CN116334195A - 基于光控细胞标记的空间单细胞转录组测序方法 - Google Patents

基于光控细胞标记的空间单细胞转录组测序方法 Download PDF

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CN116334195A CN202111580808.8A CN202111580808A CN116334195A CN 116334195 A CN116334195 A CN 116334195A CN 202111580808 A CN202111580808 A CN 202111580808A CN 116334195 A CN116334195 A CN 116334195A
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Abstract

本发明公开了一种基于光控细胞标记的空间单细胞转录组测序方法，所述方法使用的探针为ONPF‑biotin，包括使用ONPF‑biotin对待测序细胞进行标记；对ONPF‑biotin标记的细胞进行分选与单细胞测序。本发明实现了高效的光控细胞标记和空间单细胞转录组测序，解决了现有的方法在标记效率低、标记位置数量少、背景信号高、依赖遗传学操作等问题，为研究不同生物体系中细胞的空间分布与调控提供了新一代解决方案。

Description

基于光控细胞标记的空间单细胞转录组测序方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体的说，涉及一种基于光控细胞标记的空间单细胞转录组测序技术。
背景技术
单细胞转录组测序是现代生物学(scRNA-seq)的核心技术之一。利用单细胞测序，研究者可以对每个细胞的基因表达进行检测，从而获得细胞的种类、数量和状态等信息。多细胞生物中每个细胞的功能和基因表达受到其空间位置的调控，但细胞的空间信息在单细胞测序的实验流程中会丢失。针对这一挑战，研究者开发了多种方法希望实现具有空间分辨率的单细胞测序。这些方法的核心是对特定空间位置的细胞进行荧光标记，再对标记的细胞进行分离和单细胞测序，从而在单细胞测序数据中为每个细胞加入空间位置信息。Ido课题组利用遗传编码的光激活荧光蛋白实现了小鼠组织中细胞的空间标记和单细胞测序。此方法依赖遗传学操作，应用难度较高。Costantino课题组采用荧光素的光漂白原理实现了细胞的空间标记，但此方法效率较低，背景信号高。Krummel课题组开发的ZipSeq技术利用光照控制细胞表面的DNA杂交，实现了空间特异性的DNA条形码标记和单细胞测序。此方法由于需要对细胞进行单链DNA标记，存在较高的背景吸附。Schumacher课题组开发的SCARI技术利用光激活的遗传标签规避了单链DNA标记，但无法对多个区域同时进行标记，限制了其应用范围。
现有的方法存在标记效率低、标记位置数量少、背景信号高、依赖遗传学操作等问题，限制了其进一步在生物学和医学等领域的应用。
发明内容
空间单细胞转录组测序需要对空间中特定位置的细胞进行标记，而已有方法存在标记效率低、标记位置数量少、背景信号高、依赖遗传学操作等问题。本方法的目的即通过全新的化学方法，解决已有方法的这些不足，实现更为高效实用的空间单细胞转录组测序。
为了解决已有方法存在的上述问题，把发明要求保护ONPF-biotin在空间单细胞转录组测序技术中的应用，所述ONPF-biotin的结构式为：
Figure BDA0003425985850000021
本发明提供一种用于空间单细胞转录组测序的探针，所述探针为ONPF-biotin，所述ONPF-biotin的结构式为：
Figure BDA0003425985850000022
本发明提供一种权利要求2所述探针的制备方法，包括将AzONPF与DBCO-biotin加入到二甲亚砜和水的混合溶液中，反应，得到ONPF-biotin的步骤。
其中，所述AzONPF与DBCO-biotin的摩尔比为1:1；反应条件为室温反应2小时。
其中，所述AzONPF的制备方法为：
1)将2-叠氮乙醇溶解于吡啶中，加入氯甲酰基-(4-硝基)-苯酚酯并搅拌均匀，反应，纯化后得到化合物1，所述化合物1的结构式为
