JPH10503759A - 連結ペプチド核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規なペプチド核酸および新規な連結したペプチド核酸は核酸とともにトリプル鎖構造を形成する。ペプチド核酸は、適当なリンカーを介してペプチド主鎖に結合した天然に生ずる核塩基等のリガンドを含む。Ｃ−ピリミジンおよびイソピリミジンを含む他の核塩基をホーグスティーン鎖中のリガンドとして用いて結合親和性を増加させることができる。２つのペプチド核酸鎖をリンカーとともに一緒に連結してビス−ペプチド核酸を形成する。ビス化合物中のペプチド核酸の個々の鎖は互いにパラレルまたはアンチパラレルに配向しうる。

Description

【発明の詳細な説明】 連結ペプチド核酸 関連する出願のクロスリファレンス 本出願は、１９９４年７月１５日出願の米国特許出願０８／２７５，９５１の 一部継続出願であり、これは１９９３年８月２７日出願の米国特許出願０８／１ ０８，５９１の一部継続出願であり、これは１９９２年５月２２日出願の国際特 許出願ＰＣＴ／ＥＰ／０１２１９の米国国内段階であり、これは１９９１年５月 ２４日出願のデンマーク特許出願９８６／９１、１９９１年５月２４日出願の９ ８７／９１および１９９２年４月１５日出願の５１０／９２に基づく優先権を主 張している。米国特許出願０８／２７５，９５１はまた、１９９３年７月２日出 願の米国特許出願０８／０８８，６５８および１９９３年７月２日出願の米国特 許出願０８／０８８，６６１の一部継続出願である。上述のそれぞれの特許出願 の開示のすべてを本明細書の一部としてここに引用する。 発明の分野 本発明は、ポリヌクレオチドではないが、対応するポリヌクレオチドより強力 に相補的なＤＮＡおよびＲＮＡ鎖に結合する化合物に関する。特に、本発明は、 天然に生ずる核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）または他の核塩基結合部分が、ポ リアミド主鎖に共有結合的に結合しており、該ポリアミド主鎖が第２の同様に置 換されたポリアミド主鎖に連結部分を介して共有結合的に連結している、新規な ペプチド核酸化合物および新規な連結したペプチド核酸化合物に関する。 発明の背景 オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、分子生物学において、ある種の方法 においてプローブ、プライマー、リンカー、アダプターおよび遺伝子フラグメン ト等として開発され用いられてきた。これらの方法において用いられるオリゴヌ クレオチドへの修飾には、非放射性同位体、例えば、フルオレセイン、ビオチン 、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ、または他のレポーター分子での標 識が含まれる。リボースホスフェート主鎖に他の修飾を行い、得られる類似体の ヌクレアーゼ安定性を増加させた。これらの修飾には、メチルホスホネート、ホ ス ホロチオエート、ホスホロジチオエート連結、および２’−Ｏ−メチルリボース 糖ユニットの使用が含まれる。別の修飾には、取り込みおよび細胞内分布を調節 するための修飾が含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは現在のと ころ抗ウイルス剤としての使用を含む種々の疾患状態のためのヒトの臨床試験に おいてアンチセンス剤として用いられている。これらのオリゴヌクレオチドは診 断および治療において首尾よく使用されているが、改良されたオリゴヌクレオチ ド類似体に対する要望が存在する。 オリゴヌクレオチドはいくつかの方法で本来のＤＮＡおよびＲＮＡと相互作用 することができる。これらのうちの１つは、オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸と の間のデュープレックス形成である。他のものは、オリゴヌクレオチドと二本鎖 ＤＮＡとの間にトリプレックスを形成して、トリプレックス構造を形成するもの である。しかし、二本鎖ＤＮＡとトリプレックス構造を形成するためには、オリ ゴヌクレオチドのシトシン塩基がプロトン化されていなければならない。このた め、これはそのようなトリプレックス形成をｐＨ依存性にする。Ｐ．Ｏ．Ｐ．Ｔ ｓ’ｏおよび同僚は、ＤＮＡトリプレックス形成において、シトシンの永続的に プロトン化された類似体としてシュードイソシトシンを用いた（Ｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１１３，４０３２−４０３ ３；Ｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７，３２２ ５−３２３０を参照のこと）。ＴｒａｐａｎｅおよびＴｓ’ｏはまた、一本鎖核 酸標的とのトリプレックス形成のためのシュードイソシトシンの使用を示唆した （Ｔｒａｐａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｌ．Ｓｔｒｕｃ ｔ．，１９９１，８，２２９；Ｔｒａｐａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ ．Ｊ．，１９９２，６１，２４３７；およびＴｒａｐａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｂｓｔｒａｃｔｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃａｎｃｕｎ，Ｍｅｘｉｃｏ，Ｊ ａｎｕａｒｙ １９９３を参照のこと）。特許出願ＷＯ９３／０５１８０におい て、８−オキソアデニンもトリプレックス形成におけるプロトン化されたシトシ ンとして示唆されている。 ペプチド核酸は、ある点ではオリゴヌクレオチド類似体と類似する化合物であ るが、別の非常に重要な点においては、これらの構造は非常に異なる。ペプチド 核酸においては、オリゴヌクレオチドのデオキシリボースホスフェート主鎖は、 糖ホスホジエステルよりペプチドに似た主鎖により置き換えられている。それぞ れのサブユニットは、この主鎖に結合した、天然に生ずるまたは天然に生じない 塩基を有する。そのような主鎖の１つは、アミド結合を介して連結したＮ−（２ −アミノエチル）グリシンの繰り返しユニットから構築される。デオキシリボー ス主鎖からは根本的にはずれているため、これらの化合物はペプチド核酸（ＰＮ Ａ）と称されている。 ＰＮＡはＤＮＡおよびＲＮＡの両方に結合して、ＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ ／ＲＮＡデュープレックスを形成する。得られるＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ ＲＮＡデュープレックスは、Ｔｍで判定して、対応するＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤ ＮＡ／ＲＮＡデュープレックスよりも高い親和性で結合する。この高い熱安定性 は、ＰＮＡの中性の主鎖による電荷斥力の欠失に起因するのであろう。また、Ｐ ＮＡの中性の主鎖により、ＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）デュープレックスのＴｍは 事実上塩濃度に非依存性である。すなわち、ＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックス相 互作用は、イオン強度に高度に依存性であるＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックス相 互作用に比べてさらなる利点を提供する。ホモピリミジンＰＮＡは相補的なＤＮ ＡまたはＲＮＡに結合して、熱安定性の高い（ＰＮＡ）２／ＤＮＡ（ＲＮＡ）ト リプレックスを形成することが示されている（例えば、Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｔ ａ ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７；Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｔ ａ ｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９２，１１４，１８９５；Ｅｇｈｏ ｌｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９２，１１４，９６ ７７を参照のこと）。 増加した親和性に加えて、ＰＮＡはまた増加した特異性をもってＤＮＡに結合 することが示されている。ＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックスのミスマッチが溶解 するとき、ＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックスと比較して８から２０℃のＴｍの降 下が見られる。このような大きなＴｍの降下は、ミスマッチが存在する対応する ＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックスについては見られない。 ＰＮＡ鎖のＤＮＡ主たはＲＮＡ鎖への結合は、２つの配向のいずれかで起こり うる。この配向は、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖が、ＰＮＡのカルボキシル末端がＤＮ ＡまたはＲＮＡの５’末端に向けられておりかつＰＮＡのアミノ末端がＤＮＡま たはＲＮＡの３’末端に向けられるように、５’から３’配向で相補的なＰＮＡ 鎖に結合するとき、アンチパラレルと称される。パラレル配向においては、ＰＮ Ａのカルボキシル末端およびアミノ末端は、ＤＮＡまたはＲＮＡの５’−３’方 向に関してちようど反対向きである。 ＰＮＡは一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に結合する。上述したように 、二本鎖ＤＮＡへの結合においては、ＰＮＡの２つの鎖がＤＮＡに結合すること が認められている。ＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックスはアンチパラレルコンフィ ギュレーションにおいて安定であるが、以前は（ＰＮＡ）₂／ＤＮＡトリプレッ クスについてはパラレル配向が好ましいと考えられていた。 ２つの一本鎖ピリミジンＰＮＡの二本鎖ＤＮＡへの結合は、オリゴヌクレオチ ドのトリプレックス形成について観察されるような通常の三重らせん形成ではな く、鎖置換を介して生ずることが示されている。ＰＮＡ鎖が二本鎖ＤＮＡに浸入 するとき、ＤＮＡの一方の鎖が置き換えられ、ＰＮＡ₂／ＤＮＡ複合体領域側で ループを形成する。ＤＮＡの他方の鎖は（ＰＮＡ）₂／ＤＮＡトリプレックス構 造中で固定（ｌｏｃｋ ｕｐ）される。ループ領域（あるいはＰループと称され る）は一本鎖であり、これは一本鎖ＤＮＡを切断しうる酵素による切断に感受性 である。 オリゴヌクレオチドと比較してＰＮＡのさらなる利点は、そのポリアミド主鎖 （それに結合した適当な核塩基または他の側鎖基を有する）がヌクレアーゼまた はプロテアーゼのいずれによっても認識されず、切断されないことである。この 結果、ＰＮＡは、ＤＮＡおよびペプチドとは異なり、酵素による分解に耐性であ る。 これらの性質のため、ＰＮＡは、多くの異なる分野において有用であることが 知られている。ＰＮＡはオリゴヌクレオチドより強い結合および高い特異性を有 しているため、クローニング、ブロッティング方法、および蛍光インサイチオハ イブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等の応用においてプローブとして用いられて いる。ホモピリミジンＰＮＡは、ホモプリン標的における鎖置換において用いら れている。ｐ−ループと重複するかまたは隣接する制限部位は、制限酵素により 切断されないであろう。また、局所的なトリプレックスは遺伝子の転写を阻害す る。すなわち、ＤＮＡフラグメント中の特定の制限部位にＰＮＡが結合すること により、これらの部位における切断が阻害されうる、クローニングおよびサブク ローニング方法において、この利点を利用することができる。標識したＰＮＡは また、ＤＮＡ分子を直接マッピングするために用いることができる。これを行う ためには、鎖侵入を用いて蛍光標識を有するＰＮＡ分子をデュープレックスＤＮ Ａ中の相補的な配列にハイブリダイズさせる。 ＰＮＡはさらに、ＰＣＲに基づくアッセイ（ＰＣＲクランピング）において点 突然変異を検出するためにも用いられてきている。ＰＣＲクランピングは、ＰＣ Ｒに基づくアッセイ、例えば、検証中のＤＮＡのセグメント中の通常の野生型遺 伝子座と変異体遺伝子座との間の区別において、点突然変異を検出するためにＰ ＮＡを用いる。野生型配列に相補的なＰＮＡオリゴマーを合成する。ＰＣＲ反応 混合物は、このＰＮＡおよび２つのＤＮＡプライマーを含み、その１つは変異体 配列に相補的である。野生型ＰＮＡオリゴマーおよびＤＮＡプライマーは、標的 に対するハイブリダイゼーションについて競合する。標的が変異体遺伝子座であ れば、ＤＮＡプライマーのハイブリダイゼーションおよび続く増幅のみが生ずる であろう。この方法を用いて、変異体の存在および正確な同一性を検出すること ができる。 発明の目的 本発明は、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡ核酸に結合して、対応す るＤＮＡと比較して改良された熱安定性、特異性、および他の性質を有する複合 体を形成する化合物を提供することを目的とする。 本発明はさらに、一緒になってビスＰＮＡを形成するＰＮＡの２つの配列を用 いて鎖侵入を介して核酸に結合する化合物を提供することを目的とする。ここで 、１つの鎖はワトソン／クリック型の水素結合を用いて標的に対してアンチパラ レルに結合し、第２の鎖はホーグスティーン型の水素結合を用いて標的に対して パラレルに結合する。 本発明はさらに、少なくとも１つのピリミジン複素環塩基がＣ−ピリミジン複 素環塩基またはイソピリミジン複素環塩基で置換されているＰＮＡおよびビスＰ ＮＡを提供することを目的とする。 本発明はさらに、標的に対してパラレルである鎖のシトシンがシュードイソシ トシンで置き換えられている、一緒に連結してビスＰＮＡを形成してもよいＰＮ Ａの２つの配列を用いて、鎖侵入を介して核酸に結合する化合物を提供すること を目的とする。ここで１つの鎖は標的に対してアンチパラレルに結合してワトソ ン／クリック型水素結合を形成し、第２の鎖は標的に対してパラレルに結合して ホーグスティーン型水素結合を形成する。 本発明はさらに、ホーグスティーン鎖中でシトシン核塩基がシュードイソシト シで置き換えられているビスＰＮＡ構造を提供することを目的とする。 本発明はさらに、このような化合物を用いる、治療、診断および予防方法を提 供することを目的とする。 発明の概要 本発明は、修飾されたペプチド核酸、特に連結セグメントを介して連結したＰ ＮＡに関する。このようなＰＮＡは、”ビスペプチド核酸”または”ビスＰＮＡ ”という略称（ｓｈｏｒｔｈａｎｄ ｎａｍｅ）を与えられている。本発明はま た、ホーグスティーン型塩基対形成のためのある種の非天然核塩基を取り込んだ 修飾されたペプチド核酸に関する。これらの修飾されたペプチド核酸は、特に、 二本鎖ＤＮＡ中のある部位の同定、制限酵素部位、転写阻害、点突然変異を検出 するためのクランピングを含む診断用途およびトリプレックス形成モチーフ中の ホーグスティーン鎖において用いるのに有用である。 本発明に従えば、Ｃ−ピリミジン複素環塩基またはイソピリミジン複素環塩基 であるピリミジン複素環塩基を有する少なくとも１つのペプチド核酸モノマーユ ニットを有するペプチド核酸を含む化合物が提供される。本発明のある好ましい 態様においては、ピリミジン複素環塩基はＣ−ピリミジン複素環塩基である。本 発明の他の好ましい態様においては、ピリミジン複素環塩基はシュードイソシト シンである。本発明の別の態様においては、Ｃ−ピリミジン複素環塩基はシュー ドウラシル、５−ブロモウラシル、イソシトシンまたは他のイソピリミジン複素 環塩基である。 Ｃ−ピリミジンおよびイソピリミジン複素環塩基を有する化合物を含む本発明 の化合物には、式Ｉの化合物が含まれる： ［式中、 ｎは少なくとも２であり； Ｌ¹−Ｌⁿのそれぞれは、独立して、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイ ル、天然に生ずる核塩基、天然に生じない核塩基、芳香性部分、ＤＮＡインター カレーター、核塩基結合基、複素環部分、およびレポーターリガンドからなる群 より選択され； Ｃ¹−Ｃⁿのそれぞれは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_yであり、ここでＲ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天 然に生ずるアルファアミノ酸の側鎖からなる群より選択され、またはＲ⁶および Ｒ⁷は、独立して、水素、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテ ロアリール、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ 、ＮＲ³Ｒ⁴およびＳＲ⁵からなる群より選択され、ここで、Ｒ³およびＲ⁴は互い に独立して、水素、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ−もしくはアルコキシ− もしくはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、 アルキルチオおよびアミノからなる群より選択され、Ｒ⁵は水素、（Ｃ₁−Ｃ₆） アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−、またはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₆ ）アルキルであり、あるいは、Ｒ⁶およびＲ⁷は、一緒になって脂環また複素環系 を完成させてもよい； Ｄ¹−Ｄⁿのそれぞれは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、ここでＲ⁶およびＲ⁷は上で定義し たとおりであり； ｙおよびｚのそれぞれは１から１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は１より大きく １０以下であり； Ｇ¹−Ｇ^n-1のそれぞれは、いずれの方向でもよい−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ− 、−ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−であり、ここでＲ³は上で定義したとおり であり； Ａ¹−ＡⁿおよびＢ¹−Ｂⁿのそれぞれは次のように選択される： （ａ）Ａは式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）または（ＩＩｄ）の基であり 、ＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺であり；または （ｂ）Ａは式（ＩＩｄ）の基でありＢはＣＨである； ［式中、 ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり； ｐおよびｑのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０以 下であり； ｒおよびｓのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０以 下であり； Ｒ¹およびＲ²のそれぞれは、独立して、水素、およびヒドロキシ−もしくはアル コキシ−もしくはアルキルチオ−置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、 ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より 選択され； Ｒ³およびＲ⁴のそれぞれは上で定義したとおりである］ Ｑは−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ''、−ＳＯ₃Ｈまたは−ＳＯ₂ＮＲ'Ｒ''、または −ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり；そして Ｉは、−ＮＨＲ'''Ｒ''''または−ＮＲ'''Ｃ（Ｏ）Ｒ''''であり、ここでＲ'、 Ｒ''、Ｒ'''およびＲ''''は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポ ーターリガンド、インターカレーター、キレーター、ペプチド、蛋白質、炭水化 物、脂質、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチドジホスフェ ート、ヌクレオチドトリホスフェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシ ドおよび可溶性および不溶性ポリマーからなる群より選択される］。 本発明のペプチド核酸化合物はさらに、構造ＩＩＩ、ＩＶまたはＶの化合物： ［式中、 それぞれのＬは、独立して、水素、フェニル、複素環部分、天然に生ずる核塩基 および天然に生じない核塩基からなる群より選択され； それぞれのＲ⁷'は、独立して、水素および天然に生ずるアルファアミノ酸の側鎖 からなる群より選択され； ｎは１より大きい整数であり； ｋ、ｌ、およびｍのそれぞれは、独立して、０または１から５の整数であり； それぞれのｐは０または１であり； Ｒ^hは、ＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり；そして Ｒ¹はＨまたはＣＯＣＨ₃である］ を含む。 さらに本発明に従えば、少なくとも１つの連結セグメントを介して一緒に連結 した第１および第２のペプチド核酸セグメントを有する、ペプチド核酸またはオ リゴヌクレオチドではない化合物が提供される。 本発明の好ましい態様においては、連結セグメントは、その一方の末端にカル ボン酸官能基を有しかつその他方の末端に第１アミノ官能基を有する線状構造を 含む。好ましい連結セグメントは、少なくとも１つの次の構造のユニットを含む ： −［ＨＮ−Ｚ−ＣＯＯ］_n− ［式中、 ｎは１から３であり；ＺはＣ₁−Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂−Ｃ₂₀、アルケニル、Ｃ₂− Ｃ₂₀アルキニル、少なくとも１つのＯまたはＳ複素原子を有するＣ₁−Ｃ₂₀アル カノイル、Ｃ₁−Ｃ₁₇アリール、またはＣ₇−Ｃ₃₄アラルキルである。 より好ましい態様においては、連結セグメントは少なくとも１つの式： −ＮＨ−（ＣＨ₂）_e−Ｃ（＝Ｏ）− （式中、ｅは１から１５である）のアミノアルキルカルボン酸を含む。 ある好ましい態様においては、ｅは４から８である。より好主しい態様におい ては、ｅは５または６である。 別の好ましい態様においては、連結セグメントは、次の式： −（ＡＡ）_h−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_e−Ｃ（＝Ｏ）−（ＡＡ）_f］_g− ［式中 ＡＡはα−アミノ酸であり； ｅは４から８であり； ｆおよびｈは０または１であり；そして ｇは１から４である］ であるように、直前の式の構造および少なくとも１つのさらなるα−アミノ酸を 含む。 別の好ましい態様においては、連結セグメントは少なくとも１つのグリコール アミノ酸のユニットを含む。グリコールアミノ酸は、直線アレイ状に一緒に連結 し、一方の末端にアミノ基を他方の末端にカルボキシル基を含むグリコールサブ ユニットから形成される。好ましいグリコールアミノ酸連結セグメントは次式の 化合物： −［ＮＨ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_j−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−］_i ［式中、ｊは１から６であり、ｉは１から６である］ である。。１つの特に好ましい態様においては、ｊは２であり、ｉは３である。 本発明のさらに別の態様においては、２つのそれぞれのペプチド核酸セグメン トの両末端が連結セグメントの２つを介して一緒に連結されて、環状構造を形成 する。 本発明のさらに別の態様においては、連結セグメントは、第１および第２のペ プチド核酸セグメントの一方の末端アミン官能基と、第１および第２のペプチド 核酸セグメントの他方のカルボキシル官能基とを連結させる。 本発明のある好ましい態様においては、第１のペプチド核酸セグメントの、そ のアミン末端からそのカルボキシル末端への方向の核塩基配列は、第２のペプチ ド核酸セグメントの、そのカルボキシル末端からそのアミン末端への方向の核塩 基配列と同一である。 本発明の別の態様においては、第１および第２のペプチド核酸セグメントの核 塩基の少なくとも一部はピリミジン核塩基である。本発明のさらに別の態様にお いては、第１または第２のペプチド核酸セグメンとの一方の少なくとも１つのピ リミジン核塩基は、Ｃ−ピリミジン複素環塩基またはイソピリミジン複素環塩基 を含む。本発明のさらに別の態様においては、ピリミジン核塩基である核塩基の 一部は、連続するホモピリミジン配列中に位置する。 本発明の化合物はまた、核酸鎖を有する多鎖構造を含み、少なくともその一部 は標的ヌクレオチド配列を形成し、一方、第１および第２のペプチド核酸セグメ ントから形成される別の鎖はリンカーを介して一緒に連結している。第１のペプ チド核酸セグメントの核塩基の配列は、標的ヌクレオチド配列の５’から３’方 向に標的ヌクレオチド配列に相補的であるように選択され、第２のペプチド核酸 セグメントの核塩基の配列は、標的ヌクレオチド配列の３’から５’方向に標的 ヌクレオチド配列に相補的であるように選択される。 本発明のある態様においては、核酸鎖は一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであり、本 発明の別の態様においては、核酸鎖は二本鎖ＤＮＡである。 本発明のさらに別の態様においては、第１または第２のペプチド核酸セグメン トの一方はワトソン／クリック型水素結合を用いて標的ヌクレオチド配列に結合 し、第１または第２のペプチド核酸セグメントの他方は、ホーグスティーン型水 素結合を用いて標的ヌクレオチド配列に結合する。ある好ましい態様においては 、前記ホーグスティーン水素結合を用いて標的ヌクレオチド配列に結合する第１ または第２のペプチド核酸セグメントの一方は、標的ヌクレオチド配列中の核塩 基に相補的な位置の少なくとも１つの中にＣ−ピリミジン複素環核塩基またはイ ソピリミジン複素環核塩基を含む。ある好ましい態様においては、Ｃ−ピリミジ ン複素環核塩基またはイソピリミジン複素環核塩基は、シュードイソシトシン、 イソシトシン、シュードウラシルまたは５−ブロモウラシルであるように選択さ れる。 本発明の化合物はまた、核塩基の第１の配列を有する連結したペプチド核酸ユ ニットの第１のセグメントおよび核塩基の第２の配列を有する連結したペプチド 核酸ユニットの第２のセグメント、およびペプチド核酸ユニットの第１および第 ２のセグメントを連結するリンカー基を有する化合物を含む。ペプチド核酸ユニ ットの第１のセグメントは、アミノ末端からカルボキシル末端に伸び、ペプチド 核酸ユニットの第２のセグメントはアミノ末端からカルボキシル末端に伸び、こ こでリンカー基はペプチド核酸ユニットの第１のセグメントのカルボキシル末端 とペプチド核酸ユニットの第２のセグメントのアミノ末端とを連結する。 図面の簡単な説明 当業者は、添付の図面を参考にすることにより、本発明の多くの目的および利 点をよりよく理解することができるであろう。 図１は、本発明に従い、実施例２６において議論される合成スキームを示す。 図２は、本発明に従い、実施例３３において議論される合成スキームを示す。 図３は、本発明に従い、実施例３７において議論される合成スキームを示す。 図４は、本発明に従い、実施例４１において議論される合成スキームを示す。 好ましい態様の記載 本発明は、新規なＰＮＡ分子および新規な連結されたＰＮＡ分子に関する。連 結されたＰＮＡ分子は連結セグメントにより一緒に連結されているＰＮＡ鎖から 形成される。本明細書においては、これらの新規な連結された分子を”ビスＰＮ Ａ”と称する。ビスＰＮＡは、一本鎖ＰＮＡよりも改良された結合、特異性およ び認識特性を有することが示されている。 本発明に従って、２つの一本鎖ＰＮＡもしくはビスＰＮＡとＤＮＡもしくはＲ ＮＡ標的鎖との間に形成される最も安定なトリプレックスは、ワトソン／クリッ ク塩基対鎖が標的鎖に対してアンチパラレル配向にあり、ホーグスティーン塩基 対鎖が標的鎖に対してパラレル配向にあるトリプレックスであることが見いださ れた。標的鎖に対してそのような配向にあるため、２つのＰＮＡ鎖は互いにアン チパラレルである。 本発明のＰＮＡ分子および連結されたＰＮＡ分子またはビスＰＮＡにおいては 、上述の式Ｉに示されるように、リガンドＬは主として天然に見いだされる位置 、すなわちアデニンまたはグアニンについては９位、チミンまたはシトシンにつ いては１位に結合した天然に生ずる核塩基である。あるいは、Ｌは天然に生じな い核塩基（核塩基類似体）、他の塩基結合性部分、芳香族部分、（Ｃ₁−Ｃ₄）ア ルカノイル、ヒドロキシまたは水素であってもよい。ある好ましい態様において は、構造中の少なくとも１つのＬはＣ−ピリミジン複素環塩基またはイソピリミ ジン複素環塩基である。別の態様においては、ＬはＤＮＡインターカレーター、 レポ ーターリガンド（例えば、蛍光団、放射性標識、スピン標識、ハプテン）または ビオチン等の蛋白質認識リガンドでありうる。 本発明の目的のためには、用語”ピリミジン”は、その置換基または他の分子 との結合の位置にかかわらず、任意の１，３−ジアジンを意味する。本発明に従 うピリミジンには、天然に生ずるおよび合成の核塩基およびその類似体の両方が 含まれる。Ｃ−ピリミジン核塩基は、ヌクレオシド中に位置する場合にピリミジ ン環の炭素原子を介してヌクレオシドの糖部分に連結されるであろう核塩基であ る。本発明のペプチド核酸とともに用いる場合、上述のヌクレオシド連結と同様 の様式で、Ｃ−ピリミジン塩基はピリミジン環の炭素原子を介してペプチド核酸 主鎖に連結される。本発明に従うイソピリミジは、４−ケト−２−アミノ−、４ −チオ−２−アミノ、２−チオ−４−ケトおよび２−ケト−４−チオ−二置換ピ リミジンである。シュードピリミジンはピリミジンの５位を通してＰＮＡ鎖に直 接または間接的に結合しているものである。 合成の間、Ｌは保護基でブロックしてもよい。適当な保護基は、酸、塩基また は水添分解的もしくは光化学的に切断しうる保護基、例えば、ｔ−ブトキシカル ボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジ ルオキシカルボニル（ＺまたはＣＢＺ）、ベンゾイル、２−クロロベンジルオキ シカルボニルまたは２−ニトロベンジル（２Ｎｂ）である。 