JP3837633B2 - 新規な機能性ペプチド核酸およびその製法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規機能性ペプチド核酸モノマーおよびその製造方法、並びに該モノマーを用いて機能性ペプチド核酸オリゴマーを製造するための方法に関する。より詳細には、前駆体的PNAモノマーユニットおよびその製造方法、並びに該モノマーユニットをPNAオリゴマーに導入した後に１種または２種以上の所望の機能性分子をポスト合成的に導入することを特徴とする、前記製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
核酸は生物の遺伝情報を司るＤＮＡおよびＲＮＡである。これに対して、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、核酸の糖リン酸骨格をＮ−(２−アミノエチル)グリシン骨格に変換した修飾核酸である（図１）。ＤＮＡ/ＲＮＡの糖リン酸骨格は中性条件で負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、ＰＮＡの背骨構造はもともと電荷を持たないので静電的な反発がない。そのためＰＮＡは従来の核酸と比較して、高い二重鎖形成能をもち、高い塩基配列認識能を持つ。さらにＰＮＡは生体内ヌクレアーゼ・プロテアーゼに対し非常に安定で分解されないので、アンチセンス分子として遺伝子治療に応用することが検討されている。
【０００３】
従来のＤＮＡを媒体にしていた技術をＰＮＡ化することにより、これまで克服できなかったＤＮＡの欠点を補うことが可能となった。例えば、遺伝情報の体系的な解析を高速に且つ大量に行うための「ＤＮＡマイクロアレイ技術」および塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出できるプローブとして最近開発された「モレキュラービーコン」に応用することが可能である。これらはいずれも酵素耐性に乏しいＤＮＡを媒体とするため、これらの技術を用いるに際しては厳密なサンプリングが要求される。この要求を満たすことが、前記の技術を高度化する上での鍵となっている。
【０００４】
一方ＰＮＡは酵素に対し完全な耐性を持つので、ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコンにおいてＰＮＡをＤＮＡに代用することによって、前記技術の欠点が克服され、さらに長所が引き出されるものと期待されている。
ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコン以外にもＰＮＡ化することにより発展が期待される分野は数多いが、それらにおいてはＰＮＡの効率的な機能化、すなわちＰＮＡモノマーへの機能性分子の効率的な導入による新規なＰＮＡモノマーの設計が必要である。
【０００５】
ＰＮＡオリゴマーの合成方法には通常の固相ペプチド合成法を用いるので、ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡの背骨構造によって分類すると、Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットとｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの２種類が含まれる（図２）。
Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの合成方法は既に確立されており、しかもそのオリゴマーの合成は一般的なＤＮＡ自動合成機によって可能であるため、下記のルート
【化１４】
によって、少量スケールでの合成が可能となっている。
【０００６】
当初ＰＮＡには下記のようなｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニット
【化１５】
が採用され、その後より効率のよい合成方法
【化１６】
が確立された。しかし、前述したように取り扱いが容易なＦｍｏｃ型が開発されたため、ｔＢｏｃ型の使用頻度は減少している。すなわち、ｔＢｏｃ法においては、伸長反応およびレジンからの切り出し時に超強酸を用いるのに対し、Ｆｍｏｃ法においては、レジンからの切り出し時にのみ強酸であるトリフルオロ酢酸を用い、途中の伸長反応は中性または弱アルカリ性で進行するため、非常な温和な条件でオリゴマーを合成できる。
しかし、グアニン・チミン・シトシン・アデニン４種類の核酸塩基以外の機能性分子を導入する際、例えば光放出性分子を導入する際には、導入する機能性分子がアルカリ条件に不安定な場合が多いので、アルカリ条件を使用しないｔＢｏｃ型ＰＮＡ背骨構造の有用性は高い。「ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン及びアミノ酸誘導体の製造方法」に関しては、本発明者らが特願２０００−２６８６３８として既に特許出願中である。
【０００７】
これ以外にも、光放出性オリゴＰＮＡのモノマーユニットの合成例は過去に５例が知られている。これら全てが上記ルートを用いているが、その収率については記載がないか、または極めて低いものでしかない（例えば特許文献１〜２および非特許文献１〜３参照）。また、用いられる化合物の構造がアルカリ性条件に比較的安定であることが特徴的であるため、アルカリ性条件に不安定な発色団が付くと、前記従来法と類似の方法、すなわち下記ルートＡ
【化１７】
【化１８】
では効率良く合成できないと予想された。
【０００８】
したがって、一般に光放出性分子等の機能性分子は高価な場合が多いため、より合理的な機能性ＰＮＡの合成方法、すなわち、▲１▼機能性ＰＮＡモノマーユニットの設計における、機能性分子のＰＮＡ背骨構造への効率的な導入、▲２▼コストパフォーマンスを考えた合成ルート、および▲３▼遺伝子診断薬としての応用へ適応させるための、これらの機能性分子を超高速に導入する方法が探求された。
【０００９】
上記課題に鑑み、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーの新規製造方法として、下記ルートＢ
【化１９】
に示すように、ＰＮＡ背骨構造にｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体６を用いて１のペンタフルオロフェニル基を含む活性エステル体５と縮合してほぼ定量的に機能性ＰＮＡモノマー４を合成する方法を見出した。
【００１０】
また、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーを合成する別法として、ＰＮＡ背骨構造に上記ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体６の代わりにベンジルオキシカルボニル−ω−アミノ酸誘導体を用いる方法（ルートＣ）を見出した。これらの方法については、既に特許出願がなされている。
【００１１】
したがって、最終的に機能性ＰＮＡを合成するための方法として、上記ルートＢおよびルートＣのいずれかを用いる方法によって機能性ＰＮＡモノマーを合成した後に、それらを重合する方法が工業的にも確立されつつある。すなわち、現在までの機能性ＰＮＡの合成法によってＰＮＡプローブとして用いられる機能性ＰＮＡを工業的に大量合成することは可能になりつつある。
【００１２】
一方、コストパフォーマンスの向上および機能性分子を超高速に導入することを目的とした、機能性ＰＮＡの合成方法の改良もなされている。例えば、前記機能性ＰＮＡモノマーユニットを用いる方法とは異なるアプローチとして、下記の前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを利用することによって、ポスト合成的に機能性分子をＰＮＡオリゴマーに導入する方法が報告されている（非特許文献４）。
【化２０】
【００１３】
当該方法は、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後、さらに機能性分子を導入することによって機能性ＰＮＡを合成するものである。
しかし、当該方法においては、導入できる機能性分子の種類が限定される等の欠点がある。
【００１４】
例えば、下図に示すように、市販されている光放出性分子のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステルを導入することはできず、導入するためにはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ等のリンカーをまず導入する必要があるが、結果として上記化合物は使用しにくいものになっている。
【化２１】
【００１５】
また、細胞中に導入するためのに蛍光プローブとして、これまでＤＮＡオリゴマー・ＲＮＡオリゴマー・ＰＮＡオリゴマーが利用されているが、これらを細胞中に導入するためには、当然ながら細胞膜を通過させなければならない。しかし、細胞膜は膜表面が負電荷を帯びているため、元々負に帯電しているＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマーを導入するのは非常に困難である。
【００１６】
一方ＰＮＡオリゴマーは電気的に中性であるが、膜透過しにくいという結果が得られている。したがって、ＰＮＡオリゴマーを細胞内に導入するに際しては、膜表面を前処理してその導入をしやすくしたり、あるいはトランスフェクション試薬を用いて導入せざるを得ないのが現状である。
【００１７】
しかし、そのような処理を施してPNAオリゴマーを導入した場合においてプローブの機能が発揮されたとしても、本来生体が示す挙動を正確に表現していることは必ずしも保証されない。しかも、これは細胞1個の場合であり、多細胞（個体）での利用に至っては到底不可能である。
このような現状および観点から、膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブの開発が有用であると考えられている。
【００１８】
なお、膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブは既に存在する。例えば、▲１▼膜透過性機能を有するオリゴペプチドをPNAに結合させたもの、▲２▼膜透過性機能を有するリン脂質をPNAに結合させたものが挙げられる。しかしながら、これらは膜透過した後細胞内においてプロテアーゼ等の酵素によりPNA以外の部分が分解され、細胞内に滞留してしまうことが予想される。このことは、ターゲットを捕捉出来なかった過剰なPNAプローブが膜透過性機能を失い、その後の洗浄過程で細胞外に出にくくなることにつながるため、本来細胞が持っている遺伝子発現系を正確に表現できないことを意味する。
【００１９】
上記背景の下、１個または２個以上の機能性分子を超高速に導入することができる、機能性ＰＮＡオリゴマーの合成方法およびそれに用いる化合物に関して、既に特許出願がなされている（特願２００２−１２１６６７）。
この機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法は、チミンまたは保護基によって保護されたアデニン、グアニンもしくはシトシンを有するＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子をポスト合成的に導入し、さらに前記保護基の脱保護を行うことによって目的物を得ることを特徴とする。
【００２０】
しかしながら、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを用いる上記公知の製造方法においては、機能性分子のＰＮＡオリゴマーへの結合が弱い場合には、保護基の脱保護の際に機能性分子も脱離してしまうため、十分な収率が得られない。
したがって、特に、ＰＮＡオリゴマーへの結合が弱い機能性分子をより効率的に導入する方法に対する要求は依然として大きい。
【００２１】
また、酸性条件に不安定な機能性分子、すなわちｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットを用いた合成法においては導入が困難である機能性分子の導入には、アルカリ条件において用い得るＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットを用いる必要がある。したがって、前記の通りＤＮＡ自動合成機にはＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットが用いられることが多いことにも鑑み、ＤＮＡ自動合成機に用い得る新たなＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットに対する要求も多大なものがある。
【００２２】
Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットを合成する方法は、既に報告されている。
【化２２】
しかしながら、上記WoskiらのＦｍｏｃ型バックボーンを用いる方法は、重大な欠点を有している。すなわち、上記方法においては、バックボーン部と機能性分子との間の距離を調節することができない。また、Ｆｍｏｃ法に固有の問題点である、強酸に対して安定である機能性分子でなければ導入できない問題は克服されていないため、適用範囲が非常に狭いという重大な欠点もある。
【００２３】
【特許文献１】
ピーター・イー・ニールセンら（Peter E. Nielsen et al.） 国際公開第98/5295 A1 号パンフレット。
【特許文献２】
ハンス−ゲオルゲ バッツら（Hans-georg Batz et al.) 国際公開第98/37232 A2号公報。
【非特許文献１】
ティー・エイ・トランら（T. A. Tran et al.）「ペプチド研究ジャーナル」（"J. Pept. Res."）、１９９９年、第５３巻、ｐ．１３４−１４５。
【非特許文献２】
