JP2758988B2 - ペプチド核酸 - Google Patents

ペプチド核酸

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願 本出願は下記のデンマーク特許出願の一部継続出願で
ある:986/91号、1991年５月24日出願、987/91号、1991
年５月24日出願、および510/92号、1992年４月15日出
願。各出願明細書の記載全体を本明細書に参考として引
用する。
発明の分野 本発明は、ポリヌクレオチドではないが、相補的DNA
およびRNA鎖に、対応するDNAより強力に結合する化合物
に関するものである。特に本発明は、天然の核酸塩基ま
たは他の核酸塩基結合性部分がポリアミド主鎖に共有結
合している化合物に関するものである。
発明の背景 100塩基対（100bp）程度の長さのオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドは市販の全自動合成装置を用いて固相法に
よって一般的に合成される。しかしオリゴリボヌクレオ
チドの化学合成は、これよりはるかに一般性が低い。ま
たオリゴリボヌクレオチドはオリゴデオキシリボヌクレ
オチドよりはるかに安定性が低い。これはオリゴデオキ
シリボヌクレオチドの方が、たとえば遺伝子療法または
転写もしくは翻訳の制御を目的とする医学的および生物
学的研究においてより広く用いられていることに関与す
る事実である。
遺伝子の機能は、その情報をメッセンジャーRNA（mRN
A）に転写し、これがリボソームコンプレックスとの相
互作用により、その配列によりコードされる蛋白質の合
成を指示することによって開始する。この合成過程は翻
訳として知られている。翻訳には各種の補助因子、およ
びビルディングブロック、アミノ酸、およびそれらのト
ランスファーRNA（tRNA）の存在が必要であり、それら
はすべて正常な細胞内に存在する。
転写開始には、プロモーターDNA配列がRNA合成酵素で
あるRNAポリメラーゼによって特異的に認識されること
が必要である。原核細胞においては多くの場合、および
恐らく真核細胞においてはすべての場合、この認識に先
立って蛋白質転写因子がプロモーターに配列特異的に結
合する。プロモーターに結合するが、その結合がRNAポ
リメラーゼの作用を阻害する他の蛋白質は、リプレッサ
ーとして知られている。従って遺伝子の活性化は一般に
転写因子によって正に、またリプレッサーによって負に
制御されている。
大部分の一般的な薬物は、標的となる１または２以上
の内因性蛋白質、たとえば酵素との相互作用およびその
調節により機能する。しかしそれらの薬物は一般に標的
蛋白質に特異的ではなく、他の蛋白質とも相互作用す
る。従って標的蛋白質を効果的に調節するためには、か
なり大量の薬物を使用しなければならない。薬物の一般
的な１日量は体重のkg当たり10-5−10-1ミリモル、すな
わち100kgの人につき10-3−10ミリモルである。この調
節を、代わりにmRNAとの相互作用およびその不活性化に
より行うことができれば、薬物の必要量を劇的に減少さ
せ、それに対応して副作用を減少させることができると
思われる。このような相互作用を部位特異的なものにす
ることができれば、いっそうの減少をもたらすことがで
きるであろう。機能性遺伝子が連続的にmRNAを産生する
場合、遺伝子転写全体を阻止することができればよりい
っそう有利になるであろう。
オリゴデオキシヌクレオチドはこのような機会を提示
する。たとえば合成オリゴデオキシヌクレオチドをアン
チセンスプローブとして用いて、mRNAをブロックし、場
合により破壊することができるであろう。こうして合成
DNAがインビボにおける翻訳を抑制することができる。
また、たとえばオリゴヌクレオチドまたは他のDNA認識
物質を用いて三重らせんを形成することにより、動物の
ゲノムを調節することも可能であろう。しかし三重らせ
ん形成には多数の欠点が伴う。たとえばそれはホモプリ
ン配列にのみ用いることができ、またそれは非生理的な
ほど高いイオン濃度および低いpHを必要とする。
さらに、修飾されていないオリゴヌクレオチドはイン
ビボ半減期が短く、ミリグラム以上の量で調製するのは
困難であり、従って使用を差し控えるのに十分なほど高
価であり、かつ細胞膜透過性に乏しいので、アンチセン
ス法および三重らせん法の双方において非実用的であ
る。
これらの問題があるため、改良法および代替法が広範
に探求されている。たとえば三重らせん形成による二本
鎖DNA（dsDNA）の認識に関連して生じる問題は、１本の
鎖上のポリプリン配列を認識する賢明な″スイッチバッ
ク″化学結合によって軽減され、″スイッチングバッ
ク″によって他方の鎖を認識することができる。たとえ
ばマッカーディー、モールズおよびフレーラー（McCurd
y,Moulds,Froehler）,Nucleotides（印刷中）を参照さ
れたい。また、人工的な塩基を用いることによって良好
ならせん形成が達成され、これによりイオン濃度および
pHに関する結合条件が改善された。
半減期および膜透過性を改善するために、ポリヌクレ
オチド主鎖における多数の変更がなされたが、これまで
のところ目的とする結果は得られていない。これらの変
更には下記のものが含まれる：メチルホスホネート、モ
ノチオホスフェート、ジチオホスフェート、ホスホルア
ミデート、ホスフェートエステル、架橋ホスホルアミデ
ート、架橋ホスホロチオエート、架橋メチレンホスホネ
ート；シロキサン橋、カーボネート橋、カルボキシメチ
ルエステル橋、アセトアミド橋、カルバメート橋、チオ
エーテル、スルホキシ、スルホノ橋、各種″プラスチッ
ク″DNA、α−アノマー橋を含むヌクレオチド間デホス
ホ類似体；およびボラン誘導体。
国際特許出願公開86/05518号明細書には、標的塩基配
列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに結合するのに有効な
ポリマー組成物が広範に特許請求されている。その組成
物は次式の非ホモポリマー系の実質的に立体規則性ポリ
マー分子からなると述べられている： 式中： （ａ）R1−Rnはワトソン／クリック対合により標的配列
の対応するインシーケンス（in−sequence）塩基に結合
するのに有効なプリン、プリン様、ピリミジンおよびピ
リミジン様の複素環類から選ばれる認識部分であり； （ｂ）ｎはポリマー分子と標的配列の間で形成されるワ
トソン／クリック水素結合の総数が少なくとも約15にな
るものであり； （ｃ）Ｂ〜Ｂは主として化学的に安定な、実質的に帯電
していない、主としてアキラル結合により結合した主鎖
部分であり； （ｄ）主鎖部分が環式構造を有する場合には主鎖部分の
長さは５−７原子であり、主鎖部分が非環式構造を有す
る場合には主鎖部分の長さは４−６原子であり；そして （ｅ）主鎖部分は、認識部分と標的配列の対応するイン
シーケンス塩基との間のワトソン／クリック塩基対合を
可能にする位置に認識部分を支持する。
国際特許出願公開86/05518号明細書によれば、認識部
分は種々の天然核酸塩基および核酸塩基類似体であり、
主鎖部分はフラン環もしくはモルホリン環からなる環式
主鎖部分、または次式の非環式主鎖部分からなる： 式中のＥは−CO−または−SO2−である。その出願明
細書には、サブユニットの合成に関して、主鎖の結合反
応に関して、およびポリマーの組み立て法に関しては一
般的記述がある。しかしその明細書には、特許請求され
る化合物または構造体を実際に製造する例が示されてい
ない。国際特許出願公開86/05518号明細書には、特許請
求される組成物が標的配列と結合し、その結果、診断ま
たは療法に用いられる可能性のあることが示されている
が、特許請求されるポリマーの結合アフィニティに関し
てはデータがない。
国際特許出願公開86/05519号明細書には、国際特許出
願公開86/05518号明細書に記載されるポリマーであっ
て、ただし固体状支持体に結合したものを含む診断用の
試薬および系が特許請求されている。国際特許出願公開
86/05519号明細書には、特許請求される診断試薬の実際
の調製に関しても例がなく、それらの試薬の診断上の有
効性を示すデータもはるかに少ない。
国際特許出願公開89/12060号明細書には、オリゴヌク
レオチド類似体を合成するための各種ビルディングブロ
ック、およびそれらのビルディングブロックを定められ
た配列に結合させることにより形成されるオリゴヌクレ
オチド類似体が特許請求されている。それらのビルディ
ングブロックは″硬質″（環を含む）または″軟質″
（環を含まない）のいずれであってもよい。両方の場合
ともビルディングブロックはヒドロキシル基およびメル
カプト基を含み、これらによりビルディングブロックが
結合してオリゴヌクレオチド類似体を形成すると述べら
れている。オリゴヌクレオチド類似体の結合部分はスル
フィド（−Ｓ−）、スルホキシド（−SO−）およびスル
ホン（−SO2−）よりなる群から選ばれる。国際特許出
願公開89/12060号明細書には、ビルディングブロックの
合成、およびオリゴヌクレオチド類似体の合成のための
結合反応に関する一般的記載、ならびにビルディングブ
ロックの製造につき記載した実験例が提示されている。
しかしその明細書には、特許請求されるオリゴヌクレオ
チド類似体の製造に関する例、およびオリゴヌクレオチ
ド類似体が標的オリゴヌクレオチドに特異的に結合する
ことを確認する例は示されていない。
さらにオリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体は、
結合性を改善するために挿入体（intercalator）に、二
本鎖および一本鎖DNAの双方への結合性を改善するため
にポリリシンまたは他の塩基性基、また膜透過性を改善
するためにペプチドに、連結された。しかしそれらの連
結は二本鎖および一本鎖DNAのいずれに対しても満足す
べき結合性をもたらさなかった。たとえばメチルホスホ
ネートおよびモノチオホスフェートから生じる他の問題
は、キラリティ、不十分な合成収率、または固相法によ
る合成の実施の困難さであった。
大部分の場合、これらのうち数種の修飾法を採用しう
るにすぎない。その場合ですら、短い配列−−わずか二
量体である場合が多い−−またはモノマーが得られるに
すぎない。さらに、実際に製造されたオリゴマーは稀に
しかDNAもしくはRNAに結合しないことが示されたか、ま
たは生物学的な試験が行われていない。
Tm値の測定によりアッセイされるように、これらの主
鎖修飾法は大部分が、修飾されたオリゴヌクレオチドと
その相補的な天然オリゴヌクレオチド間で形成されるハ
イブリッドに関する安定性を低下させた。従って一般に
当技術分野では、主鎖の修飾はそれらのハイブリッドを
不安定にし、すなわちTm値を低下させるので、最小限に
しておくべきであると理解されている。
発明の目的 本発明の目的は、ssDNAおよびRNA鎖と結合して、それ
らと安定なハイブリッドを形成する化合物を提供するこ
とである。
さらに本発明の目的は、対応するDNAより強固にssDNA
およびRNA鎖と結合する化合物を提供することである。
他の目的は、天然の核酸塩基または他の核酸塩基結合
性部分がペプチド主鎖に共有結合した化合物を提供する
ことである。
さらに他の目的は、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の
鎖と結合し、これにより他方の鎖と置換しうる、RNA以
外の化合物を提供することである。
さらに他の目的は、それらの化合物を用いた治療法お
よび予防法を提供することである。
発明の概要 本発明は、対応するDNAより強固に相補的ssDNAおよび
RNA鎖と結合する、ペプチド核酸（PNA）として知られる
新規な一群の化合物を提供する。本発明化合物は一般
に、アミン窒素を介してペプチド主鎖に連結したリガン
ドからなる。代表的リガンドには、適切なリンカーによ
りペプチド主鎖に結合した４種類の主要天然DNA塩基
（すなわちチミン、シトシン、アデニンまたはグアニ
ン）、または他の天然核酸塩基（たとえばイノシン、ウ
ラシル、５−メチルシトシンまたはチオウラシル）また
は人工的な塩基（たとえばブロモチミン、アザアデニン
またはアザグアニンなど）が含まれる。
特定の好ましい形態においては、本発明のペプチド核
酸は一般式（Ｉ）をもつ： 式中： ｎは少なくとも２であり； L1−Lnはそれぞれ、水素、ヒドロキシ、(C1−C4)アル
カノイル、天然核酸塩基、非天然核酸塩基、芳香族部
分、DNA挿入体、核酸塩基結合性基、複素環式部分、お
よびリポーターリガンドよりなる群から別個に選ばれ、
少なくとも１個のL1−Lnは天然核酸塩基、非天然核酸塩
基、DNA挿入体、または核酸塩基結合性基であり； A1−Anはそれぞれ、単結合、メチレン基、または式
（IIa）もしくは（IIb）の基であり： ［これらの式中： ＸはＯ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはC(CH3)2であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑはそれぞれゼロまたは１−５の整数であ
り、ｐ＋ｑの和は10を越えず； ｒおよびｓはそれぞれゼロまたは１−５の整数であ
り、ｒ＋ｓの和は10を越えず； R1およびR2はそれぞれ、水素、ヒドロキシ−またはア
ルコキシ−またはアルキルチオ−置換されていてもよい
(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル
チオ、アミノおよびハロゲンよりなる群から別個に選ば
れ；そして R3およびR4はそれぞれ、水素、(C1−C4)アルキル、ヒ
ドロキシ−またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置
換された(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、
アルキルチオおよびアミノよりなる群から別個に選ばれ
る］； B1−BnはそれぞれＮまたはR3N+であり、ここでR3は上
記に定めたものであり； C1−CnはそれぞれCR6R7、CHR6CHR7またはCR6R7CH2で
あり、ここでR6は水素であり、かつR7は天然のα−アミ
ノ酸の側鎖よりなる群から選ばれるか、またはR6および
R7は、水素、(C2−C6)アルキル、アリール、アルアルキ
ル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、(C1−C6)アルコキ
シ、(C1−C6)アルキルチオ、NR3R4およびSR5［ここでR3
およびR4は上記に定めたものであり、R5は水素、(C1−C
6)アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−またはアルキ
ルチオ−置換された(C1−C6)アルキルである］よりなる
群から別個に選ばれるか、またはR6とR7は一緒になって
脂環式もしくは複素環式の系を完成し； D1−DnはそれぞれCR6R7、CH2CR6R7またはCHR6CHR7で
あり、ここでR6およびR7は上記に定めたものであり； G1−Gn-1はそれぞれ、いずれの向きであってもよい−
NR3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−、こ
こでR3は上記に定めたものであり； Ｑは−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2N
R′Ｒ″、または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化された
誘導体であり；そして Ｉは−NHRＲ′または−NHRＣ（Ｏ）Ｒ′であ
り、ここでＲ′、Ｒ″、ＲおよびＲ′は、水素、ア
ルキル、アミノ保護基、リポーターリガンド、挿入体、
キレーター（chelator）、ペプチド、蛋白質、炭水化
物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチド、ならびに
可溶性および不溶性ポリマーよりなる群から別個に選ば
れる。
本発明のペプチド核酸は、それらの認識部分が主鎖の
アミド窒素原子、ヒドラジン部分または炭素原子に結合
するのではなく、主鎖のアミン窒素原子に結合している
という点で、国際特許出願公開86/05518号明細書に記載
されたものと異なる。
好ましいペプチド核酸は一般式（III）を有する： 式中： Ｌはそれぞれ、水素、フェニル、複素環式部分、天然
核酸塩基、非天然核酸塩基よりなる群から別個に選ば
れ； R7′はそれぞれ、水素、および天然のα−アミノ酸の
側鎖よりなる群から別個に選ばれ； ｎは１−60の整数であり； ｋ、ｌおよびｍはそれぞれ別個にゼロまたは１−５の
整数であり； RhはOH、NH2または−NHLysNH2であり；そして RiはＨまたはCOCH3である。
特に好ましいものは、式中のＬがそれぞれ、核酸塩基
チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グア
ニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）よりなる群から別個に
選ばれ、ｋおよびｍがゼロまたは１であり、ｎが１−3
0、特に４−20の整数である、式（III）の化合物であ
る。これらの化合物の例は図１に提示され、これはそれ
らの化合物と一本鎖DNAとの類似性を示す。
本発明のペプチド核酸は、溶液中または固相での標準
的なペプチド合成法を適用することにより合成される。
用いられるシンソン（synthon）は特別にデザインされ
たモノマーアミノ酸またはそれらの活性化された誘導体
であり、標準的な保護基により保護されている。オリゴ
ヌクレオチド類似体も対応するジ酸およびジアミンを用
いて合成することができる。
たとえば本発明による新規なモノマーであるシンソン
は、下記一般式のアミノ酸、ジ酸およびジアミンよりな
る群から選ばれる： 式中のＬ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは前記に定めたものであ
り、ただしそれらに含まれるアミノ基はいずれもアミノ
保護基により保護されていてもよく;EはCOOH、CSOH、SO
OH、SO2OHまたはそれらの活性化された誘導体であり;F
はNHR3またはNPgR3であり、これらにおいてR3は前記に
定めたものであり、Pgはアミノ保護基である。
本発明による好ましいシンソンモノマーは、下記構造
式（VII）のアミノ酸： またはアミノ保護された、および／または酸末端活性化
されたそれらの誘導体であり、式中のＬは水素、フェニ
ル、複素環式部分、天然核酸塩基、非天然核酸塩基、お
よび保護されたそれらの誘導体であり；R7′は水素、天
然のα−アミノ酸の側鎖よりなる群から別個に選ばれ
る。特に好ましいものは、式中のR7′が水素であり、Ｌ
が核酸塩基チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン
（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）、ならび
に保護されたそれらの誘導体よりなる群から選ばれる、
式（VII）のシンソンである。
意外にもこれらの化合物は１本の鎖と置換し、これに
より恐らく他方の鎖と二重らせんを形成するすることに
より、二本鎖DNAを認識することもできるであろう。こ
れらの認識は５−60塩基対の長さのdsDNA配列に対して
起こりうる。10−20塩基の配列は重要である。これは原
核生物および真核生物のユニークDNA配列が見出される
範囲だからである。17−18塩基を認識する試薬は特に重
要である。これはヒトゲノムのユニーク配列の長さだか
らである。本発明の化合物はdsDNAと三重らせんをも形
成しうるはずである。
本発明化合物は、その結合性が改善されたことによっ
てアンチセンス試薬として有効になるはずであるという
ことからみて、この驚くべき予想外のdsDNA挙動が見出
されたため、広範な関連試薬の鎖置換を引き起こしうる
ことが予測される。
従って１観点において本発明は、生物の細胞内の特定
の遺伝子の発現を阻害する方法であって、該生物に該遺
伝子と特異的に結合する前記試薬を投与することよりな
る方法を提供する。
さらに本発明は、生物に前記試薬を投与することによ
り生物の細胞内の特定の遺伝子の転写および／または複
製を阻害する方法、あるいは二本鎖DNAの特定の領域の
分解を誘発する方法を提供する。
さらにまた本発明は、細胞またはウイルスのゲノムの
配列に特異的に結合する前記試薬とそれらの細胞または
ウイルスを接触させることにより、それらの細胞または
ウイルスを死滅させる方法を提供する。
図面の簡単な説明 添付の図面を参照することによって、本発明の多数の
目的および利点がより良く当業者に理解されるであろ
う。
図１は、天然のデオキシリボオリゴヌクレオチド
（Ａ）および本発明のペプチド核酸（PNA）（Ｂ）を示
す。
図２は、DNA認識のための天然および非天然の核酸塩
基およびリポーター基の例を示す。
図３は、下記を模式的に示す：（ａ）Acr1−(Taeg)10
−Lys−NH2(Acr-T10-LysNH2)による光分解；（ｂ）Acr1
−(Taeg)10−Lys−NH2のジアゾ結合アクリジンによるフ
ォトフットプリンティング、および好ましいKMnO4−開
裂；ならびに（ｃ）S1−ヌクレアーゼにより増強された
開裂ならびに（ｄ）Acr1−(Taeg)10−Lys−NH2結合部位
のミクロコッカスヌクレアーゼによる開裂。
図４は、本発明のPNAモノマーであるシンソンの例を
示す。
図５は、Acr1リガンド、およびPNA、すなわちAcr1−
(Taeg)10−Lys−NH2を示す。
図６は、モノマーであるシンソンの製造に関する一般
式を示す。
図７は、Acr1リガンドの製造に関する一般式を示す。
図８は、保護されていない線状PNAアミドの製造を説
明した、固相PNA合成に関する一般式を示す。
図９は、下記物質の分析用HPLCクロマトグラムを示
す：（Ａ）HF−開裂後（凍結乾燥前）の粗製Ｈ−［Tae
g］15−NH2；（Ｂ）HF−開裂後（凍結乾燥前）の粗製Ac
r1−［Taeg］15−NH2；および（Ｃ）精製Acr1−［Tae
g］15−NH2。緩衝液A,5％ CH3CN/95％ H2O/0.0445％
TFA:緩衝液B,60％ CH3CN/40％ H2O/0.0390％ TFA;直
線勾配,30分で０−100％のB;流量1.2ml/分；カラム，バ
イダック（Vydac）C18（５μm,0.46×25cm）。
図10は、図９の場合と同じ条件を用いた下記物質の分
析用HPLCクロマトグラムを示す：（Ａ）精製Ｈ−［Tae
g］10−Lys−NH2および（Ｂ）精製Ｈ−［Taeg］5−Caeg
−［Taeg］4−Lys−NH2。
図11aおよび11bは、dA10に対するAcr−T10−Lysの結
合性を示す。５′−32P−標識オリゴヌクレオチド
（１）（５′−GATCCA10G）をAcr−T10−LysNH2の不在
下または存在下で、およびオリゴヌクレオチド（２）
（５′−GATCCT10G）の不在下または存在下でインキュ
ベートし、試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動（PA
GE）およびオートラジオグラフィーにより、″自然条
件″（図11a）または″変性条件″（図11b）下で分析し
た。
図12a−ｃは、dsDNA−Acr−T10−LysNH2コンプレック
スの化学的、光化学的および酵素によるプロービングを
示す。Acr−T10−LysNH2と、dA10／dT10標的配列を含む
32P−末端標識DNAフラグメントとのコンプレックスを、
アフィニティ光開裂法（図12a、１−３列；図12b、１−
３列）、フォトフットプリンティング法（図12a、５−
６列）、過マンガン酸プロービング法（図12b、４−６
列）、またはブドウ球菌ヌクレアーゼによる（図12b、
８−10列）もしくはヌクレアーゼS1による（図12c）プ
ロービング法によりプロービングした。Ａ−鎖（図12
a）またはＴ−鎖（12b,c）をプロービングした。
図13は、保護されたPNAシンソンの合成法を示す。
図14は、保護されたアデニンモノマーシンソンの合成
法を示す。
図15は、保護されたグアニンモノマーシンソンの合成
法を示す。
図16は、PNA主鎖改変の例を示す。
図17は、正常なアミノ酸に対応する側鎖を備えたチミ
ンモノマーシンソンの合成法を示す。
図18aおよび18bは、それぞれチミンモノマーシンソン
のアミノプロピル類似体およびプロピオニル類似体の合
成法を示す。
図19は、チミンモノマーシンソンのアミノエチル−β
−アラニン類似体の合成法を示す。
図20は、PNA−T10、−T9Cおよび−T8C2が高い配列特
異性で二本鎖DNAに結合することを証明するPAGEオート
ラジオグラフを示す。
図21は、二本鎖標的に対するPNA−T10結合の反応速度
を証明する、PAGEオートラジオグラフのデンシトメトリ
ー走査に基づくグラフを示す。
図22は、A10／T10二本鎖DNA標的に結合した種々の長
さのPNAの熱安定性を証明する、PAGEオートラジオグラ
フのデンシトメトリー走査に基づくグラフを示す。
図23は、PNAが制限酵素認識部位の付近に結合した場
合にDNAに対する制限酵素活性が阻害されることを証明
する電気泳動ゲル染色を示す。
図24は、125I−標識PNA−T10が相補的dA10オリゴヌク
レオチドに結合することを証明するPAGEオートラジオグ
ラフを示す。
図25は、本発明によるペプチド核酸を示す。
図26は、本発明によるペプチド核酸に関する合成の方
向を示す。
図27は、ペプチド核酸の合成における窒素保護基とし
てのトシル基に関する試験法を示す。
発明の詳細な記述 本発明によるオリゴヌクレオチド類似体およびモノマ
ーシンソン類において、リガンドＬは主として天然にお
いて見られる位置、すなわちアデニンまたはグアニンに
ついては９位、チミンまたはシトシンについては１位に
おいて結合した、天然の核酸塩基である。あるいはＬは
非天然−核酸塩基（核酸塩基類似体）、他の塩基結合性
部分、芳香族部分、(C1−C4)アルカノイル、ヒドロキシ
または水素であってもよい。若干の代表的な核酸塩基リ
ガンドおよび合成リガンドの例を図２に示す。さらにＬ
はDNA挿入体、リポーターリガンド、たとえば発蛍光
団、放射性標識、スピン標識、ハプテン、または蛋白質
認識リガンド、たとえばビオチンであってもよい。
モノマーシンソンにおいて、Ｌは保護基によりブロッ
クされていてもよい。これを図４に示す。図中のPg
1は、酸、塩基、または水添分解により、もしくは光化
学的に開裂しうる保護基、たとえばｔ−ブトキシカルボ
ニル（Boc）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（F
moc）、または２−ニトロベンジル（2Nb）である。
リンカーＡは多様な群のものであり、たとえば−CR1R
2CO−、−CR1R2CS−、−CR1R2CSe−、−CR1R2CNHR3−、
−CR1R2C＝CH2−および−CR1R2C＝C(CH3)2−であり、こ
れらの式中のR1、R2およびR3は前記において定めたもの
である。好ましくはＡはメチレンカルボニル（−CH2CO
−）である。またＡは長鎖部分、たとえばプロパノイ
ル、ブタノイルもしくはペンタノイルであるか、または
Ｏが他の意味のＸで置換された、もしくは連鎖がR1R2で
置換された、もしくはＹを含む複素体である、対応する
誘導体であってもよい。さらにＡは、(C2−C6)アルキレ
ン鎖、R1R2で置換された(C2−C6)アルキレン鎖である
か、またはＹを含む複素体であってもよい。特定の場
合、Ａは単結合であってもよい。
本発明の好ましい形態において、Ｂは窒素原子であ
り、これによりアキラル主鎖の可能性が提示される。Ｂ
はR3N+であってもよく、この式中のR3は前記において定
めたものである。
本発明の好ましい形態において、Ｃは−CR6R7−であ
るが、炭素２個の単位、すなわち−CHR6CHR7−または−
CR6R7CH2であってもよく、これらの式中のR6およびR7は
前記において定めたものである。R6およびR7はヘテロア
リール基、たとえばピロリル、フリル、チエニル、イミ
ダゾリル、ピリジル、ピリミジニル、インドリルである
か、または一緒になって脂環式系、たとえば1,2−シク
ロブタンジイル、1,2−シクロペンタンジイルまたは1,2
−シクロヘキサンジイルを完成していてもよい。
本発明の好ましい形態において、モノマーシンソン中
のＥはCOOHまたはその活性化された誘導体であり、オリ
ゴマー中のＧは−CONR3−である。前記のように、ＥはC
SOH、SOOH、SO2OHまたはそれらの活性化された誘導体で
あってもよく、これによりオリゴマー中のＧはそれぞれ
−CSNR3−、−SONR3−および−SO2NR3−になる。活性化
は、たとえばＥにより表される基中の水素が、生長する
主鎖の形成に適した脱離基により置換された、酸無水物
または活性エステル誘導体を用いて達成しうる。
主鎖を形成するアミノ酸は同一であっても異種であっ
てもよい。本発明者らは、２−アミノエチルグリシンに
基づくものが本発明の目的に特に好適であることを見出
した。
場合により、PNAの結合性を調節するために、いずれ
かの末端（Q,I）にリガンドを結合させることが有利で
ある。代表的なリガンドには、dsDNAの結合性を改善す
るDNA挿入体、または静電相互作用によりPNAの結合を強
化する塩基性基、たとえばリシンもしくはポリリシンが
含まれる。負に帯電した基、たとえばカルボキシおよび
スルホ基を減少させるためにリガンドを使用しうる。シ
ンソンのデザインによれば、さらにこのような他の部分
を非末端位に配置することが可能となる。
本発明の他の観点においては、PNAオリゴマーを低分
子エフェクターリガンド、たとえばヌクレアーゼ活性も
しくはアルキル化活性をもつリガンド、またはリポータ
ーリガンド（蛍光性、スピン標識、放射性、蛋白質認識
性のリガンドたとえばビオチンまたはハプテン）に結合
させる。本発明の他の観点においては、PNAオリゴマー
をペプチドまたは蛋白質に結合させ、その際ペプチドは
シグナル形成活性を備え、蛋白質はたとえば他の酵素、
転写因子または抗体である。またPNAを水溶性または水
不溶性ポリマーに結合させることができる。本発明の他
の観点においては、PNAをオリゴヌクレオチドまたは炭
水化物に結合させることができる。妥当な場合には、固
体支持体に結合させたある部分（たとえばペプチド鎖、
リポーター、挿入体、または他の種類のリガンド含有
基）上にPNAオリゴマーを合成することができる。
これらのコンジュゲートを遺伝子調節（たとえば遺伝
子を標的とする薬物）、診断、バイオテクノロジーおよ
び科学的な目的に用いることができる。
本発明の他の観点としては、RNAおよびssDNAを標的と
するPNAを用いて、アンチセンス型遺伝子制御部分、な
らびに核酸の同定および精製のためのハイブリダイゼー
ションプローブの双方を調製することができる。さらに
PNAをそれらがdsDNAと三重らせんを形成しうるように修
飾することができる。dsDNAに対して配列特異的に結合
する試薬は、遺伝子を標的とする薬物として使用され
る。これらは癌、エイズその他のウイルス性感染症の治
療に極めて有用な薬物であると予想され、ある種の遺伝
子病の治療にも有効であることが分かるであろう。さら
にこれらの試薬は特異的核酸の検出および単離のための
研究および診断にも使用しうる。
三重らせんの原理はdsDNAを配列特異的に認識するた
めの当技術分野で知られている唯一の原理であると考え
られる。しかし三重らせんの形成は大部分がホモプリン
−ホモピリミジン配列の認識に限定されている。鎖置換
法は４種類の天然塩基の使用によりいかなる配列をも認
識しうるという点で、三重らせんの認識より優れてい
る。また鎖置換法の場合、認識は生理的条件において、
すなわち中性pH、周囲（20−40℃）温度および中程度の
（100−150mM）イオン濃度で容易に起こる。
遺伝子を標的とする薬物は、標的遺伝子の制御領域
（プロモーター）に対して相補的な核酸塩基配列（10−
20単位を含む）を含むようにデザインされる。従ってそ
の薬物の認識に際して、それはこのプロモーターに結合
し、RNAポリメラーゼがそれに到達するのをブロックす
る。その結果、mRNAが産生されず、従って遺伝子産物
（蛋白質）が産生されない。その標的がウイルスにとっ
て致命的な遺伝子内にある場合、生存可能なウイルス粒
子は産生されないであろう。あるいは標的がプロモータ
ーから下流にあって、この位置でRNAポリメラーゼを終
止させ、従って機能をもたないトランケートしたmRNA/
蛋白質を形成させることもできる。
塩基相補性ハイブリダイゼーションによるssDNAの配
列特異的認識を、同様に特異的遺伝子およびウイルスを
標的として利用することができる。この場合、標的配列
はmRNAに含まれ、従って標的に対する薬物の結合がリボ
ソームの作用を妨害し、結果的にmRNAから蛋白質への翻
訳を妨害する。本発明のペプチド核酸は、それらが相補
的ssDNAに対して著しく高いアフィニティをもつという
点で、先行技術の試薬より優れている。またそれらは電
荷および水溶性をもたず、これにより細胞への取り込み
が容易になり、かつそれらは非生物学的アミノ酸のアミ
ドを含み、これによりそれらは生物学的に安定になり、
たとえばプロテアーゼによる酵素分解に対して抵抗性と
なる。
PNAオリゴマーの特定の生化学的／生物学的特性を下
記の実験により説明する。
1.dsDNA水準における配列識別（実施例63、図20） S1−ヌクレアーゼプロービング法を用いて、プラスミ
ドpUC19のBamHI、SalIまたはPstI部位内へクローン化し
た認識配列A10、A5GA4(A9G)およびA2GA2GA4(A8G2へのT
10、T5CT4(T9C)およびT2CT2CT4(T8C2)PNAの結合の識別
性を分析した。結果（図20）は、これら３種類のPNAが
下記の相対効率においてそれぞれの認識配列に結合する
ことを示す:PNA−T10：A10＞A9G＞＞A8G2、PNA−T9C：A
9G＞A10〜A8G2、PNA−T8C2：A8G2A9G＞＞A10。従って
37℃において10中１個の誤対合は効率を低下させ（推定
５−10倍）、これに対し２個の誤対合は許容されない。
2.PNA−T10−dsDNA鎖置換コンプレックス形成の反応速
度（実施例66、図21） PNAと32P−末端標識dsDNAフラグメントを混合したの
ち種々の時点におけるコンプレックス形成を、S1−ヌク
レアーゼによりプロービングした（図21）。
3.PNA−dsDNAコンプレックスの安定性（実施例67、図2
2） PNA−Tnと32P−dsDNA(A10／T10)標的とのコンプレッ
クスを形成した（60分、37℃）。次いで、このコンプレ
ックスを希望する温度で過剰のオリゴ−dA10の存在下で
10分間インキュベートし、室温に冷却し、KMnO4により
プロービングした。結果（図22）は、PNAオリゴヌクレ
オチドコンプレックスの熱安定性が、″Tm″においてPN
Aのものを反映することを示す。
4.PNAによる制限酵素開裂の阻害（実施例65、図23） プラスミド構成体pT10は、pUC19内のBamHI部位へクロ
ーン化されたdA10／dT10トラクトを含む。従ってpT10を
BamHIおよびPvuIIで開裂されると、それぞれ211および1
11bpの小さなDNAフラグメント２個が得られる。PNA−T
10の存在下ではPvuIIのみによる開裂に対応する336bpフ
ラグメントが得られる（図23）。このようにBamHIによ
る開裂は、その制限酵素部位付近に結合したPNAにより
阻害される。これらの結果は、PNA−dsDNAコンプレック
スが100％の収率で形成されることをも示す。pT8C2プラ
スミドおよびPNA−T8C2を用いて、同様な結果が得られ
た。
5.オリゴヌクレオチドへの125I−標識PNAの結合（実施
例63、図24） Na125Iおよびクロラミン−Ｔを用いて、Tyr−PNA−T
10−Lys−NH2を125Iで標識し、HPLCにより精製した。
125I−PNA−T10はオリゴdA10に結合することがPAGEおよ
びオートラジオグラフィーにより示された（図24）。こ
の結合は過剰の変性ウシ胸腺DNAにより競合された。
dsDNAの配列特異性認識は、10個のチミン置換２−ア
ミノエチルグリシル単位を含み、リシンアミドをＣ−末
端とし、９−アミノアクリジンリガンドコンプレックス
をＮ−末端とするPNA（９−Acr1−(Taeg)10−Lys−N
H2，図11a,11b）の、dA10／dT10標的配列への結合によ
り説明される。標的は248bpの32P−末端標識DNAフラグ
メント中に含まれる。
鎖置換は下記種類の実験により確認された： １）照射に際してのDNAの開裂を確実にするために４−
ニトロベンズアミド基を備えた９−Acr1リガンド（図
５）は、DNAをその結合部位に近接した位置でのみ開裂
させると予想される。PNAを上記の248bp DNAフラグメン
トと共に照射すると、dA10／dT10配列における選択的開
裂が見られる（図3a）。
２）いわゆるフォトフットプリンティングアッセイにお
いて。この場合に合成ジアゾ結合アクリジンは、照射下
にDNA結合性物質の存在下でDNAと相互作用した際にDNA
を開裂させる（DNAが結合性物質により保護されている
場合を除く）。
このような実験を上記の248bp DNAフラグメントにつ
き実施したところ、PNA結合部位の光開裂に対して明ら
かな保護が示された（図3b）。
３）同様な種類の実験において、同様に大部分のDNA結
合性試薬によりその作用が妨害されるDNA開裂酵素であ
るミクロコッカスヌクレアーゼが、T10−標的において
開裂の増大を示した（図3d）。
４）さらに他の種類の実験においては、周知のとおり過
マンガン酸カリウム酸化に対する一本鎖チミンリガンド
（二本鎖チミンリガンドと対比して）の感受性が高いこ
とを利用した。この試薬の存在下での上記248bpの酸化
は、標的のT10−鎖における酸化のみを示した（図3
b）。
５）同様な種類の実験において、S1ヌクレアーゼの一本
鎖特異性は、標的のT10−鎖のみが攻撃されることを示
した（図3c）。
(Taeg)10、(Taeg)10−Lys−NH2、およびAcr1−(Taeg)
10−Lys−NH2（図11a,11b）の、対応するdA10への極め
て効果的な結合性を、さらに２方法で説明する： 1.リガンド−オリゴヌクレオチドコンプレックスは、ポ
リアクリルアミドゲル中での電気泳動に際して、裸のオ
リゴヌクレオチドより低速で泳動するであろう。従っ
て、Acr1−(Taeg)10−Lys−NH2および32P−末端標識dA
10を用いてこのような実験を行った。これは、正常なdA
10／dT10二重らせんが安定である条件下で、およびこの
ような二重らせんが不安定である条件下で（変性作用性
のゲル）、泳動遅延を示した。Acr1−(Taeg)10−Lys−N
H2と32P−末端標識dA10の混合物を用いて対照実験を行
ったが、これは上記の条件下で遅延を示さなかった。
2.一本鎖DNAからDNA二重らせん（dsDNA）が形成される
際には吸光係数が低下する（淡色性）。従って、たとえ
ばTm、すなわち50％の二重らせんが消失して一本鎖を生
じる温度の関数として吸光度を測定することにより、DN
Aの変性を追跡することができる。
一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドおよび下記の
PNAから二重らせんを形成させた。90℃に５分間加熱
し、室温に冷却させ、30分間保持し、最後に５℃の冷蔵
庫に少なくとも30分間保存することにより、一般に0.3
OD260のＴ−に富む鎖が１当量の他方の鎖とハイブリダ
イズした。用いた緩衝液はすべて、リン酸塩10mMおよび
EDTA 1mMであった。低塩緩衝液は塩化ナトリウムを含有
せず、これに対し中塩緩衝液は140mM NaClを含有し、高
塩緩衝液は500mM NaClを含有していた。すべての緩衝液
のpHは7.2であった。ハイブリッドの融点をギルフォー
ド・レスポンス装置により測定した。正常なオリゴヌク
レオチドおよびPNAの双方につき、下記の吸光係数を用
いた:A:15.4ml/μmol・cm;T:8.8;G:11.7およびC:7.3。
融点を0.5℃／分の段階で記録した。A260−対−温度の
プロットの第１導関数の最大値からTmを判定した。
オリゴデオキシリボヌクレオチドのリスト： PNAのリスト： RNA−Ａ（ポリrA）とPNA−T10−Lys−NH2の間に形成
されるハイブリッドは、測定し得ないほど高い温度（＞
90C）で融解する。しかしRNA−Ａ（Ｇ、ＣおよびＵでは
なく）との混合によりA260が大幅に低下することによっ
て、特異的ハイブリダイゼーションが証明される。実験
は、1mlのPNA溶液と1mlのRNA溶液（それぞれA260＝0.