Ａは、−ＣＲ¹Ｒ²ＣＯ−、−ＣＲ¹Ｒ²ＣＳ−、−ＣＲ¹Ｒ²ＣＳｅ−、−ＣＲ¹ Ｒ²ＣＮＨＲ³−、−ＣＲ¹Ｒ²Ｃ＝ＣＨ₂−および−ＣＲ¹Ｒ²Ｃ＝Ｃ（ＣＨ₃）₂− （ここで、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は上で定義したとおりである）等の広範囲の基で ありうる。 好ましくは、Ａはメチレンカルボニル（−ＣＨ₂ＣＯ−）である。また、Ａは より長い鎖部分、例えばプロパノイル、ブタノイルもしくはペンタノイル、また はＯがＸの他の値で置き換えられているか、または鎖がＲ¹Ｒ²で置き換えられて いるか、またはＹを含む異種混合物である、対応する誘導体でありうる。さらに 、Ａは（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキレン鎖、Ｒ¹Ｒ²で置換されている（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキ レン鎖であってもよく、またはＹを含む異種混合物であってもよい。場合によっ ては、Ａは単なる単結合であってもよい。 本発明のある好ましい態様においては、Ｂは窒素原子であり、このことにより アキラル主鎖の可能性を提示する。Ｂはまた、Ｒ³Ｎ⁺であることもでき、ここで Ｒ³は上で定義したとおりである。ＢはまたＣＨ基であってもよい。 本発明のある好ましい態様においては、Ｃは（−ＣＲ⁶Ｒ⁷−）_yであり、ここ でＲ⁶およびＲ⁷は上で定義したとおりである。Ｒ⁶およびＲ⁷はまたヘテロアリー ル基、例えば、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、ピリジル、ピリミ ジニル、インドリルであってもよく、または、一緒になって、例えば、１，２− シクロブタンジイル、１，２−シクロペンタンジイル、または１，２−シクロヘ キサンジイル等の脂環系を完成してもよい。 本発明のある好ましい態様においては、ＤはＣＨ₂基である。ＤはまたＣＲ⁶Ｒ⁷ であってもよく、ここでＲ⁶およびＲ⁷は上で定義したとおりである。 本発明のある好ましい態様においては、Ｇは、いずれの向きでもよい−ＮＲ³ ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、−ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−から選択され、こ こでＲ³は上で定義したとおりである。 本発明のペプチド核酸の主鎖を形成するアミノ酸およびアミノ酸類似体は、同 一でも異なっていてもよい。我々は、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンに基づ くものが特に本発明の目的に適していることを見いだしたが、本発明の状況にお いては広範なアミノ酸類似体を用いることができる。 本発明の連結セグメントは、２つのＰＮＡ鎖を一緒に連結しうる化合物である 。好ましい配向は、第１のＰＮＡ分子のＣ末端を第２のＰＮＡ分子のＮ末端に連 結するものである。ＰＮＡセグメントを連結するための現在のところ好ましい２ つの連結セグメントは、アミノ酸基により一緒に連結した”ｅｇｌ基”（エチレ ングリコール）および”Ａｈａ基”（アミノヘキサン酸）である。現在のところ 好ましい別の連結セグメントには、α−アミノ酸、特にグリシンまたはリジンが 隙間に置かれた上述のＡｈａ基が含まれる。 広範な他の化合物もまた連結セグメントとして有用であり、したがって本発明 の範囲内に含まれる。一般に、連結セグメントは、空間スパニング基により隔て られた第１アミノ基およびカルボキシ基を有する化合物であり、ここで空間スパ ニング基は１つまたはそれ以上の官能基から形成される。空間スパニング基の代 表的な例は、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルキニル 、少なくとも１つのＯまたはＳ原子を有するＣ₁−Ｃ₂₀アルカノイル、Ｃ₇−Ｃ₃₄ アラルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₄アリールおよびアミノ酸である。好ましいアルカノイル 基は、１から１０個の複素原子（ＯまたはＳ）を有していてもよい。好ましいア ルカノイル基には、メチル、エチルおよびプロピルアルカノキシ、特にポリエト キシすなわちエチレングリコールが含まれる。α−アミノ酸のＤ、Ｌ、およびＤ Ｌ異性体を含むアミノ酸、ならびにより長い鎖のアミノ酸が一緒に連結して連結 セグメントを形成してもよい。特に好ましいアミノ酸はヘキサン酸アミノ酸であ る。空間スパニング基として用いられるアラルキル基は、芳香族環上に位置する かまたは１個もしくはそれ以上のＣＨ₂基で隔てられていてもよいアミノまたは カルボキシ基を有していてもよく、ここで、ＣＨ₂基の総数は２０個またはそれ より少ない。アラルキル連結ＰＮＡ中の置換の位置は様々であるが、オルトおよ びメタが現在のところ好ましい。これは、これらの位置における置換、特にオル ト置換が、ビスＰＮＡが湾曲するよう誘導し、したがって、２つの連結したペプ チド核酸鎖を互いにパラレルな空間位置に配置することを容易にするからである 。誘導された湾曲を含むビスＰＮＡの別の群は、シス−アルケニルリンカーまた はプロリンリンカーを取り込んだものである。 連結セグメントの選択においては、ＰＮＡ化学との適合性、およびＰＮＡの１ つの末端の官能基を第２のＰＮＡの１つの末端上の官能基に連結させる能力を考 慮すべきである。また、連結セグメントは、２つの連結したＰＮＡが、２つの独 立したＰＮＡ一本鎖が相互作用するのとほぼ同様に、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡま たはｄｓＤＮＡと相互作用しうるように柔軟であるように選択することができる 。有効であることが示されているいくつかの好ましい連結セグメントは、２３お よび２４原子の長さのものである。 ビスＰＮＡは、一本鎖ＰＮＡと比較して、改良された結合親和性、熱安定性、 および特異性を有することが示されている。ｄｓＤＮＡを標的として用いて、好 ましい配向は、ビスＰＮＡの第１のＰＮＡ鎖が標的に対してパラレルであり、す なわち、デュープレックスの標的ＤＮＡ鎖が５’から３’方向に参照され、第１ のＰＮＡはＮからＣ方向で相補的であり、かつ、ビスＰＮＡの第２のＰＮＡ鎖は 標的に対してアンチパラレルであり、すなわち、これはＣからＮ方向でＤＮＡ鎖 に相補的（ここでも５’から３’方向に参照される）であることが示されている 。したがって、連結セグメントはＰＮＡ鎖を互いに反対向きで連結させる、すな わち、共通の参照点から、一方の鎖はＮからＣ方向に並び、他方はＣからＮ方向 に並ぶ。 理論に拘束されることを望むものではないが、ビスＰＮＡのアンチパラレル鎖 がＤＮＡ標的に結合し、このことにより鎖侵入を介して他のＤＮＡ鎖を置き換え るものと考えられる。この結合はワトソン／クリック性の結合である。一方、ビ スＰＮＡの第２のＰＮＡ鎖、すなわちパラレル鎖は、ホーグスティーン型水素結 合を用いてＤＮＡに結合する。成分一本鎖ＰＮＡを用い、これらを別々におよび 混合物としてビスＰＮＡと比較することにより、ビスＰＮＡが速度においてより 速いこと、すなわちより速く標的に結合することが示された。このより速い速度 は、ビスＰＮＡにおいて第２の鎖が非常に近づけられていることによる。 我々はまた、ｄｓＤＮＡに結合したビスＰＮＡのＴｍに及ぼすｐＨの影響を、 シトシンがシュードイソシトシンで置き換えられている同一のビスＰＮＡと比較 して調べた。以前の研究においては、ＰＮＡのｄｓＤＮＡへの結合には明白なｐ Ｈ依存性があることが観察されている。ｐＨが高くなるとＴｍが低下することは 、（ＰＮＡ）₂／ＤＮＡ複合体におけるホーグスティーン結合がｐＨ依存性であ ることを示す。正常なホーグスティーン結合は、シトシンがプロトン化されてい ることを必要とする。このことは、ホーグスティーン鎖結合をｐＨ依存性にする 。我々は、ホーグスティーン鎖中の１つまたはそれ以上のシトシン核塩基をシュ ードイソシトシンおよび他の同様の核塩基で置換するとこの依存性が除去される ことを見いだした。この効果を示すために、本発明の２つのビスＰＮＡのうち、 一方をパラレル鎖中のシトシン核塩基がシュードイソシトシンで置き換えられる ように合成し、他方をアンチパラレル鎖中のシトシンがシュードイソシトシンで 置き換えられるように合成した、パラレル鎖中にシュードイソシトシンを有する ビスＰＮＡはほとんどｐＨ非依存性であり、このことは、パラレル鎖がホーグス ティーン結合に関与していることを示す。 シュードイソシトシンまたは他の同様のＣ−ピリミジン核塩基によるシトシン の置換は、以下に記載するいくつかの例に従って、簡単に実施することができる 。これは、ヌクレオシド中におけるシュードイソシトシンまたは他のＣ−ピリミ ジンによるシトシンの置換とはちようど対照的である。ヌクレオシド中において は、アノマー特異的炭素−炭素結合はＣ−ヌクレオシドの合成中に形成されなけ ればならない。ペプチド核酸中にはアノマー（糖）炭素原子がないため、そのよ うな束縛は考慮する必要はない。 本発明のさらに別の観点においては、ＰＮＡおよびビスＰＮＡを、低分子量エ フェクターリガンド、例えばヌクレアーゼ活性またはアルキル化活性を有するリ ガンドまたはレポーターリガンド（蛍光、スピンラベル、放射活性、ビオチンま たはハプテン等の蛋白質認識リガンド）にコンジュゲートさせる。本発明のさら に別の観点においては、ＰＮＡおよびビスＰＮＡをペプチドまたは蛋白質にコン ジュゲートさせ、ここで、ペプチドはシグナリング活性を有し、蛋白質は例えば 酵素、転写因子または抗体である。また、ＰＮＡを水溶性または非水溶性ポリマ ーに結合させることもできる。本発明の別の観点においては、ＰＮＡおよびビス ＰＮＡを、オリゴヌクレオチドまたは炭水化物にコンジュゲートさせる。是認さ れる場合には、ＰＮＡまたはビスＰＮＡをさらに別の部分（例えばペプチド鎖、 レポーター、インターカレーターまたは他のタイプのリガンド含有基）に結合す るように合成し、さらにこれを固体支持体に結合させることができる。このよう なＰＮＡコンジュゲートは、本発明の他のＰＮＡのように、遺伝子調節（例えば 、遺伝子標的化薬剤）に、診断に、バイオテクノロジーおよび研究プローブ、プ ライマー、人工制限酵素等として用いることができる。 本発明の別の観点としては、ＰＮＡおよびビスＰＮＡを用いてＲＮＡおよびｓ ｓＤＮＡを標的化し、相補型の遺伝子制御部分および核酸の同定および精製用の ハイブリダイゼーションプローブの両方を製造することができる。さらに、ＰＮ ＡおよびビスＰＮＡを、これらがｄｓＤＮＡとトリプルらせんを形成することが できるように修飾することができる。配列特異的にｄｓＤＮＡに結合する試薬は 、遺伝子標的化薬剤としての適用を有する。これらは、癌、ＡＩＤＳおよび他の ウイルス感染等の疾患を治療するための非常に有用な薬剤として予知されており 、また、ある種の遺伝的疾患の治療に有効であることが判明するであろう。さら に、 これらの試薬を研究のためおよび診断において特定の核酸の検出および単離のた めに用いることができる。 当該技術分野においては、トリプルらせんの原理はｄｓＤＮＡの配列特異的認 識に用いられている。トリプルらせん形成は、ホモプリン−ホモピリミジン配列 の認識を利用する。トリプルらせん形成を伴う鎖置換複合体は、鎖置換複合体が 生理学的条件下、すなわち、中性ｐＨ、周囲温度（２０−４０℃）および中程度 の（１００−１５０ｍＭ）イオン強度で非常に安定であるという点において、単 純なトリプルらせん認識より優れている。 遺伝子標的化薬剤は、標的遺伝子の制御領域（プロモーター）に相補的な核塩 基配列（約１０から約２０ユニットを含む）を有するように設計される。したが って、この薬剤を投与すると、これはプロモーターに結合しＲＮＡポリメラーゼ がそれにアクセスすることを妨害する。結局、ｍＲＮＡ、したがって、遺伝子産 物（蛋白質）は生成されない。ウイルスについては、標的が生命の維持に必要な 遺伝子中にあれば、生存可能なウイルス粒子は生成しないであろう。あるいは、 標的はプロモーターの下流にあり、ＲＮＡポリメラーゼをこの位置で終了させ、 このことにより非機能性のトランケート型のｍＲＮＡ／蛋白質を形成させること もできる。 塩基相補的なハイブリダイゼーションによるｓｓＤＮＡの配列特異的認識は、 同様に、標的特異的遺伝子およびウイルスに利用することができる。この場合、 標的配列は、薬剤の標的への結合がリボソームの作用、したがってｍＲＮＡの蛋 白質への翻訳を妨害するように、ｍＲＮＡ中に含まれる。本発明のビスＰＮＡは 、相補的なｓｓＤＮＡに対して著しく高い親和性を有する点において従来の薬剤 より優れている。また、これらは、細胞取り込みを容易にするように電荷を有さ ず水溶性であるように合成することができ、生物学的に安定でありプロテアーゼ 等による酵素的分解に耐性となるように非生物学的アミノ酸のアミドを含有する ように合成することができる。 本発明のビス−ＰＮＡおよびＣ−ピリミジンおよびイソピリミジン核塩基含有 ＰＮＡは、特に診断アッセイおよび分子生物学的クローニングおよびサブクロー ニング技術において有用であり、ビスＰＮＡの二本鎖ＤＮＡへの結合において生 ずる鎖置換効果の利点を利用することができる。さらに、これらは正常ＰＮＡよ り高い塩基ミスマッチ特異性を示すため、診断試験およびＰＣＲに基づくアッセ イの改変において有用な転写阻害に有利に用いることができる。 モノマー性構築ブロックの合成 本発明のモノマー性構築ブロックは、アミノ酸またはアミノ酸類似体主鎖部分 および核塩基部分からなる。より一般化された記述は、カルボキシル官能基、ア ミノ官能基および少なくとも１つの他の官能基（例えば核塩基または核塩基類似 体）を有する主鎖であろう。モノマー性構築ブロックは、好ましくは、合成され るモノマーに依存して様々な一般的方法により合成される。これには、核塩基お よび任意のテザー官能部分、例えばＮ（２−アミノエチル）グリシンを付加する 前にモノマー性構築ブロックの主鎖部分を製造することが含まれる。例示は実施 例１、２、７、８および９に記載される。次に、所望の核塩基または核塩基類似 体を主鎖部分に共有結合させて、モノマー性構築ブロックを得る。チミンモノマ ーの合成は実施例３−６に、保護されたシトシンモノマーの合成は実施例９−１ ７に例示される。 保護されたアデニンモノマーの合成は、実施例１８−２２に例示されるように 、ブロモ酢酸エチルによるアルキル化およびＸ線結晶解析により置換位置が所望 の９位であることを確認することを含んでいた。次に、試薬Ｎ−エチル−ベンジ ルオキシカルボニルイミダゾールテトラフルオロボレートを用いて、Ｎ⁶−アミ ノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護した。生成物エステルの単純な加水分 解によりＮ⁶−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニンが得 られ、これを次に標準的方法において用いた。 保護されたＧ−モノマーの合成は、実施例２３−２５に例示される。出発物質 である２−アミノ−６−クロロプリンをブロモ酢酸でアルキル化し、次に塩素原 子をベンジルオキシ基で置換した。得られた酸を試薬ＰｙＢｒｏｐ（商標）を用 いて（ｂｏｃ−アミノエチル）グリシンメチルエステルにカップリングさせ、得 られたエステルを加水分解した。ＰＮＡ−オリゴマーの合成の最終ＨＦ切断段階 において、Ｏ⁶−ベンジル基を除去した。切断は、縮合剤としてジイソプロピル カルボジイミドを用いてＰＮＡ−オリゴマー中に取り込ませた後、最終ＰＮＡオ リ ゴマーの予測された分子量を判定することにより確認した。 Ｃ−ピリミジンおよびイソピリミジン複素環塩基を有するモノマーの合成、お よびこれらのＰＮＡおよびビスＰＮＡ中への取り込みは、別の実施例に例示され る。アンチパラレル鎖を含むビスＰＮＡのパラレル鎖中におけるシトシンのシュ ードイソシトシンによる置換は、あるｐＨ範囲において安定であることが示され ているが、シトシンが存在する場合には同じビスＰＮＡはｐＨ依存性を示す。こ の効果は実施例６１に例示される。 シュードイソシトシンモノマーの合成は、実施例２６−３２に例示される。イ ソシトシン、５−ブロモウラシル、またはシュードウラシルのいずれかを有する 他のモノマー性構築ブロックの合成は、実施例３３−４４に例示される。 ＰＮＡおよびビスＰＮＡの合成 ＰＮＡおよびビスＰＮＡの合成は、第１のモノマー性構築ブロックを固体支持 体に結合させることを含む。次に、所望のＰＮＡの解明は、脱保護およびカップ リングを含む反復プロセスにより実施する。所望の分子がビスＰＮＡである場合 、モノマー性構築ブロックを取り込ませるのとほぼ同一の方法によりテザーを取 り込ませ、次に別の反復プロセスを上述のように実施して、所望の配列の第２の ＰＮＡ鎖を解明する。 分子を固体マトリックス上にアンカリングさせる原理は、化学変換の間の中間 体生成物を説明することを助け、これは固相合成またはメリフィールド（Ｍｅｒ ｒｉｆｉｅｌｄ）合成として知られている（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６３，８５，２１４９およびＳｃｉｅｎｃｅ ，１９８６，２３２，３４１を参照のこと）。アミノ酸のペプチド中への段階的 またはフラグメント的固相アセンブリの確立された方法は、通常は、ジビニルベ ンゼンの混合物を添加したスチレンモノマーのパール重合により形成された架橋 コポリマーである、わずかに架橋されたスチレン−ジビニルベンゼンコポリマー のビーズマトリックスを利用する。通常は、１−２％のレベルの架橋が用いられ る。このようなマトリックスを本発明に従う固相ＰＮＡ合成において用いること もできる（図８）。 固相の最初の官能化に関しては、伝統的固相ペプチド合成に関連して５０を越 える方法が記載されている（例えば、Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅ ｌｄ，”Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”Ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９，ｐｐ．１−２８４およびＳｔｅｗａｒｔ ａ ｎｄ Ｙｏｕｎｇ，”Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅ ｓｉｓ”，２ｎｄ Ｅｄ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，１９８４を参照のこと）。クロロメチル官能基（メリフィー ルド試薬；クロロメチルメチルエーテル／ＳｎＣｌ₄反応を経由）、アミノメチ ル官能基（Ｎ−ヒドロキシメチルフタルイミド反応を経由；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７６，３７９５を参 照）、およびベンズヒドリルアミノ官能基（Ｐｉｅｔｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７０，６５０）の導入のための反応が最も広く適用さ れている。その性質にかかわらず、官能基の目的は通常は、コポリマー固体支持 体と固体支持体にカップリングされるべき第１のモノマー性構築ブロックのＣ末 端との間にアンカー連結を形成することにある。認識されるように、アンカー連 結はまた、固体支持体とモノマー性構築ブロックのＮ末端との間に形成すること もできる。一般に、官能基の”濃度”はグラムあたりミリモル（ｍｍｏｌ／ｇ） として表現することが便利である。最初に導入される他の反応性官能基には、４ −メチルベンズヒドリルアミノおよび４−メトキシベンズヒドリルアミノが含ま れる。これらの確立された方法の全ては原則として本発明の状況において有用で ある。ＰＮＡ合成のための好ましい方法は、アミノメチルを最初の官能基として 用いる。ここで、アミノメチルは、スペーサー形成試薬の一方の末端におけるカ ルボン酸基に対するアミド結合が本質的に定量的に形成するというアミノメチル 官能基のアミノ基の反応性のため、”スペーサー”または”ハンドル”基の取り 込みに関して特に有利である。非常に多数の関連するスペーサー−またはハンド ル−形成二官能性試薬（Ｂａｒａｎｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉ ｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，１９８７，３０，７０５を参照のこと）、特 にアミノメチル官能基において見いだされるようなアミノ基に対して反応性であ る試薬が記載されている。代表的な二官能性試薬としては、４−（ハロアルキル ）アリール−低級アルカン酸（例えば４−（ブロモメチル）フェニル酢酸）、Ｂ ｏｃ−ア ミノアシル−４−（オキシメチル）アリール−低級アルカン酸（例えばＢｏｃ− アミノアシル−４−（オキシメチル）フェニル酢酸）、Ｎ−Ｂｏｃ−ｐ−アシル ベンズヒドリルアミン（例えばＮ−Ｂｏｃ−ｐ−グルタロイルベンズヒドリルア ミン）、Ｎ−Ｂｏｃ−４’−低級アルキル−ｐ−アシルベンズヒドリルアミン（ 例えばＮ−Ｂｏｃ−４’−メチル−ｐ−グルタロイルベンズヒドリルアミン）、 Ｎ−Ｂｏｃ−４’−低級アルコキシ−ｐ−アシルベンズヒドリルアミン（例えば Ｎ−Ｂｏｃ−４’−メトキシ−ｐ−グルタロイルベンズヒドリルアミン）、およ び４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸が挙げられる。本発明の状況において特 に関連性のあるスペーサー基の１つのタイプは、フェニルアセトアミドメチル（ Ｐａｍ）ハンドル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｏ ｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７６，４１，２０１５）であり、これは、４−フェニル アセトアミドメチル基の電子回収（ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ）効果に由来するが 、古典的なベンジルエステル結合よりＢｏｃ−アミノ脱保護試薬であるトリフル オロ酢酸（ＴＦＡ）に対して約１００倍安定である。 合成されたＰＮＡまたはビスＰＮＡ鎖を、ＰＮＡまたはビスＰＮＡ鎖のＣ末端 がアミド型であるように固体支持体から切断する目的で取り込まれてもよいある 種の官能基（例えばベンズヒドリルアミノ、４−メチルベンズヒドリルアミノお よび４−メトキシベンズヒドリルアミノ）は、スペーサー基の導入を必要としな い。いずれのこのような官能基も、本発明の状況において有利に用いることがで きる。 スペーサーまたはハンドル基の導入に関する別の方法は、いわゆる”あらかじ め形成されたハンドル”方法であり（Ｔａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉ ｓ，１９７９，９５５−９５７を参照のこと）、これは第１のモノマー性構築ブ ロックのカップリングの間の完全な制御を与え、ＰＮＡ合成と関係のない望まれ ない官能基の存在から生ずる複雑性の可能性を排除する。この方法においては、 上述したものと同一のタイプのスペーサーまたはハンドル基を、固体支持体に結 合することが望まれる第１のモノマー性構築ブロックと反応させ、モノマー性構 築ブロックはＮ−保護されており、所望のＰＮＡ鎖の成長に関して関連性のない 他の側鎖で任意に保護されている。すなわち、スペーサーまたはハンドル基が望 ましい場合においては、固体支持体にカップリングさせるべき第１のモノマー性 構築ブロックは、最初に導入された官能基（例えば、アミノメチル基）に結合し ているスペーサー基の遊離の反応性末端にカップリングさせてもよく、あるいは スペーサー形成試薬と反応させてもよい。次に、スペーサー形成試薬を最初に導 入された官能基と反応させる。他の有用なアンカー形成スキームには、”マルチ デタッチャブル”樹脂（Ｔａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ ｔｔ．，１９７９，４９３５およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８０， １０２，６１１；Ｔａｍ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，５０，５２９１ ）が含まれ、これは１より多い放出のモードを提供し、このことにより合成の設 計をより柔軟にする。 Ｎ−保護の適当な選択は、通常は側鎖の保護のためのベンジル系基と組み合わ せて用いられるｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基（Ｃａｒｐｉｎ ｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５７，７９，４４２７；ＭｃＫａｙ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５７，７９，４６８６；Ａ ｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５７，７ ９，６１８０）、および通常は任意の側鎖の保護のためのｔｅｒｔ−ブチル（ｔ Ｂｕ）基と組み合わせて用いられる９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ Ｆｍｏｃ）基（Ｃａｒｐｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ，１９７０，９２，５７４８およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７２，３７， ３４０４）であるが、従来の固相ペプチド合成においてよく知られている多くの 他の可能性が存在する。 すなわち、広範な他の有用なアミノ保護基が存在し、そのいくつかは、Ａｄｏ ｃ（Ｈａｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６６，８８ ，１９８８）、Ｂｐｏｃ（Ｓｉｅｂｅｒ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．，１ ９６８，５１，６１４）、Ｍｃｂ（Ｂｒａｄｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ ｈｅｍ．，１９７７，４２，１４３）、Ｂｉｃ（Ｋｅｍｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅ ｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９７５，４６２４）、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル （Ｎｐｓ）（Ｚｅｒｖａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１ ９６３，８５，３６６０）、およびジチアスクシノイル（Ｄｔｓ）（Ｂａｒａｎ ｙ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７７，９９，７３６３） である。これらのアミノ保護基、特に広く用いられているウレタン官能基系のも のは、ほとんどのα−アミノ酸のカップリングの間に首尾よくラセミ化を妨害す る（容易に形成されるオキサゾリノン（アザラクトン）中間体の互変異性化によ り媒介される（Ｇｏｏｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ，１９６４，８６，２９１８））。このようなアミノ保護基に加えて、あらゆる 範囲の非ウレタンタイプのアミノ保護基が、ＰＮＡ分子、特にアキラルユニット から構築されるものを組み立てる場合に適用しうる。すなわち、上述したアミノ 保護基（またはそれらの任意の基から誘導されるもの）のみならず、以下の要件 をよく満たすほとんどいかなるアミノ保護基も本発明の状況において有用である ：（１）穏和な酸に対する安定性（カルボキシル基により顕著に攻撃されない） ；（２）穏和な塩基または求核基に対する安定性（問題とするアミノ基により顕 著に攻撃されない）：（３）アシル化に対する耐性（活性化アミノ酸または活性 化モノマー性構築ブロックにより顕著に攻撃されない）。さらに、（４）保護基 は重要な副反応なしにほぼ定量的に除去されなくてはならず、そして（５）存在 する場合には、入りつつあるモノマー性構築ブロックの光学的一体性は、好まし くはカップリングの際に高度に保存されるべきである。最後に、側鎖官能基の保 護は繰り返されるアミノ脱保護サイクルの条件に抵抗しなければならないため、 側鎖保護基の選択は一般にアミノ保護基の選択に依存する。これは、ＰＮＡまた はビスＰＮＡ分子の化学的な組立の総合的方法が、例えばアミノおよび側鎖保護 基の異なる酸安定性に頼るか（上述の”Ｂｏｃ−ベンジル”アプローチの場合等 ）、または直交するすなわち化学選択的な保護スキームを用いるか（上述の”Ｆ ｍｏｃ−ｔＢｕ”アプローチの場合等）にかかわらず真実である。 第１のモノマー性構築ブロックのカップリングに続いて、固相合成の次の段階 は、所望のＰＮＡ鎖の体系的な仕上げである。この仕上げは、繰り返される脱保 護／カップリングのサイクルを含む。最後にカップリングされたモノマー性構築 ブロック上の一時的保護基、例えばＢｏｃまたはＦｍｏｃ基は、適当な処理、例 えばＢｏｃの場合にはトリフルオロ酢酸等によるアシドリシス、または、Ｆｍｏ ｃの場合にはピペリジン等による塩基処理により定量的に除去され、Ｎ末端アミ ン官能基が解放される。 次の所望のN−保護されたモノマー性構築ブロックは、次に最後にカップリン グされたモノマー性構築ブロックのN末端にカップリングされる。このモノマー 性構築ブロックのC末端と最後にカップリングされたモノマー性構築ブロックのN 末端とのカップリングは、いくつかの方法により実施することができる。例えば 、入りつつあるモノマー性構築ブロックをいくつかの方法のいずれかにより活性 化されたカルボキシル基を有する形で提供することによりこれを結合させること ができる。この方法には、２，４，５−トリクロロフェニルエステル（Ｐｌｅｓ ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９６３，４６，１６０９ ）、フタルイミドエステル（Ｎｅｆｋｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ ｍ．Ｓｏｃ．，１９６１，８３，１２６３）、ペンタクロロフェニルエステル（ Ｋｕｐｒｙｓｚｅｗｓｋｉ，Ｒｏｃｚ．Ｃｈｅｍ．