ジェスパー・ローゼら（Jesper Lohse et al.）「バイオコンジュゲート化学」（"Bioconjugate Chem."）、１９９７年、第８巻、ｐ．５０３−５０９。
【非特許文献３】
ブルース・アルミタージら（Bruce Armitage et al.） 「核酸研究」（"Nucleic Acid Res."）、１９９８年、第２６巻、ｐ．７１５−７２０。
【非特許文献４】
オリバー・ザイツ（Oliver Seitz）「テトラヘドロン・レターズ」（"Tetrahedron Letters"） １９９９年 第４０巻、ｐ．４１６１−４１６４。
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、酸性、アルカリ性または中性下において、液性に不安定な化合物があっても、直接またはポスト合成的に、複数の機能性分子を任意の位置に、種々の長さを有するリンカーを介して導入するための、機能性ＰＮＡモノマーユニットおよび機能性ＰＮＡオリゴマーの新規合成方法ならびに新規機能性ＰＮＡモノマーユニットおよび機能性ＰＮＡオリゴマーを提供することを目的とする。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み研究を重ねた結果、本発明者らは、多岐にわたる新規な前駆体的Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットおよびその製造方法を用いることによって、驚くべきことに、従来法における前記課題が克服され、かつ極めて広範にわたる機能性ＰＮＡモノマーユニットおよび機能性ＰＮＡオリゴマーを合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２６】
すなわち、本発明は、下記一般式（Ｉ）：
【化２３】
（式中、ＲはＨ、機能性分子または保護基を表し、ｎは１〜１１までの整数を表す。）で表される化合物に関する。
また、本発明は、機能性分子が、光放出性分子、光消失性分子、膜透過機能性分子、臓器選択性機能性分子、殺菌性機能性分子、分子認識性機能性分子、光架橋機能性分子、光増感機能性分子、ＤＮＡ結合性分子、およびＤＮＡ切断機能性分子から選択された１種または２種以上である、前記化合物に関する。
さらに、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および膜透過機能性分子を含む、前記化合物に関する。
また、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および光消失性分子を含む、前記化合物に関する。
さらに、本発明は、光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、光消失性分子がＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩまたはＡｚｏである、前記化合物に関する。
また、本発明は、膜透過機能性分子が水溶性アミノ酸である、前記化合物に関する。
【００２７】
また、本発明は、Ｒが、
【化２４】
からなる群から選択される、前記化合物に関する。
さらに、本発明は、ｎが１〜５の整数である、前記化合物に関する。
【００２８】
また、本発明は、下記一般式（Ｉ）：
【化２５】
（式中、ＲはＨ、機能性分子または保護基を表し、ｎは１〜１１までの整数を表す。）で表される化合物を製造するための方法であって、下記工程ａ）〜ｂ）の１つを含む、前記方法に関する：
ａ）下記一般式（ＩＩ）
【化２６】
（式中、ｎは１〜１１までの整数を表す。）で表される化合物を、機能性分子のＯＳｕまたはＯＰｆｐとの活性エステル誘導体または機能性分子のイソチオシアネート誘導体と反応せしめる工程、
ｂ）下記一般式（ＩＩＩ）
【化２７】
（式中、ＲはＨ、機能性分子または保護基を表し、ｎは１〜１１までの整数を表す。）で表される化合物を、加水分解する工程、および
ｃ）下記一般式（ＩＶ）
【化２８】
（式中、ＲはＨ、機能性分子または保護基を表し、ｎは１〜１１までの整数を表す。）で表される化合物を、下記一般式（Ｖ）
【化２９】
で表される化合物と反応せしめる工程。
【００２９】
さらに、本発明は、機能性ＰＮＡオリゴマーを製造するための方法であって、下記一般式（Ｉ）
【化３０】
（式中、ＲはＨ、機能性分子または保護基を表し、ｎは１〜１１までの整数を表す。）
で表される化合物の１種または２種以上を結合したＰＮＡオリゴマーの基Ｒを、順次または同時に機能性分子によって置換する工程を含む、前記方法に関する。
【００３０】
またさらに、本発明は、Ｒが、
【化３１】
からなる群から選択される、前記方法に関する。
【００３１】
さらにまた、本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記ａ）〜ｃ）の工程の１つによって製造される、前記方法に関する：
ａ）下記一般式（ＩＩ）
【化３２】
（式中、ｎは１〜１１までの整数を表す。）で表される化合物を、機能性分子のＯＳｕまたはＯＰｆｐとの活性エステル誘導体または機能性分子のイソチオシアネート誘導体と反応せしめる工程、
ｂ）下記一般式（ＩＩＩ）
【化３３】
（式中、ＲはＨ、機能性分子または保護基を表し、ｎは１〜１１までの整数を表す。）で表される化合物を、加水分解する工程、および
ｃ）下記一般式（ＩＶ）
【化３４】
（式中、ＲはＨ、機能性分子または保護基を表し、ｎは１〜１１までの整数を表す。）で表される化合物を、下記一般式（Ｖ）
【化３５】
で表される化合物と反応せしめる工程。
【００３２】
また、本発明は、機能性分子が、光放出性分子、光消失性分子、膜透過機能性分子、臓器選択性機能性分子、殺菌性機能性分子、分子認識性機能性分子、光架橋機能性分子、光増感機能性分子、ＤＮＡ結合性分子、およびＤＮＡ切断機能性分子から選択された１種または２種以上である、前記方法に関する。
さらに、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および膜透過機能性分子を含む、前記方法に関する。
また、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および光消失性分子を含む、前記方法に関する。
またさらに、本発明は、光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、光消失性分子がＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩまたはＡｚｏである、、前記方法に関する。
そして、本発明は、膜透過機能性分子が水溶性アミノ酸である、前記方法に関する。
【００３３】
本発明は、ＰＮＡ背骨構造に１種または２種以上の保護基または機能性分子基を有する、前記一般式（Ｉ）で表されるＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後、前記保護基を、順次または同時に機能性分子と置換することによって、機能性分子をポスト合成的に導入することにより、ほぼ定量的に機能性ＰＮＡオリゴマーを合成できることに成功したものである。
前記保護基は、各種条件によって特異的に機能性分子と置換されるものである。したがって、本発明の方法によれば、機能性分子を導入するためのあらゆる条件に適切な保護基を導入することができるため、極めて多岐にわたる機能性ＰＮＡオリゴマーを製造することができる。
【００３４】
また、本発明による化合物によれば、前記一般式（Ｉ）で表されるＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットを用いて、アルカリ性条件の非常に温和な条件下で安定的にオリゴマーの伸長が行うことができる。
さらに、本発明の保護基を有するＦｍｏｃ誘導体は、多くのＤＮＡ自動合成機に用い得るものである。したがって、本発明によれば、ＤＮＡ自動合成機を用いて、より広範な機能性ＰＮＡオリゴマーを、より迅速に製造することが可能になる。
【００３５】
上記特徴により、本発明の製造方法においては、導入する機能性分子として市販のsuccinimideエステルを使用する必要がなく、カルボン酸を有する化合物であれば問題なく利用でき且つ定量的に導入できる。そのため、本発明による製造方法はコストパフォーマンスに極めて優れている。
【００３６】
また、本発明によれば、同一または異なるあらゆる機能性分子を、任意の複数の位置に導入したＰＮＡオリゴマーを合成することが可能となる。すなわち、前記前駆体的Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットを用いてＰＮＡオリゴマーを合成した後、各保護基の脱離に好適な条件下において、機能性分子のポスト合成的導入を順次または同時に行うことによるものである。これはＰＮＡオリゴマーの細胞膜透過性機能を向上させるアンテナペディアを高速に設計する上で欠かせないものである。また、本発明の製造方法によれば、光機能性分子と光消失性分子とを有するＰＮＡオリゴマーであるモレキュラービーコンの合成も容易になる。この点においても、本発明による方法は極めて優れたものである。
【００３７】
このように製造される化合物の例として、機能性分子として、細胞膜透過性分子誘導体および他の機能性カルボン酸誘導体を有するものが挙げられる。このようなプローブは大きく蛍光標識領域・細胞膜透過性機能領域・分子認識領域の３つに分けることができ、それぞれをリンカー部位を介して結合させた形をとることができる。
蛍光標識化合物は市販のものも、既に本発明者らがＰＣＴ出願を行った新規蛍光標識化ＰＮＡモノマーユニットも用いることができる。
【００３８】
分子認識部位は市販のＰＮＡユニットを用いて合成する。この化合物の特徴は、既に国内特許出願を行っている新規ＰＮＡモノマーユニットを膜透過性機能領域部に用いていることである。該新規ＰＮＡモノマーユニットは機能性分子をポスト合成的に導入するために開発された前駆体ユニットであり、これを複数個並べて導入した後、前記したように同一機能性分子も導入することができる。
したがって、本発明によれば、光機能性分子に限定されることない、多種多様な機能性分子を、リンカーの長さの制約を受けることなくＰＮＡ中に容易かつ極めて効率的に導入することができるようになる。
【００３９】
このような機能性分子として、ＦＩＴＣ型、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ型、Ｆｌａｖｉｎ型、ＦＡＭ型、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ型、ＴＡＭＲＡ型、ＲＯＸ型、Ｐｙｒｅｎｅ型およびＣｏｕｍａｒｉｎｅ型等の光放出性分子、Ｄａｂｃｙｌ型、ＨＡＢＡ型、ＤＮＩ型およびＡｚｏ型等の光消失性分子、水溶性アミノ酸等の膜透過機能性分子、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌機能性分子、Ｂｉｏｔｉｎ型およびビオローゲン等の分子認識機能性分子、ソラレン等の光架橋機能性分子、ルシフェリン等の光増感機能性分子、ディスタマイシン、ヘキスト３３２５８およびエチジウムブロミド等のＤＮＡ結合性分子、ならびにブレオマイシン等のＤＮＡ切断機能性分子が挙げられる。
【００４０】
すなわち、本発明における「機能性」の語は、光放出性、光消失性、膜透過機能性、臓器選択性機能性、殺菌性機能性、分子認識性機能性、光架橋機能性、光増感機能性、ＤＮＡ結合性、およびＤＮＡ切断機能性から選択された１種または２種以上である等を含む、ある特定の修飾を行うことによって化合物に新たに付与される種々の機能の全てを意味するものである。
さらに、本発明における「機能性ＰＮＡ」の語は、ＰＮＡモノマー同士が２−（Ｎ−アミノエチル）グリシン骨格によって直接結合したもののみならず、その間にリンカーとしての炭化水素鎖等を含むものも意味するものである。
また、本発明における「保護基」の語は、酸性、アルカリ性および中性のいずれかの条件において特定の基を保護する基全般を意味するものである。特に前記式（Ｉ）の化合物の基Ｒにおいては、保護基は、側鎖アミノ基を保護する保護基を意味し、例えば炭素数１〜２０までの鎖状または環状の基であり、特にｔＢｏｃ、Ｃｂｚ、Ｎｖｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、ＴｒｏｃおよびＴｒｔの各基である。
【００４１】
【発明の実施の形態】
ここで、本発明による方法の特徴を更に詳細に説明する。
【００４２】
本発明による機能性ＰＮＡオリゴマーの合成は、典型的には、
（１）Ｆｍｏｃモノマーユニットの合成、
（２）ＦｍｏｃモノマーユニットのＰＮＡオリゴマーへの導入、および
（３）保護基の脱離および機能性分子の導入
によって行われる。
【００４３】
まず、必要に応じて、下図
【化３６】
【００４４】
【化３７】
【００４５】
【化３８】
に示すように、工程ａ）〜ｃ）のいずれか等によって式（Ｉ）のＦｍｏｃモノマーユニットが合成される。
【００４６】
ａ）の工程は、式（ＩＩ）で表される化合物（ω−アミノ酸−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ）から、機能性分子のＯＳｕやＯＰｆｐの活性エステル誘導体や、ＦＩＴＣのようなイソチオシアネート誘導体を用いて、ＰＮＡモノマーユニットを合成する工程である。該工程においては、１ステップで効率よくＰＮＡモノマーユニット
例えば、機能性分子のペンタフルオロフェニルエステルかＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルといった活性エステルと式（ＩＩ）の化合物をトリエチルアミンのような３級アミン存在下室温で縮合することにより、目的とする式（Ｉ）の化合物を得ることができる。
一般に、機能性分子は高価であるが、このａ）工程を用いる方法においては、少量の機能性分子を用いることによって定量的に目的物を得ることができるため、極めてコストパフォーマンスが優れている。
【００４７】
なお、前記式（ＩＩ）の化合物は、下図の経路によって好適に合成される。
【化３９】