6）を混合し、次いで260nmにおける吸光度を測定するこ
とにより行われる。次いで試料を90℃に５分間加熱し、
室温に冷却させ、この温度に30分間保持し、最後に５℃
に30分間保存する。
上記の実験から、下記の結論を出すことができる。融
点曲線が観察されるので、塩基スタッキングがある。PN
A−DNAハイブリッドは正常なDNA−DNAハイブリッドより
安定であり、PNA−RNAはよりいっそう安定である。誤対
合は、その誤対合した塩基がDNA鎖またはPNA鎖のいずれ
にあるにかかわらず、Tm値を著しく低下させる。正常な
オリゴヌクレオチドの場合と異なり、Tmはわずかにイオ
ン濃度に依存するにすぎない。
本発明によるPNAの合成につき以下に詳述し、その際
図１に好ましいPNAの一例を示し、その構造を相補的DNA
の構造と比較する。
PNAオリゴマーおよびポリマーの合成 固体マトリックスへの分子の固定の原理−−化学的変
換に際しての中間体を説明するのに役立つ−−は、固相
合成またはメリフィールド合成として知られている（参
照：たとえばメリフィールド（Merrifield）,J.Am.Che
m.Soc.,1963,85,2149およびScience,1986,232,341）。
アミノ酸からペプチドへの段階的またはフラグメント毎
の固相組み立てのための確立された方法には、普通はわ
ずかに架橋したスチレン−ジビニルベンゼンコポリマー
のビーズ状マトリックス、すなわち予めジビニルベンゼ
ン類の混合物が添加されたスチレンモノマーを粒状重合
させることにより形成された架橋コポリマーを使用す
る。通常は１−２％の水準の架橋が採用される。このよ
うなマトリックスを本発明による固相PNA合成にも用い
ることができる（図８）。
固相の初期官能化に関しては、伝統的な固相ペプチド
合成に関連して50以上の方法が報告されている（参照：
たとえばバラニーおよびメリフィールド（Barany,Merri
field），″The Peptides″Vol.2,アカデミック・プレ
ス，ニューヨーク州,1979,p.1−284,ならびにスチュワ
ートおよびヤング（Stewart,Young），″Solid Phase P
eptide Synthesis″，第２版，パース・ケミカル・カン
パニー，イリノイ州）。クロロメチル官能基導入のため
の反応（メリフィールド樹脂；クロロメチル メチルエ
ーテル／SnCl4反応による）、アミノメチル官能基（Ｎ
−ヒドロキシメチルフタルイミド反応による；参照：ミ
ッチェル（Mitchell）ら,Tetrahedron Lett.,1976,3795
参照）およびベンゾヒドリルアミノ官能基（ピエッタ
（Pietta）ら,J.Chem.Soc.,1970,650）は、最も広く用
いられているものである。官能基の性質に関係なく、そ
の目的は普通はコポリマーである固体支持体とその固体
支持体に結合させるＣ−末端第１アミノ酸との間に固定
のための結合を形成することである。認識されるよう
に、固定用結合は固体支持体とＮ−末端アミノ酸との間
にも形成しうる。官能基の″濃度″をmmol/gにより表す
ことが一般に好都合である。初期に導入された他の反応
性官能基には、４−メチルベンゾヒドリルアミノおよび
４−メトキシベンゾヒドリルアミノが含まれる。これら
の確立された方法はすべて、原則として本発明に関して
有用である。PNA合成のための好ましい方法は、最初の
官能基としてアミノメチルを用いる。この場合、スペー
サー形成試薬の一方の末端にあるカルボン酸基に対する
本質的に定量的なアミド結合の形成に関してアミノメチ
ル官能基のアミノ基が反応性であるため、アミノメチル
は″スペーサー″または″ハンドル″基の取り込みにつ
いて特に有利である。多数の適切なスペーサー−または
ハンドル−形成性の二官能性試薬（バラニー（Barany）
ら,Int.J.Peptide Protein Res.,1987,30,705参照）、
特にアミノメチル官能基中などにあるアミノ基に対して
反応性である試薬が報告されている。代表的な二官能性
試薬には下記のものが含まれる:4−（ハロアルキル）ア
リール−低級アルカン酸、たとえば４−（ブロモメチ
ル）フェニル酢酸、Boc−アミノアシル−４−（オキシ
メチル）アリール−低級アルカン酸、たとえばBoc−ア
ミノアシル−４−（オキシメチル）フェニル酢酸、Ｎ−
Boc−ｐ−アシルベンゾヒドリルアミン、たとえばＮ−B
oc−ｐ−グルタロイルベンゾヒドリルアミン、Ｎ−Boc
−４′−低級アルキル−ｐ−アシルベンゾヒドリルアミ
ン、たとえばＮ−Boc−４′−メチル−ｐ−グルタロイ
ルベンゾヒドリルアミン、Ｎ−Boc−４′−低級アルコ
キシ−ｐ−アシルベンゾヒドリルアミン、たとえばＮ−
Boc−４′−メトキシ−ｐ−グルタロイルベンゾヒドリ
ルアミン、および４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢
酸。本発明に関して特に適切な１タイプのスペーサー基
はフェニルアセトアミドメチル（Pam）ハンドルであり
（ミッチェルおよびメリフィールド（Mitchell,Merrifi
eld）,J.Org.Chem.,1976,41,2015）、これは４−フェニ
ルアセトアミドメチル基の電子吸引効果のため、Boc−
アミノ脱保護試薬であるトリフルオロ酢酸（TFA）に対
し、古典的ベンジルエステル結合より約100倍安定であ
る。
合成されたPNA鎖をPNA鎖のＣ−末端がアミド形である
状態で固体支持体から開裂させるために取り込ませるこ
とができる特定の官能基（たとえばベンゾヒドリルアミ
ノ、４−メチルベンゾヒドリルアミノ、および４−メト
キシベンゾヒドリルアミノ）は、スペーサー基の導入を
必要としない。それらの官能基はいずれも本発明に関し
て有利に使用しうる。
スペーサーまたはハンドル基の導入に関する他の方法
は、いわゆる″プレフォームド−ハンドル″法であり
（参照：タム（Tam）ら,Synthesis,1979,955−957）、
これは第１アミノ酸の結合を完全に制御し、ペプチドま
たはPNAの合成に関係ない目的外の官能基の存在により
問題が生じる可能性を排除する。この方法においては、
前記と同じ種類のスペーサーまたはハンドル基を、固体
支持体に結合させたい第１アミノ酸と反応させる。この
アミノ酸はＮ−保護されており、かつ所望により目的の
PNA鎖の生長に関係ない他の側鎖において保護されてい
る。従ってスペーサーまたはハンドル基を希望する場
合、固体支持体に結合させる第１アミノ酸を最初に導入
された官能基（たとえばアミノメチル基）に結合してい
るスペーサー基の反応性遊離末端に結合させるか、また
はスペーサー形成試薬と反応させることができる。次い
でスペース形成試薬を最初に導入された官能基と反応さ
せる。他の有用な固定方式には、″マルチ脱離性（mult
idetachable）″樹脂が含まれ（タム（Tam）ら,Tetrahe
dron Lett.,1979,4935,およびJ.Chem.Soc.,1980,102,61
1;タム（Tam）J.Org.Chem.,1985,50,5291）、これは２
以上の遊離様式を可能にし、これにより合成デザインに
際していっそうの融通性が可能となる。
Ｎ−保護に適した選択はｔ−ブチルオキシカルボニル
（Boc）基（カルピノ（Carpino）,J.Am.Chem.Soc.,195
7,79,4427;マッケイ（McKay）ら,J.Am.Chem.Soc.,1957,
79,4686;アンダーソン（Anderson）ら,J.Am.Chem.Soc.,
1957,79,6180）−−これは普通は側鎖の保護のためのベ
ンジル系基と組み合わせられる−−および９−フルオレ
ニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基（カルピノ（Ca
rpino）,J.Am.Chem.Soc.,1970,92,5748、およびJ.Org.C
hem.,1972,37,3404）−−これは普通は側鎖の保護のた
めのｔ−ブチル（tBu）と組み合わせる−−であるが、
通常の固相ペプチド合成法において周知の多数の他の可
能性がある。たとえば広範な他の有用なアミノ保護基が
あり、それらのうちの幾つかは以下のものである:Adoc
（ハス（Hass）ら,J.Am.Chem.Soc.,1966,88,1988）、Bp
oc（シーバー（Sieber）,.Helv.Chem.Acta.,1968,51,61
4）、Mcb（ブラディ（Brady）,J.Org.Chem.,1977,42,14
3）、Bic（ケンプ（Kemp）ら,Tetrahedron.,1975,462
4）、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル（Nps）（ゼルバ
ス（Zervas）ら,J.Am.Chem.Soc.,1963,85,3660）、およ
びジチアスクシノイル（Dts）（バラニー（Barany）ら,
J.Am.Chem.Soc.,1977,99,7363）。これらのアミノ保護
基、特に広範に用いられるウレタン官能基を基礎とする
ものは、大部分のα−アミノ酸の結合に際してラセミ化
（容易に形成されるオキサゾリノン（アザラクトン）中
間体の互変異性化により仲介される（グッドマン（Good
man）ら,J.Am.Chem.Soc.,1964,86,2918））を効果的に
阻止する。これらのアミノ保護基のほかに、PNA分子、
特にアキラル単位から形成されるものを組み立てる際に
は、他の点では″価値のない″広範な非ウレタン型のア
ミノ保護基を利用しうる。従って上記のアミノ保護基
（またはこれらの基のいずれかより誘導されたもの）が
本発明に関して有用であるだけでなく、以下の大部分の
要件を満たすアミノ保護基は実質的にいずれも有用であ
る：（１）緩和な酸に対する安定性（カルボキシル基に
よって著しい攻撃を受けない）；（２）緩和な塩基また
は求核剤に対する安定性（当該アミノ基によって著しい
攻撃を受けない）；（３）アシル化に対する抵抗性（活
性化されたアミノ酸によって著しい攻撃を受けない）。
さらに：（４）保護基は著しい副反応なしにほぼ定量的
に除去し得なければならず、かつ（５）加入するアミノ
酸がある場合、それの光学的インテグリティーは結合に
際して高度に保守されることが好ましい。最後に、側鎖
官能基の保護基は反復されるアミノ脱保護サイクルの条
件に耐えなければならないので、側鎖保護基の選択は一
般にアミノ保護基の選択に依存する。これは、PNA分子
を化学的に組み立てる全体的方法がたとえばアミノ酸と
側鎖保護基の酸安定性の差に依存するか（たとえば上記
の″Boc−ベンジル″法の場合）、または直交性の（ort
hogonal）、すなわち化学選択的な保護方式を採用する
か（たとえば上記の″Fmoc−tBu″法の場合）に関係な
く適用される。
第１アミノ酸の結合ののち、固相合成の次の段階は目
的とするPNA鎖の系統的な形成である。この形成は、反
復される脱保護／結合のサイクルを伴う。最後に結合し
たアミノ酸の一時的な保護基、たとえばBocまたはFmoc
基が、適切な処理、たとえばBocの場合はトリフルオロ
酢酸などを用いる酸加水分解、またはFmocの場合はピペ
リジンなどを用いる塩基処理によって定量的に除去さ
れ、Ｎ−末端アミン官能基を遊離させる。
次いで、次に目的とするＮ−保護されたアミノ酸を最
後に結合したアミノ酸のＮ−末端に結合させる。アミノ
酸のＣ−末端と最後に結合したアミノ酸のＮ−末端との
この結合は、数種の方法で行うことがてきる。たとえば
加入するアミノ酸のカルボキシル基と最後に結合したア
ミノ酸のＮ−末端とを、縮合反応試薬、たとえばジシク
ロヘキシルカルボジイミド（DCC）（シーハンおよびヘ
ス（Sheehan,Hess）ら,J.Am.Chem.Soc.,1955,77.106
7）、およびジイソプロピルカルボジイミド（DIC）（ス
ラーンタキス（Sraantakis）ら,Biochem.biophys.res.C
ommun.,1976,73,336）、またはそれらの誘導体の補助に
より、直接に反応させることができる。あるいは加入す
るアミノ酸をカルボキシル基が下記を含む数種の方法の
いずれかにより活性化された形で供給することにより、
結合させることができる：活性エステル誘導体、たとえ
ば2,4−トリクロロフェニルエステル（プレス（Pless）
ら,.Helv.Chem.Acta.,1963,46,1609）、フタルイミドエ
ステル（ネフケンス（Nefkens）ら,J.Am.Chem.Soc.,196
1,83,1263）、ペンタクロロフェニルエステル（クプリ
スゼウスキー（Kupryszewski）,Rocz.Chem.,1961,35,59
5）、ペンタクロロフェニルエステル（コバックス（Kov
acs）ら,J.Am.Chem.Soc.,1963,85,183）、ｏ−ニトロフ
ェニルエステル（ボダンスキー（Bodanzsky）,Nature,1
955,175,685）、イミダゾールエステル（リー（Li）ら,
J.Am.Chem.Soc.,1970,92,7608）、および３−ヒドロキ
シ−４−オキソ−3,4−ジヒドロキナゾリン（Dhbt−O
H）エステル（コーニッヒ（Konig）ら,Chem.Ber.,1973,
103,2024および2034）の初期形成、または酸無水物、た
とえば対称的な酸無水物の初期形成（ウィーランド（Wi
eland）ら,Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.,1971.10,336）。
第二アミノ基を含むPNA分子を組み立てる場合には、ベ
ンゾトリアゾリル Ｎ−オキシトリスジメチルアミノホ
スホニウム ヘキサフルオロホスフェート（BOP）、す
なわち″カストロ氏試薬″（リベイル（Rivaille）ら,T
etrahedron.,1980,36,3413）が推奨される。最後に、最
近報告されたアミノ酸フッ化物（カルピノ（Carpino）,
J.Am.Chem.Soc.,1990,112,9651）に類似する活性化され
たPNAモノマーも、PNA合成に使用しうるかなりの有望性
がある。
保護基を含む状態の目的PNA鎖が組み立てられたの
ち、次の工程は普通はPNA鎖のアミノ酸部分の脱保護、
および合成されたPNAを固体支持体から開裂させること
である。これらの過程が実質的に同時に起こり、これに
より遊離PNA分子を得ることができる。あるいは別個に
合成された２種類のPNA鎖の縮合を行う場合は、合成の
開始時に適切なスペーサー基を選ぶことにより、目的PN
A鎖をそれぞれの固体支持体から開裂させ（両方のペプ
チド鎖はなおそれらの側鎖保護基を含む）、最後にたと
えば２種類の側鎖保護ペプチド鎖を結合させてより長い
PNA鎖を形成したのち、側鎖保護基を除去することがで
きる。
上記の″Boc−ベンジル″保護方式の場合、最終的な
側鎖の脱保護、および固体支持体からのPNA分子の遊離
は、強酸、たとえば無水HF（サカキバラ（Sakakibara）
ら,Bull.Chem.Soc.Jpn.,1965,38,4921）、ボロントリス
（トリフルオロアセテート）（プレス（Pless）ら,.Hel
v.Chem.Acta.,1963,46,1609）、ならびにスルホン酸、
たとえばトリフルオロメタンスルホン酸およびメタンス
ルホン酸（ヤジマ（Yajima）ら,J.Chem.Soc.,Chem.Com
m.,1974,107）を用いることにより実施される場合が最
も多い。この一般的な強酸（たとえば無水HF）脱保護法
によれば、PNA鎖中の感受性残基のアルキル化およびア
シル化を生じる可能性のある極めて反応性の高いカルボ
カチオンが生成する。このような副反応はスキャベンジ
ャー、たとえばアニソール、フェノール、ジメチルスル
フィドおよびメルカプトエタノールの存在下で部分的に
避けられるにすぎないので、ペプチドおよびPNA合成に
おいてはスルフィドにより補助される酸加水分解式SN2
脱保護法（タム（Tam）ら,J.Am.Chem.Soc.,1983,105,64
42およびJ.Am.Chem.Soc.,1986,108,5242）、すなわち有
害なカルボカチオンの前駆物質を排除して不活性スルホ
ニウム塩を形成する、いわゆる″低い″方法が、単独
で、または″高い″方法と組み合わせて用いられる場合
が多い。これより頻度は低いが、特殊な場合に脱保護お
よび／または最終的なPNA−固体支持体結合の開裂のた
めに用いられる他の方法は、たとえば下記のものであ
る：塩基触媒によるアルコーリシス（バートン（Barto
n）ら,J.Am.Chem.Soc.,1973,95.4501）、ならびにアン
モノリシスおよびヒドラジノリシス（ボダンスキー（Bo
danzsky），ら,Chem.Ind.,1964,1423）、水添分解（ジ
ョーンズ（Jones）,Tetrahedron Lett.,1977,2853およ
び（シュラッター（Schlatter）ら,Tetrahedron Lett.,
1977,2861）、ならびに光分解（リッヒおよびグルワラ
（Rich,Gurwara）,J.Am.Chem.Soc.,1975,97,1575）。
最後に、″正常な″ペプチドの化学合成とは異なり、
アキラルPNA、たとえばアミノエチルグリシル主鎖単位
を基礎とするものは、結合反応がラセミ化を伴わないの
で、Ｎ−末端またはＣ−末端のいずれから出発すること
もできる。Ｃ−末端において開始する合成には一般に保
護されたアミン基および遊離または活性化された酸基を
用いるのに対し、Ｎ−末端において開始する合成には一
般に保護された酸基および遊離または活性化されたアミ
ン基を用いることは、当業者には認識されるであろう。
固相ペプチド合成の合成サイクルにおいて大部分の操
作は均等である（固相PNA合成の場合も同様）という認
識に基づいて、多数のペプチドの調製を促進するため
に、新規なマトリックスであるPEPSが最近導入された
（バーグ（Berg）ら,J.Am.Chem.Soc.,1989,111,8024お
よび国際特許出願公開90/02749号明細書）。このマトリ
ックスはペンダント長鎖ポリスチレン（PS）グラフトを
備えたポリエチレン（106のオーダーの分子量）フィル
ムからなる。フィルムの負荷容量はビーズ状マトリック
スの場合と同程度であるが、PEPSは多重合成に同時に適
合する融通性をさらに備えている。従って固相ペプチド
合成のための新規な形態において、PEPSフィルムはそれ
ぞれが個々のコンパートメントとして作用する別個のラ
ベル付きシートの形に形成される。合成サイクルの均等
な工程すべてにおいて、これらのシートは単一の反応容
器内に一緒に保持され、多数のペプチドを常法による単
一ペプチドの場合に近似する速度で同時に行うことがで
きる。その特定の化学に適合するリンカーまたはスペー
サー基を含むPEPSフィルム状支持体は、多数のPNA分子
の合成に際して特に有用であり、これらは普通は４個の
異なる反応コンパートメント、すなわち４種類の″プソ
イド−ヌクレオチド″単位につきそれぞれ１個が必要と
されるにすぎないので、概念的には合成するのが簡単で
あると考えられた。従ってPEPSフィルム状支持体を試験
したところ、平行して実質的に同時に行われた多数のPN
A合成において有効であった。PEPSから得られた生成物
の収率および品質は、伝統的なポリスチレンのビーズ状
支持体を用いて得たものに匹敵した。また他の幾何学的
形状、たとえば不織フェルト、編成ネット、スティック
またはミクロウェルプレート状のPEPSポリマーを用いた
実験も、合成効率の制限を示さなかった。
多数のペプチドの同時合成のために提示された他の２
方法が、多数の異なるPNA分子の製造にも適用される。
これらの方法のうち第１（ゲイセン（Geisen）ら,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,1984,81,3998）は、生長するペプチ
ド鎖を固定化するために、またコンパートメント式合成
を行うために、アクリル酸グラフト−ポリエチレンロッ
ドおよび96−ミクロタイターウェルを利用する。この方
法は有効性が高いが、マイクログラム規模に適用される
にすぎない。第２（ハウフテン（Hauften）,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,1985,82,5131）は、伝統的に使用されて
いるポリマービーズを収容した″ティーバッグ″を利用
する。本発明に関する多数のペプチドまたはPNAの合成
のための他の適切な提案には、下記のものが含まれる：
密度の異なる２種類の支持体を同時に使用すること（ト
レギヤー（Tregear），″Chemistry and Biology of Pe
ptides″中，マイエンホーファー（Meienhofer）編，ア
ン・アーバー出版社，アン・アーバー,1972,p.175−17
8）、マニホールドを介して反応容器を結合させること
（ゴルマン（Gorman）,Anal.Biochem.,1984,136,39
7）、多重カラム固相合成（たとえばクルシュナク（Krc
hnak）ら,Int.J.Peptide Protein Res.,1989,33,209、
ならびにホルムおよびメルダール（Holm,Meldal），″P
roceedings of the 20th European Peptide Symposiu
m″，ユングおよびバイエル（G.Jung,E.Bayer）編，ウ
ォルター・デ・グルイター・アンド・コ，ベルリン,198
9,p.208−210）、およびセルロース紙の使用（アイヒラ
ー（Eichler）ら,Collect.Czech.Chem.Commun.,1989,5
4,1746）。
通常の架橋スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーマ
トリックス、ならびにPEPS支持体が現在では固相PNA合
成に関して好ましいが、限定ではない固体支持体の適切
な例を以下に挙げる：（１）N,N′−ビスアクリロイル
エチレンジアミン−−既知量のＮ−ｔ−ブトキシカルボ
ニル−β−アラニル−Ｎ′−アクリロイルヘキサメチレ
ンジアミンを含む−−と架橋したジメチルアクリルアミ
ドのコポリマーを基礎とする粒子。一般に数種類のスペ
ーサー分子がβ−アラニル基を介して付加され、次いで
アミノ酸残基サブユニットが付加される。また、β−ア
ラニル含有モノマーを重合中にアクリロイルサルコシン
モノマーで置換して、樹脂ビーズを形成することができ
る。重合ののち、ビーズをエチレンジアミンと反応させ
て、共有結合した官能基として第一アミンを含有する樹
脂粒子を形成する。ポリアクリルアミド系支持体はポリ
スチレン系支持体の場合より比較的親水性が高く、通常
はジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−
メチルピロリドンなどを含めた極性、非プロトン溶剤と
共に用いられる（参照：アサートン（Atherton）ら,J.A
m.Chem.Soc.,1975,97,6584,Bioorg.Chem.,1979,8,351,
ならびにJ.C.S.Perkin I 538（1981））；（２）第２群
の固体支持体はシリカ含有粒子を基礎とするもの、たと
えば多孔質ガラスビーズおよびシリカゲルである。一例
はトリクロロ−［３−（４−クロロメチル）フェニル］
プロピルシランと多孔質ガラスビーズの反応生成物（パ
ルおよびグローマン（Parr,Grohman）,Angew.Chem.,Int
ernal.Ed.,1972,11,314）−−商標″ポラシル（PORASI
L）Ｅ″でウォーターズ・アソシエーツ、米国マサチュ
セッツ州フレーミンハム、により市販されている−−で
ある。同様に1,4−ジヒドロキシメチルベンゼンのモノ
エステルおよびシリカ（商標″バイオパック（BIOPA
K）″でウォーターズ・アソシエーツにより市販されて
いる）が有用であることが報告されている（参照：バイ
エルおよびユング（Bayer,Jung）,Tetrahedron Lett.,1
970,4503）；（３）第３の種類の有用な固体支持体は２
種類の主成分、すなわち樹脂および有機合成反応条件に
対して同様に実質的に不活性である他の材料を含有する
という点で複合材料と呼ぶことができる。複合材料の一
例（参照：スコット（Scott）ら,J.Chrom.Sci.,1971,9,
577）は、反応性クロロメチル基を含む疎水性架橋スチ
レンポリマーで被覆されたガラス粒子を用いたものであ
り、ノースゲート・ラボラトリーズ社、米国コネチカッ
ト州ハムデンにより供給される。他の複合材料の一例は
フッ素化エチレンポリマーのコアを有し、これにポリス
チレンがグラフトしている（参照：ケントおよびメリフ
ィールド（Kent,Merrifield）,Israel J.Chem.,1978,1
7,243、ならびにファン・リートショーテン（van Riets
choten）″Peptides 1974″，ウォルマン（Y.Walman）
編，ジョン・ワイリイ・アンド・サンズ，ニューヨー
ク,1975,p.113−116）；ならびに（４）PEPS以外の連続
固体支持体、たとえば木綿シート（レブルおよびアイヒ
ラー（Lebl,Eichler）,Peptide Res.1989,2,232）およ
びヒドロキシプロピルアクリレート被覆されたポリプロ
ピレンメンブラン（ダニエルス（Daniels）ら,Tetrahed
ron Lett.,1989,4345）がPNA合成にも適切である。
手動または自動いずれにより操作する場合でも、本発
明に関するPNA固相合成は普通はバッチ式で実施され
る。しかし大部分の合成は連続フロー方式でも同様に良
好に実施することができ、この場合支持体はカラムに充
填される（バイエル（Bayer）ら,Tetrahedron Lett.,19
70,4503,およびスコット（Scott）ら,J.Chromatogr.Sc
i.,1971,9,577）。連続フロー固相合成に関しては、硬
質ポリ（ジメチルアクリルアミド）−キーゼルグール支
持体（アサートン（Atherton）ら,J.Chem.Soc.Chem.Com
mun.,1981,1151）が特に有効であると思われるが、他の
有用な形態は標準コポリ（スチレン−１％−ジビニルベ
ンゼン）支持体につきなされたものに関連する（クルシ
ュナク（Krchnak）ら,Tetrahedron Lett.,1987,446
9）。
固相法がPNA合成に関して現在好ましいが、他の方法
またはその組み合わせ、たとえば固相法との組み合わせ
も適切である：（１）ペプチド合成のための古典的な溶
液相法（たとえばボダンスキー（Bodanszky），″Princ
iples of Peptide Synthesis″，スプリンガー−フェル
ラーク，ベルリン−ニューヨーク,1984）−−段階的組
み立てによるか、またはセグメント／フラグメント縮合
によるもの−−は、特に大規模生産（グラム、キログラ
ム、さらにはトン）を考慮する場合に適切である；
（２）いわゆる″液相″法、これは可溶性ポリマー系支
持体、たとえば線状ポリスチレン（シェミアキン（Shem
yakin）ら,Tetrahedron Lett.,1965,2323）を用い、ポ
リエチレングリコール（PEG）（ムッターおよびバイエ
ル（Mutter,Bayer）,Angew,Chem.,Int.Ed.Engl.,1974,1
3,88）が有用である；（３）多様な分子量のペプチドま
たはPNA分子の混合物（″多分散体″）を与えるランダ
ム重合（参照：たとえばオディアン（Odian），″Princ
iples of Polymerization″，マグローヒル，ニューヨ
ーク（1970））は、抗ウイルス作用をスクリーニングす
るために特に適切である；（４）ポリマーに支持された
アミノ酸活性エステルの使用に基づく方法（フリードキ
ン（Fridkin）ら,J.Am.Chem.Soc.,1965,87,4646）−−
時に″逆メリフィールド合成″または″高分子試薬合
成″と呼ばれる−−は、中間体の単離および精製という
利点を与え、従って中サイズの、所望により保護された
PNA分子の合成に特に適切な方法を提供し、次いでこれ
をフラグメント縮合に用いて、より大型のPNA分子とな
すことができる；（５）PNA分子は酵素、たとえばプロ
テアーゼまたは新規な特異性をもつその誘導体（たとえ
ば工学的な蛋白質合成などの人工的な手段により得たも
の）により酵素的に組み立てることができると考えられ
る。また多数のPNAフラグメントを縮合させて、より大
型のPNA分子となすための″PNAリガーゼ″の開発も考慮
しうる；（６）実質的にいかなる目的分子に対しても抗
体を形成させることができるので、最近開発された触媒
性抗体（アブザイム、abzyme）−−レルナーのグループ
（トラマンタノ（Tramantano）ら,Science,1986,234,15
66）およびシュルツのグループ（ポラック（Pollack）
ら,Science,1986,234,1570）が同時に発見−−も、PNA
分子の組み立てのための有効な候補とみなすべきであ
る。たとえばアシルトランスファー反応を触媒するアブ
ザイムの調製にはかなり成功している（たとえばショカ
ット（Shokat）ら,Nature,1989,338,269およびその参考
文献を参照されたい）。最後にスチュワートのグループ
によってごく最近創始された完全に人工的な酵素（ハー
ン（Hahn）ら,Science,1990,248,1544）をPNA合成に適
したものに発展させることができる。特異的な結合反応
を仲介しうる酵素、リガーゼおよび触媒性抗体の設計
は、″正常な″ペプチドの合成よりPNA合成の場合の方
が、より容易に達成されるであろう。PNAは、ペプチド
を構成する天然（蛋白質原、proteinogenic）アミノ酸2
0種類と比較して、わずか４種類（４種類の天然核酸塩
基それぞれにつき１種類）の異なるアミノ酸で構成され
る場合が多いであろう。結論として、特異的なPNA分子
の合成に完全に適した単一の方法はなく、従って時には
上記方法の組み合わせが良好に作動する可能性がある。
本発明はペプチド核酸についての治療または予防的な
使用をも目的とする。可能性のある治療または予防の標
的には、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒト乳頭腫ウ
イルス（HPV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、カンジ
ダ・アルビカンス、インフルエンザウイルス、サイトメ
ガロウイルス（CMV）、細胞内付着分子（ICAM）、５−
リポキシゲナーゼ（５−LO）、ホスホリパーゼA2(PL
A2)、プロテインキナーゼＣ（PKC）、およびRASオンコ
ジーンが含まれる。このような標的法の適用の可能性に
は下記のものが含まれる：眼、唇側、性器および全身性
の単純ヘルペスＩおよびII感染症；性器ゆうぜい（疣
贅、いぼ）；子宮頚癌；尋常性ゆうぜい；カポジ肉腫；
エイズ；皮膚および全身性の真菌感染症；インフルエン
ザ；肺炎；免疫抑制処置患者における網膜炎および肺
炎；単核症；眼、皮膚および全身性の炎症；心臓血管疾
患；癌；喘息；乾癬；心臓血管虚脱；心筋梗塞；胃腸疾
患；腎臓疾患；変形関節炎；骨関節炎；急性膵臓炎；敗
血症性ショック；ならびにクローン病。
治療または予防処置のために、本発明のペプチド核酸
を薬剤組成物中に配合することができ、これはキャリヤ
ー、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤など
を含有しうる。薬剤組成物は１種または２種以上の有効
成分、たとえば抗微生物薬、抗炎症薬、麻酔薬などをペ
プチド核酸のほかに含有してもよい。
薬剤組成物は局所または全身適用のいずれを目的とす
るか、または処置すべき領域に応じて多数の方法で投与
することができる。投与は局所的に（眼、子宮、直腸、
鼻内を含む）、経口的に、吸入により、または非経口的
に、たとえば静脈内点滴により、または皮下、腹腔内も
しくは筋肉内注射により実施することができる。
局所投与用配合物には軟膏、ローション、クリーム、
ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液剤および散剤が含まれ
る。通常の薬剤用キャリヤー、水性、粉末または油性の
基剤、増粘剤などが必要であり、または望ましい。コー
ティングしたコンドームも有用であろう。
経口投与用組成物には、散剤もしくは顆粒剤、水もし
くは非水性媒質中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、
サシェー（sachet）または錠剤が含まれる。増粘剤、芳
香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望まし
い。
非経口投与のための配合物には、無菌水溶液が含ま
れ、これは緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加物をも
含有しうる。
投薬は処置すべき状態の程度および反応性に依存する
が、普通は１日１回または２回以上であり、処置期間は
数日から数カ月間、または治癒するまで、または疾病状
態の軽減が達成されるまで継続される。当業者は最適
量、投与法および反復速度を容易に決定することができ
るであろう。
この種類の処置は、単細胞性の原核および真核生物か
ら多細胞性の真核生物に及ぶ多様な生物に適用しうる。
その遺伝、代謝または細胞性の制御の基本的一部として
DNA−RNA転写またはRNA−蛋白質翻訳を利用している生
物はいずれも、本発明による治療および／または予防処
置を施すことができる。多様な生物、たとえば細菌、酵
母、原生動物、藻類、すべての植物、および温血動物を
含めたすべての高等動物形態を処置することができると
考えられる。さらに多細胞性真核生物の各細胞はそれら
の細胞活性の構成部分としてDNA−RNA転写およびRNA−
蛋白質翻訳の双方を含むので、それらを処置することが
できる。さらに、真核細胞の多くの細胞小器官（たとえ
ばミトコンドリアおよびクロロプラスト）も転写および
翻訳のメカニズムを含む。従って単一細胞、細胞集団ま
たは細胞小器官も、治療または診断用のホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドで処置することができる。本明
細書において用いる治療とは、生物を死滅させることに
より、または誤った、もしくは有害な細胞増殖もしくは
発現を制御することにより、疾病状態を消失させること
を含む意味である。
本発明はまた、PNA分子を固相生化学に（参照：たと
えば″Solid−Phase Biochemistry−Analytical and Sy
thetic Aspects″，スクーテン（W.H.Scouten）編，ジ
ョン・ワイリイ・アンド・サンズ，ニューヨーク,198
3）、殊に固相バイオシステム、特に相補的核酸の診断
検出／定量またはアフィニティ精製（参照：たとえば″
Affinity Chromatography−A Practical Approach″，
ディーン、ジョンソンおよびミドル（P.D.G.Dean,W.S.J
ohnson,F.A.Middle）編,IRLプレス社，オックスフォー
ド,1986;″Nucleic Acid Hybridisation−A Practical
Approach″，ハーネスおよびヒギンス（B.D.Harnes,S.
