CN103524428A - 一种公斤级合成Fmoc-PNA-T-OH的方法 - Google Patents

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杜建坤
刘金永
黄忠林
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
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Abstract

本发明公开了一种公斤级合成Fmoc-PNA-T-OH的方法，包括以下步骤：乙二胺为原料，与卤代乙酸反应，用DMSO重结晶得到N-(2-氨乙基)甘氨酸；以N-(2-氨乙基)甘氨酸为原料，与Fmoc-osu反应，得到N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸，再与甲醇反应制得N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯盐酸盐；以胸腺嘧啶为原料，加入原料，反应得1-乙酸基胸腺嘧啶；以1-乙酸基胸腺嘧啶为原料，与N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯反应，得Fmoc-PNA-T-OMe；以Fmoc-PNA-T-OMe为原料，水解即得产品。

Description

一种公斤级合成Fmoc-PNA-T-OH的方法
技术领域
本发明涉及一种合成PNA的方法，具体涉及的是一种公斤级合成Fmoc-PNA-T-OH的方法。
背景技术
寡核苷酸在治疗用药物、分子生物学研究工具及诊断试剂上应用广泛。寡核苷酸应用的主要制约在于它容易被核酸酶所降解、杂交后热稳定性差以及会与蛋白等非特异性结合等。为改造寡核苷酸的理化和生物学特性，许多寡核苷酸类似物被研究出来。肽核酸是寡核苷酸模拟物中的较为重要的一种。1991年Nielsen等报道了用N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(Pept idenucleicacid，PNA)。尽管PNA在结构上相对寡核苷酸有了显著的改变，但PNA与互补核酸之间的结合仍遵循碱基互补配对原则，甚至比天然核苷酸具有更高的亲和性，有较强的抗核酸酶和蛋白水解酶降解的能力。科研人员设计合成了各种结构的PNA，以优化其生物学稳定性和利用度、靶结合特性以及药代动力学特性，并将PNA应用于诊断和治疗等方面，从而开创了一个新的研究领域。
各种各样的构建模块被用于合成PNA及其类似物，包括骨架结构、在N-(2-氨基乙基)甘氨酸上连接手性和非手性的基团、碱基的类型等。经典的PNA的骨架单体是N-(2-氨基乙基)甘氨酸，在甘氨酸的氮上连接碱基的衍生物。通常先合成端基N有保护基的氨基乙基甘氨酸酯，然后再将碱基衍生物连在未受保护的氮上。常用的方法有：烷基化反应、席夫碱的还原反应、Mit sunobu反应。
四种碱基都是经胺的烷基化反应形成碱基乙酸衍生物，再采用通常的多肽合成的方法，联结碱基乙酸和骨架上的未受保护的氮。胸腺嘧啶的烷基化反应通常不需要使用保护基团，因此当与溴乙酸酯反应再经皂化或直接与溴乙酸反应即可得胸腺嘧啶乙酸。其余三种碱基上都有活泼基团，需先加以保护。胞嘧啶上的活泼基团为4位上的氨基，可选择的保护基有：苄氧羰基(benzy loxycarbonyl，Cbz)、对叔丁基苯甲酰基(4-tert-butylbenzoyl，4-t-BuBz)、苯甲酰基(benzoyl，Bz)以及Mmt等，再与溴乙酸酯进行烷基化反应，然后皂化即得胞嘧啶乙酸的衍生物。腺嘌呤的保护过程与胞嘧啶基本相同，可用的保护基有Cbz，Mmt，对甲氧基苯基(anisoly，An)。鸟嘌呤的保护比较复杂，需要在N9的烷基化的过程中避免N7烷基化的副反应干扰。一种常用的方法是在烷基化中用2-氨基-6-氯嘌呤，烷基化后再在酸性或碱性条件下回流，将氯水解转化为羰基，或是直接烷基化N2连有保护基的腺嘌呤，色谱分离N7/N9两种烷基化产物，然后皂化得鸟嘌呤乙酸的衍生物。
目前国内已经有部分公司可以定制合成PNA系列产品，但是他们的合成规模很小，一般在毫克级别，这种局面大大制约了PNA这种化合物的应用以及研究工作。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种公斤级合成Fmoc-PNA-T-OH的方法，通过简单工艺，大量生产高纯度的Fmoc-PNA-T-OH。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种公斤级合成Fmoc-PNA-T-OH的方法，包括以下步骤：
步骤1)乙二胺与卤代乙酸反应，用DMSO重结晶得到N-(2-氨乙基)甘氨酸；
步骤2)以N-(2-氨乙基)甘氨酸为原料，与Fmoc-osu反应，得到N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸；
步骤3)N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸与甲醇在氯化亚砜参与下反应制得N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯盐酸盐；
步骤4)以胸腺嘧啶为原料，加入卤代乙酸，反应得1-乙酸基胸腺嘧啶；
步骤5)以1-乙酸基胸腺嘧啶为原料，与N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯盐酸盐反应，得到Fmoc-PNA-T-OMe；
