KR20060015512A - 신규 기능성 펩티드 핵산 및 그 제법 - Google Patents
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Abstract
기능성 PNA 올리고머를 제조하는 방법에 있어서, 보호된 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 가지는 PNA 모노머 유닛을, Boc-리신(Fmoc)-OH 또는 Fmoc-리신(Alloc)-OH와 반응시켜 PNA 올리고머를 합성한 후, 상기 PNA 올리고머에 유리 카르본산을 가지는 기능성 분자를 도입하고, 또한 상기 보호기의 탈보호를 실시하는 것을 포함한 방법에 의해서, 코스트 퍼포먼스가 뛰어나고, 또한 기능성 분자를 초고속으로 도입하는 것이 가능해지고, 게다가, 해당 방법에 의해서 합성되는 화합물 및 전구체 PNA 모노머 유닛으로서 기능하는 Boc-리신(Fmoc)-OH 또는 Fmoc-리신(Alloc)-OH를 제조할 수 있다.
Description
본 발명은, 리신을 사용한 기능성 펩티드 핵산 올리고머 및 그 중간체의 신규 제조 방법에 관한 것이다.
핵산은 생물의 유전 정보를 담당하는 DNA 및 RNA이다. 이것에 대해서, 펩티드 핵산(PNA)이란, 핵산의 당인산 골격을 N-(2-아미노에틸)글리신 골격으로 변환한 수식(修飾) 핵산이다(도 1). DNA/RNA의 당인산 골격은 중성 조건에서 음전하를 띠고 있어 상보쇄(complementary chains)간의 정전기적인 반발이 있지만, PNA의 골격 구조(backbone structure)는 원래 전하를 가지지 않기 때문에, 정전기적인 반발이 없다. 그 때문에 PNA는 종래의 핵산에 비하여, 높은 이중쇄 형성능을 갖고, 높은 염기 서열 인식능을 가진다. 또한, PNA는 생체내 뉴클레아제·프로테아제에 대해 매우 안정하여 분해되지 않기 때문에, 안티센스 분자로서 유전자 치료에 응용하는 것이 검토되고 있다.
종래의 DNA를 매체로 하고 있던 기술을 PNA화하는 것에 의해, 지금까지 극복할 수 없었던 DNA의 결점을 보충하는 것이 가능해졌다. 예를 들면, 유전 정보의 체계적인 해석을 고속으로, 대량으로 실시하기 위한 「DNA 마이크로어레이 (microarray) 기술」, 및 염기 서열을 특이적으로 인식한 것을 형광 발광에 의해 검출할 수 있는 프로브로서 최근 개발된 「몰레큘러 비콘(molecular beacons)」에 응용하는 것이 가능하다. 이것들은 모두 효소 내성이 부족한 DNA를 매체로 하기 때문에, 이러한 기술을 이용할 때에는 엄밀한 샘플링이 요구된다. 이 요구를 만족하는 것이, 상기 기술을 고도화하는데 있어서의 열쇠가 되고 있다.
한편, PNA는 효소에 대해 완전한 내성을 가지므로, DNA 마이크로어레이 기술 및 몰레큘러 비콘에 있어서 PNA를 DNA에 대용하는 것에 의해서, 상기 기술의 결점이 극복되어, 한층 더 장점이 나타날 것이라고 기대되고 있다.
DNA 마이크로어레이 기술 및 몰레큘러 비콘 이외에도 PNA화하는 것으로 발전이 기대되는 분야는 많지만, 이들에 있어서는 PNA의 효율적인 기능화, 즉 PNA 모노머에의 기능성 분자의 효율적인 도입에 의한 신규 PNA 모노머의 설계가 필요하다.
PNA 올리고머의 합성 방법에는 통상의 고상(solid-phase) 펩티드 합성법을 이용하므로, PNA 모노머 유닛(unit)을 PNA의 골격 구조에 의해서 분류하면, Fmoc형 PNA 모노머 유닛과 Boc형 PNA 모노머 유닛의 2 종류가 포함된다(도 2).
Fmoc형 PNA 모노머 유닛의 합성 방법은 이미 확립되어 있고, 게다가 그 올리고머의 합성은 일반적인 DNA 자동 합성기에 의해서 가능하기 때문에, 아래와 같은 루트
[화학 4]
(X는 구아닌, 티민, 시토신 또는 아데닌을 나타낸다)
에 의해서, 소량 스케일로의 합성이 가능해지고 있다.
또한, Fmoc란 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Boc란 tButoxycarbonyl, Alloc란는 Allyloxycarbonyl을 의미한다.
당초, PNA에는 아래와 같은 Boc형 PNA 모노머 유닛
[화학 5]
이 채용되었고, 그 후, 보다 효율이 좋은 합성 방법인
[화학 6]
가 확립되었다. 그러나, 전술한 바와 같이 취급이 용이한 Fmoc형이 개발되었기 때문에, Boc형의 사용 빈도는 감소하고 있다.
그러나, 구아닌·티민·시토신·아데닌 4종류의 핵산 염기 이외의 기능성 분자를 도입할 때, 예를 들면 광기능성 분자를 도입할 때, 도입하는 기능성 분자가 알칼리 조건에 불안정한 경우가 많기 때문에, 알칼리 조건을 사용하지 않는 Boc형 PNA 골격 구조의 유용성은 높다. 「t-부톡시카보닐아미노에틸아민 및 아미노산 유도체의 제조 방법」에 관해서는, 본 발명자들이 특허출원 2000-268638호로서 이미 특허 출원중이다.
이외에도, 광기능성 올리고 PNA의 모노머 유닛의 합성예는, 과거에 5예가 알려져 있다. 이것들 모두가 상기 루트를 이용하고 있지만, 그 수율에 대해서는 기재가 없거나, 또는 극히 낮은 것 밖에 없다(Peter E. Nielsen, Gerald Haaiman, Anne B. Eldrup PCT Int. Appl. (1998) WO 985295 A1 19981126, T. A. Tran, R.-H. Mattern, B. A. Morgan (1999) J. Pept. Res, 53, 134-145, Jesper Lohse 등. (1997) Bioconjugate Chem., 8, 503-509, Hans-georg Batz, Henrik Frydenlund Hansen 등. Pct Int. Appl. (1998) WO 9837232 A2 19980827, Bruce Armitage, Troels Koch 등. (1998) Nucleic Acid Res., 26, 715-720). 또한, 이용되는 화합물의 구조가 알칼리성 조건에 비교적 안정한 것이 특징이기 때문에, 알칼리성 조건에 불안정한 발색단(chromophore)이 붙으면, 상기 종래법과 유사한 방법, 즉 하기 루트 A
[화학 7]
[화학 8]
로는 효율 좋게 합성할 수 없다고 예상되었다.