すなわち、機能性分子の遊離カルボン酸誘導体（ＩＶａ）と鍵化合物４をまず縮合した後に、強酸によるＢｏｃ基とｔＢｕ基の同時脱保護を行い、機能性ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ（式（Ｉ）の化合物）を合成するための前駆体である式（ＩＩ）の化合物を得るのが特徴的である。化合物（ＩＩ）は機能性分子の活性エステル体を用いることにより、１工程で目的とする式（Ｉ）の化合物を高速に合成できる。
より詳細はに、Ｂｏｃ−ω−ＡＡ−ＯＨ（ＩＶａ）とＦｍｏｃＰＮＡ−ＯｔＢｕ（４）のＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶液に縮合剤ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＨＢＴＵあるいはＨＡＴＵを加えて、室温で１２時間反応させる。反応液を濾過し、ろ液を減圧濃縮した後、残渣をカラムクロマトグラフィーに付し化合物ＩＶｂを得る。
化合物ＩＶｂは、ＴＦＡの塩化メチレン溶液または４Ｎ ＨＣｌのｄｉｏｘａｎｅ溶液による酸加水分解に付し、Ｂｏｃ基とｔＢｕ基の脱保護を同時に行い、式（ＩＩ）の化合物を得る。
【００４８】
ｂ）の工程は、前記Ｗｏｓｋｉらの方法を改良したもので、リンカーの長さを考慮したものである。すなわち、機能性分子が本来有する機能性を発揮するためには、該機能性分子が、その活性部位において、最適な立体的位置に存在しなければならないが、前記前記Ｗｏｓｋｉらの方法においては、リンカーが存在しないため、機能性分子の機能性を最大限に発揮せしめることはできない。一方、工程ｂ）を用いた本発明の方法においては、リンカーの長さを自由に変更できるため、機能性分子の性質に対応したリンカーを選択し、機能性分子の機能を発揮せしめることができる利点がある。
工程ｂ）によって、式（Ｉ）の化合物を得るには、例えば、式（ＩＩＩ）の化合物のＴＦＡの塩化メチレン溶液または４Ｎ ＨＣｌのｄｉｏｘａｎｅ溶液による酸加水分解を行い、ｔＢｕ基の脱保護を行う。すなわち、工程ｂ）を用いる方法においては、遊離カルボン酸誘導体を、活性エステル化することなく用いることができるため、コストパフォーマンスに優れている。なお、終了反応過程は酸加水分解であるため、酸性条件で安定な機能性分子への適用が好適である。
【００４９】
なお、前記式（ＩＩＩ）の化合物は、下図の経路によって好適に合成される。
【化４０】
すなわち、機能性分子を付加したω−アミノ酸の遊離カルボン酸誘導体Ｖａを鍵化合物４と縮合する。その後、強酸によりｔＢｕ基を選択的に脱保護する反応を行えば、式（Ｉ）の化合物が得られる。したがって、非常に簡単な反応工程であり、強酸に安定な機能性分子を好適に導入することができる利点がある。
例えば、リンカーを結合した機能性分子Ｒ−ω−ＡＡ−ＯＨ（Ｖａ）とＦｍｏｃＰＮＡ−ＯｔＢｕ（４）のＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶液に縮合剤ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＨＢＴＵあるいはＨＡＴＵを加えて、室温で１２時間反応させる。反応液を濾過し、ろ液を減圧濃縮した後、残渣をカラムクロマトグラフィーに付し目的とする式（ＩＩＩ）の化合物を得る。
【００５０】
ｃ）の工程は、前記ａ）またはｂ）の工程のように前記鍵化合物４を利用した場合、反応工程に必ず強酸によるｔＢｕ基の脱保護過程が入るので、これを避けるために予め強酸による鍵化合物４のｔＢｕ基の脱保護を行った式（Ｖ）の化合物を利用する方法である。式（Ｖ）の化合物を利用するためには機能性分子のカルボン酸を活性エステル化しておく必要がある。
したがって、ペンタフルオロフェニル活性エステル誘導体Ｒ−ω−ＡＡ−ＯＰｆｐ（式（ＩＶ）の化合物）を、式（Ｖ）の化合物の炭酸水素ナトリウム水溶液とアセトンの混合液に加えて、室温で１２時間縮合反応させる。反応液を塩酸酸性（ｐＨ ３）にした後、クエン酸水溶液と酢酸エチルを加え、分液操作を行う。有機相を減圧濃縮した後、残渣をカラムクロマトグラフィーに付し目的とする式（Ｉ）の化合物を得る。
このｃ）工程を用いる方法は、式（Ｖ）の化合物中のＦｍｏｃ基が、反応の進行に必要な３級アミンによって脱保護される場合があること、および機能性分子にリンカーを導入する工程が必要である点に特徴を有する。したがって、該方法は、実験室レベルで、中間体の生成を確認しながら目的物の生成を行う場合に好適に用いられる。
【００５１】
なお、前記式（ＩＶ）の化合物は、下図に示すように、
【化４１】
Ｒ−ω−ＡＡ−ＯＨ（ＶＩａ）を、ＰｆｐＯＨと縮合することによって好適に合成される。
【００５２】
次に、ＦｍｏｃモノマーユニットのＰＮＡオリゴマーへの導入が、ｔＢｏｃ固相法等によって行われる。この際に用いられる固相担体に特に制限はないが、例えばＭＢＨＡが好適に用いられる。
本発明において典型的に用いられる式（Ｉ）で表されるＦｍｏｃモノマーユニットおよびその特徴は、以下に示すとおりである。
（１）ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４２】
機能性ＰＮＡモノマーユニット用の前駆体として使用される。なお、本明細書中においては、「ＡＡ」の表記はアミノ酸を表す。
【００５３】
（２）Ａｚｏ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
化合物）
【化４３】
機能性分子のＯＳｕ活性エステル体と反応させることにより、定量的に機能性ＰＮＡモノマーユニットを合成できることを示した例である。ただし、機能性分子はＡｚｏに限定されない。
【００５４】
（３）Ｔｒｔ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４４】
前駆体ＰＮＡモノマーユニットとして固相合成時に使用される。５０％酢酸水溶液でＴｒｔ基を脱保護できるので、レジンにオリゴマーが結合した状態でアミノ基を遊離することができる。これに機能性分子を逐次導入できることが特徴である。
【００５５】
（４）ｔＢｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４５】
前駆体ＰＮＡモノマーユニットとして固相合成時に使用される。オリゴマー伸長反応中において安定であるが、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を用いたレジンからのオリゴマー切り出し時に、アミノ基が遊離されるので、Ｔｒｔ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨやＣｂｚ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨと区別して使用することができる。
【００５６】
（５）Ｎｖｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４６】
前駆体ＰＮＡモノマーユニットとして固相合成時に使用される。光照射でＮｖｏｃ基を脱保護できるので、レジンにオリゴマーが結合した状態でアミノ基を遊離することができる。ＴＦＡに対して完全な安定性がないので、レジンからオリゴマーを切り出す前に、光照射してＮｖｏｃ基を脱保護するべきである。伸長反応中で好ましく用いられる。
【００５７】
（６）Ｆｍｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４７】
前駆体ＰＮＡモノマーユニットとして固相合成時に使用される。ピペリジン処理によりＦｍｏｃ基を選択的に脱保護できるので、レジンにオリゴマーが結合した状態でアミノ基を遊離することができる。デンドリマー構造を作成する際に好適に用いられる。
【００５８】
（７）Ａｌｌｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４８】
前駆体ＰＮＡモノマーユニットとして固相合成時に使用される。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４でＡｌｌｏｃ基を選択的に脱保護できるので、レジンにオリゴマーが結合した状態でアミノ基を遊離することができる。
【００５９】
（８）Ｃｂｚ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４９】
前駆体ＰＮＡモノマーユニットとして固相合成時に用いられる。オリゴマー伸長反応中やＴＦＡを用いたレジンからのオリゴマー切り出し時に安定であるが、接触還元によりアミノ基が遊離されるので、Ｔｒｔ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨやｔＢｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨと区別して使用することができる。
【００６０】
（９）Ｔｒｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化５０】
前駆体ＰＮＡモノマーユニットとして固相合成時に用いられる。１０％亜鉛酢酸溶液で選択的にＴｒｏｃ基を脱保護できるので、レジンにオリゴマーが結合した状態でアミノ基を遊離することができる。また、ＴＦＡや接触還元に対し耐性を有するので、レジンから切り出した後も、安定に存在することが可能であり、Ｃｂｚ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨと使い分けることができる。
【００６１】
最後に、保護基の機能性分子による置換が行われる。該置換は、各Ｆｍｏｃモノマーユニットの前記特徴を考慮し、順次または同時に行われる。
なお、本発明における式（Ｉ）の化合物におけるリンカーの長さは、ｎ＝１〜１１の範囲であれば特に制限されないが、ｎ＝１〜５のものは、式（Ｉ）の化合物の合成の際およびＰＮＡオリゴマーの合成の際におけるリンカー部の安定性の面で有利であり好適である。
【００６２】
上記のように、本発明による方法においては、従来の機能性モノマー合成に用いる活性エステル化の合成を要する方法とは異なり、機能性分子をそのまま利用できる。また、保護基ごとに機能性分子との置換条件が異なるため、保護基を有するＰＮＡオリゴマーを合成した後に種々の機能性分子が所望の箇所に導入可能である。したがって、本発明の方法によれば、従来困難であった高速かつ多様な並列ＰＮＡプローブの合成が可能である。
【００６３】
本発明による式（Ｉ）の化合物を重合させることよって、例えば、下記のように、機能性ＰＮＡオリゴマーを合成することができる。
【化５１】
（式中、Ａ〜Ｇは機能性カルボン酸誘導体を表す）。
すなわち、本発明による式（Ｉ）の化合物を用いれば、細かい条件設定を行うことによって、機能性分子の性質に即したあらゆる機能性ＰＮＡオリゴマーを合成することができる。特に、Ｆｍｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨを用いることによって、枝分かれ構造を有するデンドリマーを効率的に合成できる点において、式（Ｉ）の化合物の使用は有利である。
【００６４】
より具体的な例は、下記のとおりである。第一の例は、前記Ｔｒｔ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨとｔＢｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨを用い、オリゴマーのレジンからの切り出し前及び切り出し後に機能性分子をそれぞれ１個ずつ導入する例である。また、第二の例は、さらにＴｒｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨも用いることにより、レジンからの切り出し後にさらに機能性分子を導入する例である。
【００６５】
【化５２】
【００６６】
【化５３】
【００６７】
このように、本発明による式（Ｉ）の化合物を用いれば、複数の機能性分子が導入されたものとして、例えば、機能性分子が細胞膜透過性機能分子誘導体であるものが好適に合成される。このような化合物は、典型的には、機能性分子として、細胞膜透過性機能分子誘導体等および光機能性分子等の機能性カルボン酸誘導体等を有するもの、すなわち、末端部を含む複数部位に機能性分子が導入され、それらによって複数の機能が付与された化合物である。
【００６８】
また、リンカー部位を導入することによって、個々の機能性部位および塩基配列認識領域の干渉を防ぎ、分子の機能をより確実なものにすることができる。本明細書におけるＰＮＡ、ＰＮＡモノマーおよびＰＮＡオリゴマーの語には、リンカー部位をその末端および／または内部に含むものも包含される。
これらの部位または領域間の相互干渉を防ぐための部位としては、前記リンカー部位のみならず、リンカーの長さを、所望に応じて選択することによっても可能である。
リンカー部位を構成する基としては、直鎖状または分枝状の炭化水素およびそれらのエーテル体等が挙げられるが、直鎖状炭化水素基は導入の容易さおよびコストなどの面から好適であり、特に炭素数１〜６の直鎖状炭化水素基が好適である。また、エーテル体は、その汎用性において好適である。
【００６９】
前記複数の機能性分子が導入された化合物は、例えばKoch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.を利用して好適に合成される。塩基配列認識部位は、市販の各種ＰＮＡモノマーを用いて固相合成によりオリゴマー化することができる。リンカー部位には、市販のＢｏｃ−７−アミノヘプタン酸、Ｂｏｃ−６−アミノカプロン酸等を用いることができる。
【００７０】
１の機能性分子として光機能性分子を導入すれば、蛍光標識することが可能であり、かつ他の機能も有する化合物を合成することができる。このような蛍光標識部位として、市販のＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＰｙｒｅｎｅ等の市販の活性エステル型蛍光標識化合物を用いて、多様な蛍光発光波長を選択することが可能であるが、導入される蛍光標識化合物はこれらに限定されるものではない。また、本発明の方法によれば、Ｄａｂｃｙｌなどの光消失性分子の導入も容易に行うことができる。