J.Higgins）編,IRLプレス社，オックスフォード,1987）
に関与するバイオアッセイまたは固相法に有利に利用す
ることにも関するものである。このようなバイオアッセ
イまたは精製法を実施するための今日の方法は、ほとん
ど例外なくビーズ状固体支持体、たとえばセルロース、
ガラスビーズ−−制御された多孔度をもつものを含む−
−（ミズタニ（Mizutani）ら,J.Chromatogr.,1986,356,
202）、″セファデックス″、″セファロース″、アガ
ロース、ポリアクリルアミド、多孔質粒状アルミナ、ヒ
ドロキシアルキルメタクリレートゲル、ジオール結合シ
リカ、多孔質セラミックス、または連続材料、たとえば
ナイロンおよびニトロセルロースのフィルターディスク
に、物理的に吸着された、または実質上永久的な固定用
共有結合を介して結合した″正常な″またはわずかに修
飾されたオリゴヌクレオチドを用いる。一例では、ポリ
Ａテイルを含むmRNAのアフィニティ単離のために、セル
ロースビーズ上でのオリゴ−dTの化学合成を利用した
（ギラン（Gilham），″Methods in Enzymology″，グ
ロスマンおよびモルデイブ（L.Grossmann,K.Moldave）,
vol.21,D,p.191,アカデミック・プレス，ニューヨーク
およびロンドン,1971）。上記の方法はすべて本発明に
関して利用することができる。しかし可能ならば、共有
結合の方が当該分子の物理的吸着より好ましい。後者の
方法は、固定化された分子の一部がハイブリダイゼーシ
ョンまたはアフィニティ操作に際して洗い出される（脱
着される）可能性があるからである。従って、バイオア
ッセイ／精製操作の過程で支持体が受ける各種の処理に
際して支持体材料の表面に吸着している分子種が失われ
る程度を、ほとんど制御することができない。この問題
の重大性はもちろん、吸着された分子種と″遊離″した
分子種との間に平衡が成立する速度に大幅に依存するで
あろう。場合によっては、許容しうる精度および／また
は再現性をもって定量的アッセイを行うことが実質的に
不可能であろう。支持体が体液、水性試薬または洗浄用
媒質で処理される際に失われる吸着分子種は、一般に比
較的低分子量の分子種につき最も顕著であると推定され
る。オリゴヌクレオチドと対照的に、PNA分子は強力な
求核および／または求電子中心を含むので、固体支持体
に結合させるのがより容易である。さらに、オリゴヌク
レオチドを固体支持体上に直接組み立てるのは、固定さ
れる分子の負荷が極めて低いという欠点をもつ。これは
主として、オリゴヌクレオチドの構成に関する現在の技
術水準のホスホルアミダイト化学を有効に利用しうる材
料の表面容量が低いことによる（ビューケージおよびカ
ルサーズ（Beaucage,Caruthers）,Tetrahedron Lett.,1
981,22,1859;カルサーズ（Caruthers）,Science,1985,2
32,281）。高い表面／負荷容量をもつ固体支持体に適し
た他のホスファイトトリエステル法（レッツィンガーお
よびマハデバン（Letsinger,Mahadevan）,J.Am,Chem.So
c.,1976,98,3655）の採用では比較的短いオリゴヌクレ
オチドが得られるにすぎないという事実もある。しかし
通常の固相ペプチド合成法に関しては、後者の支持体は
固定化されたPNA分子を形成するための優れた材料であ
る（側鎖を固定支持体に保持する固定用結合を開裂させ
ることなく、合成されたPNA鎖から側鎖保護基が除去さ
れる）。従ってPNA種は上記の固相法から、相補的核酸
に対するはるかに高い（なおかつ配列特異的である）結
合アフィニティ、さらに二本鎖構造体中に存在する核酸
のユニーク配列特異的認識（および核酸への強力な結
合）という利益を得る。またそれらは固体支持体に大量
に負荷することもでき、従って固相法の感度／容量がさ
らに高まる。さらに、最近報告された″光により指示さ
れ、空間的に指定しうる、平行化学合成″法（フォダー
（Fodor）ら,Science,1991,251,767）、すなわち多数の
著しく多様な、ただし同定可能な、永久に固定化された
化合物（たとえばペプチド）を実質的に同時に製造する
ための、固相化学と写真平板法を組み合わせた技術の採
用によって、固相バイオケミストリーの利用に関する特
定の種類の研究は到達可能となり、容易になり、または
大幅に促進される。
本発明の他の目的、利点および新規な特色は、以下の
本発明の実施例を検討することにより当業者に自明とな
るであろう。それらは本発明を限定するためのものでは
ない。
モノマー性ビルディングブロックの合成 モノマーは好ましくは図13に概説した一般式により合
成される。これは実施例24−26に記載するように、保護
／脱保護処理による（Boc アミノエチル）グリシンの
メチルまたはエチルエステルの製造を伴う。チミンモノ
マーの合成は実施例27−28に記載され、保護されたシト
シンモノマーの合成は実施例29に記載される。
保護されたアデニンモノマーの合成（図14）は、ブロ
モ酢酸エチルによるアルキル化（実施例30）、および置
換の位置が目的とする９−位であることの、Ｘ線結晶学
による証明を伴った。次いでN6−アミノ基を、試薬Ｎ−
エチル−ベンジルオキシカルボニルイミダゾール テト
ラフルオロボレートの使用によりベンジルオキシカルボ
ニル基で保護した（実施例31）。生成エステルの簡単な
加水分解により（実施例32）N6−ベンジルオキシカルボ
ニル−９−カルボキシメチルアデニンが得られ、次いで
これを標準法に用いた（実施例33−34、図13）。アデニ
ンモノマーは２種類の異なるPNA−オリゴマー内に組み
込まれた（実施例56、57、71および73）。
保護されたＧ−モノマーの合成を図15に概説する。出
発原料である２−アミノ−６−クロロプリンをブロモ酢
酸によりアルキル化（実施例35）し、次いで塩素原子を
ベンジルオキシ基で置換した（実施例36）。得られた酸
を試薬PyBrop（商標）により（Boc アミノエチル）グ
リシンメチルエステル（実施例26より）に結合させ、得
られたエステルを加水分解した（実施例37）。PNAオリ
ゴマーの合成に際して、最終HF−開裂工程でO6−ベンジ
ル基を除去した。開裂は、縮合剤としてのジイソプロピ
ルカルボジイミドをPNAオリゴマー中へ取り込んだ際
に、最終PNAオリゴマーの予想量が認められたことによ
り証明された（実施例55および71）。
延長された主鎖 モノマービルディングブロックの合成およびPNAオリ
ゴマーへの取り込みにより、Ａ、ＣおよびＤ基（図16）
の変化が証明される。
一例においては、Ｃ基はCH(CH3)基であった。対応す
るモノマーの合成を図17に概説する。それはBoc保護さ
れた１−アミノ−2,3−プロパンジオールの製造を伴う
ものであり（実施例38）、これが過ヨウ素酸塩により開
裂してBoc アミノアセトアルデヒドを与え、これがそ
のまま次の反応に用いられる。このBoc アミノアセト
アルデヒドが種々のアミンと縮合しうる；実施例39にお
いては、アラニンエチルエステルが用いられた。実施例
40−42においては、対応するチミンモノマーが製造され
た。このモノマーがDCC−結合プロトコールにより８量
体（実施例60）中へ取り込まれた（実施例56および5
7）。
他の例においては、Ｄ基は(CH2)3基である。対応する
モノマーの合成を図18Aに記載し、実施例43−44に概説
する。
他の例においては、Ａ基は(CH2)2CO基である。対応す
るチミンモノマーの合成を図18Bおよび実施例46−48に
概説する。
さらに他の例においては、Ｃ基は(CH2)2基である。チ
ミンおよび保護されたシトシンモノマーの合成を図19お
よび実施例49−54に概説する。１単位を含むPNAオリゴ
マーとのハイブリダイゼーション実験を実施例61−81に
記載する。これは有意のアフィニティ低下を示すが、特
異性は保持されている。
一般的見解 実験例においては下記の略号を用いる:DMF,N,N−ジメ
チルホルムアミド;DCC,N,N−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド;DCU,N,N−ジシクロヘキシル尿素;THF,テトラヒ
ドロフラン;aeg,N−アセチル−（２′−アミノエチル）
グリシン;pfp,ペンタフルオロフェニル;Boc,t−ブトキ
シカルボニル;Z,ベンジルオキシカルボニル;NMR,核磁気
共鳴;s,1重項;d,2重項;dd,2重項の２重項;t,3重項;q,4
重項;m,多重項;b,幅広い；δ，化学シフト。
NMRスペクトルはJEOL FX 90Qスペクトロメーター、ま
たはブルーカー（Bruker）250MHzにより、テトラメチル
シランを内部基準として記録された。質量分析は、VG F
AB源およびプローブを備えたマスラボ（MassLab）VG12
−250四重極計測により実施された。融点はブチ（Buch
i）融点測定装置により記録され、補正されなかった。
N,N−ジメチルホルムアミドは４Åモレキュラーシーブ
により乾燥され、蒸留され、４Åモレキュラーシーブ上
に保存された。ピリジン（HPLC用）は乾燥され、４Åモ
レキュラーシーブ上に保存された。用いた他の溶剤は入
手しうる最高品質のものであるか、または使用前に蒸留
された。ジオキサンは使用前に塩基性アルミナに導通さ
れた。Boc酸無水物、４−ニトロフェノール、ブロモ酢
酸メチル、ベンジルオキシカルボニルクロリド、ペンタ
フルオロフェノールはすべてアルドリッヒ・ケミカル・
カンパニーから入手された。チミン、シトシン、アデニ
ンはすべてシグマから入手された。
薄層クロマトグラフィー（Tlc）は下記の溶剤系を用
いて実施された：（１）クロロホルム：トリエチルアミ
ン：メタノール、7:1:2;（２）塩化メチレン：メタノー
ル、9:1;（３）クロロホルム：メタノール：酢酸、85:1
0:5。スポットはUV（254nm）により、および／または12
0℃に５分間加熱したのちニンヒドリン溶液（１−ブタ
ノール1000mlおよび酢酸30ml中のニンヒドリン3g）を吹
付け、そして吹付け後に再度加熱することにより、視覚
化された。
実施例１ tert−ブチル４−ニトロフェニルカーボネート 炭酸ナトリウム（29.14g;0.275モル）および４−ニト
ロフェノール（12.75g;91.6ミリモル）をジオキサン（2
50ml）と混合した。Boc−無水物（20.0g;91.6ミリモ
ル）をジオキサン（50ml）に溶解して混合物に加えた。
混合物を１時間還流し、０℃に冷却し、濾過して1/3に
濃縮した後０℃で水（350ml）中に注いだ。1/2時間撹拌
後、濾過して生成物を集め、水で洗浄した後、真空下シ
カペント上で乾燥させた。収量21.3g（97％）。M.p.73.
0〜74.5℃（文献値78.5〜79.5℃）。元素分析：C11H13N
O5として、実測値（計算値）C:55.20（55.23）;H:5.61
（5.48）;N:5.82（5.85）。
実施例２ （Ｎ′−Boc−２′−アミノエチル）グリシン（２） 表記化合物はHeimer et.al.Int.J.Pept.,1984,23,203
−211,の方法を改良して合成された。Ｎ−（２−アミノ
エチル）グリシン（1,3.00g;25.4ミリモル）を水（50m
l）に溶解し、ジオキサン（50ml）を加え、2N水酸化ナ
トリウムでpHを11.2に調整した。tert−ブチル−４−ニ
トロフェニルカーボネート（7.29g;30.5ミリモル）をジ
オキサン（40ml）に溶解し、２時間以上かけて滴下した
（その間2N水酸化ナトリウムによりpHは11.2に維持され
た）。さらに３時間周期的にpHを11.2に調整した後溶液
を一夜放置した。溶液を０℃に冷却し、0.5M塩酸にて注
意深くpHを3.5に調整した。水性溶液をクロロホルム
（３×200ml）で洗浄し、2N水酸化ナトリウムでpHを9.5
に調整して真空下（14mmHg）溶液を蒸発乾固させた。残
渣をDMF（25＋２×10ml）で抽出し、過剰の塩を除去す
るため抽出液を濾過した。これにより表記化合物の溶液
を約60％の収率で得、tl cにより95％以上の純度であっ
た（系１およびニンヒドリンで可視化、Rf＝0.3）。こ
の溶液はさらに精製することなく次のBoc−aeg誘導体の
合成に使用された。
実施例３ Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（４） この方法は文献の合成法と異なっているが、より容易
で、高収率を与え、生成物中に未反応チミンが残ってい
ない。チミン（3,40.0g;0.317モル）および炭酸カリウ
ム（87.7g;0.634モル）のDMF（900ml）懸濁液にブロモ
酢酸メチル（30.00ml;0.317モル）を加えた。混合物は
窒素雰囲気下一夜激しく撹拌した。混合物を濾過し、真
空下蒸発乾固させた。固形残渣に水（300ml）および4N
塩酸（12ml）を加え、０℃で15分間撹拌した後濾過し、
水（２×75ml）で洗浄した。沈殿物に水（120ml）およ
び2N水酸化ナトリウム（60ml）を加え10分間煮沸した。
混合物を０℃に冷却して濾過し、4N塩酸（70ml）を添加
することにより純粋な表記化合物が沈殿された。シカペ
ント上真空下で乾燥後の収量:37.1g（64％）。1 H−NMR:（90MHz;DMSO−d6）： 11.33ppm（s,1H,NH）;7.49（d,J＝0.92Hz,1H,ArH）;4.3
8（s,2H,CH 2）;1.76（d,J＝0.92Hz,T−CH 3）。
実施例４ Ｎ−１−カルボキシメチルチミンペンタフルオロフェニ
ルエステル（５） Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（4,10.0g;54.3ミリ
モル）およびペンタフルオロフェノール（10.0g;54.3ミ
リモル）をDMF（100ml）に溶解し、氷水中で５℃に冷却
した。次にDCC（13.45g;65.2ミリモル）を添加した。温
度が５℃以下に下がったら氷浴を除き、混合物を３時間
室温で撹拌した。沈殿してきたDCUを濾過して除き、DMF
で２度洗浄した（２×10ml）。合併した濾液をエーテル
（1400ml）中に注ぎ、０℃に冷却した。石油エーテル
（1400ml）を加え混合物を一夜放置した。表記化合物は
濾過により単離され、十分に石油エーテルで洗浄した。
収量:14.8g（78％）。生成物は次の反応の実施には十分
きれいであったが、分析用試料は２−プロパノールから
再結晶することにより得られた。M.p.200.5〜206℃。元
素分析：C13H7F5N2O4として、実測値（計算値）C:44.79
（44.59）;H:2.14（2.01）;N:8.13（8.00）。
FAB−MS:443（Ｍ＋１＋グリセロール）、351（Ｍ＋
１）。1 H−NMR:（90MHz;DMSO−d6）： 11.52ppm（s,1H,NH）;7.64（s,1H,ArH）;4.99（s,2H,CH
2）;1.76（s,3H,CH 3）。
実施例５ １−（Boc−aeg）チミン（６） 前記のDMF溶液にトリエチルアミン（7.08ml;50.8ミリ
モル）続いてＮ−１−カルボキシメチルチミンペンタフ
ルオロフェニルエステル（5,4.45g;12.7ミリモル）を加
えた。得られた溶液は１時間撹拌した。この溶液は０℃
に冷却し、陽イオン交換物質（“Dowex50W X−8",40g）
で20分間処理した。濾過して陽イオン交換物質を除き、
ジクロロメタン（２×15ml）で洗浄し、ジクロロメタン
（150ml）を加えた。得られた溶液は飽和塩化ナトリウ
ム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、真空
下（最初は水流アスピレーターで続いて油回転ポンプ
で）蒸発乾固させた。残渣を水（50ml）と振とうし、蒸
発乾固させた。この操作をもう一度繰返す。残渣は次に
メタノール（75ml）に溶解させ、エーテル（600ml）お
よび石油エーテル（1.4l）中に注いだ。一夜撹拌後、白
色固形物を濾過して集め、石油エーテルで洗浄した。真
空下、シカペント上で乾燥すると、30.5g（71.7％）得
られた。M.p.142〜147℃。元素分析：C16H24N4O7とし
て、実測値（計算値）C:49.59（50.00）;H:6.34（6.2
9）;N:14.58（14.58）。1 H−NMR:（250MHz:DMSO−d6）：二級アミド結合の周り
の回転制限のためいくつかの信号が2:1の比で２本にわ
れた（リスト中、主ピークはmj.により、副ピークはmi.
により示されている） 12.73ppm（b,1H,−CO2H）;11.27ppm（s,mj.,イミド）;1
1.25ppm（s,mi.,イミド）;7.30ppm（s,mj.,ArH）;7.26p
pm（s,mi.,ArH）;6.92ppm（未解析.t,mj.,BocNH）;6.73
ppm（未解析.t,mj.,BocNH）;4.64ppm（s,mj.,T−CH2−C
O−）;4.47ppm（s,mi.,T−CH2−CO−）;4.19ppm（s,m
i.,CONRCH 2CO2H）;3.97ppm（s,mj.,CONRCH 2CO2H）;3.41
−2.89ppm（未解析.m,CH2CH2−および水）;1.75ppm（s,
3H,T−CH3）;1.38ppm（s,9H,t−Bu）。13 C−NMR:170.68ppm（CO）;170.34（CO）； 167.47（CO）;167.08（CO）;164.29（CO）;150.9（C
5″）;141.92（C6″）;180.04（C2′）;77.95および77.
68（Thy−CH2CO）;48.96,47.45および46.70（−CH2 CH2
−およびNCH 2CO2H）;37.98（Thy−CH 3）;28.07（ｔ−B
u）。
FAB−MS:407（Ｍ＋Na+）;385（Ｍ＋H+）。
実施例６ １−（Boc−aeg）チミンペンタフルオロフェニルエステ
ル（7.Boc−Taeg.OPfp） １−（Boc.aeg）チミン（６）（2.00g:5.20ミリモ
ル）をDMF（5ml）に溶解し、メチレンクロリド（15ml）
を加えた。ペンタフルオロフェノール（1.05g;5.72ミリ
モル）を加え、溶液は氷浴中で０℃まで冷却した。次に
DDC（1.29g;6.24ミリモル）を加え、２分後に氷浴を除
いた。室温で３時間撹拌後、沈殿したDCUを濾過して除
き、メチレンクロリドで洗浄した。合併した濾液は２度
炭酸水素ナトリウム水溶液および１度飽和塩化ナトリウ
ム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、真空下蒸
発乾固させた。固形残渣をジオキサン（150ml）に溶解
し、０℃で水中（200ml）に注いだ。表記化合物を濾過
により単離し、水で洗浄して真空下シカペント上で乾燥
させた。収量:2.20g（77％）。分析用試料は２−プロパ
ノールから再結晶することにより得られた。M.p.174〜1
75.5℃。元素分析：C22H23N4O7F5として、実測値（計算
値）:C:48.22（48.01）;4.64（4.21）;N:9.67（10.1
8）。1 H−NMR（250MHz,CDCl3）：二級アミド結合の周りの制
限回転のため、いくつかの信号は6:1で２本にわれた
（リスト中、主ピークはmj.副ピークはmi.により示され
ている） 7.01ppm（s,mi.,ArH）;6.99ppm（s,mj.,ArH）;5.27ppm
（未解析.t,BocNH）;4.67ppm（s,mj.,T−CH2−CO−）;
4.60ppm（s,mi.,T−CH2−CO−）;4.45ppm（s,mj.,CONRC
H 2CO2Pfp）;4.42ppm（s,mi.,CONRCH 2CO2Pfp）;3.64ppm
（t,2H,BocNHCH2CH 2−）;3.87ppm（“q"2H,BocNHCH 2CH2
−）;1.44（s.9H,t−Bu）。
FAB−Ms:551（10;M＋１）;495（10;M＋１−tBu）;451
（80;−Boc）。
実施例７ N4−ベンジルオキシカルボニルシトシン（９） オーブンで乾燥させた装置を用い、窒素雰囲気下、０
℃にてシトシン（8,20.0g;0.18モル）の乾燥ピリジン
（1000ml）懸濁液に約１時間かけてベンジルオキシカル
ボニルクロリド（52ml;0.36モル）を滴下した。溶液は
次に一夜撹拌した後、真空下ピリジン懸濁液を蒸発乾固
する。水（200ml）および4N塩酸をpHが１に達するまで
添加した。生じる白色沈殿を濾取し、水で洗浄して空気
吸引により少し乾燥させた。まだ湿っている沈殿物は無
水エタノール（500ml）と10分間煮沸し、０℃に冷却
し、濾過後十分にエーテルで洗浄して真空下乾燥した。
収量24.7g（54％）。M.p.＞250℃。元素分析：C12H11N3
O3として実測値（計算値）;C:58.59（58.77）;H:4.55
（4.52）;17.17（17.13）。生成物を溶解させることが
できなかったのでNMRスペクトルは記録されなかった。
実施例８ N4−ベンジルオキシカルボニル−N1−カルボキシメチル
シトシン（10） 機械的撹拌器および窒素導入装器を備えた三頚丸底フ
ラスコ中にブロモ酢酸メチル（7.82ml;82.6ミリモル）
およびN4−ベンジルオキシカルボニル−シトシン（9,2
1.0g;82.6ミリモル）および炭酸カリウム（11.4g;82.6
ミリモル）の乾燥DMF（900ml）懸濁液を入れた。混合物
は一夜激しく撹拌し、濾過した後真空下蒸発乾固させ
た。水（300ml）および4N塩酸（10ml）を加え、混合物
を０℃にて15分間撹拌した後濾過し、水（２×75ml）で
洗浄した。単離された沈殿に水（120ml）、2N水酸化ナ
トリウム（60ml）を加えて30分間撹拌し濾過後、０℃に
冷却して4N塩酸（35ml）を加えた。表記化合物は濾過に
より単離され、十分に水で洗浄してメタノール（1000m
l）から再結晶し、エーテルで十分に洗浄した。これに
より7.70g（31％）の純粋な化合物が得られた。再結晶
の母液を200mlの容量に減少させ０℃に冷却した。これ
によりさらに2.30gの物質が得られ、それはtl cで純粋
であったが赤ちゃけた色をもっていた。M.p.266〜274
℃。元素分析：C14H13N3O5として、実測値（計算値）;
C;55.41（55.45）;H:4.23（4.32）;N:14.04（13.86）。1 H−NMR（90MHz;DMSO−d6）： 8.02ppm（d,J＝7.32Hz,1H,H−６）;7.39（s,5H,Ph）;7.
01（d,J＝7.32Hz,1H,H−５）;5.19（s,2H,PhCH 2−）;4.
52（s,2H）。
実施例９ N4−ベンジルオキシカルボニル−N1−カルボキシメチル
−シトシンペンタフルオロフェニルエステル（11） N4−ベンジルオキシカルボニル−N1−カルボキシメチ
ル−シトシン（10,4.00g;13.2ミリモル）およびペンタ
フルオロフェノール（2.67g;14.5ミリモル）をDMF（70m
l）に混合し、氷浴で０℃に冷却してDCC（3.27g;15.8ミ
リモル）を加えた。３分後に氷浴を除き、混合物を室温
で３時間撹拌した。沈殿したDCVを濾過して除き、DMFで
洗浄して濾液を真空下（0.2mmHg）蒸発乾固させた。固
形残渣にメチレンクロリド（250ml）を加え、15分間激
しく撹拌した後２度炭酸水素ナトリウムおよび１度飽和
塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥
させ、真空下蒸発乾固させた。固形残渣は２−プロパノ
ールから再結晶し、結晶は十分にエーテルで洗浄した。
収量3.40g（55％）。M.p.241〜245℃。元素分析：C20H
12N3F5O5として、実測値（計算値）;C:51.56（51.18）;
H:2.77（2.58）;N:9.24（8.95）。1 H−NMR（90MHz;CDCl3）： 7.66ppm（d,J＝7.63Hz,1H,H−６）;7.37（s,5H,Ph）;7.
31（d,J＝7.63Hz,1H,H−５）;5.21（s,2H,PhCH 2−）4.9
7（s,2H,NCH 2−）。
FAB−MS:470（Ｍ＋１） 実施例10 N4−ベンジルオキシカルボニル−１−Boc−aeg−シトシ
ン（12） （Ｎ−Boc−２−アミノエチル）グリシン（２）のDMF
溶液（前記のようにして調製）にトリエチルアミン（7.
00ml;50.8ミリモル）およびN4−ベンジルオキシカルボ
ニル−N1−カルボキシメチル−シトシンペンタフルオロ
フェニルエステル（11,2.70g;5.75ミリモル）を加え
た。室温で溶液を１時間撹拌後、メチレンクロリド（15
0ml）、飽和塩化ナトリウム溶液（250ml）を加え、4N塩
酸でpHを約１に調整した。有機層を分離し、飽和塩化ナ
トリウム溶液で２度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後
真空下（最初に水流アスピレーターで次に油回転ポンプ
で）蒸発乾固させた。油性残渣（2.80g）はメチレンク
ロリド（100ml）に溶解し、石油エーテル（250ml）を加
え、混合物は一夜撹拌した。表記化合物が濾過により単
離されるので石油エーテルで洗浄した。Tl c（系１）は
かなりの量のペンタフルオロフェノールを示したが、そ
れを除去することはしなかった。収量:1.72g（59％）。
M.p.156℃（分解）。1 H−NMR（250MHz,CDCl3）：二級アミド結合の周りの回
転制限のためいくつかの信号は2:1の比で２本にわれた
（リスト中主ピークはmj.副ピークはmi.で示されてい
る） 7.88ppm（dd,1H,H−６）;7.39（m,5H,Ph）;7.00（dd,1
H,H−５）;6.92（b,1H,BocNH）;6.74（b,1H,ZNH）−?;
5.19（s,2H,Ph−CH3）;4.81ppm（s,mj.,Cyt−CH2−CO
−）;4.62ppm（s,mi.,Cyt−CH2−CO−）;4.23（s,mi.,C
ONRCH 2CO2H）;3.98ppm（s,mj.,CONRCH 2CO2H）;3.42−3.
02（未解決.m,−CH2CH2−および水）;1.37（s,9H,tB
u）。
FAB−MS:504（Ｍ＋１）;448（Ｍ＋１−tBu）。
実施例11 N4−ベンジルオキシカルボニル−１−Boc−aeg−シトシ
ンペンタフルオロフェニルエステル（13） N4−ベンジルオキシカルボニル−１−Boc−aeg−シト
シン（12,1.50g;2.98ミリモル）およびペンタフルオロ
フェノール（548mg;2.98ミリモル）をDMF（10ml）に溶
解した。メチレンクロリド（10ml）を加え、反応混合物
を氷浴で０℃に冷却してDCC（676mg;3.28ミリモル）を
加えた。３分後に氷浴を除き、混合物は室温で３時間撹
拌した。沈殿を濾過して分離し、１度メチレンクロリド
で洗浄した。沈殿を煮沸ジオキサン（150ml）に溶解
し、溶液を15℃に冷却するとDCUを沈殿した。濾過してD
CUを除き、得られた濾液は０℃で水（250ml）中へ注い
だ。表記化合物が濾過により単離され、水で洗浄され、
真空下シカペント上で乾燥された。収量1.30g（65
％）。元素分析：C29H28N5O8F5として、実測値（計算
値）;C:52.63（52.02）;H:4.41（4.22）;N:10.55（10.4
6）。
1H−NHR（250MHz;DMSO−d6）：多分エステルが加水分
解されるため、本質的に上記の酸と同じスペクトルを示
した。
FAB−MS:670（Ｍ＋１）;614（Ｍ＋１−tBu）。
実施例12 ４−クロロカルボキシ−９−クロロアクリジン ４−カルボキシアクリドン（6.25g;26.1ミリモル）、
チオニルクロリド（25ml）および４滴のDMFをすべての
固形物質が溶解するまで窒素通気下緩やかに加熱した。
溶液は次に40分間還流した。溶液を冷却し、過剰のチオ
ニルクロリドは真空下除去した。痕跡のチオニルクロリ
ドは２度乾燥ベンゼン（Na−Pbで乾燥）と共蒸留するこ
とにより除去された。残った黄色粉末は次の反応に直接
使用された。
実施例13 ４−（５−メトキシカルボニルペンチルアミドカルボニ
ル）−９−クロロアクリジン ６−アミノヘキサン酸メチル塩酸塩（4.70g;25.9ミリ
モル）をメチレンクロリド（90ml）に溶解し、０℃に冷
却してトリエチルアミン（15ml）を加え、得られた溶液
は直ちに上記の酸クロリドに加えた。酸クロリドを含む
丸底フラスコは氷浴中０℃に冷却した。混合物は０℃で
30分、室温で３時間激しく撹拌した。得られた混合物は
濾過して残存する固形物を除き、それはメチレンクロリ
ド（20ml）で洗浄した。赤褐色のメチレンクロリド濾液
は次に２度飽和炭酸水素ナトリウム溶液で、１度飽和塩
化ナトリウム溶液で洗浄後硫酸マグネシウムで乾燥して
真空下蒸発乾固させた。得られる油状物に乾燥ベンゼン
（35ml）およびリグロイン（60〜80℃,Na−Pbで乾燥）
を加えた。混合物は加熱還流した。活性炭およびセライ
トを加え混合物を３分間還流させた。濾過後、表記化合
物を磁気撹拌しながら冷却して結晶化させた。濾過して
単離し、石油エーテルで洗浄した。生成物は固体水酸化
カリウム上で貯蔵された。収量5.0g（50％）。
実施例14 ４−（５−メトキシカルボニルペンチル）アミドカルボ
ニル−９−〔６′−（４″−ニトロベンズアミド）ヘキ
シルアミノ〕−アミノアクリジン ４−（５−メトキシカルボニルペンチルアミドカルボ
ニル）−９−クロロアクリジン（1.30g;3.38ミリモル）
およびフェノール（5g）を窒素雰囲気下80℃にて30分間
加熱した後６−（４′−ニトロベンズアミド）−１−ヘ
キシルアミン（897mg;3.38ミリモル）を加えた。温度が
２時間で120℃まで上昇した。反応混合物を冷却し、メ
チレンクロリド（80ml）を加えた。得られた溶液は３度
2N水酸化ナトリウム（60mlずつ）および１度水で洗浄
し、硫酸マグネシウムで乾燥した後真空下蒸発乾固させ
た。得られる赤色油状物（1.8g）をメチレンクロリド
（40ml）に溶解し、０℃に冷却した。エーテル（120m
l）を加え、得られた溶液は一夜撹拌した。これにより
固形物質と油状物の混合物が得られた。固形物は濾過に
より単離された。固形物および油状物をメチレンクロリ
ド（80ml）に溶解し、冷エーテル（150ml）に滴下し
た。20分撹拌後、表記化合物がオレンジ色結晶の形で濾
過により単離された。生成物はエーテルで洗浄し、水酸
化カリウム上真空下で乾燥した。収量1.60g（77％）。
M.p.145〜147℃。
実施例15 ４−（５−カルボキシペンチル）アミドカルボニル−９
−〔６′−（４″−ニトロベンズアミド）ヘキシルアミ
ノ〕−アミノアクリジン ４−（５−メトキシカルボニルペンチル）アミドカル
ボニル−９−〔６′−（４″−ニトロベンズアミド）ヘ
キシルアミノ〕アミノアクリジン（503mg;0.82ミリモ
ル）をDMF（30ml）に溶解し、2N水酸化ナトリウム（30m
l）を加えた。15分撹拌後、０℃にて2N塩酸（35ml）お
よび水（50ml）を加えた。30分撹拌後、溶液をデカント
して油状物を残し、煮沸メタノール（150ml）に溶解し
て濾過し、1/3の容量に濃縮した。このメタノール溶液
にエーテル（125ml）および５〜６滴のHClエタノール液
を加えた。０℃で１時間撹拌後にこの溶液をデカントし
た。油状物をメタノール（25ml）に再溶解し、エーテル
（150ml）で沈殿を生じさせた。一夜撹拌後、表記化合
物が黄色結晶として単離された。収量417mg（80％）。
M.p.173℃（分解）。
実施例16 （ａ）４−（５−ペンタフルオロフェニルオキシカルボ
ニルペンチル）アミドカルボニル−９−〔６′−（４″
−ニトロベンズアミド）ヘキシルアミノ〕−アミドアク
リジン（Acr1opfp） 前記の酸（300mg;0.480ミリモル）をDMF（2ml）に溶
解しメチレンクロリド（8ml）を加えた。ペンタフルオ
ロフェノール（97mg;0.53ミリモル）を加えた（２×2ml
のメチレンクロリドで洗い出した）。得られた溶液は０
℃に冷却した後DCC（124mg;0.60ミリモル）を続けて加
えた。５分後に氷浴を除き、混合物は一夜撹拌した。沈
殿してきたDCUは遠心分離により除き、遠心分離液は真
空下（最初に水流アスピレーターで、次に油ポンプによ
り）蒸発乾固させた。残渣をメチレンクロリド（20ml）
に溶解し、濾過後真空下蒸発乾固した。残渣は再びメチ
レンクロリドおよび石油エーテル（150ml）に溶解し
た。5M HClエーテル溶液を1ml加えた。０℃で30分撹拌
後にデカントすることにより溶媒を除去した。残った油
状物はメチレンクロリド（100ml）に溶解した。石油エ
ーテル（150ml）を加え、混合物を一夜撹拌した。次の
日、沈殿した黄色結晶性物質を濾過して集め、大量の石
油エーテルで洗浄した。乾燥後の収量300mg（78％）。
M.p.97.5℃（分解）。すべての試料は満足すべき元素分
析1H−および13C−NMRおよびマススペクトルを示した。
（ｂ）図８のPNA化合物の合成実験 材料:Boc−Lys（ClZ）、ベンズヒドリルアミン−コポ
リ（スチレン１％−ジビニルベンゼン）樹脂（BHA樹
脂）およびｐ−メチルベンズヒドリルアミン−コポリ
（スチレン−１％−ジビニルベンゼン）樹脂（MBHA樹
脂）はPeninsula Laboratoriesから購入された。他の試
薬および溶媒は：生化学用トリフルオロ酢酸はHalocarb
on Productsから；ジイソプロピルエチルアミン（99
％；更には蒸留されなかった）およびＮ−アセチルイミ
ダゾール（98％）はArdrichから；H2Oは２度蒸留され
た；無水HFはUnion Carbideから；合成用N,N−ジメチル
ホルムアミドおよび分析用メチレンクロリド（更には蒸
留されなかった）はMerckから;HPLC用アセトニトリルは
Lab−Scanから;purum等級アニソール、N,N′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミ
ド、puriss等級2,2,2−トリフルオロエタノールはFluka
から、およびトリフルオロメタンスルホン酸はflourad
からのものである。
（ｃ）一般法および注意 特に記さないかぎり、以下のことが応用された。PNA
化合物は“一時的"N−保護のためにTFA反応活性tert−
ブチルオキシカルボニル（Boc）基（Merrifield,J.Am.C
hem.Soc.,1964,86,304）および“恒久的”側鎖保護とし
てより酸に安定なベンジルオキシカルボニル（Ｚ）およ
び２−クロロベンジルオキシカルボニル（ClZ）基を利
用する通常のペプチド化学を用いた段階的固相法（Merr
ifield,J.Am.Chem.Soc.,1963,85,2149）により合成され
た。Ｃ−末端アミドを得るため、PNAはHF反応活性BHAま
たはMBHA樹脂（MBHA樹脂は非置換BHA樹脂に比較すると
最終的HF切断に対する感受性が増大している、Matsued
a,et al.,Peptides,1981,２,45）上に組入れられてい
る。すべての反応（HF反応を除く）は粗いガラスフリッ
トを取り付けた標準固相反応容器（Merrifield,et al.,
Biochemistry,1982,21,5020）で手動で実施された。
“正常”のアミノ酸を含むペプチドのためにMerrifield
および共同研究者により（Sarin,et al.,Anal,Bioche
m.,1981,117,147）最初に開発された定量的ニンヒドリ
ン反応（カイザーテスト）がうまく応用でき（表Ｉ−II
I参照）、個々のカップリングの安全性の決定ならびに
増大するペプチド鎖の数を測定するためすべての残基に
対して“通常”有効吸光係数ε＝15000M-1cm-1が使用さ
れた。残基数ｎのカップリングによる理論的置換S
n -1（完全な脱保護およびカップリングならびに合成サ
イクル間の連鎖終結またはPNA鎖の喪失を仮定して）は
式： Sn＝Sn-1×（１＋（Sn-1×ΔMW×10-3ミリモル／モ
ル））-1 から計算され、ここでΔMWは分子量の増加分であり
（〔ΔMW〕＝g/モル）およびSn-1は前の残基n-1のカッ
プリングによる理論的置換である（〔Ｓ〕＝ミリモル/
g）。個々のカップリングの程度の推定値（％）は観察
された置換と比較して計算され（Ｓが決定されていない
限り）、前のサイクル後に残っている遊離のアミノ酸の
数の補正を含んでいる。HF反応はToho Kasei（Osaka,Ja
pan）よりのDiaflon HF装置中で実施された。Vydac C18
（５μm,0.46×25cmおよび５μm,1.0×25cm）逆相カラ
ムがSP8000装置での分析およびセミ分取HPLCに各々使用
された。緩衝液Ａはリットル当り445μｌのトリフルオ
ロ酢酸を含む５容量％アセトニトリルの水溶液であり、
緩衝液Ｂはリットル当り390μｌのトリフルオロ酢酸を
含60容量％アセトニトリルの水溶液であった。直線濃度
勾配は30分で緩衝液Ｂが０〜100％であり、流速は1.2ml
/分（分析）および5ml/分（セミ分取）であった。溶出
液は215nm（分析）および230nm（セミ分取）でモニター
された。PNAの分子量は最も存在割合の多い同位元素の
平均から252Cfプラズマ脱離飛行時間型質量分析計によ
り決定された。
実施例17 Acr1−〔Taeg〕15−NH2およびより短い誘導体の固相合
成 （ａ）Boc−〔Taeg〕15−BHA樹脂の段階的作製 約33％DMF/CH2Cl2中の3.2当量のBocTaeg−OPfpを使用
する単カップリング（“合成プロトコール1"）を用いて
100mgの前もって膨潤させおよび中和したBHA樹脂（定量
的ニンヒドリン反応で0.57ミリモルNH2/gを含んでいる
と決定された）で合成が開始された。個々のカップリン
グ反応は手動式6ml標準固相反応容器で少くとも12時間
振とうすることにより実施され、未反応のアミノ酸は合
成中の選択された段階でアセチル化されることにより塞
がれた。鎖伸長の進展は定性的ニンヒドリン反応により
いくつかの段階でモニターされた（表Ｉ参照）。5,10お
よび15の残基の組立て後、保護Boc−〔Taeg〕5−BHA,Bo
c−〔Taeg〕10−BHAおよびBoc−〔Taeg〕15−BHA樹脂の
一部を各々取り出した。
（ｂ）Acr1−〔Taeg〕15−BHA樹脂の合成 残存するBoc−〔Taeg〕15−BHA樹脂（乾燥重量は約30
mgと推定された；約0.002ミリモル成長する鎖）の脱保
護に続いて、Ｈ−〔Taeg〕15−BHA樹脂は3mlの固相反応
容器中約66％DMF/CH2CH21ml中の約50当量のAcr1−OPfp
（80mg;0.11ミリモル）（即ち、ペンタフルオロフェニ
ルエステルの0.11M溶液）と反応させた。定性的ニンヒ
ドリン反応により判定されるごとく、アクリジン部分の
カップリングはほとんど定量的であった。
（ｃ）Ｈ−〔Taeg〕5−NH2の切断、精製および同定 HF切断に先立ってＮ−末端Boc基（非常に有害なtert
−ブチルカオチンの前駆体である）を除去するため、メ
チレンクロリド中保護Boc−〔Taeg〕5−BHA樹脂の一部
が50％トリフルオロ酢酸で処理された。中和および洗浄
（“合成プロトコール1"中の工程２〜４の方法と同じ方
法で実施された）に続いて真空下で２時間乾燥し、得ら
れた67.1mg（乾燥重量）のＨ−〔Taeg〕5−BHA樹脂は5m
lのHF:アニソール（9:1,v/v）と０℃にて60分間撹拌さ
せて切断した。HF除去後、残渣は乾燥ジエチルエーテル
と撹拌して（４×15ml,15分ずつ）アニソールを除き、
重力を利用してフリットしたガラス漏斗を通して濾過し
乾燥した。PNAは次に60mlの10％酢酸水溶液で抽出され
た（４×15ml,各々15分間撹拌）。この溶液の一部は分
析用逆相HPLCで分析され、粗PNAの純度が確かめられ
た。13.0分の主ピークは全吸光度の約93％であった。残
りの溶液は凍結乾燥して約22.9mgの粗物質を得た。最終
的に19.0mgの粗生成物が５つのバッチ（各々1mlのH2O中
に3.8mgを含んでいる）から精製された。主ピークはセ
ミ分取逆相カラムを用いて集められた。アセトニトリル
はスピードバックで除去し、残りの溶液は凍結し（ドラ
イアイス）続いて凍結乾燥させると13.1mgの99％以上の
純度のＨ−〔Taeg〕5−NH2を得た。PNA分子は容易に水
に溶解し、質量スペクトルによる決定に基づいた正しい
分子量を持っていた。（Ｍ＋Ｈ）+として計算されたm/z
値は1349.3であり、測定されたm/z値は1347.8であっ
た。
（ｄ）Ｈ−〔Taeg〕10−NH2の切断、精製および同定 保護Boc−〔Taeg〕10−BHA樹脂の一部が節（ｃ）に記
載したごとく処理されて18.9mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕10−
BHA樹脂のHF切断により11.0mgの粗物質を得た。15.5分
の主ピークは全吸光度の約53％であった。約1mgの粗生
成物が繰返し精製され（下記の理由で）、少くとも80％
しかし多分99％以上の純度のＨ−〔Taeg〕10−NH2を約
0.1mg得た。標的ピーク後のかなり広いテーリング（全
吸光度の約20％）は繰返しの精製でも除去できなかった
（わずかに減少した）。正しい分子量Ｈ−〔Taeg〕10−
NH2の存在のみを確認する質量スペクトルにより判断す
るとテーリング現象は多かれ少かれ標的分子の明瞭な会
合／コンホメーション状態に帰着する。従って、粗生成
物は上記の53％以上の標的分子を含んでいるようであ
る。Ｈ−〔Taeg〕10−NH2は容易に水に溶解する。（Ｍ
＋Ｈ）+として計算されたm/z値は2679.6であり、測定さ
れたm/z値は2681.5であった。
（ｅ）Ｈ−〔Taeg〕15−NH2の切断、精製および同定 保護Boc−〔Taeg〕15−BHA樹脂の一部が節（ｃ）に記
載されているごとく処理され13.9mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕
15−BHA樹脂のHF切断により3.2mgの粗生成物を得た。2
2.6分の主ピークは広いふくらみの中に位置しており、
全吸光度の約60％であった（図12a）。再び（前節参
照）、集められた“ふくらみ”の質量スペクトル分析は
他の分子の存在を有意に示さなかったので、このふくら
みは標的分子Ｈ−〔Taeg〕15−NH2の会合／コンホメー
ション状態に帰着された。粗生成物のすべてが“ふくら
み”を集めることにより精製され、約2.8mgの物質を得
た。（Ｍ＋Na）+として計算m/z値は4033.9であり、測定
されたm/z値は4032.9であった。
（ｆ）Acr1−〔Taeg〕15−NH2の切断、精製および同定 保護Acr1−〔Taeg〕15−BHA樹脂の一部が節（ｂ）に
記載したごとく処理され、29.7mgの乾燥Acr1−〔Taeg〕
15−BHA樹脂のHF切断により14.3mgの粗物質を得た。23.
