる。また、導入される機能性分子が、、光応答性機能分子、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子から選択されることを特徴とする。
また、導入する機能性分子として市販のsuccinimideエステルを使用する必要がなく、カルボン酸を有する化合物であれば問題なく利用でき且つ定量的に導入できるので、前記合成方法はコストパフォーマンスに極めて優れている。
さらに、前記前駆体的PNAモノマーユニットを機能性PNAオリゴマーに導入した後にレジンを分割することにより、それぞれのレジンに異なった機能性分子を導入することができるので、極めて高速な機能性PNAオリゴマーの合成手法を開発することが可能となる。
この方法によって効率的な合成が可能になる機能性PNAオリゴマーの例として、下記一般式(V)
ところで、細胞中に導入するためのに蛍光プローブとして、これまでDNAオリゴマー・RNAオリゴマー・PNAオリゴマーが利用されているが、これらを細胞中に導入するためには、当然ながら細胞膜を通過させなければならない。しかし、細胞膜は膜表面が負電荷を帯びているため、元々負に帯電しているDNA/RNAオリゴマーを導入するのは非常に困難である。
一方PNAオリゴマーは電気的に中性であるが、膜透過しにくいという結果が得られている。したがって、PNAオリゴマーを細胞内に導入するに際しては、膜表面を前処理してその導入をしやすくしたり、あるいはトランスフェクション試薬を用いて導入せざるを得ないのが現状である。
しかし、そのような処理を施してPNAオリゴマーを導入した場合においてプローブの機能が発揮されたとしても、本来生体が示す挙動を正確に表現していることは必ずしも保証されない。しかも、これは細胞1個の場合であり、多細胞(個体)での利用に至っては到底不可能である。
このような現状および観点から、膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブの開発が有用であると考えられている。
なお、膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブは既に存在する。例えば、▲1▼膜透過性機能を有するオリゴペプチドをPNAに結合させたもの、▲2▼膜透過性機能を有するリン脂質をPNAに結合させたものが挙げられる。しかしながら、これらは膜透過した後細胞内においてプロテアーゼ等の酵素によりPNA以外の部分が分解され、細胞内に滞留してしまうことが予想される。このことは、ターゲットを捕捉出来なかった過剰なPNAプローブが膜透過性機能を失い、その後の洗浄過程で細胞外に出にくくなることにつながるため、本来細胞が持っている遺伝子発現系を正確に表現できないことを意味する。
ところが、本発明者らは、Fmoc−ω−アミノ酸−BocPNA−OHを含有した前駆体的PNAオリゴマーを用いて、膜透過性機能を有するアミノ酸誘導体をポスト合成的に導入することにより、煩雑な前処理・後処理を含まない、すなわち生きた細胞をそのまま用いて遺伝子発現系を正確に分析できる新規蛍光PNAプローブの設計に成功した。
しかし、この前駆体的PNAオリゴマーはFmoc−ω−アミノ酸−BocPNA−OHのみが有効であるわけでなく、必須アミノ酸であるリジン誘導体でもその役割を代行することが可能で、扱いやすさ・入手のしやすさを考慮に入れた新規蛍光PNAプローブの設計が今後必要になってくると予想される。
したがって、本発明は、コストパフォーマンスに優れ、かつ機能性分子を超高速に導入することができる、機能性PNAの新規合成方法およびそれに用いる化合物、ならびに新規機能性PNAを提供することを目的とする。
(1).機能性PNAオリゴマーを製造する方法であって、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するPNAモノマーユニットを、一般式(I)によるBoc−リジン(Fmoc)−OH(尚、Fmocとは9−Fluorenylmethoxycarbonylを示す。)、或いは下記の一般式(II)によるFmoc−リジン(Alloc)−OH(尚、Fmocとは9−Fluorenylmethoxycarbonyl、BocとはtButoxycarbonyl、AllocとはAllyloxycarbonylを示す。)と反応させてPNAオリゴマーを合成した後、該PNAオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子を導入し、さらに前記保護基の脱保護を行うことを含む、前記方法。