，１９６１，３５，５９５） 、ペンタフルオロフェニルエステル（Ｋｏｖａｃｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６３，８５，１８３）、ｏ−ニトロフェニルエステル （Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５５，１７５，６８５）、イミダゾ ールエステル（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７０ ，９２，７６０８）、および３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキ ナゾリン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）エステル（Ｋｏｎｉｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ． Ｂｅｒ，１９７３，１０３，２０２４および２０３４）等の活性エステル誘導体 の最初の形成、または対称アンヒドリド（Ｗｉｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９７１，１０，３３６）等 のアンヒドリドの最初の形成が含まれる。あるいは、入りつつあるモノマー性構 築ブロックのカルボキシル基を、例えば、ジクロロヘキシルカルボジイミド（Ｓ ｈｅｅｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５５，７７ ，１０６７）またはその誘導体等の縮合試薬の補助により、最後にカップリング されたモノマー性構築ブロックのＮ末端と直接反応させてもよい。第２アミノ基 を含むＰＮＡまたはビスＰＮＡ分子を組み立てる場合には、ベンゾトリアゾリル Ｎ−オキシ−トリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ ＢＯＰ）、”Ｃａｓｔｒｏ試薬”（例えば、Ｒｉｖａｉｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．， Ｔｅ ｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９８０，３６，３４１３を参照のこと）が推奨される。 最後に、最近報告されたアミノ酸フッ化物に類似する活性化ＰＮＡモノマー（Ｃ ａｒｐｉｎｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，９６５１） も、ＰＮＡおよびビスＰＮＡ合成において用いるのに多大な見込みを有する。 固体支持体に結合したＰＮＡ鎖からのビスＰＮＡの合成は、ＰＮＡ鎖の合成に 用いた反復プロセスに類似する。最後の所望のモノマー性構築ブロックをカップ リングさせ、ゲルを適当な溶媒、例えばピリジンで洗浄する。末端Ｎ保護基を除 去し、活性化された連結セグメントをカップリングさせる。連結セグメントは単 一ユニットであってもよく、またはエチレングリコールもしくはアミノヘキサン 酸タイプの連結セグメントの場合と同様に（実施例４７および５５）、連結セグ メントを一緒にカップリングさせたときに所望の連結セグメントを与えるサブユ ニットとして付加してもよい。ＰＮＡの第２のセグメントの合成は、第１のセグ メントと同様に実施する。 保護基を含む所望のＰＮＡまたはビスＰＮＡ鎖の組立に続いて、次の段階は通 常は、ＰＮＡまたはビスＰＮＡ鎖のカップリングされた構築ブロックの脱保護お よび合成されたＰＮＡまたはビスＰＮＡの固体支持体からの切断である。これら のプロセスは実質的に同時に実施することができ、このことにより、遊離のＰＮ ＡまたはビスＰＮＡ分子が所望の形で与えられる。あるいは、２つの別々に合成 されたＰＮＡ鎖の縮合が実施される場合には、合成開始時に適当なスペーサー基 を選択することにより所望のＰＮＡまたはビスＰＮＡ鎖をそれぞれの固体支持体 から切断し（いずれのペプチド鎖も依然としてその側鎖保護基を取り込んでいる ）、例えば２つの側鎖保護されたペプチド鎖をカップリングさせてより長いＰＮ ＡまたはビスＰＮＡ鎖を形成した後に、最後に側鎖保護基を除去する。 上述の”Ｂｏｃ−ベンジル”保護スキームにおいては、側鎖の最終的な脱保護 およびＰＮＡまたはビスＰＮＡ分子の固体支持体からの放出は、最もしばしば、 無水ＨＦ（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ ．Ｊｐｎ，１９６５，３８，４９２１）、ボロントリス（トリフルオロ酢酸）（ Ｐｌｅｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９７３，４６， １６０９）、およびトリフルオロメタンスルホン酸およびメタンスルホン酸等の ス ルホン酸（Ｙａｊｉｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ．，１９７４，１０７）等の強酸を用いて実施される。この従来の強酸 （例えば無水ＨＦ）脱保護方法は、ＰＮＡ鎖中の感受性残基のアルキル化および アシル化を引き起こしうる非常に反応性の高いカルボカチオンを生成する。この ような副反応は、アニソール、フェノール、ジメチルスルフィドおよびメルカプ トエタノール等のスカベンジャーの存在によっては部分的にしか回避することが できず、したがって、有害なカルボカチオンの前駆体を除去して不活性なスルホ ニウム塩を形成するスルフィド補助アシドリシスＳ_N２脱保護方法（Ｔａｍ，ｅ ｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８３，１０５，６４４２およ びＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８６，１０８，５２４２）、いわゆる” 低（ｌｏｗ）”がペプチドおよびＰＮＡ合成において、単独でまたは”高（ｈｉ ｇｈ）”方法との組み合わせでしばしば用いられる。より頻度は低いが、特定の 場合においては、脱保護および／またはＰＮＡ−固体支持体結合の最終切断に用 いられる他の方法は、例えば、塩基触媒性アルコリシス（Ｂａｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７３，９５，４５０１）、および アンモリシスならびにヒドラジノリシス（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．，１９６４，１４２３）、水添分解（Ｊｏｎｅｓ，Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７７，２８５３およびＳｃｈｌａｔｔｅｒ， ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７７，２８６１）、お よび光分解（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｇｕｒｗａｒａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ ．，１９７５，９７，１５７５）等の方法である。 最後に、”正常な”ペプチドの化学的合成とは対照的に、例えばアミノエチル グリシル主鎖ユニットに基づくもの等のアキラルＰＮＡおよびビスＰＮＡの段階 的鎖構築は、カップリング反応がラセミ化を含まないため、Ｎ末端またはＣ末端 のいずれから始めることもできる。当業者は、Ｃ末端で開始する合成が典型的に は保護されたアミン基および遊離または活性化酸基を用いるが、Ｎ末端で開始す る合成が典型的には保護された酸基および遊離または活性化されたアミン基を用 いることを認識するであろう。 固相ペプチド合成の合成サイクルにおいてはほとんどの操作が同一であるとい う認識に基づいて（固相ＰＮＡおよびビスＰＮＡ合成の場合ににもあてはまる） 、多数のペプチドの製造を容易にするために、新規マトリックスであるＰＥＰＳ が最近導入された（Ｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．， １９８９，１１１，８０２４および国際特許出願ＷＯ９０／０２７４９）。この マトリックスは、ぶら下がった長鎖ポリスチレン（ＰＳ）グラフト（分子量１０⁶ の桁）を有するポリエチレン（ＰＥ）フィルムからなる。フィルムの負荷容量 は、ビーズマトリックスと同程度に高いが、ＰＥＰＳは、多数の同時合成に適合 する追加の柔軟性を有する。すなわち、固相ペプチド合成のための新規コンフィ ギュレーションにおいては、ＰＥＰＳフィルムは、それぞれが個々のコンパート メントとして働く、別々の、ラベルされたシートの形状に仕上げられる。合成サ イクルのすべての同一段階の間、シートは単一の反応容器中に一緒に保持されて 、従来の方法による単一のペプチドの速度と近い速度で多数のペプチドを同時に 製造することを可能とする。これは、問題とする特定の化学に適合するリンカー またはスペーサー基を含むＰＥＰＳフィルム支持体が多数のＰＮＡおよびビスＰ ＮＡ分子の合成において特に価値が高いためである。通常は４つの”シュードヌ クレオチド”ユニットのそれぞれに対して４つの異なる反応コンパートメントの みが必要であるため、ＰＮＡおよびビスＰＮＡ分子は概念的には簡単に合成しう る。すなわち、ＰＥＰＳフィルム支持体は、平行して実質的に同時に実施される 多くのＰＮＡ合成において首尾よく試験されてきた。ＰＥＰＳから得られた生成 物の収率および品質は、伝統的なポリスチレンビーズ支持体を用いて得られたも のに匹敵した。またＰＥＰＳポリマーの他の形状、例えば、不織フェルト、編ネ ット、スティックまたはマイクロウエルプレートを用いた実験は、合成効率の何 らの限界も示さなかった。 多数のペプチドの同時合成のために提案された２つの他の方法も、多数の異な るＰＮＡ分子の製造に適用することができる、これらの方法の第１（Ｇｅｙｓｅ ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４ ，８１，３９９８）は、アクリル酸−グラフトポリエチレンのロッドおよび９６ −マイクロタイターウエルを用いて、成長しつつあるペプチド鎖を固定化し、コ ンパートメント化された合成を実施する。この方法は高度に効果的ではあるが、 マ イクログラムスケールにしか適用することができない。第２の方法（Ｈｏｕｇｈ ｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，５ １３１）は、伝統的に用いられるポリマービーズを含む”ティーバッグ”を用い る。本発明の状況における多数のペプチド、ＰＮＡまたはビスＰＮＡ合成につい ての他の関連性のある提案には、異なる密度を有する２つの異なる支持体の同時 使用（Ｔｒｅｇｅａｒ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏ ｒ Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，１９７２ ｐｐ．１７５−１７ ８）、マニホールドを介する反応容器の組み合わせ（Ｇｏｒｍａｎ，Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３６，３９７）、マルチカラム固相合成（例え ば、Ｋｒｃｈｎａｋ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉ ｎ Ｒｅｓ．，１９８９，３３，２０９およびＨｏｌｍ ａｎｄ Ｍｅｌｄａｌ ，”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ２０ｔｈ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐ ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ”，Ｇ．Ｊｕｎｇ ａｎｄ Ｅ．Ｂａｙｅｒ ，ｅｄｓ．，Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ＆Ｃｏ．，Ｂｅｒｌｉｎ，１ ９８９，２０８−２１０）、およびセルロース紙の使用（Ｅｉｃｈｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８９ ，５４，１７４６）、および米国特許５，３２４，４８３（１９９４年６月２８ 日発行）が含まれる。 固相ＰＮＡおよびビスＰＮＡ合成に関しては、従来の架橋スチレン／ジビニル ベンゼンコポリマーマトリックスおよびＰＥＰＳ支持体が現在のところ好ましい が、関連性があるであろう固体支持体の例の非限定的リストは：（１）Ｎ，Ｎ’ −ビスアクリロイルエチレンジアミンと架橋したジメチルアクリルアミドのコポ リマーに基づく粒子であり、既知の量のＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ベ ータ−アラニル−Ｎ’−アクリロイルヘキサメチレンジアミンを含む。いくつか のスペーサー分子が、典型的にはベータアラニル基、次にアミノ酸残基サブユニ ットを介して付加される。また、重合の間にベータアラニル含有モノマーをアク リロイルサルコシンモノマーで置き換えて、樹脂ビーズを形成することもできる 。重合の次にビーズをエチレンジアミンと反応させて、共有結合的に連結した官 能 基として第１アミンを含む樹脂粒子を形成する。ポリクリルアミド系支持体は、 ポリスチレン系支持体よりも比較的より疎水的であり、通常は、ジメチルホルム アミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンおよび同様のもの等の極 性非プロトン性溶媒とともに用いられる（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７５，９７，６５８４，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈ ｅｍ．１９７９，８，３５１およびＪ．Ｃ．Ｓ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ ５３８（１ ９８１）を参照のこと）；（２）固体支持体の第２グループは多孔性ガラスビー ズおよびシリカゲル等の、シリカ含有粒子に基づく。１つの例は、商標”ＰＯＲ ＡＳＩＬ Ｅ”としてＷａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈ ａｍ，ＭＡ，ＵＳＡから販売されている、トリクロロ−［３−（４−クロロメチ ル）フェニル］プロピルシランと多孔性ガラスビーズとの反応生成物である（Ｐ ａｒｒ ａｎｄ Ｇｒｏｈｍａｎｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ ．Ｅｄ．１９７２，１１，３１４を参照のこと）。同様に、１，４−ジヒドロキ シメチルベンゼンとシリカとのモノエステル（商標”ＢＩＯＰＡＫ”としてＷａ ｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから販売）は、有用であることが報告されてい る（Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｊｕｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１ ９７０，４５０３を参照のこと）；（３）第３のタイプの有用な固体支持体は、 これらが２つの主要な成分、すなわち樹脂および用いられる有機合成反応条件で 実質的に不活性の他の材料を含む点において複合材料と称することができる。１ つの例示的複合材料（Ｓｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｓｃｉ．， １９７１，９，５７７を参照のこと）は、反応性クロロメチル基を含む疎水性架 橋スチレンポリマーで被覆したガラス粒子を用い、これはＮｏｒｔｈｇａｔｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡにより供給 された。他の例示的複合材料は、フッ素化エチレンポリマーのコアを含み、この 上にポリスチレンがグラフトされている（Ｋｅｎｔ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅ ｌｄ，Ｉｓｒａｅｌ Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９７８，１７，２４３およびｖａｎ Ｒ ｉｅｔｓｃｈｏｔｅｎ，”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９７４”，Ｙ．Ｗｏｌｍａｎ， Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７５，ｐｐ． １１３−１１６を参照のこと）；および（４）ＰＥＰＳ以外の連続固体支持体、 例 えば綿シート（Ｌｅｂｌ ａｎｄ Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ． １９８９，２，２３２）およびヒドロキシプロビルアクリレート被覆ポリプロピ レン膜（Ｄａｎｉｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９８９，４３４５）もまた、ＰＮＡおよびビスＰＮＡ合成に適している。 手動または自動で操作しても、本発明の状況においては固相ＰＮＡおよびビス ＰＮＡ合成は通常はバッチ式で実施される。しかし、ほとんどの合成は、支持体 をカラム中に詰めた連続フローモードにおいても同様に実施することができる（ Ｂａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９７０， ４５０３およびＳｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ ．，１９７１，９，５７７）。連続フロー固相合成に関しては、硬質ポリ（ジメ チルアクリルアミド）−多孔質ケイソウ土（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ）支持体（Ａ ｔｈｅｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕ ｎ．，１９８１，１１５１）が特に首尾がよいように見えるが、他の有用なコン フィギュレーションは、標準的コポリ（スチレン−１％−ジビニルベンゼン）支 持体（Ｋｒｃｈｎａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９８７，４４６９）について達成されたものに関する。 ＰＮＡおよびビスＰＮＡ合成に関しては、現在のところ固相技術が好ましいが 、他の方法論またはそれらの組み合わせ、例えば、固相技術との組み合わせも同 様に適用することができる。（１）段階的組立またはセグメント／フラグメント 縮合のいずれかによる、ペプチド合成のための古典的溶液相方法（例えば、Ｂｏ ｄａｎｓｚｋｙ，”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈ ｅｓｉｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎｅｗ Ｙｏｒ ｋ１９８４）は、非常に大きいスケール（グラムまたはキログラム）のＰＮＡま たはビスＰＮＡ化合物の製造を考慮したとき、特に関連性が高いであろう；（２ ）線状ポリスチレン（Ｓｈｅｍｙａｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９６５，２３２３）およびポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）（Ｍｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ． Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９７４，１３，８８）等の可溶性ポリマー支持体を用いる 、いわゆる”液相”方法は有用である；（３）ランダム重合（例えば、Ｏｄｉａ ｎ，” Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，ＭｃＧｒａｗ −Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７０）を参照のこと）は、多くの分子量” （ポリディスパース”）のペプチド、ＰＮＡまたはビスＰＮＡ分子の混合物を与 え、抗ウイルス効果のスクリーニング等の目的に特に関連性が高い；（４）ポリ マー支持アミノ酸活性エステルの使用に基づく技術（Ｆｒｉｄｋｉｎ，ｅｔ ａ ｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６５，８７，４６４６）は、”逆メ リフィールド合成”または”ポリマー性試薬合成”とも称され、中間体生成物の 単離および生成に利点を提供し、したがって、次にフラグメント縮合によりより 大きいＰＮＡまたはビスＰＮＡ分子を得ることができる、中間のサイズの任意に 保護されたＰＮＡまたはビスＰＮＡ分子の合成に特に適した方法を提供する；（ ５）新規な特異性を有するプロテアーゼまたはその誘導体（例えばプロテインエ ンジニアリング等の人工的手段により得られる）等の酵素によりＰＮＡ分子を酵 素的に組み立てることが意図される。また、多数のＰＮＡフラグメントを縮合さ せて非常に大きいＰＮＡまたはビスＰＮＡ分子を生成するための”ＰＮＡリガー ゼ”の開発を意図することができる；（６）興味あるほとんどいかなる分子に対 しても抗体を生成させることができるため、Ｌｅｒｎｅｒのグループ（Ｔｒａｍ ａｎｔａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３４，１５６６） およびＳｃｈｕｌｔｚのグループ（Ｐｏｌｌａｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ ｃｅ，１９８６，２３４，１５７０）により同時に発見された、最近開発された 触媒的抗体（アブザイム：ａｂｚｙｍｅｓ）もまた、ＰＮＡおよびビスＰＮＡ分 子を組み立てるための潜在的候補として考慮すべきである。すなわち、アシル転 移反応を触媒するアブザイムの製造は非常に成功している（例えば、Ｓｈｏｋａ ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３８，２６９およびこの中の引 用文献を参照のこと）。最後に、ごく最近Ｓｔｅｗａｒｔのグループによって発 見された完全に人工的な酵素（Ｈａｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９ ９０，２４８，１５４４）をＰＮＡ合成に適するように開発することができる。 特定のカップリング反応を媒介しうる、一般的に適用しうる酵素、リガーゼおよ び触媒的抗体の設計は、”正常な”ペプチド合成よりもＰＮＡ合成についてより 容易に達成されるはずである。これは、２０個の天然に生ずる（蛋白質生成性 （ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ））アミノ酸から構成されるペプチドと比較して 、ＰＮＡ分子はしばしば４つの異なるアミノ酸のみ（４つの天然の核塩基につい てそれぞれ１つ）からなるであろうためである。結論として、特定のＰＮＡまた はビスＰＮＡ分子の合成に単一の方法が完全に適していることはなく、したがっ て、複数の方法の組み合わせがしばしばもっともよく働く。 本発明はまた、ＰＮＡおよびビスＰＮＡの治療的または予防的使用に関する。 治療および予防的標的であろうものとしては、ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ） 、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、カン ジダアルビカンス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ） 、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）、ホスホリ パーゼＡ₂（ＰＬＡ₂）プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、およびＲＡＳオンコジ ンが挙げられる。このような標的への潜在的適用には、眼、口唇、性器および全 身性ヘルペス単純ウイルスＩおよびＩＩ感染；性器いぼ；子宮頸癌；尋常性ゆう ぜい；カポジ肉腫；ＡＩＤＳ；皮膚および全身性真菌感染；インフルエンザ；肺 炎；免疫抑制患者における網膜炎および肺炎；単核細胞症；眼、皮膚および全身 性炎症；心血管疾患；癌；喘息；乾癬；心血管虚脱；心筋梗塞；胃腸疾患；腎疾 患；慢性関節リウマチ；骨関節炎；急性膵炎；敗血症性ショック；クローン病； および細菌感染の治療が含まれる。 治療的または予防的処置のためには、本発明のＰＮＡおよびビスＰＮＡを、担 体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤等を含んでいてもよい医薬組 成物中に処方することができる。医薬組成物は、ＰＮＡまたはビスＰＮＡに加え て、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等の１つまたはそれ以上の活性成分を含んでいて もよい。 医薬組成物は、局所または全身処置が望まれるか、および処置されるべき領域 に依存して多くの方法で投与することができる。投与は、局所（目、膣、直腸、 鼻孔内を含む）、経口、吸入、または例えば、静脈内滴注、または皮下、腹腔内 もしくは筋肉内注射による非経口で実施することができる。 局所投与のための処方には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、 座剤、スプレー、水剤および散剤が含まれる。通常の医薬担体、水性、粉末また は油性基剤、増粘剤等が必要であるかまたは望ましいであろう。被覆コンドーム もまた有用である。 経口投与のための組成物には、散剤または顆粒剤、懸濁剤または水または非水 媒質溶液剤、カプセル剤、サッシェ剤または錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、 希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤も望ましいであろう。 非経口投与のための処方には無菌水溶液が含まれ、それは緩衝剤、希釈剤およ び他の適当な添加物を含んでいてもよい。 用量は、処置されるべき状態の重篤度および応答性に依存するが、通常は、数 日から数か月、または治癒が達成されるまで、あるいは病状の減縮が達成される まで、治療の経過にしたがって、１日に１回またはそれ以上の用量である。業者 は、最適な用量、投与方法論および反復速度を容易に決定することができる。 このような処置は、単細胞原核生物および真核生物から多細胞真核生物までの 範囲にわたる種々の生物で実施することができる。その遺伝、代謝または細胞の 制御の基本部分としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写またはＲＮＡ−蛋白質翻訳を用いるい ずれの生物も、本発明にしたがう治療的および／または予防的処置に感受性であ る。細菌、酵母、原生生物、藻類、すべての植物および温血動物を含むすべての 高等動物のように外見上は異なった生物を処置することができる。さらに、多細 胞真核生物の細胞の各々は、それらの細胞活性に不可欠な部分としてＤＮＡ−Ｒ ＮＡ転写およびＲＮＡ−蛋白質翻訳の両方を含むため、処置することができる。 さらに、真核生物細胞の多くのオルガネラ（例えばミトコンドリアおよびクロロ プラスト）もまた、転写および翻訳の機構を含む。すなわち、単一の細胞、細胞 集団またはオルガネラもまた、本発明の治療的または診断的ＰＮＡまたはビスＰ ＮＡで治療することのできる生物の定義の内に含まれうる。本明細書において用 いる場合、“治療”とは、生物の殺傷または遊走性あるいは有害な細胞の増殖ま たは発現の制御による疾病状態の根絶を含むことを意味する。 本発明はまた、固相生化学（例えば、”Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ−Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｓｐ ｅｃｔｓ”，Ｗ．Ｈ．Ｓｃｏｕｔｅｎ，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３を参照のこと）、とりわけ固相バイオシステム 、 特に相補的な核酸の診断的検出／定量およびアフィニティ精製に関するバイオア ッセイまたは固相技術（例えば、”Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ ｐｈｙ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｐ．Ｄ．Ｇ．Ｄｅａｎ ，Ｗ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｆ．Ａ Ｍｉｄｄｌｅ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ１９８６；”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ” ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓ ｓ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ １９８７を参照のこと）におけるＰＮＡおよびビ スＰＮＡ分子の有益な使用に関する。このようなバイオアッセイまたは精製技術 を実施するための今日の方法は、ほぼ排他的に、ビーズ状固体支持体に物理学的 に吸着されたまたは実質的に永久の共有アンカー連結を介して結合された、”正 常な”またはわずかに修飾されたオリゴヌクレオチドを使用する。固体支持体と しては、例えば、セルロース、ガラスビーズ（制御された多孔度を有するものを 含む）（Ｍｉｚｕｔａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９ ８６，３５６，２０２）、”セファデックス”、”セファロース”、アガロース 、ポリアクリルアミド、多孔粒子アルミナ、ヒドロキシアルキルメタクリレート ゲル、ジオール結合シリカ、多孔セラミクス、またはナイロンおよびニトロセル ロースのフィルターディスク等の連続材料が挙げられる。１つの例は、ポリＡテ イル含有ｍＲＮＡのアフィニティ単離のためにセルロースビーズ上でのオリゴ− ｄＴの化学的合成を用いた（Ｇｉｌｈａｍ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ”Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｋ．Ｍｏｌｄａｖｅ，ｅｄｓ ．，ｖｏｌ．２１，ｐａｒｔ Ｄ，ｐａｇｅ １９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ，１９７１）。上述の全ての 方法は、本発明の状況中で適用しうる。しかし、可能な場合には、問題とする分 子の物理学的吸着より共有結合が好ましい。これは、吸着方法は、固定化された 分子のいくつかがハイブリダイゼーションまたはアフィニティプロセスの間に洗 い流される（脱離）という欠点を有するからである。すなわち、支持体材料の表 面に吸着される分子種がバイオアッセイ／精製方法の過程で支持体が供される種 々の処置の間に失われる程度にはほとんど制御がない。この問題の深刻さは、も ちろ ん、吸着と”遊離”種との間に平衡が達成される速度に大きく依存する。