7分の主ピークおよび29.2分の“ダイマー”（下記参
照）を一緒にすると全吸光度の約40％であった（図12
b）。粗生成物を繰返し精製すると約1mgの多分＞99％の
純度のAcr1−〔Taeg〕15−NH2を得、27.4分,29.2分およ
び最後に100％緩衝液Ｂで溶出される非常に幅広いピー
クとして溶出される自己会合分子が“夾雑している”
（図12c）。この説明は酢酸水溶液中で放置すると（幾
時間も）これらのピークが大きくなり、最終的に定量的
に沈殿してくるという観察結果と一致している。（Ｍ＋
Ｈ）+として計算m/z値は4593.6であり、測定されたm/z
値は4588.7であった。
（ｇ）合成プロトコール１ （１）TFA/CH2Cl2（1:1,v/v）によるBoc−脱保護、3ml,
3×１分および１×30分；（２）CH2Cl2による洗浄、3m
l,6×１分；（３）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による中
和、3ml,3×２分；（４）CH2Cl2による洗浄、3ml,6×１
分および排溶媒１分；（５）PNA樹脂の試料２〜5mgを取
り出し、置換を決定するための定量的ニンヒドリン分析
のために十分に乾燥；（６）1mlのCH2Cl2に溶解した3.2
当量（0.18ミリモル;100mg）のBocTaeg−OPfpを加え、
続いて0.5mlのDMFの添加（ペンタフルオロフェニルエス
テルの最終濃度〜0.12M）；カップリング反応は全部で1
2〜24時間室温で振とうすることにより進行させた；
（７）DMFにて洗浄、3ml,1×２分；（８）CH2Cl2にて洗
浄、3ml,4×１分；（９）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）で中
和、3ml,2×２分；（10）CH2Cl2にて洗浄、3ml,6×１
分；（11）保護PNA樹脂の試料２〜5mgを迅速な定性的ニ
ンヒドリン試験のために取り出し、さらにカップリング
の程度を決定するための定量的ニンヒドリン試験のため
に２〜5mgを十分に乾燥させた（サイクル7,10および15
の後、未反応アミノ基はメチレンクロリドに溶解したＮ
−アセチルイミダゾールでアセチル化することにより塞
がれた）。
実施例18 Acr1−〔Taeg〕15−Lys−NH2およびより短い誘導体の固
相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕15−Lys（ClZ）−BHA樹脂の段階的
作製 100mgの前もって膨潤させ中和したBHA樹脂（0.57ミリ
モル；NH2/g）上に定量的なBoc−Lys（ClZ）を加えるこ
とにより（ニートCH2Cl2中での標準DCC原位置カップリ
ング）合成が開始された。サイクル１から５およびサイ
クル10から15には約33％DMF/CH2Cl2中の3.2当量のBocTa
eg−OPfpを用いる単一カップリング（“合成プロトコー
ル2"）が保護PNA鎖のさらなる伸長に用いられた。サイ
クル５から10は約33％DMF/CH3Cl2中の遊離酸BocTaeg−O
HのエクストラストレートDCC（すなわち原位置）カップ
リングが用いられた。すべてのカップリング反応は手動
式6ml標準固相反応容器中で少くとも12時間振とうする
ことにより実施された。未反応アミノ基は実施例17で行
ったごとく、合成の同じ段階でアセチル化することによ
り塞がれた。保護Boc−〔Taeg〕15−Lys（ClZ）−BHAお
よびBoc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−BHA樹脂は各々５お
よび10PNA残基の作製後に一部を取り出した。Boc−〔Ta
eg〕10−Lys（ClZ）−BHA樹脂からの粗切断生成物の分
析用HPLCクロマトグラムから判断すると（節（ｅ）参
照）、PNA残基５から10の追加の“遊離酸”カップリン
グは実施例17中の単カップリングした残基と比較して有
意な合成収量の改良を与えなかった。
（ｂ）Acr1−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−BHA樹脂の合成 Boc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−BHA樹脂の一部（推定
乾燥重量は約90mgである；〜0.01ミリモル成長鎖）の脱
保護に続いて、Ｈ−〔Taeg〕15−BHA樹脂を3mlの固相反
応容器中1mlの約66％DMF/CH2Cl2に溶解した約20当量のA
cr1−OPfp（141mg;0.19ミリモル）と反応させた。定性
的ニンヒドリン反応から判断すると、アクリジン部分の
カップリングはほゞ定量的であった。
（ｃ）Acr1−〔Taeg〕15−Lys（ClZ）−BHA樹脂の合成 残りのBoc−〔Taeg〕15−Lys（ClZ）−BHA樹脂（推定
乾燥重量約70mg;〜0.005ミリモル成長鎖）の脱保護に続
いてＨ−〔Taeg〕15−Lys（ClZ）−BHA樹脂は3mlの固相
反応容器中、1mlの約66％DMF/CH2Cl2に溶解した約25当
量のAcr1−OPfp（91mg;0.12ミリモル）と反応させた。
定性的ニンヒドリン反応で判断するとアクリジン部分の
カップリングはほとんど定量的であった。
（ｄ）Ｈ−〔Taeg〕5−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護Boc−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−BHA樹脂の一部を
実施例17cのごとく処理すると19.0mgの乾燥Ｈ−〔Tae
g〕5−Lys（ClZ）−BHA樹脂のHF切断により8.9mgの粗物
質を得た。12.2分の主ピーク（10％酢酸水溶液のかわり
に水溶液で注入すると14.2分に溶出）は全吸光度の約90
％であった。約2.2mgの粗生成物を精製して約1.5mgの99
％の純度のＨ−〔Taeg〕5−Lys−NH2を得た。
（ｅ）Ｈ−〔Taeg〕10−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護Boc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−BHA樹脂の一部を
実施例17cのごとく処理すると、7.0mgの乾燥Ｈ−〔Tae
g〕10−Lys（ClZ）−BHA樹脂のHF切断により1.7mgの粗
物質を得た。15.1分の主ピーク（10％酢酸水溶液のかわ
りに水溶液で注入すると17.0分に溶出）は全吸光度の約
50％であった。約1.2mgの粗生成物を精製すると約0.2mg
の＞95％の純度のＨ−〔Taeg〕10−Lys−NH2を得た。図
13a（Ｍ＋Ｈ）+としての計算m/z値は2807.8であり、実
測m/z値は2808.2であった。
（ｆ）Acr1−〔Taeg〕10−Lys−NH2の切断、精製および
同定 99.1mgの保護Acr1−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−BHA樹
脂（乾燥重量）が実施例17cに記載したごとく切断さ
れ、42.2mgの粗物質を得た。25.3分の主ピーク（10％酢
酸水溶液のかわりに水溶液として注入すると23.5分に溶
出した）は全吸光度の約45％であった。8.87mgの粗生成
物を精製すると約5.3mgの＞97％の純度のＨ−〔Taeg〕
10−Lys−NH2を得た。（Ｍ＋Ｈ）+として計算m/z値は28
50.8であり、実測m/z値は2849.8であった。
（ｇ）Acr1−〔Taeg〕15−Lys−NH2の切断および精製 保護Acr1−〔Taeg〕15−Lys（ClZ）−BHA樹脂の一部7
8.7mg（乾燥重量）を実施例１節（ｃ）に記載したごと
く切断し、34.8mgの粗物質を得た。23.5分の主ピーク
（10％酢酸水溶液のかわりに水溶液で注入してもほとん
ど同じ溶出時間）および28.2分の“ダイマー”は全吸光
度の約35％であった。約4.5mgの粗生成物を精製すると
約1.6mgのおそらく＞95％の純度のＨ−〔Taeg〕10−Lys
−NH2を得た。この化合物から“ダイマー”ピークを除
くことはできず、“ダイマー”ピークは酢酸水溶液中で
放置すると増大した。
（ｈ）合成プロトコール２ （１）TFA/CH2Cl2（1:1,v/v）によるBoc脱保護、3ml,3
×１分および１×30分；（２）CH2Cl2による洗浄、3ml,
6×１分；（３）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による中和、
3ml,3×２分；（４）CH2Cl2による洗浄、3ml,6×１分お
よび脱溶媒１分；（５）PNA樹脂の２〜5mgの試料をと
り、定性的ニンヒドリン分析のために十分に乾燥；
（６）サイクル１から５およびサイクル10から15に対し
ては、1mlのCH2Cl2に溶解した3.2当量（0.18ミリモル;1
00mg）のBocTaeg−OPfp、続けて0.5mlのDMFを添加する
ことにより（ペンタフルオロフェニルエステルの最終濃
度〜0.12M）カップリング反応を実施した；カップリン
グ反応は総計で12〜24時間振とうすることにより進行さ
せた；サイクル５から10では1.5mlDMF/CH2Cl2（1:2,V/
V）中の0.12MBocTaeg−OHのさらなる0.12M DCCカップリ
ングを用いた;DMFで洗浄、3ml、１×２分；（８）CH2Cl
2による洗浄、3ml,4×１分；（９）DIEA/CH2Cl2（1:19,
v/v）による中和、3ml,2×２分；（10）CH2Cl2による洗
浄、3ml,6×１分；（11）保護PNA樹脂の試料２〜5mgを
定性的にニンヒドリン試験のためにとる（サイクル7,10
および15後未反応のアミノ基はメチレンクロリドに溶解
したＮ−アセチルイミダゾールによるアセチル化により
塞いだ）。
実施例19 Ｈ−〔Taeg〕10−Lys−NH2の改良固相合成 前の実施例で使用されたBHA樹脂の約半分の充填でMBH
A樹脂上に保護PNAが組入れられた。さらに、一つを除く
すべてのサイクルで引続いてカップリングされていない
アミノ基がアセチル化された。以下にその合成を詳細に
記載する。
（ａ）0.3ミリモル/gの初期置換を持つBoc−Lys（ClZ）
−NH−CH（ｐ−CH3−C6H4）−C6H4樹脂（MBHA樹脂）の
製造 Boc−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の所望の置換は0.25〜0.3
0ミリモル/gであった。この値を得るため、60mlのCH2Cl
2中の単“原位置”カップリング（1.5ミリモルDCC）を
用いて、1.5ミリモルのBoc−Lys（ClZ）が5.0gの中和お
よび前もって膨潤されたMBHA樹脂（定量的ニンヒドリン
反応により0.64ミリモルNH2/gと決定されている）と結
合された。反応は手動式、225mlの標準固相反応容器中
で３時間振とうすることにより実施された。未反応アミ
ノ基は次に無水酢酸／ピリジン／CH2Cl2（1:1:2,v/v/
v）の混合物で18時間アセチル化することにより塞がれ
た。中和樹脂の定量的ニンヒドリン反応により0.00093
ミリモル/gの遊離アミンしか残っていないことが示され
た（表Ｉ参照）（すなわち、本来のアミノ基の0.15
％）。置換の程度は脱保護およびニンヒドリン分析によ
り推定され、中和Ｈ−Lys（ClZ）−MBHA樹脂に対し0.32
ミリモル/gであることが観察された。この値は0.30ミリ
モルBoc−Lys（ClZ）/g樹脂の定量的カップリングの最
大値0.28ミリモル/gと比較されたい（表II参照）。
（ｂ）Boc−〔Taeg〕3−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の段階的
作製 節（ａ）で製造されたＨ−Lys（ClZ）−MBHAの樹脂の
全バッチがCH2Cl2中の2.5当量BocTaeg−OPfpを利用する
単カップリング（“合成プロトコール3"）によるBoc−
〔Taeg〕3−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の組立てに直接利用
された（同一の反応容器）。定量的ニンヒドリン反応が
合成を通して応用された（表II参照）。
（ｃ）Boc−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の段階的
作製 約4.5gの湿潤Boc−〔Taeg〕3−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
（〜0.36ミリモル成長鎖；節（ｂ）で製造された全部で
〜19gの湿潤樹脂からとられた）を55mlのSPPS反応容器
に入れた。Boc−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は約
30％DMF/CH2Cl2中の2.5当量のBocTaeg−OPfpを利用する
単カップリング（“合成プロトコール4"）により組立て
られた。合成の進行はすべての段階での定量的ニンヒド
リン反応によりモニターされた（表II参照）。
（ｄ）Boc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の段階
的作製 約1gの湿潤Boc−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
（〜0.09ミリモル成長鎖；節（ｃ）で製造された全部で
〜4gの湿潤樹脂からとられた）を20mlのSPPS反応容器に
入れた。Boc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は、
約30％DMF/CH2Cl2中の2.5当量のBocTaeg−OPfpを利用す
る前の節で用いられた単カップリングプロトコールによ
り組立てられた。反応容量は3mlであった（激しく振と
う）。合成は定量的ニンヒドリン反応でモニターされた
（表II参照）。
（ｅ）Ac−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の合成 Boc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の一部（推
定乾燥重量は約45mgである）の脱保護に続いて、樹脂は
次に3ml固相反応容器中、2mlの無水酢酸／ピリジン／CH
2Cl2（1:1:2,v/v/v）の混合物で２時間、定量的にアセ
チル化された。
（ｆ）Ｈ−〔Taeg〕10−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護Boc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−BHA樹脂の一部を
実施例17cに記載したごとく処理し、76mgの乾燥Ｈ−〔T
aeg〕5−Lys（ClZ）−BHA樹脂のHF切断により約24mgの
粗物質を得た。15.2分の主ピーク（欠損ペプチドおよび
種々の副産物のような不純物を含んでいる）は全吸光度
の約78％であった。主ピークはまた“主ピークに欠損ピ
ークを加えた”吸光度の約88％とみなされ、それは表II
中の個々の収率の統計により得られた全推定カップリン
グ収率90.1％とよく一致している。粗生成物の一部7.2m
gが２つのバッチからセミ分取逆相カラムにより精製さ
れた（ドライアイス/2−プロパノールで冷却したビーカ
ーで主ピークを集めた）。各々1mlのH2O中に3.6mg含ん
でいた。凍結溶液を直接（スピードバックでアセトニト
リルを前もって除去することなく）凍結乾燥して4.2mg
の82％の純度のＨ−〔Taeg〕10−Lys−NH2を得た。
（ｇ）Ac−〔Taeg〕10−Lys−NH2の切断、精製および同
定 Ac−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−BHA樹脂の一部400.0mg
（乾燥重量）が実施例17cに記載したごとくして（TFA処
理を除く）切断され、11.9mgの粗物質を得た。15.8分の
主ピークは全吸光度の約75％とみなせた。粗生成物の一
部4.8gを精製して約3.5mgの＞95％の純度のAc−〔Tae
g〕10−Lys−NH2を得た。（Ｍ＋Ｈ）+として計算m/z値
＝2849.8であり、実測m/z値＝2848.8であった。
（ｈ）合成プロトコール３ （１）TFA/CH2Cl2（1:1,v/v）によるBoc脱保護、100ml,
3×１分および１×30分；（２）CH2Cl2にて洗浄、100m
l,6×１分；（３）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による中
和、100ml,3×２分；（４）CH2Cl2にて洗浄、100ml,6×
１分および脱溶媒１分；（５）置換を決定する定量的ニ
ンヒドリン分析のためPNA樹脂の試料２〜5mgをとり、十
分に乾燥；（６）35mlのCH2Cl2に溶解した2.5当量（3.7
5ミリモル;2.064g）のBocTaeg−OPfpを加える（ペンタ
フルオロフェニルエステルの最終濃度〜0.1M）；カップ
リング反応は振とうしながら全部で20〜24時間進行させ
る；（７）DMFにて洗浄、100ml,1×２分（BocTaeg−OH
の沈殿を除くため）；（８）CH2Cl2にて洗浄、100ml,4
×１分；（９）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）で中和、100m
l,2×２分；（10）CH2Cl2で洗浄、100ml,6×１分；（1
1）迅速定性的ニンヒドリン試験のため保護PNA樹脂試料
２〜5mgをとり、さらにカップリングの程度を決定する
ための定量的ニンヒドリン分析のために２〜5mgを十分
に乾燥させる；（12）100mlの無水酢酸／ピリジン／CH2
Cl2（1:1:2,v/v/v）の混合物で２時間アセチル化するこ
とにより未反応のアミノ基を塞ぐ；（13）CH2Cl2にて洗
浄、100ml,6×１分；（14）２×２〜5mgの保護PNA樹脂
をとり、定性的および定量的ニンヒドリン分析のために
DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）で中和し、CH2Cl2で洗浄す
る。
（ｉ）合成プロトコール４ （１）TFA/CH2Cl（1:1,v/v）によるBoc脱保護、25ml、
３×１分および１×30分；（２）CH2Clによる洗浄、25m
l,6×１分；（３）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による中
和、25ml,3×２分；（４）CH2Cl2にて洗浄、25ml,6×１
分および脱溶媒１分；（５）置換を決定するための定量
的ニンヒドリン分析のためPNA樹脂試料を２〜5mgとり十
分に乾燥；（６）6ml,CH2Cl2に溶解した2.5当量（0.92
ミリモル;0.506g）のBocTaeg−OPfpの添加に続いて3ml
のDMFを加える（ペンタフルオロフェニルエステルの最
終濃度〜0.1m）；カップリング反応は振とうしながら総
計で20〜24時間進行させた；（７）DMFによる洗浄、25m
l,1×２分；（８）CH2Cl2による洗浄、25ml,4×１分；
（９）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による中和、25ml,2×
２分；（10）CH2Cl2による洗浄、25ml,6×１分；（11）
迅速な定量的ニンヒドリン試験のために保護PNA樹脂の
試料２〜5mgをとり、カップリングの程度を決定するた
めの定性的ニンヒドリン分析のためさらに２〜5mgを十
分に乾燥させる；（12）25mlの無水酢酸／ピリジン／CH
2Cl2（1:1:2,v/v/v）の混合物で２時間アセチル化する
ことにより未反応のアミノ基を塞ぐ（最初のサイクル後
を除いて）；（13）CH2Cl2による洗浄、25ml,6×１分；
（14）定性的および定量的ニンヒドリン分析のため２×
２〜5mgの保護PNA樹脂の試料をとり、DIEA/CH2Cl2（1:1
9,v/v）で中和し、CH2Clで洗浄。
実施例20 Ｈ−〔Taeg〕5−Caeg−〔Taeg〕4−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕5−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕4−Lys
−（ClZ）−MBHA樹脂の段階的作製 約2.5gの湿潤Boc−〔Taeg〕5−Lys−（ClZ）−MBHA樹
脂（残っている総計で約16gの湿潤樹脂の〜1/6;〜0.75g
乾燥樹脂、〜0.15ミリモル成長鎖）を6mlのSPPS反応容
器に入れた。Boc−〔Taeg〕5−Caeg−〔Taeg〕4−Lys−
（ClZ）−MBHA樹脂は2.5mlの約30％DMF/CH2Cl2中の通常
の2.5当量のBocTaeg−OPfpを利用するすべてのTaeg残基
の複カップリングにより作製された（ただし最初の残基
は単カップリングによる）。Ｃ（Ｚ）aeg−残基の組込
みはTFE/CH2CH2（1:2,v/v）中の2.0当量のBocC（Ｚ）ae
g−OPfpの結合により達成された。合成の進行はすべて
の段階において定量的ニンヒドリン反応によりモニター
された（表III参照）。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕5−Caeg−〔Taeg〕4−Lys−NH2の切
断、精製および同定 保護Boc−〔Taeg〕5−Caeg−〔Taeg〕4−Lys−（Cl
Z）−BHA樹脂の一部が実施例節（ｃ）に記載されたごと
く処理され、66.9mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕5−Caeg−〔Tae
g〕4−Lys−（ClZ）−BHA樹脂のHF切断により約14.4mg
の粗物質を得た。14.5分の主ピークは全吸収度の＞50％
とみなされた。粗生成物の一部100.0mgを精製すると
（８つのバッチ；各々1mlのH2Oに溶解されている）約9.
1mgの96％の純度のＨ−〔Taeg〕5−Caeg−〔Taeg〕4−L
ys−NH2を得た（図13b）。（Ｍ＋Ｈ）+として計算m/z値
＝2793.8であり、実測m/z値＝2790.6であった。
実施例21 Acr1−（Taeg）10−Lys−NH2のdA10への結合（図11a） 20μｌのTE緩衝液中（10mMトリス−HCl,1mM EDTA,pH
7.4）、Acr1−（Taeg）10−Lys（100ng）を50cpsの５′
−〔32P〕−末端標識オリゴヌクレオチド〔ｄ（GATCCA
10G）〕と室温で15分インキュベートした。試料は氷中
で冷却し（15分）、ポリアクリルアミド（PAGE）でのゲ
ル電気泳動により分析した。10μｌの試料に２μｌの50
％のグリセロール5TBE（TBE＝90mMトリス−ホウ酸,1mM
EDTA,pH8.3）を加え、試料はTBE緩衝液中４℃にてPAGE
（15％アクリルアミド,0.5％ビサクリルアミド）により
分析された。試料の10μｌを凍結乾燥し、10μｌの80％
ホルムアミド1TBEに再溶解して90℃に加熱し（５分）、
TBE中尿素/PAGE（15％アクリルアミド,0.5％ビサクリル
アミド,7M尿素）により分析した。〔32P〕含有DNAバン
ドは増感板およびAgfaCurix RPI X線フィルムを用い、
−80℃で２時間暴露するオートラジオグラフィーにより
可視化された。
オリゴヌクレオチドはBiosearch7500DNA合成機で合成
され、γ〔32P〕ATP（Amersham,5000Ci/ミリモル）およ
びポリヌクレオチドキナーゼにより標識され、常法を用
いてPAGEにより精製された（Maniatis et al（1986）：
実験室マニアル,Cold Spring Harbor Laboratories）。
実施例22 鎖置換複合体の形成 プラスミドDNA配列内に含まれたdA10−dT10標的配列
は常法により（Maniatis et al.,1986）大腸菌JM101株
を使用し、pUC19のBamHI制限部位内へ２つのオリゴヌク
レオチド（ｄ（GATCCA10G）＋ｄ（GATCCT10G））をクロ
ーン化することにより作製された。生じるクローンの１
つから所望のプラスミド（pT10と称された）が単離さ
れ、アルカリ抽出法およびCsCl遠心分離により（Maniat
is et al.,1986）精製された。dA10−dT10標的配列を含
む248bpの３′−〔32P〕末端標識DNA断片は、pT10DNAを
制限酵素EcoRIおよびPvuIIで切断し、大腸菌DNAポリメ
ラーゼのクレノー断片（Boehringer Mannheim）を用い
る切断DNAのα〔32P〕−dATP（4000Ci/ミリモル,Amersh
am）による標識、およびPAGE（５％アクリルアミド,0.0
6％ビサクリルアミド,TBE緩衝液）により精製すること
により得られた。EcoRI切断pT10プラスミドの細菌アル
カリ性ホスファターゼ（Boehringer Mannheim）による
処理、低融点アガロース中のゲル電気泳動によるプラス
ミドDNAの精製、およびγ〔32P〕ATPおよびポリヌクレ
オチドキナーゼによる標識によりこの断片は５′末端で
の〔32P〕末端標識物として得られた。PvuIIで処理する
と248bpDNA断片は上記のごとく精製された。
Acr1−（Taeg）10−Lys−NH2および248bpDNA断片間の
複合体は、50ngのAcr1−（Taeg）10−Lys−NH2と500cps
32P標識248bp断片および0.5μｇのウシ胸腺DNAを100μ
ｌの緩衝液中37℃にて60分インキュベートすることによ
り形成された。
実施例23 鎖置換複合体の証明： （ａ）スタフィロコッカスヌクレアーゼ（図12b） 鎖置換複合体は前記のごとく25mMトリス−HCl,1mM Mg
Cl2,0.1mM CaCl2,pH7.4中で形成された。複合体は750U/
mlのスタフィロコッカスヌクレアーゼ（Boehringer Man
nheim）で20℃にて５分処理され、25mMまでのEDTAの添
加により反応を停止させた。２容量のエタノール、２％
酢酸カリウムでDNAを沈殿させ、80％ホルムアミド、TBE
に再溶解して90℃に加熱し（５分）、高分解能PAGE（10
％アクリルアミド,0.3％ビサクリルアミド,7M尿素）お
よびオートラジオグラフィーにより分析した。
（ｂ）アフィニティ光切断（図12a＋12b） 複合体はTE緩衝液中で形成させた。エッペンドルフチ
ューブに含まれている試料に約300nm以上を30分照射し
た（Philips TL20W/12蛍光チューブ，24Jm-2s-1）。前
記のごとくDNAを沈殿させ、1Mピペリジンにとり、90℃
に20分加熱した。凍結乾燥後前記のごとくPAGEによりDN
Aを分析した。
（ｃ）過マンガン酸カリウム（図12b） 100μｌのTF中で複合体を形成させ、20mM KMnO4を加
えた。20℃で15秒後、50μｌの1.5M酢酸ナトリウム,pH
7.0,1M2−メルカプトエタノールを加えて反応を停止さ
せた。DNAを沈殿させ、前記のごとくピペリジンで処理
して分析した。
（ｄ）フォトフットプリンティング（図12b） 100μｌのTF中で複合体が形成され、ジアゾ結合アク
リジン（0.1μg/μｌ）（DHA,Nielsen et al.（1988）N
ucl.Acids Res.16,3877−88）が使用された。試料に365
nmを30分照射し（Philips TL20W/09N,22Jm-2s-1）“ア
フィニティ光切断”に記載したように処理した。
（ｅ）S1−ヌクレアーゼ（図12c） 50mM酢酸ナトリウム,200mM NaCl,0.5％グリセロール,
1mM ZnCl2,pH4.5中で複合体を形成させ、0.5U/mlのヌク
レアーゼS1（Boehringer Mannheim）で５分間20℃にて
処理した。反応を停止させ、“スタフィロコッカスヌク
レアーゼ”に記載したごとくさらに処理された。
実施例24 Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ′−（bocアミノエ
チル）グリシン アミノエチルグリシン（52.86g;0.447モル）を水（90
0ml）に溶解し、ジオキサン（900ml）を加えた。2N NaO
HでpHを11.2に調整した。tert−ブチル−ｐ−ニトロフ
ェニルカーボネート（128,4g;0.537モル）をジオキサン
（720ml）に溶解し、pHを11.2に保ちながら、２時間以
上かけて滴下した。さらに少くとも３時間pHを11.2に保
ち、その後一夜撹拌した。黄色溶液を０℃に冷却し、2N
HClでpHを3.5に調整した。混合物をクロロホルムで洗
浄し（４×100ml）、水相のpHを０℃にて2N NaOHを用い
て9.5に再調整した。ベンジルオキシカルボニルクロリ
ド（73.5ml;0.515モル）を30分以上かけて添加し、その
間pHは2N NaOHにて9.5に保たれた。続いての４時間pHを
しばしば調整した後溶液を一夜撹拌した。次の日、溶液
をエーテルで洗浄し（３×600ml）、その後０℃にて溶
液のpHを2N HClで1.5に調整した。表記化合物は酢酸エ
チルによる抽出（５×1000ml）により単離された。酢酸
エチル溶液は硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下蒸発乾
固させた。138gの物質が得られ、エーテル（300ml）に
溶解し、石油エーテル（1800ml）を加えて沈殿させた。
収量124.7g（79％）。M.p.64.5〜85℃。元素分析：C17H
24N2O6として、実測値（計算値）:C:58.40（57.94）;H:
7.02（6.86）;N:7.94（7.95）。1 H−NMR（250MHz,CDCl3） 7.33＆7.32（5H,Ph）;5.15＆5.12（2H），PhCH 2）;4.03
＆4.01（2H,NCH 2CO2H）;3.46（b,2H,BocNHCH2CH 2）;3.2
8（b,2H,BocNHCH 2CH 2）;1.43＆1.40（9H,tBu）。
HPLC（260nm）20.71分（80.2％）および21.57分（19.