(2).機能性PNAオリゴマーを製造する方法は、機能性分子を導入した後に、さらに別異の機能性分子の導入を行うことを特徴とする前記(1)の方法。
(3).導入される機能性分子が、光応答性機能分子、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子から選択されることを特徴とする前記(1)の方法。
(4).導入される機能性分子が、光機能性分子および膜透過性機能分子を含むことを特徴とする前記(2)、(3)の方法。
(5).光機能性分子が、下記のCy3、Cy5、Bodipy、pyrene、naphthalimide、naphthaldiimide、FAM、FITC、ROX、TAMRAまたはDabcylであり、膜透過性機能分子が水溶性アミノ酸誘導体であることを特徴とする前記(4)の方法。
(7).PNAオリゴマーの合成が、Boc法用及びFmoc法用固相担体を用いたPNA鎖における縮合・伸長を含むことを特徴とする前記(1)〜(6)のいずれかの方法。
(8).Boc法用固相担体が固相Boc法でペプチド合成に使用するmethylbenzhydrylamine樹脂(MBHA)であることを特徴とする、前記(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9).Fmoc法用固相担体がMBHA、ポリスチレンをクロロメチル化した樹脂(Merrifield樹脂)、4−ヒドロキシベンジルアルコールで修飾したMerrifield樹脂(Wang樹脂)、Boc−アミノ酸−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂(PAM樹脂)、N−Fmoc−N−メトキシ−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂(Weinreb樹脂)、ポリスチレンにp−ニトロベンゾフェノンオキシムを結合させた樹脂(Oxime樹脂)、ポリスチレンを利用してトリチル化した樹脂(Trityl樹脂)であることを特徴とする前記(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(10).遊離カルボン酸を有する機能性分子の導入が、Boc法におけるFmoc基をピペリジン処理によって或いはFmoc法におけるAlloc基を亜鉛酢酸溶液処理によって、選択的に脱保護して得られた1級アミノ基との脱水縮合によって行われることを特徴とする前記(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11).下記a)〜d):
a)Boc−リジン(Fmoc)−OHをPNAオリゴマー中に導入する工程において、PNAモノマーユニットを、Boc−リジン(Fmoc)−OHと反応させてPNAオリゴマーを製造すること;
b)前記PNAオリゴマーから機能性PNAオリゴマーを製造する工程において、PNAオリゴマーへの機能性分子の導入が、Fmoc基をピペリジン処理によって選択的に脱保護して得られた1級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の1または2以上を含むこと;
c)Fmoc−リジン(Alloc)−OHをPNAオリゴマー中に導入する工程において、PNAモノマーユニットを、Fmoc−リジン(Alloc)−OHと反応させてPNAオリゴマーを製造すること;および
d)前記PNAオリゴマーから機能性PNAオリゴマーを製造する工程において、PNAオリゴマーへの機能性分子の導入が、Alloc基を亜鉛酢酸溶液処理によって選択的に脱保護して得られた1級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の1または2以上を含むことを特徴とする前記(2)記載の方法。
(12).下記一般式(III)
(13).X1+X2+X3=3であり、Y1+Y2=15であることを特徴とする、前記(12)記載の化合物。
(14).X1=3であり、Y1=15であることを特徴とする、前記(13)記載の化合物。
(15).RまたはR1が細胞膜透過性機能分子誘導体であることを特徴とする、前記(14)記載の化合物。
(16).R1が機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、前記(15)記載の化合物。