Figure BDA0003425985850000023
2)将化合物1溶解于二氯甲烷中，向体系中加N-叔氧羰基-1,2-乙二胺和三乙胺，室温过夜反应，反应结束后，将产物进一步萃取纯化，得到化合物2；
3)将化合物2溶解于二氯甲烷中，加入三氟乙酸，室温反应，得到化合物3；
4)将2-羟基-5-甲酰基-苯甲酸甲酯溶解于二甲基甲酰胺中，加入碳酸铯，冰浴下加入邻硝基苄溴的二甲基甲酰胺溶液，体系升至室温并反应过夜；反应结束后，将产物进一步萃取纯化，得到化合物4；
5)将化合物4溶解于甲醇/四氢呋喃中，冰浴下缓慢加入硼氢化钠，搅拌下继续反应，反应结束后，将产物进一步萃取纯化，得到化合物5；
6)将化合物5溶解于四氢呋喃中，加入氢氧化锂的水溶液，室温反应过夜；反应结束后，将产物进一步萃取纯化，将得到的白色粗产物重新溶解在二甲基甲酰胺中，并加入化合物3，L N,N-二异丙基乙胺，羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应过夜；反应结束后，将产物进一步萃取纯化，得到白色固体AzONPOH；
7)将AzONPOH溶解于二氯甲烷中，冰浴下缓慢加入双(2-甲氧乙基)氨基三氟化硫的二氯甲烷溶液，将体系升至室温并反应过夜；反应结束后，将产物进一步萃取纯化，得到白色固体AzONPF。
本发明还提供一种基于光控细胞标记的空间单细胞转录组测序方法，所述方法使用的探针为ONPF-biotin。
所述的方法，包括如下步骤：
1)使用ONPF-biotin对待测序细胞进行标记；
2)对ONPF-biotin标记的细胞进行分选与单细胞测序。
所述步骤1)中的标记方法包括：
11)将待检测细胞使用ONPF-biotin的HBSS溶液进行孵育；
12)将步骤11)中孵育后的细胞，去除溶液，进行激光照射；所述激光照射可以通过激光扫描共聚显微镜实现，也可以通过其他包含405nm激光器的设备实现，例如荧光显微镜；
13)照射后的细胞洗涤两次后，加入含有链霉亲和素-荧光分子偶联物的培养基，室温孵育；孵育结束后，细胞将再次用HBSS溶液洗涤两次；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的标记次数为多次，在步骤13的最后一次HBSS溶液洗涤后，重复步骤11)-13)。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括如下步骤：
21)向标记完成后的细胞中加入胰酶，孵育，吸去胰酶，细胞用含有5％胎牛血清的PBS吹散后进行流式分选，流式信号中可以观测到明显的细胞分群，将阳性群落选中并分离；
22)将阳性细胞分选至预加裂解液的96孔板中，每孔一个细胞，进行细胞裂解；
23)随后分别对每个孔得到的RNA进行反转录；得到cDNA；
24)分别将第3步得到的cDNA产物进行PCR扩增；
25)分别将每个孔的PCR产物利用磁珠进行纯化，并进行二代测序文库构建；
26)构建完成的文库使用5200Fragment Analyzer进行质控；
27)通过质控的文库合并后进行二代测序，每样品共下机140万条左右的Reads进行后续分析，即可得到空间单细胞转录组测序结果。
本发明提出利用光激活的亚甲基苯醌探针(ONPF-biotin)对特定区域的细胞进行标记，再将被标记的细胞分离后进行单细胞测序。这一方法被命名为OpTAG-seq。亚甲基苯醌是一类寿命较短的化学中间体，具有极强的反应活性。原位生成后，亚甲基苯醌可以与细胞表面蛋白的亲核性残基发生高效的共价连接，实现细胞的原位标记。这种标记方法可以循环进行，从而实现同一样品中多个空间位置的标记。利用流式细胞仪将标记的细胞分离至微孔板中进行单细胞文库构建与测序，即可实现空间单细胞转录组测序。本发明的实施例中通过实验证明，ONPF-biotin可实现高效的细胞空间标记，并结合流式分选实现空间单细胞转录组测序。
本发明利用全新的化学方法，实现了高效的光控细胞标记和空间单细胞转录组测序，解决了现有的方法在标记效率低、标记位置数量少、背景信号高、依赖遗传学操作等问题，为研究不同生物体系中细胞的空间分布与调控提供了新一代解决方案。
附图说明
图1为ONPF-biotin的合成路线；
图2为利用OpTAG对活细胞进行多轮光控标记；