【００７１】
本発明の化合物に導入し得る他の機能性の例としては、膜透過性機能が挙げられる。膜透過性を向上させることができる機能性分子としてアルギニンが挙げられるが、リシンおよびセリン等の他の水溶性アミノ酸も好適に用いることができる。
【００７２】
これらのプローブの特徴は、「全てＰＮＡ型になっているので、完全な酵素耐性を有すること」である。すなわち、これまでの膜透過性機能を有するプローブは、ＰＮＡと膜透過性機能を有するペプチド鎖あるいはリン脂質を共有結合させたものが主流であったが、これらの既知のプローブは優れた膜透過性機能を有するものの、一旦細胞内に入ると酵素群によりペプチド鎖あるいはリン脂質が分解されることが予想される。したがって、これらは、ターゲットを認識していない分解を受けたプローブを洗浄過程で完全に取り除くことができないという欠点を有する。
【００７３】
これに対して、今回合成可能になったプローブは、細胞内においても酵素分解を受けないため、ターゲットを認識していないプローブは洗浄過程で完全に取り除かれるため、正確な遺伝子発現量の定量を可能とするものである。
なお、これらの機能性を有する化合物以外にも、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌機能性分子およびビオローゲン等の分子認識機能性分子等も、本発明によれば制限なく導入することが可能であり、そのような化合物を、大量に低コストで実用に供することが可能になる。
【００７４】
さらに、本発明による製造方法を用いたプローブには、光機能性分子および光消失性分子とを併せて有するモレキュラービーコンも包含される。モレキュラービーコンとは塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出するプローブであって、遺伝子工学において重要な化合物である。
従来のモレキュラービーコンは、耐酵素活性が低いため保存には不適当であったが、本発明によるプローブＰＮＡバックボーンを用いているためより安定性に優れている。
前記光放出性分子としては、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅが挙げられ、光消失性分子としてはＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩおよびＡｚｏを挙げることができる。
【００７５】
【実施例】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限られるものではない。
（実施例１）
C5-FmocPNA-OHの合成
【化５４】
Boc-C5-OH (1.15 g, 4.5 mmol）とFmocPNA-OtBu（2.0 g, 5.0 mmol）のジメチルホルムアミド溶液（DMF; 10 mL）にDCC（2.06 g, 10.0 mmol）を加えて0 ℃で２時間、さらに室温で15時間撹拌した。反応液をろ過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（0-4% MeOH/CH2Cl2）に付し、Boc-C5-FmocPNA-OtBuを白色粉末として1.16 g (42%) 得た。1H NMR (CDCl3) δ7.75 (brd, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.59 (brd, J = 6.4 Hz, 2 H), 7.38 (brt, 2 H), 7.29 (brt, 2 H), 4.36 (ma) and 4.33 (mi) (brd, J = 6.8 Hz, 2 H), 4.19 (t, J = 6.8 Hz, 1 H), 3.94 (mi) and 3.90 (ma) (s, 2 H), 3.53 (mi) and 3.48 (ma) (brs, 2 H), 3.35 (brs, 2 H), 3.08 (ma) and 3.04 (mi) (brs, 4 H), 2.33 (ma) and 2.18 (mi) (brt, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.62 (m, 2 H), 1.47 (brs, 9 H), 1.42 (ma) and 1.41 (mi) (s, 9 H), 1.31 (m, 2 H)。
Boc-C5-FmocPNA-OtBu (250.0 mg, 0.41 mmol) を4 N HCl in dioxane (2 mL) に溶解し、室温で15時間攪拌した。これを減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（10-30% MeOH/CH2Cl2）に付し、C5-FmocPNA-OH（48.0mg, 26%）を淡桃色粉末として得た。1H NMR (CDCl3)δ 7.71 (brd, J = 6.8 Hz, 2 H), 7.54 (brd, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.30 (brt, 2 H), 7.22 (brt, J = 7.2 Hz, 2 H), 4.26 (ma) and 4.23 (mi) (brt, J = 6.8 Hz, 2 H), 4.10 (brt, 1 H), 3.99 (ma) and 3.94 (mi) (s, 2 H), 3.40 (q, J = 6.1 Hz, 2 H), 2.82 (m, 4 H), 2.79 (mi) and 2.75 (ma) (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 2.34 (ma) and 2.09 (mi) (brt, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.6 - 1.3 (m, 4 H)。
【００７６】
（実施例２）tBoc-GABA-FmocPNA-OHの合成
【化５５】
アセトン(4.8 mL)と水(0.7 mL)の混合溶液にNaHCO3(74.1 mg，0.88 mmol)を加え、tBoc-GABA-OPfp (200 mg，0.54 mmol)とFmocPNA-OH (74.1 mg，0.29 mmol)を溶解し、室温で15時間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液（15 mL）を加え、酢酸エチル（20 mL）で抽出し、有機層を飽和食塩水（15 mL）で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(2-7% MeOH/CH2Cl2)で精製し、白色粉末としてtBoc-GABA-FmocPNA-OH (71.0 mg，46%)を得た。1H-NMR(CDCl3)δ 7.74 (brd, J = 5.3 Hz, 2 H), 7.57 (brd, 2 H), 7.38 (brt, 2 H), 7.29 (brt, J = 5.2 Hz, 2 H), 4.36 (ma) and 4.32 (mi) (brd, J = 6.2 Hz, 2 H), 4.23 (mi) and 4.19 (ma) (m, 1 H), 4.07 (mi) and 4.03 (ma) (s, 2 H), 3.55 (mi) and 3.50 (ma) (brs, 2 H), 3.36 (ma) and 3.26 (mi) (brs, 2 H), 3.08 (m, 2 H), 2.41 (ma) and 2.27 (mi) (brt, 2 H), 1.79 (m, 2 H), 1.41 (m, 9 H); HRMS (FAB+) calcd for C28H36N3O7 [(M+H)+] 526.2553, observed 526.2546。
【００７７】
（実施例３）tBoc-C5-FmocPNA-OHの合成
【化５６】
アセトン(14.3 mL)と水(2.0 mL)の混合溶液にNaHCO3(221.8 mg，2.64 mmol)を加え、tBoc-C5-OPfp (454.6 mg，1.14 mmol)とFmocPNA-OH (300.0 mg，0.88 mmol)を溶解し、室温で3日間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液（45 mL）を加え、酢酸エチル（60 mL）で抽出し、有機層を飽和食塩水（45 mL）で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(2-7% MeOH/CH2Cl2)で精製し、白色のアモルファスパウダーとしてtBoc-C5-FmocPNA-OH (242.0 mg，50%)を得た。1H-NMR(CDCl3)δ 7.75 (m, 2 H), 7.57 (m, 2 H), 7.37 (m, 2 H), 7.28 (m, 2 H), 4.34 (ma) and 4.31 (mi) (brd, J = 6.8 Hz, 2 H), 4.22 (mi) and 4.18 (ma) (m, 1 H), 4.06 (mi) and 4.03 (ma) (s, 2 H), 3.56 (mi) and 3.50 (ma) (brs, 2 H), 3.36 (m, 2 H), 3.01 (m, 4 H), 235 (ma) and 2.22 (mi) (brt, 2 H), 1.61 (ma) and 1.60 (mi) (brq, 2 H), 1.41 (m, 9 H), 1.27 (ma) and 1.19 (mi) (brq, 2 H); HRMS (FAB+) calcd for C30H40N3O7 [(M+H)+] 554.2866, observed 554.2867。
【００７８】
（実施例４）Nvoc-GABA-FmocPNA-OHの合成
【化５７】
Nvoc-GABA-OH (150.0 mg, 0.44 mmol) とPfpOH (96.8 mg, 0.53 mmol)のDMF溶液(5 mL)にDCC (108.5 mg, 0.53 mmol)を氷冷下加え、この反応液を0℃で30分次いで室温で18時間撹拌した。反応液を濾過し、濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（2% Acetone/CH2Cl2）により精製し、Nvoc-GABA-OPfp (200.0 mg, 90%)を黄色粉末として得た。1H NMR (CDCl3)δ 7.70 (s, 1 H), 7.00 (s, 1 H), 5.51 (s, 2 H), 5.04 (m, 1 H), 3.97 and 3.95 (each s, 3 H), 3.36 (q, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.75 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 2.02 (t, J = 6.9 Hz, 9 H); HRMS (FAB+) calcd for C20H18N2O8 [(M+H)+] 509.0983, observed 509.1002。
アセトン(4.3 mL)と水(0.6 mL)の混合溶液にNaHCO3(62.0 mg，0.74 mmol)を加え、Nvoc-GABA-OPfp (150.0 mg，0.30 mmol)とFmocPNA-OH (83.7 mg，0.25 mmol)を溶解し、室温で3日間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液（45 mL）を加え、酢酸エチル（60 mL）で抽出し、有機層を飽和食塩水（45 mL）で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(2-15% MeOH/CH2Cl2)で精製し、黄色粉末としてNvoc-GABA-FmocPNA-OH (242.0 mg，50%)を得た。1H NMR (CDCl3)δ 8.05 and 7.29 (each s, 1 H), 7.69, 7.54, 7.35, and 7.26 (each brs, 2 H), 5.45 (mi) and 5.41 (ma) (s, 2 H), 4.5 - 4.0 (m, 3 H), 4.0 - 3.7 (m, 8 H), 3.55 (brs, 2 H), 3.37 (ma) and 3.24 (mi) (brs, 2 H), 3.09 (ma) and 3.03 (mi) (brs, 2 H), 2.47 (ma) and 2.33 (mi) (brs, 2 H), 1.86 (ma) and 1.74 (mi) (brs, 2 H); HRMS (FAB+) calcd for C33H37N4O11 [(M+H)+] 665.2459, observed 665.2469。
【００７９】
（実施例５）Nvoc-C5-FmocPNA-OHの合成
【化５８】