따라서, 일반적으로 광기능성 분자 등의 기능성 분자는 고가의 경우가 많기 때문에, 보다 목적에 부합하는 기능성 PNA의 합성 방법, 즉, ① 기능성 PNA 모노머 유닛의 설계에 있어서의, 기능성 분자의 PNA 골격 구조에의 효율적인 도입, ② 코스트 퍼포먼스(cost performance)를 고려한 합성 루트, 및 ③ 유전자 진단약으로서의 응용에 적용시키기 위한, 이들 기능성 분자를 초고속으로 도입하는 방법이 탐구 되었다.
상기 과제를 감안하여, 본 발명자들은, 기능성 PNA 모노머의 신규 제조 방법으로서, 하기 루트 B
[화학 9]
에 나타낸 바와 같이, PNA 골격 구조에 t-부톡시카보닐아미노에틸아민 유도체 6을 이용하여, 1의 펜타플루오로페닐기를 포함하는 활성 에스테르체 5와 축합하여 거의 정량적으로 광기능성 PNA 모노머 4를 합성하는 방법을 발견했다.
또한, 본 발명자들은, 기능성 PNA 모노머를 합성하는 별법으로서 PNA 골격 구조에 상기 t-부톡시카보닐아미노에틸아민 유도체 6 대신에 벤질옥시카보닐-ω-아미노산 유도체를 이용하는 방법(루트 C)을 발견했다. 이러한 방법에 대해서는, 이미 특허 출원이 이루어져 있다.
따라서, 최종적으로 기능성 PNA를 합성하기 위한 방법으로서, 상기 루트 B 및 루트 C의 어느쪽을 이용하는 방법에 의해, 기능성 PNA 모노머를 합성한 후에, 그것들을 중합하는 방법이 공업적으로도 확립되고 있다. 즉, 현재까지의 기능성 PNA의 합성법에 의해, PNA 프로브로서 이용되는 기능성 PNA를 공업적으로 대량 합성하는 것은 가능하게 되고 있다.
한편, 코스트 퍼포먼스의 향상 및 기능성 분자를 초고속으로 도입하는 것을 목적으로 하는, 기능성 PNA를 합성하는 방법의 개량도 이루어지고 있다. 예를 들면, 상기 기능성 PNA 모노머 유닛을 이용하는 방법과는 다른 어프로치로서, 하기의 전구체 PNA 모노머 유닛을 이용하는 것에 의해서, 포스트(post) 합성적으로 기능성 분자를 PNA 올리고머에 도입하는 방법이 보고되고 있다(0liver Seitz; Tetrahedron Letters 1999, 40, 4161-4164.).
[화학 10]
상기 방법은, 상기 전구체 PNA 모노머 유닛을 PNA 올리고머에 도입한 후, 기능성 분자를 더 도입하는 것에 의해서 기능성 PNA를 합성하는 것이다.
그러나, 상기 방법에 있어서는, 도입할 수 있는 기능성 분자의 종류가 한정되는 등의 결점이 있다.
예를 들면, 하기 도에 나타낸 바와 같이, 시판되고 있는 광기능성 분자인 숙신이미드(succinimide)에스테르를 도입하지 못하고, 도입하기 위해서는 Fmoc-Gly 등의 링커(linker)를 우선 도입할 필요가 있지만, 결과적으로 상기 화합물은 사용하기 어려운 것으로 되어 있다.
[화학 11]
그런데, 본 발명자들은, 전구체 PNA 모노머 유닛의 구조를 최적화하는 것에 의해서, 놀랍게도, 종래법에서의 상기 과제를 극복하여, 코스트 퍼포먼스가 뛰어나고, 또한 기능성 분자를 초고속으로 도입할 수 있는, 극히 광범위에 걸친 기능성 PNA를 합성할 수 있음을 발견했다.
즉, 보호기에 의해 보호된 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 가지는 PNA 모노머 유닛을, 하기 도에 나타내는 Fmoc-ω-아미노산-BocPNA-OH(IV)와 반응시켜 PNA 올리고머를 합성한 후, 상기 PNA 올리고머에 유리 카르본산을 가지는 기능성 분자를 포스트 합성적으로 도입하는 것에 성공했다.
[화학 12]
(식중, n는 1∼15까지의 정수를 나타낸다)
상기 합성 방법은, 기능성 분자를 도입한 후에, 다른 기능성 분자의 도입을 더 실시할 수 있다. 또한, 도입되는 기능성 분자가, 광반응성 기능 분자, 막투과성 기능 분자, 장기(臟器;organ) 선택성 기능 분자, 살균성 기능 분자, 분자 파괴성 기능 분자, 유착성(adhesive) 기능성 분자 및 분자 인식성 기능 분자로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 도입하는 기능성 분자로서 시판의 숙신이미드에스테르를 사용할 필요가 없고, 카르본산을 가지는 화합물이면 문제 없이 이용할 수 있는 한편, 정량적으로 도입할 수 있으므로, 상기 합성 방법은 코스트 퍼포먼스에 극히 우수하다.
또한, 상기 전구체 PNA 모노머 유닛을 기능성 PNA 올리고머에 도입한 후에 레진(resin)을 분할하는 것에 의해, 각각의 레진에 다른 기능성 분자를 도입할 수 있으므로, 극히 고속의 기능성 PNA 올리고머의 합성 수법을 개발하는 것이 가능해진다.
이 방법에 따라 효율적인 합성이 가능하게 되는 기능성 PNA 올리고머의 예로서, 하기 일반식(V)
[화학 13]
(식중, B는, 서로 독립하고, 동일 또는 다르고, 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민이며, R은, 서로 독립하고, 동일 또는 다르고, Fmoc기 또는 기능성 카르본 산 유도체이며, R1은, 수소 원자 또는 기능성 카르본산 유도체이며, a∼h는 0∼10의 정수이며, X1∼X3, Y1, Y2 및 Z1∼Z5는 모두 0 이상의 정수이며, X1＋X2＋X3≥0이며, Y1＋Y2＞0이며, Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5≥0이다. 다만, X1＋X2＋X3 및 Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5가 동시에 0인 경우는 없고, X1＋X2＋X3=0의 경우, R1은 기능성 카르본산 유도체이다.)로 나타내는 화합물에 있어서, Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5=0이며, R1이 수소 원자인 화합물을 들 수 있다.
그런데, 세포중에 도입하기 위한 형광 프로브로서, 지금까지 DNA 올리고머·RNA 올리고머·PNA 올리고머가 이용되고 있지만, 이것들을 세포내에 도입하기 위해서는, 당연히 세포막을 통과시키지 않으면 안된다. 그러나, 세포막은 막표면이 음전하를 띠고 있기 때문에, 원래 음전하로 대전하고 있는 DNA/RNA 올리고머를 도입하는 것은 매우 곤란하다.
한편, PNA 올리고머는 전기적으로 중성이지만, 막투과하기 어렵다고 하는 결과가 얻어지고 있다. 따라서, PNA 올리고머를 세포내에 도입하는 때에는, 막표면을 사전처리하여 그 도입을 쉽게 하거나, 또는 트랜스팩션(transfection) 시약을 이용해 도입하지 않을 수 없는 것이 현상황이다.