ある場 合には、許容しうる正確さおよび／または再現性をもって定量的アッセイを実施 することはほとんど不可能であろう。体液、水性試薬または洗浄剤による支持体 の処理の間に吸着された分子種が失われることは、一般に、比較的低い分子量の 分子種については最も顕著であると予測される。オリゴヌクレオチドとは対照的 に、ＰＮＡおよびビスＰＮＡ分子は、強い求核性および／または求電子中心を含 むため、固体支持体により容易に結合させることができる。さらに、オリゴヌク レオチドの固体支持体上での直接組立は、固定化された分子の非常に低い負荷を こうむる。これは主として、オリゴヌクレオチドの構築における最新技術のホス ホルアミダイト化学の成功的な使用を可能とする材料の表面容量が低いことによ る（Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９８１，２２，１８５９；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ，１９８５，２３２，２８１）。これはまた、高い表面負荷容量を有する固体 支持体に適合した別のホスファイトトリエステル方法を用いることによっては、 比較的短いオリゴヌクレオチドしか得られない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｍａｈａｄｅｖａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７６，９８，３６５５ ）という事実もこうむる。しかし、従来の固相ペプチド合成については、後者の 支持体は固定化ＰＮＡおよびビスＰＮＡ分子を構築するための非常に優れた材料 である（側鎖保護基は、鎖を固体支持体に保持するアンカー連結を切断すること なく、合成されたＰＮＡまたはビスＰＮＡ鎖から除去される）。すなわち、ＰＮ Ａ種は、相補的な核酸についてのはるかに高い（かつ依然として配列特異的な） 結合親和性に関して上述の固相技術から恩恵を受けており、そして二本鎖構造中 に存在する核酸のさらに独特の配列特異的認識（およびそれに対する強い結合） から恩恵を受けている。これらはまた、大量に固体支持体上に負荷することがで き、したがって、固相技術の感受性／容量をさらに増加することができる。さら に、最近報告された”光指示性、空間的にアドレス可能な平行化学合成”技術（ Ｆｏｄｏｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５１，７６７）、す なわち固相化学と光リトグラフィーとを組み合わせて、非常に多様なしかし同定 可能な永久に固定化された数千の化合物（ペプチド等）を実質的に同時に製造す る技 術を用いることにより、固相生化学におけるＰＮＡの使用に関するあるタイプの 研究にとりかかり、これを容易にし、または著しく加速することができる。 以下の実施例を検討することにより、本発明のさらなる目的、利点および新規 な特性が当業者に明らかとなるであろう。ただしこれらの実施例は限定を意図す るものではない。 一般的事項 実験例では以下の略号を用いる：ｅｇｌ，−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−；Ａｈａ，６−アミノヘキサン酸；ＤＭＦ， Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＣＣ，Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイ ミド；ＤＣＵ，Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル尿素；ＴＨＦ，テトラヒドロフラン； ａｅｇ，（２′−アミノエチル）グリシン；ｐｆｐ，ペンタフルオロフェニル； Ｂｏｃ，ｔ−ブトキシカルボニル：Ｚ，ベンジルオキシカルボニル；ＮＭＲ，核 磁気共鳴；ｓ，１重線；ｄ，２重線；ｄｄ，２重線の２重線；ｔ，３重線；ｑ， ４重線；ｍ，多重線；ｂ，幅広い；δ，化学シフト。 ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ ＦＸ ９０Ｑ分光計、またはブルーカー（Ｂ ｒｕｋｅｒ）２５０ＭＨｚにより、テトラメチルシランを内標準として記録され た。質量分析はＶＧ ＦＡＢ源およびプローブを備えたマスラボ（ＭａｓｓＬａ ｂ）ＶＧ １２−２５０四重極分析計により行われた。融点はブチ（Ｂｕｃｈｉ ）融点測定装置により記録され、未補正である。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド は４Åのモレキュラーシーブで乾燥され、蒸留され、４Åのモレキュラーシーブ 上に保存された。ピリジン（ＨＰＬＣ用）は４Åのモレキュラーシーブ上で乾燥 され、保存された。用いた他の溶剤は得られる最高純度であるか、または使用前 に蒸留された。ジオキサンは使用前に塩基性アルミナに導通された。無水ｔ−ブ チルオキシカルボニル、４−ニトロフェノール、ブロモ酢酸メチル、ベンジルオ キシカルボニルクロリド、ペンタフルオロフェノールはすべてアルドリッヒ・ケ ミカル・カンパニーから得られた。チミン、シトシン、アデニンはすべてシグマ から得られた。 薄層クロマトグラフィー（Ｔｌｃ）は下記の溶剤系を用いて行われた：（１） クロロホルム：トリエチルアミン：メタノール、７：１：２；（２）塩化メチレ ン：メタノール、９：１；(３)クロロホルム：メタノール：酢酸、８５：１０： ５。スポットはＵＶ（２５４ｎｍ）により、および／または１２０℃に５分間加 熱したのちニンヒドリン溶液（１−ブタノール１０００ｍｌおよび酢酸３０ｍｌ 中のニンヒドリン３ｇ）を噴霧し、噴霧後に再び加熱することにより、視覚化さ れた。Ｔｌｃプレートはガラスまたはプラスチックを支持体とする、蛍光指示薬 を含有するシリカゲルであった。 実施例１ 炭酸ｔ−ブチル４−ニトロフェニル（１） 炭酸ナトリウム（２９．１４ｇ；０．２７５ｍｏｌ）および４−ニトロフェノ ール（１２．７５ｇ；９１．６ｍｍｏｌ）をジオキサン（２５０ｍｌ）と混合し た。無水Ｂｏｃ（２０．０ｇ；９１．６ｍｍｏｌ）をジオキサン（５０ｍｌ）と 共に混合物に移した。この混合物を１時間還流し、０℃に冷却し、濾過し、１／ ３に濃縮し、次いで０℃の水（３５０ｍｌ）に注入した。１／２時間撹拌したの ち、生成物を濾過により採集し、水で洗浄し、次いで真空中で乾燥剤（sicapent ）により乾燥させた。収量２１．３ｇ（９７％）。融点７３．０〜７４．５℃（ 文献７８．５〜７９．５℃）。元素分析；Ｃ₁₁Ｈ₁₃ＮＯ₅につき実測値（計算値 ）Ｃ：５５．２０（５５．２３）；Ｈ：５．６１（５．４８）；Ｎ：５．８２（ ５．８５）。 実施例２ Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシン（２） 表題化合物をＨｅｉｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．，１９８ ４，２３，２０３〜２１１の方法の変法により製造した。Ｎ−（２′−アミノエ チル）グリシン（３．００ｇ；２５．４ｍｍｏｌ）を水（５０ｍｌ）に溶解し、 シオキサン（５０ｍｌ）を添加し、２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを１１．２に調 整した。炭酸ｔ−ブチル−４−ニトロフェニル（１，７．２９ｇ；３０．５ｍｍ ｏｌ）をジオキサン（４０ｍｌ）に溶解し、２時間かけて滴加した。その間、２ Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを１１．２に維持した。さらに３時間、定期的にｐＨ を１１．２に調整し、次いで溶液を一夜放置した。溶液を０℃に冷却し、０．５ Ｍ塩酸でｐＨを慎重に３．５に調整した。この水溶液をクロロホルムで洗浄し（ ２００ｍｌで３回）、２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを９．５に調整し、溶液を真 空中（１４ｍｍＨｇ）で蒸発乾固した。残渣をＤＭＦで抽出し（２５ｍｌ＋１０ ｍｌで２回）、抽出液を濾過して過剰の塩を除去した。その結果、表題化合物の 溶液が６０％の収率、およびＴｌｃ（系１、ニンヒドリンで視覚化、Ｒ_f＝０． ３）による純度９５％以上で得られた。この溶液をそれ以上精製せずに下記のＢ ｏｃ−ａｅｇ誘導体の製造に用いた。 実施例３ Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（３） この方法は文献の合成法とは異なるが、より簡単であり、より高い収率を与え 、かつ生成物中に未反応のチミンを残さない。チミン（４０．０ｇ；０．３１７ ｍｏｌ）および炭酸カリウム（８７．７ｇ；０．６４３ｍｍｏｌ）の、ＤＭＦ（ ９００ｍｌ）中における懸濁液に、ブロモ酢酸メチル（３０．００ｍｌ；０．３ １７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を窒素下に一夜激しく撹拌した。混合物 を濾過し、真空中で蒸発乾固した。固体残渣を水（３００ｍｌ）および４Ｎ塩酸 （１２ｍｌ）で処理し、０℃で１５分間撹拌し、濾過し、水で洗浄した（７５ｍ ｌで２回）。沈殿を水（１２０ｍｌ）および２Ｎ水酸化ナトリウム（６０ｍｌ） で処理し、１０分間煮沸した。混合物を０℃に冷却し、濾過し、４Ｎ塩酸（７０ ｍｌ）の添加によって純粋な表題化合物を沈殿させた。真空中で乾燥剤（sicape nt）により乾燥したのちの収量：３７．１ｇ（６４％）。 実施例４ Ｎ−１−カルボキシメチルチミンペンタフルオロフェニルエステル（４） Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（３，１０．０ｇ；５４．３ｍｍｏｌ）およ びペンタフルオロフェノール（１０.０ｇ；５４.３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ(１００ ｍｌ)に溶解し、氷水中で５℃に冷却した。次いでＤＣＣ(１３.４５ｇ；６５.２ ｍｍｏｌ)を添加した。温度が５℃より低くなった時点で氷浴を取り除き、混合 物を周囲温度で３時間撹拌した。沈殿したＤＣＵを濾過により分離し、ＤＭＦで ２回洗浄した（１０ｍｌで２回）。濾液を合わせてエーテル(１４００ｍｌ)に注 入し、０℃に冷却した。石油エーテル（１４００ｍｌ）を添加し、混合物を一夜 放置した。表題化合物を濾過により単離し、石油エーテルで十分に洗浄した。収 量：１４.８ｇ(７８％)。生成物は次の反応を実施するのに十分なほど純粋であ ったが、２−プロパノールからの再結晶により分析用試料を得た。融点２００． ５ 〜２０６℃。元素分析；Ｃ₁₃Ｈ₇Ｆ₅Ｎ₂Ｏ₄につき実測値（計算値）Ｃ：４４．７ ９（４４．５９）；Ｈ：２．１４（２．０１）；Ｎ：８．１３(８.００)。ＦＡＢ −ＭＳ：４４３（Ｍ＋１＋グリセリン）、３５１（Ｍ＋１）。 実施例５ １−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミン（５） 実施例２で得たＤＭＦ溶液に、トリエチルアミン（７．０８ｍｌ；５０．８ｍ ｍｏｌ）、次いでＮ−１−カルボキシメチルチミンペンタフルオロフェニルエス テル（４，４．４５ｇ；１２．７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を１時間 撹拌した。この溶液を０℃に冷却し、カチオン交換材（“Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ−８”，４０ｇ）で２０分間処理した。カチオン交換材を濾過により分離し、 ジクロロメタンで洗浄し（１５ｍｌで２回）、ジクロロメタン（１５０ｍｌ）を 添加した。得られた溶液を飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾 燥させ、まず水流アスピレーターによる、次いでオイルポンプによる真空中で蒸 発乾固した。残渣を水（５０ｍｌ）と共に振盪し、蒸発乾固した。この操作を一 度繰り返した。次いで残渣をメタノール（７５ｍｌ）に溶解し、エーテル（６０ ０ｍｌ）および石油エーテル（１．４Ｌ）に注入した。一夜撹拌したのち、白色 固体を濾過により単離し、石油エーテルで洗浄した。真空中で乾燥剤（sicapent ）により乾燥させて、３．５０ｇ（７１．７％）を得た。融点１４２〜１４７℃ 。元素分析；Ｃ₁₆Ｈ₂₄Ｎ₄Ｏ₇につき実測値（計算値）Ｃ：４９.５９(５０.００) ；Ｈ：６．３４（６．２９）；Ｎ：１４．５８（１４．５８）。¹Ｈ−ＮＭＲ（ ２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）：第二級アミド結合の周りの回転が制限されて いるため、シグナルの幾つかが２：１の比率で二重になった（リスト中に主につ いてはｍｊ、副についてはｍｉで示した）。 実施例６ １−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミンペンタフルオロフェニルエステル（６，Ｂｏｃ− Ｔａｅｇ・ＯＰｆｐ） １−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミン（５）（２．００ｇ；５．２０ｍｍｏｌ）をＤ ＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、塩化メチレン（１５ｍｌ）を添加した。ペンタフルオ ロフェノール（１．０５ｇ；５．７２ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を氷浴中で ０℃に冷却した。次いでＤＤＣ（１．２９ｇ；６．２４ｍｍｏｌ）を添加し、２ 分後に氷浴を取り除いた。周囲温度で３時間撹拌したのち、沈殿したＤＣＵを濾 過により分離し、塩化メチレンで洗浄した。濾液を合わせて炭酸水素ナトリウム 水溶液で２回、飽和塩化ナトリウムで１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ 、真空中で蒸発乾固した。固体残渣をジオキサン（１５０ｍｌ）に溶解し、０℃ の水（２００ｍｌ）に注入した。表題化合物を濾過により単離し、水で洗浄し、 乾燥剤（sicapent）で乾燥させた。収量：２．２０ｇ（７７％）。２−プロパノ ールからの再結晶により分析用試料を得た。融点１７４〜１７５.５℃。元素分 析；Ｃ₂₂Ｈ₂₃Ｎ₄Ｏ₇Ｆ₅につき実測値（計算値）Ｃ：４８．２２（４８．０１） ；Ｈ：４．６４（４．２１）；Ｎ：９．６７（１０．１８）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２ ５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：第二級アミド結合の周りの回転が制限されているた め、シグナルの幾つかが６：１の比率で二重になった（リスト中に主については ｍｊ、副についてはｍｉで示した）。 実施例７ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ′−（Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシン（７ ） アミノエチルグリシン（５２．８６ｇ；０．４４７ｍｏｌ）を水（９００ｍｌ ）に溶解し、シオキサン（９００ｍｌ）を添加した。２Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１ １．２に調整した。ｐＨを１１．２に維持しながら、炭酸ｔ−ブチル−ｐ−ニト ロフェニル（１２８．４ｇ；０．５３７ｍｏｌ）をジオキサン（７２０ｍｌ）に 溶解して２時間かけて滴加した。少なくともさらに３時間、ｐＨを１１．２に維 持し、次いで撹拌しながら一夜放置した。黄色溶液を０℃に冷却し、２Ｎ ＨＣ ｌでｐＨを３．５に調整した。混合物をクロロホルムで洗浄し（１００ｍｌで４ 回）、水相のｐＨを０℃の２Ｎ ＮａＯＨで９．５に再調整した。ベンジルオキ シカルホニルクロリド（７３．５ｍｌ；０．５１５ｍｏｌ）を半時間かけて添加 した。その間、２Ｎ ＮａＯＨでｐＨを９．５に維持した。その後４時間にわた ってｐＨを頻繁に調整し、そして溶液を撹拌しながら一夜放置した。翌日、溶液 をエーテルで洗浄し（６００ｍｌで３回）、次いで溶液のｐＨを０℃の２Ｎ Ｈ Ｃｌで１．５に調整した。酢酸エチルで抽出することにより（１０００ｍｌで５ 回）、表題化合物を単離した。酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、 真空中で蒸発乾固した。これにより１３８ｇが得られ、これをエーテル（３００ ｍｌ）に溶解し、石油エーテル（１８００ｍｌ）の添加により沈殿させた。収量 ：１２４．７ｇ（７９％）。融点６４．５〜８５℃。元素分析；Ｃ₂₂Ｈ₂₄Ｎ₂Ｏ₆ につき実測値（計算値） ＨＰＬＣ(２６０ｎｍ)２０.７１分(８０.２％)および２１.５７分(１９.８％)。 ＵＶスペクトル（２００ｎｍ〜３００ｎｍ）は同一であり、これは副ピークがＢ ｉｓ−Ｚ−ＡＥＧからなることを示した。 実施例８ Ｎ′−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエステル（８） Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ′−(Ｂｏｃ−アミノエチル)グリシン（７ ， ６０．０ｇ；０．１７０ｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン （６．００ｇ）を無水エタノール（５００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却したのち ＤＣＣ（４２．２ｇ；０．２０４ｍｏｌ）を添加した。５分後に氷浴を取り除き 、さらに２時間撹拌を続けた。沈殿したＤＣＵ（３５．５ｇ、乾燥）を濾過によ り分離し、エーテルで洗浄した（１００ｍｌで３回）。濾液を合わせて順次、希 硫酸水素カリウム（４００ｍｌで２回）、希炭酸水素ナトリウム（４００ｍｌで ２回）および飽和塩化ナトリウム（４００ｍｌで１回）で洗浄した。有機相を濾 過し、次いで硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空中で蒸発乾固すると６６．１ｇ の油状物質が得られ、これは少量のＤＣＵを含有していた。 この油を無水エタノール（６００ｍｌ）に溶解し、カーボン上パラジウム（６ ．６ｇ）を添加した。この溶液を大気圧で水素添加し、その際、溜めに２Ｎ水酸 化ナトリウムを充填した。４時間後に理論値の４.２Ｌのうち３.３Ｌが消費され た。反応混合物をセライトで濾過し、真空中で蒸発乾固して、３９．５ｇ（９４ ％）の油状物質を得た。油状物質の一部１３ｇをシリカゲル（６００ｇ，ＳｉＯ₂ ）クロマトグラフィーにより精製した。塩化メチレン中の２０％石油エーテル ３００ｍｌで溶離したのち、表題化合物が塩化メチレン中の５％メタノール１７ ００ｍｌで溶出した。十分な純度をもつ画分から真空中で溶剤を除去すると、収 量は８．４９ｇであった。あるいは１０ｇの粗製物質をバルブ管（Ｋｕｇｅｌ Ｒｏｈｒ）蒸留により精製した。 実施例９ Ｎ′−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンメチルエステル（９） 上記の方法を採用し、エタノールの代わりにメタノールを用いた。最終生成物 をフラッンュカラムクロマトグラフィーにより精製した。 実施例１０ １−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミンエチルエステル（１０） Ｎ′−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエステル（８，１３．５ｇ；５４ ．８ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（９．８４ｇ；６０．３ｍｍｏｌ）およびＮ−１ −カルボキシメチルチミン（４，１１．１ｇ；６０．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ １０ｍｌ）に溶解した。次いで塩化メチレン（２１０ｍｌ）を添加した。この溶 液をエタノール／氷浴中で０℃に冷却し、ＤＣＣ（１３．６ｇ；６５．８ｍｍｏ ｌ）を添加した。１時間後に氷浴を取り除き、周囲温度でさらに２時間、撹拌を 続けた。沈殿したＤＣＵを濾過により分離し、塩化メチレンで２回洗浄した（７ ５ｍｌで２回）。合わせた濾液に塩化メチレン（６５０ｍｌ）を追加した。溶液 を順次、希炭酸水素ナトリウム（５００ｍｌで３回）、希硫酸水素カリウム（５ ００ｍｌで２回）、および飽和塩化ナトリウム（５００ｍｌで１回）で洗浄した 。有機相から少量の沈殿を濾過により除去した。有機相を硫酸マグネシウムで乾 燥させ、真空中で蒸発乾固した。油状残渣を塩化メチレン（１５０ｍｌ）に溶解 し、濾過し、０℃の石油エーテル（３５０ｍｌ）の添加により表題化合物を沈殿 させた。この塩化メチレン／石油エーテル処理を一度繰り返した。これにより１ ６．０ｇ（７１％）の表題化合物が得られ、これはＨＰＬＣによれば９９％以上 の純度であった。 実施例１１ １−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミン（６ａ） 実施例１０で得た物質をＴＨＦ（１９４ｍｌ、０．２Ｍ溶液を与える）に懸濁 し、１Ｍ水酸化リチウム水溶液（１１６ｍｌ）を添加した。この混合物を周囲温 度で４５分間撹拌し、次いで濾過して残留ＤＣＵを除去した。溶液に水（４０ｍ ｌ）を添加し、次いでこれを塩化メチレン（３００ｍｌ）で洗浄した。水（３０ ｍｌ）を追加し、このアルカリ性溶液を塩化メチレン（１５０ｍｌ）でもう一度 先浄した。水溶液を０℃に冷却し、１Ｎ ＨＣｌ（約１１０ｍｌ）の滴加により ｐＨを２に調整した。表題化合物を酢酸エチルで抽出し（２００ｍｌで９回）、 抽出液を合わせて硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空中で蒸発乾固した。残渣を メタノールから一度蒸発させた。これは一夜乾燥させたのち無色のガラス状固体 となった。収量９．５７ｇ（６４％）。ＨＰＬＣ＞９８％、Ｒ_f＝１４．８分。 元素分析；Ｃ₁₆Ｈ₂₄Ｎ₄Ｏ₇・0.25 Ｈ₂Ｏにつき実測値（計算値）Ｃ：４９．２９ （４９．４２）；Ｈ：６．５２（６．３５）；Ｎ：１４．１１（１４．４１）。 第二級アミド結合の周りの回転が制限されているため、シグナルの幾つかが２： １の比率で二重になった(リスト中に主についてはｍｊ、副についてはｍｉで示 した)。 実施例１２ Ｎ−４−ベンジルオキシカルボニルシトシン（１２） 約１時間かけてベンジルオキシカルボニルクロリド（５２ｍｌ；０．３６ｍｏ ｌ）を、乾燥ピリジン（１０００ｍｌ）中のシトシン（８，２０．０ｇ；０．１ ８ｍｏｌ）の懸濁液に、０℃で窒素下にオーブン乾燥した装置内で滴加した。次 いで溶液を一夜撹拌したのち、このピリジン懸濁液を真空中で蒸発乾固した。水 （２００ｍｌ）および４Ｎ塩酸を添加してｐＨを約１にした。生じた白色沈殿を 濾別し、水で洗浄し、空気吸引により部分乾燥させた。まだ湿潤している沈殿を 無水エタノール（５００ｍｌ）と共に１０分間煮沸し、０℃に冷却し、濾過し、 エーテルで十分に洗浄し、真空中で乾燥させた。収量２４．７ｇ（５４％）。融 点＞２５０℃。元素分析；Ｃ₁₂Ｈ₁₁Ｎ₃Ｏ₃につき実測値（計算値）Ｃ：５８．５ ９（５８．７７）；Ｈ：４．５５（４．５２）；Ｎ：１７．１７（１７．１３） 。生成物を溶解させられなかったので、ＮＭＲスベクトルを記録しなかった。 実施例１３ Ｎ−４−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシン(１３) 機械的撹拌および窒素保護を備えた三つ口丸底フラスコに、ブロム酢酸メチル （７．８２ｍｌ；８２．６ｍｍｏｌ）、ならびに乾燥ＤＭＦ（９００ｍｌ）中の Ｎ−４−ベンジルオキシカルボニルシトシン（１２，２１．０ｇ；８２．６ｍｍ ｏｌ）および炭酸カリウム（１１．４ｇ；８２．６ｍｍｏｌ）の懸濁液を装入し た。混合物を一夜激しく撹拌し、濾過し、真空中で蒸発乾固した。水（３００ｍ ｌ）および４Ｎ塩酸（１０ｍｌ）を添加し、混合物を０℃で１５分間撹拌し、濾 過し、水で洗浄した（７５ｍｌで２回）。単離した沈殿を水（１２０ｍｌ）、２ Ｎ水酸化ナトリウム（６０ｍｌ）で処理し、３０分間撹拌し、濾過し、０℃に冷 却し、４Ｎ塩酸（３５ｍｌ）を添加した。表題化合物を濾過により単離し、水で 十分に洗浄し、メタノール（１０００ｍｌ）から再結晶し、エーテルで十分に洗 浄した。これにより７．７０ｇ（３１％）の純粋な化合物が得られた。再結晶の 母液を２００ｍｌの容量に減少させ、０℃に冷却した。これによりさらに２．３ ０ｇの物質が得られ、これはＴｌｃでは純粋であったが、赤色であった。融点２ ６６〜２７４℃。元素分析；Ｃ₁₄Ｈ₁₃Ｎ₃Ｏ₅につき実測値（計算値）； 実施例１４ Ｎ−４−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシンペンタ フルオロフェニルエステル（１４） Ｎ−４−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシン（１ ３，４．００ｇ；１３．２ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノール（２．６ ７ｇ；１４．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７０ｍｌ）と混合し、氷水で０℃に冷却し 、ＤＣＣ（３．２７ｇ；１５．８ｍｍｏｌ）を添加した。３分後に氷浴を取り除 き、混合物を室温で３時間撹拌した。沈殿したＤＣＵを濾過により分離し、ＤＭ Ｆで洗浄し、濾液を真空中（０．２ｍｍＨｇ）で蒸発乾固した。固体残渣を塩化 メチレン（２５０ｍｌ）で処理し、１５分間激しく撹拌し、濾過し、希炭酸水素 ナトリウムで２回、飽和塩化ナトリウムで１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥 させ、真空中で蒸発乾固した。固体残渣を２−プロパノール（１５０ｍｌ）から 再結晶し、結晶をエーテルで十分に洗浄した。収量３．４０ｇ（５５％）。融点 ２４１ 〜２４５℃。元素分析；Ｃ₂₀Ｈ₁₂Ｎ₃Ｆ₅Ｏ₅につき実測値（計算値） 実施例１５ Ｎ−４−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ−ａｅｇ−シトシン（１５） ＤＭＦ中の（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）グリシン（２）（実施例２の記 載に従って製造）の溶液に、トリエチルアミン（７．００ｍｌ；５０．８ｍｍｏ ｌ）およびＮ−４−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−１−カルボキシメチルシト シンペンタフルオロフェニルエステル（１４，２．７０ｇ；５．７５ｍｍｏｌ） を添加した。この溶液を室温で１時間撹拌したのち、塩化メチレン(１５０ｍｌ) 、飽和塩化ナトリウム（２５０ｍｌ）、およびｐＨ約１となる量の４Ｎ塩酸を添 加した。有機層を分離し、飽和塩化ナトリウムで２回洗浄し、硫酸マグネシウム で乾燥させ、まず水流アスピレーターによる、次いでオイルポンプによる真空中 で蒸発乾固した。油状の残渣を水（２５ｍｌ）で処理し、再び真空中で蒸発乾固 した。次いでこの操作を繰り返した。次いで油状の残渣（２．８０ｇ）を塩化メ チレン（１００ｍｌ）に溶解し、石油エーテル（２５０ｍｌ）を添加し、混合物 を一夜撹拌した。表題化合物を濾過により単離し、石油エーテルで洗浄した。Ｔ ｌｃ（系１）は実質量のペンタフルオロフェノールを示したが、それを除去する ことは試みなかった。収量１．７２ｇ（５９％）。融点１５６℃（分解）。¹Ｈ −ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：第二級アミト結合の周りの回転が制限 されているため、シグナルの幾つかが２：１の比率で二重になった(リスト中に 主についてはｍｊ、副についてはｍｉで示した)。 実施例１６ Ｎ−４−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ−ａｅｇ−シトシンペンタフル オロフェニルエステル（１６） Ｎ−４−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ−ａｅｇ−シトシン（１５， １.５０ｇ；２．９８ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノール（５４８ｍｇ ；２．９８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解した。塩化メチレン（１０ｍ ｌ）を添加し、反応混合物を氷浴中で０℃に冷却し、ＤＣＣ（６７６ｍｇ；３． ２８ｍｍｏｌ）を添加した。３分後に氷浴を取り除き、混合物を周囲温度で３時 間撹拌した。沈殿を濾過により単離し、塩化メチレンで１回洗浄した。沈殿を沸 騰ジオキサン（１５０ｍｌ）に溶解し、溶液を１５℃に冷却し、これによりＤＣ Ｕが沈殿した。このＤＣＵを濾過により除去し、得られた濾液を０℃で水（２５ ０ｍｌ）に注入した。表題化合物を濾過により単離し、水で洗浄し、真空中で乾 燥剤(sicapent)により乾燥させた。収量１.３０ｇ（６５％）。元素分析；Ｃ₂₉ Ｈ₂₈Ｎ₅Ｏ₈Ｆ₅につき実測値（計算値）Ｃ：５２．６３（５２．０２）；Ｈ：４ ．４１（４．２２）；Ｎ：１０．５５（１０．４６）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０Ｍ Ｈｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）：本質的に上記酸のスペクトルを示した。これはエステ ルの加水分解による可能性が最も高い。ＦＡＢ−ＭＳ：６７０（Ｍ＋１）；６１ ４（Ｍ＋１−tBu）。 実施例１７ Ｎ−４−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）シトシン（１７） Ｎ′−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエステル（８，５．００ｇ；２０ ．３ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（３．６４ｇ；２２．３ｍｍｏｌ）およびＮ−４ −ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシン（１３，６． ７７ｇ；２２．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍｌ）に懸濁した。次いで塩化メ チレン（１００ｍｌ）を添加した。この溶液を０℃に冷却し、ＤＣＣ（５．０３ ｇ；２４．４ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後に水浴を取り除き、周囲温度でさ らに１時間撹拌を続けた。次いで反応混合物を真空中で蒸発乾固した。残渣をエ ーテル（１００ｍｌ）に懸濁し、３０分間激しく撹拌した。固体物質を濾過によ り単離し、このエーテル洗浄操作を２回繰り返した。