8％）。
UVスペクトルは同一で副ピークがビス−Ｚ−AEGから
成っていることを示している。
実施例25 Ｎ′−Boc−アミノエチルグリシンエチルエステル Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ′−（bocアミノ
エチル）グリシン（60.0g;0.170モル）およびN,N−ジメ
チル−４−アミノピリジン（6.00g）を無水エタノール
（500ml）に溶解し、DCC（42.2g;0.204モル）の添加に
先だって０℃に冷却した。５分後に氷浴を除き、さらに
２時間撹拌を続けた。濾過して沈殿したDCU（32g,乾
燥）を除き、エーテルで洗浄した（３×100ml）、合併
した濾液は希硫酸水素カリウム（２×400ml）、希炭酸
水素ナトリウム（２×400ml）および飽和塩化ナトリウ
ム（１×400ml）の順で洗浄した。有機相を濾過して硫
酸マグネシウムで乾燥し、真空下蒸発乾固させると、6
6.1gの少量のDCUを含んだ油状物を得た。
油状物を無水エタノール（600ml）に溶解し、10％パ
ラジウム炭素（6.6g）を加えた。溶液は大気圧で水素化
し、溜めは2N水酸化ナトリウムを満たした。４時間後、
理論量の4.2Lのうち3.3Lが消費された。反応混合物はセ
ライトを通して濾過し、真空下蒸発乾固させると39.5g
（94％）の油状物を得た。油状物の一部13gがシリカゲ
ル（600g SiO2）クロマトグラフィーにより精製され
た。300mlの20％石油エーテル／メチレンクロリドで溶
出後、表記化合物が1700mlの５％メタノール／メチレン
クロリドで溶出された。満足すべき純度の分画の溶媒を
真空下除去すると8.49gの収量であった。もしくは粗物
質の10gがクーゲルロール蒸留により精製された。1 H−NMR（250MHz,CD3OD）； 4.77（b,s,NH）;4.18（q,2H,MeCH 2）;3.38（s,2H,NCH 2C
O2Et）;3.16（t,2H,BocNHCH 2CH2）;2.68（t,2H,BocNHCH
2CH 2）;1.43（s,9H,tBu）および1.26（t,3H,CH3）。13 C−NMR 171.4（ＣOEt）;156.6（CO）;78.3（(CH3)
3 C）;59.9(CH2);49.0(CH2);48.1(CH2);39.0(CH2);26.9
(CH2)および12.6(CH3)。
実施例26 Ｎ′−Boc−アミノエチルグリシンメチルエステル エタノールをメタノールにかえて前記の方法が用いら
れた。最終生成物はカラム精製により精製された。
実施例27 １−（Boc−aeg）チミンエチルエステル Ｎ′−Boc−アミノエチルグリシンエチルエステル（1
3.5g;54.8ミリモル）、DhbtOH（9.84g;60.3ミリモル）
および１−カルボキシメチルチミン（11.1g;60.3ミリモ
ル）をDMF（210ml）に溶解した。次にメチレンクロリド
（210ml）を加えた。溶液をエタノール／氷浴中で０℃
に冷却し、DCC（13.6g;65.8ミリモル）を加えた。１時
間後に氷浴を除き、室温でさらに２時間撹拌を続けた。
濾過により沈殿したDCUを除去し、メチレンクロリドで
２回洗浄した（２×75ml）。合併した濾液にさらにメチ
レンクロリド（650ml）を加えた。溶液を希炭酸水素ナ
トリウム（３×500ml）、希硫酸水素ナトリウム（２×5
00ml）および飽和塩化ナトリウム（１×500ml）の順で
洗浄した。濾過して少量の沈殿物を有機相から除去し
た。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下蒸発乾
固させた。油状残渣をメチレンクロリド（150ml）に溶
解して濾過し、０℃で石油エーテル（350ml）を加える
と表記化合物が沈殿した。メチレンクロリド／石油エー
テル工程をもう一度繰返した。これにより、HPLCで99％
以上の純度の物質16.0g（71％）を得た。
実施例28 １−（Boc−aeg）−チミン 前実施例の物質をTHFに懸濁し（194ml,0.2M溶液）、1
M水酸化リチウム水溶液（116ml）を加えた。混合物は室
温で45分間撹拌した後濾過して残りのDCUを除いた。溶
液に水（40ml）を加え、次にメチレンクロリド（300m
l）で洗浄した。さらに水（30ml）を加え、アルカリ溶
液をもう一度メチレンクロリド（150ml）で洗浄した。
水性溶液を０℃に冷却し、1NHClを滴下して（約110ml）
pHを２に調整した。表記化合物を酢酸エチルで抽出し
（９×200ml）、合併した抽出液は硫酸マグネシウムで
乾燥した後真空下蒸発乾固させた。残渣に一度メタノー
ルを加え蒸発させ、一夜乾燥すると無色のガラス状固形
物を得る。収量9.57g（64％）。HPLC＞98％RT＝14.8
分。元素分析：C16H24N4O7・0.25H2Oとして実測値（計
算値）:C:49.29（49.42）;H:6.52（6.35;N:14.11（14.4
1）。二級アミドの周りの制限回転のためいくつかの信
号は2:1の比で２本にわれた（リスト中主ピークがmj.お
よび副ピークがmi.で示されてる）。1 H−NMR（250MHz,DMSO−d6）； 12.75（b.s.,1H,CO2H）;11.28 （s,“1H",mj.,イミド NH）;11.26 （s,“1H",mj.,イミド NH）;7.30 （s,“1H",mj.,T H−６）;7.26 （s,“1H",mi.,T H−６）;6.92 （b.t.,“1H",mj.,BocNH）;6.73 （b.t.,“1H",mi.,BocNH）;4.64 （s,“2H",mj.,CH 2CON）;4.46 （s,“2H",mj.,CH 2CON）;4.19 （s,“2H",mi.,CH 2CO2H）;3.97 （s,“2H",mj.,CH 2CO2H）;3.63−3.01 （未解析m,水を含む，CH 2CH 2）;1.75（s,3H,CH 3）およ
び1.38（s,9H,tBU）。
実施例29 N4−ベンジルオキシカルボニル−１−（Boc−aeg）シト
シン Ｎ′−Boc−アミノエチルグリシンエチルエステル
（5.00g;20.3ミリモル）、DhbtOH（3.64g;22.3ミリモ
ル）およびN4−ベンジルオキシカルボニル−１−カルボ
キシメチルシトシン（6.77g;22.3ミリモル）をDMF（100
ml）に懸濁した。続いてメチレンクロリド（100μｌ）
を加えた。溶液を０℃に冷却し、DCC（5.03g;24.4ミリ
モル）を加えた。２時間後に氷浴を除き、さらに１時間
室温で撹拌を続けた。次に反応混合物は真空下蒸発乾固
させた。残渣をエーテル（100ml）に懸濁し、30分激し
く撹拌した。濾過により固形物を単離し、エーテル洗浄
工程を二度繰返した。この物質は次に希炭酸水素ナトリ
ウム（約４％溶液、100ml）と15分激しく撹拌し、濾過
し、水で洗浄した。この工程をもう一度繰返すと、乾燥
後17.0gの黄色がかった固形物を得た。固形物はジオキ
サン（200ml）と煮沸し、熱時濾過した。冷却後水（200
ml）を加えた。沈殿した物質を濾過により単離し、水で
洗浄して乾燥させた。HPLC（260nmで観察）によると、
この物質は99％より高い純度を持っていた（ほかにDC
U）。エステルは次にTHF（100ml）に懸濁し、０℃に冷
却し、1N LiOH（60ml）を加えた。15分撹拌後、混合物
を濾過し、濾液はメチレンクロリドで洗浄した（２×15
0ml）。アルカリ溶液は次に０℃に冷却し、1N HClによ
りpHを2.0に調整した。表記化合物が濾過により単離さ
れ、水で一度洗浄すると乾燥後11.3gの白色粉末が残っ
た。この物質はメチレンクロリド（300ml）に懸濁し、
石油エーテル（300ml）を加えた。濾過洗浄して乾燥す
ると7.1g（69％）の生成物を得た。HPLCは99％の純度を
示しRT＝19.5分、Ｚ−脱保護モノマーらしい少量の不純
物を12.6分（約１％）に示した。元素分析：C23H29N5O8
として実測値（計算値）:C:54.16（54.87）;H:5.76（5.
81）；およびN:13.65（13.91）。1 H−NMR（250MHz,DMSO−d6）;10.78（b.s.1H,CO2H）;7.
88（２つの重なったタブレット.1H,Cyt H−５）;7.41−
7.32（m,5H,Ph）;7.01（２つの重なったタブレット,1H,
Cyt H−６）;6.94＆6.78（未解析，トリプレット,1H,Bo
cNH）;5.19（s,2H,PhCH 2）;4.81＆4.62（s,2H,CH 2CO
N）;4.17＆3.98（s,2H,CH 2CO2H）;3.42−3.03（m,水を
含む，CH 2CH 2）および1.38＆1.37（s,9H,tBU）。13 C NMR 150.88;128.52;128.18;127.96;93.90;66.53;4
9.58および28.22。
IR:波数cm1（強度）； 3423（26.4）;3035（53.2）;2978（41.4）;1736（17.
3）;1658（3.8）;1563（23.0）;1501（6.8）および1450
（26.4）。
実施例30 ９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル アデニン（10.0g;74ミリモル）および炭酸カリウム
（10.29g;74.0ミリモル）をDMFに懸濁し、プロモ酢酸エ
チル（8.24ml;74ミリモル）を加えた。窒素下室温で懸
濁液を2.5時間撹拌し、濾過した。固形残渣は３回DMF
（10ml）で洗浄した。合併した濾液は真空下蒸発乾固さ
せた。黄−オレンジ色の固形物を水中（200ml）に注
ぎ、4N HClをpH６になるまで添加した。０℃で10分
間撹拌後、固形物を濾取し、水で洗浄し、96％エタノー
ル（150ml）から再結晶した。表記化合物が濾過により
単離され、エーテルで十分に洗浄した。収量3.4g（20
％）。M.p.215.5〜220℃。元素分析：C9H11N5O2とし
て、実測値（計算値）:C:48.86（48.65）;H:5.01（4.9
1）;N:31.66（31.42）。1 H−NMR（250MHz,DMSO−d6）；（s,2H,H−２＆Ｈ−
８）;7.25（b.s.,2H,NH2）;5.06（s,2H,NCH2）;4.17
（q,2H,J＝7.11Hz,OCH2）；および1.21（t,3H,J＝7.13H
z,NCH2）。13 C−NMR 152.70;141.30;61.41;43.97および14.07。
FAB−MS 222（MH+）。
IR:波数cm-1（強度）； 3855（54.3）;3274（10.4）;3246（14.0）;3117（5.
3）;2989（22.3）;2940（33.9）;2876（43.4）;2753（4
9.0）;2346（56.1）;2106（57.1）;1899（55.7）;1762
（14.2）;1742（14.2）;1742（1.0）;1671（1.8）;1644
（10.9）;1606（0.6）;1582（7.1）;1522（43.8）;1477
（7.2）;1445（35.8）；および1422（8.6）。
アルキル化の位置は96％エタノールから再結晶するこ
とにより得られた結晶のＸ線結晶学により確認された。
もしくは、９−カルボシメチルアデニンエチルエステ
ルは下記の方法によっても製造することができる。窒素
導入口、機械的撹拌機および滴下ロートを備えた2Lの３
頚フラスコ中のアデニン（50.0g;0.37モル）のDMF（110
0ml）懸濁液にヘキサンで洗浄された水酸化ナトリウム
−鉱油分散液16.4g（0.407モル）を加えた。混合物を２
時間激しく撹拌した後、３時間以上かけてブロモ酢酸エ
チル（75ml;0.67モル）を滴下した。混合物をさらに１
時間撹拌すると、アデニンの完全な変換がtlcにより示
された。混合物を1mmHgで蒸発乾固させ、油状残渣に水
（500ml）を添加すると、表記化合物の結晶化が起こっ
た。固形物は96％エタノール（600ml）から再結晶され
た。乾燥後収量53.7g（65.6％）。HPLC（215nm）純度＞
99.5％。
実施例31 N6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチル
アデニンエチルエステル ９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（3.40
g;15.4ミリモル）を緩やかに加熱することにより乾燥DM
F（50ml）に溶解し、20℃に冷却し、さらに氷浴で冷却
しながらＮ−エチル−ベンジルオキシカルボニルイミダ
ゾールテトラフルオロボレート（62ミリモル）のメチレ
ンクロリド（50ml）溶液を15分以上かけて添加した。少
量の沈殿物が観察された。氷浴を除き、溶液を一夜撹拌
した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム（100ml）
を加えた。10分撹拌後、相を分離し、有機相を一容量の
水、希硫酸水素ナトリウム（２回）、および飽和塩化ナ
トリウムの順で洗浄した。溶液を硫酸マグネシウムで乾
燥し、真空下蒸発乾固させると、11gの油状物を得た。
この物質をメチレンクロリド（25ml）に溶解し、０℃に
冷却して石油エーテル（50ml）で沈澱させた。この工程
をもう一度繰返すと3.45g（63％）の表記化合物が得ら
れた。M.p.132〜35℃。元素分析：C17H17N5O4として、
実測値（計算値）:C:56.95（57.46）;H:4.71（4.82）;
N:19.35（19.71）。1 H−NMR（250MHz,CDCl3）;8.77（s,1H,H−２またはＨ−
８）;7.99（s,1H,H−２またはＨ−８）;7.45−7.26（m,
5H,Ph）;5.31（s,2H,N−CH 2）;4.96（s,2H,Ph−CH 2）;
4.27（q,2H,J＝7.15Hz,CH 2CH3）および1.30（t,3H,J＝
7.15Hz,CH2CH 3）。13 C−NMR 153.09;143.11;128.66;67.84;62.51;44.24お
よび14.09。
FAB−MS 356（MH+）および312（MH+−CO2）。
IR:波数cm-1（強度）； 3423（52.1）;3182（52.8）;3115（52.1）;3031（47.
9）;2981（38.6）;1747（1.1）;1617（4.8）;1587（8.
4）;1552（25.2）;1511（45.2）;1492（37.9）;1465（1
4.0）および1413（37.3）。
実施例32 N6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチル
アデニン N6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチ
ルアデニンエチルエステル（3.20g;9.01ミリモル）とメ
タノール（50ml）を混合し、０℃に冷却した。水酸化ナ
トリウム溶液（50ml;2N）を加えるとすみやかに溶解し
た。０℃30分後、アルカリ溶液をメチレンクロリド（２
×50ml）で洗浄した。アルカリ溶液を０℃で4N HClに
よりpH1.0に調整すると表記化合物が沈澱した。濾過
し、水で洗浄し乾燥した後の収量は3.08g（104％）であ
った。生成物は塩を含んでおり、元素分析はそれを反映
していた。元素分析：C15H13N5O4として、実測値（計算
値）:C:46.32（55.05）;H:4.24（4.00）;N:18.10（21.4
0）およびC/N:2.57（2.56）。1 H−NMR（250MHz,DMSO−d6）;8.70（s,2H,H−２または
Ｈ−８）;7.50−7.35（m,5H,Ph）;5.27（s,2H,N−CH 2）
および5.15（s,2H,Ph−CH 2）。13 C−NMR 168.77;152.54;151.36;148.75;145.13;128.5
1;128.17;127.98;66.76および44.67。
IR（KBr）； 3484（18.3）;3109（15.9）;3087（15.0）;2966（17.
1）;2927（19.9）;2383（53.8）;1960（62.7）;1739
（2.5）;1688（5.2）;1655（0.9）;1594（11.7）;1560
（12.3）;1530（26.3）;1499（30.5）;1475（10.4）;14
55（14.0）;1429（24.5）および1411（23.6）。
FAB−MS 328（MH+）および284（MH+−CO2）。
HPLC,系1:15.18分。少量の不純物は全部で２％未満。
実施例33 N6−ベンジルオキシカルボニル−１−（Boc−aeg）アデ
ニンエチルエステル Ｎ′−Boc−アミノエチルグリシンエチルエステル
（2.00g;8.12ミリモル）、DhbtOH（1.46g;8.93ミリモ
ル）およびN6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボ
キシメチルアデニン（2.92g;8.93ミリモル）をDMF（15m
l）に溶解した。次にメチレンクロリド（15ml）を加え
た。溶液はエタノール／氷浴中で０℃に冷却した。DCC
（2.01g;9.74ミリモル）を添加した。2.5時間後氷浴を
除き、室温でさらに1.5時間撹拌を続けた。沈澱したDCU
を濾過して除去し、DMF（15ml）で一回、メチレンクロ
リドで二回（２×15ml）洗浄した。合併した濾液にさら
にメチレンクロリド（100ml）を加えた。溶液は希炭酸
水素ナトリウム（２×100ml）、希硫酸水素ナトリウム
（２×100ml）および飽和塩化ナトリウム（１×100ml）
の順で洗浄した。有機相を真空下蒸発乾固させると3.28
g（73％）の黄色がかった油状物を与えた。粗生成物のH
PLCは66％の純度を示した（主ピークより極性の高いお
よび低いいくつかの不純物を含んでいる）。油状物を無
水エタノール（50ml）に溶解し、活性炭を加えた。５分
撹拌後、溶液を濾過した。濾液を水（30ml）と混合し一
夜撹拌して放置した。次の日、白色沈殿物を濾過し、水
で洗浄して乾燥させるとHPLCで98％より高い純度を持つ
1.16g（26％）の物質が得られた。母液に水を加えると
さらに約95％の純度の物質0.53gを得た。元素分析：C26
H33N7O7・H2Oとして、実測値（計算値）:C:55.01（54.4
4）;H:6.85（6.15）およびN:16.47（17.09）。1 H−NMR（250MHz,CDCl3）;8.74（s,1H,Ade Ｈ−２）;
8.18（b,s,1H,ZNH）;8.10＆8.04（s,1H,H−８）;7.46−
7.34（m,5H,Ph）;5.63（未解析,t,1H,BocNH）;5.30（s,
2H,PhCH2）;5.16＆5.00（s,2H,CH 2CON）;4.29＆4.06
（s,2H,CH 2CO2H）;4.20（q,2H,OCH 2CH3）;3.67−3.29
（m,4H,CH 2CH 2）;1.42（s,9H,tBU）および1.27（t,3H,O
CH2CH3）。
スペクトルは痕跡のエタノールおよびDCUを示した。
実施例34 N6−ベンジルオキシカルボニル−１−（Boc−aeg）アデ
ニン N6ベンジルオキシカルボニル−１−（Boc−aeg）アデ
ニンエチルエステル（1.48g;2.66ミリモル）をTHF（13m
l）に懸濁し、混合物は０℃に冷却した。水酸化リチウ
ム（8ml;1N）を加えた。15分撹拌後、反応混合物を濾過
し、さらに水（25ml）を加えて、メチレンクロリドで洗
浄した（２×25ml）。水溶液のpHは1N HClにより2.0に
調整された。沈殿を濾過して分離し、水で洗浄して乾燥
すると、0.82g（58％）の生物を得た。生成物をメチレ
ンクロリド／石油エーテルで２回再沈殿させると乾燥後
に0.77g（55％）の生成物を得た。M.p.119℃（分解）。
元素分析：C24H29N7O7・H2Oとして実測値（計算値）:C:
53.32（52.84）;H:5.71（5.73）;N:17.68（17.97）。
FAB−MS 528.5（MH+）。1 H−NMR（250MHz,DMSO−d6）;12.75（非常にb,1H,CO
2H）;10.65（b,s,1H,ZNH）;8.59（d,1H,J＝2.14Hz,Ade
Ｈ−２）;8.31（s,1H,Ade Ｈ−８）;7.49−7.31（m,
5H,Ph）;7.03＆6.75（未解析,t,1H,BocNH）;5.33＆5.16
（s,2H,CH2CON）;5.22（s,2H,PhCH2 ）;4.34−3.99（s,2
H,CH2CO2H）;3.54−3.03（ｍ′s.水を含む，CH 2CH 2）お
よび1.39＆137（s,9H,tBU）。13 C−NMR 170.4;166.6;152.3;151.5;149.5;145.2;128.
5;128.0;127.9;66.32;47.63;47.03;43.87および28.24。
実施例35 ２−アミノ−６−クロロ−９−カルボキシメチルプリン ２−アミノ−６−クロロプリン（5.02g;29.6ミリモ
ル）および炭酸カリウム（12.91g;93.5ミリモル）のDMF
（50ml）懸濁液にブロモ酢酸（4.70g;22.8ミリモル）を
加えた。混合物は窒素下20時間激しく撹拌した。水（15
0ml）を加え、溶液をセライトを通して濾過すると透明
な黄色溶液が得られた。この溶液は4N塩酸でpH3の酸性
とした。沈殿を濾過し、真空下シカペント上で乾燥し
た。収量（3.02g;44.8％）。1 H−NMR（DMSO−d6）;d＝4.88ppm:（s,2H）;6.95（s,2
H）;8.10（s,1H）。
実施例36 ２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチ
ルプリン ナトリウム（2.0g;87.0ミリモル）をベンジルアルコ
ール（20ml）に溶解し、130℃に２時間加熱した。０℃
に冷却後、２−アミノ−６−クロロ９−カルボキシメチ
ルプリン（4.05g;18.0ミリモル）のDMF（85ml）溶液を
徐々に加え、得られた懸濁液は20℃で一夜撹拌した。水
酸化ナトリウム溶液（1N;100ml）を加え、透明化した溶
液は酢酸エチルで洗浄した（３×100ml）。水相を4N塩
酸でpH3の酸性とした。沈殿を酢酸エチル（200ml）にと
り、水相は酢酸エチルで抽出した（２×100ml）。合併
した有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し（２×75
ml）、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下蒸発乾固さ
せた。残渣はエタノール（300ml）から再結晶した。真
空下シカペント上で乾燥後の収量:2.76g（52％）。M.p.
159〜65℃。元素分析：（実測値；計算値）Ｃ（56.18;5
5.97）;H（4.38;4.32）;N（23.4;23.10）。1 H−NMR（DMSO−d6）;4.82ppm:（s,2H）;5.51（s,2H）;
6.45（s,2H）;7.45（m,5H）;7.82（s,1H）。
実施例37 Ｎ−（〔２−アミノ−６−ベジンジルオキシ−プリン−
９−イル〕−アセチル）−Ｎ−（２−Boc−アミノエチ
ル）−グリシン〔BocGaeg−OHモノマー〕 DMF（2ml）中、２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９
−カルボキシメチル−プリン（0.50g;1.67ミリモル）、
メチル−Ｎ（〔tert−ブトキシカルボニルアミノ〕エチ
ル）グリシネート（0.65g;2.80ミリモル）、ジイソプロ
ピルエチルアミン（0.54g;4.19ミリモル）およびブロモ
−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム−ヘキサフルオロ
−ホスフェート（PyBroP （0.798g;1.71ミリモル）を
４時間撹拌した。透明な溶液を炭酸水素ナトリウムの氷
冷溶液（1N;40ml）中へ注ぎ、酢酸エチルで抽出した
（３×40ml）。有機層を硫酸水素ナトリウム溶液（1N;2
×40ml）、炭酸水素ナトリウム溶液（1N;1×40ml）およ
び飽和塩化ナトリウム溶液（60ml）で洗浄した。無水硫
酸ナトリウムで乾燥させて真空下蒸発させた後、固形残
渣を酢酸エチル／ヘキサン（20ml（2:1））から再結晶
するとメチルエステルを63％の収率で得た（MS−FAB;51
4（Ｍ＋１））。エステルを濃水酸化ナトリウム（1ml）
を含むエタノール／水（30ml（1:2））に溶解させるこ
とにより加水分解が達成された。２時間撹拌後、溶液を
濾過し、4N塩酸の添加によりpH3の酸性に調整した。表
記化合物は濾過により得られた。収量:370mg（加水分解
に対して72％）。HPLCによる純度は99％以上であった。
二級アミドの周りの回転制限のため、いくつかの信号は
2:1の比で二重に現れた（リスト中、主ピークはmj.およ
び副ピークはmi.で示されている）。1 H−NMR（250MHz,DMSO−d6）;d＝1.4ppm:（s,9H）;3.2
（m,2H）;3.6（m,2H）;4.1（s,mj.,CONRCH 2COOH）;4.4
（s,mi.,CONRCH 2COOH）;5.0（s,mi.,Gua−CH 2CO−）;5.
2（s,mj.,Gua−CH 2CO−）;5.6（s,2H）;6.5（s,2H）;6.
9（m,mi.,BocNH）;7.1（m,mi.,BocNH）;7.5（m.,3H）;
7.8（s,1H）;12.8（s,1H）。13 C−NMR 170.95;170.52;167.29;166.85;160.03;159.7
8;155.84;154.87;140.63;136.76;128.49;128.10;113.0
4;78.19;77.86;66.95;49.22;47.70;46.94;45.96;43.62;
43.31および28.25。
実施例38 ３−Boc−アミノ−1,2−プロパンジオール ３−アミノ−1,2−プロパンジオール（40.00g;0.440
モル;1.0当量）を水（1000ml）に溶解し０℃に冷却し
た。ジ−tert−ブチルジカルボン酸（115.0g;0.526モ
ル;1.2当量）を一度に加えた。反応混合物は撹拌しなが
ら水浴で室温まで加熱した。pHは水酸化ナトリウム（1
7.56g;0.440モル;1.0当量）の水（120ml）溶液で10.5に
維持された。水酸化ナトリウム水溶液の添加が完了した
ら、反応混合物は室温で一夜撹拌した。次に反応混合物
に酢酸エチル（750ml）を加え、続いて０℃に冷却し
た。激しく撹拌しながら4N硫酸でpHを2.5に調整した。
相を分離し、水相を新しい酢酸エチルで洗浄した（６×
350ml）。有機相の容量は減圧下のエバポレーションに
より900mlに減少させた。次に有機相を硫酸水素カリウ
ムの飽和水溶液を20倍に希釈した液（１×1000ml）およ
び飽和塩化ナトリウム水溶液（１×500ml）で洗浄し
た。有機相を乾燥し（MgSO4）、減圧下蒸発させると50.
12g（60％）の表記化合物が得られた。メチレンクロリ
ド溶液を蒸発させ続いて冷凍すると生成物を固形化でき
た。1 H−NMR（CDCl3/TMS）:d＝1.43（s,9H,Me3C）;3.25（m,
2H,CH2）;3.57（m,2H,CH2）;3.73（m,1H,CH）。13 C−NMR（CDCl3/TMS）:d＝28.2（Me3C）;42.6（CH2）;
63.5;71.1（CH2OH,CHOH）;79.5（Me3C）;157.0（Ｃ＝
０）。
実施例39 ２−（Boc−アミノ）エチル−Ｌ−アラニンメチルエス
テル ３−Boc−アミノ−1,2−プロパンジオール（20.76g;
0.109モル;1当量）を水（150ml）に懸濁した。Ｍ−過ヨ
ウ素酸カリウム（24.97g;0.109モル;1.0当量）を加え、
反応混合物は窒素下室温で２時間撹拌した。反応混合物
を濾過し、水相をクロロホルムで抽出した（６×250m
l）。有機相を乾燥し（MgSO4）、蒸発させるとほとんど
定量的にBoc−アミノアセトアルデヒドを黒色油状物と
して得、それはさらに精製することなく以下の工程で使
用された。
パラジウム炭素（10％;0.8g）をMeOH（250ml）に窒素
下で加え、冷却しながら（０℃）激しく撹拌した。無水
酢酸ナトリウム（4.49g;54.7モル;2当量）およびＬ−ア
ラニンメチルエステル塩酸塩（3.82g;27.4モル;1当量）
を加えた。Boc−アミノアセトアルデヒド（4.79g;30.1
モル;1.1当量）をMeOH（150ml）に溶解し、反応混合物
に添加した。反応混合物は水素吸収が止まるまで室温、
大気圧で水素化した。反応混合物をセライトを通して濾
過し、MeOHで洗浄した。MeOHは減圧下溜去された。残渣
は水（150ml）に懸濁し、激しく撹拌しながら0.5NNaOH
を滴下し、pHを8.0に調整した。水層をメチレンクロリ
ドで抽出した（４×250ml）。有機相を乾燥し（MgS
O4）、セライトを通して濾過し、減圧下蒸発させると6.
36g（94％）の表記化合物を透明でわずかに黄色の油状
物として得た。
MS（FAB−MS）:m/z（％）＝247（100,M＋1,191（90）;1
47（18）。1 H−NMR（250MHz,CDCl3）;1.18（d,J＝7.0Hz,3H,Me）;
1.36（s,9H,Me3C）;1.89（b,1H,NH）;2.51（m,1H,C
H2）;2.66（m,1H,CH2）;3.10（m,2H,CH2）;3.27（q,J＝
7.0Hz,1H,CH）;3.64（s,3H,OMe）;5.06（b,1H,カーバメ
ートNH）。13 C−NMR;d＝18.8（Me）;28.2（Me3C）;40.1;47.0（C
H2）;51.6（OMe）;56.0（CH）;155.8（カーバメート
Ｃ＝０）;175.8（エステル Ｃ＝０）。
実施例40 Ｎ−（Boc−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニルアセ
チル）−Ｌ−アラニンメチルエステル Boc−アミノエチル−（Ｌ）−アラニンメチルエステ
ル（1.23g;5.0ミリモル）のDMF（10ml）溶液にDhbt−OH
（0.90g;5.52ミリモル）および１−チミニル酢酸（1.01
g;5.48ミリモル）を加えた。１−チミニル酢酸が溶解さ
れた時ジクロロメタン（10ml）を加え溶液を氷浴上で冷
却した。反応混合物が０℃に達した後にDCC（1.24g;6.0
1ミリモル）を加えた。添加後５分以内にDCUの沈殿が観
察された。さらに５分後氷浴を取り除いた。２時間後、
TLC分析は反応が終了していることを示した。混合物を
濾過し、沈殿をジクロロメタン（100ml）で洗浄した。
得られた溶液は５％炭酸水素ナトリウム水溶液（150m
l）で２回、および飽和硫酸水素カリウム（25ml）に水
（100ml）を加えた液で２回抽出した。最後に飽和塩化
ナトリウム（150ml）で抽出した後、溶液を硫酸マグネ
シウムで乾燥し蒸発させると白色あわ状物を得た。あわ
状物はメタノールの濃度勾配をつけたジクロロメタンを
溶出液として使用するシリカゲルのカラムクロマトグラ
フィーにより精製した。それにより純粋な化合物（＞99
％,HPLCにより）が得られた（1.08g;52.4％）。
FAB−MS 413（Ｍ＋１）および431（Ｍ＋１＋水）。1 H−NMR（CDCl3）;4.52（s,2H,CH′2）;3.73（s,3H,OM
e）;3.2−3.6（m,4H,エチル CH2）;1.90（s,3H,Me Ｔ
中）;1.49（d,3H,Me Ala中 Ｊ＝7.3Hz）;1.44（s,9H,
Boc）。
実施例41 Ｎ−（Boc−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニルアセ
チル）−Ｌ−アラニン 表記化合物ののメチルエステル（2.07g;5.02ミリモ
ル）をメタノール（100ml）に溶解し、氷浴上で冷却し
た。2M水酸化ナトリウム（100ml）を加えた。10分間撹
拌した後、混合物のpHを4M塩酸で３に調整した。溶液は
続いて酢酸エチルで抽出された（３×100ml）。合併し
た有機抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥した。蒸発後、
得られたあわ状物は酢酸エチル（400ml）に溶解し、固
形物を溶解させるため数mlのメタノールを加えた。次に
沈殿ができ始めるまで石油エーテルを加えた。−20℃で
一夜放置後、沈殿を濾取した。これにより1.01g（50.5
％）の純粋な化合物（＜99％,HPLCにて）が得られた。
この化合物は２−プロパノールから再結晶できる。
FAB−MS 399（Ｍ＋１）。1H−NMR（DMSO−d6）;11.35
（s,1H,COO）;7.42（s,1H,H′6）;4.69（s,2H,CH′2）;
1.83（s,3H,Me Ｔ中）;1.50−1.40（m,12H,Me Ala＋B
oc中）。
実施例42 （ａ）Ｎ−（Boc−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニ
ルアセチル）−Ｄ−アラニンメチルエステル Boc−アミノエチル・アラニンメチルエステル（2.48
g;10.1ミリモル）のDMF（20ml）溶液にDhbt−OH（1.80
g;11.0ミリモル）およびチミニル酢酸（2.14g;11.6ミリ
モル）を加えた。１−チミニル酢酸が溶解後、メチレン
クロリド（20ml）を加え、溶液を氷浴上で冷却した。反
応混合物が０℃に達した時にDCC（2.88g;14.0ミリモ
ル）を加えた。添加後５分以内にDCUの沈殿が観察され
た。35分後に氷浴を取り除いた。3.5時間後に反応混合
物を濾取し、沈殿をメチレンクロリド（200ml）で洗浄
した。得られた溶液は５％炭酸水素ナトリウム（200m
l）を２回、飽和硫酸水素カリウム水溶液（100ml）で２
回洗浄した。最後に飽和塩化ナトリウム（250ml）で洗
浄した後、溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し蒸発させる
と油状物を得られた。油状物はメタノール濃度勾配をつ
けたメチレンクロリドを溶出液として用いる短いカラム
のシリガゲルクロマトグラフィーにより精製された。こ
れにより96％の純度（HPLCによる）の化合物が石油エー
テルによる沈殿化後に得られた（1.05g;25.3％）。
FAB−MS 413（Ｍ＋１）。1 H−NMR（CDCl3）;5.64（t,1H,BocNH,J＝5.89Hz）;4.56
（d,2H,CH′2）;4.35（q,1H,CH Ala中Ｊ＝7.25Hz）;3.
74（s,3H,OMe）;3.64−3.27（m,4H,エチル Ｈ′ｓ）;
1.90（s,3H,Me Ｔ中の）;1.52−1.44（t,12H,Boc＋Me
Ala中の）。
（ｂ）Ｎ−（Boc−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニ
ルアセチル）−Ｄ−アラニン 表記化合物のメチルエステル（1.57g;3.81ミリモル）
メタノール（100ml）に溶解し、氷浴上で冷却した。水
酸化ナトリウム（100ml;2M）を加えた。10分撹拌後、4M
塩酸で混合物のpHを３に調整した。次に溶液を酢酸エチ
ルで抽出した（３×100ml）。合併した有機抽出液は硫
酸マグネシウムで乾燥した。エバポレーション後油状物
は酢酸エチル（200ml）に溶解させた。沈殿が生じ始め
るまで石油エーテルを加えられた（総量で600ml）。−2
0℃で一夜放置後、沈殿を濾取した。これにより1.02g
（67.3％）の表記化合物が得られ、HPLCによると94％の
純度であった。
FAB−MS 399（Ｍ＋１）。1 H−NMR;11.34（s,1H,COOH）;7.42（s,1H,H′6）;4.69
（s,2H,CH′2）;4.40（q,1H,CH Ala中,J＝7.20Hz）;1.