그러나, 이러한 처리를 실시하여 PNA 올리고머를 도입했을 경우에, 프로브의 기능이 발휘되었다고 해도, 본래 생체가 나타내 보이는 거동을 정확하게 표현하고 있음이 반드시 보증되지는 않는다. 게다가, 이것은 세포 1개의 경우이며, 다세포( 개체)에서의 이용까지는 도저히 불가능하다.
이러한 현상 및 관점으로부터, 막투과성 기능을 가지는 형광 PNA 프로브의 개발이 유용하다고 생각되고 있다.
한편, 막투과성 기능을 가지는 형광 PNA 프로브는 이미 존재한다. 예를 들면, ① 막투과성 기능을 가지는 올리고 펩티드를 PNA에 결합시킨 것, ② 막투과성 기능을 가지는 인지질을 PNA에 결합시킨 것을 들 수 있다. 그렇지만, 이것들은 막투과한 후 세포내에서 프로테아제 등의 효소에 의해 PNA 이외의 부분이 분해되어, 세포내에 체류해 버리는 것이 예상된다. 이것은, 타겟을 포착할 수 없었던 과잉인 PNA 프로브가 막투과성 기능을 잃어, 그 후의 세정 과정에서 세포외에 나오기 어려워지는 것에 이르기 때문에, 본래 세포가 가지고 있는 유전자 발현계를 정확하게 표현할 수 없는 것을 의미한다.
그런데, 본 발명자들은, Fmoc-ω-아미노산-BocPNA-OH를 함유한 전구체 PNA 올리고머를 이용하고, 막투과성 기능을 가지는 아미노산 유도체를 포스트 합성적으로 도입하는 것에 의해, 번잡한 사전 처리·후처리를 포함하지 않는, 즉 살아있는 세포를 그대로 이용하여, 유전자 발현계를 정확하게 분석할 수 있는 신규 형광 PNA 프로브의 설계에 성공했다.
그러나, 이러한 전구체 PNA 올리고머는 Fmoc-ω-아미노산-BocPNA-OH만이 유효할 뿐만 아니라, 필수 아미노산인 리신 유도체로도 그 역할을 대행하는 것이 가능하고, 취급하기 쉬움·입수의 용이성을 고려한 신규 형광 PNA 프로브의 설계가 향 후 필요하게 될 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명은, 코스트 퍼포먼스가 뛰어난 한편 기능성 분자를 초고속으로 도입할 수 있는, 기능성 PNA의 신규 합성 방법 및 이에 이용하는 화합물, 및 신규 기능성 PNA를 제공하는 것을 목적으로 한다.
발명의 개시
상기 과제를 감안하여 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은, 전구체 PNA 모노머 유닛의 구조를 최적화하는 것에 의해서, 놀랍게도, 종래법에 있어서의 상기 과제가 극복되는 한편, 극히 광범위에 걸쳐 기능성 PNA를 합성할 수 있는 것을 발견하여, 이하와 같은 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
(1). 보호기에 의해 보호된 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 가지는 PNA 모노머 유닛을, 일반식(I)에 의한 Boc-리신(Fmoc)-OH (Fmoc란 9- Fluorenylmethoxycarbonyl을 나타낸다.), 또는 하기의 일반식(II)에 의한 Fmoc-리신(Alloc)-OH(Fmoc란 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Boc란 tButoxycarbonyl, Alloc란 Allyloxycarbonyl을 나타낸다.)와 반응시켜 PNA 올리고머를 합성한 후, 상기 PNA 올리고머에 유리 카르본산을 가지는 기능성 분자를 도입하고, 상기 보호기의 탈보호를 실시하는 것을 포함하는, 기능성 PNA 올리고머의 제조방법.
(2). 기능성 PNA 올리고머의 제조방법은, 기능성 분자를 도입한 후에, 또한 다른 기능성 분자의 도입을 실시하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)의 방법.
(3). 도입되는 기능성 분자가, 광반응성 기능 분자, 막투과성 기능 분자, 장기 선택성 기능 분자, 살균성 기능 분자, 분자 파괴성 기능 분자, 유착성 기능성 분자 및 분자 인식성 기능 분자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 (1)의 방법.
(4). 도입되는 기능성 분자가, 광기능성 분자 및 막투과성 기능 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 (2), (3)의 방법.
(5). 광기능성 분자가, 하기의 Cy3, Cy5, Bodipy, 피렌(pyrene), 나프탈이미드(naphthalimide), 나프탈디이미드(naphthaldiimide), FAM, FITC, ROX, TAMRA 또는 Dabcyl이며, 막투과성 기능 분자가 수용성 아미노산 유도체인 것을 특징으로 하는 상기 (4)의 방법.
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(6). 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 보호하는 보호기가, 벤질옥시카르보닐기(Z기)인 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(5)중의 어느 하나의 방법.
(7). PNA 올리고머의 합성이, Boc법용 및 Fmoc법용 고상(solid-phase) 담체를 이용한 PNA쇄에 있어서의 축합·신장을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(6)중의 어느 하나의 방법.
(8). Boc법용 고상 담체가 고상 Boc법에서 펩티드 합성에 사용하는 메틸벤즈히드릴아민(methylbenzhydrylamine) 수지(MBHA)인 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(7)중의 어느 하나의 방법.
(9). Fmoc법용 고상 담체가, MBHA, 폴리스틸렌을 클로로메틸화한 수지(Merrifield 수지), 4-히드록시벤질알코올로 변형된 Merrifield 수지(Wang 수지), Boc-아미노산-링커를 결합시킨 아미노메틸 수지(PAM 수지), N-Fmoc-N-메톡시-링커를 결합시킨 아미노메틸 수지(Weinreb 수지), 폴리스틸렌에 p-니트로벤조페논옥심을 결합시킨 수지(Oxime 수지), 폴리스틸렌을 이용하여 트리틸화한 수지(Trityl 수지)인 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(7)중의 어느 하나의 방법.
(10). 유리 카르본산을 가지는 기능성 분자의 도입이, Boc법에 있어서의 Fmoc기를 피페리딘 처리에 의해서, 또는 Fmoc법에 있어서의 Alloc기를 아연 초산 용액 처리에 의해서, 선택적으로 탈보호하여 얻어지는 1급 아미노기와의 탈수 축합에 의해서 행해지는 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(9)중의 어느 하나의 방법.
(11). 하기 a)∼d)：
a) Boc-리신(Fmoc)-OH를 PNA 올리고머중에 도입하는 공정에 있어서, PNA 모노머 유닛을, Boc-리신(Fmoc)-OH와 반응시켜 PNA 올리고머를 제조하는 방법；
b) 상기 PNA 올리고머로부터 기능성 PNA 올리고머를 제조하는 공정에 있어서, PNA 올리고머에의 기능성 분자의 도입이, Fmoc기를 피페리딘 처리에 의해서 선택적으로 탈보호하여 얻어지는 1급 아미노기와의 탈수 축합에 의해서 행해지는 방법 중의 1 또는 2 이상을 포함하는 방법；
c) Fmoc-리신(Alloc)-OH를 PNA 올리고머중에 도입하는 공정에 있어서, PNA 모노머 유닛을, Fmoc-리신(Alloc)-OH와 반응시켜 PNA 올리고머를 제조하는 방법；
d) 상기 PNA 올리고머로부터 기능성 PNA 올리고머를 제조하는 공정에 있어서, PNA 올리고머에의 기능성 분자의 도입이, Alloc기를 아연 초산 용액 처리에 의해서 선택적으로 탈보호하여 얻어지는 1급 아미노기와의 탈수 축합에 의해서 행해지는 방법 중의 1 또는 2 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 (2) 기재의 방법.