C5-FmocPNA-OH（20 mg, 0.04 mmol）とNaHCO3（7.4 mg, 0.09 mmol）の水溶液（1.5 mL）にNvoc-Cl（24.3 mg, 0.09 mmol）のdioxane溶液（1.5 mL）を滴下し、室温で1日間撹拌した。反応液を塩酸酸性（pH 3.0）にし、水（10 mL）と酢酸エチル（20 mL）を加え分液抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水して、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（2.5-20% MeOH/CH2Cl2）に付し、黄色粉末としてNvoc-C5-FmocPNA-OH（7.2 mg, 24%）を得た。1H NMR (CDCl3)δ 7.69, 7.52, 7.33, and 7.25 (each brs, 2 H), 7.63 and 7.26 (each s, 1 H), 6.92 (brs, 1 H), 5.43 (mi) and 5.36 (ma) (s, 2 H), 4.29 (ma) and 4.17 (mi) (brs, 2 H), 4.12 (mi) and 4.00 (ma) (m, 1 H), 4.04 (mi) and 3.90 (ma) (brs, 6 H), 3.87 (brs, 2 H), 3.55 (mi) and 3.48 (ma) (brs, 2 H), 3.35 (ma) and 3.24 (mi) (brs, 2 H), 3.09 (ma) and 3.02 (mi) (brs, 4 H), 2.36 (ma) and 2.23 (mi) (brs, 2 H), 1.60 (brs, 2 H), 1.47 (mi) and 1.41 (ma) (m, 2 H), 1.31 (ma) and 1.26 (mi) (m, 2 H)。
【００８０】
（実施例６）Fmoc-GABA-FmocPNA-OHの合成
【化５９】
アセトン(4.8 mL)と水(0.7 mL)の混合溶液にNaHCO3(74.1 mg，0.88 mmol)を加え、Fmoc-GABA-OPfp (173.5 mg，0.35 mmol)とFmocPNA-OH (100.0 mg，0.29 mmol)を溶解し、室温で3日間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液（45 mL）を加え、酢酸エチル（60 mL）で抽出し、有機層を飽和食塩水（45 mL）で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(2-15% MeOH/CH2Cl2)で精製し、黄色粉末としてNvoc-GABA-FmocPNA-OH (242.0 mg，50%)を得た。1H NMR (CDCl3)δ 7.67, 7.49, 7.31, and 7.21 (each m, 4 H), 4.28 (m, 4 H), 4.15 (mi) and 4.10 (ma) (m, 2 H), 3.95 (ma) and 3.75 (mi) (brs, 2 H), 3.46 (mi) and 3.39 (ma) (brs, 2 H), 3.30 (mi) and 3.25 (ma) (brs, 2 H), 3.13 (mi) and 3.08 (ma) (brs, 2 H), 2.35 (ma) and 2.21 (mi) (brs, 2 H), 1.87 (mi) and 1.75 (ma) (brs, 2 H)。
【００８１】
（実施例７）Alloc-ω-AA-FmocPNA-OHの合成
【化６０】
Alloc-GABA-OH (243.3 mg, 1.3 mmol) とPfpOH (239.3 mg, 1.3 mmol)のアセトン溶液(2.5 mL)にDCC (206.3 mg, 1.0 mmol)を氷冷下加え、この反応液を0℃で30分次いで室温で15時間撹拌した。反応液を濾過し、濾液を直接水(1.0 mL)と混合し、NaHCO3(112.5 mg，1.3 mmol)を加え、FmocPNA-OH (252.2 mg，0.67 mmol)を溶解し、室温で3日間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液（40 mL）を加え、酢酸エチル（50 mL）で抽出し、有機層を飽和食塩水（40 mLｘ3）で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(1-15% MeOH/CH2Cl2)で精製し、淡褐色粉末としてAlloc-GABA-FmocPNA-OH (200.3 mg，59%)を得た。1H NMR (CDCl3)δ 7.69 (brs, 2 H), 7.52 (brs, 2 H), 7.33 (brt, 2 H), 7.24 (brt, 2 H), 5.78 (m, 1 H), 5.1 (m, 2 H), 4.6-4.4 (m, 3 H), 4.29 (ma) and 4.13 (mi) (s, 2 H), 3.94 (m, 2 H), 3.55-3.35 (m, 2 H), 3.26 (m, 2 H), 3.07 (m, 2 H), 2.86 (m, 2 H), 2.35 (ma) and 2.23 (mi) (brs, 2 H), 1.90 (mi) and 1.74 (ma) (brs, 2 H)。
【００８２】
（実施例８）Cbz-GABA-FmocPNA-OHの合成
【化６１】
アセトン(4.8 mL)と水(0.7 mL)の混合溶液にNaHCO3(74.1 mg，0.88 mmol)を加え、Cbz-GABA-OPfp (177.9 mg，0.44 mmol)とFmocPNA-OH (100.0 mg，0.29 mmol)を溶解し、室温で3日間攪拌した。氷冷した1 N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液（45 mL）を加え、酢酸エチル（60 mL）で抽出し、有機層を飽和食塩水（45 mL）で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(2-15% MeOH/CH2Cl2)で精製し、白色粉末としてCbz-GABA-FmocPNA-OH (81.1 mg，50%)を得た。1H NMR (CDCl3)δ 7.73 (brs, 2 H), 7.55 (brs, 2 H), 7.35 (brt, 2 H), 7.28 (brt, 2 H), 7.26 (s, 5 H), 5.03 (mi) and 5.00 (ma) (s, 2 H), 4.4 - 4.1 (m, 3 H), 3.96 (m, 2 H), 3.41 (ma) and 3.31 (mi) (brs, 2 H), 3.27 (ma) and 3.16 (mi) (brs, 2 H), 3.11 (ma) and 3.05 (mi) (brs, 2 H), 2.36 (ma) and 2.23 (mi) (brs, 2 H), 1.86 (mi) and 1.78 (ma) (brs, 9 H)。
【００８３】
（実施例９）Troc-GABA-FmocPNA-OHの合成
【化６２】
Troc-GABA-OH (150.0 mg, 0.44 mmol) とPfpOH (96.8 mg, 0.53 mmol)のDMF溶液(5 mL)にDCC (108.5 mg, 0.53 mmol)を氷冷下加え、この反応液を0℃で30分次いで室温で18時間撹拌した。反応液を濾過し、濾液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマト法（2% Acetone/CH2Cl2）により精製し、Troc-GABA-OPfp (200.0 mg, 90%)を白色粉末として得た。1H NMR (CDCl3)δ 5.05 (brs, 1 H), 4.67 (s, 2 H), 3.32 (q, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.69 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 1.97 (m, 2 H)。
アセトン(4.0 mL)と水(0.5 mL)の混合溶液にNaHCO3(62.0 mg，0.74 mmol)を加え、Troc-GABA-OPfp (133.4 mg，0.30 mmol)とFmocPNA-OH (56.5 mg，0.25 mmol)を溶解し、室温で3日間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液（45 mL）を加え、酢酸エチル（60 mL）で抽出し、有機層を飽和食塩水（45 mL）で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(2-15% MeOH/CH2Cl2)で精製し、黄色粉末としてTroc-GABA-FmocPNA-OH (46.1 mg，31%)を得た。1H NMR (CDCl3)δ 7.70, 7.52, 7.34, and 7.24 (each m, 2 H), 4.64 (mi) and 4.61 (ma) (brs, 2 H), 4.31 (m, 2 H), 4.13 (m, 1 H), 4.2-3.9 (m, 2 H), 3.45 (ma) and 3.42 (mi) (brs, 2 H), 3.27 (ma) and 3.16 (mi) (brs, 2 H), 3.11 (mi) and 3.06 (ma) (brs, 2 H), 2.38 (ma) and 2.25 (mi) (brs, 2 H), 1.77 (mi) and 1.68 (ma) (brs, 2 H)。
【００８４】
【発明の効果】
本発明によれば、酸性、アルカリ性または中性下において、液性に不安定な化合物があっても、直接またはポスト合成的に、複数の機能性分子を任意の位置に、種々の長さを有するリンカーを介して導入するための、機能性ＰＮＡモノマーユニットおよび機能性ＰＮＡオリゴマーの新規合成方法ならびに新規機能性ＰＮＡモノマーユニットおよび機能性ＰＮＡオリゴマーが提供される。したがって、本発明によれば、種々のＰＮＡの構築が可能になるため、化学工業および遺伝子治療等に寄与するところ極めて大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡとＰＮＡの構造および荷電の状況の違いを表す図である。
【図２】２種類のＰＮＡモノマーユニットの構造を表す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規機能性ペプチド核酸モノマーおよびその製造方法、並びに該モノマーを用いて機能性ペプチド核酸オリゴマーを製造するための方法に関する。より詳細には、前駆体的PNAモノマーユニットおよびその製造方法、並びに該モノマーユニットをPNAオリゴマーに導入した後に１種または２種以上の所望の機能性分子をポスト合成的に導入することを特徴とする、前記製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
核酸は生物の遺伝情報を司るＤＮＡおよびＲＮＡである。これに対して、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、核酸の糖リン酸骨格をＮ−(２−アミノエチル)グリシン骨格に変換した修飾核酸である（図１）。ＤＮＡ/ＲＮＡの糖リン酸骨格は中性条件で負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、ＰＮＡの背骨構造はもともと電荷を持たないので静電的な反発がない。そのためＰＮＡは従来の核酸と比較して、高い二重鎖形成能をもち、高い塩基配列認識能を持つ。さらにＰＮＡは生体内ヌクレアーゼ・プロテアーゼに対し非常に安定で分解されないので、アンチセンス分子として遺伝子治療に応用することが検討されている。
【０００３】
従来のＤＮＡを媒体にしていた技術をＰＮＡ化することにより、これまで克服できなかったＤＮＡの欠点を補うことが可能となった。例えば、遺伝情報の体系的な解析を高速に且つ大量に行うための「ＤＮＡマイクロアレイ技術」および塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出できるプローブとして最近開発された「モレキュラービーコン」に応用することが可能である。これらはいずれも酵素耐性に乏しいＤＮＡを媒体とするため、これらの技術を用いるに際しては厳密なサンプリングが要求される。この要求を満たすことが、前記の技術を高度化する上での鍵となっている。
【０００４】
一方ＰＮＡは酵素に対し完全な耐性を持つので、ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコンにおいてＰＮＡをＤＮＡに代用することによって、前記技術の欠点が克服され、さらに長所が引き出されるものと期待されている。
ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコン以外にもＰＮＡ化することにより発展が期待される分野は数多いが、それらにおいてはＰＮＡの効率的な機能化、すなわちＰＮＡモノマーへの機能性分子の効率的な導入による新規なＰＮＡモノマーの設計が必要である。
【０００５】
ＰＮＡオリゴマーの合成方法には通常の固相ペプチド合成法を用いるので、ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡの背骨構造によって分類すると、Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットとｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの２種類が含まれる（図２）。
Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの合成方法は既に確立されており、しかもそのオリゴマーの合成は一般的なＤＮＡ自動合成機によって可能であるため、下記のルート
【化１４】
【０００６】
当初ＰＮＡには下記のようなｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニット
【化１５】
【化１６】
しかし、グアニン・チミン・シトシン・アデニン４種類の核酸塩基以外の機能性分子を導入する際、例えば光放出性分子を導入する際には、導入する機能性分子がアルカリ条件に不安定な場合が多いので、アルカリ条件を使用しないｔＢｏｃ型ＰＮＡ背骨構造の有用性は高い。「ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン及びアミノ酸誘導体の製造方法」に関しては、本発明者らが特願２０００−２６８６３８として既に特許出願中である。