83（s,3H,Me Ｔ中）;1.52−1.40（m,12H,Boc＋Me Ala
中）。
実施例43 Ｎ−（Ｎ′−Boc−３′−アミノプロピル）−Ｎ−
〔（１−チミニル）アセチル〕グリシンメチルエステル Ｎ−（Ｎ′−Boc−３′−アミノプロピル）グリシン
メチルエステル（2.84g;0.0115モル）をDMF（35ml）に
溶解し、続いてDhbtOH（2.07g;0.0127モル）および１−
チミニル酢酸（2.34g;0.0127モル）を加えた。メチレン
クロリドを加え、混合物は氷浴上で０℃に冷却した。DC
C（2.85g;0.0138モル）添加後、混合物は０℃で２時
間、続いて室温で１時間撹拌した。沈殿したDCUを濾過
して除き、メチレンクロリド（25ml）で洗浄し、さらに
濾液に150mlのメチレンクロリドを加えた。有機相を炭
酸水素ナトリウム（１容量の飽和液を１容量の水で希
釈、６×250ml）、硫酸カリウム液（１容量の飽和液を
４容量の水で希釈、３×250ml）および飽和塩化ナトリ
ウム水溶液（１×250ml）で洗浄し、硫酸マグネシウム
で乾燥させて真空下蒸発乾固させた。固形残渣をメチレ
ンクロリド（35ml）に懸濁し、１時間撹拌した。沈殿し
たDCUを濾過して除き、メチレンクロリド（25ml）で洗
浄した。濾液を真空下蒸発乾固させ、残渣をメタノール
およびメチレンクロリド混合物（メチレンクロリド中３
〜７％のメタノール濃度勾配）で溶出するシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより表
記化合物が白色固形物として得られた（3.05g;64％）。
M.p.76〜79℃（分解）。元素分析：C18H28N4O7として、
実測値（計算値）:C:52.03（52.42）;H:6.90（6.84）;
N:13.21（13.58）。この化合物は満足すべき1Hおよび13
C−NMRスペクトルを示した。
実施例44 Ｎ−（Ｎ′−Boc−３′−アミノプロピル）−Ｎ−
〔（１−チミニル）アセチル〕グリシン Ｎ−（Ｎ′−Boc−３′−アミノプロピル）−Ｎ
〔（１−チミニル）アセチル〕グリシンメチルエステル
（3.02g;0.00732モル）をメタノール（25ml）に溶解
し、2M水酸化ナトリウム（25ml）と1.5時間撹拌した。
真空下蒸発させてメタノールを除去し、０℃で4M塩酸に
てpHを２に調整した。濾過により生成物が白色結晶とし
て単離され、水で洗浄して（３×10ml）真空下、シカペ
ント上で乾燥した。収量2.19g（75％）。元素分析：C17
H26N4O7・H2O）として実測値（計算値）:C:49.95（49.0
3）;H:6.47（6.29）;N:13.43（13.45）。この化合物は
満足すべき1Hおよび13C−NMRスペクトルを示した。
実施例45 ３−（１−チミニル）プロパン酸メチルエステル チミン（14.0g;0.11モル）をメタノールに懸濁した。
触媒量の水酸化ナトリウムと一緒にアクリル酸メチル
（39.6ml;0.44モル）を加えた。溶液は暗所で45時間還
流した後真空下蒸発乾固させ、残渣を加熱しながらメタ
ノール（8ml）に溶解した。氷浴上で冷却後、エーテル
（20ml）を添加すると生成物が沈殿するので濾過し単離
し、真空下シカペント上で乾燥した。収量11.23g（48
％）。M.p.112〜119℃。元素分析：C9H12N2O4として実
測値（計算値）:C:51.14（50.94）;H:5.78（5.70）;N:1
1.52（13.20）。この化合物は満足すべき1Hおよび13C−
NMRスペクトルを示した。
実施例46 ３−（１−チミニル）プロパン酸 ３−（１−チミニル）−プロパン酸メチルエステル
（1.0g;0.0047モル）を2M水酸化ナトリウム（15ml）に
懸濁し、10分間煮沸した。濃塩酸でpHを0.3に調整し
た。この溶液は酢酸エチルで抽出された（10×25ml）。
有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグ
ネシウムで乾燥した後、真空下蒸発乾固させると表記化
合物が白色固形物として得られた（0.66g;71％）。M.p.
118〜121℃。元素分析：C8H10N2O4として実測値（計算
値）:C:48.38（48.49）;H:5.09（5.09）;N:13.93（14.1
4）。この化合物は満足すべき1Hおよび13C−NMRスペク
トルを示した。
実施例47 Ｎ−（Ｎ′−Boc−アミノエチル）−Ｎ−〔（１−チミ
ニル）プロパノイル〕グリシンエチルエステル Ｎ−（Ｎ′−Boc−アミノエチル）グリシンエチルエ
ステル（1.0g;0.0041モル）をDMF（12ml）に溶解した。
DhbtOH（0.73g;0.0045モル）および３−（１−チミニ
ル）−プロパン酸（0.89g;0.0045モル）を添加した。メ
チレンクロリド（12ml）を次に加え、混合物は氷浴上で
０℃に冷却した。DCC（1.01g;0.0049モル）添加後、混
合物は０℃で２時間、続いて室温で１時間撹拌した。沈
殿したDCUは濾過して除き、メチレンクロリド（25ml）
で洗浄し、濾液にさらに50mlのメチレンクロリドを加え
た。有機相は炭化水素ナトリウム（１容量の飽和液を１
容量の水で希釈、６×100ml）、硫酸カリウム（１容量
の飽和液を４容量の水で希釈、３×100ml）および飽和
塩化ナトリウム水溶液（１×100ml）で洗浄した後、硫
酸マグネシウムで乾燥し、真空下蒸発乾固した。固形残
渣はメチレンクロリド（15ml）に懸濁し、１時間撹拌し
た。沈殿したDCUは濾過して除き、メチレンクロリドで
洗浄した。濾液を真空下蒸発乾固させ、残渣はメタノー
ルおよびメチレンクロリドの混合物（メチレンクロリド
中１〜６％のメタノール濃度勾配をつけて）で溶出する
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。
これにより表記化合物を白色固形物として得た（1.02g;
59％）。元素分析：C19H30H4O7として、実測値（計算
値）:C:53.15（53.51）;H:6.90（7.09）;N:12.76（13.1
3）。この化合物は満足すべき1Hおよび13C−NMRスペク
トルを示した。
実施例48 Ｎ−（Ｎ′−Boc−アミノエチル）−Ｎ−〔（１−チミ
ニル）プロパノイル〕グリシン Ｎ−（Ｎ′−Boc−アミノエチル）−Ｎ〔（１−チミ
ニル）プロパノイル〕グリシンエチルエステル（0.83g;
0.00195モル）をメタノール（25ml）に溶解した。水酸
化ナトリウム（25ml;2M）を加えた。溶液を１時間撹拌
した。真空下メタノールを蒸発させ、０℃で4M塩酸によ
りpHを調整した。生成物を濾過により単離し、エーテル
で洗浄し（３×15ml）、真空下シカペント上で乾燥し
た。収量0.769g（99％）。M.p.213℃（分解）。
実施例49 モノ−Boc−エチレンジアミン（２） tert−ブチル−４−ニトロフェニルカーボネート
（１）（10.0g;0.0418モル）をDMF（50ml）に溶解し、
エチレンジアミン（27.9ml;0.418モル）のDMF（50ml）
溶液に30分以上かけて滴下し、一夜撹拌した。混合物は
真空下蒸発乾固させ、得られた油状物は水（250ml）に
溶解した。０℃に冷却後4M塩酸でpHを3.5に調整した。
次に溶液を濾過し、クロロホルムで抽出した（３×250m
l）。０℃で2M水酸化ナトリウムにてpHを12に調整し、
水性溶液をメチレンクロリドで抽出した（３×300m
l）。飽和塩化ナトリウム水溶液（250ml）で処理した後
メチレンクロリド溶液を硫酸マグネシウムで乾燥した。
濾過後、真空下蒸発乾固させると4.22g（63％）の生成
物（油状物）が得られた。1 H−NMR（90MHz,CDCl3）：δ1.44（s,9）;2.87（t,2
H）;3.1（q,2H）;5.62（s,ブロード）。
実施例50 （Ｎ−Boc−アミノエチル）−β−アラニンメチルエス
テル,HCl モノ−Boc−エチレンジアミン（２）（16.28g;0.102
モル）をアセトニトリル（40ml）に溶解し、アクリル酸
メチル（91.50ml;1.02モル）のアセトニトリル（200m
l）溶液を加えた。溶液はアクリル酸メチルの重合化を
避けるために窒素下暗所にて一夜還流した。真空下蒸発
乾固させ、水およびエーテルの混合物（200＋200ml）を
加え、溶液を濾過した後激しく撹拌した。水相をもう一
度エーテルで抽出した後凍結乾燥すると黄色固形物が得
られた。酢酸エチルから再結晶すると13.09g（46％）の
表記化合物を得た。M.p.138〜140℃。元素分析：C11H23
N2O4Clとして、実測値（計算値）C:46.49（46.72）;H:
8.38（8.20）;N:9.83（9.91）;Cl:12.45（12.54）。1 H−NMR:（90MHz;DMSO−d6）：δ1.39（s,9H）;2.9（m,
8H）;3.64（s,3H）。
実施例51 Ｎ−〔（１−チミニル）アセチル〕−Ｎ′−Boc−アミ
ノエチル−β−アラニンメチルエステル （Ｎ−Boc−アミノエチル）−β−アラニンメチルエ
ステル、HCl（３）（2.0g;0.0071モル）および１−チミ
ニル酢酸ペンタフルオロフェニルエステル（５）（2.82
8g;0.00812モル）をDMF（50ml）に溶解した。トリエチ
ルアミン（1.12ml;0.00812モル）を加え、混合物は一夜
撹拌した。メチレンクロリド（200ml）を加えた後有機
相を炭化水素ナトリウム水溶液（３×250ml）、半飽和
硫酸水素カリウム（３×250ml）および飽和塩化ナトリ
ウム水溶液（250ml）で抽出し、硫酸マグネシウムで乾
燥した。濾過および真空下の蒸発乾固により2.9g（99
％）の生成物（油状物）を得た。1 H−NMR（250MHz:CDCl3）：二級アミドの周りの回転制
限のためいくつかの信号は２本にわれた； δ1.43（s,9H）;1.88（s,3H）;2.63（t,1H）;2.74（t,1
H）;3.25−3.55（４×t,8H）;3.65（２×t,2H）;3.66
（s,1.5）;3.72（s,1.5）;4.61（s,1H）;4.72（s,2H）;
5.59（s,0.5H）;5.96（s,0.5H）;7.11（s,1H）;10.33
（s,1H）。
実施例52 Ｎ−〔（１−チミニル）アセチル〕−Ｎ′−Boc−アミ
ノエチル−β−アラニン Ｎ−〔（１−チミニル）アセチル〕−Ｎ′−Boc−ア
ミノエチル−β−アラニンメチルエステル（3.0g;0.007
3モル）を2M水酸化ナトリウム（30ml）に溶解し、4M H
ClにてpHを２に調整し、２時間撹拌した。沈殿物を濾過
して単離し、３回冷水で洗浄後真空下シカぺント上で乾
燥した。収量2.23g（77％）。M.p.170〜176℃。元素分
析：C17H26N4O7・H2Oとして、実測値（計算値）C:49.49
（49.03）;H:6.31（6.78）;N:13.84（13.45）。1 H−NMR（90MHz;DMSO−d6）：δ1.38（s,9H）;1.76（s,
3H）;2.44および3.29（m,8H）;4.55（s,2H）;7.3（s,1
H）;11.23（s,1H）。
FAB−MS:399（Ｍ＋１）。
実施例53 Ｎ−〔（１−（N4−Ｚ）−シトシル）アセチル〕−Ｎ′
−Boc−アミノエチル−β−アラニンメチルエステル （Ｎ−Boc−アミノエチル）−β−アラニンメチルエ
ステル、HCl（３）（2.0g:0.0071モル）および１−（Ｎ
−４−Ｚ）−シトシル酢酸ペンタフルオロフェニルエス
テル（５）（3.319g;0.0071モル）をDMF（50ml）に溶解
した。トリエチルアミン（0.99ml;0.0071モル）を加え
混合物は一夜撹拌した。メチレンクロリド（200ml）を
加えた後有機相を炭酸水素ナトリウム水溶液（３×250m
l）、半飽和硫酸水素カリウム水溶液（３×250ml）およ
び飽和塩化ナトリウム水溶液（250ml）で抽出し、硫酸
マグネシウムで乾燥した。濾過および真空下の蒸発乾固
により3.36gの固形化合物を得、それはメタノールから
再結晶された。収量2.42g（64％）。M.p.158〜161℃。
元素分析：C25H33N5O8として、実測値（計算値）C:55.1
9（56.49）;H:6.19（6.26）;N:12.86（13.18）。1 H−NMR（250MHz;CDCl3）：二級アミドの周りの回転制
限のためいくつかの信号は２本にわれた； δ1.43（s,9H）;2.57（t,1H）;3.60−3.23（ｍ′s,6
H）;3.60（s,1.5H）;3.66（s,1.5H）;4.80（s,1H）;4.8
8（s,1H）;5.20（s,2H）;7.80−7.25（ｍ′s,7H）。
FAB−MS:532（Ｍ＋１）。
実施例54 Ｎ−〔（１−（N4−Ｚ）−シトシル）−アセチル〕−
Ｎ′−Boc−アミノエチル−β−アラニン Ｎ−〔（１−（Ｎ−４−Ｚ）−シトシル）アセチル〕
−Ｎ′−Boc−アミノエチル−β−アラニンメチルエス
テル（0.621g;0.0012モル）を2M水酸化ナトリウム（8.5
ml）に溶解し２時間撹拌した。次に０℃で4M塩酸にてpH
を２に調整し、２時間撹拌した。沈殿物を濾過により単
離し、３回冷水で洗浄し、真空下シカペント上で乾燥し
た。収量0.326g（54％）。白色固形物は２−プロパノー
ルから再結晶し、石油エーテルで洗浄した。M.p.163℃
（分解）。元素分析：C24H3N5O8として、実測値（計算
値）C:49.49（49.03）;H:6.31（6.78）;N:13.84（13.4
5）。1 H−NMR（250MHz;CDCl3）：二級アミドの周りの回転制
限のためいくつかの信号は２本にわれた； δ1.40（s,9H）;2.57（t,1H）;2.65（t,1H）;3.60−3.3
2（ｍ′s,6H）;4.85（s,1H）;4.98（s,1H）;5.21（s,2
H）;5.71（s,1H,ブロード）;7.99−7.25（ｍ′s,7H）。
FAB−MS:518（Ｍ＋１）。
実施例55 グアニン残基を持つPNA−オリゴマーの例 （ａ）Ｈ−〔Taeg〕5−〔Gaeg〕−〔Taeg〕4−Lys−NH2
の固相合成 保護PNAは約0.15ミリモル/gの置換で（定量的ニンヒ
ドリン反応により決定された）Boc−Lys（ClZ）修飾MBH
A樹脂に組入れられた。非結合アミノ基のキャッピング
はBocGaeg−OHモノマーの組込み前に実施された。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕5−〔Gaeg〕−〔Taeg〕4−Lys−NH2
の段階的作製（合成プロトコール） 合成は102mg（乾燥重量）の前もって膨潤され（DCMで
一夜）中和されたBoc−Lys（ClZ）−MBHA樹脂から開始
された。実施された工程は以下のようである： （１）TFA/DCM（1:1,v/v）によるBoc脱保護、１×２
分および１×1/2時間,3ml;（２）DCMにて洗浄、４×20
秒,3ml;DMFにて洗浄、２×20秒,3ml;DCMにて洗浄、２×
20秒,3ml、およひ脱溶媒30秒；（３）DIEA/DCM（1:19,v
/v）による中和、２×３分,3ml;（４）DCMにて洗浄、４
×20秒、3ml,脱溶媒１分；（５）４等量のジイソプロピ
ルカルボジイミド（0.06ミリモル;9.7μｌ）および0.6
μｌのDCM/DMF（1:1,v/v）に溶解した４当量のBocTaeg
−OH（0.06ミリモル;24mg）またはBocGaeg−OH（0.06ミ
リモル:30mg）の添加（モノマーの最終濃度0.1M）、カ
ップリング反応は室温で1/2時間振とうすることにより
進行させた；（６）脱溶媒20秒；（７）DMFにて洗浄、
２×20秒および１×２分,3ml;DCMにて洗浄、４×20秒,3
ml;（８）DIEA/DCM（1:19,v/v）にて中和、２×３分,3m
l;（９）DCMにて洗浄、４×20秒,3mlおよび脱溶媒１
分；（10）定性的Kaiser試験；（11）Al2O／ピリジン/D
CM（1:1:2,v/v）でのアセチル化による未反応アミノ基
の遮断、１×1/2時間,3ml;および（12）DCMにて洗浄、
４×20秒,2×２分および２×20秒,3ml。所望の配列が得
られるまで工程１〜12を繰返した。すべての定性的Kais
er試験は陰性であり（淡黄色、ビーズの着色なし）ほと
んど100％のカップリング収率を示している。PNA−オリ
ゴマーは切断され通常の方法で精製された。
FAB−MS:2832.11〔M*＋１〕（計算値2832.15）。
実施例56 Ｈ−Taeg−Aaeg−〔Taeg〕8−Lys−NH2−の固相合成 （ａ）Boc−Taeg−Ａ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕8−Lys（Cl
Z）−MBHA樹脂の段階的作製 約0.3gの湿潤Boc−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
を3mlのSPPS反応容器に入れた。Boc−Taeg−Ａ（Ｚ）ae
g−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）−MBHAは2.5mlの50％DMF/CH2
Cl2に溶解した0.19MのBocA（Ｚ）aeg−OHと0.15MのDCC
を利用するＡ（Ｚ）aeg残基の原位置DCCカップリング
（単）およびCH2Cl2中の0.15M BocTaeg−OPfpとの単カ
ップリングにより作製された（“合成プロトコール
5"）。合成は定量的ニンヒドリン反応によりモニターさ
れ、約50％のＡ（Ｚ）aegの取り込みおよび約96％のTae
gの取り込みが示された。
（ｂ）Ｈ−Taeg−Aaeg−〔Taeg〕8−Lys−NH2−の切
断、精製および同定 保護Boc−Taeg−Ａ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕8−Lys（Cl
Z）−BHA樹脂が実施例40cに記載したごとく処理され、5
3.1mgの乾燥Ｈ−Taeg−Ａ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕8−Lys
（ClZ）−BHA樹脂のHF切断により約15.6mgの粗物質を得
た。14.4分の主ピークは全吸光度の50％未満しかなかっ
た。粗物質の一部0.5mgを精製すると約0.1mgのＨ−Taeg
−Aaeg−〔Taeg〕8−Lys−NH2が得られた。(M+H)+の計
算m/z値は2816.16であり実測m/z値は2816.28であった。
（ｃ）合成プロトコール５ （１）TFA/CH2Cl2（1:1,v/v）によるBoc脱保護、2.5m
l,3×１分および１×30分；（２）CH2Cl2による洗浄、
2.5ml,6×１分；（３）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による
中和、2.5ml,3×２分；（４）CH2Cl2による洗浄、2.5m
l,6×１分および脱溶媒１分；（５）置換を決定するた
めの定量的ニンヒドリン分析のため、PNA樹脂試料２〜5
mgを取り出し、十分に乾燥；（６）1.25mlのDMFに溶解
した0.47ミリモル（0.25g）のBocA（Ｚ）aeg−OHを加
え、続いて1.25mlのCH2Cl2に溶解した0.47ミリモル（0.
1g）のDCCまたは2.5mlのCH2Cl2に溶解した0.36ミリモル
（0.20g）のBocTaeg−OPfpを加えた；カップリング反応
は総計で20〜24時間振とうすることにより進行させた；
（７）DMFによる洗浄、2.5ml,1×２分；（８）CH2Cl2に
よる洗浄、2.5ml,4×１分;DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）に
よる中和、2.5ml,2×２分；（10）CH2Cl2による洗浄、
2.5ml,6×１分；（11）カップリングの程度を決定する
定量的ニンヒドリン分析のため、保護PNA樹脂試料の２
〜5mgを取り出し、十分に乾燥；（12）25mlの無水酢酸
／ピリジン／CH2Cl2（1:1:2,v/v/v）の混合物での２時
間のアセチル化による未反応アミノ基の遮断（最終サイ
クル後を除く）；（13）およびCH2Cl2による洗浄、2.5m
l,6×１分；（14）ニンヒドリン分析のため保護PNA樹脂
の試料２×２〜5mgを取り出し、DIEA/CH2Cl2（1:19,v/
v）で中和し、CH2Cl2で洗浄。
実施例57 Ｈ−〔Taeg〕2−Aaeg−〔Taeg〕5−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕2−Ａ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys
（ClZ）−MBHA樹脂の段階的組立て 約0.5gの湿潤Boc−〔Taeg〕5−Lys−（ClZ）−MBHA樹
脂を5mlのSPPS反応容器に入れた。Boc−〔Taeg〕2−Ａ
（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は0.15M
から0.2Mの保護PANモノマー（遊離酸）と一緒に当量のD
CC（2ml,CH2Cl2）を利用するＡ（Ｚ）aegおよひTaegの
両方の残基の原位置DCCカップリングにより組立てられ
た（“合成プロトコール6"）。合成は定量的ニンヒドリ
ン反応によりモニターされ、３回カップリング後にＡ
（Ｚ）aegの約82％の取り込み（最初のカップリングで
約50％の取り込みを得;50％DMF/CH2Cl2中の４回目のカ
ップリングは有意に全カップリング収量を増加させなか
った）およびTaeg残基の定量的な取り込み（単カップリ
ング）を示した。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕2−Aaeg−〔Taeg〕5−Lys−NH2の切
断、精製および同定 保護Boc−〔Taeg〕2−Ａ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys
（ClZ）−BHA樹脂が実施例40cに記載したごとく処理さ
れ、102.5mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕2−Ａ（Ｚ）aeg−〔Tae
g〕5−Lys（ClZ）−BHA樹脂のHF切断により約16.2mgの
粗物質を得た。粗物質を小量精製した。(M+H)+として計
算m/z値は2050.85であり、実測m/z値は2050.90であっ
た。
（ｃ）合成プロトコール６ （１）TFA/CH2Cl2（1:1,v/v）によるBoc脱保護、2ml,
3×１分および１×30分；（２）CH2Cl2による洗浄、2m
l,6×１分；（３）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による中
和、2ml,3×２分；（４）CH2Cl2による洗浄、2ml,6×１
分および脱溶媒１分；（５）置換を決定する定量的ニン
ヒドリン分析のため、PNA樹脂試料を２〜5mg取り出し、
十分に乾燥；（６）1.5mlのCH2Cl2に溶解した0.44ミリ
モル（0.23g）のBocA（Ｚ）aeg−OHの添加に続いての0.
5mlのCH2Cl2に溶解した0.44ミリモル（0.09g）のDCCの
添加または1.5mlのCH2Cl2に溶解した0.33ミリモル（0.1
3g）のBocTaeg−OHの添加に続いての0.5mlのCH2Cl2に溶
解した0.33ミリモル（0.07g）のDCCの添加；カップリン
グ反応は総計で20〜24時間振とうすることにより進行さ
せた；（７）DMFによる洗浄、2ml,1×２分；（８）CH2C
l2による洗浄、2ml,4×１分；（９）DIEA/CH2Cl2（1:1
9,v/v）による中和、2ml,2×２分；（10）CH2Cl2による
洗浄、2ml、６×１分；（11）カップリングの程度を決
定するための定量的ニンヒドリン分析のため保護PNA樹
脂試料を２〜5mg取り出し、十分に乾燥；（12）25mlの
無水酢酸／ピリジン／CH2Cl2（1:1:2,v/v/v）の混合物
による２時間のアセチル化による未反応のアミノ基の遮
断（最終のサイクル後を除く）；（13）CH2Cl2による洗
浄、2ml,6×１分；および（14）ニンヒドリン分析のた
め保護PNA樹脂の試料を２×２〜5mg取り出し、DIEA/CH2
Cl2（1:19,v/v）で中和し、CH2Cl2により洗浄。
実施例58 PNA−オリゴマーＨ−T4C2TCT−LysNH2は実施例93に記
載したごとく合成された。この配列のハイブリダイゼー
ション実験は配向の結果を解決するはずである（なぜな
ら、それは全く非対称である）。そのような実験はまた
TmのpH依存性および形成された複合体の化学量論の結果
も解決するはずである。
PNAオリゴマーＨ−T4C2TCTC−LysNH2によるハイブリ
ダイゼーション実験は以下のごとく実施された： これらの結果は真に混合された配列がはっきり決めら
れた融解曲線を生じることを示している。PNA−オリゴ
マーはＮ−末端/5′−配向が優先するが両方の配向で実
際に結合できる（列１および４を比較せよ）。Ｔまたは
Ｃの一つの不適正相対塩基の導入はpH7.2で16℃以上のT
mの低下を起こした;pH5.0ではTm値は27℃以上低下し
た。このことは非常に高い度合いの配列選択性が存在
し、それはすべてのPNA C/T配列の一般的特色にちがい
ないことを示している。
上に示したごとく、Tm値の非常に強いpH依存性が存在
しており、ハイブリッドの形成にフーグスティーン型塩
基対形成が重要であることを示している。従って、化学
量論が2:1であることが観察されたことは驚くべきこと
ではない。
配列中の対称性の欠除および不適正対が存在した場合
の非常に大きなTmの低下は相補DNAに結合された時にワ
トソン−クリック鎖およびファーグスティーン鎖が匹敵
していることを示している。このことは両方の配向（す
なわち、５′/N末端および３′/N末端）に対して事実で
ある。
実施例59 Ｈ−T5GT4−Lys−NH2とのハイブリダイゼーション実
験の結果は以下のごとくである： 列1,3および６と列2,4,5および７を比較することによ
り示されるごとく、Ｇはこの様式でDNA鎖中のC/Aおよび
C/Tを区別できる（すなわち配向列区別が観察され
た）。UV混合曲線により列３の複合体は2PNA:IDNA複合
体であることがさらに決定された。
実施例60 FAB質量スペクトル分光法により決定されたいくつか
の合成PNA−オリゴマーの質量は以下のごとくである： 実施例61 伸長バックボーン（β−アラニン修飾）を一つのユニ
ットに持つPNA−オリゴマーに対するハイブリダイゼー
ションのデータは以下のごとくである： 融解温度は減少しているが、データは塩基特異的認識
は保たれていることを示している。
実施例62 “塩基なしの”置換の例。
実施例63 ヨード化法 Tyr−PNA−T10−Lys−NH2の５μｇを40μｌの100mMリ
ン酸ナトリウム、pH7.0に融解し、1mCiのNa125Iおよび
２μｌのクロラミン−Ｔ（50mMアセトニトリル溶液）を
加える。溶液は20℃で10分間放置した後0.5×5cmのセフ
ァデックスG10カラムを通す。放射活性を含む最初の２
つの分画（各々100μｌ）を集めHPLCで精製する:0.1％C
F3COOH水溶液中０〜60％のアセトニトリル濃度勾配を用
いた逆相Ｃ−18。125I−PNAはPNAピークのすぐ後に溶出
する。溶媒は減圧下除去される。
実施例64 PNA−T10／T9C／T8C2の二本鎖DNAへの結合はA10／A9G／
A8G2を標的とする（図20） 100μｌの緩衝液200mM NaCl,50mM酢酸ナトリウム,pH
4.5,1mM ZnSO4）に溶解した200cpsの指定されたプラス
ミドの32P標識EcoRI−PvuII断片（EcoRI部位の３′末端
が標識されたラージフラグメント）、0.5μｇの担体ウ
シ胸腺DNAおよび300ngのPNAの混合物37℃にて120分イン
キュベートした。ヌクレオーゼS1の50単位を加え、20℃
で５分インキュベートした。３μｌの0.5M EDTAを添加
して反応を停止させ、250μｌの２％酢酸カリウムエタ
ノール溶液を添加することによりDNAを沈殿させた。10
％ポリアクリルアミドシークエンシングゲル中で電気泳
動し、オートラジオグラフィーにより放射標識DNAバン
ドを可視化することによりDNAを分析した。
標的プラスミドは適当なオリゴヌクレオチドをpUC19
内へクローニングすることにより調製された。標的
A10：オリゴヌクレオチドGATCCA10GおよびGATCCT10GをB
amHI部位内へクローン化した（プラスミドはpT10と称さ
れた）。標的A5GA4：オリゴヌクレオチドTCGACT4CT5Gお
よひTCGACA5GA4GをSalＩ部位内へクローン化した（プラ
スミドpT9C）。標的A2GA2GA4：オリゴヌクレオチドGA2G
A2GA4TGCAおよびGT4CT2CT2CTGCAをPstＩ部位内へクロー
ン化した（プラスミドpT8C2）。ゲル中の標的の位置は
左の棒線により示されている。A/Gは標的P10のＡ＋Ｇ配
列ラダーである。
実施例65 PNAによる制限酵素切断の阻害（図23） プラスミドpT10の２μｇを20μのTE緩衝液（10mMトリ
ス−HCl,1mM EDTA,pH7.4）に溶解した指定された量のP
NA−T10と混合し、37℃で120分インキュベートした。２
μl10×緩衝液（10mMトリス−HCl,pH7.5,10mM MgC
l2,50mM NaCl,1mM DTT）。PvuII（２単位）およびBam
HI（２単位）を加え、インキュベーションを60分間続け
た。DNAは５％ポリアクリルアミド中のゲル電気泳動に
より分析され、DNAはエチジウムブロミド染色により可
視化された。
実施例66 PNA−T10の動力学−dsDNA鎖置換複合体形成（図21） 100μｌの緩衝液（200mM NaCl,50mM酢酸ナトリウム,
pH4.5,1mM ZnSO4）に溶解した200cpsのpT10の32P標識E
coRI−PvuII断片（EcoRI部位の３′末端が標識されたラ
ージフラグメント）、0.5μｇの担体ウシ胸腺DNAおよび
300ngのPNA−T10−LysNH2の混合物を37℃でインキュベ
ートした。指定された時間の50UのS1ヌクレアーゼを７
つの試料に各々加え、インキュベーションを20℃で５分
続けた。次に250μｌの２％酢酸カリウムのエタノール
溶液を添加することによりDNAを沈殿させ、10％ポリア
クリルアミドシ−クエンシングゲル中での電気泳動によ
り分析した。鎖置換複合体の量は、オートラジオグラフ
の光学密度計測スキャンニングにより測定した標的配列
でのS1−切断の強度から計算された。
実施例67 PNA−dsDNA複合体の安定性（図22） 200cps32P−pT10断片、0.5μｇウシ胸腺DNAおよび300
ngの所望のPNA（T10−LysNH2，T8−LysNH2またはT6−Ly
sNH2）を100μｌの緩衝液（200mM NaCl,50mM酢酸ナト
リウム,pH4.5,1mM ZnSO4）中37℃で60分インキュベー
トした。２μｇのオリゴヌクレオチドGATCCA10Gを加
え、各々の試料を指定された温度で10分間加熱し、氷中
で10分間冷却した後20℃に暖めた。50UのS1ヌクレアー
ゼを加え、試料を処理、分析し、結果を定量化した。
実施例68 PNAによる転写阻害 15μｌの10mMトリス−HCl,1mM EDTA,pH7.4中、100ng
のプラスミドDNA（制限酵素PvuIIで切断されている、下
記参照）および100ngのPNAを37℃で60分インキュベート
した。続いて４μｌの５×濃縮緩衝液（0.2Mトリス−HC
l（pH8.0）,40mM MgCl2,10mMスペルミジン、125mM Na
Cl）を１μｌのNTP混合物（10mM ATP,10mM CTP,10mM
GTP、1mM UTP,0.1μCi/μｌ、32P−UTP,5mM DTT,2
μg/ml tRNA,1μg/mlヘパリン）および３単位のRNAポ
リメラーゼと混合した。インキュベーションを37℃で10
分間続けた。次に−20℃で60μｌの２％酢酸カリウムを
含む96％エタノールを添加してRNAを沈殿させ、８％ポ
リアクリルアミドシークエンシングゲル中での電気泳動
により分析した。RNA転写体はオートラジオグラフィー
により可視化した。次のプラスミドが使用された:pT8C2
−KS/pA8G2−KS:オリゴヌクレオチドGA2GA2GA4GTGACお
よびGT4CT2CT2CTGCAがｐブルースクリプトーKS+のPstＩ
部位内へのクローン化された;pT10−KS/pA10−KS（両方
の配向の挿入体が得られた）。pT10UV5:オリゴヌクレオ
チドGATCCA10GおよびGATCCT10Gが、LacUV5大腸菌プロモ
ーターがEcoRI部位にクローン化されているpUC18誘導体
（Jeppesen et al., Nucleic Acids Res., 1988, 16, 9
545）のBamHI部位内へクローン化された。
T3−RNAポリメラーゼを用いると、転写延長停止は鋳
型鎖上にPNA認識配列を持つPNA−T8C2−LysNH2およびpA
8G2−KSプラスミドでは得られたが、非鋳型鎖上にPNA認
識配列を持つpT8C2−K2では得られなかった。同様の結
果がPNA−T10−LysNH2およびプラスミドpA10−KSおよび
pT10−KSで得られた（図25参照）。大腸菌RNAポリメラ
ーゼおよびpT10UV5プラスミド（鋳型鎖上にA10配列）を
用いると、転写延長停止はPNA−T10−LysNH2で得られ
た。
実施例69 PNAの生物活性 40μｌの50mMトリス−HCl、pH7.4中、PNA−T5（10μ
ｇ）および対照の“正常”ペプチド（10μｇ）の混合物
を種々の量のブタ腸粘膜からのペプチダーゼまたはスト
レプトマイセスケスピトスス（Streptomyces caespitos
us）からのプロテアーゼで10分間37℃にて処理した。PN
Aおよびペプチドの量はHPLC分析により決定された（逆
相Ｃ−18カラム:0〜〜60％アセトニトリル、0.1％トリ
フルオロ酢酸）。ペプチドの完全な分解が観察された
（HPLCでピークなし）ペプチダーゼ／プロテアーゼ濃度
でもPNAはまた無傷であった。
実施例70 遺伝子発現阻害 パピローマウイルスのE2mRNAの発現を阻害するペプチ
ド核酸の能力を試験する好適なアッセイはよく知られて
いるE2のトランス活性化の性質に基づいている。Spalho
ltz, et al., J. Virol., 1987, 61, 2128−2137。レポ
ータープラスミド（E2RECAT）はE2依存エンハンサーと
して機能するE2応答性要素を含むように作製された。E2
RECATはまたSV40初期プロモーター、初期ポリアデニル
化信号およびクロラムフェニルコールアセチルトランス
フェラーゼ遺伝子（CAT）も含んでいる。このプラスミ
ドとの関係内においてはCAT発現はE2の発現に依存して
いる。E2依存に依存するCAT発現かBPV−１で形質転換さ
れたC127細胞中へのこのレプラスミドのトランスフェク
ション、非感染C127細胞およびE2RECATおよびE2発現ベ
クターで同時トランスフェクトされたC127細胞で試験さ
れた。
A.BPV−１ E2発現阻害 BPV−１形質転換C127細胞を12ウェルプレートにま
く。E2RE1によるトランスフェクションの24時間前に、
5,15および30mMの最終濃度になるように増殖培地にアン
チセンスPNAを添加することにより細胞を前処理した。
次の日、リン酸カルシウム沈殿により10μｇのE2RE1CAT
で細胞をトランスフェクトした。10マイクログラムのE2
RE1CATおよび10μｇの担体DNA（PUC19）を62μｌの2M
CaCl2と混合し250μｌのH2Oの最終容量とし、続いて250
μｌの２×HBSP（1.5mM Na2PO2,10mM KCl,280mM NaC
l,12mMグルコースおよび50mMHEPES,pH7.0）を加え、室
温で30分インキュベートした。この溶液の100マイクロ
リットルを各々の試験ウェルに加え、37℃で４時間イン
キュベートした。インキュベート後、15％のグリセロー
ルを含む0.75mMNa2PO2,5mM KCl,140mM NaCl,6mMグル
コースおよび25mM HEPES,pH7.0で細胞にグリセロール
衝撃を１分間与えた。衝撃を与えた後、細胞を２回血清
を含まないDMEMで洗浄し、再び10％ウシ胎児血清および
本来の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むDM
EMを与えた。48時間後、細胞を採取し、CAT活性を検定
した。
CAT活性決定のため、細胞を２回リン酸緩衝化塩溶液
で洗浄し、こすり取ることにより集めた。細胞は100μ
ｌの250mMトリス−HCl,pH8.0に再懸濁させ、３回の凍結
融解により破壊した。各々のアッセイに24マイクロリッ
トルの細胞抽出液が使用された。各々のアッセイのため
以下のものが1.5mlのエッペンドルフチューブ中に一緒
に混合され、37℃で１時間インキュベートされた:25μ
の細胞抽出液、５μｌの4mMアセチル補酵素Ａ、18μｌ
のH2Oおよび１μｌの14C−クロラムフェニコール、40〜
60mCi/mM。インキュベーション後、クロラムフェニコー
ル（アセチル化および非アセチル化形）が酢酸エチルで
抽出され、蒸発乾固された。試料を25μｌの酢酸エチル
中に再懸濁し、TLCリプレート上にスポットされ、クロ
ロホルム：メタノール（19:1）でクロマトグラフィーを
行った。クロマトグラフはオートラジオグラフィーによ
り分析された。アセチル化および非アセチル化14C−ク
ロラムフェニコールに対応するスポットをTLCプレート
から切り出し、CAT活性の定量のため液体シンチレーシ
ョンにより計数した。ペプチド核酸はCAT活性を用量依
存様式で制御し、陽性と考えられた。
B.HPV E2発現阻害 ペプチド核酸によるヒトパピローマウイルス（HPV）E
2の阻害のためのアッセイはBPV−１ E2の方法と本質的
に同じである。HPVアッセイのため、上記のリン酸カル
シウム法を用いて、HPVはPSV2NEOとCV−１またはA431細
胞内へ同時にトランスフェクトされた。DNAを組込んだ
細胞は抗生物質G418を含む培地中で培養して選択した。
G418耐性細胞は続いてHPV DNAおよびRNAが分析され
た。E2を発現する細胞がアンチセンス研究のための標的
細胞として使用された。各々のPNAに対し細胞は上記の
ごとく前処理され、E2RE1CATでトランスフェクトされ、
上記のごとくCAT活性が分析された。CAT活性を用量依存
様式で制御できるならペプチド核酸は陽性の効果を持っ
ていると考えられた。
実施例71 天然に存在する核酸塩基を含有するPNA15−merの合成； Ｈ−〔Taeg〕−〔Aaeg〕−〔Gaeg〕−〔Taeg〕−〔Tae
g〕−〔Aaeg〕−〔Taeg〕−〔Caeg〕−〔Taeg〕−〔Cae
g〕−〔Taeg〕−〔Aaeg〕−〔Taeg〕−〔Caeg〕−〔Tae
g〕−LYS−NH2。
保護PNAが約0.145ミリモル/gの置換でBoc−Lys（Cl
Z）修飾MBHA樹脂に組入れられた。未反応アミノ基のキ
ャッピングはBocGaeg−OHモノマーの取り込み前にのみ
実施された。
合成はDCMで一夜前もって膨潤されている100mg（乾燥
重量）の中和Boc−Lys（ClZ）−MBHA樹脂上で開始され
た。モノマーの取り込みは実施例32のプロトコールに従
ったが、ただしBocAaeg−OHモノマーの取り込みのため
の工程５は除外される。本合成のための工程５では、４
当量のジイソプロルカルボジイミド（0.06ミリモル;9.7
μｌ）および0.6mlのDCM/DMF（1:1,v/v）に溶解した４
当量のBocAaeg−OH（0.06ミリモル;32mg）が添加された
（モノマーの最終濃度0.1M）。カップリング反応は１×
15分および１×60分（再カップリング）進行させた。
すべての定性的Kaiser試験は陰性であった（淡黄色、
ビーズの着色なし）。PNA−オリゴマーは常法により切
断および精製された。
FAB−MS平均質量実測値（計算値）（Ｍ＋Ｈ）+ 4145.1（4146.1）。
実施例72 Ｈ−TAGTTATCTCTATCT−LysNH2のハイブリダイゼーショ
ン pH7.2から9.0にかわってもTmの損失がほとんどないと
いうことはフーグスティーン型塩基対形成が含まれてい
ないことを示している。平行配向に対し7.2から５へい
くとTmの増加が大きく、多分2:1複合体の形成のためで
ある。ワトソン−クリック結合モチーフ中の最も好まし
い配向は３′/N配向であり、フーグスティーンモチーフ
中では５′/N配向が最も安定であると信じられている。
従って、最も安定な複合体は２つのPNA鎖が逆平行であ
る場合であろう。
フーグスティーン鎖の平行配向に対する非常に強い優
先性が明らかである。このことはpH9でさえも５′／配
向の2:1複合体が観察されることで説明されるであろ
う。さらに、pHが7.2から９へいくと３′/Nが少量減る
ことも説明している（これは多分1:1複合体であるの
で）。
実施例73 Ｈ−〔Taeg〕2−Aaeg−Taeg−Caeg−Aaeg−Taeg−Caeg
−Taeg−Caeg−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕2−Ａ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）a
eg−Ａ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）
aeg−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の段階的作製 約1gの湿潤Boc−Lys（ClZ）−MBHA（0.28ミリモル L
ys/g）樹脂を5mlのSPPS反応容器に入れた。Boc−〔Tae
g〕2−Ａ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Ａ（Ｚ）aeg
−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Lys（ClZ）
−MBHA樹脂は、2.0mlの50％DMF/CH2Cl2中の0.16MのBocC
（Ｚ）−OH,BocTaeg−OHまたはBocA（Ｚ）aeg−OHと共
に0.16MのDCCを利用する最初の５つの残基の原位置DCC
カップリング（“合成プロトコール9"）により、および
最後の５つの残基の類似の原位置DICカップリング
（“合成プロトコール10"）により組立てられた。各々
のカップリング反応は総計で20〜24時間振とうして進行
させた。合成はニンヒドリン反応によりモニターされ、
最初のＡ（Ｚ）aeg残基を除く（２回カップリングしな
ければならなかった）すべての残基の取り込みはほとん
ど定量的であったことを示した。全カップリング収率は
約96％であった（最初のカップリング、約89％の効
率）。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕2−Aaeg−Taeg−Caeg−Aaeg−Taeg
−Caeg−Taeg−Caeg−Lys−NH2の切断、精製および同定 保護Boc−〔Taeg〕2−Ａ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）a
eg−Ａ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）
aeg−Lys（ClZ）−MBHA樹脂が実施例17cに記載したごと
く処理され、166.1mgの乾燥、Boc−〔Taeg〕2−Ａ
（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Ａ（Ｚ）aeg−Taeg−
Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Lys（ClZ）−MBHA樹
脂のHF切断により約53.4mgの粗物質を得た。粗物質（5
3.4mg）を精製すると18.3mgのＨ−〔Taeg〕2−Aaeg−Ta
eg−Caeg−Aaeg−Taeg−Caeg−Taeg−Caeg−Lys−NH2が
得られた。（Ｍ＋Ｈ）+として、計算m/z値＝2780.17お
よび実測m/z値＝2780.07。
実施例74 Ｈ−TTATCATCTC−Lys−NH2のハイブリダイゼーションの
性質 表記化合物が以下のオリゴヌクレオチドとハイブリダ
イズされた： 実施例75 ２つの平行な一連の塩基が一緒に結び合わされたPNAの
合成 MBHA樹脂（装填0.6ミリモル/g）の375mgをジクロロメ
タン（DCM）中で一夜膨潤させた。DMF/DCM中で１時間
後、５％ジイソプロピルエルチアミンのDCM溶液で２回
洗浄（２分）することにより樹脂を中和し、続けてDCM
で洗浄した（2ml:6×１分）。2mlのDMFに溶解したN,N′
−ジ−Boc−アミノエチルグリシン（41.9mg;0.132ミリ
モル）を樹脂に加え、続けて1mlのDCMに溶解したDCC（6
4.9mg;0.315ミリモル）を加えた。2.5時間後、樹脂をDM
Fで３回（１分）およびDCMで１回（１分）洗浄した。未
反応のアミノ基は無水酢酸/DCM/ピリジン（1ml/2ml/2m
l）で72時間処理することによりキャッピングした。DCM
で洗浄後、（2ml;4×１分）、Kaiser試験はアミノ基が
存在しないことを示した。樹脂は前記のごとく脱保護さ
れ洗浄された。続いてDMF/DCM 1:1（4ml）に溶解した
６−（Bocアミノ）−ヘキサン酸DHBTエステル（255.8m
g:67ミリモル）と一夜反応させた。洗浄および中和後、
Kaiser試験およびイサチン試験が実施された。両方とも
陰性であった。キャッピング後、DCCカップリングのた
めの常法に従ってPNA鎖の伸長が実施された。カップリ
ング反応後に実施されたすべてのKaiser試験は陰性であ
った（黄色）。PNAユニット番号1,2,4および６の脱保護
後に定性的Kaiser試験が行われた。各々の試験は青色で
あった。PNAオリゴマーは常法により切断および精製さ
れた。
各々のカップリングに使用されたモノマーおよびDCC
の量は以下のようであった（総容量4.5ml）： 構造式（70）（式中R70＝T6）を持つPNAに対しては2
4.5mgの粗生成物が得られ、精製後は6.9mgとなった。R1
＝T8であるPNAに対しては28.8mgの粗生成物が得られ精
製後は2.8mgとなった。1mg/ml以上の濃度で室温で数時
間後の複雑なHPLCクロマトグラムにより示されるごと
く、生成物は会合する高い傾向を持っていた。PNA−
(T6)2およびPNA−(T8)2各々(dA)6および(dA)8とハイブ
リダイズされ各々42℃および59℃のTmが記録された。
実施例76 Ｈ−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の固相合成 PNAオリゴマーがDCMで一夜前もって膨潤されている50
0mg（乾燥重量）のMBHA樹脂上に組立てられた。定量的
ニンヒドリン反応により決定されたごとく樹脂は最初に
約0.15ミリモル/g Boc−Lys（ClZ）で置換されてい
た。オリゴマーの段階的合成は、各々のカップリングに
2.0mlの50％DMF/CH2Cl2に溶解した0.077g（0.2ミリモ
ル）にBocTaeg−OHおよび31.3μｌ（0.2ミリモル）のジ
イソプロピルカルボジイミドを用いて実施例32に記載し
た合成プロトコールに従った。各々の工程の脱保護前に
未反応アミノ基のキャッピングが実施された。すべての
Kaiser試験は陰性であり100％近いカップリング収率を
示している。
実施例77 Ｈ−〔Taeg〕4−〔apgT〕−〔Taeg〕5−Lys−NH2の固相
合成 合成は実施例76からの湿潤Ｈ−〔Taeg〕5−Lys（Cl
Z）−MBHAの約1/4を用いて開始された。Boc−（apgT）
−OHおよびBocTaeg−OH両方の原位置ジイソプロピルカ
ルボジイミド（DIC）カップリングは1.2mlの50％DMF/CH
2Cl2中、各々0.048g（0.12ミリモル）および0.046g（0.