(12). 하기 일반식(Ⅲ)
[화학 24]
(식중, B는, 서로 독립하고, 동일 또는 다르고, 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민이며, R은, 서로 독립하고, 동일 또는 다르고, Fmoc기 또는 기능성 카르본산 유도체이며, R1은, 수소 원자 또는 기능성 카르본산 유도체이며, R2는, 수소 원자, 아미노기, 수산기, 티올기를 포함한 유도체 또는 기능성 카르본산 유도체이며, a∼f는 0∼
의 정수이며, X1∼X3, Y1, Y2 및 Z1∼Z5는 모두 0 이상의 정수이며, X1＋X2＋X3≥0이며, Y1＋Y2＞0이며, Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5≥0이다. 다만, X1＋X2＋X3 및 Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5가 동시에 0인 경우는 없고, X1＋X2＋X3=0의 경우, R1은 기능성 카르본산 유도체이다.)로 나타내는 화합물.
(13). X1＋X2＋X3=3이며, Y1＋Y2=15인 것을 특징으로 하는 상기 (12) 기재의 화합물.
(14). X1=3이며, Y1=15인 것을 특징으로 하는 상기 (13) 기재의 화합물.
(15). R 또는 R1이 세포막 투과성 기능 분자 유도체인 것을 특징으로 하는 상기 (14) 기재의 화합물.
(16). R1이 기능성 카르본산 유도체인 것을 특징으로 하는 상기 (15) 기재의 화합물.
(17). X1=Z1=1인 것을 특징으로 하는 상기 (15) 또는 (16) 기재의 화합물.
(18). Y1≥2이며, Z2=1인 것을 특징으로 하는 상기 (15)∼(17)중의 어느 하나의 화합물.
(19). a≤6이며, b≤4이며, f≤6인 것을 특징으로 하는 상기 (15)∼(18)중의 어느 하나의 화합물.
(20). R1이 광기능성 카르본산 유도체인 것을 특징으로 하는 상기 (15)∼(19)중의 어느 하나의 화합물.
본 발명은, Boc-리신(Fmoc)-OH 또는 Fmoc-리신(Alloc)-OH를 PNA 올리고머에 도입한 후, 기능성 분자를 포스트 합성적으로 도입하는 것에 의해, 거의 정량적으로 광기능성 PNA 올리고머를 합성할 수 있는 것에 성공한 것이다.
한편, Fmoc, Boc, Alloc의 각 정의에 대해서는, 증거를 설명하는 상기 (1)에서 나타낸 바 대로다.
상기 특징에 의해, 본 발명의 제조 방법에 있어서는, 도입하는 기능성 분자로서 시판의 숙신이미드에스테르를 사용할 필요가 없고, 카르본산을 가지는 화합물이면 문제 없이 이용할 수 있는 한편 정량적으로 도입할 수 있다. 그 때문에, 본 발명에 의한 제조 방법은 코스트 퍼포먼스에 극히 우수하다.
또한, 상기 전구체 PNA 모노머 유닛을 기능성 PNA 올리고머에 도입한 후에 레진을 분할하는 것에 의해, 각각의 레진에 다른 기능성 분자를 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 제조 방법에 의하면, 극히 고속의 기능성 PNA 올리고머의 합성 수법을 개발하는 것이 가능해진다.
본 발명의 방법에 의해 효율적인 합성이 가능하게 되는 기능성 PNA 올리고머의 예로서, 하기 일반식(Ⅲ)
[화학 25]
(식중, B는, 서로 독립하고, 동일 또는 다르고, 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민이며, R은, 서로 독립하고, 동일 또는 다르고, Fmoc기 또는 기능성 카르본산 유도체이며, R1은, 수소 원자 또는 기능성 카르본산 유도체이며, R2는, 수소 원자, 아미노기, 수산기, 티올기를 포함한 유도체 또는 기능성 카르본산 유도체이며, a∼f는 0∼
의 정수이며, X1∼X3, Y1, Y2 및 Z1∼Z5는 모두 0 이상의 정수이며, X1＋X2＋X3≥0이며, Y1＋Y2＞0이며, Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5≥0이다. 다만, X1＋X2＋X3 및 Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5가 동시에 0인 경우는 없고, X1＋X2＋X3=0의 경우, R1은 기능성 카르본산 유도체이다.)로 나타내는 화합물에 있어서, Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5=0이며, R1이 수소 원자인 화합물을 들 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 일반식(Ⅰ)로 나타내는 화합물에 있어서 동일 또는 다른 기능성 분자를, 임의의 복수의 위치에 도입하는 것도 가능해진다. 즉, 상기 전구체 PNA 모노머 유닛 s를 이용하여 PNA 올리고머를 도입한 후, 피페리딘 처리 또는 아연 초산 용액 처리중의 어느 쪽과, 기능성 분자의 포스트 합성적 도입을 일괄해 실시하는 것에 의하는 것이지만, 이것은 PNA 올리고머의 세포막 투과 기능을 향상시키는 안테나페디아(antennapedia)를 고속으로 설계하는데 있어서, 빠뜨릴 수 없는 것이다. 이 점에 있어서도, 본 발명에 의한 방법은 극히 뛰어난 것이다.
이와 같이 제조되는 화합물의 예로서, 상기 일반식(Ⅰ)에 있어서, Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5＞0이며, R이 세포막 투과성 분자 유도체이며, R1이 기능성 카르본산 유도체인 것을 들 수 있다.
이 프로브는 크게 형광 표지 영역·세포막 투과성 기능 영역·분자 인식 영역의 3개로 나눌 수 있고, 각각을 링커 부위(Z1∼Z5의 첨자 첨부로 나타내지는 부분)를 개입시켜 결합시킨 형태를 하고 있다.
형광 표지 화합물은 시판의 것도 이용할 수 있고, 이미 본 발명자들이 PCT 출원을 실시한 신규 형광 표지화 PNA 모노머 유닛도 이용할 수 있다.
분자 인식 부위는 시판의 PNA 유닛을 이용해 합성한다. 이것의 특징은, 기능성 분자를 포스트 합성적으로 도입하기 위해서, 전구체 유닛으로서 Boc-리신(Fmoc)-OH 또는 Fmoc-리신(Alloc)-OH를 막투과성 기능 영역부에 이용하고 있는 것이다. 상기 전구체 유닛은 시판되고 있고, 이것을 복수개 나란히 도입한 후, 상기 한 바와 같이 동일 기능성 분자를 일괄 도입할 수 있는 것을 특징으로 하고 있다.