图3为利用OpTAG对活细胞进行多轮光控标记的荧光成像结果；
图4为利用OpTAG-seq进行空间单细胞转录组测序流程图；
图5为利用流式细胞仪对标记后细胞的细胞标记信号进行检测的结果图；
图6为利用OpTAG-seq解析癌细胞迁移过程的基因表达调控。
图7为利用ONPF-biotin对活细胞标记后，对细胞裂解液的蛋白质进行免疫印记分析。
图8为分别以ONPF-Cy5(图a)和ONPF-biotin(图b)作为探针分子进行细胞标记后的细胞表面的荧光信号。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1ONPF-biotin的制备
按照下述步骤，制备ONPF-biotin，所述ONPF-biotin的制备流程如图1所示，所述ONPF-biotin的结构式为
Figure BDA0003425985850000051
具体步骤如下：
1)将500mg 2-叠氮乙醇溶解于10mL吡啶中，加入1.27mg氯甲酰基-(4-硝基)-苯酚酯并搅拌均匀，室温过夜反应。反应结束后，体系中的吡啶通过旋蒸除去后，重溶至20mL乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液依次洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥并再次旋蒸除去溶剂。得到的粗产物用高效液相色谱(水/乙腈)进行纯化，得到白色固体化合物1(563mg,39％)，所述化合物1的结构式为
Figure BDA0003425985850000052
2)将520mg化合物1溶解于15mL二氯甲烷中，向体系中加入364mg N-叔氧羰基-1,2-乙二胺和865μL三乙胺，室温过夜反应。反应结束后，向体系中的二氯甲烷通过旋蒸除去后，重溶至20mL水中，用60mL二氯甲烷分三次萃取，得到的有机相合并后用无水硫酸钠干燥并再次旋蒸除去溶剂。得到的粗产物用高效液相色谱(水/乙腈)进行纯化，得到白色固体化合物2(370mg,66％)，所述化合物2的结构式为
Figure BDA0003425985850000061
3)将308mg化合物2溶解于15mL二氯甲烷中，向体系中加入4mL三氟乙酸，室温反应1小时，得到化合物3(162mg)，所述化合物3为浅棕色油状物，其结构式为
Figure BDA0003425985850000062
可直接用于后续步骤。
4)将500mg 2-羟基-5-甲酰基-苯甲酸甲酯溶解于20mL二甲基甲酰胺中，向体系中加入950mg碳酸铯，冰浴下加入5mL邻硝基苄溴(580mg)的二甲基甲酰胺溶液，体系升至室温并反应过夜。反应结束后，向体系中加入50mL水淬灭并用3×40mL乙酸乙酯萃取。将有机相合并并用2×25mL水和2×30mL饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥并旋蒸除去溶剂。得到的粗产物用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯)进行纯化，得到白色固体化合物4(700mg,82％)，所述化合物4的结构式为
Figure BDA0003425985850000063
5)将500mg化合物4溶解于20mL甲醇/四氢呋喃(1:9)中，冰浴下缓慢加入34mg硼氢化钠，搅拌下继续反应30分钟。反应结束后，向体系中加入10mL饱和氯化铵溶液淬灭反应，并用3×40mL乙酸乙酯萃取。将有机相合并并用2×30mL饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥并旋蒸除去溶剂。得到的粗产物用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯)进行纯化，得到白色固体化合物5(480mg,95％)，所述化合物5的结构式为
Figure BDA0003425985850000064