次いでこの物質を希炭酸水 素ナ トリウム（約４％溶液、１００ｍｌ）と共に１５分間激しく撹拌し、濾過し、水 で洗浄した。次いでこの操作を１回繰り返すと、乾燥後に１７．０ｇの黄色を帯 びた固体物質が残った。次いでこの固体をジオキサン（２００ｍｌ）と共に煮沸 し、熱時濾過した。冷後、水（２００ｍｌ）を添加した。沈殿した物質を濾過に より単離し、水で洗浄し、乾燥させた。ＨＰＬＣ（２６０ｎｍで観察）によれば 、ＤＣＵを除いてこの物質は９９％より高い純度を有していた。次いでこのエス テルをＴＨＦ（１００ｍｌ）に懸濁し、０℃に冷却し、１Ｎ ＬｉＯＨ（６０ｍ ｌ）を添加した。１５分間撹拌したのち、混合物を濾過し、濾液を塩化メチレン で洗浄した（１５０ｍｌで２回）。次いでこのアルカリ性溶液を０℃に冷却し、 １Ｎ ＨＣｌでｐＨを２．０に調整した。表題化合物を濾過により単離し、水で １回洗浄すると、乾燥後に１１．３ｇの白色粉末が残った。この物質を塩化メチ レン（３００ｍｌ）に懸濁し、石油エーテル（３００ｍｌ）を添加した。濾過お よび洗浄し、乾燥したのち、７．１ｇ（６９％）が得られた。ＨＰＬＣは純度９ ９％のＲ_f＝１９．５分、および少量の不純物１２．６分（約１％）（Ｚ−脱保 護モノマーである可能性が最も高い）を示した。元素分析；Ｃ₂₃Ｈ₂₉Ｎ₅Ｏ₈につ き実測値（計算値）Ｃ：５４.１６（５４．８７）；Ｈ：５．７６（５．８１） ；Ｎ：１３．６５（１３．９１）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆ ）：10.78(b.s,1H,CO₂ H); 7.88(2つのオーバーラップ d，1H，Cyt H-5); 7.41-7 .32(m，5H，Ph); 7.01(2つのオーバーラップ d，1H，Cyt H-6); 6.94 & 6.78(un res.L，1H，BocNH); 5.19(s，2H，PhCH₂ ); 4.81 & 4.62(s，2H，CH₂ CON); 4.17 & 3.98(s，2H，CH₂ CO₂H); 3.42-3.03（m．水を含む，CH₂ CH₂ ）および 1.38 & 1. 37(s，9H，tBu)。¹³Ｃ−ＮＭＲ 150.88; 128.52; 128.18; 127.96; 93.90; 66.5 3; 49.58 および 28.22。ＩＲ：周波数ｃｍ¹（強度）3423(26.4)，3035(53.2)， 2978(41.4)，1736(17.3)，1658(3.8)，1563(23.0)，1501（6.8）および 1456(26 .4)。 実施例１８ ９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（１８） アデニン（１０．０ｇ；７４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１０．２９ｇ； ７４．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦに懸濁し、ブロモ酢酸エチル（８．２４ｍｌ；７４ ｍｍｏｌ）を添加した。この懸濁液を室温で窒素下に２．５時間撹拌し、次いで 濾過した。固体残渣をＤＭＦ（１０ｍｌ）で３回洗浄した。濾液を合わせて真空 中て蒸発乾固した。黄橙色の固体物質を水（２００ｍｌ）に注入し、ｐＨ約６に なるまで４Ｎ ＨＣｌを添加した。０℃で１０分間撹拌したのち、固体を濾別し 、水で洗浄し、９６％エタノール（１５０ｍｌ）から再結晶した。表題化合物を 濾過により単離し、エーテルで十分に洗浄した。収量３．４ｇ（２０％）。融点 ２１５．５〜２２０℃。元素分析；Ｃ₉Ｈ₁₁Ｎ₅Ｏ₂につき実測値（計算値） ＩＲ：周波数ｃｍ¹（強度） アルキル化の位置は、９６％エタノールからの再結晶で得た結晶についてのＸ 線結晶法により証明された。 あるいは９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（１８）は以下の方法 で製造できる。窒素導入口、機械的撹拌機および滴下漏斗を備えた２Ｌの三つ口 フラスコ内で、ＤＭＦ（１１００ｍｌ）中のアデニン（５０．０ｇ；０．３７ｍ ｏｌ）の懸濁液に、ヘキサン洗浄した水素化ナトリウム−鉱油分散液１６．４ｇ （０．４０７ｍｏｌ）を添加した。この混合物を２時間激しく撹拌し、次いでブ ロモ酢酸エチル（７５ｍｌ；０．６７ｍｏｌ）を３時間かけて滴加した。混合物 をさらに１時間撹拌したのち、Ｔｌｃはアデニンが完全に転化したことを示した 。混合物を１ｍｍＨｇで蒸発乾固し、油状の残渣に水（５００ｍｌ）を添加する と、表題化合物が結晶化した。この固体を９６％エタノール（６００ｍｌ）から 再結晶した。乾燥後の収量５３．７ｇ（６５．６％）。ＨＰＬＣ（２１５ｎｍ） 純度＞９９．５％。 実施例１９ Ｎ−６−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニンエチルエス テル（１９） ９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（１８，３．４０ｇ；１５．４ ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５０ｍｌ）に緩和な加熱により溶解し、２０℃に冷却 し、塩化メチレン（５０ｍｌ）中のＮ−エチル−ベンジルオキシカルボニルイミ ダゾールテトラフルオロボレート（６２ｍｍｏｌ）の溶液に、氷冷しながら１５ 分かけて添加した。少量の沈殿が見られた。氷浴を取り除き、溶液を一夜撹拌し た。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム（１００ｍｌ）で処理した。１０分間 撹拌したのち、相を分離し、有機相を順次、１容量の水、希硫酸水素カリウム（ ２回）、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。この溶液を硫酸マグネシウムで 乾燥させ、真空中で蒸発乾固した。これにより１１ｇの油状物質を得た。この物 質を塩化メチレン（２５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、石油エーテル（５０ｍ ｌ）で沈殿させた。この操作を一度繰り返して、３．４５ｇ（６３％）の表題化 合物を得た。融点１３２〜３５℃。元素分析；Ｃ₁₇Ｈ₁₇Ｎ₅Ｏ₄につき実測値（計 算値） ＦＡＢ−ＭＳ:３５６(ＭＨ+)および３１２(ＭＨ+ -ＣＯ₂)。ＩＲ：周波数ｃｍ¹( 強度) 実施例２０ Ｎ−６−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニン（２０） Ｎ−６−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニンエチルエ ステル（１９，３．２０ｇ；９．０１ｍｍｏｌ）を、０℃に冷却したメタノール （５０ｍｌ）と混合した。水酸化ナトリウム溶液（５０ｍｌ；２Ｎ）を添加する と、これによりこの物質が速やかに溶解した。０℃で３０分後に、このアルカリ 性溶液を塩化メチレンで洗浄した（５０ｍｌで２回）。この水溶液を０℃の４Ｎ ＨＣｌでｐＨ１．０にすると、表題化合物が沈殿した。濾過し、水で洗浄し、 乾燥したのちの収量は３．０８ｇ（１０４％）であった。生成物は塩を含有し、 元素分析はそれを反映した。元素分析；Ｃ₁₅Ｈ₁₃Ｎ₅Ｏ₄につき実測値（計算値） Ｃ：４６．３２（５５．０５）；Ｈ：４．２４（４．００）；Ｎ：１８．１０（ ２１．４０）およびＣ／Ｎ：２．５７（２．５６）。 ＦＡＢ−ＭＳ：３２８（ＭＨ+）および２８４（ＭＨ+ -ＣＯ₂）。ＨＰＬＣ（２ １５ｎｍ，２６０ｎｍ）系１において：１５．１８分、少量の不純物はすべて２ ％未満。 実施例２１ Ｎ−６−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）アデニンエチルエ ステル（２１） Ｎ′−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエステル（８，２．００ｇ；８． １２ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（１．４６ｇ；８．９３ｍｍｏｌ）およびＮ−６ −ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニン（２０，２．９２ ｇ；８．９３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解した。次いで塩化メチレン （１５ｍｌ）を添加した。この溶液をエタノール／氷浴中で０℃に冷却した。Ｄ ＣＣ（２．０１ｇ；９．７４ｍｍｏｌ）を添加した。２．５時間後に氷浴を取り 除き、周囲温度でさらに１．５時間撹拌を続けた。沈殿したＤＣＵを濾過により 分離し、ＤＭＦ（１５ｍｌ）で１回、塩化メチレンで２回（１５ｍｌで２回）洗 浄した。合わせた濾液に塩化メチレン（１００ｍｌ）を追加した。この溶液を順 次、希炭酸水素ナトリウム（１００ｍｌで２回）、希硫酸水素カリウム（１００ ｍｌで２回）、および飽和塩化ナトリウム（１００ｍｌで１回）洗浄した。有機 相を真空中で蒸発乾固すると、３．２８ｇ（７３％）の黄色を帯びた油状物質が 得られた。祖生成物のＨＰＬＣはわずか６６％の純度を示し、共に主ピークより 多少極性の低い数種の不純物を伴った。この油を無水エタノール（５０ｍｌ）に 溶解し、活性炭を添加した。５分間撹拌したのち、溶液を濾過した。濾液を水（ ３０ｍｌ）と混合し、撹拌しながら一夜放置した。翌日、白色沈殿を濾過により 分離し、水で洗浄し、乾燥すると、ＨＰＬＣで９８％を越える純度の物質１．１ ６ｇ（２６％）が得られた。母液に水を添加すると、純度約９５％のものがさら に０．５３ｇ得られた。元素分析；Ｃ₂₆Ｈ₃₃Ｎ₇Ｏ₇・Ｈ₂Ｏにつき実測値（計算 値） このスペクトルは痕跡量のエタノールおよびＤＣＵを示す。 実施例２２ Ｎ−６−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）アデニン（２２） Ｎ−６−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）アデニンエチル エステル（２１，１．４８ｇ；２．６６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１３ｍｌ）に懸濁 し、この混合物を０℃に冷却した。水酸化リチウム（８ｍｌ；１Ｎ）を添加した 。１５分間撹拌したのち、反応混合物を濾過し、水（２５ｍｌ）を追加し、溶液 を塩化メチレンで洗浄した（２５ｍｌで２回）。この水溶液を１Ｎ ＨＣｌでｐ Ｈ２．０に調整した。沈殿を濾過により単離し、水で洗浄し、乾燥させて、０． ８２ｇ（５８％）を得た。塩化メチレン／石油エーテルから２回再沈殿させた生 成物は乾燥後に０.７７ｇ（５５％）であった。融点１１９℃（分解）。元素分 析；Ｃ₂₄Ｈ₂₉Ｎ₇Ｏ₇・Ｈ₂Ｏにつき実測値（計算値）Ｃ：５３．３２（５２．８ ４）；Ｈ：５.７１（５.７３）；Ｎ：１７.６８（１７.９７）。ＦＡＢ−ＭＳ： ５２８.５（ＭＨ+）。 実施例２３ ２−アミノ−６−クロロ−９−カルボキシメチルプリン（２３） ＤＭＦ（５０ｍｌ）中の２−アミノ−６−クロロプリン（５．０２ｇ；２９． ６ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１２．９１ｇ；９３．５ｍｍｏｌ）の懸濁液 に、ブロモ酢酸（４．７０ｇ；２２．８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素下 に２０時間、激しく混合した。水（１５０ｍｌ）を添加し、溶液をセライトで濾 過して、明るい黄色の溶液を得た。この溶液を４Ｎ塩酸でｐＨ３に酸性化した。 沈殿を濾過し、真空中で乾燥剤（sicapent）により乾燥させた。収量（３．０２ ｇ；４４．８％）。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）：ｄ - 4.88 ppm(s，2H); 6. 95(s，2H); 8.10(s，1H)。 実施例２４ ２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチルプリン（２４） ナトリウム（２．０ｇ；８７．０ｍｍｏｌ）をベンジルアルコール（２０ｍｌ ）に溶解し、１３０℃に２時間加熱した。０℃に冷却したのち、ＤＭＦ（８５ｍ ｌ）中の２−アミノ−６−クロロ−９−カルボキシメチルプリン（２３，４．０ ５ｇ；１８．０ｍｍｏｌ）の溶液を徐々に添加し、得られた懸濁液を２０℃で一 夜撹拌した。水酸化ナトリウム溶液（１Ｎ，１００ｍｌ）を添加し、透明な溶液 を酢酸エチルで洗浄した（１００ｍｌで３回）。次いで水相を４Ｎ塩酸でｐＨ３ に酸性化した。沈殿を酢酸エチル（２００ｍｌ）に装入し、水相を酢酸エチルで 抽出した（１００ｍｌで２回）。有機相を合わせて飽和塩化ナトリウム溶液で洗 浄し（７５ｍｌで２回）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で蒸発乾固し た。残渣をエタノール（３００ｍｌ）から再結晶した。真空中で乾燥剤（sicape nt） により乾燥したのちの収量：２．７６ｇ（５２％）。融点１５９〜６５℃。元素 分析（計算値，実測値） 実施例２５ Ｎ−（［２−アミノ−６−ベンジルオキシプリン−９−イル］アセチル）−Ｎ− （２−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシン［ＢｏｃＧａｅｇモノマー］（２５） ２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチルプリン（２４，０． ５０ｇ；１．６７ｍｍｏｌ）、Ｎ′−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンメチルエス テル（０．６５ｇ；２．８０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５ ４ｇ；４．１９ｍｍｏｌ）、およびブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム −ヘキサフルオロ−ホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ、登録商標）(０．７９８ｇ； １.７１ｍｍｏｌ)をＤＭＦ（２ｍｌ）中で４時間撹拌した。透明な溶液を氷冷し た炭酸水素ナトリウム溶液（１Ｎ；４０ｍｌ）に注入し、酢酸エチルで抽出した （４０ｍｌで３回）。有機相を硫酸水素カリウム溶液（１Ｎ；４０ｍｌで２回） 、炭酸水素ナトリウム溶液（１Ｎ；４０ｍｌで１回）、飽和塩化ナトリウム溶液 （６０ｍｌ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で蒸発させた のち、固体残渣を酢酸エチル／ヘキサン（２０ｍｌ（２：１））から再結晶して 、メチルエステルを６３％の収率で得た。ＭＳ−ＦＡＢ ５１４（Ｍ＋１）。こ のエステルを、濃水酸化ナトリウム（１ｍｌ）を含有するエタノール／水（３０ ｍｌ（１：２））に溶解することにより加水分解した。２時間撹拌したのち、溶 液を濾過し、４Ｎ塩酸の添加によりｐＨ３に酸性化した。濾過により表題化合物 を得た。収量３７０ｍｇ（７２％、加水分解につき）。ＨＰＬＣによる純度は９ ９％より高かった。第二級アミド結合の周りの回転が制限されているため、シグ ナルの幾つかが２：１の比率で二重になった(リスト中に主についてはｍｊ、副 についてはｍｉで示した)。 実施例２６ α−ホルミルコハク酸メチル、図１（２６ａ） Ｆｉｓｓｅｋｉｓ ａｎｄ Ｓｗｅｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７ ０，９，３１３６〜４２の方法の変法により、ナトリウムメトキシド（４０．５ ｇ；０．７５ｍｏｌ）を乾燥エーテル（５００ｍｌ）に懸濁し、窒素下に０℃で 撹拌した。コハク酸ジメチル（６５．４ｍｌ；０．５０ｍｏｌ）およびキ酸メチ ル（１２３ｍｌ；２．００ｍｏｌ）を３０分かけて滴加した。反応混合物を０℃ で２時間、次いで室温で一夜撹拌した。次いで反応混合物を蒸発させて粘稠な褐 色の残渣を得た。これを石油エーテルで１回洗浄し、次いで３Ｍ塩酸（１６０ｍ ｌ）に溶解した。この溶液を濃塩酸で弱酸性となし、次いでジクロロメタンで抽 出した（２５０ｍｌで４回）。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濾過し、減圧 下で蒸発させた。得られた残渣をバルブ管装置内で６０℃および０．６ｍＢａｒ において蒸留して、モル比８０：２０（ＮＭＲにより測定）の表題化合物とコハ ク酸ジメチルの混合物５２．３ｇを無色の油として得た。この混合物をそのまま 以下の製造に使用できる。生成物は、ジクロロメタンによる抽出の代わりにジエ チルエーテルによる連続抽出を用いることにより、コハク酸ジメチルを含有しな い状態で単離できる。しかし本発明者らの手法ではこれにより収率が３４％に低 下した。ＦｉｓｓｅｋｉｓおよびＳｗｅｅｔ（前掲）は６２％の低下を報告して いる。 実施例２７ イソシトシン−５−イル酢酸（２７） Ｂｅｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ ｍｕｎ．１９８３，４８，２９２〜８の方法の変法により、ナトリウムメトキシ ド（４１．９ｇ，０．７８ｍｏｌ）を乾燥メタノール（２００ｍｌ）に溶解し、 塩酸グアニジン（４９．４ｇ，０．５２ｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素下に 室温で１０分間撹拌した。乾燥メタノール（１００ｍｌ）中のα−ホルミルコハ ク酸メチル（２６，３０．０ｇ，０．１７ｍｏｌ）の溶液を混合物に添加した。 反応混合物を窒素下で３時間還流し、次いで室温で一夜撹拌した。次いで反応混 合物を濾過し、濾過ケークをメタノールで１回洗浄した。濾液と洗液を集めて減 圧下で蒸発させた。得られた残渣を水（８０ｍｌ）に溶解し、この溶液を濃塩酸 でｐＨ４．２に酸性化した。０℃で撹拌したのち、混合物を濾過し、沈殿を水で １回洗浄し、次いで凍結乾燥すると、２８．２９ｇ（９７％）の表題化合物が白 色固体として残った。Ｃ₆Ｈ₇Ｎ₃Ｏ₃・1/2 Ｈ₂Ｏにつき計算値：Ｃ，４０．４５ ；Ｈ，４．５３；Ｎ，２３．５９；実測値：Ｃ，４０．１３；Ｈ，４．２２；Ｎ ，２３．２６。 生成物が貧溶解性であるため、そのナトリウム塩としてさらに特性解明した。 ２７（０．４２ｇ，２．５ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウムを沸騰水（３５ ｍｌ）に溶解した。この溶液を冷却し、蒸発させた。残渣を水（６ｍｌ）に溶解 し、エタノール（４ｍｌ）およびイソプロパノール（８ｍｌ）を添加した。２７ のナトリウム塩を濾過により採集し、無水エタノールおよび石油エーテルで洗浄 し、乾燥させて、０．３１ｇ（６５％）を白色結晶として得た。 実施例２８ イソシトシン−５−イル酢酸メチル（２８） 塩化チオニル（３．６ｍｌ，５０ｍｍｏｌ）を−４０℃で窒素下に撹拌したメ タノール（２１０ｍｌ）に添加した。イソシトシン−５−イル酢酸（２７，７． ０ｇ，４１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１時間、６０℃で３時間、 そして室温で一夜撹拌した。反応混合物を蒸発乾固し、残渣を飽和炭酸水素ナト リウム水溶液（８０ｍｌ）に溶解すると、泡状沈殿が生じた。ｐＨ６．５になる まで４Ｍ塩酸を添加し、懸濁液を１時間撹拌した。沈殿を濾過により採集し、水 で洗浄し、水から再結晶し、凍結乾燥して、４．６６ｇ（６２％）のイソシトシ ン−５−イル酢酸メチルを白色結晶として得た。 Ｃ₇Ｈ₉Ｎ₃Ｏ₃・3/2 Ｈ₂Ｏにつき計算値：Ｃ，４０．００；Ｈ，５．７５；Ｎ， １９．９９；実測値：Ｃ，４０．１８；Ｈ，５．４６；Ｎ，２０．３０。 実施例２９ Ｎ−２−（ベンジルオキシカルボニル）イソシトシン−５−イル酢酸メチル（２ ９） イソシトシン−５−イル酢酸メチル（２８，９．５ｇ，５２ｍｍｏｌ）を乾燥 ＤＭＦ（９５ｍｌ）に溶解し、この溶液を０℃で窒素下に撹拌した。Ｎ−ベンジ ルオキシカルボニル−Ｎ′−メチルイミダゾリウムトリフレート（３７．９９ｇ ，１０４ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。反応混合物を０℃で３０分間、次いで室 温で一夜撹拌した。ジクロロメタン（８００ｍｌ）を添加し、得られた混合物を 半飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４００ｍｌで２回）、半飽和硫酸水素カリウ ム水溶液（４００ｍｌで２回）、およびブライン（４００ｍｌで１回）で洗浄し た。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をメ タノールから再結晶して、１３．３２ｇ（８１％）の表題化合物を白色結晶とし て得た。 Ｃ₁₅Ｈ₁₅Ｎ₃Ｏ₅につき計算値：Ｃ，５６．７８；Ｈ，４．７６；Ｎ，１３．２４ ；実測値：Ｃ，５６．６８；Ｈ，４．７９；Ｎ，１３．２８。 実施例３０ Ｎ−２−（ベンジルオキシカルボニル）イソシトシン−５−イル酢酸（３０） Ｎ−２−（ベンジルオキシカルボニル）イソシトシン−５−イル酢酸メチル（ ２９，５．２ｇ，１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５２ｍｌ）に懸濁し、０℃に冷却し た。１Ｍ水酸化リチウム（４９ｍｌ，４９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０ ℃で２５分間撹拌した。１Ｍ水酸化リチウム（２０ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）を追加 し、混合物を０℃で９０分間撹拌した。１Ｍ塩酸でｐＨ２に酸性化することによ り生成物を沈殿させ、濾過により採集し、水で１回洗浄し、乾燥させて、４．１ ２ｇ（８３％）の白色結晶を得た。 ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ（％）：３０４（１２，Ｍ＋Ｈ）。Ｃ₁₄Ｈ₁₃Ｎ₃Ｏ₅につ き計算値：Ｃ，５５．４５；Ｈ，４．３２：Ｎ，１３．８６；実測値：Ｃ，５５ ．５５；Ｈ，４．４６；Ｎ，１３．８４。 実施例３１ エチルＮ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ−２−（ベンジルオキシカ ルボニル）イソシトシン−５−イルアセチル）グリシネート（３１） Ｎ−２−（ベンジルオキシカルボニル）イソシトシン−５−イル酢酸（３０， ２．０ｇ，６．６ｍｍｏｌ）を、撹拌棒および隔壁を備えたフラスコに移し、隔 壁を通して窒素流を導入した。乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）およびＮ−メチルモルホ リン（２．２ｍｌ，１９．８ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を０℃に冷却し 、エチルＮ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシネート（１．８ｇ，７．３ｍ ｍｏｌ）およびＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テト ラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ，３．０ｇ，７．９ ｍ ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素下に４時間撹拌したのち、ジクロロメタ ン（１００ｍｌ）を添加した。有機相を半飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（７５ ｍｌで２回）、半飽和硫酸水素カリウム水溶液（７５ｍｌで２回）、およびブラ イン（７５ｍｌで１回）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濾過し、減圧下で 蒸発させた。残渣を酢酸エチル（５０ｍｌ）に溶解し、０℃で１０分間撹拌し、 セライトで濾過し、これを酢酸エチルで洗浄した。濾液および洗液を集めて１０ ｍｌの容量に濃縮した。ジエチルエーテル（１００ｍｌ）を添加し、得られた溶 液を室温で一夜撹拌した。生成物を濾過により採集し、ジエチルエーテルで１回 洗浄して、２．６ｇ（７４％）の表題化合物を白色結晶として得た。アミド結合 の周りの回転が阻害されているため、ＮＭＲシグナルの幾つかが主（ｍａ）およ び副（ｍｉ）成分から構成される。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／ＴＭＳ）：δ ＝ 1.20-1.30(m，3H，CH₂ CH₃ ); 1.45(s，9H，BOC); 3.05-3.52(m，6H,NCH₂，CH₂ N，CH₂CON); 4.08 および 4.40(s，ma および s，mi，各 2H，CH₂COO); 4.15 お よび 4.25(q，ma，J=7 Hz および q，mi，各 2H，CH₂ CH₃); 5.29(s，2H，PhCH₂ ) ; 7.40-7.52(m，5H，PhCH₂); 7.64 および 7.67(s，mi および s，ma，各 1H，H -6)．¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／ＴＭＳ）：δ＝ 14.1(CH₂ CH₃ ); 28.2(BOC) ; 30.2 および 30.5(ma および mi，各 CH₂ CON); 37.9 および 38.3(mi および ma，各 NCH₂); 47.7 および 48.0(ma および mi，各CH₂N); 50.2(CH₂ COO); 60.4 および 61.0(ma および mi，各CH₂ CH₃); 67.0(PhCH₂ ); 127.9-128.5(m，PhCH₂) ; 135.8(PhCH₂); 155.7(C-6); 169.4(CON); 170.0(COO)。ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ ｚ（％）：５３２（３.５，Ｍ＋Ｈ）；４３２（３.５，Ｍ−ＢＯＣ＋Ｈ）。Ｃ₂₅ Ｈ₃₃Ｎ₅Ｏ₈につき計算値：Ｃ，５６．４９；Ｈ，６．２６；Ｎ，１３．１７；実 測値：Ｃ，５６．４６；Ｈ，６.１４；Ｎ，１２.８６。 実施例３２ Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ−２−（ベンジルオキシカルボニ ル）イソシトシン−５−イルアセチル）グリシン（３２） エチルＮ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ−２−（ベンジルオキシ カルボニル）イソシトシン−５−イルアセチル）グリシネート（３１，１．６ｇ ，３．０ｍｍｏｌ）を、緩和に加熱することによりメタノール（１６ｍｌ）に溶 解 した。この溶液を０℃に冷却し、２Ｍ水酸化ナトリウム（２３ｍｌ）を添加した 。反応混合物を室温で７５分間撹拌したのち、再び０℃に冷却した。ｐＨを１． ７に調整し、生成物を濾過により採集し、水で１回洗浄し、乾燥させて、１．２ ４ｇ（８２％）の３２を白色結晶として得た。 アミド結合の周りの回転が阻害されているため、ＮＭＲシグナルの幾つかが主 （ｍａ）および副（ｍｉ）成分から構成される。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／ ＴＭＳ）：δ＝ 1.45(s，9H，BOC); 3.05-3.52(m，6H，NCH₂，CH₂N，CH₂CON); 4 .01 および 4.29(s，ma および s，mi．各，CH₂COO); 5.29(s，2H，PhCH₂ ); 7.4 0-7.51(m，5H，PhCH₂); 7.63 および 7.68(s，mi および s，ma，各 1H，H-6)．¹³ C−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／ＴＭＳ）：δ＝ 28.2(BOC); 30.2 および 30.5(m a および mi，各 CH₂ CON); 37.9 および 38.3(mi および ma,各 NCH₂); 47.5 お よび 47.9（ma および mi，各 CH₂N); 50.2(CH₂ COO); 67.0(PhCH₂ ); 128.0-128. 5(m，PhCH₂); 135.8(m，PhCH₂); 150.5(Z-CO); 155.7(C-6); 169.9 および 170. 3(ma および mi，各 CON); 170.8 および 171.2(ma および mi，各 COO)。ＭＳ （ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ（％）：５０４（１６，Ｍ＋Ｈ）；４４８（３.５，Ｍ−ｔ −Ｂｕ＋Ｈ）；４０４（２３，Ｍ−ＢＯＣ＋Ｈ）。 実施例３３ （２−チオウラシル−５−イル）酢酸エチル、図２（３３） すべての操作を乾燥した装置内で窒素雰囲気下に実施した。ナトリウム（４． ３６ｇ，１９０ｍｍｏｌ）を無水エタノール（４４０ｍｌ）に溶解した。チオ尿 素（１４．４ｇ，１９０ｍｍｏｌ）およびα−ホルミルコハク酸メチル（２６， ３０．０ｇ，１７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６時間還流し、次いで 減圧下で蒸発乾固した。冷１５％酢酸（３００ｍｌ）を残渣に添加した。混合物 を０℃で一夜撹拌し、濾過した。沈殿を水で１回洗浄し、乾燥させて、１２．２ ９ｇ（３７％）の表題化合物を白色固体として得た。 Ｃ₈Ｈ₁₀Ｎ₂Ｏ₃Ｓ につき計算値：Ｃ，４４．８５；Ｈ，４．７０；Ｎ，１３．０ ８；Ｃ／Ｎ，３．４３．実測値：Ｃ，４２．９５；Ｈ，４．５８；Ｎ，１２．８ ９；Ｃ／Ｎ，３．３３。 実施例３４ ウラシル−５−イル酢酸（３４） （２−チオウラシル−５−イル）酢酸エチル（３３，７．８ｇ，３６ｍｍｏｌ ）を、クロロ酢酸（１．９ｇ，２０ｍｍｏｌ）および水（４７ｍｌ）と混合し、 ２時間還流した。濃塩酸（２２ｍｌ）を添加し、反応混合物を一夜還流した。反 応混合物を濾過し、沈殿を水で１回洗浄し、乾燥させた。８の代わりに沈殿につ きこの操作を繰り返して、４．１９ｇ（６８％）の表題化合物を白色固体として 得た。 実施例３５ エチルＮ−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）−Ｎ−（ウラシル−５−イルアセチル ）グリシネート（３５） ウラシル−５−イル酢酸（３４，１．０ｇ，５．９ｍｍｏｌ）を、隔壁を備え た丸底フラスコに移し、隔壁を通して窒素流を導入した。乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ ）およびＮ−メチルモルホリン（１．９ｍｌ，１７．６ｍｍｏｌ）をフラスコに 移し、混合物を０℃に冷却した。エチルＮ−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）グリ シネート（１．６ｇ，６．５ｍｍｏｌ）およびＯ−（３，４−ジヒドロ−４−オ キ ソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ メチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＤＢＴＵ，２．