따라서, 본 발명에 의하면, 광기능성 분자로 한정되는 일 없이, 다종 다양한 기능성 분자를, PNA중에 용이하고 또한 극히 효율적으로 도입할 수 있게 된다.
이러한 기능성 분자로서, Cy3형, Cy5형, Bodipy형, Naphthalimide형, Naphthaldiimide형, Flavin형, Dabcyl형, Biotin형, FAM형, Rhodamine형, TAMRA형, ROX형, HABA형, Pyrene형, Coumarine형 등의 광기능성 모노머 유닛, 막투과성 기능 분자, 장기 선택성 기능 분자, 살균성 기능 분자, 분자 파괴성 기능 분자, 유착성 기능성 분자 또는 분자 인식성 기능 분자 등을 들 수 있다.
즉, 본 발명에 있어서의 「기능성」이란, 광기능성 뿐만 아니라, 막투과성, 장기 선택성, 살균성, 분자 파괴성, 유착성 또는 분자 인식성 등을 포함한, 어느 특정의 변형을 실시하는 것에 의해서, 화합물에 새롭게 부여되는 여러 가지 기능 모두를 의미하는 것이다.
또한, 본 발명에 있어서의 「기능성 PNA」이란, PNA 모노머끼리가 2-(N-아미노에틸)글리신 골격에 의해서 직접 결합한 것 뿐만 아니라, 그 사이에 링커로서의 탄화수소쇄와 기능성 분자를 도입하는 전구체인 리신 골격 등을 포함하는 것도 의미하는 것이다.
여기서, 본 발명에 의한 방법의 특징을 더욱 상세하게 설명한다.
발명을 실시하기
위한 최선의 형태
본 발명에 의한 올리고 PNA를 합성하는 루트는, 전형적으로는, 하기 도
[화학 26]
[화학 27]
에 나타내는 대로다.
한편, MBHA는, 고상 Boc로 펩티드 합성에 사용하는 메틸벤즈히드릴아민(methylbenzhydrylamine) 수지이며, Wang는, 4-히드록시벤질알코올로 변형된 Merrifield 수지이며, 이것들에 대해서는, 상기한 바와 같다.
다음에, [화학 26]에 관한 제조공정중, 하기 도
[화학 28]
에 나타낸 바와 같이, Boc-리신(Fmoc)-OH를 이용하여, 올리고머 Ia를 합성한다. 구체적으로는, Z기(N-벤질옥시카르보닐기) 등으로 보호된 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 가지는 PNA 모노머 유닛을, 전구체 PNA 모노머 유닛과 반응시켜, Boc법용 고상 담체를 이용해 PNA쇄를 순차로 축합·신장하게 한다.
PNA쇄의 축합에 있어서는, 미리 Boc기를 제거해 둘 필요가 있지만, 그 방법에 제한은 없고, 일반적인 방법이 이용된다. 여기에 계속되는 축합에는, HATU, HBTU 및 BOP 등의 일반적인 축합제가 이용된다.
또한, 고상 담체에 관해서는, Boc법용의 것이면 특히 제한은 없지만, 특히 MBHA가 적합하게 이용된다.
다음에,[화학 26]에 관련되는 제조 공정중, 하기 도
[화학 29]
에 나타낸 바와 같이, 피페리딘 처리에 의해서 Fmoc기를 선택적으로 탈보호하여 아미노기로 하고, Ib를 얻고, 또한 하기 도
[화학 30]
에 나타낸 바와 같이, 상기 Ib의 상기 아미노기에 유리 카르본산을 가지는 기능성 분자를 탈수 축합하여 Ic를 얻는다.
상기 카르본산으로서 특히 제한은 없지만, 반응성의 점에 있어서는 지방족 카르본산이 방향족 카르본산을 상회하기 때문에, 지방족 카르본산을 이용하면 제조의 효율이 높고 바람직하다.
또한, 피페리딘 처리에 의한 Fmoc기의 탈보호는, 어느 정도의 시간을 들이는 것에 의해서 적합하게 행해진다. 특히, 20∼40분이 적합하고, 가장 적합하게는 30분이었다.
축합제의 종류에 특히 제한은 없고, 상기 PNA쇄의 축합과 동일하게, HATU, HBTU 및 BOP 등의 일반적인 축합제가 이용된다.
또한, 기능성 분자의 도입은, Boc-리신(Fmoc)-OH를 축합한 후, 즉시 수행하여도 좋고, 또는 Boc-리신(Fmoc)-OH를 포함한 모든 PNA 모노머 유닛을 순차로 축합 한 후에 행하여도 좋다.
마지막으로,[화학 26]에 관련되는 제조 공정중, 하기 도
[화학 31]
에 나타낸 바와 같이, 담체 레진으로부터의 절단과 Z기의 탈보호를 동시에 실시하는 것에 의해서, 목적으로 하는 PNA 올리고머 Id를 얻는다.
절단 및 탈보호는, Fmoc기의 탈보호의 후에 행해지는 한, 그 조건에 특히 제한은 없다. 예를 들면, TFA/TFMSA/p-크레졸(Cresol)/티오아니졸(Thioanisole) 60/25/10/10과 같이 일반적인 조건에서 적합하게 행해진다.
다음에,[화학 27]에 관련되는 제조 공정중, 하기 도
[화학 32]
에 나타낸 바와 같이, Fmoc-리신(Alloc)-OH를 이용하여, 올리고머 IIa를 합성한다.구체적으로는, Boc기 등으로 보호된 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 가지는 PNA 모노머 유닛을, 전구체 PNA 모노머 유닛과 반응시켜, Fmoc법용 고상 담체를 이용하여 PNA쇄을 순차로 축합·신장하게 한다.
PNA쇄의 축합에 있어서는, 미리 Fmoc기를 제거해 둘 필요가 있지만, 그 방법에 제한은 없고, 일반적인 방법이 이용된다. 여기에 계속되는 축합에는, HATU, HBTU 및 BOP 등의 일반적인 축합제가 이용된다.
또한, 고상 담체에 관해서는, Fmoc법용의 것이면 특히 제한은 없지만, 특히 Wang가 적합하게 이용된다.
다음에,[화학 27]에 관련되는 제조 공정중, 하기 도
[화학 33]
에 나타낸 바와 같이, 아연 초산 용액 처리에 의해서 Fmoc기를 선택적으로 탈보호하여 아미노기로 하고, IIb를 얻고, 또한 하기 도
[화학 34]
에 나타낸 바와 같이, 상기 IIb의 상기 아미노기에 유리 카르본산을 가지는 기능성 분자를 탈수 축합하여 IIc를 얻는다.
상기 카르본산으로서 특히 제한은 없지만, 반응성의 점에 있어서는 지방족 카르본산이 방향족 카르본산을 상회하기 때문에, 지방족 카르본산을 이용하면 제조의 효율이 높고 바람직하다.
또한, 아연 초산 용액 처리에 의한 Alloc기의 탈보호는, 어느 정도의 시간을 들이는 것에 의해서 적합하게 행해진다. 10분∼1시간이 적합했다.