【０００７】
これ以外にも、光放出性オリゴＰＮＡのモノマーユニットの合成例は過去に５例が知られている。これら全てが上記ルートを用いているが、その収率については記載がないか、または極めて低いものでしかない（例えば特許文献１〜２および非特許文献１〜３参照）。また、用いられる化合物の構造がアルカリ性条件に比較的安定であることが特徴的であるため、アルカリ性条件に不安定な発色団が付くと、前記従来法と類似の方法、すなわち下記ルートＡ
【化１７】
【０００８】
したがって、一般に光放出性分子等の機能性分子は高価な場合が多いため、より合理的な機能性ＰＮＡの合成方法、すなわち、▲１▼機能性ＰＮＡモノマーユニットの設計における、機能性分子のＰＮＡ背骨構造への効率的な導入、▲２▼コストパフォーマンスを考えた合成ルート、および▲３▼遺伝子診断薬としての応用へ適応させるための、これらの機能性分子を超高速に導入する方法が探求された。
【０００９】
上記課題に鑑み、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーの新規製造方法として、下記ルートＢ
【化１９】
【００１０】
また、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーを合成する別法として、ＰＮＡ背骨構造に上記ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体６の代わりにベンジルオキシカルボニル−ω−アミノ酸誘導体を用いる方法（ルートＣ）を見出した。これらの方法については、既に特許出願がなされている。
【００１１】
したがって、最終的に機能性ＰＮＡを合成するための方法として、上記ルートＢおよびルートＣのいずれかを用いる方法によって機能性ＰＮＡモノマーを合成した後に、それらを重合する方法が工業的にも確立されつつある。すなわち、現在までの機能性ＰＮＡの合成法によってＰＮＡプローブとして用いられる機能性ＰＮＡを工業的に大量合成することは可能になりつつある。
【００１２】
一方、コストパフォーマンスの向上および機能性分子を超高速に導入することを目的とした、機能性ＰＮＡの合成方法の改良もなされている。例えば、前記機能性ＰＮＡモノマーユニットを用いる方法とは異なるアプローチとして、下記の前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを利用することによって、ポスト合成的に機能性分子をＰＮＡオリゴマーに導入する方法が報告されている（非特許文献４）。
【化２０】
当該方法は、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後、さらに機能性分子を導入することによって機能性ＰＮＡを合成するものである。
しかし、当該方法においては、導入できる機能性分子の種類が限定される等の欠点がある。
【００１４】
例えば、下図に示すように、市販されている光放出性分子のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステルを導入することはできず、導入するためにはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ等のリンカーをまず導入する必要があるが、結果として上記化合物は使用しにくいものになっている。
【化２１】
また、細胞中に導入するためのに蛍光プローブとして、これまでＤＮＡオリゴマー・ＲＮＡオリゴマー・ＰＮＡオリゴマーが利用されているが、これらを細胞中に導入するためには、当然ながら細胞膜を通過させなければならない。しかし、細胞膜は膜表面が負電荷を帯びているため、元々負に帯電しているＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマーを導入するのは非常に困難である。
【００１６】
一方ＰＮＡオリゴマーは電気的に中性であるが、膜透過しにくいという結果が得られている。したがって、ＰＮＡオリゴマーを細胞内に導入するに際しては、膜表面を前処理してその導入をしやすくしたり、あるいはトランスフェクション試薬を用いて導入せざるを得ないのが現状である。
【００１７】
しかし、そのような処理を施してPNAオリゴマーを導入した場合においてプローブの機能が発揮されたとしても、本来生体が示す挙動を正確に表現していることは必ずしも保証されない。しかも、これは細胞1個の場合であり、多細胞（個体）での利用に至っては到底不可能である。
このような現状および観点から、膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブの開発が有用であると考えられている。
【００１８】
なお、膜透過性機能を有する蛍光PNAプローブは既に存在する。例えば、▲１▼膜透過性機能を有するオリゴペプチドをPNAに結合させたもの、▲２▼膜透過性機能を有するリン脂質をPNAに結合させたものが挙げられる。しかしながら、これらは膜透過した後細胞内においてプロテアーゼ等の酵素によりPNA以外の部分が分解され、細胞内に滞留してしまうことが予想される。このことは、ターゲットを捕捉出来なかった過剰なPNAプローブが膜透過性機能を失い、その後の洗浄過程で細胞外に出にくくなることにつながるため、本来細胞が持っている遺伝子発現系を正確に表現できないことを意味する。
【００１９】
上記背景の下、１個または２個以上の機能性分子を超高速に導入することができる、機能性ＰＮＡオリゴマーの合成方法およびそれに用いる化合物に関して、既に特許出願がなされている（特願２００２−１２１６６７）。
この機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法は、チミンまたは保護基によって保護されたアデニン、グアニンもしくはシトシンを有するＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子をポスト合成的に導入し、さらに前記保護基の脱保護を行うことによって目的物を得ることを特徴とする。
【００２０】
しかしながら、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを用いる上記公知の製造方法においては、機能性分子のＰＮＡオリゴマーへの結合が弱い場合には、保護基の脱保護の際に機能性分子も脱離してしまうため、十分な収率が得られない。
したがって、特に、ＰＮＡオリゴマーへの結合が弱い機能性分子をより効率的に導入する方法に対する要求は依然として大きい。
【００２１】
また、酸性条件に不安定な機能性分子、すなわちｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットを用いた合成法においては導入が困難である機能性分子の導入には、アルカリ条件において用い得るＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットを用いる必要がある。したがって、前記の通りＤＮＡ自動合成機にはＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットが用いられることが多いことにも鑑み、ＤＮＡ自動合成機に用い得る新たなＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットに対する要求も多大なものがある。
【００２２】
Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットを合成する方法は、既に報告されている。
【化２２】
【００２３】
【特許文献１】
ピーター・イー・ニールセンら（Peter E. Nielsen et al.） 国際公開第98/5295 A1 号パンフレット。
【特許文献２】
ハンス−ゲオルゲ バッツら（Hans-georg Batz et al.) 国際公開第98/37232 A2号公報。
【非特許文献１】
ティー・エイ・トランら（T. A. Tran et al.）「ペプチド研究ジャーナル」（"J. Pept. Res."）、１９９９年、第５３巻、ｐ．１３４−１４５。
【非特許文献２】
ジェスパー・ローゼら（Jesper Lohse et al.）「バイオコンジュゲート化学」（"Bioconjugate Chem."）、１９９７年、第８巻、ｐ．５０３−５０９。
【非特許文献３】
ブルース・アルミタージら（Bruce Armitage et al.） 「核酸研究」（"Nucleic Acid Res."）、１９９８年、第２６巻、ｐ．７１５−７２０。
【非特許文献４】
オリバー・ザイツ（Oliver Seitz）「テトラヘドロン・レターズ」（"Tetrahedron Letters"） １９９９年 第４０巻、ｐ．４１６１−４１６４。
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、酸性、アルカリ性または中性下において、液性に不安定な化合物があっても、直接またはポスト合成的に、複数の機能性分子を任意の位置に、種々の長さを有するリンカーを介して導入するための、機能性ＰＮＡモノマーユニットおよび機能性ＰＮＡオリゴマーの新規合成方法ならびに新規機能性ＰＮＡモノマーユニットおよび機能性ＰＮＡオリゴマーを提供することを目的とする。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み研究を重ねた結果、本発明者らは、多岐にわたる新規な前駆体的Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットおよびその製造方法を用いることによって、驚くべきことに、従来法における前記課題が克服され、かつ極めて広範にわたる機能性ＰＮＡモノマーユニットおよび機能性ＰＮＡオリゴマーを合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２６】
すなわち、本発明は、下記一般式（Ｉ）：
【化２３】
また、本発明は、機能性分子が、光放出性分子、光消失性分子、膜透過機能性分子、臓器選択性機能性分子、殺菌性機能性分子、分子認識性機能性分子、光架橋機能性分子、光増感機能性分子、ＤＮＡ結合性分子、およびＤＮＡ切断機能性分子から選択された１種または２種以上である、前記化合物に関する。
さらに、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および膜透過機能性分子を含む、前記化合物に関する。
また、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および光消失性分子を含む、前記化合物に関する。
さらに、本発明は、光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、光消失性分子がＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩまたはＡｚｏである、前記化合物に関する。
また、本発明は、膜透過機能性分子が水溶性アミノ酸である、前記化合物に関する。
【００２７】
また、本発明は、Ｒが、
【化２４】
さらに、本発明は、ｎが１〜５の整数である、前記化合物に関する。
【００２８】
また、本発明は、下記一般式（Ｉ）：
【化２５】
ａ）下記一般式（ＩＩ）
【化２６】
ｂ）下記一般式（ＩＩＩ）
【化２７】
ｃ）下記一般式（ＩＶ）
【化２８】
【化２９】
【００２９】
さらに、本発明は、機能性ＰＮＡオリゴマーを製造するための方法であって、下記一般式（Ｉ）
【化３０】
で表される化合物の１種または２種以上を結合したＰＮＡオリゴマーの基Ｒを、順次または同時に機能性分子によって置換する工程を含む、前記方法に関する。
【００３０】
またさらに、本発明は、Ｒが、
【化３１】
【００３１】
さらにまた、本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記ａ）〜ｃ）の工程の１つによって製造される、前記方法に関する：
ａ）下記一般式（ＩＩ）
【化３２】
ｂ）下記一般式（ＩＩＩ）
【化３３】
ｃ）下記一般式（ＩＶ）
【化３４】
【化３５】
【００３２】
また、本発明は、機能性分子が、光放出性分子、光消失性分子、膜透過機能性分子、臓器選択性機能性分子、殺菌性機能性分子、分子認識性機能性分子、光架橋機能性分子、光増感機能性分子、ＤＮＡ結合性分子、およびＤＮＡ切断機能性分子から選択された１種または２種以上である、前記方法に関する。
さらに、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および膜透過機能性分子を含む、前記方法に関する。
また、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および光消失性分子を含む、前記方法に関する。
またさらに、本発明は、光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、光消失性分子がＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩまたはＡｚｏである、、前記方法に関する。
そして、本発明は、膜透過機能性分子が水溶性アミノ酸である、前記方法に関する。
【００３３】
本発明は、ＰＮＡ背骨構造に１種または２種以上の保護基または機能性分子基を有する、前記一般式（Ｉ）で表されるＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後、前記保護基を、順次または同時に機能性分子と置換することによって、機能性分子をポスト合成的に導入することにより、ほぼ定量的に機能性ＰＮＡオリゴマーを合成できることに成功したものである。
前記保護基は、各種条件によって特異的に機能性分子と置換されるものである。したがって、本発明の方法によれば、機能性分子を導入するためのあらゆる条件に適切な保護基を導入することができるため、極めて多岐にわたる機能性ＰＮＡオリゴマーを製造することができる。
【００３４】