(17).X1=Z1=1であることを特徴とする、前記(15)または(16)記載の化合物。
(18).Y1≧2であり、Z2=1であることを特徴とする、前記(15)〜(17)のいずれかに記載の化合物。
(19).a≦6であり、b≦4であり、f≦6であることを特徴とする、前記(15)〜(18)のいずれかに記載の化合物。
(20).R1が光機能性カルボン酸誘導体であることを特徴とする、前記(15)〜(19)のいずれかに記載の化合物。
本発明は、Boc−リジン(Fmoc)−OH或いはFmoc−リジン(Alloc)−OHをPNAオリゴマーに導入した後、機能性分子をポスト合成的に導入することにより、ほぼ定量的に光機能性PNAオリゴマーを合成できることに成功したものである。
尚、Fmoc、Boc、Allocの各趣旨については、証拠を説明する前記(1)において示した通りである。
上記特徴により、本発明の製造方法においては、導入する機能性分子として市販のsuccinimideエステルを使用する必要がなく、カルボン酸を有する化合物であれば問題なく利用でき且つ定量的に導入できる。そのため、本発明による製造方法はコストパフォーマンスに極めて優れている。
また、前記前駆体的PNAモノマーユニットを機能性PNAオリゴマーに導入した後にレジンを分割することにより、それぞれのレジンに異なった機能性分子を導入することができる。したがって、本発明による製造方法によれば、極めて高速な機能性PNAオリゴマーの合成手法を開発することが可能となる。
本発明の方法によって効率的な合成が可能になる機能性PNAオリゴマーの例として、下記一般式(III)
本発明によれば、前記一般式(I)で表される化合物において同一または異なる機能性分子を、任意の複数の位置に導入することも可能となる。すなわち、前記前駆体的PNAモノマーユニットsを用いてPNAオリゴマーを導入した後、ピペリジン処理或いは亜鉛酢酸溶液処理のいずれかと機能性分子のポスト合成的導入を一括して行うことによるものであるが、これはPNAオリゴマーの細胞膜透過機能を向上させるアンテナペデイアを高速に設計する上で、欠かせないものである。この点においても、本発明による方法は極めて優れたものである。
このように製造される化合物の例として、前記一般式(I)において、Z1+Z2+Z3+Z4+Z5>0であり、Rが細胞膜透過性分子誘導体であり、R1が機能性カルボン酸誘導体であるものが挙げられる。
このプローブは大きく蛍光標識領域・細胞膜透過性機能領域・分子認識領域の3つに分けることができ、それぞれをリンカー部位(Z1〜Z5の添字付きで表される部分)を介して結合させた形をしている。
蛍光標識化合物は市販のものも、既に本発明者らがPCT出願を行った新規蛍光標識化PNAモノマーユニットも用いることができる。
分子認識部位は市販のPNAユニットを用いて合成する。このものの特徴は、機能性分子をポスト合成的に導入するために前駆体ユニットとしてBoc−リジン(Fmoc)−OH或いはFmoc−リジン(Alloc)−OHを膜透過性機能領域部に用いていることである。該前駆体ユニットは市販されており、これを複数個並べて導入した後、前記したように同一機能性分子を一括導入できることを特徴としている。
したがって、本発明によれば、光機能性分子に限定されることない、多種多様な機能性分子を、PNA中に容易かつ極めて効率的に導入することができるようになる。
このような機能性分子として、Cy3型、Cy5型、Bodipy型、Naphthalimide型、Naphthaldiimide型、Flavin型、Dabcyl型、Biotin型、FAM型、Rhodamine型、TAMRA型、ROX型、HABA型、Pyrene型、Coumarine型等の光機能性モノマーユニット、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子等が挙げられる。
すなわち、本発明における「機能性」の語は、光機能性のみならず、膜透過性、臓器選択性、殺菌性、分子破壊性、癒着性、或いは分子認識性等を含む、ある特定の修飾を行うことによって化合物に新たに付与される種々の機能の全てを意味するものである。
さらに、本発明における「機能性PNA」の語は、PNAモノマー同士が2−(N−アミノエチル)グリシン骨格によって直接結合したもののみならず、その間にリンカーとしての炭化水素鎖と機能性分子を導入する前駆体的なリジン骨格等を含むものも意味するものである。