축합제의 종류에 특히 제한은 없고, 상기 PNA쇄의 축합과 동일하게, HATU, HBTU 및 BOP 등의 일반적인 축합제가 이용된다.
또한, 기능성 분자의 도입은, Fmoc-리신(Alloc)-OH를 축합한 후, 즉시 행하여도 좋고, 또는, Fmoc-리신(Alloc)-OH를 포함한 모든 PNA 모노머 유닛을 순차로 축합한 후에 행하여도 좋다.
마지막으로, [화학 27]에 관련되는 제조 공정중, 하기 도
[화학 35]
에 나타낸 바와 같이, 담체 레진으로부터의 절단과 Boc기의 탈보호를 동시에 실시하는 것에 의해서, 목적으로 하는 PNA 올리고머 IId를 얻는다.
절단 및 탈보호는, Fmoc기의 탈보호의 후에 행해지는 한, 그 조건에 특히 제한은 없다. 예를 들면, TFA/p-크레졸(Cresol)=95/5와 같이 일반적인 조건에서 적합하게 행해진다.
상기와 같이, 본 발명에 의한 방법에 있어서는, 종래의 기능성 모노머 합성에 이용하는 활성 에스테르화의 합성을 필요로 하는 방법과는 달리, 기능성 분자를 그대로 이용할 수 있다. 또한 일단 IIa를 합성한 후에 여러 가지의 기능성 분자가 도입 가능하기 때문에, 종래 곤란하였던 고속이고, 또한 다양한 병렬 PNA 프로브 합성이 가능하다.
Boc-리신(Fmoc)-OH 또는 Fmoc-리신(Alloc)-OH와 PNA쇄를 가지는 분자와의 반응을 포함한 본 발명에 의한 방법에 의하면, 하기 일반식(Ⅲ)
[화학 36]
(식중, B는, 서로 독립하고, 동일 또는 다르고, 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민이며, R은, 서로 독립하고, 동일 또는 다르고, Fmoc기 또는 기능성 카르본산 유도체이며, R1은, 수소 원자 또는 기능성 카르본산 유도체이며, R2는, 수소 원자, 아미노기, 수산기, 티올기를 포함한 유도체 또는 기능성 카르본산 유도체이며, a∼f는 0∼
의 정수이며, X1∼X3, Y1, Y2 및 Z1∼Z5는 모두 0 이상의 정수이며, X1＋X2＋X3≥0이며, Y1＋Y2＞0이며, Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5≥0이다. 다만, X1＋X2＋X3 및 Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5가 동시에 0인 경우는 없고, X1＋X2＋X3=0의 경우, R1은 기능성 카르본산 유도체이다.)로 나타내는 화합물에 있어서, Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5=0이며, R1이 수소 원자인 화합물을 들 수 있다.
또한, 상기 일반식(Ⅲ)으로 나타내는 화합물에 있어서, 복수의 기능성 분자가 도입된 것으로서, 예를 들면, R 또는 R1이 세포막 투과성 기능 분자 유도체인 것이 적합하게 합성된다. 이러한 화합물은, 전형적으로는, R이 세포막 투과성 기능 분자 유도체 등이며, R1이 광기능성 분자 등의 기능성 카르본산 유도체 등인 것, 즉, 말단부를 포함한 복수 부위에 기능성 분자가 도입되어, 이것들에 의해서 복수의 기능이 부여된 화합물이다. 이러한 화합물은, 예를 들면 아래와 같이 모식화할 수 있다.
[화학 37]
이러한 화합물은, 예를 들면 상기 일반식(Ⅲ)에 있어서, X1=Z1=Z2=1이며, 또한 Y1≥2인 화합물이다. 이러한 화합물은 합성의 용이성 및 합성 코스트의 면 등에서 적합하다.
상기 화합물에 있어서, a, b 및 f는 각각 0∼10의 정수이면 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 a≤6이고, b≤4이고, f≤6인 것이어도, 합성상 및 실용상의 어느 것에 있어서도 지장은 없다.
링커 부위를 도입하는 것에 의해서, 개개의 기능성 부위 및 염기 서열 인식 영역의 간섭을 막아, 분자의 기능을 보다 확실한 것으로 할 수 있다. 본 명세서에 있어서의 PNA, PNA 모노머 및 PNA 올리고머의 의미에는, 링커 부위를 그 말단 및/또는 내부에 포함하는 것도 포함된다.
이러한 부위 또는 영역간의 상호 간섭을 막기 위한 부위로서는, 상기 링커 부위 뿐만 아니라, 일반식(Ⅲ)에 있어서의 f∼h를, 소망에 따라 선택하는 것에 의해서도 가능하다.
링커 부위를 구성하는 기(基)로서는, 직쇄상 또는 분기상의 탄화수소 및 이들의 에테르체 등을 들 수 있지만, 직쇄상 탄화수소기는 도입의 용이함 및 코스트 등의 면으로부터 적합하고, 특히 탄소수 1∼6의 직쇄상 탄화수소기가 적합하다. 또한, 에테르체는, 그 범용성에 있어서 적합하다.
상기 복수의 기능성 분자가 도입된 화합물은, 예를 들면 Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88을 이용하여 적합하게 합성된다.
염기 서열 인식 부위는, 시판의 각종 PNA 모노머를 이용하여 고상 합성에 의해 올리고머화할 수 있다. 링커 부위에는, 시판의 Boc-7-아미노헵탄산, Boc-6-아미노카프론산 등을 이용할 수 있다.
일반식(Ⅲ)의 기능성 분자로서 광기능성 분자를 도입하면, 형광 표지하는 것이 가능하고, 또한 다른 기능도 가지는 화합물을 합성할 수 있다. 이러한 형광 표지 부위로서 시판의 Cy3, Cy5, Bodipy, pyrene, naphthalimide, naphthaldiimide, FAM, FITC, ROX, TAMRA 또는 Dabcyl 등의 시판의 활성 에스테르형 형광 표지 화합물을 이용하여, 다양한 형광 발광 파장을 선택하는 것이 가능하지만, 도입되는 형광 표지 화합물은 이것들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물에 도입할 수 있는 다른 기능성의 예로서는, 막투과성 기능을 들 수 있다. 이러한 막투과성 기능 부위는, 전회 특허 상기 일반식(Ⅲ)으로 나타내는 화합물을 이용하는 것에 의해, 동일하게 도입할 수 있다. 막투과성을 향상시킬 수 있는 기능성 분자로서 아르기닌을 들 수 있지만, 리신 및 세린 등의 다른 수용성 아미노산도 적합하게 이용할 수 있다.
또한, Boc-리신(Fmoc)-OH 또는 Fmoc-리신(Alloc)-OH를 이용하는 것에 의해서, 복수개의 아미노산을 도입하는 것도 가능하다. 그 합성예는 실시예 1에 나타냈다.그렇지만, 상기 화합물은 본 발명에 의한 막투과성 기능을 가지는 형광 PNA 프로브의 모델 화합물이며, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.