また、本発明による化合物によれば、前記一般式（Ｉ）で表されるＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットを用いて、アルカリ性条件の非常に温和な条件下で安定的にオリゴマーの伸長が行うことができる。
さらに、本発明の保護基を有するＦｍｏｃ誘導体は、多くのＤＮＡ自動合成機に用い得るものである。したがって、本発明によれば、ＤＮＡ自動合成機を用いて、より広範な機能性ＰＮＡオリゴマーを、より迅速に製造することが可能になる。
【００３５】
上記特徴により、本発明の製造方法においては、導入する機能性分子として市販のsuccinimideエステルを使用する必要がなく、カルボン酸を有する化合物であれば問題なく利用でき且つ定量的に導入できる。そのため、本発明による製造方法はコストパフォーマンスに極めて優れている。
【００３６】
また、本発明によれば、同一または異なるあらゆる機能性分子を、任意の複数の位置に導入したＰＮＡオリゴマーを合成することが可能となる。すなわち、前記前駆体的Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットを用いてＰＮＡオリゴマーを合成した後、各保護基の脱離に好適な条件下において、機能性分子のポスト合成的導入を順次または同時に行うことによるものである。これはＰＮＡオリゴマーの細胞膜透過性機能を向上させるアンテナペディアを高速に設計する上で欠かせないものである。また、本発明の製造方法によれば、光機能性分子と光消失性分子とを有するＰＮＡオリゴマーであるモレキュラービーコンの合成も容易になる。この点においても、本発明による方法は極めて優れたものである。
【００３７】
このように製造される化合物の例として、機能性分子として、細胞膜透過性分子誘導体および他の機能性カルボン酸誘導体を有するものが挙げられる。このようなプローブは大きく蛍光標識領域・細胞膜透過性機能領域・分子認識領域の３つに分けることができ、それぞれをリンカー部位を介して結合させた形をとることができる。
蛍光標識化合物は市販のものも、既に本発明者らがＰＣＴ出願を行った新規蛍光標識化ＰＮＡモノマーユニットも用いることができる。
【００３８】
分子認識部位は市販のＰＮＡユニットを用いて合成する。この化合物の特徴は、既に国内特許出願を行っている新規ＰＮＡモノマーユニットを膜透過性機能領域部に用いていることである。該新規ＰＮＡモノマーユニットは機能性分子をポスト合成的に導入するために開発された前駆体ユニットであり、これを複数個並べて導入した後、前記したように同一機能性分子も導入することができる。
したがって、本発明によれば、光機能性分子に限定されることない、多種多様な機能性分子を、リンカーの長さの制約を受けることなくＰＮＡ中に容易かつ極めて効率的に導入することができるようになる。
【００３９】
このような機能性分子として、ＦＩＴＣ型、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ型、Ｆｌａｖｉｎ型、ＦＡＭ型、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ型、ＴＡＭＲＡ型、ＲＯＸ型、Ｐｙｒｅｎｅ型およびＣｏｕｍａｒｉｎｅ型等の光放出性分子、Ｄａｂｃｙｌ型、ＨＡＢＡ型、ＤＮＩ型およびＡｚｏ型等の光消失性分子、水溶性アミノ酸等の膜透過機能性分子、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌機能性分子、Ｂｉｏｔｉｎ型およびビオローゲン等の分子認識機能性分子、ソラレン等の光架橋機能性分子、ルシフェリン等の光増感機能性分子、ディスタマイシン、ヘキスト３３２５８およびエチジウムブロミド等のＤＮＡ結合性分子、ならびにブレオマイシン等のＤＮＡ切断機能性分子が挙げられる。
【００４０】
すなわち、本発明における「機能性」の語は、光放出性、光消失性、膜透過機能性、臓器選択性機能性、殺菌性機能性、分子認識性機能性、光架橋機能性、光増感機能性、ＤＮＡ結合性、およびＤＮＡ切断機能性から選択された１種または２種以上である等を含む、ある特定の修飾を行うことによって化合物に新たに付与される種々の機能の全てを意味するものである。
さらに、本発明における「機能性ＰＮＡ」の語は、ＰＮＡモノマー同士が２−（Ｎ−アミノエチル）グリシン骨格によって直接結合したもののみならず、その間にリンカーとしての炭化水素鎖等を含むものも意味するものである。
また、本発明における「保護基」の語は、酸性、アルカリ性および中性のいずれかの条件において特定の基を保護する基全般を意味するものである。特に前記式（Ｉ）の化合物の基Ｒにおいては、保護基は、側鎖アミノ基を保護する保護基を意味し、例えば炭素数１〜２０までの鎖状または環状の基であり、特にｔＢｏｃ、Ｃｂｚ、Ｎｖｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、ＴｒｏｃおよびＴｒｔの各基である。
【００４１】
【発明の実施の形態】
ここで、本発明による方法の特徴を更に詳細に説明する。
【００４２】
本発明による機能性ＰＮＡオリゴマーの合成は、典型的には、
（１）Ｆｍｏｃモノマーユニットの合成、
（２）ＦｍｏｃモノマーユニットのＰＮＡオリゴマーへの導入、および
（３）保護基の脱離および機能性分子の導入
によって行われる。
【００４３】
まず、必要に応じて、下図
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【００４６】
ａ）の工程は、式（ＩＩ）で表される化合物（ω−アミノ酸−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ）から、機能性分子のＯＳｕやＯＰｆｐの活性エステル誘導体や、ＦＩＴＣのようなイソチオシアネート誘導体を用いて、ＰＮＡモノマーユニットを合成する工程である。該工程においては、１ステップで効率よくＰＮＡモノマーユニット
例えば、機能性分子のペンタフルオロフェニルエステルかＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルといった活性エステルと式（ＩＩ）の化合物をトリエチルアミンのような３級アミン存在下室温で縮合することにより、目的とする式（Ｉ）の化合物を得ることができる。
一般に、機能性分子は高価であるが、このａ）工程を用いる方法においては、少量の機能性分子を用いることによって定量的に目的物を得ることができるため、極めてコストパフォーマンスが優れている。
【００４７】
なお、前記式（ＩＩ）の化合物は、下図の経路によって好適に合成される。
【化３９】
より詳細はに、Ｂｏｃ−ω−ＡＡ−ＯＨ（ＩＶａ）とＦｍｏｃＰＮＡ−ＯｔＢｕ（４）のＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶液に縮合剤ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＨＢＴＵあるいはＨＡＴＵを加えて、室温で１２時間反応させる。反応液を濾過し、ろ液を減圧濃縮した後、残渣をカラムクロマトグラフィーに付し化合物ＩＶｂを得る。
化合物ＩＶｂは、ＴＦＡの塩化メチレン溶液または４Ｎ ＨＣｌのｄｉｏｘａｎｅ溶液による酸加水分解に付し、Ｂｏｃ基とｔＢｕ基の脱保護を同時に行い、式（ＩＩ）の化合物を得る。
【００４８】
ｂ）の工程は、前記Ｗｏｓｋｉらの方法を改良したもので、リンカーの長さを考慮したものである。すなわち、機能性分子が本来有する機能性を発揮するためには、該機能性分子が、その活性部位において、最適な立体的位置に存在しなければならないが、前記前記Ｗｏｓｋｉらの方法においては、リンカーが存在しないため、機能性分子の機能性を最大限に発揮せしめることはできない。一方、工程ｂ）を用いた本発明の方法においては、リンカーの長さを自由に変更できるため、機能性分子の性質に対応したリンカーを選択し、機能性分子の機能を発揮せしめることができる利点がある。
工程ｂ）によって、式（Ｉ）の化合物を得るには、例えば、式（ＩＩＩ）の化合物のＴＦＡの塩化メチレン溶液または４Ｎ ＨＣｌのｄｉｏｘａｎｅ溶液による酸加水分解を行い、ｔＢｕ基の脱保護を行う。すなわち、工程ｂ）を用いる方法においては、遊離カルボン酸誘導体を、活性エステル化することなく用いることができるため、コストパフォーマンスに優れている。なお、終了反応過程は酸加水分解であるため、酸性条件で安定な機能性分子への適用が好適である。
【００４９】
なお、前記式（ＩＩＩ）の化合物は、下図の経路によって好適に合成される。
【化４０】
例えば、リンカーを結合した機能性分子Ｒ−ω−ＡＡ−ＯＨ（Ｖａ）とＦｍｏｃＰＮＡ−ＯｔＢｕ（４）のＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶液に縮合剤ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＨＢＴＵあるいはＨＡＴＵを加えて、室温で１２時間反応させる。反応液を濾過し、ろ液を減圧濃縮した後、残渣をカラムクロマトグラフィーに付し目的とする式（ＩＩＩ）の化合物を得る。
【００５０】
ｃ）の工程は、前記ａ）またはｂ）の工程のように前記鍵化合物４を利用した場合、反応工程に必ず強酸によるｔＢｕ基の脱保護過程が入るので、これを避けるために予め強酸による鍵化合物４のｔＢｕ基の脱保護を行った式（Ｖ）の化合物を利用する方法である。式（Ｖ）の化合物を利用するためには機能性分子のカルボン酸を活性エステル化しておく必要がある。
したがって、ペンタフルオロフェニル活性エステル誘導体Ｒ−ω−ＡＡ−ＯＰｆｐ（式（ＩＶ）の化合物）を、式（Ｖ）の化合物の炭酸水素ナトリウム水溶液とアセトンの混合液に加えて、室温で１２時間縮合反応させる。反応液を塩酸酸性（ｐＨ ３）にした後、クエン酸水溶液と酢酸エチルを加え、分液操作を行う。有機相を減圧濃縮した後、残渣をカラムクロマトグラフィーに付し目的とする式（Ｉ）の化合物を得る。
このｃ）工程を用いる方法は、式（Ｖ）の化合物中のＦｍｏｃ基が、反応の進行に必要な３級アミンによって脱保護される場合があること、および機能性分子にリンカーを導入する工程が必要である点に特徴を有する。したがって、該方法は、実験室レベルで、中間体の生成を確認しながら目的物の生成を行う場合に好適に用いられる。
【００５１】
なお、前記式（ＩＶ）の化合物は、下図に示すように、
【化４１】
【００５２】
次に、ＦｍｏｃモノマーユニットのＰＮＡオリゴマーへの導入が、ｔＢｏｃ固相法等によって行われる。この際に用いられる固相担体に特に制限はないが、例えばＭＢＨＡが好適に用いられる。
本発明において典型的に用いられる式（Ｉ）で表されるＦｍｏｃモノマーユニットおよびその特徴は、以下に示すとおりである。
（１）ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４２】
【００５３】
（２）Ａｚｏ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
化合物）
【化４３】
【００５４】
（３）Ｔｒｔ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４４】
【００５５】
（４）ｔＢｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４５】
【００５６】
（５）Ｎｖｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４６】
【００５７】
（６）Ｆｍｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４７】
【００５８】
（７）Ａｌｌｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４８】
【００５９】
（８）Ｃｂｚ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化４９】
【００６０】
（９）Ｔｒｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨ
【化５０】
【００６１】
最後に、保護基の機能性分子による置換が行われる。該置換は、各Ｆｍｏｃモノマーユニットの前記特徴を考慮し、順次または同時に行われる。
なお、本発明における式（Ｉ）の化合物におけるリンカーの長さは、ｎ＝１〜１１の範囲であれば特に制限されないが、ｎ＝１〜５のものは、式（Ｉ）の化合物の合成の際およびＰＮＡオリゴマーの合成の際におけるリンカー部の安定性の面で有利であり好適である。
【００６２】
上記のように、本発明による方法においては、従来の機能性モノマー合成に用いる活性エステル化の合成を要する方法とは異なり、機能性分子をそのまま利用できる。また、保護基ごとに機能性分子との置換条件が異なるため、保護基を有するＰＮＡオリゴマーを合成した後に種々の機能性分子が所望の箇所に導入可能である。したがって、本発明の方法によれば、従来困難であった高速かつ多様な並列ＰＮＡプローブの合成が可能である。
【００６３】
本発明による式（Ｉ）の化合物を重合させることよって、例えば、下記のように、機能性ＰＮＡオリゴマーを合成することができる。
【化５１】
すなわち、本発明による式（Ｉ）の化合物を用いれば、細かい条件設定を行うことによって、機能性分子の性質に即したあらゆる機能性ＰＮＡオリゴマーを合成することができる。特に、Ｆｍｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨを用いることによって、枝分かれ構造を有するデンドリマーを効率的に合成できる点において、式（Ｉ）の化合物の使用は有利である。
【００６４】
より具体的な例は、下記のとおりである。第一の例は、前記Ｔｒｔ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨとｔＢｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨを用い、オリゴマーのレジンからの切り出し前及び切り出し後に機能性分子をそれぞれ１個ずつ導入する例である。また、第二の例は、さらにＴｒｏｃ−ω−ＡＡ−ＦｍｏｃＰＮＡ−ＯＨも用いることにより、レジンからの切り出し後にさらに機能性分子を導入する例である。