５ｇ，７．０ｍｍ ｏｌ）を混合物に添加した。反応混合物を０℃で３時間撹拌し、次いで酢酸エチ ル（３００ｍｌ）に注入した。得られた懸濁液を飽和硫酸水素カリウム水溶液（ ５０ｍｌで２回）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌで２回）およびブ ライン（５０ｍｌで１回）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、 濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン（１０ｍｌ）およびジエチ ルエーテル（４０ｍｌ）中で一夜撹拌した。得られた沈殿を濾過により単離し、 シエチルエーテルで１回洗浄し、乾燥させて、１．１３ｇ（４８％）の表題化合 物を白色結晶として得た。 アミド結合の周りの回転が阻害されているため、ＮＭＲシグナルの幾つかが主 （ｍａ）および副（ｍｉ）成分から構成される。 Ｃ₁₇Ｈ₂₆Ｎ₄Ｏ₇につき計算値：Ｃ，５１．２５；Ｈ，６．５８；Ｎ，１４．０６ ；Ｃ／Ｎ，３．６５．実測値：Ｃ，５０．６２；Ｈ，６．５１；Ｎ，１３．６０ ；Ｃ／Ｎ，３．７２。 実施例３６ Ｎ−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）−Ｎ−（ウラシル−５−イルアセチル）グリ シン（３６） エチルＮ−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）−Ｎ−（ウラシル−５−イルアセチ ル）グリシネート（３５，１．００ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を１Ｍ水酸化ナトリウ ム水溶液（５０ｍｌ）に溶解し、混合物を室温で１５分間撹拌した。反応混合物 を０℃に冷却し、２Ｍ塩酸の添加によりｐＨを１．５に調整した。３０分後に水 溶液をｎ−ブタノールで抽出した（８０ｍｌで４回）。合わせた有機相のｎ−ブ タノールを減圧下で蒸発させた。残留ｎ−ブタノールを水との共沸蒸留により除 去した（５０ｍｌで５回）。得られた水溶液を凍結乾燥させて、０．９３ｇ（１ ００％）の表題化合物を白色結晶として得た。アミド結合の周りの回転が阻害さ れているため、ＮＭＲシグナルの幾つかが主（ｍａ）および副（ｍｉ）成分から 構成される。 Ｃ₁₅Ｈ₂₂Ｎ₄Ｏ₇につき計算値：Ｃ，４８．６５；Ｈ，５．９９；Ｎ，１５．１３ ；Ｃ／Ｎ，３．２２．実測値：Ｃ，３５．１３；Ｈ，４．６６；Ｎ，１０．４８ ；Ｃ／Ｎ，３．３５。 実施例３７ Ｎ−２−（ベンジルオキシカルボニル）イソシトシン、図３（３７） イソシトシン（５．０ｇ，４５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５０ｍｌ）に加熱に より溶解した。この溶液を０℃に冷却し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ′ −メチルイミダソリウムトリフレート（３３ｇ，９０ｍｍｏｌ）を徐々に添加し た。反応混合物を窒素下に０℃で３０分間、次いで室温で一夜撹拌した。ジクロ ロメタン（４００ｍｌ）を添加し、有機相を半飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（ ２００ｍｌで２回）、半飽和硫酸水素カリウム水溶液（２００ｍｌで２回）、お よびブライン（２００ｍｌで１回）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濾過し 、減圧下で蒸発させた。残渣をメタノールから再結晶して、７．５２ｇ（６８％ ）の表題化合物を白色結晶として得た。 実施例３８ エチルＮ−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）−Ｎ−（ブロモアセチル）グリシネー ト（３８） Ｎ′−ＢＯＣ−アミノエチルグリシンエチルエステル（８，５．９５ｇ，２４ ．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。３， ４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ ＤｈｂｔＯＨ，４．３４ｇ，２６．６ｍｍｏｌ）、シクロロメタン（１５ｍｌ） 中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，５．９８ｇ，２９．０ｍｍｏｌ ）、およびジクロロメタン（３０ｍｌ）中のブロモ酢酸（３．６９ｇ，２６．６ ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で１００分間、次いで室温で１００分 間撹拌した。次いでそれを濾過し、沈殿をジクロロメタンで洗浄した（３０ｍｌ で３回）。濾液および洗液を集めて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１２０ｍｌ で３回）、飽和硫酸水素カリウム水溶液（１２０ｍｌで２回）、およびブライン （１２０ｍｌで２回）で洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、 減圧下で蒸発させた。残渣をシリカで濾過した（３０ｇ，ＥｔＯＡｃ／石油エー テル２５：７５，ｖ／ｖ，最高速度で移動するＴＬＣスポットが除去されるまで ；次いで５５：５０，ｖ／ｖ，生成物を採集）。集めた画分を減圧下で蒸発させ て、８．２９ｇ（９３％）の表題化合物を黄色の油として得た。この油をそれ以 上精製せずに次の工程に用いた。アミド結合の周りの回転が阻害されているため 、ＮＭＲシグナルの幾つかが主（ｍａ）および副（ｍｉ）成分から構成される。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／ＴＭＳ）：δ＝ 1.24-1.33(m，3H，CH₂ CH₃ ); 1.43 お よび 1.44(s，mi および s，ma，各 9H，BOC); 3.28-3.32(m，2H，NCH₂); 3.54- 3.56(m，2H，CH₂N); 3.79 および 3.93(s，mi および s，ma，各 CH₂CON); 4.02 および 4.19-4.26(s，ma，CH₂COO および m，S，mi，CH₂ CH₃，CH₂COO，各 4H) ．¹³C−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／ＴＭＳ）：δ＝ 13.8(CH₂ CH₃ ); 28.1(BOC); 38.2 および 38.5(mi および ma，各NCH₂); 48.0 および 48.9(mi および ma，各 CH₂ N); 50.1 および 50.8(ma および mi，各 CH₂ COO); 61.4(CH₂ CON); 61.8(CH₂ CH₃ )。ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ（％）：３６９（１０，Ｍ＋２＋Ｈ）；３６７（１ ２，Ｍ＋Ｈ）；３１３（２４，Ｍ−ｔ−Ｂｕ＋２＋Ｈ）；３１１（２ ７，Ｍ−ｔ−Ｂｕ＋Ｈ）；２６９（６７，Ｍ−ＢＯＣ＋２＋Ｈ）；２６７（７５ ，Ｍ−ＢＯＣ＋Ｈ）。 実施例３９ エチルＮ−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ−２−（ベンシルオキシカ ルボニル）イソシトシン−１−イル−アセチル）グリシネート（３９） Ｎ−２−（ベンジルオキシカルボニル）イソシトシン（３７，２．００ｇ，８ ．２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（１．６９ｇ ，１２．３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を７５℃に３０分間加熱し、次いで室 温に冷却した。乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中のエチルＮ−（２−ＢＯＣ−アミノエ チル）−Ｎ−（ブロモアセチル）グリシネート（３８，３．００ｇ，８．２ｍｍ ｏｌ）を添加し、反応混合物を窒素下に室温で一夜撹拌した。反応混合物に水（ １５０ｍｌ）を添加し、次いでこれをジクロロメタン（１５０および１００ｍｌ ）で抽出した。有機相を飽和硫酸水素カリウム水溶液（１００ｍｌで３回）およ びブライン（１００ｍｌで２回）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、 減圧下で蒸発させた。残渣をシリカ上でクロマトグラフィー処理（１８０ｍｌ， ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン１：１，ｖ／ｖ，次いでＥｔＯＡｃ）して、１．９５ ｇ（４５％）の表題化合物を白色ガラス質泡状物として得た。アミド結合の周り の回転が阻害されているため、ＮＭＲシグナルの幾つかが主（ｍａ）および副（ ｍｉ）成分から構成される。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／ＴＭＳ）：δ＝ 1.22-1. 29(m，3H，CH₂ CH₃ ); 1.39 および 1.40(s，ma および s，mi，各 9H，BOC); 3.1 5-3.25 および 3.35-3.36(m，mi および m，ma，各 2H，NCH₂); 3.50-3.53(m，2 H，CH₂N); 4.02 および 4.27(s，ma および s，mi，各 2H，CH₂COO); 4.09-4.23 (m，2H，CH₂ CH₃); 4.48 および 4.71(s，mi および s，ma，各 2H，CH₂CON); 5. 12(s，2H，PhCH₂ ); 5.80(d，J-8 Hz，1H，H-5); 7.19(d，J-8 Hz，1H，H-6); 7. 25-7.38(m，5H，PhCH₂)．¹³C−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／ＴＭＳ）：δ＝ 13.7(CH₂ CH ₃ ); 28.0(BOC); 38.4(NCH₂); 48.4 および 48.9(mi および ma，各 CH₂N); 49.1 および 49.4(ma および mi，各 CH₂ CON);；50.5(CH₂ COO); 61.3 および 61.8(m a および mi，各 CH₂ CH₃); 67.1(PhCH₂ ); 104.0(C-5); 127.7-128.1(m．PhCH₂); 135.8(m，PhCH₂); 144.9(C-6); 153.9(Z-CO); 159.4(C-2); 161.9(C-4); 166.4(CON); 168.9(COO)。ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ（％）：５３２ （９２，Ｍ＋Ｈ）；４７６（８，Ｍ−ｔ−Ｂｕ＋Ｈ）。Ｃ₂₅Ｈ₃₃Ｎ₅Ｏ₈につき計 算値：Ｃ，５６．４９；Ｈ，６．２６；Ｎ，１３．１７；Ｃ／Ｎ，４．２９；実 測値：Ｃ，５５．７６；Ｈ，６．５４；Ｎ，１２．６４；Ｃ／Ｎ，４．４１。 実施例４０ Ｎ−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ−２−（ベンジルオキシカルボニ ル）イソシトシン−１−イル−アセチル）グリシン（４０） エチルＮ−（２−ＢＯＣ−アミノエチル）−Ｎ−（Ｎ−２−（ベンジルオキシ カルボニル）イソシトシン−１−イル−アセチル）グリシネート（３９，１．３ ４ｇ，２．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍｌ）に０℃で溶解した。１Ｍ水酸化リ チウム（７．５ｍｌ，７．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で７５分間 撹拌した。水（５０ｍｌ）を添加し、濃塩酸でｐＨを３に調整した。水相をＥｔ ＯＡｃで抽出した（７０ｍｌで２回）。抽出液を集めて乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄） 、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をデシケーター内で乾燥剤（sicapent）に より６５時間乾燥させて、１．２６ｇ（１００％）の表題化合物を白色ガラス質 泡状物として得た。 アミド結合の周りの回転が阻害されているため、ＮＭＲシグナルの幾つかが主 （ｍａ）および副（ｍｉ）成分から構成される。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／ ＴＭＳ）：δ＝ 1.44(s，9H，BOC); 3.29-3.51(m，4H，NCH₂ および CH₂N); 4.0 7 および 4.31(s，ma および s，mi，各 2H，CH₂COO); 4.82 および 5.01(s，mi および s，ma，各 2H，CH₂CON); 5.19(s，2H，PhCH₂ ); 5.99-6.01(m，1H，H-5) ; 7.73 および 7.76(d，mi，J-8 Hz および d．ma，J-8 Hz，各 1H，H-6); 7.39 -7.45(m，5H，PhCH₂)．¹³C−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆／ＴＭＳ）：δ＝ 28.2(BOC ); 37.6 および 38.2(mi および ma，各 NCH₂); 47.0 および 47.9(mi および m a，各 CH₂N); 49.2(CH₂ CON); 49.4 および 49.6(ma および mi，各 CH₂ COO); 66 .8 および 66.9(ma および mi，各 PhCH₂ ); 103.2(C-5); 127.8-128.3(m，PhCH₂ ); 136.5(PhCH₂); 147.7(C-6); 154.1(Z-CO); 155.7(BOC-CO); 159.5(C-2); 162 .2(C-4); 166.5 および 166.9(ma および mi，各 CON); 170. 3および 170.7(ma および mi，各 COO)。ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ（％）：５０ ４（２１，Ｍ＋Ｈ）；４４８（６，Ｍ−ｔ−Ｂｕ＋Ｈ）；４０４（１１，Ｍ−Ｂ ＯＣ＋Ｈ）；９１（１００，ＰｈＣＨ₂）。 実施例４１ ５−ブロモウラシル−Ｎ−１−メチルアセテート、図４（４１） ５−ブロモウラシル（５．００ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（ ７．２３ｇ，５２．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７５ｍｌ）に懸濁した。ブロモ酢酸 メチル（２．４８ｍｌ，２６．ｌｍｍｏｌ）を５分間かけて添加した。懸濁液を 室温で２時間撹拌し、次いで濾過した。固体残渣をＤＭＦで２回洗浄し、濾液を 合わせて真空中で蒸発乾固した。残渣は表題化合物、ＤＭＦおよび少量の未同定 不純物を含有する油であった。加水分解前に表題化合物を精製する必要はない。¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆，２５０ＭＨｚ）：8.55(不純物); 8.27(CBr=CHN); 8.02(不純物); 4.76(不純物); 4.70(不純物); 4.62(NCH₂ COOCH₃); 3.78(COOCH₃ ); 2.96(DMF); 2.80(DMF)． ¹³C−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆，２５０ＭＨｚ）：1 68.8(COOCH₃); 172.5(CH-CBrCON); 161.6(DMF); 151.9(NCON); 145.0(CO-CBr-CH N); 95.6(COCBr-CHN); 52.6(不純物); 52.5(OCH₃); 49.7(不純物); 48.8(NCH₂CO OMe); 43.0(不純物); 36.0(DMF)。 ＵＶ（メタノール；_maxｎｍ） 実施例４２ （５−ブロモウラシル）酢酸（４２） 水（３０ｍｌ）を実施例４１で得た粗生成物である油に添加し、水酸化ナトリ ウム（２Ｍ，６０ｍｌ）の添加により混合物を溶解した。０℃で１０分間撹拌し たのち、ｐＨ＝２になるまで塩酸（４Ｍ，４５ｍｌ）を添加すると表題化合物が 沈殿した。５０分後に固体残渣を濾過により単離し、冷水で１回洗浄し、次いで 真空中で乾燥剤（sicapent）により乾燥させた。収量：２．４６ｇ（３８％）。 融点２５０〜２５１℃。 元素分析：Ｃ₂₅Ｈ₃₃Ｎ₅Ｏ₈につき実測値（計算値）： ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ（帰属，強度）；２５１／２４９（Ｍ＋Ｈ，５）。 実施例４３ Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（５−ブロモウラシル−Ｎ−１−メチ レンカルボニル）グリシンエチルエステル（４３） Ｎ′−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエステル（８，１．８０ｇ，７． ３０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解した。Ｄｈｂｔ−ＯＨ（１．３１ｇ ，８．０３ｍｍｏｌ）を添加すると、沈殿が生じた。沈殿が溶解するまでＤＭＦ を添加した（１０ｍｌ、２回）。沈殿しないように徐々に（５−ブロモウラシル ）酢酸（４２，２．００ｇ，８．０３ｍｍｏｌ）を添加した。塩化メチレン（３ ０ｍｌ）を添加し、混合物を０℃に冷却し、次いで濾過した。沈殿、すなわちＤ ＣＵを塩化メチレンで２回洗浄した。合わせた濾液に塩化メチレン（１００ｍｌ ）を添加した。混合物を半飽和ＮａＨＣＯ₃溶液（１００ｍｌで３回、Ｈ₂Ｏ：飽 和ＮａＨＣＯ₃溶液１：１ ｖ／ｖ）、次いで希ＫＨＳＯ₄（１００ｍｌで２回、 Ｈ₂Ｏ：飽和ＫＨＳＯ₄溶液４：１ ｖ／ｖ）、最後に飽和ＮａＣｌ溶液（１００ ｍｌで１回）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空 中て（約１５ｍｍＨｇ、次いて約１ｍｍＨｇ）蒸発乾固した。残渣を塩化メチレ ン（３５ｍｌ）に懸濁し、室温で４５分間撹拌し、濾過した（沈殿はＤＣＵであ った）。濾液に０℃で石油エーテル（２容量）を滴加すると、油が沈殿した。液 体をデカントし、残留する油を塩化メチレン（２０〜５０ｍｌ）に溶解した。石 油エーテル（２容量）の添加により沈殿させた。不純物が除去されるまでこの操 作を５回繰り返した。不純物は展開溶媒として１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂を用 い るＴＬＣで検出できる。得られた油を塩化メチレン（２５ｍｌ）に溶解し、真空 中で蒸発乾固すると、表題化合物が凝固した。収量：２．０３ｇ（５８％）。融 点８７〜９０℃。元素分析：Ｃ₁₇Ｈ₂₅ＢｒＮ₄Ｏ₇につき実測値（計算値）： ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ（帰属，相対強度）；４７９／４７７（Ｍ＋Ｈ，５）；４ ２３／４２１（Ｍ＋２Ｈ−ｔＢｕ，８）；４２３／４２１(Ｍ＋２Ｈ−ｔＢｕ， ８);３７９／３７７（Ｍ＋２Ｈ−Ｂｏｃ，１００）；２３３／２３１（Ｍ−主鎖 、２０）。 実施例４４ Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（５−ブロモウラシル−Ｎ−１−メチレン カルボニル）グリシン（４４） Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（５−ブロモウラシル−Ｎ−１−メチレ ンカルボニル）エチルエステル（４３，１．９６ｇ，４．１１ｍｍｏｌ）を加熱 によりメタノール（３０ｍｌ）に溶解し、次いで０℃に冷却した。水酸化ナトリ ウム（２Ｍ，３０ｍｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。ｐＨ＝２．０に なるまでＨＣｌ（１Ｍ，７０ｍｌ）を添加した。水相を酢酸エチルで抽出した（ ６５ｍｌで３回、および４０ｍｌで７回）。酢酸エチル抽出液を合わせて、飽 和ＮａＣｌ溶液（５００ｍｌ）で洗浄した。酢酸エチル相を硫酸マグネシウムで 乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発乾固した。収量：１．７７ｇ（９６％）。融点 ９２〜９７℃。元素分析：Ｃ₁₅Ｈ₂₁ＢｒＮ₄Ｏ₇につき実測値（計算値）： ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ（帰属，相対強度）；４４９／４５１（Ｍ＋Ｈ，７０）； ３４９／３５１（Ｍ＋２Ｈ−Ｂｏｃ，１００）；２３１／２３３（Ｍ−主鎖、２ ０）。 実施例４５ 固相法によるＰＮＡオリゴマーの合成、一般法 一般に０.１〜１.０ｍｍｏｌの官能価が得られるように官能基付き樹脂を秤量 する（樹脂に結合した官能基は種々の業者から市販されている；たとえばケンタ ッキー州ペプタイズ・インタナショナル）。この重量の樹脂を１：１（v／v）ジ クロロメタン：ジメチルホルムアミド溶液（５ｍＬ／１ｇ樹脂）に懸濁し、所望 により一定期間膨潤させる。次いで溶剤を濾過により除去し、樹脂をトリフルオ ロ酢酸（１ｍＬ／１ｇ樹脂）に懸濁し、２分間振盪する。トリフルオロ酢酸を濾 過により除去し、この工程を１回繰り返す。樹脂を１：１（ｖ／ｖ）ジクロロメ タン:ジメチルホルムアミド溶液で３回洗浄する。得られた樹脂をピリジン溶液( ５ｍＬ／１ｇ樹脂)に再懸濁し、真空濾過してピリジンを除去する。この工程を ２回繰り返す。次いで１：１（v／v）ジクロロメタン：ジメチルホルムアミド溶 液 （５ｍＬ／１ｇ樹脂）を用いて再懸濁したのち濾過し（“洗浄”と呼ぶ）、この 洗浄工程を２回繰り返す。この樹脂を１：１（ｖ／ｖ）ピリジン：ジメチルホル ムアミドに懸濁し、この懸濁液に目的とするＰＮＡモノマー（２〜１０モル当量 ）、ＴＢＴＵ（１．９〜９．９モル当量）、およびジイソプロピルアミン（５〜 ２０モル当量）を、ＰＮＡの最終濃度が０．２Ｍとなるように添加する。この懸 濁液を１５〜６０分間振盪し、消費されたカップリング溶液を濾過により除去す る。樹脂をピリジンで３回洗浄し、未反応アミンをＤＭＦ中５当量のラポポルト （Ｒａｐｏｐｏｒｔ）試薬で５分間、キャッピングする。次いで樹脂をピリジン で３回洗浄したのち、１：１（ｖ／ｖ）ジクロロメタン：ジメチルホルムアミド （５ｍＬ／１ｇ樹脂）で３回洗浄する。この時点で樹脂は次のカップリング反応 に使用できる状態となる。。目的とするＰＮＡが樹脂上に組み立てられるまでこ の操作を繰り返す。 この一般法で製造したアミノエチルグリシン（ａｅｇ−）ＰＮＡおよびａｅｇ− ＰＮＡ誘導体の具体例 実施例４６ ＰＮＡのキャッピング ＰＮＡは、実施例４５に記載した方法に従い、最終工程でＰＮＡモノマーの代 わりに目的とするカルボン酸系キャッピング試薬を用いて、Ｎ−末端で非ＰＮＡ 部分によりキャッピングすることができる。 この一般法で製造した（ａｅｇ−）ＰＮＡおよびａｅｇ−ＰＮＡ誘導体の具体例 実施例４７ Ｌｙｓ／Ａｈａ結合ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 最初の１０個のａｅｇ−ＰＮＡモノマー単位は、実施例４５に従った標準固相 法によりＴＢＴＵ活性化を用いてａｅｇ−Ｔモノマー単位をリシン−ＭＢＨＡ樹 脂に結合させて、アミノ末端ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基を含 む樹脂結合ＰＮＡモノマーを得ることにより結合させた。反復法により他方の９ ａｅｇ−ＰＮＡモノマー単位を結合させた。末端ａｅｇ−ＰＮＡはアミノ末端ｔ −ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基を含む。 支持体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン（１：１）で４回洗 浄し、次いでトリフルオロ酢酸中の５％ ｍ−クレゾール（３ｍＬ）で２回、そ のつど３分間振盪しながら処理した。支持体を再びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ ド／ジクロロメタン（１：１）で、次いでピリジンで洗浄した。バイアルにｔ− ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベンジルオキシカルボニル）− Ｌ−リシン（２００ｍｍｏｌ）およびＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）− １，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１８０ｍｍ ｏｌ）を添加した。このバイアルにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）お よびピリジン（１ｍＬ）を添加したのち、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン （４００ｍｍｏｌ）を添加した。すべての固体が溶解するまでバイアルを振盪し た。１分後にバイアルの内容物をペプチド合成容器に添加し、２０分間振盪した 。次いで反応溶液を排除し、支持体をピリジンで５回洗浄した。Ｎ，Ｎ−ジメチ ル ホルムアミド（１．５ｍＬ）中の１０％Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ′− メチル−イミダゾールトリフレートの溶液を添加することにより、残留する遊離 アミンをキャッピングした。５分間振盪したのち、キャッピング溶液を排除し、 支持体をピリジンで５回洗浄した。 リンカーの残部は、（前記に従って）Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ε− アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベンジ ルオキシカルボニル）−Ｌ−リシン、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ε−ア ミノヘキサン酸、およびｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベ ンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リシンの逐次結合により製造された。得られた ｔ−ブチルオキシカルボニルキャップ付きのアミノ末端リンカーを含むデカマー ａｅｇ−ＰＮＡからなるオリゴマーを、次いで残り１０ＰＮＡ単位につき再び標 準固相法により伸長させた。支持体の開裂除去およびＨＰＬＣ精製は、標準ＰＮ Ａオリゴマーにつき記載したものと同様であった。表題化合物はエレクトロスプ レー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析により、予想分子量６０１２ダルト ンをもつと測定された。このビス−ＰＮＡとその標的によって形成されたＰＮＡ ／ＤＮＡトリプレックスの熱安定性は、対応する単一ＰＮＡとその標的によって 形成されたＰＮＡ／ＤＮＡトリプレックスより大きいことが見出された（ビスに ついてはＴｍ＝８９℃、単一体については８５℃）。質量分析によって、ビス− ＰＮＡは標的と１：１複合体を形成するのに対し、単一ＰＮＡはその標的と２： １複合体を形成することも証明された。 実施例４７ａ Ｌｙｓ／アミノシス−ヘキセン酸連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 最初の１０個のａｅｇ−ＰＮＡモノマー単位は、実施例４５に従った標準固相 法によりＴＢＴＵ活性化を用いてａｅｇ−Ｔモノマー単位をリシン−ＭＢＨＡ樹 脂に結合させ、アミノ末端ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基を含む 樹脂結合ＰＮＡモノマーを得ることにより結合させる。反復法により他方の９個 のａｅｇ−ＰＮＡモノマー単位を結合させる。末端ａｅｇ−ＰＮＡはアミノ末端 ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基を含む。 支持体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン（１：１）で４回洗 浄し、次いでトリフルオロ酢酸中の５％ ｍ−クレゾール（３ｍＬ）で２回、そ のつど３分間振盪しながら処理する。支持体を再びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ ド／ジクロロメタン（１：１）で洗浄し、次いでピリジンで洗浄する。バイアル にｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベンジルオキシカルボニ ル）−Ｌ−リシン（２００ｍｍｏｌ）およびＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イ ル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１８ ０ｍｍｏｌ）を添加する。このバイアルにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍ Ｌ）およびピリジン（１ｍＬ）を添加したのち、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチル アミン（４００ｍｍｏｌ）を添加する。すべての固体が溶解するまでバイアルを 振盪する。１分後にバイアルの内容物をペプチド合成容器に添加し、２０分間振 盪する。次いで反応溶液を排除し、支持体をピリジンで５回洗浄する。Ｎ，Ｎ− ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）中の１０％Ｎ−ベンジルオキシカルボニル −Ｎ′−メチル−イミダゾールトリフレートの溶液を添加することにより、残留 する遊離アミンをキャッピングする。５分間振盪したのち、キャッピング溶液を 排除し、支持体をピリジンで５回洗浄する。 リンカーの残部は、（前記に従って）Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ε− アミノヘキセン酸、ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベンジ ルオキシカルボニル）−Ｌ−リシン、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ε−ア ミノヘキセン酸、およびｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベ ンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リシンの逐次結合により製造される。