6)将170mg化合物5溶解于10mL四氢呋喃中，加入257mg氢氧化锂的水溶液(5mL)，室温反应过夜。反应结束后，向体系中加入20mL 1M盐酸溶液中和反应，并用3×15mL乙酸乙酯萃取，将有机相合并并用2×20mL饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥并旋蒸除去溶剂。得到的白色粗产物重新溶解在10mL二甲基甲酰胺中，并加入100mg化合物3，140μL N,N-二异丙基乙胺，8.0mg羟基苯并三唑和153mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应过夜。反应结束后，向体系中加入20mL 1M盐酸溶液中和反应，并用3×20mL乙酸乙酯萃取，将有机相合并并用3×20mL饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤，用无水硫酸钠干燥并旋蒸除去溶剂。得到的粗产物用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯)进行纯化，得到白色固体AzONPOH(128mg,53％)，所述AzONPOH的结构式为
Figure BDA0003425985850000071
7)将110mg AzONPOH溶解于8mL二氯甲烷中，冰浴下缓慢加入2mL双(2-甲氧乙基)氨基三氟化硫(530mg)的二氯甲烷溶液，将体系升至室温并反应过夜。反应结束后，加入20mL冰水淬灭反应，并用2×20mL二氯甲烷萃取。将有机相合并后，用3×15mL饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤，用无水硫酸钠干燥并旋蒸除去溶剂。得到的粗产物用柱色谱(二氯甲烷/甲醇)进行纯化，得到白色固体AzONPF(53mg,48％)，所述AzONPF的结构式为
Figure BDA0003425985850000072
8)向二甲亚砜和水的混合溶液中加入10mM的AzONPF和10mM的DBCO-biotin，室温反应2小时，得到终浓度为10mM的ONPF-biotin溶液。其中，所述DBCO-biotin的结构式为
Figure BDA0003425985850000073
ONPF-biotin的结构式为
Figure BDA0003425985850000081
实施例2利用ONPF-biotin对活细胞进行标记
1.将ONPF-biotin用HBSS溶液(Beyotime，C0219)稀释至浓度为100μM的工作溶液。培养于玻璃底容器的HeLa细胞(ATCC，CCL-2)吸去培养基后，用HBSS溶液洗涤两次，加入工作溶液室温孵育5分钟。
2.孵育结束后，将溶液吸去，细胞置于Zeiss LSM710激光扫描共聚焦显微镜上。在软件辅助下选定标记的范围，采用“Bleach”模式进行激光照射(迭代次数＝250，激光强度＝95％，其余采用默认参数)。
3.照射后的细胞用含有5％胎牛血清的PBS溶液(胎牛血清购买自Gibco公司，货号为10099。PBS溶液购买自索莱宝公司，货号为P1020。取95mL PBS溶液，加入5mL胎牛血清，得到5％胎牛血清的PBS溶液)洗涤两次后，加入终浓度为5μg/mL链霉亲和素-荧光分子偶联物(Bioss，bs-0437P)的5％胎牛血清的PBS溶液(即每毫升5％胎牛血清的PBS溶液含有5μg的链霉亲和素-荧光分子偶联物)，室温孵育5分钟。
4.孵育结束后，细胞将再次用HBSS溶液洗涤两次。
5.若需要多轮标记，在最后一次HBSS溶液洗涤后，向细胞中加入工作溶液并重复步骤1-4。细胞标记的流程与具体结果如附图2与3所示。
实施例3对ONPF-biotin标记的细胞进行分选与单细胞测序
1.向标记完成后的细胞中加入终浓度为0.25％的胰酶(Thermo，25200056)，37℃孵育5min。吸去胰酶，细胞用含有5％胎牛血清的PBS吹散后进行流式分选。流式信号中可以观测到明显的细胞分群，将阳性群落选中并分离。结果如图5所示，图5为ONPF-biotin对活细胞进行标记后，利用流式细胞仪对细胞标记信号进行检测的结果图，从图中可以看出通过流式细胞仪检测到明显的标记信号的为阳性群落。