図2は、2種類のPNAモノマーユニットの構造を表す図である。
ここで、本発明による方法の特徴を更に詳細に説明する。
尚、MBHAは、固相Bocでペプチド合成に使用するmethylbenzhydrylamine樹脂のことであり、Wangは、4−ヒドロキシベンジルアルコールで修飾したMerrifield樹脂のことであり、これらについては、[0036]、または[0037]において述べた通りである。
PNA鎖の縮合においては、予めBoc基を脱離しておく必要があるが、その方法に制限はなく、一般的な方法が用いられる。それに続く縮合には、HATU、HBTUおよびBOP等の一般的な縮合剤が用いられる。
また、固相担体に関しては、Boc法用のものであれば特に制限はないが、特にMBHAが好適に用いられる。
次に、[化26]に関わる製造工程のうち、下図
前記カルボン酸として特に制限はないが、反応性の点においては脂肪族カルボン酸が芳香族カルボン酸を上回るため、脂肪族カルボン酸を用いると製造の効率が高く好ましい。
また、ピペリジン処理によるFmoc基の脱保護は、ある程度の時間をかけることによって好適に行われる。特に、20〜40分が好適であり、最も好適には30分であった。
縮合剤の種類に特に制限はなく、前記PNA鎖の縮合と同様に、HATU、HBTUおよびBOP等の一般的な縮合剤が用いられる。
なお、機能性分子の導入は、Boc−リジン(Fmoc)−OHを縮合した後、直ちに行ってもよく、あるいは、Boc−リジン(Fmoc)−OHを含む全てのPNAモノマーユニットを逐次縮合した後に行ってもよい。
最後に、[化26]に関わる製造工程のうち、下図
切り出しおよび脱保護は、Fmoc基の脱保護の後に行われる限りにおいてはその条件に特に制限はない。例えば、TFA/TFMSA/p−Cresol/Thioanisole=60/25/10/10のような一般的な条件において好適に行われる。
次に、[化27]に関わる製造工程のうち、下図
PNA鎖の縮合においては、予めFmoc基を脱離しておく必要があるが、その方法に制限はなく、一般的な方法が用いられる。それに続く縮合には、HATU、HBTUおよびBOP等の一般的な縮合剤が用いられる。
また、固相担体に関しては、Fmoc法用のものであれば特に制限はないが、特にWangが好適に用いられる。
次に、[化27]に関わる製造工程のうち、下図
前記カルボン酸として特に制限はないが、反応性の点においては脂肪族カルボン酸が芳香族カルボン酸を上回るため、脂肪族カルボン酸を用いると製造の効率が高く好ましい。
また、亜鉛酢酸溶液処理によるAlloc基の脱保護は、ある程度の時間をかけることによって好適に行われる。10分〜1時間が好適であった。
縮合剤の種類に特に制限はなく、前記PNA鎖の縮合と同様に、HATU、HBTUおよびBOP等の一般的な縮合剤が用いられる。
なお、機能性分子の導入は、Fmoc−リジン(Alloc)−OHを縮合した後、直ちに行ってもよく、あるいは、Fmoc−リジン(Alloc)−OHを含む全てのPNAモノマーユニットを逐次縮合した後に行ってもよい。
最後に、[化27]に関わる製造工程のうち、下図
切り出しおよび脱保護は、Fmoc基の脱保護の後に行われる限りにおいてはその条件に特に制限はない。例えば、TFA/p−Cresol=95/5のような一般的な条件において好適に行われる。
上記のように、本発明による方法においては、従来の機能性モノマー合成に用いる活性エステル化の合成を要する方法とは異なり、機能性分子をそのまま利用できる。また一旦IIaを合成した後に種々の機能性分子が導入可能であるため、従来困難であった高速かつ多様な並列PNAプローブ合成が可能である。
Boc−リジン(Fmoc)−OH或いはFmoc−リジン(Alloc)−OHとPNA鎖を有する分子との反応を含む本発明による方法によれば、下記一般式(III)
また、前記一般式(III)で表される化合物において、複数の機能性分子が導入されたものとして、例えば、RまたはR1が細胞膜透過性機能分子誘導体であるものが好適に合成される。このような化合物は、典型的には、Rが細胞膜透過性機能分子誘導体等であり、R1が光機能性分子等の機能性カルボン酸誘導体等であるもの、すなわち、末端部を含む複数部位に機能性分子が導入され、それらによって複数の機能が付与された化合物である。このような化合物は、例えば下記のように模式化することができる。