이들 프로브의 특징은, 「모두 PNA형으로 되어 있으므로, 완전한 효소 내성을 가지는 것」이다. 즉, 지금까지의 막투과성 기능을 가지는 프로브는, PNA와 막투과성 기능을 가지는 펩티드쇄 또는 인지질을 공유결합시킨 것이 주류였지만, 이러한 기존의 프로브는 뛰어난 막투과성 기능을 가지지만, 일단 세포내에 들어가면 효소군에 의해 펩티드쇄 또는 인지질이 분해되는 것이 예상된다. 따라서, 이것들은, 타겟을 인식하고 있지 않는 분해를 받은 프로브를 세정 과정에서 완전하게 제거할 수 없다고 하는 결점을 가진다.
이것에 대해서, 이번 설계한 프로브는, 세포내에서도 효소 분해를 받지 않기 때문에, 타겟을 인식하고 있지 않는 프로브는 세정 과정에서 완전하게 제거되기 때문에, 정확한 유전자 발현량의 정량을 가능하게 하는 것이다.
또한, 이러한 기능성을 가지는 화합물 이외에도, 락토스나 트리스엑스(tris-X) 등의 장기 선택 기능성 분자, 타나틴(tanatin)이나 세크로핀(secropin) 등의 살균 기능성 분자 및 비오로겐(viologen) 등의 분자 인식 기능성 분자, N-메틸히드록사민산 등의 분자 파괴성 기능 분자 등도 본 발명에 의하면 제한없이 도입하는 것이 가능하고, 그러한 화합물을, 대량으로 저비용으로 실용에 제공하는 것이 가능하게 된다.
도 1은, DNA와 PNA의 구조 및 하전 상태의 차이를 나타내는 도이다.
도 2는, 2종류의 PNA 모노머 유닛의 구조를 나타내는 도이다.
이하에 실시예를 이용해 본 발명을 한층 더 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위는 이것에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 막투과성 기능을 가지는 형광 PNA 프로브의 합성
[화학 38]
표준적 Boc법(cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.)에 따라, 우선, 고상 담체 MBHA(50mg)에 티민 PNA 모노머 유닛(7.7mg, 20mmol), 축합제HBTU(7.6mg, 20mmol)와 DIEA(3.5mL, 20mL)를 이용하여, 순차로 신장 반응을 실시했다(염기 서열 인식 영역의 설계).
그 다음에, 링커용 ω-아미노산-Boc-7-아미노헵타노익산(aminoheptanoic Acid)5.2mg, 20mmol), Fmoc-Ahx-BocPNA-OH(10.0mg, 20mmol)와 재차 Boc-7-아미노헵타노익산을, 축합제 HBTU(7.6mg, 20mmol)와 DIEA(3.5mg, 20mmol)를 이용하여, 순차 로 축합시켰다(링커 부위와 막투과성 기능 영역의 설계).
모든 유닛을 순차로 축합한 후, 피페리딘 처리(DMF중의 20% 피페리딘, 실온 3분)하여, Fmoc기를 탈보호했다. 그 다음에, 기능성 카르본산 유도체로서 천연형 Fmoc-Arg(Mts)-OH(23.1mg, 40mmol)를 축합제 HBTU(15.2mg, 40mmol)와 DIEA(7.0mL, 40mmol)를 이용, 축합하여, 목적의 위치에 기능성 분자를 도입했다(막투과성 기능의 도입).
이것을 피페리딘 처리(DMF중의 20% 피페리딘, 실온 3분)하여 Fmoc기를 탈보호한 후, 재차 천연형 Fmoc-Arg(Mts)-OH(23.1mg, 40mmol)를 축합제 HBTU(15.2mg, 40mmol)와 DIEA(7.0mL, 40mmol)를 이용, 축합하여 목적의 위치에 기능성 분자를 도입했다. 이것을 한번 더 반복했다(막투과성 기능의 추가 도입).
TFA 처리(95% TFA/5% m-크레졸)에 의해 Boc기를 탈보호한 후, FITC(9.3mg, 25mg)를 DIEA(17.4mg, 100mmol) 존재하, 실온에서 12시간 교반하여, 형광 표지화했다(형광 표지 부위의 설계).
마지막에 피페리딘 처리(2초 piperidinein D, 실온 3분)하여 남는 Fmoc기를 탈보호한 후, 통상의 방법(TFA/TFMSA/p-크레졸/티오아니졸(thioanisol)=60/25/10/ 10)에 의해 고상 담체로부터의 절단을 실시하고, 후처리하여, 목적물을 얻었다. MALDI-TOF MS：calcd. 6373.0231(M＋H＋).
(실시예 2) 막투과성 기능을 가지는 형광 PNA 프로브의 합성
[화학 39]
표준적 Boc법(cf. Koch, T.; Hansen, H.F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H.G.; Otteson, K.; Orum, H. J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88.)에 따라, 우선, 고상 담체 MBHA(50mg)에 티민 PNA 모노머 유닛(7.7mg, 20mmol), 축합제HBTU(7.6mg, 20mmol)와 DIEA(3.5mL, 20mL)를 이용하여, 순차로 신장(elongation) 반응을 실시했다(염기 서열 인식 영역의 설계).
그 다음에, 링커용 ω-아미노산-Boc-7-아미노헵타노익산(5.2mg, 20mmol), Fmoc-Ahx-BocPNA-OH(10.0mg, 20mmol)와 재차 Boc-7-아미노헵타노익산을, 축합제HBTU(7.6mg, 20mmol)와 DIEA(3.5mg, 20mmol)를 이용하여, 순차로 축합시켰다(링커 부위와 막투과성 기능 영역의 설계).
모든 유닛을 순차로 축합한 후, 피페리딘 처리(DMF중의 20% 피페리딘, 실온 3분)하여 Fmoc기를 탈보호했다. 그 다음에, 기능성 카르본산 유도체로서 비천연형 Fmoc-Arg(Mts)-OH(23.1mg, 40mmol)를 축합제 HBTU(15.2mg, 40mmol)와 DIEA(7.0mL, 40mmol)를 이용, 축합하여, 목적의 위치에 기능성 분자를 도입했다(막투과성 기능의 도입).
이것을 피페리딘 처리(DMF중의 20% 피페리딘, 실온 3분)하여 Fmoc기를 탈보호한 후, 재차 비천연형 Fmoc-Arg(Mts)-OH(23.1mg, 40mmol)를 축합제 HBTU(15.2mg, 40mmol)와 DIEA(7.0 mL, 40mmol)를 이용, 축합하여, 목적의 위치에 기능성 분자를 도입했다. 이것을 한번 더 반복했다(막투과성 기능의 추가 도입).
TFA 처리(95% TFA/5% m-크레졸)에 의해 Boc기를 탈보호한 후, FITC(9.3mg, 25mg)를 DIEA(17.4mg, 100mmol) 존재하, 실온에서 12시간 교반하여, 형광 표지화했다(형광 표지 부위의 설계).