2.将步骤1阳性细胞分选至预加裂解液的96孔板中，每孔一个细胞。每个孔中的裂解液体积为4μL，所述裂解液中含有4单位Ambion RNA酶抑制剂(Invitrogen，AM2684)，0.5％Triton X-100(Sigma，T9284)，2.5μM反转录引物，以及2.5mM dNTP(NEB，N0447)。反转录引物序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(V代表A/C/G，N代表A/C/G/T)。细胞分离至孔板后，将孔板加热至72℃并保持3分钟以裂解细胞。
3.随后对每个孔得到的RNA进行反转录。反转录体系为6μL RT Mix(包含10单位SuperScript II逆转录酶(Invitrogen，18064014)，1单位Ambion RNA酶抑制剂，Superscript II一链缓冲液(Invitrogen，18064014)，5mM二硫苏糖醇，1M甜菜碱，6mM氯化镁，1M TSO引物)以及4μL裂解产物。TSO引物序列为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGG-3’。反转录程序设置为42℃ 90分钟，50℃-42℃十个循环，70℃ 15分钟。
4.将第3步得到的cDNA产物进行PCR扩增。引物序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’。
5.PCR产物利用AMPure XP SPRI磁珠(Beckman,A63882)进行纯化。对每个细胞，使用5ng cDNA产物进行二代测序文库构建。文库构建采用Vazyme TruePrep DNA LibraryPrep Kit V2试剂盒(Vazyme，TD502)进行。
6.构建完成的文库使用5200Fragment Analyzer进行质控。通过质控的文库合并后进行二代测序，每样品共下机140万条左右的Reads进行后续分析。对癌细胞迁移过程的空间单细胞转录组测序分析流程如图4所示，结果如图6所示。图6a为标记癌细胞的空间范围。将高迁移活性的癌细胞和靠内的低迁移活性的癌细胞使用ONPF-biotin探针进行标记和分选。对这些细胞进行单细胞测序后，降维分析图可以鉴定出两个细胞群体，如图6b所示。通过差异基因分析，我们鉴定到许多在高迁移活性细胞中上调或下调的基因，如图6c所示。将这些基因与UMAP图进行叠加，可以发现在外部细胞上调的基因确实更多地、但不均匀地分布在外部细胞中，如图6d所示。将高迁移活性细胞中显著上调的基因进行功能聚类分析，发现细胞迁移(Cell migration)、伤口响应(Response to wounding)以及细胞运动(Cell motility)相关的通路显著富集(图6e)。从鉴定地基因列表中挑选两个进行免疫荧光实验验证，可以看到其结果与测序结果高度一致。这说明本发明的方法能够灵敏高效地实现空间单细胞转录组测序。
实施例4对ONPF-biotin标记的细胞进行免疫印记分析
去实施例2中的制备的ONPF-biotin标记的细胞对细胞裂解液的蛋白质进行免疫印记分析，结果显示有大量蛋白质带有biotin信号，如图7所示。
实施例5以ONPF-Cy5作为探针分子的对比例
1.在实验室通过化学合成的方法制备ONPF-Cy5备用，所述ONPF-Cy5为结构式为
Figure BDA0003425985850000101
的化合物。
2.按照实施例2中的步骤，将其中的ONPF-biotin换成ONPF-Cy5进行细胞标记。
3.将步骤2中制备的ONPF-Cy5标记的细胞按照实施例3中步骤1和2进行流式分析标记后细胞表面的荧光信号。结果显示，虽然光照后Cy5的信号明显增强，但不光照的负对照组也存在较高信号(图8a)。这很可能是由于活细胞对染料分子的吸附导致的。对比而言，实施例3中的通过探针结构优化设计得到ONPF-biotin，能在光照后对活细胞进行很好的标记，并且在不光照的负对照中几乎没有背景信号，成功实现了光控活细胞表面的标记。(图8b)
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.ONPF-biotin在空间单细胞转录组测序技术中的应用，所述ONPF-biotin的结构式为：
Figure FDA0003425985840000011
2.一种用于空间单细胞转录组测序的探针，其特征在于，所述探针为ONPF-biotin，所述ONPF-biotin的结构式为：