12ミリモル）モノマーおよび18.7μｌ（0.12ミリモル）
のジイソプロピルカルボジイミドを各々のカップリング
に用いて実施された。すべての定性的Kaiser試験は陰性
であり、100％近いカップリング収率を示している。PNA
オリゴマーは常法により切断および精製された。(M+H)+
として、計算m/z値は2820.15であり、実測m/z値は2820.
92であった。
実施例78 Ｈ−〔Taeg〕4−〔proT〕−〔Taeg〕5−LysNH2の固相合
成 合成は実施例76からの湿潤Ｈ−〔Taeg〕5−Lys（Cl
Z）−MBHA樹脂の約1/4を用いて開始された。BocTaeg−O
Hの原位置ジイソプロピルカルボジイミドカップリング
は1.2mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.046g（0.12ミリモル）
のモノマーおよび18.7μｌ（0.12ミリモル）のジイソプ
ロピルカルボジイミドを各々のカップリングに用いて実
施された。溶解性の問題のため、Boc−（proT）−OH0.0
48g（0.12ミリモル）はカップリングに先立って2.5mlの
50％DMF/DMSOに懸濁し、懸濁液を濾過し、約2mlの濾過
液を終夜のカップリングに使用した。
すべての定性的Kaiser試験は陰性であり、100％近い
カップリング収率を示した。PNAオリゴマーは常法によ
り切断および精製された。
実施例79 Ｈ−〔Taeg〕4−〔proT〕−〔Taeg〕5−Lys−NH2のハイ
ブリダイゼーションの性質 実施例80 Ｈ−〔Taeg〕4−〔bc〕−〔Taeg〕5Lys−NH2の固相合成 PNAオリゴマーはDCMで一夜前もって膨潤させた100mg
（乾燥重量）のMBHA樹脂上で組立てられた。樹脂は始め
に約0.25ミリモル/gのBoc−Lys（ClZ）で置換されてい
るのが定量的ニンヒドリン反応により決定されている。
オリゴマー段階的合成は、0.023g（0.06ミリモル）のBo
cTaeg−OH、0.062gのBocbc（Ｚ）−OHおよび0.012g（0.
06ミリモル）のDCCの50％DMF/CH2Cl2溶液（1.2ml）を各
々のカップリングに用いる合成プロトコール９に従っ
た。未反応アミノ基のキャッピングは各々の工程の脱保
護前に実施された。すべての定性的Kaiser試験は陰性で
あり、100％近いカップリング収率を示した。PNA−オリ
ゴマーは常法により切断および精製された。
実施例81 Ｈ−T4bcT5−Lys−NH2のハイブリダイゼーションの性質 実施例82 Ｈ−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Aae
g〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Tae
g〕−Lys−NH2の段階的組立て 合成はDCMで一夜前もって膨潤させてあるBoc−〔Tae
g〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂（実施例76から）上で開始
された。この樹脂は約100mg（乾燥重量）のBoc−Lys（C
lZ）−MBHA樹脂（装填0.15ミリモル/g）と似ていた。モ
ノマーの取り込みは工程５（BocA（Ｚ）aeg−OHモノマ
ーの取り込みを除いて実施例55のプロトコールに従っ
た。新工程５（Ａ（Ｚ）aegの取り込み）には、0.6mlの
DCM/DMF（1:1,v/v）に溶解された４当量のジイソプロピ
ルカルボジイミド（0.06ミリモル;9.7μｌ）および４当
量のBocA（Ｚ）aeg−OH（0.06ミリモル;32mg）の添加
（モノマーの最終濃度0.1M）が含まれていた。カップリ
ング反応は１×15分および１×60分（再カップリング）
進行させた。
未反応アミノ基のキャッピングはBocA（Ｚ）aeg−OH
モノマーの取り込みの前にのみ実施された。カップリン
グ反応は定性的ニンヒドリン反応（Kaiser試験）により
モニターされた。すべてのKaiser試験は陰性であった
（淡黄色でビーズの着色はなかった）。PNAオリゴマー
は常法により切断および精製された。
実施例84 Ｈ−T4AT5−LysNH2のハイブリダイゼーションの性質 実施例85 Ｈ−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Gae
g〕−〔Gaeg〕−〔Taeg〕−〔Gaeg〕−〔Taeg〕−〔Gae
g〕−Lys−NH2の段階的組立て 保護PNAが0.15ミリモル/gの置換を持つBoc−Lys（Cl
Z）修飾MBHA樹脂上に組み立てられた。モノマーの取り
込みは実施例32のプロトコールに従ったがキャッピング
工程11および洗浄工程12は省略された。第1,第２および
第４のＧ（Bzl）aeg−モノマーの取り込みおよび脱保護
後に樹脂を適当に膨潤させる点でいくつかの難点があっ
た。DCM中で３時間振とうすることで受け入れられる膨
潤を得た。残基Taeg−4,G（Bzl）aeg−６およびTaeg−
７からTaeg−10の取り込みでは定量的に近いカップリン
グ収率を得るには再カップリングが必要であった。Taeg
4（２×50％DMF/DCM中）、Gaeg6（２×50％DMF−DCM
中）、Taeg7（２×50％DMF/DCM中、１×50％NMP/DCM中
および１×DCM中）、Taeg8（１×50％DMF/DCM中および
２×DCM中）、Taeg9（２×50％DMF/DCM中）、Taeg
10（２×50％DMF/DCM中）。すべての定性的Kaiser試験
は陰性であった（淡黄色、ビーズの着色なし）。PNAオ
リゴマーは常法により切断および精製された。
実施例86 粗（約50％）Ｈ−T4G2TGTG−LysNH2のハイブリダイゼー
ションの性質 実施例87 Ｈ−〔Taeg〕6−Lys−NH2,H−〔Taeg〕7−Lys−NH2,H−
〔Taeg〕8−Lys−NH2,H−〔Taeg〕9−Lys−NH2，および
Ｈ−〔Taeg〕10−Lys−NH2の大規模固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂および
より短い断片の段階的組立て 約9gの湿潤Boc−〔Taeg〕3−Lys（ClZ）−MBHA（実施
例19b参照）を60mlのSPPS反応容器に入れた。Boc−〔Ta
eg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は10mlのCH2Cl2中0.15Mの
Boc−Taeg−OPfpと両方の残基の単カップリングにより
組立てられた（“合成プロトコール8"）。両方のカップ
リング反応とも一夜進行させた。合成はニンヒドリン反
応によりモニターされ、両方の残基の定量的に近い取り
込みを示した。Ｎ末端Boc基の脱保護後、約4.5gのＨ−
〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHAを20mlのSPPS反応容器に
入れ、7.5mlのCH2Cl2中、0.2MのBocTaeg−OHならびに0.
2MのDCCと一夜おくすべての残基（ほとんど定量的、た
だし残基番号８を除く）の単原位置DCCカップリングに
よりBoc−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）−MBHAへ伸長させた
（“合成プロトコール9"）。Taeg残基７番および８番の
カップリング前に各々Ｈ−〔Taeg〕6−Lys（ClZ）−MBH
AおよびＨ−〔Taeg〕7−Lys（ClZ）−MBHAの一部をHF切
断のために取り出した。
Taeg残基番号８番は２度カップリングすると（一夜）
定量的に近い取り込みを与えた。Ｎ末端Boc基の脱保護
後、Ｈ−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）−MBHAの大部分がHF切
断のために取り出された。Boc−〔Taeg〕10−Lys（Cl
Z）−MBHAは2.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.16MのBocTaeg
−OH（0.16MのDCCと共に）の２回の原位置DCCカップリ
ングにより組立てられた（“合成プロトコール9"）。最
後の残基のカップリングの前に、Ｈ−〔Taeg〕9−Lys
（ClZ）−MBHAを少量HF切断のために取り出した。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕6−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護Boc−〔Taeg〕6−Lys（ClZ）−MBHA樹脂が実施例
17cのごとく処理され、52.4mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕6−Ly
s（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約14.0mgの粗物質を
得た。粗生成物は精製されなかった（約99％の純度）。
（ｃ）Ｈ−〔Taeg〕7−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護Boc−〔Taeg〕7−Lys（ClZ）−MBHA樹脂が実施例
17cのごとく処理され、52.4mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕7−Ly
s（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約5.2mgの粗物質を
得た。
（ｄ）Ｈ−〔Taeg〕8−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護Boc−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）−MBHA樹脂が実施例
17cのごとく処理され、約604mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕8−L
ys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約114mgの粗物質を
得た。
（ｅ）Ｈ−〔Taeg〕9−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護Boc−〔Taeg〕9−Lys（ClZ）−MBHA樹脂が実施例
17cのごとく処理され、81.0mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕9−Ly
s（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約19.3mgの粗物質を
得た。
（ｆ）Ｈ−〔Taeg〕10−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護Boc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂が実施
例17cに記載したごとく処理され、約417mgの乾燥Ｈ−
〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂から約141mgの粗物
質を得た。
（ｇ）合成プロトコール８（一般的プロトコール） （１）TFA/CH2Cl2（1:1,v/v）によるBoc脱保護、３×
１分および×30分；（２）CH2Cl2による洗浄、６×１
分；（３）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による中和、３×
２分；（４）CH2Cl2による洗浄６×１分、および脱溶媒
１分；（５）合成のいくつかの段階において置換を決定
するためのニンヒドリン分析のため、PNA樹脂試料２〜5
mgを取り出し、十分に乾燥；（６）Boc保護PNAモノマー
（Pfpエステル）の添加；カップリング反応は総計でＸ
時間振とうすることにより進行させた；（７）DMFによ
る洗浄、１×２分；（８）CH2Cl2による洗浄、４×１
分；（９）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による中和、２×
２分；（10）CH2Cl2により洗浄、６×１分；（11）時
折、カップリングの程度を決定するためのニンヒドリン
分析のため、保護PNA樹脂の試料２〜5mgを取り出し十分
に乾燥；（12）合成のいくつかの段階で無水酢酸／ピリ
ジン／CH2Cl2（1:1:2,v/v/v）の混合物で２時間アセチ
ル化することにより未反応アミノ基を塞ぎ、続いてCH2C
l2により洗浄、６×１分、および時折ニンヒドリン分
析。
実施例88 Ｈ−〔Taeg〕4−Caeg−〔Taeg〕5−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕4−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys
（ClZ）−MBHA樹脂の段階的組立て 約1gの湿潤Boc−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂を
5mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−〔Taeg〕4−Ｃ
（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は2.0ml
の50％DMF/CH2Cl2中、0.16M DCCと共に0.16MのBocC
（Ｚ）aeg−OHまたは2.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.16M
DCCと共に0.16MのBocTaeg−OHを利用するすべての残
基の原位置DCCカップリングにより組立てた（“合成プ
ロトコール9"）。各々のカップリング反応は総計で20〜
24時間振とうして進行させた。合成はニンヒドリン反応
によりモニターされ、Ｃ（Ｚ）aegの取り込みは約98％
およびすべてのTaeg残基の取り込みは定量的に近いこと
が示された。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕4−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys−
NH2の切断、精製および同定 保護Boc−〔Taeg〕4−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys
（ClZ）−MBHA樹脂が実施例17cに記載したごとく処理さ
れ、128.2mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕4−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Tae
g〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約22.5mgの
粗物質を得た。粗物質（5.8mg）を精製すると3.1mgのＨ
−〔Taeg〕4−Caeg−〔Taeg〕5−Lys−NH2を得た。
（ｃ）合成プロトコール９（一般的プロトコール） （１）TFA/CH2Cl2（1:1,v/v）によるBoc脱保護、３×
１分および１×30分；（２）CH2Cl2による洗浄、６×１
分；（３）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による中和、３×
２分；（４）CH2Cl2による洗浄、６×１分および脱溶
媒、１分；（５）合成のいくつかの段階で、置換の決定
のためのニンヒドリン分析のためPNA樹脂の試料２〜5mg
の取り出し十分に乾燥；（６）XmlのDMFに溶解したBoc
−保護PNAモノマー（遊離酸）の添加、続いてXmlのCH2C
l2に溶解したDCCの添加；カップリング反応は総計でＹ
時間振とうすることにより進行させた；（７）DMFによ
る洗浄、１×２分；（８）CH2Cl2による洗浄、４×１
分；（９）DIEA/CH2Cl2（1:19,v/v）による中和、２×
２分；（10）CH2Cl2による洗浄、６×１分；（11）時
折、カップリングの程度を決定するためのニンヒドリン
分析のため保護PNA樹脂試料の２〜5mgを取り出し、十分
に乾燥；（12）合成のいくつかの段階で、無水酢酸／ピ
リジン／CH2Cl2（1:1:2,v/v/v）の混合物による２時間
のアセチル化により未反応アミノ基を塞ぎ、続いてCH2C
l2により洗浄、６×１分、および時折ニンヒドリン分
析。
実施例89 Ｈ−〔Taeg〕4−（NBaeg）−〔Taeg〕5−Lys−NH2の固
相合成（NB＝COCH3） （ａ）Boc−〔Taeg〕4−（NBaeg）−〔Taeg〕5−Lys（C
lZ）−MBHA樹脂の段階的組立て 約1gの湿潤Boc−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂を
5mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−〔Taeg〕4−（NBae
g）−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は2.0mlのCH2Cl
2に溶解した0.16M Boc（NBaeg）−OHならびに0.16M D
CCまたは2.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.16M BocTaeg−O
Hと共に、0.16M DCCを利用する原位置DCCカップリング
により組立てられた（“合成プロトコール9"）。各々の
カップリング反応は振とうしながら総計で20〜24時間進
行させた。NBaeg残基は３回結合され、Taeg残基はすべ
て１回結合された。合成はニンヒドリン反応によりモニ
ターされ、＞99％のNBaegの総計の取り込み（最初のカ
ップリング後は約88％および２回目のカップリング後は
約93％）およびすべてのTaeg残基のほとんど定量的取り
込みが示された。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕4−（NBaeg）−〔Taeg〕5−Lys−NH
2の切断、精製および同定 保護されたBoc−〔Taeg〕4−（NBaeg）−〔Taeg〕5−
Lys（ClZ）−MBHA樹脂を実施例17cに記載のごとく処理
し、108.9mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕4−（NBaeg）−〔Tae
g〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約33.6mgの
粗物質を得た。粗生成物（20.6mg）を精製して4.6mgの
Ｈ−〔Taeg〕4−（NBaeg）−〔Taeg〕5−Lys−NH2を得
た。(M+H)+として、計算m/z値は2683.12であり、実測m/
z値は2683.09であった。
実施例90 Ｈ−〔Taeg〕4−aeg−〔Taeg〕5−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕4−aeg−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−
MBHA樹脂の段階的組立て 約1gの湿ったBoc−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
を5mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−〔Taeg〕4−aeg−
〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は（１）2.0mlの50％
DMF/CH2Cl2中、0.16M Bocaeg−OHと共に0.16M DCC
を、または（２）2.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.16MBocT
aeg−OHと共に0.16M DCCを利用するすべての残基の原
位置DCC単カップリングにより組立てられた（“合成プ
ロトコール9"）。各々のカップリング反応は振とうしな
がら総計で20〜24時間進行させた。合成はニンヒドリン
反応によりモニターされ、すべての残基の取り込みが定
量的に近いことが示された。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕4−aeg−〔Taeg〕5−Lys−NH2の切
断、精製および同定 保護されたBoc−〔Taeg〕4−aeg−〔Taeg〕5−Lys（C
lZ）−MBHA樹脂が実施例17cに記載したように処理さ
れ、126.0mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕4−aeg−〔Taeg〕5−Ly
s（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約22.2mgの粗物質を
得た。粗生成物（22.2mg）を精製して、7.6mgのＨ−〔T
aeg〕4−aeg−〔Taeg〕5−Lys−NH2を得た。(M+H)+に対
し計算m/z値は2641.11であり、実測m/z値は2641.16であ
った。
実施例91 Ｈ−〔Taeg〕4−Gly−〔Taeg〕5−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕4−Gly−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−
MBHA樹脂の段階的組立て 約1gの湿潤Boc−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂を
5mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−〔Taeg〕4−Gly−
〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は（１）2.0mlの50％
DMF/CH2Cl2中、0.16M BocGly−OHと共に0.16M DCC
を、または（２）2.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.16MのBo
cTaeg−OHと共に0.16M DCCを利用するすべての残基の
原位置DCC単カップリングにより組立てられた（“合成
プロトコール9"）。各々のカップリング反応は振とうし
ながら総計で20〜24時間進行させた。合成はニンヒドリ
ン反応によりモニターされ、すべて残基の取り込みが定
量的に近いことが示された。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕4−Gly−〔Taeg〕5−Lys−NH2の切
断、精製および同定 保護されたBoc−〔Taeg〕4−Gly−〔Taeg〕5−Lys−
（ClZ）−MBHA樹脂が実施例18cに記載したごとく処理さ
れ、124.1mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕4−Gly−〔Taeg〕5−Ly
s−（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約45.0mgの粗物質
の得た。粗生成物（40.4mg）を精製して、8.2mgのＨ−
〔Taeg〕4−Gly−〔Taeg〕5−Lys−NH2を得た。
実施例92 Ｈ−〔Taeg〕4−Gly2−〔Taeg〕5−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕4−Gly2−〔Taeg〕2−Lys（ClZ）
−MBHA樹脂の段階的組立て 約1gの湿潤Boc−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂を
5mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−〔Taeg〕4−〔Ｃ
（Ｚ）aeg〕2−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg
−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は（１）20mlの50％DMF/CH2Cl2
中、0.16MBocGly−OHと共に0.16M DCCを、または
（２）2.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.16M BocTaeg−OH
と共に0.16M DCCを利用するすべての残基の原位置DCC
単カップリングにより組立てられた（“合成プロトコー
ル9"）。各々のカップリング反応は振とうしながら総計
で20〜24時間進行させた。合成はニンヒドリン反応によ
りモニターされ、すべての残基の取り込みが定量的に近
いことが示された。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕4−Gly2−〔Taeg〕5−Lys−NH2の切
断、精製および同定 保護されたBoc−〔Taeg〕4−Gly2−〔Taeg〕5−Lys
（ClZ）−MBHA樹脂が実施例17cに記載のごとく処理さ
れ、156.6mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕4−Gly2−〔Taeg〕5−L
ys−（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約32.6mgの粗物
質を得た。粗生成物（30mg）を精製して、7.8mgのＨ−
〔Taeg〕4−Gly2−〔Taeg〕5−Lys−NH2を得た。(M+H)+
に対し計算m/z値は2655.09であり実測m/z値は2655.37で
あった。
実施例93 Ｈ−〔Taeg〕4−〔Caeg〕2−Taeg−Caeg−Taeg−Caeg−
Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕4−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Taeg−Ｃ
（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
の段階的組立て 約1.5gの湿潤Boc−Lys（ClZ）−MBHA（0.28ミリモルL
ys/g）樹脂を5mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−〔Tae
g〕4−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−
Ｃ（Ｚ）aeg−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は（１）2.0mlの50
％DMF/CH2Cl2中、0.16MのBocC（Ｚ）−OHと共に0.16M
DCCを、または（２）2.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.16M
BocTaeg−OHと共に0.16M DCCを利用するすべての残
基の原位置DCC単カップリングにより組立てられた
（“合成プロトコール9"）。各々のカップリング反応は
振とうしながら総計で20〜24時間進行させた。合成はニ
ンヒドリン反応によりモニターされ、すべての残基の取
り込みが定量的に近いことが示された。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕4−〔Caeg〕2−Taeg−Caeg−Taeg−
Caeg−Lys−NH2の切断、精製および同定 保護されたBoc−〔Taeg〕4−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Taeg
−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Lys（ClZ）−MBHA
樹脂が実施例17cに記載したごとく処理され、216.7mgの
乾燥Ｈ−〔Taeg〕4−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Taeg−Ｃ
（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
のHF切断により約52.1mgの粗物質を得た。粗生成物（3
0.6mg）を精製して6.2mgのＨ−〔Taeg〕4−〔Caeg〕2−
Taeg−Caeg−Taeg−Caeg−Lys−NH2を得た。(M+H)+に対
し計算m/z値は2747.15であり実測m/z値は2746.78であっ
た。
実施例94 Ｈ−Caeg−Taeg−Caeg−Taeg−〔Caeg〕3−Taeg−Caeg
−Taeg−LysNH2の固相合成 （ａ）Boc−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−
〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Lys（Cl
Z）−MBHA樹脂の段階的組立て 約1.5gの湿潤Boc−Lys（ClZ）−MBHA（0.28ミリモルL
ys/g）樹脂を5mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−Ｃ
（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−〔Ｃ（Ｚ）ae
g〕3−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Lys（ClZ）−MBHA樹
脂は（１）2.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.16MのBocC
（Ｚ）−OHと共に0.16M DCCを、または（２）2.0mlの5
0％DMF/CH2Cl2中、0.16MのBocTaeg−OHと共に0.16M DC
Cを利用するすべての残基の原位置DCC単カップリングに
より組立てられた（“合成プロトコール9"）。各々のカ
ップリング反応は振とうしながら総計で20〜24時間進行
させた。合成はニンヒドリン反応によりモニターされ、
すべての残基の取り込みが定量的に近いことが示され
た。
（ｂ）Ｈ−Caeg−Taeg−Caeg−Taeg−〔Caeg〕3−Taeg
−Caeg−Taeg−Lys−NH2の切断、精製および同定 保護されたBoc−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−T
aeg−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−TaegLys
（ClZ）−MBHA樹脂が実施例17cに記載したごとく処理さ
れ、255.0mgの乾燥Ｈ−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg−Ｃ（Ｚ）ae
g−Taeg−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−Taeg
Lys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約56.1mgの粗物質
を得た。粗生成物（85.8mg）を精製して46.2mgのＨ−Ca
eg−Taeg−Caeg−Taeg−〔Caeg〕3−Taeg−Caeg−Taeg
−LysNH2を得た。(M+H)+に対し、計算m/z値は2717.15で
あり実測m/z値は2716.93であった。
実施例95 Ｈ−〔Taeg〕2−〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−〔Caeg〕2−Ly
s−NH2,H−Caeg−〔Taeg〕2−〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−
〔Caeg〕2−Lys−NH2，およびＨ−Tyr−〔Taeg〕2−〔C
aeg〕3−〔Taeg〕2−〔Caeg〕2−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2
−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂,Boc−Caeg
−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−〔Ｃ
（Ｚ）aeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂およびBoc−Tyr
（BrZ）−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−
〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の段階的組立
て 約3gの湿潤Boc−Lys（ClZ）−MBHA樹脂（0.28ミリモ
ルLys/g）樹脂を20mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−
〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）
aeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は（１）3.0mlの50％DMF
/CH2Cl2中、0.16MのBocC（Ｚ）−OHと共に0.16M DCC
を、または（２）3.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.16M Bo
cTaeg−OHと共に0.16M DCCを利用するすべての残基の
原位置DCC単カップリングにより組立てられた（“合成
プロトコール9"）。各々のカップリング反応は振とうし
ながら総計で20〜24時間進行させた。合成はニンヒドリ
ン反応によりモニターされ、すべての残基の取り込みが
定量的に近いことが示された。Ｎ末端Boc基の脱保護
後、PNA樹脂の半分はTyr（BrZ）−OHに定量的に結合さ
れ、ごく一部はもう一つのCaeg残基に定量的に結合され
た。両方のカップリングとも上記の合成プロトコールを
用いた。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕2−〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−〔Cae
g〕2−Lys−NH2の切断、精製および同定 保護されたBoc−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−〔Ta
eg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂が実
施例17cに記載したごとく処理され、182.5mgの乾燥Ｈ−
〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）
aeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約50.9mg
の粗物質を得た。粗生成物（50.9mg）を精製して13.7mg
のＨ−〔Taeg〕2−〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−〔Caeg〕2−
LysNH2を得た。(M+H)+として計算m/z値は2466.04であっ
た;m/z値は測定されなかった。
（ｃ）Ｈ−Tyr−〔Taeg〕2−〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−
〔Caeg〕2−Lys−NH2の切断、精製および同定 保護されたBoc−Try（BrZ）−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）
aeg〕3−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Lys（ClZ）−M
BHA樹脂が実施例17cに記載したごとく処理され、188.8m
gの乾燥Ｈ−Tyr（BrZ）−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3
−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹
脂のHF切断により約60.8mgの粗物質を得た。粗生成物
（60.8mg）を精製して20.7mgのＨ−Tyr−〔Taeg〕2−
〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−〔Caeg〕2−LysNH2を得た。(M+
H)+に対し、計算m/z値は2629.11であり、実測m/z値は26
29.11であった。
（ｄ）Ｈ−Caeg−〔Taeg〕2−〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−
〔Caeg〕2−Lys−NH2の切断、精製および同定 保護されたBoc−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕2−〔Ｃ
（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Lys（Cl
Z）−MBHA樹脂が実施例17cに記載したごとく処理され、
42.0mgの乾燥Ｈ−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）
aeg〕3−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−Lys（ClZ）−M
BHA樹脂のHF切断により約11.7mgの粗物質を得た。粗生
成物（11.6mg）を精製して3.1mgのＨ−Caeg−〔Taeg〕2
−〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−〔Caeg〕2−LysNH2を得た。
(M+H)+として計算m/z値は2717.15であった:m/z値は測定
されていない。
実施例96 Ｈ−〔Caeg〕2−〔Taeg〕2−〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−Ly
s−NH2,H−Taeg−〔Caeg〕2−〔Taeg〕2−〔Caeg〕3−
〔Taeg〕2−Lys−NH2，およびＨ−Tyr−〔Caeg〕2−〔T
aeg〕2−〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）
aeg〕3−〔Taeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂,Boc−Taeg
−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−
〔Taeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂およびBoc−Tyr（Br
Z）−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3
−〔Taeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の段階的組立て 約3gの湿潤Boc−Lys（ClZ）−MBHA（0.28ミリモルLys
/g）樹脂を20mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−〔Tae
g〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕
2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は（１）3.0mlの50％DMF/CH2C
l2中、0.16MのBocC（Ｚ）−OHと共に0.16M DCCを、ま
たは（２）3.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.16MのBocTaeg
−OHと共に0.16M DCCを利用するすべての残基の原位置
DCC単カップリングにより組立てられた（“合成プロト
コール9"）。各々のカップリング反応は振とうしながら
総計で20〜24時間進行させた。合成はニンヒドリン反応
によりモニターされ、すべての残基の取り込みが定量的
に近いことが示された。Ｎ末端Boc基の脱保護後、PNA樹
脂の半分はTyr（BrZ）−OHに定量的に結合され、ごく一
部がもう一つのTaeg残基と定量的に結合された。両方の
カップリングとも上記の合成プロトコールを用いた。
（ｂ）Ｈ−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）a
eg〕3−〔Taeg〕2−Lys−NH2の切断、精製および同定 保護されたBoc−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕2−〔Ｃ
（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は実
施例17cに記載されたごとく処理され、172.7mgの乾燥Ｈ
−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−
〔Taeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約57.