上記化合物において、a、bおよびfはそれぞれ0〜10の整数であれば特に限定されないが、例えばa≦6であり、b≦4であり、f≦6であるものであっても、合成上および実用上のいずれにおいても支障はない。
リンカー部位を導入することによって、個々の機能性部位および塩基配列認識領域の干渉を防ぎ、分子の機能をより確実なものにすることができる。本明細書におけるPNA、PNAモノマーおよびPNAオリゴマーの語には、リンカー部位をその末端および/または内部に含むものも包含される。
これらの部位または領域間の相互干渉を防そための部位としては、前記リンカー部位のみならず、一般式(III)におけるf〜hを、所望に応じて選択することによっても可能である。
リンカー部位を構成する基としては、直鎖状または分枝状の炭化水素およびそれらのエーテル体等が挙げられるが、直鎖状炭化水素基は導入の容易さおよびコストなどの面から好適であり、特に炭素数1〜6の直鎖状炭化水素基が好適である。また、エーテル体は、その汎用性において好適である。
前記複数の機能性分子が導入された化合物は、例えばKoch,T.;Hansen,H.F.;Andersen,P.;Larsen,T.;Batz,H.G.;Otteson,K.;▲O▼rum,H.J.Peptide Res.1997,49,80−88.を利用して好適に合成される。
塩基配列認識部位は、市販の各種PNAモノマーを用いて固相合成によりオリゴマー化することができる。リンカー部位には、市販のBoc−7−アミノヘプタン酸、Boc−6−アミノカプロン酸等を用いることができる。
一般式(III)の機能性分子として光機能性分子を導入すれば、蛍光標識することが可能であり、かつ他の機能も有する化合物を合成することができる。このような蛍光標識部位として、市販のCy3、Cy5、Bodipy、pyrene、naphthalimide、naphthaldiimide、FAM、FITC、ROX、TAMRAまたはDabcyl等の市販の活性エステル型蛍光標識化合物を用いて、多様な蛍光発光波長を選択することが可能であるが、導入される蛍光標識化合物はこれらに限定されるものではない。
本発明の化合物に導入し得る他の機能性の例としては、膜透過性機能が挙げられる。このような膜透過性機能部位は、前回特許前記一般式(III)で表される化合物を用いることにより、同様に導入することができる。膜透過性を向上させることができる機能性分子としてアルギニンが挙げられるが、リシンおよびセリン等の他の水溶性アミノ酸も好適に用いることができる。
また、Boc−リジン(Fmoc)−OH或いはFmoc−リジン(Alloc)−OHを利用することによって、複数個のアミノ酸を導入することも可能である。その合成例は実施例1に示した。しかしながら、上記化合物は本発明による膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブのモデル化合物であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
これらのプローブの特徴は、「全てPNA型になっているので、完全な酵素耐性を有すること」である。すなわち、これまでの膜透過性機能を有するプローブは、PNAと膜透過性機能を有するペプチド鎖あるいはリン脂質を共有結合させたものが主流であったが、これらの既知のプローブは優れた膜透過性機能を有するものの、一旦細胞内に入ると酵素群によりペプチド鎖あるいはリン脂質が分解されることが予想される。したがって、これらは、ターゲットを認識していない分解を受けたプローブを洗浄過程で完全に取り除くことができないという欠点を有する。
これに対して、今回設計したプローブは、細胞内においても酵素分解を受けないため、ターゲットを認識していないプローブは洗浄過程で完全に取り除かれるため、正確な遺伝子発現量の定量を可能とするものである。
なお、これらの機能性を有する化合物以外にも、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌機能性分子およびビオローゲン等の分子認識機能性分子、N−メチルヒドロキサム酸等の分子破壊性機能分子等も本発明によれば制限なく導入することが可能であり、そのような化合物を、大量に低コストで実用に供することが可能になる。
(実施例1)膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブの合成