Figure FDA0003425985840000012
3.一种权利要求2所述探针的制备方法，其特征在于，包括将AzONPF与DBCO-biotin加入到二甲亚砜和水的混合溶液中，反应，得到ONPF-biotin的步骤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述AzONPF与DBCO-biotin的摩尔比为1:1；反应条件为室温反应2小时。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述AzONPF的制备方法为：
1)将2-叠氮乙醇溶解于吡啶中，加入氯甲酰基-(4-硝基)-苯酚酯并搅拌均匀，反应，纯化后得到化合物1，所述化合物1的结构式为
Figure FDA0003425985840000013
2)将化合物1溶解于二氯甲烷中，向体系中加N-叔氧羰基-1,2-乙二胺和三乙胺，室温过夜反应，反应结束后，将产物进一步萃取纯化，得到化合物2；
3)将化合物2溶解于二氯甲烷中，加入三氟乙酸，室温反应，得到化合物3；
4)将2-羟基-5-甲酰基-苯甲酸甲酯溶解于二甲基甲酰胺中，加入碳酸铯，冰浴下加入邻硝基苄溴的二甲基甲酰胺溶液，体系升至室温并反应过夜；反应结束后，将产物进一步萃取纯化，得到化合物4；
5)将化合物4溶解于甲醇/四氢呋喃中，冰浴下缓慢加入硼氢化钠，搅拌下继续反应，反应结束后，将产物进一步萃取纯化，得到化合物5；
6)将化合物5溶解于四氢呋喃中，加入氢氧化锂的水溶液，室温反应过夜；反应结束后，将产物进一步萃取纯化，将得到的白色粗产物重新溶解在二甲基甲酰胺中，并加入化合物3，L N,N-二异丙基乙胺，羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应过夜；反应结束后，将产物进一步萃取纯化，得到白色固体AzONPOH；
7)将AzONPOH溶解于二氯甲烷中，冰浴下缓慢加入双(2-甲氧乙基)氨基三氟化硫的二氯甲烷溶液，将体系升至室温并反应过夜；反应结束后，将产物进一步萃取纯化，得到白色固体AzONPF。
6.一种基于光控细胞标记的空间单细胞转录组测序方法，其特征在于：使用权利要求2所述的探针为ONPF-biotin。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)使用ONPF-biotin对待测序细胞进行标记；
2)对ONPF-biotin标记的细胞进行分选与单细胞测序。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的标记方法包括：
11)将待检测细胞使用ONPF-biotin的HBSS溶液进行孵育；
12)将步骤11)中孵育后的细胞，去除溶液，进行激光照射；
13)照射后的细胞洗涤两次后，加入含有链霉亲和素-荧光分子偶联物的培养基，室温孵育；孵育结束后，细胞将再次用HBSS溶液洗涤两次；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的标记次数为多次，在步骤13的最后一次HBSS溶液洗涤后，重复步骤11)-13)。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括如下步骤：
21)向标记完成后的细胞中加入胰酶，孵育，吸去胰酶，细胞用含有5％胎牛血清的PBS吹散后进行流式分选，将流式信号中可以观测到明显的细胞分群，将阳性群落选中并分离；
22)将阳性细胞分选至预加裂解液的96孔板中，每孔一个细胞，进行细胞裂解；
23)随后分别对每个孔得到的RNA进行反转录；得到cDNA；
24)分别将第3步得到的cDNA产物进行PCR扩增；
25)分别将每个孔的PCR产物利用磁珠进行纯化，并进行二代测序文库构建；
26)构建完成的文库使用5200Fragment Analyzer进行质控；
27)通过质控的文库合并后进行二代测序，每样品共下机140万条左右的Reads进行后续分析，即可得到空间单细胞转录组测序结果。
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