步骤6)以N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯-2-(胸腺嘧啶-1)-乙酰胺为原料，水解即得产品Fmoc-PNA-T-OH；
步骤1、2、3、4、5、6的反应公式为：
Figure BSA0000096186720000031
本发明的有益效果是：
本发明属于大规模生产工艺，为PNA的大规模研究做好物质准备，以及为以后的大规模应用做好工艺准备。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种公斤级合成Fmoc-PNA-T-OH的方法，包括以下步骤：
步骤1)1升三口瓶装入500毫升乙二胺，冰浴冷却至10度，将75克氯乙酸分批加入控制温度在10度以下，每批加完后，观察完全消耗掉之后再加下一批，加料完毕后，室温过夜反应，将乙二胺旋干，回收乙二胺可以循环使用，用油泵将乙二胺尽可能去除干净，用DMSO重结晶得到白色粉末状晶体，为N-(2-氨乙基)甘氨酸，收率40-50％；
步骤2)将50克N-(2-氨乙基)甘氨酸溶于850毫升二氯甲烷和50毫升N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，加入134毫升三甲基氯硅烷，反应混合物室温搅拌40分钟，然后冷却至5度，将134克Fmoc-osu加入上面混合物中，在5度下滴加N-甲基吗啉186毫升，30分钟滴完，在此温度下搅拌2小时，然后加入100毫升甲醇，再搅拌20分钟，加入1升乙酸乙酯，20分钟后过滤固体，用乙酸乙酯洗涤，产品粉末旋干，产品水中打浆洗涤，过滤水洗，干燥得到纯品，为N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸，收率60％；
步骤3)将12克N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸溶于100毫升的无水甲醇中，7.72毫升二氯亚砜在冰浴下滴入，滴完后此温度下继续反应15分钟，然后回流2小时，除掉溶剂，用9/1的乙醚和甲醇溶解，0度析晶，过滤，乙醚洗涤，干燥，得到纯品，为N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯盐酸盐，收率90％；
步骤4)将44.8克的氢氧化钾溶于180毫升水中，搅拌将至室温，加入25.22克胸腺嘧啶，搅拌均匀；滴加31.4g氯乙酸和60毫升水的混合物，1小时内滴加完毕，加热至50度，保温反应6小时，然后将至室温过夜，TLC原料无剩余，浓盐酸调PH=5.5，室温搅拌1小时，过滤，滤饼水洗，干燥，得纯品1-乙酸基胸腺嘧啶，收率70.2％；
步骤5)将11.04克1-乙酸基胸腺嘧啶溶于50毫升乙腈和50毫升N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌均匀，加入18.2克N-甲基吗啉、30克HBTU、23.4克N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯盐酸盐，氮气保护。反应液白色浆状，3小时后，逐渐变稀。室温搅拌过夜，反应液中有大量白色固体析出，变得黏稠。TLC原料无剩余。过滤，滤饼用乙腈洗涤，干燥得纯品Fmoc-PNA-T-OMe，收率46.1％；
步骤6)将17.3克的Fmoc-PNA-T-OMe溶于200毫升的乙腈中，降温至0度，滴加2摩尔/升的氢氧化锂水溶液150毫升，保温搅拌1小时，溶液澄清，加入柠檬酸45g，保温搅拌1小时，大量固体析出，过滤，滤饼水洗，干燥得粗品，加入甲基叔丁基醚重结晶，得到纯品Fmoc-PNA-T-OH，纯度为97％，收率64.7％；
Figure BSA0000096186720000061

Claims (1)

1.一种公斤级合成Fmoc-PNA-T-OH的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)乙二胺与卤代乙酸反应，用DMSO重结晶得到N-(2-氨乙基)甘氨酸；
步骤2)以N-(2-氨乙基)甘氨酸为原料，与Fmoc-osu反应，得到N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸；
步骤3)N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸与甲醇在氯化亚砜参与下反应制得N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯盐酸盐；
步骤4)以胸腺嘧啶为原料，加入卤代乙酸，反应得1-乙酸基胸腺嘧啶；
步骤5)以1-乙酸基胸腺嘧啶为原料，与N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯盐酸盐反应，得到Fmoc-PNA—T-OMe；
步骤6)以N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯-2-(胸腺嘧啶-1)-乙酰胺为原料，水解即得产品Fmoc-PNA-T-OH；
步骤1、2、3的反应公式为：
Figure FSA0000096186710000011
步骤4、5、6的反应公式为：
Figure FSA0000096186710000021
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