次いで、リンカー用ω−アミノ酸−Boc−7−aminoheptanoic Acid(5.2mg、20mmol)、Fmoc−Ahx−BocPNA−OH(10.0mg、20mmol)と再度Boc−7−aminoheptanoic Acidを、縮合剤HBTU(7.6mg、20mmol)とDIEA(3.5mg、20mmol)を用いて順次縮合させた(リンカー部位と膜透過性機能領域の設計)。
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理(20%piperidine in DMF、室温3分)してFmoc基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体として天然型Fmoc−Arg(Mts)−OH(23.1mg、40mmol)を縮合剤HBTU(15.2mg、40mmol)とDIEA(7.0mL、40mmol)を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した(膜透過性機能の導入)。
これをピペリジン処理(20%piperidine in DMF、室温3分)してFmoc基を脱保護した後、再度天然型Fmoc−Arg(Mts)−OH(23.1mg、40mmol)を縮合剤HBTU(15.2mg、40mmol)とDIEA(7.0mL、40mmol)を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した。これをもう一度繰り返した(膜透過性機能の追加導入)。
TFA処理(95%TFA/5%m−cresol)によりBoc基を脱保護した後、FITC(9.3mg、25mg)をDIEA(17.4mg、100mmol)存在下、室温で12時間攪拌し蛍光標識化した(蛍光標識部位の設計)。
最後にピペリジン処理(2哨piperidinein D肝、室温3分)して残るFmoc基を脱保護した後、常法(TFA/TFMSA/p−cresol/thioanisol=60/25/10/10)により固相担体からの切り出しを行い、後処理して、目的物を得た。MALDI−TOF MS:calcd.6373.0231(M+H+).
(実施例2)膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブの合成
次いで、リンカー用ω−アミノ酸−Boc−7−aminoheptanoic Acid(5.2mg、20mmol)、Fmoc−Ahx−BocPNA−OH(10.0mg、20mmol)と再度Boc−7−aminoheptanoic Acidを、縮合剤HBTU(7.6mg、20mmol)とDIEA(3.5mg、20mmol)を用いて順次縮合させた(リンカー部位と膜透過性機能領域の設計)。
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理(20%piperidine in DMF、室温3分)してFmoc基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体として非天然型Fmoc−Arg(Mts)−OH(23.1mg、40mmol)を縮合剤HBTU(15.2mg、40mmol)とDIEA(7.0mL、40mmol)を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した(膜透過性機能の導入)。
これをピペリジン処理(20%piperidine in DMF、室温3分)してFmoc基を脱保護した後、再度非天然型Fmoc−Arg(Mts)−OH(23.1mg、40mmol)を縮合剤HBTU(15.2mg、40mmol)とDIEA(7.0mL、40mmol)を用いて縮合し目的の位置に機能性分子を導入した。これをもう一度繰り返した(膜透過性機能の追加導入)。
TFA処理(95%TFA/5%m−cresol)によりBoc基を脱保護した後、FITC(9.3mg、25mg)をDIEA(17.4mg、100mmol)存在下、室温で12時間攪拌し蛍光標識化した(蛍光標識部位の設計)。
最後にピペリジン処理(2哨piperidinein D肝、室温3分)して残るFmoc基を脱保護した後、常法(TFA/TFMSA/p−cresol/thioanisol=60/25/10/10)により固相担体からの切り出しを行い、後処理して、目的物を得た。MALDI−TOF MS:calcd.6373.0231(M+H+).