得られた ｔ−ブチルオキシカルボニルキャップ付きのアミノ末端リンカーを含むデカマー ａｅｇ−ＰＮＡからなるオリゴマーを、次いで残りの１０ＰＮＡ単位につき再び 標準固相法により伸長させる。支持体の開裂除去およびＨＰＬＣ精製は、標準Ｐ ＮＡオリゴマーにつき記載したものと同様である。 実施例４７ｂ Ｌｙｓ／アミノヘキシン酸連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 最初の１０個のａｅｇ−ＰＮＡモノマー単位は、実施例４５に従った標準固相 法によりＴＢＴＵ活性化を用いてａｅｇ−Ｔモノマー単位をリシン−ＭＢＨＡ樹 脂に結合させ、アミノ末端ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基を含む 樹脂結合ＰＮＡモノマーを得ることにより結合させる。反復法により他方の９個 のａｅｇ−ＰＮＡモノマー単位を結合させる。末端ａｅｇ−ＰＮＡはアミノ末端 ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基を含む。 支持体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン（１：１）で４回洗 浄し、次いでトリフルオロ酢酸中の５％ ｍ−クレゾール（３ｍＬ）で２回、そ のつど３分間振盪しながら処理する。支持体を再びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ ド／ジクロロメタン（１：１）で、次いでピリジンで洗浄する。バイアルにｔ− ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベンジルオキシカルボニル）− Ｌ−リシン（２００ｍｍｏｌ）およびＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）− １．１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１８０ｍｍ ｏｌ）を添加する。このバイアルにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）お よびピリジン（１ｍＬ）を添加したのち、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン （４００ｍｍｏｌ）を添加する。すべての固体が溶解するまでバイアルを振盪す る。１分後にバイアルの内容物をペプチド合成容器に添加し、２０分間振盪する 。次いで反応溶液を排除し、支持体をピリジンで５回洗浄する。Ｎ，Ｎ−ジメチ ルホルムアミド（１．５ｍＬ）中の１０％Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ′ −メチル−イミダゾールトリフレートの溶液を添加することにより、残留する遊 離アミンをキャッピングする。５分間振盪したのち、キャッピング溶液を排除し 、支持体をピリジンで５回洗浄する。 リンカーの残部は、（前記に従って）Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ε− アミノヘキシン酸、ｔ−ブチルオキンカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベンジ ルオキシカルボニル）−Ｌ−リシン、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ε−ア ミノヘキシン酸、およびｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベ ンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リシンの逐次結合により製造される。得られた ｔ−ブチルオキシカルボニルキャップ付きのアミノ末端リンカーを含むデカマー ａｅｇ−ＰＮＡからなるオリゴマーを、次いで残り１０ＰＮＡ単位につき再び標 準固相法により伸長させる。支持体の開裂除去およびＨＰＬＣ精製は、標準ＰＮ Ａオリゴマーにつき記載したものと同様である。 実施例４７ｃ Ｌｙｓ／メタ−アミノ安息香酸連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 最初の１０個のａｅｇ−ＰＮＡモノマー単位は、実施例４５に従った標準固相 法によりＴＢＴＵ活性化を用いてａｅｇ−Ｔモノマー単位をリシン−ＭＢＨＡ樹 脂に結合させ、アミノ末端ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基を含む 樹脂結合ＰＮＡモノマーを得ることにより結合させる。反復法により他方の９個 のａｅｇ−ＰＮＡモノマー単位を結合させる。末端ａｅｇ−ＰＮＡはアミノ末端 ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基を含む。 支持体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン（１：１）で４回洗 浄し、次いでトリフルオロ酢酸中の５％ ｍ−クレゾール（３ｍＬ）で２回、そ のつど３分間振盪しながら処理する。支持体を再びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ ド／ジクロロメタン（１：１）で、次いでピリジンで洗浄する。バイアルにｔ− ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベンジルオキシカルボニル）− Ｌ−リシン（２００ｍｍｏｌ）およびＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）− １，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１８０ｍｍ ｏｌ）を添加する。このバイアルにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）お よびピリジン（１ｍＬ）を添加したのち、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン （４００ｍｍｏｌ）を添加する。すべての固体が溶解するまでバイアルを振盪す る。１分後にバイアルの内容物をペプチド合成容器に添加し、２０分間振盪する 。 次いで反応溶液を排除し、支持体をピリジンで５回洗浄する。Ｎ，Ｎ−ジメチル ホルムアミド（１．５ｍＬ）中の１０％Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ′− メチル−イミダゾールトリフレートの溶液を添加することにより、残留する遊離 アミンをキャッピングする。５分間振盪したのち、キャッピング溶液を排除し、 支持体をピリジンで５回洗浄する。 リンカーの残部は、（前記に従って）Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−メタ −アミノ安息香酸、ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベンジ ルオキシカルボニル）−Ｌ−リシン、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−メタ− アミノ安息香酸、およびｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（２−クロロベ ンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リシンの逐次結合により製造される。得られた ｔ−ブチルオキシカルボニルキャップ付きのアミノ末端リンカーを含むデカマー ａｅｇ−ＰＮＡからなるオリゴマーを、次いで残り１０個のＰＮＡ単位につき再 び標準固相法により伸長させる。支持体の開裂除去およびＨＰＬＣ精製は、標準 ＰＮＡオリゴマーにつき記載したものと同様である。 実施例４８ Ｌｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 表題のＬｙｓ／Ａｈａ連結ａｅｇ−ＰＮＡを実施例４７の方法に従って合成し 、ただしポリスチレンポリエチレングリコールコポリマー樹脂の代わりに“テン タゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ）樹脂”を合成支持体として用いた。 実施例４９ Ｌｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 表題のＬｙｓ／Ａｈａ連結ａｅｇ−ＰＮＡを実施例４７の方法に従って合成し 、ただしポリスチレンポリエチレングリコールコポリマー樹脂の代わりに“テン タゲル樹脂”を合成支持体として用いた。 実施例５０ Ｌｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 表題のＬｙｓ／Ａｈａ連結ａｅｇ−ＰＮＡを実施例４７の方法に従って合成し 、ただしポリスチレンポリエチレングリコールコポリマー樹脂の代わりに“テン タゲル樹脂”を合成支持体として用いた。 実施例５１ シュードイソシトシン（Ｊ）を含むＬｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡ 表題のＬｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡを実施例４７の方法に従って製 造する。シュードイソシトシン“（Ｊ）”モノマー単位を実施例２６〜３２の方 法に従って合成し、シトシンモノマー単位の代わりに用いて表題化合物を得る。 実施例５２ シュードウラシル（ΨＵ）を含むＬｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡ 表題のＬｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡを実施例４７の方法に従って製 造する。シュードウラシル“ΨＵ”モノマー単位を実施例３３〜３６の方法に従 って合成し、ウラシルモノマー単位の一部の代わりに用いて表題化合物を得る。 実施例５３ イソシトシン（ｉＣ）を含むＬｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡ 表題のＬｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡを実施例４７の方法に従って製 造する。ａｅｇ−イソシトシン“ｉＣ”モノマー単位を実施例３７〜４０の方法 に従って合成し、ａｅｇ−シトシンモノマー単位の一部の代わりに用いて表題化 合物を得る。 実施例５４ ５−ブロモウラシル（５ＢｒＵ）を含むＬｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡ 表題のＬｙｓ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡを実施例４７の方法に従って製 造する。ａｅｇ−５−ブロモウラシルモノマー単位を実施例４１〜４４の方法に 従って合成し、ａｅｇ−ウラシルモノマー単位の一部の代わりに用いて表題化合 物を得る。 実施例５５ ｅｇｌ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 保護されたビスａｅｇ−ＰＮＡを、置換度約０．１０ｍｍｏｌ／ｇのＢｏｃ− Ｌｙｓ（ＣＩＺ）官能基付きＭＢＨＡ樹脂上で組み立てた。ジクロロメタン中で 一夜予め膨潤させたｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂２００ｍｇ（ 乾燥重量）上で、合成を開始した。以下の工程を、目的配列が得られるまで繰り 返した：（１）９５：５ ＴＦＡ／ｍ−クレゾールで処理することによりＮ−末 端ｔ−Ｂｏｃ保護基を除去した（２×４分，１ｍｌ）：（２）１：１ ＤＭＦ／ ジクロロメタンで洗浄する（３×１分，１ｍｌ）；（３）ピリジンで洗浄した（ ２×１分，１ｍｌ）；（４）ＨＢＴＵ（１８．０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）およ びモノマー（０．５ｍｍｏｌ）、ｔ−Ｂｏｃ−Ｃ^zＯＨ（２５．１ｍｇ）、ｔ− Ｂｏｃ−Ｔ−ＯＨ（１９．２ｍｇ）、またはｔ−Ｂｏｃ−ｅｇｌ−ＯＨ（１３． １ｍｇ）を１：１ ＤＭＦ／ピリジン（ｔ−Ｂｏｃ−ｅｇｌ−ＯＨの場合は純Ｄ ＭＦを用いた）に装入し、最終容量０．５ｍｌになるまでＤＥＣＡ（１６ｍｌ， １ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１分間、予備活性化したのち樹脂に添加し、そ こで室温において２０分間結合を行わせた；（５）定量カイザー試験（ニンヒド リン）用に数個のビーズを取り出した；（６）ピリシンで洗浄した（２×１分， １ｍｌ）；（７）ＤＭＦ（１ｍｌ）中のラポポルト試薬（１００ｍｇ，０．２８ ｍｍｏｌ）でアシル化した；（８）８：２ ＤＭＦ／ピピリジンで洗浄した；（ ９）ピリジンで洗浄した（３×１分，１ｍｌ）；（１０）１：１ ＤＭＦ／ジク ロロメタンで洗浄した（３×１分，１ｍｌ）。 目的配列が得られたのち、樹脂を純ジクロロメタンで洗浄し（３×１分，１． ５ｍｌ）、次いでデシケーター内で真空下に乾燥させた。定量カイザー試験はす べて黄色であり、ビーズは着色しなかった。 ビスａｅｇ−ＰＮＡを樹脂から開裂させ、永久保護基を除去した。１：８：１ ＴＦＡ／ＤＭＳ／ｍ−クレゾール溶液（５０μＬ）および９：１ ＴＦＡ／ＴＦ ＭＳＡ溶液（５０μＬ）を氷浴で冷却し、乾燥樹脂１０ｍｇにつき添加した。室 温で１時間、反応を進行させ、樹脂から排液し、純ＴＦＡで洗浄した（１×１分 ，１ｍｌ）。８：１：１ ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｍ−クレゾール溶液（１００μ Ｌ）（氷浴で冷却）を乾燥樹脂１０ｍｇにつき添加した。反応を２時間進行させ 、樹脂から排液し、ＴＦＡで洗浄した（１×１分，１ｍｌ）。これら２つのＴＦ Ａ溶液を合わせて、乾燥エーテルの添加によりａｅｇ−ＰＮＡを沈殿させた。沈 殿を乾燥エーテルで４回洗浄した。収量１２．７ｍｇ（純度＞９０％、ＲＰ−Ｈ ＰＬＣにより精製、μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８）。ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ： （実測値／計算値）４２４９／４２４７。 実施例５５ａ ｅｇｌ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 表題のｅｇｌ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡを実施例５５の方法に従って合成した。 実施例５５ｂ ｅｇｌ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 表題のｅｇｌ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡを実施例５５の方法で合成した。 実施例５６ シュードイソシトシン（Ｊ）を含むｅｇｌ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡ この保護されたａｅｇ−ＰＮＡを、置換度約０．１０ｍｍｏｌ／ｇのＢｏｃ− Ｌｙｓ（ＣＩＺ）修飾ＭＢＨＡ樹脂上で組み立てた。ジクロロメタン中で一夜予 め膨潤させたｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂１００ｍｇ（乾燥重 量）上で、合成を開始した。実施例５５の方法でビスａｅｇ−ＰＮＡを合成した 。工程（４）でａｅｇ−Ｊ単位の導入のために実施例２６〜３２のａｅｇ−シュ ードイソシトシンモノマー（２５．１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を用いた。実施例 ４５の方法でビスａｅｇ−ＰＮＡを樹脂から開裂させた。収量５．５ｍｇ（純度 ＞９０％、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製、μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８）。ＭＳ（ ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ：（実測値／計算値）４７４８／４７４７。 この例の方法を用いて、以下のシュードイソシトシン（Ｊ）を含むｅｇｌ連結 ビスａｅｇ−ＰＮＡをさらに合成した： 実施例５６ａ シュードイソシトシン（Ｊ）を含むＰＮＡ 表題化合物を実施例５６の方法で合成した。シュードイソシトシン（Ｊ）塩基 を含むこのａｅｇ−ＰＮＡにはリンカーを導入しなかった。 実施例５７ シュードイソシトシン（Ｊ）を含むｅｇｌ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡ この保護されたａｅｇ−ＰＮＡを、置換度約０．１０ｍｍｏｌ／ｇのＢｏｃ− Ｌｙｓ（ＣＩＺ）修飾ＭＢＨＡ樹脂上で組み立てた。ジクロロメタン中で一夜予 め膨潤させたｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂１００ｍｇ（乾燥重 量）上で、合成を開始した。実施例５５の方法でビスａｅｇ−ＰＮＡを合成した 。工程（４）でａｅｇ−シュードイソシトシン単位の導入のために実施例２６〜 ３２のａｅｇ−シュードイソシトシンモノマー（２５．１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ ）を用いた。実施例４５の方法でビスａｅｇ−ＰＮＡを樹脂から開裂させた。収 量２．８ｍｇ（純度＞９０％、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製、μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８）。ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ：（実測値／計算値）４７４９／４７４７ 。 実施例５８ ａｅｇ−ＰＮＡの合成 表題のａｅｇ−ＰＮＡを実施例４５の方法で合成した。 実施例５９ シュードイソシトシン（Ｊ）、およびシュードウリジン（ΨＵ）を含むａｅｇ− ＰＮＡオリゴマー この保護されたａｅｇ−ＰＮＡオリゴマーを、置換度約０．１０ｍｍｏｌ／ｇ のＢｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）修飾ＭＢＨＡ樹脂上で組み立てた。ジクロロメタン 中で一夜予め膨潤させたｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂１００ｍ ｇ（乾燥重量）上で、合成を開始した。実施例５５の方法でビスａｅｇ−ＰＮＡ オリゴマーを合成した。工程（４）で、ａｅｇ−シュートイソシトシンモノマー 単位およびａｅｇ−シュードウラシルモノマー単位の導入のために、実施例２６ 〜３２のａｅｇ−シュードイソシトシンモノマー（２５．１ｍｇ，０．５ｍｍｏ ｌ）および実施例３３〜３６のａｅｇ−シュードウラシルモノマー（１９．２ｍ ｇ，０．５ｍｍｏｌ）を用いた。実施例４５の方法でａｅｇ−ＰＮＡを樹脂から 開裂させた。収量５．８ｍｇ（純度＞９０％、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製、μＢ ｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８）。ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ：（実測値／計算値）２８ １１／２８１１。 実施例６０ ａｅｇ−イソシトシン（ａｅｇ−ｉＣ）、およびａｅｇ−シュードイソシトシン （ａｅｇ−Ｊ）を含むａｅｇ−ＰＮＡオリゴマー この保護されたａｅｇ−ＰＮＡを、置換度約０．１０ｍｍｏｌ／ｇのＢｏｃ− Ｌｙｓ（ＣＩＺ）修飾ＭＢＨＡ樹脂上で組み立てた。ジクロロメタン中で一夜予 め膨潤させたｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂１００ｍｇ（乾燥重 量）上で、合成を開始した。実施例５５の方法でａｅｇ−ＰＮＡオリゴマーを合 成した。工程（４）で、ａｅｇ−シュードイソシトシンモノマー単位およびａｅ ｇ−イソシトシンモノマー単位の導入のために、実施例２６〜３２のａｅｇ−シ ュードイソシトシンモノマー（２５．１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）および実施例３ ７〜４０のａｅｇ−シュードウラシルモノマー（２５．１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ ）を用いた。実施例４５の方法でａｅｇ−ＰＮＡを樹脂から開裂させた。収量５ ．８ｍｇ（純度＞９０％、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製、μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ １８）。ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ：（実測値／計算値）２７０２／２７０１。 実施例６１ １−カルボキシメチルピリミジン−２−オン 表題化合物を実施例２３の方法で、ピリミジン−２−オンを用いて合成した。 実施例６２ Ｎ−（［１−ピリミジン−２−オン］−アセチル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノ エチル）グリシン［ＢｏｃＰｙモノマー］ １−カルボキシメチルピリミジン−２−オン（実施例６１，１当量）およびＢ ｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエステル（２．９ｇ）をＤＭＦ（５０ｍｌ） に溶解した。Ｄｈｂｔ−ＯＨ（１．１当量）を添加し、混合物を氷浴で冷却した 。ＤＣＣ（１.２当量，２.９ｇ）を添加し、混合物を室温で一夜撹拌した。ＤＣ Ｕを濾別し、ＤＭＦで洗浄した。ＤＭＦ層を合わせて真空中で蒸発させた。得ら れた樹脂をジクロロメタンに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ₃、ＫＨＳＯ₄およびＮａＣ ｌ水溶液で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、真空中で蒸発させた。残 渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得た。 実施例６３ ａｅｇ／Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 表題のビスａｅｇ−ＰＮＡオリゴマーを、実施例６２のＮ−（［１−ピリミジ ン−２−オン）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシン［ＢｏｃＰｙモノ マー］を用いる方法に従って、実施例４７の方法で組み立てた。 実施例６４ Ｎ−アセチル−Ｎ−(２−Ｂｏｃ−アミノエチル)グリシン[ＢｏｃＡｃモノマー] 表題化合物を実施例２５の方法で、酢酸を用いて製造した。 実施例６５ （Ａｈａ）ａｅｇ（Ａｃ）Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 表題のビスａｅｇ−ＰＮＡオリゴマーを、実施例６４のＮ−アセチル−Ｎ− （２−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシン［ＢｏｃＡｃモノマー］を用いる方法に 従って、実施例４７の方法で組み立てた。 実施例６６ Ｎ−（４−ペンチノイル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−β−アラニン ［ＢｏｃＷモノマー］ 表題化合物を実施例２５の方法で、４−ペンチン酸（４−ｐｅｎｔｙｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を用いて製造した。 実施例６７ Ｗを含むビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 表題のＷを含むビスａｅｇ−ＰＮＡオリゴマーを、実施例６６のＮ−（４−ペ ンチノイル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−β−アラニン［ＢｏｃＷモ ノマー］を用いる方法に従って、実施例４７の方法で組み立てた。 実施例６８ Ｗを含むビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 表題のＷを含むビスａｅｇ−ＰＮＡオリゴマーを、実施例６７のＮ−（４−ペ ンチノイル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−β−アラニン［ＢｏｃＷモ ノマー］を用いる方法に従って、実施例４７の方法で組み立てた。 実施例６９ Ｎ−Ｂｏｃ−４−アミノ酪酸 表題化合物を実施例２の方法で、４−アミノ酪酸を用いて製造した。 実施例７０ Ｎ−（４−アミノブチリル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシン［Ｂ ｏｃａｂａモノマー］ 表題化合物を実施例２５の方法で、実施例６９のＮ−Ｂｏｃ−４−アミノ酪酸 を用いて製造した。 実施例７１ ａｂａ-ｅｇｌ-Ｈｉｓ-(β-ａｌａ)-Ａｓｐ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡの製造 表題化合物を実施例４７の方法で、実施例７０のＮ−（４−アミノブチリル） −Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシンを用いて製造した。 実施例７２ Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ′−（２−Ｚ−アミノエチル）エチレンジアミン塩酸塩 ジエチレントリアミン（４５．１６ｍｌ；０．４１８ｍｏｌ）をクロロホルム （４００ｍｌ）に溶解し、クロロホルム（１００ｍｌ）中のｔ−ブチル−４−ニ トロフェニルカーボネート（１０．００ｇ；０．０４１８ｍｏｌ）の溶液を０℃ で３時間かけて滴加した。次いで反応混合物を室温に一夜放置した。沈殿したニ トロフェノールを濾過により分離し、クロロホルムで２回洗浄した。濾液を真空 中で蒸発乾固することにより得られた黄色の油を水（２００ｍｌ）に溶解し、０ ℃の４Ｍ塩酸でｐＨを３．５に調整した。水相を酢酸エチルで抽出し（３００ｍ ｌで３回）、次いで２Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整し、真空中で容量を 約３００ｍｌに減少させた。次いで２Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを１２に調整し 、この溶液を酢酸エチルで抽出した（３００ｍｌで８回）。有機相を飽和塩化ナ トリウム水溶液で洗浄し（５００ｍｌで２回）、硫酸マグネシウムで乾燥させ、 真空中で蒸発乾固した。得られた油を水（５０ｍｌ）に溶解し、０℃の４Ｍ塩酸 によりｐＨを５に調整し、溶液を真空中で蒸発乾固した。残渣をエーテルで数回 洗浄し、真空中で乾燥剤（sicapent）により乾燥させた。乾燥した化合物の一部 （３．８０ｇ；０．１３８ｍｏｌ）を水とジオキサンの混合物（７０ｍｌ；水１ 容量対ジオキサン１容量）に溶解し、２Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを１１に調整 した。次いでジオキサン（３５ｍｌ）中のベンジル−４−ニトロフェニルカーボ ネート（４．１４ｇ；０．０１５ｍｏｌ）を２時間かけて滴加し、その間２Ｍ水 酸化ナトリウムでｐＨを常に１１に維持した。混合物を室温で一夜撹拌したのち 、０℃の４Ｍ塩酸でｐＨを３．５に調整し、溶液を酢酸エチルと共に振盪した（ １００ｍｌで４回）。振盪の間に沈殿した生成物を濾別し、酢酸エチルで２回洗 浄 し、真空中で上記乾燥剤により乾燥させた。収量３．４２ｇ（６６％）。融点１ ９４〜１９６℃。元素分析：Ｃ₁₇Ｈ₂₈Ｎ₃Ｏ₄₄Ｃｌにつき実測値（計算値）：Ｃ ，５３．７７（５４．６１）；Ｈ，７．４６（７．５５）；Ｎ，１１．０７（１ １．２４）；Ｃｌ，９．６３（９．４８）。 実施例７３ Ｎ−（２−Ｚ−アミノエチル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシンエ チルエステル 塩酸Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ′−（２−Ｚ−アミノエチル）エチレンジアミン（２．０ ｇ；０．００５４ｍｏｌ）をＤＭＦ（４０ｍｌ）とトリエチルアミン（１．８５ ｍｌ；０.０１３ｍｏｌ）の混合物に溶解し、ブロモ酢酸エチル（０．７２ｍｌ ；０．００６４ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一夜撹拌した。次いで 水（４０ｍｌ）を添加し、この溶液を塩化メチレンで抽出した（５０ｍｌで２回 ）。有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ た。真空中で蒸発乾固すると黄色の油が得られ、これをシリカゲル上で塩化メチ レン中１０％メタノールにより溶離するカラムクロマトグラフィーによって精製 した。これにより表題化合物を油として得た。収量１．９８ｇ（８７％）。元素 分析：Ｃ₂₁Ｈ₃₃Ｎ₃Ｏ₆につき実測値（計算値）：Ｃ，５８．３８（５９．５６） ；Ｈ，８．０１（７．８５）；Ｎ，１０．０６（９．９２）。 実施例７４ Ｎ−（２−Ｚ−アミノエチル）−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンエチルエス テル塩酸塩 Ｎ−（２−Ｚ−アミノエチル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシン エチルエスデル（３.２ｇ；０.００７５６ｍｏｌ）を酢酸中の１Ｍ塩酸（３２ｍ ｌ）に溶解し、室温で撹拌した。４時間後に溶液を真空中で蒸発乾固した。収量 ２.３３ｇ（８３％）。融点１５２℃（分解）。元素分析：Ｃ₁₆Ｈ₂₇Ｎ₃Ｏ₄Ｃｌ₂ ・２Ｈ₂Ｏにつき実測値（計算値）： 実施例７５ Ｎ−（β−メトキシ−α−メチルアクリロイル）−Ｎ′−［Ｎ″−（２−Ｚ−ア ミノエチル）−Ｎ″−（エトキシカルボニルメチル）−２−アミノエチル］尿素 β−メトキシ−α−メチルアクリロイルクロリド（０．７２９ｇ；０．００５ ４２ｍｏｌ）およびシアン酸銀（１．０５５ｇ；０．００７０４ｍｏｌ）を乾燥 トルエン中で３０分間還流した。次いでこの懸濁液を室温に冷却したのち、Ｎ− （２−Ｚ−アミノエチル）−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンエチルエステル 塩酸塩（２．００ｇ；０．００５４２ｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミ ン（２．３６ｍｌ；０．０１４ｍｏｌ）を添加した。