마지막으로, 피페리딘 처리(2초 piperidinein D, 실온 3분)하여 남는 Fmoc기를 탈보호한 후, 통상의 방법(TFA/TFMSA/p-크레졸/티오아니졸=60/25/10/10)에 의해 고상 담체로부터의 절단을 실시하고, 후처리하여, 목적물을 얻었다. MALDI-TOF MS：calcd. 6373.0231(M＋H＋).
본 발명에 의하면, 광기능성 분자에 한정되지 않는 다종 다양한 기능성 분자를, PNA중에 용이하고 효율적으로 도입할 수 있고, 유전자 치료 등에 이용되는 여러 가지의 PNA의 구축이 가능하게 되므로, 본 발명은, 광범위한 의료 산업분야에서 이용할 수 있다.
Claims (20)
- 보호기에 의해 보호된 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 가지는 PNA 모노머 유닛을, 하기의 일반식(I)에 의한 Boc-리신(Fmoc)-OH(Fmoc란 9- Fluorenylmethoxycarbonyl을 나타낸다.), 또는 하기의 일반식(II)에 의한 Fmoc-리신(Alloc)-OH(Fmoc란 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Boc란 tButoxycarbonyl, Alloc란 Allyloxycarbonyl을 나타낸다.)와 반응시켜 PNA 올리고머를 합성한 후, 상기 PNA 올리고머에 유리 카르본산을 가지는 기능성 분자를 도입하고, 또한 상기 보호기의 탈보호를 실시하는 것을 포함하는, 기능성 PNA 올리고머의 제조방법:
- 제 1 항에 있어서, 기능성 분자를 도입한 후에, 또한 다른 기능성 분자의 도입을 실시하는 것을 특징으로 하는 기능성 PNA 올리고머의 제조방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 도입되는 기능성 분자가, 광반응성 기능 분 자, 막투과성 기능 분자, 장기 선택성 기능 분자, 살균성 기능 분자, 분자 파괴성 기능 분자, 유착성 기능성 분자 및 분자 인식성 기능 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 PNA 올리고머의 제조방법.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 도입되는 기능성 분자가, 광기능성 분자 및 막투과성 기능 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 PNA 올리고머의 제조방법.
- 제 4 항에 있어서, 광기능성 분자가, Cy3, Cy5, Bodipy, 피렌, 나프탈이미드, 나프탈디이미드, FAM, FITC, ROX, TAMRA 또는 Dabcyl이며, 막투과성 기능 분자가 수용성 아미노산 유도체인 것을 특징으로 하는 기능성 PNA 올리고머의 제조방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 보호하는 보호기가, 벤질옥시카르보닐기(Z기)인 것을 특징으로 하는 기능성 PNA 올리고머의 제조방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, PNA 올리고머의 합성이, Boc법용 및 Fmoc법용 고상(solid-phase) 담체를 이용한 PNA쇄에 있어서의 축합·신장을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 PNA 올리고머의 제조방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, Boc법용 고상 담체가, 고상 Boc법에서 펩티드 합성에 사용하는 메틸벤즈히드릴아민(MBHA)인 것을 특징으로 하는 기능성 PNA 올리고머의 제조방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, Fmoc법용 고상 담체가, MBHA, 폴리스틸렌을 클로로메틸화한 수지(Merrifield 수지), 4-히드록시벤질알코올로 변형된 Merrifield 수지(Wang 수지), Boc-아미노산-링커를 결합시킨 아미노메틸 수지(PAM 수지), N-Fmoc-N-메톡시-링커를 결합시킨 아미노메틸 수지(Weinreb 수지), 폴리스틸렌에 p-니트로벤조페논옥심을 결합시킨 수지(Oxime 수지) 또는 폴리스틸렌을 이용하여 트리틸화한 수지(Trityl 수지)인 것을 특징으로 하는 기능성 PNA 올리고머의 제조방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 유리 카르본산을 가지는 기능성 분자의 도입이, Boc법에 있어서의 Fmoc기를 피페리딘 처리에 의해, 또는 Fmoc법에 있어서의 Alloc기를 아연 초산 용액 처리에 의해, 선택적으로 탈보호하여 얻어지는 1급 아미노기와의 탈수 축합에 의해서 행해지는 것을 특징으로 하는 기능성 PNA 올리고머의 제조방법.
- 제 2 항에 있어서, 하기의 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 PNA 올리고머의 제조방법：a) Boc-리신(Fmoc)-OH를 PNA 올리고머중에 도입하는 공정에 있어서, PNA 모노머 유닛을, Boc-리신(Fmoc)-OH와 반응시켜 PNA 올리고머를 제조하는 방법；b) 상기 PNA 올리고머로부터 기능성 PNA 올리고머를 제조하는 공정에 있어서, PNA 올리고머에의 기능성 분자의 도입이, Fmoc기를 피페리딘 처리에 의해서 선택적으로 탈보호하여 얻어지는 1급 아미노기와의 탈수 축합에 의해서 행해지는 방법;중의 1 또는 2 이상을 포함하는 방법과,c) Fmoc-리신(Alloc)-OH를 PNA 올리고머중에 도입하는 공정에 있어서, PNA 모노머 유닛을, Fmoc-리신(Alloc)-OH와 반응시켜 PNA 올리고머를 제조하는 방법；d) 상기 PNA 올리고머로부터 기능성 PNA 올리고머를 제조하는 공정에 있어서, PNA 올리고머에의 기능성 분자의 도입이, Alloc기를 아연 초산 용액 처리에 의해서 선택적으로 탈보호하여 얻어지는 1급 아미노기와의 탈수 축합에 의해서 행해지는 방법;중의 1 또는 2 이상을 포함하는 방법.
- 하기 일반식(Ⅲ)으로 나타내는 화합물:
(식중, B는, 서로 독립하고, 동일 또는 다르고, 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민이며, R은, 서로 독립하고, 동일 또는 다르고, Fmoc기 또는 기능성 카르본산 유도체이며, R1은, 수소 원자 또는 기능성 카르본산 유도체이며, R2는, 수소 원자, 아미노기, 수산기, 티올기를 포함한 유도체 또는 기능성 카르본산 유도체이며, a∼f는 0∼의 정수이며, X1∼X3, Y1, Y2 및 Z1∼Z5는 모두 0 이상의 정수이며, X1＋X2＋X3≥0이며, Y1＋Y2＞0이며, Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5≥0이다. 다만, X1＋X2＋X3 및 Z1＋Z2＋Z3＋Z4＋Z5가 동시에 0인 경우는 없고, X1＋X2＋X3=0의 경우, R1은 기능성 카르본산 유도체이다.)
- 제 12 항에 있어서, X1＋X2＋X3=3이며, Y1＋Y2=15인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 13 항에 있어서, X1=3이며, Y1=15인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 14 항에 있어서, R 또는 R1이 세포막 투과성 기능 분자 유도체인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 15 항에 있어서, R1이 기능성 카르본산 유도체인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, X1=Z1=1인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, Y1≥2이며, Z2=1인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, a≤6이며, b≤4이며, f≤6인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 광기능성 카르본산 유도체인 것을 특징으로 하는 화합물.
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