Claims (11)
- 機能性PNAオリゴマーを製造する方法であって、保護基によって保護されたアデニン、
グアニン、シトシンまたはチミンを有するPNAモノマーユニットを、一般式(I)によ
るBoc−リジン(Fmoc)−OH(尚、Fmocとは9−Fluorenylmet
hoxycarbonylを示す。)、或いは下記の一般式(II)によるFmoc−リ
ジン(Alloc)−OH(尚、Fmocとは9−Fluorenylmethoxyc
arbonyl、BocとはtButoxycarbonyl、AllocとはAlly
loxycarbonylを示す。)と反応させてPNAオリゴマーを合成した後、該P
NAオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子を導入し、さらに前記保護基の脱保
護を行うことを含む、前記方法。
- 機能性分子を導入した後に、さらに別異の機能性分子の導入を行うことを特徴とする、請
求の範囲1に記載の方法。 - 導入される機能性分子が、光応答性機能分子、膜透過性機能分子、臓器選択性機能分子、
殺菌性機能分子、分子破壊性機能分子、癒着性機能性分子、或いは分子認識性機能分子か
ら選択されることを特徴とする、請求の範囲1〜2のいずれかに記載の方法。 - 導入される機能性分子が、光機能性分子および膜透過性機能分子を含むことを特徴とする
、請求の範囲2または3に記載の方法。 - 光機能性分子が、Cy3、Cy5、Bodipy、pyrene、naphthalim
ide、naphthaldiimide、FAM、FITC、ROX、TAMRAまた
はDabcylであり、膜透過性機能分子が水溶性アミノ酸誘導体であることを特徴とす
る、請求の範囲4に記載の方法。 - アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを保護する保護基が、ベンジルオキシカルボ
ニル基(Z基)であることを特徴とする、請求の範囲1〜5のいずれかに記載の方法。 - PNAオリゴマーの合成が、Boc法用及びFmoc法用固相担体を用いたPNA鎖にお
ける縮合・伸長を含むことを特徴とする、請求の範囲1〜6のいずれかに記載の方法。 - Boc法用固相担体が固相Boc法でペプチド合成に使用するmethylbenzhy
drylamine(MBHA)であることを特徴とする、請求の範囲1〜7のいずれか
に記載の方法。 - Fmoc法用固相担体がMBHA、ポリスチレンをクロロメチル化した樹脂(Merri
field樹脂)、4−ヒドロキシベンジルアルコールで修飾したMerrifield
樹脂(Wang樹脂)、Boc−アミノ酸−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂(P
AM樹脂)、N−Fmoc−N−メトキシ−リンカーを結合させたアミノメチル樹脂(W
einreb樹脂)、ポリスチレンにp−ニトロベンゾフェノンオキシムを結合させた樹
脂(Oxime樹脂)、ポリスチレンを利用してトリチル化した樹脂(Trityl樹脂
)であることを特徴とする請求の範囲1〜7のいずれかに記載の方法。 - 遊離カルボン酸を有する機能性分子の導入が、Boc法におけるFmoc基をピペリジン
処理によって或いはFmoc法におけるAlloc基を亜鉛酢酸溶液処理によって、選択
的に脱保護して得られた1級アミノ基との脱水縮合によって行われることを特徴とする、
請求の範囲1〜9のいずれかに記載の方法。 - 下記a)〜d):
a)Boc−リジン(Fmoc)−OHをPNAオリゴマー中に導入する工程において
、PNAモノマーユニットを、Boc−リジン(Fmoc)−OHと反応させてPNAオ
リゴマーを製造すること;
b)前記PNAオリゴマーから機能性PNAオリゴマーを製造する工程において、PN
Aオリゴマーへの機能性分子の導入が、Fmoc基をピペリジン処理によって選択的に脱
保護して得られた1級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の1または2以上を
含むことを特徴とする、請求の範囲2に記載の方法;
c)Fmoc−リジン(Alloc)−OHをPNAオリゴマー中に導入する工程にお
いて、PNAモノマーユニットを、Fmoc−リジン(Alloc)−OHと反応させて
PNAオリゴマーを製造すること;および
d)前記PNAオリゴマーから機能性PNAオリゴマーを製造する工程において、PN
Aオリゴマーへの機能性分子の導入が、Alloc基を亜鉛酢酸溶液処理によって選択的
に脱保護して得られた1級アミノ基との脱水縮合によって行われること、の1または2以
上を含むことを特徴とする、請求の範囲2に記載の方法。
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