この混合物を２時間撹拌し 、次いで濾過して塩類を分離し、これらの塩類を塩化メチレンで洗浄した（１５ ｍｌ）。濾液を水（２０ｍｌで３回）および飽和塩化ナトリウム水溶液（２０ｍ ｌ）で抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空中で蒸発乾固した。 得られた固体をエーテルで十分に洗浄し、真空中で乾燥剤（sicapent）により乾 燥させた。収量１．１６ｇ（４６％）。融点７３〜７６℃。元素分析：Ｃ₂₂Ｈ₃₂ Ｎ₄Ｏ₇につき実測値（計算値） 実施例７６ Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−［２−（１−チミニル）エチル］グリ シンヒドロトリフルオロアセテート Ｎ−（β−メトキシ−α−メチルアクリロイル）−Ｎ′−［Ｎ″−（２−Ｚ− アミノエチル）−Ｎ″−（エトキシカルボニルメチル）−２−アミノエチル］尿 素（１．１４６ｇ；０．００２４７ｍｏｌ）を４Ｍ塩酸中で４時間煮沸した。次 いでこの溶液を真空中で蒸発乾固し、得られた固体をメタノール中１０％トリエ チルアミン（２５ｍｌ）に懸濁した。ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（１．２４ ｇ；０．００５７ｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で１時間撹拌したのち真空中で 蒸発乾固した。ＲＰ−８カラムを用い、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水 中の１４．４％アセトニトリルで溶離するＭＰＬＣにより、残渣を精製した。収 量０.４４６ｇ（３７％）。融点７９℃（分解）。元素分析：Ｃ₁₈Ｈ₂₇Ｎ₄Ｏ₈Ｆ₃ につき実測値（計算値） 実施例７７ ビスＰＮＡの熱安定性 実施例５８の表題ａｅｇ−ＰＮＡ、ならびに実施例５５、５６および５７の表 題ａｅｇ−ＰＮＡを、ｐＨ５、７および９でオリゴヌクレオチド標的と対比した （ＰＮＡ）₂／ＤＮＡトリプレックス形成の熱安定性を測定する実験に用いた。 標的として用いたデオキシオリゴヌクレオチトは、Ｉ−ＣＧＣ−ＡＧＡ−ＧＡ３ Ｃ−ＧＣ；およびＩＩ−ＣＧＣ−Ａ３ＧＡ−ＧＡＣ−ＧＣであった。これらの標 的分子はアンチパラレルである。 実験は１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸Ｎａ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ 中で行われた。加熱速度は５〜９０℃で０．５℃／分であった。 ＰＮＡおよび各ビスＰＮＡを独立して各標的に結合させ、各ｐＨ範囲でＴｍを 測定した。結果を次表に示す。 この実験の結果は、２個のＰＮＡを互いに連結させることによってわずかでは あるが有意のＴｍ上昇が得られることを明瞭に示す。これは化合物Ａについて得 た結果を化合物Ｄについて得た結果と比較することにより示される。この実験は 、反対の極性をもつＤＮＡ標的を比較した場合に大差が見られないことも示す。 被験化合物のＴｍは、パラレルホーグスティーン鎖中にシュートイソシトシン を含まない化合物について、強いｐＨ依存性を示す。このｐＨ依存性は、ホーグ スティーン鎖中のシトシンのプロトン化が必要であることにより説明される。こ のプロトン化は、シュードイソシトシンについては結合が起こるのに必要ない。 形成されたトリプレックスの熱安定性にｐＨが与える影響を調べるために、化 合物Ｂにおいては化合物の一方の連結鎖中のシトシンをシュードイソシトシンで 置換し、化合物Ｃにおいては他方の結合鎖中のシトシンを同様に置換した。これ らのＰＮＡは酸性ｐＨ（５）で、ビスＰＮＡ化合物Ａのものに匹敵する熱安定性 を示した。しかしその化合物のシトシン含有部分がＤＮＡ標的に対してアンチパ ラレルである（したがってシュードイソシトシン鎖がパラレルである）複合体に おいては、ＴｍのｐＨ依存性はほとんど見られない。このことは、標的Ｉと化合 物Ｂ、および標的ＩＩと化合物Ｃにおいて見られた。これらの結果は、この配向 が複合体形成を導くことを示す（アンチパラレル→ワトソン／クリック）。標的 ＩＩと化合物Ｂ、および標的Ｉと化合物Ｃにおいて見られたｐＨ依存性は、これ らの化合物のシトシン鎖がホーグスティーン水素結合に関与することを示す。化 合物Ａ〜Ｃは冷却に際して極めて速やかな形成速度を示した。このように、ＤＮ Ａへの２本の一本鎖ＰＮＡ結合につき普通見られる溶融に際しての顕著なヒステ リシス挙動がないことは、本発明において共有結合している第２ＰＮＡの局所濃 度が高いことによる。 実施例７８ 塩基対ミスマッチがビス−ＰＮＡ／ＤＮＡ、ａｅｇ−ＰＮＡ₂／ＤＮＡ熱安定性 （Ｔｍ）に与える影響 実施例６１で調べた３種類のａｅｇ−ＰＮＡ、すなわち化合物ＣであるＨ-Ｔ ＣＴ-ＣＴＴ-Ｔ-ｅｇｌ-ｅｇｌ−ｅｇｌ-ＴＴＴ-ＪＴＪ-Ｔ-Ｌｙｓ-ＮＨ₂（配列 番号：５２）（ＰＮＡ−Ｃ）、化合物ＤであるＨ-ＴＣＴ-ＣＴＴ-Ｔ-Ｌｙｓ-Ｎ Ｈ₂（配列番号：５３）（ＰＮＡ−Ｄ）および化合物ＥであるＨ-Ｔ₃ＪＴＪＴ-Ｌ ｙｓ-ＮＨ₂（配列番号：５１）（ＰＮＡ−Ｅ）を調べて、結合がミスマッチを含 むオリゴヌクレオチト標的に与える影響を判定した。 熱安定性測定から判定されたビスＰＮＡ（ＰＮＡ−Ｃ）の配列識別性は、著し い安定性損失を生じる（１つの塩基ミスマッチにつき３０℃）。これは両ＰＮＡ 鎖を伴う認識プロセスが２倍であることを反映する。 実施例７９ ビスａｅｇ−ＰＮＡの鎖置換結合 プラスミドｐＴＨａ¹²の³²Ｐ−末端標識ＥｃｏＲ１−ＰｖｕＩＩフラグメント を、１００μｌの１０ｍＭリン酸Ｎａ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７）中における ａｅｇ−ＰＮＡと共に２０℃で６０分間インキュベートし、次いでＫＭｎＯ₄（ ２０ｍＭ，１５秒）で処理した。沈殿およびピペリジン処理ののち、試料を配列 決定用ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動により分析し、放射性ＤＮＡバント をオートラジオグラフィーにより視覚化した。下記濃度のＰＮＡを用いた：１μ Ｍ、３μＭ、１０μＭおよび３０μＭ。ＰＮＡは実施例７７の化合物Ａ、Ｂ、Ｃ およびＤであった。ＰＮＡを含有しない対照も試験した。 結果は、これらのフラグメントが鎖置換用として期待されることを示す。 実施例８０ ビスａｅｇ−ＰＮＡの結合親和性 連結していないａｅｇ−ＰＮＡのものと比較したビスａｅｇ−ＰＮＡの結合特 性を調べるために、下記のａｅｇ−ＰＮＡおよびビスａｅｇ−ＰＮＡを合成した ： ２つの標準１０ｍｅｒ ａｅｇ−ＰＮＡ（化合物ＡおよびＢ）は実施例４５の 方法に従って反対の配向で、すなわちアンチパラレルに合成され、２つのビスａ ｅｇ−ＰＮＡは２つの１０ｍｅｒ配列が連結部分を介して互いに連結した状態で 合成された。一方のビスａｅｇ−ＰＮＡ（化合物Ｃ）は、先に実施例４７に記載 したＡｈａおよびｌｙｓ基を用いて連結された。他方のビスａｅｇ−ＰＮＡ（化 合物Ｄ）は、実施例５５に記載したポリエチレングリコール連結部分を用いて連 結された。これらのａｅｇ−ＰＮＡは連結部分以外は同じである。 二本鎖ＤＮＡ侵入の解離定数（Ｋ_dｓ）を、各ビスａｅｇ−ＰＮＡ、各単一ａ ｅｇ−ＰＮＡ、および単一ａｅｇ−ＰＮＡの等モル混合物につき測定した。ハイ ブリダイゼーションを１００ｍＭ Ｎａ⁺（１×ＴＭＴＢ）中で３７℃において ４日間行った。ＤＮＡ標的は、反対配向の相補鎖を含む６５ｍｅｒデュープレッ クスであった。 Ａｈａ連結ビスａｅｇ−ＰＮＡ（化合物Ｃ）は、最良の単一ａｅｇ−ＰＮＡ（ 化合物Ｂ）より約５００倍良好にデュープレックスＤＮＡを結合した。ＰＥＧ連 結ビスａｅｇ−ＰＮＡは、最良の単一ａｅｇ−ＰＮＡ（化合物Ｂ）と同程度に良 好に結合した。ビス結合の配向が見られたのはトリプレックスの５′末端を架橋 するＡｈａリンカーについてであった。一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ標的へのビ ス体の結合を同様に評価し、個々のａｅｇ−ＰＮＡと比較した。Ａｈａ連結ビス ａｅｇ−ＰＮＡは、ａｅｇ−ＰＮＡより１００倍以上良好に一本鎖ＤＮＡを結 合した。好ましい配向は標的鎖の５′末端を架橋するリンカーを含む。個々のａ ｅｇ−ＰＮＡは、一本鎖ＤＮＡより一本鎖ＲＮＡを５００倍以上良好に結合した 。ビスａｅｇ−ＰＮＡは、最も良好に結合する単一ａｅｇ−ＰＮＡより３倍良好 に一本鎖ＲＮＡを結合した。 ビスａｅｇ−ＰＮＡ鎖の侵入をＭｇ⁺⁺およびスペルミンの存在下で評価した。 Ｍｇ⁺⁺はＰＮＡ鎖の侵入を弱め、一方スペルミンは結合を完全に阻害することが 種々の実験で示された。Ｍｇ⁺⁺およびスペルミンは化合物Ｃの結合を弱めたが、 スペルミンの存在下では検出可能な侵入が見られた。 デュープレックスＤＮＡの化合物Ｃについてのハイブリダイゼーション速度を ２種類の濃度で測定し、幾つかの単一ＰＮＡについての侵入速度と比較した。化 合物Ｃは単一ＰＮＡより９倍以上速やかに結合した。ビスＰＮＡによって向上し た鎖侵入には、速度の増大も伴った。これは第２のトリプレックス形成ａｅｇ− ＰＮＡが近接しており、デュープレックス中の鎖侵入ａｅｇ−ＰＮＡを安定化す ることによると思われる。第２のａｅｇ−ＰＮＡは侵入ａｅｇ−ＰＮＡがデュー プレックスから排除されるのを阻止すると思われる。 ビスａｅｇ−ＰＮＡ（化合物Ｃ）によって向上したこの結合がＡｈａリンカー の非特異的結合によるものでないことを確認するために、化合物Ｃを最高１μＭ の非相補デュープレックス標的とハイブリダイズさせた。結合は見られなかった 。 実施例８１ ビスａｅｇ−ＰＮＡ：ＤＮＡのＥＳ／ＭＳ ビスａｅｇ−ＰＮＡと一本鎖ＤＮＡの結合の化学量論的量を、広域質量範囲の ヒューレット−パッカード５９９８７Ａエレクトロスプレーユニット、５９８９ Ａ四重極質量分析計、およびＬＣパッキング１／１００スプリッターによりエレ クトロスプレーニードルに接続したヒューレット−パッカード１０９０ＨＰＬＣ を用いて測定した。化合物Ａ、質量４９９１ＡＭＵのＤＮＡ一本鎖１６ｍｅｒ（ ５０ｍＭ ＮＨ₄ＯＡｃ溶液中、８μＭ）、および実施例８０の化合物Ｃ、質量 ６０１２のビスａｅｇ−ＰＮＡ（５０ｍＭ ＮＨ₄ＯＡｃ溶液中、１０μＭ） を、別個に、および混合物として分析した。混合物として試験する試料は、３７ ℃で７２時間インキュベートし、２℃に４８時間冷却した、ＮＨ₄ＯＡｃ溶液中 の５０ｍＭ原液から採取した。試験前に試料を室温に昇温させた。各試料原液５ ０μｌを用い、混合物を７５μｌのイソブロパノールと混合し、質量分析計に連 続供給する５０μｌのループに注入した。試料はすべて陰イオンモードで分析さ れ、最小１６の走査を平均して質量を決定した。データのデコンボルーション（ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）をヒューレット−パッカードのエレクトロスプレ ーデコンボルーションプログラムにより行った。一本鎖ＤＮＡの測定質量は４９ ９０ＡＭＵであり、ビスａｅｇ−ＰＮＡの測定質量は６０１２ＡＭＵであった。 混合物の測定質量は１１００５ＡＭＵであり、１つのＤＮＡ鎖と１つのビスａｅ ｇ−ＰＮＡ鎖、すなわち１：１の比率に相当する。トリプレックスについての計 算質量は１１００２ＡＭＵであり、１１００５ＡＭＵは計算質量の０．０３％以 内である。 実施例８２ ａｅｇ−ＰＮＡ：ＤＮＡのＥＳ／ＭＳ ２つの単一ａｅｇ−ＰＮＡと相補配列を含む一本鎖ＤＮＡとの結合の化学量論 的量を、実施例８１の装置を用いる質量分析により測定した。 ８μＭの一本鎖ＤＮＡ（化合物Ａ）を５０ｍＭ ＮＨ₄ＯＡｃ原液から採取し 、同様に５０ｍＭ ＮＨ₄ＯＡｃ原液から採取した２０μＭの単一ａｅｇ−ＰＮ Ａ（化合物Ｃ、実施例８０）と混合した。２試料を混和し、３７℃で７２時間イ ンキュベートし、２℃に４８時間冷却した。試験前に試料を室温に昇温させた。 こうして混合物中に形成された化合物の測定質量は１０５９７Ｄａであった。単 一ａｅｇ−ＰＮＡの質量は２８０２であり、一本鎖ＤＮＡ標的（化合物Ａ）の質 量は４９００Ｄａである。１つの一本鎖ＤＮＡと２つのａｅｇ−ＰＮＡの合計は １０５９４Ｄａである。この質量は２：１の化学量論的量、すなわち２つのａｅ ｇ−ＰＮＡと１つのＤＮＡの結果である。 実施例８３ 単一ＰＮＡ、トランスＰＮＡおよびシスＰＮＡを用いた転写開始 ３種類のプラスミドｐＴ９Ｃ、ｐＴ９ＣＴ９Ｃ（それぞれ配列Ｔ９ＣおよびＴ ９ＣＴ９Ｃを含むｐＵＣ１９誘導体）、およびｐＴ９ＣＡ９ＧＫＳ（配列Ｔ９Ｃ Ａ９Ｇを含む９ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋誘導体）の制限フラグメントをＰ ｖｕＩＩ消化により単離し、ポリアクリルアミドゲルで精製し、３３８塩基対（ ｐＴ９Ｃ）、３５４塩基対（ｐＴ９ＣＴ９Ｃ）および４７７塩基対（ｐＴ９ＣＡ ９ＧＫＳ）のフラグメントを得た。ＰＮＡとＤＮＡフラグメントを総容量１５μ Ｌの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中に おいて３７℃で１時間インキュベートすることにより、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を 形成した。下記最終濃度を含有するように反応混合物を調整した：４０ｍＭ ト リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１２０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０１ １ｍＭ ＤＴＴ、ならびに１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰならびに０．１ ｍＭ ＵＴＰ、ならびに５μＣｉ ³²Ｐ ＵＴＰ。用いたＰＮＡはそれぞれの場 合Ｔ９Ｃ−ｌｙｓＮＨ₂であった。 用いた３種類のプラスミドは、それぞれＰＮＡに対して１つの結合部位(モノ) 、同−ＤＮＡ鎖上に１対の結合部位（シス）、反対側のＤＮＡ鎖上に１対の結合 部位（トランス）を備えている。ＰＮＡ濃度０Ｍ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３μＭお よび１０μＭで、ＰＮＡと３種類のプラスミドの間に複合体を形成させた。 １００ｎＭの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素（ベーリン ガー）の添加により、転写を開始した。混合物（総容量３０μｌ）を３７℃で２ ０分間インキュベートし、転写により生成したＲＮＡを次いでエタノール沈殿法 により回収した。ＲＮＡ転写体を８％変性ポリアクリルアミドゲル上で分析し、 オートラジオグラフィーにより視覚化した。 対応するゲル上に見られるように、モノについてはＲＮＡ濃度１０μＭにおい て、ＰＮＡ結合部位で転写が起こった場合に予想される大きさの単一ＲＮＡ生成 物が生成する。 対応するゲル上に見られるように、シスについてはＲＮＡ濃度１０μＭにおい て、ＰＮＡ結合部位で転写が起こった場合に予想される大きさの一本鎖ＲＮＡ転 写体が生成するが、シスに配置された結合部位に２つのオリゴＰＮＡが存在する ことによって転写がより効果的に促進されることが示される。 対応するゲル上に見られるように、トランスについてはＲＮＡ濃度１０ｎＭ、 ３μＭおよび１０μＭにおいて、２本のＤＮＡ鎖それぞれから転写が開始し、か つそれぞれの結合部位からＤＮＡフラグメントの末端へ進行した場合に予想され る大きさの２つのＲＮＡ転写体が生成する。 転写ＲＮＡが見られたゲルにおいては、１個のＤＮＡ鋳型分子につき１〜５個 のＲＮＡ分子が生成すると推定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/13 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 ブシャート，ドルテ デンマーク王国デーコー−3500 ベルラー ゼ，サナーゴールスヴェイ 73 (71)出願人 エグホルム，ミカエル アメリカ合衆国マサチューセッツ州02173, レキシントン，レキシントン，リッジ・ド ライブ 1231 (71)出願人 ニールセン，ペーター デンマーク王国デーコー−2980 コーデダ ル，イェルテヴァンゲット 509 (72)発明者 エグホルム，ミカエル アメリカ合衆国マサチューセッツ州02173, レキシントン，レキシントン・リッジ・ド ライブ 1231 (72)発明者 ニールセン，ペーター デンマーク王国デーコー−2980 コーデダ ル，イェルテヴァンゲット 509 (72)発明者 ブシャート，オレ デンマーク王国デーコー−3500 ベルラー ゼ，サナーゴールスヴェイ 73 (72)発明者 ドゥーホルム，キム・エル デンマーク王国デーコー−2980 コーデダ ル，エネーヴァルハーヴェン 505 (72)発明者 クリステンセン，レイフ デンマーク王国デーコー−2500 ヴァルヴ ィー，サシリアヴェイ 11，３テーヴェー (72)発明者 コウル，ジェームズ・エム アメリカ合衆国マサチューセッツ州01886, ウエストフォード，バンバリー・ドライブ ７ (72)発明者 キーリー，ジョン アメリカ合衆国カリフォルニア州92130, サン・ディエゴ，コルテ・ファシル 4230 (72)発明者 グリフィス，マイケル アメリカ合衆国カリフォルニア州92130, サン・ディエゴ，カーメル・ランディング 3686

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ペプチド核酸鎖を含む化合物であって、前記ペプチド核酸鎖はピリミジン 複素環塩基を有する少なくとも１つのペプチド核酸ユニットを含み；かつ、 前記ピリミジン複素環塩基はＣ−ピリミジン複素環塩基またはイソピリミジン複 素環塩基を含むことを特徴とする化合物。 ２．前記ピリミジン塩基がＣ−ピリミジン複素環塩基である、請求項１記載の化 合物。 ３．前記Ｃ−ピリミジン複素環塩基がシュードイソシトシンである、請求項２記 載の化合物。 ４．前記Ｃ−ピリミジン複素環塩基がシュードウラシルである、請求項２記載の 化合物。 ５．前記イソピリミジン複素環塩基が５−ブロモウラシルである、請求項２記載 の化合物。 ６．前記ピリミジン塩基がイソピリミジン複素環塩基である、請求項１記載の化 合物。 ７．前記イソピリミジン複素環塩基がイソシトシンである、請求項６記載の化合 物。 ８．前記ペプチド核酸鎖が次式： ［式中： ｎは少なくとも２であり、 Ｌ¹−Ｌⁿのそれぞれは、独立して、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイ ル、天然に生ずる核塩基、天然に生じない核塩基、芳香族性部分、ＤＮＡインタ ーカレーター、核塩基結合基、複素環部分およびレポーターリガンドからなる群 より選択され； Ｃ¹−Ｃⁿのそれぞれは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_yであり、ここでＲ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天 然に生ずるアルファアミノ酸の側鎖からなる群より選択され、またはＲ⁶および Ｒ⁷は、独立して、水素、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテ ロアリール、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ 、ＮＲ³Ｒ⁴およびＳＲ⁵からなる群より選択され、ここでＲ³およびＲ⁴は、それ ぞれ独立して、水素、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ−もしくはアルコキシ −もしくはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ 、アルキルチオおよびアミノからなる群より選択され、Ｒ⁵は、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆ ）アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−、もしくはアルキルチオ−置換（Ｃ₁ −Ｃ₆）アルキルであり、またはＲ⁶およびＲ⁷は一緒になって脂環または複素環 系を形成し； Ｄ¹−Ｄⁿのそれぞれは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、ここでＲ⁶およびＲ⁷は上で定義し たとおりであり； ｙおよびｚのそれぞれは０または１から１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は１よ り大きいが１０より小さく； Ｇ¹−Ｇ^n-1のそれぞれは、いずれの向きでもよい−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ− 、−ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−であり、ここでＲ³は上で定義したとおり であり； Ａ¹−ＡⁿおよびＢ¹−Ｂⁿのそれぞれは、 （ａ）Ａは式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）または（ＩＩｄ）の基であり 、ＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺であり；または （ｂ）Ａは式（ＩＩｄ）の基であり、ＢはＣＨであるように選択され； ［式中、 ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり； ｐおよびｑのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０以 下であり； ｒおよびｓのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０以 下であり； Ｒ¹およびＲ²のそれぞれは、独立して、水素、ヒドロキシ−もしくはアルコキシ −もしくはアルキルチオ−置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロ キシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より選択さ れ；そして Ｒ³およびＲ⁴のそれぞれは上で定義したとおりである］ Ｑは−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ''、−ＳＯ₃Ｈもしくは−ＳＯ₂ＮＲ'Ｒ''または −ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり；そして Ｉは−ＮＨＲ'''Ｒ''''または−ＮＲ'''Ｃ（Ｏ）Ｒ''''であり、ここでＲ'、Ｒ' '、Ｒ'''およびＲ''''は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レボータ ーリガンド、インターカレーター、キレーター、ペプチド、蛋白質、炭水化物、 脂質、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチドジホスフェート 、ヌクレオチドトリホスフェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドお よび可溶性および不溶性ポリマーからなる群より選択される］ の化合物を含む、請求項１記載の化合物。 ９．前記ペプチド核酸鎖が式ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ： ［式中： それぞれのＬは、独立して、水素、フェニル、複素環部分、天然に生ずる核塩基 および天然に生じない核塩基からなる群より選択され； それぞれのＲ⁷'は、独立して、水素および天然に生ずるアルファアミノ酸の側鎖 からなる群より選択され； ｎは１より大きい整数であり； ｋ、ｌおよびｍのそれぞれは、独立して、０または１から５の整数であり； それぞれのｐは０または１であり； Ｒ^hは、ＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり；そして ＲⁱはＨまたはＣＯＣＨ₃である］ の化合物を含む、請求項１記載の化合物。 １０．第１のペプチド核酸セグメントおよび第２のペプチド核酸セグメントを含 む化合物であって、 前記セグメントは少なくとも１つの連結セグメントを介して連結しており；そし て 前記連結セグメントはペプチド核酸またはオリゴヌクレオチドではない化合物。 １１．前記連結セグメントが式： −［ＨＮ−Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）］_n− ［式中： ｎは１から３であり；そして Ｚは、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルキニル、少な くとも１つのＯまたはＳ原子を有するＣ₁−Ｃ₂₀アルカノイル、Ｃ₇−Ｃ₃₄アラル キル、Ｃ₆−Ｃ₁₄、アリールまたはアミノ酸である］ のものである、請求項１０記載の化合物。 １２．前記連結セグメントが次式： −ＮＨ−（ＣＨ₂）_e−Ｃ（＝Ｏ）− ［式中、ｅは１から１５である］ のアミノアルキルカルボン酸の少なくとも１つのユニットを含む、請求項１０記 載の化合物。 １３．ｅが４から８である、請求項１２記載の化合物。 １４．ｅが５または６である、請求項１３記載の化合物。 １５．前記連結セグメントがさらに少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１ ２記載の化合物。 １６．前記連結セグメントが次式： −（ＡＡ）_h−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_e−Ｃ（＝Ｏ）−（ＡＡ）_f］_g− ［式中、 ＡＡはα−アミノ酸であり； ｅは４から８であり； ｆおよびｈは０または１であり；そして ｇは１から４である］ の化合物を含む、請求項１０記載の化合物。 １７．前記連結セグメントがグリコールアミノ酸の少なくとも１つのユニットを 含む、請求項１０記載の化合物。 １８．前記グリコールアミノ酸が、線状の配列で一緒に連結し一方の末端にアミ ノ基を他方の末端にカルボキシル基を有するグリコールサブユニットを含む、請 求項１７記載の化合物。 １９．前記連結セグメントが次式： −［ＮＨ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_j−ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）−］_i ［式中、 ｊは１から６であり；そして ｉは１から６である］ の化合物を含む、請求項１０記載の化合物。 ２０．ｊが２であり、ｉが３である請求項１９記載の化合物。 ２１．前記ペプチド核酸セグメントが前記連結セグメントの２つを介して一緒に 連結して環状構造を形成している、請求項１０記載の化合物。 ２２．前記連結セグメントが前記第１および第２のペプチド核酸セグメントの一 方の上の末端アミン官能基を前記第１および第２のペプチド核酸セグメントの他 方の上のカルボキシル官能基に連結している、請求項１０記載の化合物。 ２３．前記第１のペプチド核酸セグメントがそのアミン末端からそのカルボキシ ル末端方向で決定される核塩基配列を有し、前記第２のペプチド核酸セグメント がそのカルボキシル末端からそのアミン末端方向で決定される核塩基配列を有し 、 かつ前記配列が同一である、請求項２２記載の化合物。 ２４．前記第１および第２のペプチド核酸セグメントの核塩基の少なくとも一部 がピリミジン核塩基である、請求項１０記載の化合物。 ２５．前記第１または前記第２のペプチド核酸セグメントの一方の前記ピリミジ ン核塩基の少なくとも１つがＣ−ピリミジン複素環塩基またはイソピリミジン複 素環塩基を含む、請求項２４記載の化合物。 ２６．ピリミジン核塩基である前記核塩基の前記一部が連続するホモピリミジン 配列中に位置する、請求項２４記載の化合物。 ２７．前記連結セグメントがカルボン酸官能基および第１アミノ官能基を含む請 求項１０記載の化合物。 ２８．その少なくとも一部が標的ヌクレオチド配列を形成する核酸鎖；およびリ ンカーを介して一緒に連結した第１および第２のペプチド核酸セグメントを含む 別の鎖 を含む多鎖構造であって； 前記第１のペプチド核酸セグメントは、前記標的ヌクレオチド配列の５’から３ ’方向で前記標的ヌクレオチド配列に相補的な核塩基配列を有し；かつ 前記第２のペプチド核酸セグメントは、前記標的ヌクレオチド配列の３’から５ ’方向で前記標的ヌクレオチド配列に相補的な核塩基配列を有する ことを特徴とする多鎖構造。 ２９．前記核酸鎖が一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項２８記載の構造。 ３０．前記核酸鎖が二本鎖ＤＮＡである、請求項２８記載の構造。 ３１．前記第１または第２のペプチド核酸セグメントの一方が前記標的ヌクレオ チド配列に対してワトソン／クリック結合を示し、前記第１および第２のペプチ ド核酸セグメントの他方が前記標的ヌクレオチド配列に対してホーグスティーン 結合を示す、請求項２８記載の構造。 ３２．前記標的ヌクレオチド配列に対してホーグスティーン結合を示す前記第１ または第２のペプチド核酸セグメントの前記一方が、前記標的ヌクレオチド配列 中の核塩基に相補的な位置の少なくとも１つにおいて、Ｃ−ピリミジン複素環核 塩基またはイソピリミジン複素環核塩基を含む、請求項３１記載の構造。 ３３．前記Ｃ−ピリミジン複素環核塩基またはイソピリミジン複素環核塩基が、 シュードイソシトシン、イソシトシン、シュードウラシルまたは５−ブロモウラ シルである、請求項３２記載の構造。 ３４．第１の核塩基配列を有する連結したペプチド核酸ユニットの第１のセグメ ント； そのカルボキシル末端からそのアミン末端への方向で決定される第２の核塩基配 列を有する連結したペプチド核酸ユニットの第２のセグメント；および 前記第１および前記第２のペプチド核酸ユニットのセグメントを連結するリンカ ー基； を含む化合物。 ３５．ペプチド核酸ユニットの前記第１のセグメントがアミノ末端からカルボキ シル末端に伸び、； ペプチド核酸ユニットの前記第２のセグメントがアミノ末端からカルボキシル末 端に伸び；かつ 前記リンカー基が、ペプチド核酸ユニットの前記第１のセグメントの前記カルボ キシル末端を、ペプチド核酸ユニットの前記第２のセグメントの前記アミノ末端 に連結している、請求項３４記載の化合物。 ３６．ペプチド核酸ユニットの前記第１のセグメントがアミノ末端からカルボキ シル末端に伸び、； ペプチド核酸ユニットの前記第２のセグメントがアミノ末端からカルボキシル末 端に伸び；かつ ペプチド核酸ユニットの前記第２のセグメントのカルボキシル末端からアミノ末 端への方向で決定される前記第２の核塩基配列と、ペプチド核酸ユニットの前記 第１のセグメントのアミノ末端からカルボキシル末端への方向で決定される前記 第１の核塩基配列とが同一である、請求項３４記載の化合物。 ３７．前記リンカー基が、ペプチド核酸ユニットの前記第１のセグメントの前記 カルボキシル末端をペプチド核酸ユニットの前記第２のセグメントの前記アミノ 末端に連結する、請求項３６記載の化合物。