【００６５】
【化５２】
【化５３】
このように、本発明による式（Ｉ）の化合物を用いれば、複数の機能性分子が導入されたものとして、例えば、機能性分子が細胞膜透過性機能分子誘導体であるものが好適に合成される。このような化合物は、典型的には、機能性分子として、細胞膜透過性機能分子誘導体等および光機能性分子等の機能性カルボン酸誘導体等を有するもの、すなわち、末端部を含む複数部位に機能性分子が導入され、それらによって複数の機能が付与された化合物である。
【００６８】
また、リンカー部位を導入することによって、個々の機能性部位および塩基配列認識領域の干渉を防ぎ、分子の機能をより確実なものにすることができる。本明細書におけるＰＮＡ、ＰＮＡモノマーおよびＰＮＡオリゴマーの語には、リンカー部位をその末端および／または内部に含むものも包含される。
これらの部位または領域間の相互干渉を防ぐための部位としては、前記リンカー部位のみならず、リンカーの長さを、所望に応じて選択することによっても可能である。
リンカー部位を構成する基としては、直鎖状または分枝状の炭化水素およびそれらのエーテル体等が挙げられるが、直鎖状炭化水素基は導入の容易さおよびコストなどの面から好適であり、特に炭素数１〜６の直鎖状炭化水素基が好適である。また、エーテル体は、その汎用性において好適である。
【００６９】
前記複数の機能性分子が導入された化合物は、例えばKoch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.を利用して好適に合成される。塩基配列認識部位は、市販の各種ＰＮＡモノマーを用いて固相合成によりオリゴマー化することができる。リンカー部位には、市販のＢｏｃ−７−アミノヘプタン酸、Ｂｏｃ−６−アミノカプロン酸等を用いることができる。
【００７０】
１の機能性分子として光機能性分子を導入すれば、蛍光標識することが可能であり、かつ他の機能も有する化合物を合成することができる。このような蛍光標識部位として、市販のＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＰｙｒｅｎｅ等の市販の活性エステル型蛍光標識化合物を用いて、多様な蛍光発光波長を選択することが可能であるが、導入される蛍光標識化合物はこれらに限定されるものではない。また、本発明の方法によれば、Ｄａｂｃｙｌなどの光消失性分子の導入も容易に行うことができる。
【００７１】
本発明の化合物に導入し得る他の機能性の例としては、膜透過性機能が挙げられる。膜透過性を向上させることができる機能性分子としてアルギニンが挙げられるが、リシンおよびセリン等の他の水溶性アミノ酸も好適に用いることができる。
【００７２】
これらのプローブの特徴は、「全てＰＮＡ型になっているので、完全な酵素耐性を有すること」である。すなわち、これまでの膜透過性機能を有するプローブは、ＰＮＡと膜透過性機能を有するペプチド鎖あるいはリン脂質を共有結合させたものが主流であったが、これらの既知のプローブは優れた膜透過性機能を有するものの、一旦細胞内に入ると酵素群によりペプチド鎖あるいはリン脂質が分解されることが予想される。したがって、これらは、ターゲットを認識していない分解を受けたプローブを洗浄過程で完全に取り除くことができないという欠点を有する。
【００７３】
これに対して、今回合成可能になったプローブは、細胞内においても酵素分解を受けないため、ターゲットを認識していないプローブは洗浄過程で完全に取り除かれるため、正確な遺伝子発現量の定量を可能とするものである。
なお、これらの機能性を有する化合物以外にも、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌機能性分子およびビオローゲン等の分子認識機能性分子等も、本発明によれば制限なく導入することが可能であり、そのような化合物を、大量に低コストで実用に供することが可能になる。
【００７４】
さらに、本発明による製造方法を用いたプローブには、光機能性分子および光消失性分子とを併せて有するモレキュラービーコンも包含される。モレキュラービーコンとは塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出するプローブであって、遺伝子工学において重要な化合物である。
従来のモレキュラービーコンは、耐酵素活性が低いため保存には不適当であったが、本発明によるプローブＰＮＡバックボーンを用いているためより安定性に優れている。
前記光放出性分子としては、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅが挙げられ、光消失性分子としてはＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩおよびＡｚｏを挙げることができる。
【００７５】
【実施例】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限られるものではない。
（実施例１）
C5-FmocPNA-OHの合成
【化５４】
Boc-C5-FmocPNA-OtBu (250.0 mg, 0.41 mmol) を4 N HCl in dioxane (2 mL) に溶解し、室温で15時間攪拌した。これを減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（10-30% MeOH/CH2Cl2）に付し、C5-FmocPNA-OH（48.0mg, 26%）を淡桃色粉末として得た。1H NMR (CDCl3)δ 7.71 (brd, J = 6.8 Hz, 2 H), 7.54 (brd, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.30 (brt, 2 H), 7.22 (brt, J = 7.2 Hz, 2 H), 4.26 (ma) and 4.23 (mi) (brt, J = 6.8 Hz, 2 H), 4.10 (brt, 1 H), 3.99 (ma) and 3.94 (mi) (s, 2 H), 3.40 (q, J = 6.1 Hz, 2 H), 2.82 (m, 4 H), 2.79 (mi) and 2.75 (ma) (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 2.34 (ma) and 2.09 (mi) (brt, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.6 - 1.3 (m, 4 H)。
【００７６】
（実施例２）tBoc-GABA-FmocPNA-OHの合成
【化５５】
【００７７】
（実施例３）tBoc-C5-FmocPNA-OHの合成
【化５６】
【００７８】
（実施例４）Nvoc-GABA-FmocPNA-OHの合成
【化５７】
アセトン(4.3 mL)と水(0.6 mL)の混合溶液にNaHCO3(62.0 mg，0.74 mmol)を加え、Nvoc-GABA-OPfp (150.0 mg，0.30 mmol)とFmocPNA-OH (83.7 mg，0.25 mmol)を溶解し、室温で3日間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液（45 mL）を加え、酢酸エチル（60 mL）で抽出し、有機層を飽和食塩水（45 mL）で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(2-15% MeOH/CH2Cl2)で精製し、黄色粉末としてNvoc-GABA-FmocPNA-OH (242.0 mg，50%)を得た。1H NMR (CDCl3)δ 8.05 and 7.29 (each s, 1 H), 7.69, 7.54, 7.35, and 7.26 (each brs, 2 H), 5.45 (mi) and 5.41 (ma) (s, 2 H), 4.5 - 4.0 (m, 3 H), 4.0 - 3.7 (m, 8 H), 3.55 (brs, 2 H), 3.37 (ma) and 3.24 (mi) (brs, 2 H), 3.09 (ma) and 3.03 (mi) (brs, 2 H), 2.47 (ma) and 2.33 (mi) (brs, 2 H), 1.86 (ma) and 1.74 (mi) (brs, 2 H); HRMS (FAB+) calcd for C33H37N4O11 [(M+H)+] 665.2459, observed 665.2469。
【００７９】
（実施例５）Nvoc-C5-FmocPNA-OHの合成
【化５８】
【００８０】
（実施例６）Fmoc-GABA-FmocPNA-OHの合成
【化５９】
【００８１】
（実施例７）Alloc-ω-AA-FmocPNA-OHの合成
【化６０】
【００８２】
（実施例８）Cbz-GABA-FmocPNA-OHの合成
【化６１】
【００８３】
（実施例９）Troc-GABA-FmocPNA-OHの合成
【化６２】
アセトン(4.0 mL)と水(0.5 mL)の混合溶液にNaHCO3(62.0 mg，0.74 mmol)を加え、Troc-GABA-OPfp (133.4 mg，0.30 mmol)とFmocPNA-OH (56.5 mg，0.25 mmol)を溶解し、室温で3日間攪拌した。氷冷した１ N 塩酸で溶液(0 ℃)をpH 3.0とし、さらに1%クエン酸水溶液（45 mL）を加え、酢酸エチル（60 mL）で抽出し、有機層を飽和食塩水（45 mL）で洗浄をした。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を濃縮しシリカゲルカラムクロマト法(2-15% MeOH/CH2Cl2)で精製し、黄色粉末としてTroc-GABA-FmocPNA-OH (46.1 mg，31%)を得た。1H NMR (CDCl3)δ 7.70, 7.52, 7.34, and 7.24 (each m, 2 H), 4.64 (mi) and 4.61 (ma) (brs, 2 H), 4.31 (m, 2 H), 4.13 (m, 1 H), 4.2-3.9 (m, 2 H), 3.45 (ma) and 3.42 (mi) (brs, 2 H), 3.27 (ma) and 3.16 (mi) (brs, 2 H), 3.11 (mi) and 3.06 (ma) (brs, 2 H), 2.38 (ma) and 2.25 (mi) (brs, 2 H), 1.77 (mi) and 1.68 (ma) (brs, 2 H)。
【００８４】
【発明の効果】
本発明によれば、酸性、アルカリ性または中性下において、液性に不安定な化合物があっても、直接またはポスト合成的に、複数の機能性分子を任意の位置に、種々の長さを有するリンカーを介して導入するための、機能性ＰＮＡモノマーユニットおよび機能性ＰＮＡオリゴマーの新規合成方法ならびに新規機能性ＰＮＡモノマーユニットおよび機能性ＰＮＡオリゴマーが提供される。したがって、本発明によれば、種々のＰＮＡの構築が可能になるため、化学工業および遺伝子治療等に寄与するところ極めて大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡとＰＮＡの構造および荷電の状況の違いを表す図である。
【図２】２種類のＰＮＡモノマーユニットの構造を表す図である。
Claims (16)
- 下記一般式（Ｉ）：
Ｒは以下に示す群から選択される
で表される化合物。 - Ｒが、
- ｎが１〜５の整数である、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
- 下記一般式（Ｉ）：
ａ）下記一般式（ＩＩ）
- 下記一般式（Ｉ）：
ｂ）下記一般式（ＩＩＩ）
- 下記一般式（Ｉ）：
ｃ）下記一般式（ＩＶ）
- 機能性ＰＮＡオリゴマーを製造するための方法であって、下記一般式（Ｉ）
- Ｒが、
- 一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記ａ）の工程によって製造される、請求項７または８に記載の方法：
ａ）下記一般式（ＩＩ）
- 一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記ｂ）の工程によって製造される、請求項７または８に記載の方法：
ｂ）下記一般式（ＩＩＩ）
- 一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記ｃ）の工程によって製造される、請求項７または８に記載の方法：
ｃ）下記一般式（ＩＶ）
- 機能性分子が、光放出性分子、光消失性分子、膜透過機能性分子、臓器選択性機能性分子、殺菌性機能性分子、分子認識性機能性分子、光架橋機能性分子、光増感機能性分子、ＤＮＡ結合性分子、およびＤＮＡ切断機能性分子から選択された１種または２種以上である、請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
- 機能性分子が、光放出性分子および膜透過機能性分子を含む、請求項１２に記載の方法。
- 機能性分子が、光放出性分子および光消失性分子を含む、請求項１２に記載の方法。
- 光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、光消失性分子がＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩまたはＡｚｏである、請求項１４に記載の方法。
- 膜透過機能性分子が水溶性アミノ酸である、請求項１３に記載の方法。
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