6mgの粗物質を得た。粗生成物（57.6mg）を精製して26.
3mgのＨ−〔Caeg〕2−〔Taeg〕2−〔Caeg〕3−〔Taeg〕
2−Lys−NH2を得た。(M+H)+に対して計算m/z値は2466.0
4であった;m/z値は測定されていない。
（ｃ）Ｈ−Tyr−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕2−〔Ｃ
（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−Lys−NH2の切断、精製およ
び同定 保護されたBoc−Tyr−（BrZ）−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−
〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−Lys（ClZ）
−MBHA樹脂は実施例17cに記載のごとく処理され、172.7
mgの乾燥Ｈ−Tyr−（BrZ）〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕
2−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹
脂のHF切断により約57.6mgの粗物質を得た。粗生成物
（47.1mg）を精製して13.4mgのＨ−Tyr−〔Caeg〕2−
〔Taeg〕2−〔Caeg〕3−〔Taeg〕2−Lys−NH2を得た。
(M+H)+に対し、計算m/z値は2629.11であり、実測m/z値
は2629.11であった。
（ｄ）Ｈ−Taeg−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕2−〔Ｃ
（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−Lys−NH2の切断、精製およ
び同定 保護されたBoc−Taeg−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕2
−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕3−〔Taeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹
脂が実施例17cに記載dqごとく処理され、42.4mgの乾燥
Ｈ−Taeg−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−〔Taeg〕2−〔Ｃ（Ｚ）a
eg〕3−〔Taeg〕2−Lys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断によ
り約53.4mgの粗物質を得た。粗生成物（11.9mg）を精製
して4.3mgのＨ−Taeg−〔Caeg〕2−〔Taeg〕2−〔Cae
g〕3−〔Taeg〕2−Lys−NH2を得た。(M+H)+に対し、計
算m/z値は2732.15であった:m/z値は測定されなかった。
（ｃ）合成プロトコール10（一般的プロトコール）“合
成プロトコール9"と同じプロトコール、ただしDCCはDIC
に置き代えられている。
実施例97 還元的アミノ化による規模拡大のためのバックボーン部
分の合成 （ａ）（bocアミノ）アセトアルデヒドの製造 ３−アミノ−1,2−プロパンジオール（80.0g;0.88モ
ル）を水（1500ml）に溶解し、溶液を４℃に冷却した後
Boc無水物（230g;1.05モル）を一度に加えた。溶液は水
浴で緩やかに室温まで加熱した。水酸化ナトリウムを滴
下することによりpHは10.5に保たれた。反応終了までに
総計で480mlの水に溶解した70.2gのNaOHが加えられた。
一夜撹拌後、酢酸エチル（1000ml）を加え、混合物を０
℃に冷却し、4N塩酸の添加によりpHを2.5に調整した。
酢酸エチル層を除き、酸性水溶液はさらに酢酸エチルで
抽出された（８×500ml）。合併した酢酸エチル溶液の
容量は回転エバポレーターを用いて1500mlに減量した。
得られた溶液は半飽和硫酸水素カリウム（1500ml）続い
て飽和塩化ナトリウムで洗浄した。次に硫酸マグネシウ
ムで乾燥させ、真空下蒸発乾固させた。収量145.3（86
％）。
３−Bocアミノ−1,2−プロパンジオール（144.7g;0.7
57モル）を水（750ml）に懸濁し、過ヨウ素カリウム（1
91.5g;0.833モル）を加えた。混合物は窒素下で2.5時間
撹拌し、沈殿したヨウ素酸カリウムを濾過して除去し一
度水（100ml）で洗浄した。水相をクロロホルムで抽出
した（６×400ml）。クロロホルム抽出液を乾燥し、真
空下蒸発乾固させた。油状物の収量102g（93％）。（bo
cアミノ）アセトアルデヒドは２つに分けて84℃,0.3mmH
gでクーゲルロール蒸留することにより精製された。無
色油状物の収量79g（77％）。
（ｂ）（Ｎ′−bocアミノエチル）グリシンメチルエス
テルの製造 ０℃にてパラジウム炭素（10％;2.00g）を（bocアミ
ノ）アセトアルデヒド（10.0g;68.9ミリモルのメタノー
ル（150ml）溶液を加えた。酢酸ナトリウム（11.3g;138
ミリモル）のメタノール（150ml）溶液およびグリシン
メチルエステル塩酸塩（8.65g;68.9ミリモル）のメタノ
ール（75ml）溶液を次に加えた。混合物は大気圧で2.5
時間水素化した後、セライトを通して濾過し、真空下蒸
発乾固させた。これにより14.1g（88％）の（Ｎ′−boc
アミノエチル）グリシンメチルエステルを得た。粗生成
物を120℃,0.5mmHgでクーゲルロール蒸留により精製す
ると11.3g（70％）の無色油状物を得た。tlc分析（10％
メタノールを含むメチレンクロリド）によるとこの生成
物は実施例26で製造された物よりも高い純度を持ってい
た。
もしくは、収率は低いが（42％）水素（Pd（ｃ）と共
に触媒として）のかわりに還元剤としてシアノ水素化ホ
ウ素ナトリウムが使用できる。
（ｃ）（Ｎ′−bocアミノエチル）グリシンエチルエス
テルの製造 表記化合物はグリシンメチルエステル塩酸塩をグリシ
ンエチルエステル塩酸塩にかえ、前記の方法で製造され
た。また使用された溶媒はエタノールであった。収率は
78％であった。
実施例98 Ｈ−Tyr−〔Taeg〕10−Lys−NH2の固相合成 （ａ） Boc−Tyr（BrZ）−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−M
BHA樹脂の段階的組立て 約0.2gの湿潤Boc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹
脂を5mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−Tyr（BrZ）−
〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は、3.0mlのCH2Cl2
中の0.32MのBocCTyr（BrZ）−OHと共に、0.32MのDCCを
利用して一夜行う標準原位置DCCカップリングにより組
立てられた。ニンヒドリン反応はBocTyr（BrZ）の約97
％の取り込みを示した。
（Ｂ）Ｈ−Tyr−〔Taeg〕10−Lys−NH2の切断、精製お
よび同定 保護されているBoc−Tyr（BrZ）−〔Taeg〕10−Lys
（ClZ）−MBHA樹脂は実施例17cに記載されたごとく処理
され、20.7mgの乾燥Ｈ−Tyr（BrZ）−〔Taeg〕10−Lys
（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約5.5mgの粗物質を得
た。粗生成物を精製して2.5mgのＨ−Tyr−〔Taeg〕10−
Lys−NH2を得た。
実施例99 ダンシル−〔Taeg〕10−Lys−NH2の固相合成 （ａ）ダンシル−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の
段階的組立て 約0.3gの湿潤Boc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹
脂を5mlのSPPS反応容器に加えた。ダンシル−〔Taeg〕
10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は2.0mlのピリジンに溶解し
た0.5Mダンシル−Clと一夜結合させることにより組立て
られた。ニンヒドリン反応はダンシルの約95％が取り込
まれたことを示した。
（ｂ）ダンシル−〔Taeg〕10−Lys−NH2の切断、精製お
よび同定 保護されているダンシル−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−
MBHA樹脂は実施例17cに記載されたごとく処理され、71.
3mg乾燥ダンシル−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
のHF切断により約12mgの粗物質を得た。粗生成物を精製
して5.4mgのダンシル−〔Taeg〕10−Lys−NH2を得た。
実施例100 Gly−Gly−His−〔Taeg〕10−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−Gly−Gly−His（Tos）−〔Taeg〕10−Lys
（ClZ）−MBHA樹脂の段階的組立て 約0.05gのBoc−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂を
5mlのSPPS反応容器に加えた。Boc−Gly−Gly−His（To
s）−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は、2.5mlのDM
F/CH2Cl2に溶解したBoc保護アミノ酸（0.1M）の標準原
位置DCC複カップリングにより組立てられた。ただしBoc
His（Tos）の最初のカップリングは25％DMF/CH2Cl2中前
もって形成された対称的無水物（0.1M）を用いて行われ
た。すべてのカップリングは一夜実施され、ニンヒドリ
ン反応は実施されなかった。
（ｂ）Gly−Gly−His−〔Taeg〕10−Lys−NH2の切断、
精製および同定 保護されているBoc−Gly−Gly−His（Tos）−〔Tae
g〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は実施例17cに記載されて
いるごとく処理され、34.5mgの乾燥Boc−Gly−Gly−His
（Tos）−〔Taeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断
により約10.3mgの粗物質（約40％の純度）を得た。粗生
成物の少量（凍結乾燥前に取り出した）を精製して0.1m
gのGly−Gly−His−〔Taeg〕10−Lys−NH2を得た。
実施例101 Ｈ−〔Taeg〕5−〔Caeg〕2−NH2−固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕5−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−MBHA樹脂の
段階的組立て 約0.2gのMBHA樹脂を3mlのSPPS反応容器へ入れ中和し
た。負荷は約0.64ミリモル/gであることが決定された。
2.5mlの25％フェノール／CH2Cl2中0.13Mの濃度を用いて
BocC（Ｚ）aeg−OPfpが樹脂上に結合された。ニンヒド
リン分析はカップリングは約40％の収率であることを示
した。残存するアミノ基は通常のようにアセチル化され
た。Boc−〔Taeg〕5−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−MBHA樹脂は2.
5mlの50％DMF/CH2Cl2中0.11MのBocC（Ｚ）aeg−OHと共
に0.11MのDCCを利用する次の残基の原位置DCC単カップ
リングにて、および残っている残基に対してCH2Cl2中の
0.13M BocTaeg−OPfpとのカップリングにより（“合成
プロトコール8"）組立てられた。各々のカップリング反
応は一夜振とうすることにより進行させた。合成はニン
ヒドリン反応でモニターされ、すべての残基の取り込み
は定量的に近いことが示された。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕5−〔Caeg〕2−NH2の切断、精製お
よび同定 保護されているBoc−〔Taeg〕5−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−
MBHA樹脂は実施例17cに記載されているごとく処理さ
れ、94.8mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕 5 −〔Ｃ（Ｚ）aeg〕2−M
BHA樹脂のHF切断により約21.7mgの粗物質（＞80％の純
度）を得た。粗生成物（7.4mg）を精製して2.0mgのＨ−
〔Taeg〕5−〔Caeg〕2−HN2−（＞99％の純度）を得
た。
実施例102 Ｈ−〔Taeg〕3−Caeg−〔Taeg〕4−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕3−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕4−MBHA
樹脂の段階的組立て 約0.2gの前記MBHA樹脂を5mlのSPPS反応容器へ入れ中
和した。Boc−〔Taeg〕3−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕4−MB
HA樹脂は、2.5mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.13MのBocC
（Ｚ）aeg−OHと共に0.13MのDCCを利用するＣ（Ｚ）aeg
残基の原位置DCC単カップリングにより、および2.5mlの
CH2Cl2中の0.13M BocTaeg−OPfpとTaeg残基とのカップ
リングにより組立てられた。各々のカップリング反応は
一夜振とうすることにより進行させた。合成はニンヒド
リン反応によりモニターされ、すべての残基の定量的に
近い取り込みを示した。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕3−Caeg−〔Taeg〕4−NH2の切断、
精製および同定 保護されているBoc−〔Taeg〕3−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Tae
g〕4−MBHA樹脂は実施例17cに記載されているごとく処
理され、約123mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕3−Ｃ（Ｚ）aeg−
〔Taeg〕4−MBHA樹脂のHF切断により約44.4mgの粗物質
を得た。粗生成物（11.0mg）を精製して3.6mgのＨ−〔T
aeg〕3−Caeg−〔Taeg〕4−NH2を得た。
実施例103 Ｈ−Taeg−Caeg−〔Taeg〕8−LysNH2の固相合成 （ａ）Boc−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕8−Lys（Cl
Z）−MBHA樹脂の段階的組立て 約0.3gの湿潤Boc−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
を3mlのSPPS反応容器へ入れた。Boc−Taeg−Ｃ（Ｚ）ae
g−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は、2.5mlの50％D
MF/CH2Cl2中、0.2MのBocC（Ｚ）aeg−OHと共に0.2MDCC
を利用して一夜行うＣ（Ｚ）aeg残基の原位置DCC単カッ
プリングにより（“合成プロトコール9"）（ニンヒドリ
ン分析により判断された取り込みは約80％であった；残
りの遊離アミノ基はアセチル化された）、および2.5ml
のCH2Cl2中、0.15M BocTaeg−OPfpとTaeg残基の一夜の
カップリングにより（ほとんど定量的）組立てられた。
（ｂ）Ｈ−Taeg−Caeg−〔Taeg〕8−LysNH2の切断、精
製および同定 保護されているBoc−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕8
−Lys（ClZ）MBHA樹脂は実施例17cに記載されているご
とく処理され、約76.5mgの乾燥Ｈ−Taeg−Ｃ（Ｚ）aeg
−〔Taeg〕8−Lys（ClZ）MBHA樹脂はHF切断により約22.
3mgの粗物質を得た。粗生成物（6.7mg）を精製して2.6m
gのＨ−Taeg−Caeg−〔Taeg〕8−LysNH2を得た。(M+H)+
に対する計算m/z値は2792.15であり、実測m/z値は2792.
21であった。
実施例104 Ｈ−Caeg−〔Taeg〕5−LysNH2およびＨ−〔Taeg〕2−Ca
eg−〔Taeg〕5−Lys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕2−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys
（ClZ）−MBHA樹脂の段階的組立て 約0.5gの湿潤Boc−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
を5mlのSPPS反応容器へ入れた。Boc−〔Taeg〕2−Ｃ
（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は、
（１）3.0mlの50％DMF/CH2Cl2中、0.12MのBocC（Ｚ）ae
g−OHと共に0.12M DCCを、または（２）3.0mlの50％DM
F/CH2Cl2中、0.12MのBocTaeg−OHと共に0.12M DCCを利
用するすべての残基の原位置DCC単カップリンにより組
立てられた（“合成プロトコール9"）。各々のカップリ
ング反応は振とうしながら一夜進行させた。合成はニン
ヒドリン反応によりモニターされ、すべての残基の取り
込みは定量的に近いことが示された。合成の間、少量の
Ｈ−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂が
HF切断のため取り出された。
（ｂ）Ｈ−Caeg−〔Taeg〕5−LysHN2の切断、精製およ
び同定 保護されているBoc−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys
（ClZ）−MBHA樹脂は実施例17cに記載されているごとく
処理され、37.5mgの乾燥Ｈ−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−
Lys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約3.0mgの粗物質
を得た。約0.7mgの粗生成物を精製して約0.5mgのＨ−Ca
eg−〔Taeg〕5−Lys−NH2を得た。
（ｃ）Ｈ−〔Taeg〕2−Caeg−〔Taeg〕5−Lys−HN2の切
断、精製および同定 保護されているBoc−〔Taeg〕2−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Tae
g〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は実施例17cに記載されて
いるごとく処理され、118.6mgの乾燥Ｈ−〔Taeg〕2−Ｃ
（Ｚ）aeg−〔Taeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断
により約37.7mgの粗物質を得た。
実施例105 Ｈ−〔Caeg〕5−Lys−NH2、Ｈ−〔Caeg〕6−Lys−NH2、
Ｈ−〔Caeg〕8−Lys−NH2およびＨ−〔Caeg〕10−Lys−
NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
および短い断片の段階的組立て 約5gの湿潤Boc−Lys（ClZ）−MBHA樹脂（置換＝0.3ミ
リモルLys/g）を30mlのSPPS反応容器へ入れた。Boc−
〔Ｃ（Ｚ）aeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂は、10mlの5
0％DMF/CH2Cl2中、0.1MのBocC（Ｚ）aeg−OHと0.1M DC
Cによる最初の３つの残基の原位置DCC単カップリングに
より（“合成プロトコール9"）、および10mlの50％DMF/
CH2Cl2中、0.1MのBocC（Ｚ）aeg−OHと0.1M DICによる
残りの７つの残基の原位置DIC単カップリングにより
（“合成プロトコール10"）組立てられた。すべてのカ
ップリング反応は一夜進行させた。合成はニンヒドリン
反応によりモニターされ、すべての残基の取り込みは定
量的に近いことが示された。合成の間、より短い断片Ｈ
−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂、Ｈ〔Ｃ
（Ｚ）aeg〕6−Lys（ClZ）−MBHA樹脂、Ｈー〔Ｃ（Ｚ）
aeg〕7−Lys（ClZ）−MBHA樹脂、Ｈ−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕8
−Lys（ClZ）−MBHA樹脂およびＨ−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕9−
Lys（ClZ）−MBHA樹脂の一部をHF切断のために取り出し
た。
（ｂ）Ｈ−〔Caeg〕5−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護されているBoc−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕5−Lys（ClZ）M
BHA樹脂は実施例17cに記載したごとく処理され、60.1mg
の乾燥Ｈ−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕5−Lys（ClZ）−MBHA樹脂の
HF切断により約10.8mgの粗物質を得た。
（ｃ）Ｈ−〔Caeg〕6−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護されているBoc−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕6−Lys（ClZ）
−MBHA樹脂は実施例17cに記載したごとく処理し、56.2m
gの乾燥Ｈ−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕6−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
のHF切断により約13.4mgの粗物質を得た。
（ｄ）Ｈ−〔Caeg〕8−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護されているBoc−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕8−Lys（ClZ）
−MBHA樹脂は実施例17cに記載したごとく処理し、65.6m
gの乾燥Ｈ−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕8−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
のHF切断により約16.8mgの粗物質を得た。
（ｅ）Ｈ−〔Caeg〕10−Lys−NH2の切断、精製および同
定 保護されているBoc−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕10−Lys（ClZ）
−MBHA樹脂は実施例17cに記載したごとく処理し、441mg
の乾燥Ｈ−〔Ｃ（Ｚ）aeg〕10−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
のHF切断により約142.4mgの粗物質を得た。
実施例106 Ｈ−〔Taeg〕2−Caeg−〔Taeg〕2−Caeg−〔Taeg〕4−L
ys−NH2の固相合成 （ａ）Boc−〔Taeg〕2−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕2−Ｃ
（Ｚ）aeg−〔Taeg〕4−Lys（ClZ）MBHA樹脂の段階的組
立て Boc−〔Taeg〕5−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕4−Lys（Cl
Z）−MBHA樹脂の前の合成からの湿潤Ｈ−〔Taeg〕2−Ｃ
（Ｚ）aeg−〔Taeg〕4−Lys（ClZ）−MBHAの約0.3gを5m
lのSPPS反応容器に入れた。次の残基を５回カップリン
グした後、87％のBocC（Ｚ）aegの余取り込みが得られ
た。５回の繰返しカップリングは各々2mlのTFE/CH2Cl2
（1:2,v/v）、2mlのTFE/CH2Cl2（1:2,v/v）、ジオキサ
ン２滴およびDIEA2滴を加えた2mlのTFE/CH2Cl2（1:2,v/
v）、（この条件は数パーセントのカップリング収率を
上げる）、2mlのTFE/CH2Cl2（1:2,v/v）に0.5gフェノー
ルを加える、および1mlのCH2Cl2に0.4gのフェノールを
加えた溶媒中の0.18MBocC（Ｚ）aeg−OPfpにより実施さ
れた。２つの最後のTaeg残基は25％フェノール／CH2Cl2
に溶解した0.25M BocTaeg−OPfpの複カップリングによ
りほとんど定量的に取り込まれた。すべてのカップリン
グは一夜進行させた。
（ｂ）Ｈ−〔Taeg〕2−Caeg−〔Taeg〕2−Caeg−〔Tae
g〕4−Lys−NH2の切断、精製および同定 保護されているBoc−〔Taeg〕2−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Tae
g〕2−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕4−Lys（ClZ）−MBHA樹脂
は実施例17cに記載したごとく処理され、80.7mgの乾燥
Ｈ−〔Taeg〕2−Ｃ（Ｚ）aeg−〔Taeg〕2−Ｃ（Ｚ）aeg
−〔Taeg〕4−Lys（ClZ）−MBHA樹脂のHF切断により約7
mgの粗物質を得た。粗生成物を精製して1.2mgのＨ−〔T
aeg〕2−Caeg−〔Taeg〕2−Caeg−〔Taeg〕4−Lys−NH2
（＞99.9％の純度を）を得た。
実施例107 ２つの逆平行鎖が互に結合されたPNAの合成 Ｈ−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Gaeg〕−〔Ta
eg〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔６−AHA〕−〔aeg〕−
〔６−AHA〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Aae
g〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−〔Taeg〕−LYS−NH2の合成
（６−AHA＝６−アミノヘキサン酸） （図26） 保護されたPNAがBoc−Lys（ClZ）修飾MBHA樹脂上に約
0.30ミリモル/gの置換で組み入れられた。非結合アミノ
基のキャッピングはBocGaeg−OHモノマーの取り込み前
にのみ実施された。1.00g（乾燥重量）の前もって膨潤
させ（DCM中一夜）中和されたBoc−Lys（ClZ）−MBHA樹
脂で合成が開始された。モノマーの取り込みは実施例32
および実施例71のプロトコールに従った。カップリング
反応は定性的ニンヒドリン試験（Kaiser試験）によりモ
ニターされた。陽性のKaiser試験の場合、試験がビーズ
の着色を示さなくなるまでカップリング反応を繰返し
た。最終的脱保護、支持体からの切断および精製は常法
に従って実施された。
実施例108 PNA合成のための別の保護基（図27） （ａ）試験化合物の合成 ２−アミノ−６−ｏ−ベンジルプリン:2.5g（0.109モ
ル）のナトリウムのベンジルアルコール（100ml）溶液
に10.75g（0.063モル）の２−アミノ−６−クロロプリ
ンを加えた。混合物は120℃で12時間撹拌した。溶液を
室温まで冷却して酢酸で中和し、50mlの0.2N水酸化ナト
リウムで10回抽出した。集めた水酸化ナトリウム相を10
0mlのジブチルエーテルで洗浄し、酢酸で中和すると沈
殿が生じた。溶液を０℃に冷却し、黄色沈殿物を濾過し
て集めた。エタノールから再結晶して14.2g（92％）の
標的化合物の純粋な白色結晶を得た。1 H−NMR（250MHz,DMSO−d6）ｄ ppm:8−H,7.92;ベンジ
ル芳香族、7.60−7.40;2NH2,6.36;ベンジルCH2,5.57。
（２−アミノ６−０−ベンジルプリニル）メチルエタ
ノアート:5g（0.0207モル）の２−アミノ−６−０−ベ
ンジル−プリン、30mlのDMFおよび2.9g（0.021モル）の
炭酸カリウムの混合物を室温で撹拌した。ブロモ酢酸メ
チル（3.2g;1.9ml;0.0209モル）を滴下した。４時間後
溶液を濾過し、減圧下溶媒を除去した（4mmHg,40℃）。
残渣を２回酢酸エチルから再結晶して3.7g（57％）の標
的化合物を得た。1 H−NMR（250MHz,DMSO−d6）ｄ ppm:8−H,7.93;ベンジ
ル芳香族、7.4−7.6;2−NH2,6.61;ベンジルCH2,5.03;CH
2,5.59;OCH3,3.78。
（2N−ｐ−トルエンスルホンアミド−６−０−ベンジ
ルプリニル）メチルエタノアート； 0.5g（1.6ミリモル）の（２−アミノ−６−ｏ−ベン
ジルプリニル）メチルエタノアートのメチレンクロリド
（25ml）溶液に0.53g（1.62ミリモル）のｐ−トルエン
スルホン酸無水物および0.22g（1.62ミリモル）の炭酸
カリウムを加えた。混合物は室温で撹拌した。混合物を
濾過し、溶媒を減圧下除去した（15mmHg,40℃）。ジエ
チルエーテルを油状残渣に加えた。得られた溶液を一夜
撹拌すると標的化合物（0.145g;55％）が沈殿し、濾過
により集められた。1 H−NMR（250MHz;DMSO−d6）ｄ ppm:8−H,8.97;芳香族
7.2−7.8;ベンジルCH2,5,01;CH2,4.24;OCH3,3.73;CH3,
2.43。
（ｂ）TFAおよびHF中でのトシル保護塩基残基の安定性 試験材料を標準脱保護条件（TFA−脱保護）およびHF
による最終的切断条件においた。生成物は４μRCM8×10
Nova packカラムおよび2ml/分の流速で下記の時間濃度
勾配に従うＡ（0.1％TFA水溶液）およびＢ（0.1％アセ
トニトリル）の溶媒を用いるHPLC分析を行った。
時間 ％Ａ ％Ｂ ０ 100 ０ ５ 100 ０ 35 ０ 100 37 ０ 100 39 100 ０ 次の保持時間が観察された：（ａ）化合物1:30.77分；
（ｂ）化合物2:24.22分；および（ｃ）化合物3:11.75
分。この分析により06−ベンジル基はTFAおよびHFの両
方で除去され、一方、トシル基はTFA中では切断されな
いが標準切断条件下のHF中では定量的に除去されること
が示された。
実施例109 ５−ブロモウラシル−N1−メチルアセテート ５−ブロモウラシル（5.00g;26.2ミリモル）および炭
酸カリウム（7.23g;52.3ミリモル）をDMF（75ml）に懸
濁した。５分以上かけてブロモ酢酸メチル（2.48ml;26.
1ミリモル）を添加した。懸濁液は室温で２時間撹拌し
た後濾過した。固形残渣は２度DMFで洗浄し、合併した
濾液は真空下蒸発乾固させた。残渣は表記化合物、DMF
および未同定の不純物を含む油状物であった。加水分解
前に表記化合物を精製する必要はない。1 H−NMR（DMSO−d6,250MHz）;8.55（不純物）;8.27（CB
r＝CHHN）;8.02（不純物）;4.76（不純物）;4.70（不純
物）;4.62（NCH 2COOCH 3）;3.78（COOCH3）;2.96（DM
F）;2.80（DMF）。13 C−NMR（DMSO−d6,250MHz）;168.8（COOCH3）;172.5
（CH＝CBrCON）;161.6（DMF）;151.9（NCON）;145.0（C
O−CBr＝CHN）;95.6（COCBr＝CHN）;52.6（不純物）;5
2.5（OCH3）;49.7（不純物）;48.8（NCH2COOMe）;43.0
（不純物）;36.0（DMF）。
UV（メタノール；maxnm）;226;278。
IR（KBr;cm-1）;3158s（NH）;1743vs（Ｃ＝O,COOMe）;1
701vs（Ｃ＝O,CONH）;1438vs（∂CH,CH3O）;1223vs（Ｃ
−O,COOMe）;864m（∂CH,Br＝Ｃ−Ｈ）。
FAB−MS m/z（帰属）;265/263（Ｍ＋Ｈ）。
実施例110 （５−ブロモウラシル）酢酸 実施例109の粗生成物の油状物に水（30ml）を加え、
混合物は水酸化ナトリウム（2M,60ml）を加えることに
より溶解された。０℃で10分撹拌後、pH2になるまで塩
酸（4M,45ml）を加えると表記化合物が沈殿した。50分
後、固形残渣が濾過により単離され、一度冷水で洗浄し
て真空下シカペント上で乾燥させた。収量:2.46g（38
％）M.p.250〜251℃。
元素分析：C6H5BrN2O4として、実測値（計算値）:C:28.
78（28.94）;H:2.00（2.02）;Br:32.18（32.09）;N:11.
29（11.25）。1 H−NMR（DMSO−d6,250MHz）;12.55（1H,s,COOH）;11.9
7（1H,s,NH）;8.30（1H,s,C＝Ｃ−Ｈ）;4.49（2H,s,NCH
2COOH）。13 C−NMR（DMSO−d6,250MHz）;169.4（COOH）;159.8（N
HCOCBr＝CH）;150.04（NCON）;145.8（COCBr＝CHN）;9
4.6（COCBr＝CHN）;48.8（NCH2COOH）。
UV（メタノール；maxnm）;226;278。
IR（KBr;cm-1）;3187s（NH）;1708vs（Ｃ＝O,COOH）;16
87vs;1654vs（Ｃ＝O,CONH）;1192s（Ｃ−O,COOH）;842m
（∂CH,Br−Ｃ＝Ｃ−Ｈ）。
FAB−MS m/z（帰属、相対強度）;251/249（Ｍ＋H,
5）。
実施例111 Ｎ−（Boc−アミノエチル）−Ｎ−（５−ブロモウラシ
ル）メチレンカルボノイルグリシンエチルエステル Boc−アミノエチルグリシンエチルエステル（1.80g;
7.30ミリモル）をDMF（10ml）に溶解した。Dhbt−OH
（1.31g;8.03ミリモル）を加えると沈殿が形成した。沈
殿が溶解するまでDMFが加えられた（２×10ml）。実施
例110の生成物（2.00g;8.03ミリモル）を沈殿を避ける
ため徐々に加えた。メチレンクロリド（30ml）を加え、
混合物を０℃に冷却した後濾過した。沈殿物（DCU）は
２回メチレンクロリドで洗浄した。合併した濾液にさら
にメチレンクロリド（100ml）を加えた。混合物は半飽
和NaHCO3溶液（３×100ml,H2O：飽和NaHCO3溶液1:1v/
v）、次に希KHSO4溶液（２×100ml,H2O：飽和KHSO4溶液
4:1v/v）および最後に飽和NaCl溶液（１×100ml）で洗
浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥して濾過し、
真空下蒸発乾固させた（約15mmHg、続いて約1mmHg）。
残渣をメチレンクロリド（35ml）に懸濁し、室温で45分
撹拌した後濾過した（沈殿はDCUであった）。０℃にて
濾液に石油エーテル（２容量）を滴下すると油状物が沈
んだ。液をデカントして捨て残った油状物はメチレンク
ロリド（20〜50ml）に溶解した。石油エーテル（２容
量）を加えると沈殿が生じた。この操作を不純物が除去
されるまで５回繰返した。不純物は10％MeOH/CH2Cl2を
展開液とするTLCにて観察できる。得られた油状物をメ
チレンクロリド（25ml）に溶解し、真空下蒸発乾固させ
ると表記化合物の固形化が起こった。収量:2.03g（58
％）。M.p.87〜90℃。元素分析：C17H25BrN4O7として、
実測値（計算値）:C:42.33（42.78）;H:5.15（5.28）;B
r:17.20（16.74）;N:11.69（11.74）。1 H−NMR（DMSO−d6,250MHz,JHz）;1.93＆11.92（1H,s,C
＝ONHC＝Ｏ）;8.09＆8.07（1H,s,C＝Ｃ−Ｈ）;7.00＆6.
80（1H,t,b,BocNH）;4.80＆4.62（2H,s,NCH 2CON）;4.35
＆4.24（2H,s,NCH 2COOEt）;4.27−4.15（2H,m′s,COOCH
2CH3O）;3.47−3.43（2H,m′s,BocNHCH2CH 2N）;3.28−
3.25＆3.12−3.09（2H,m′s,BocNHCH 2CH2-N）;1.46＆1.
45（9H,s,tBu）;1.26＆1.32（3H,t,J＝7.1,COOCH2C
H 3）。13 C−NMR （DMSO−d6,250MHz）;169.3＆169.0（tBuOC
＝Ｏ）;167.4＆167.1（COOEt）;159.8（Ｃ＝Ｃ−CON）;
155.9（NCH2 CON）;150.4（NCON）;145.9（COCBr−CH
N）;94.5（COCBr＝CHN）;78.2（Me3 C）;61.3＆60.7（CO
CH2CH3）;49.1＆48.0（NCH2COOH）;48.0＆47.0（NCH2CO
N）;38.6（BocNHCH2 CH2N）;38.2（BocNHCH2CH2N）;26.3
（Ｃ(CH3)3）;14.1（COCH2 CH3）。
UV（メタノール；maxnm）;226;280。
IR（KBr;cm-1）;3200ms,ブロード（NH）;168vs,非常に
幅広（Ｃ＝O,COOH,CONH）;1250s（Ｃ−O,COOEt）;1170s
（Ｃ−O,COOtBu）;859m（∂CH,Br−Ｃ＝Ｃ−Ｈ）。
FAB−MS m/z（帰属、相対強度）;479/477（Ｍ＋H,5）;
423/421（Ｍ＋2H−tBu,8）;379/377（Ｍ＋2H−Boc,10
0）;233/231（Ｍ−バックボーン,20）。
実施例112 Ｎ−（Boc−アミノエチル）−Ｎ−（５−ブロモウラシ
ル−N1−メチレンカルボノイル）グリシン 実施例111の生成物（1.96g;4.11ミリモル）を加熱す
ることによりメタノール（30ml）に溶解させ、続いて０
℃に冷却した。水酸化ナトリウム（2M,30ml）を加え、
混合物を30分撹拌した。pH＝2.0になるまでHClを加えた
（1M,70ml）。水相を酢酸エチルで抽出した（３×65ml
＋７×40ml）。合併した酢酸エチル抽出液は飽和NaCl溶
液（500ml）で洗浄した。酢酸エチル相は硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、濾過後真空下で蒸発乾固させた。収量:
1.77g（96％）。M.p.92〜97℃。元素分析：C15H21BrN4O
7として実測値（計算値）:C:40.79（40.10）;H:5.15
（4.71）;Br:14.64（17.70）;N:11.35（12.47）。1 H−NMR（DMSO−d6,250MHz,JHz）;12.83（1H,s,COOH）;
11.93＆11.91（1H,s,C＝ONHC＝Ｏ）;8.10＆8.07（1H,s,
C＝Ｃ−Ｈ）;7.00＆6.81（1H,t,b,BocNH）;4.79＆4.61
（2H,s,NCH 2CON）;4.37＆4.25（2H,s,NCH 2COOH）;3.46
−3.39（2H,m′s,BocNHCH2CH 2N）;3.26−3.23＆3.12−
3.09（2H,m′s,BocNHCH 2CH2N）;1.46（9H,s,tBu）。13 C−NMR（DMSO−d6,250MHz）;170.4（tBuOC＝Ｏ）;16
6.9（COOH）;159.7（Ｃ＝Ｃ−CON）;155.8（NCH2 CON）;
150.4（ＮＣON）;145.9（COCBr＝CHN）;94.4（COCBr＝C
HN）;78.1（Me3 C）;49.1＆48.0（NCH2COOH）;47.7＆47.
8（NCH2CON）;38.6（BocNHC2 CH2N）;38.1（BocNHCH2CH2
N）;28.2（C(CH3)3）。
UV（メタノール；maxnm）;226;278。
IR（KBr;cm-1）;3194ms,幅広（NH）;1686vs,非常に幅広
（Ｃ＝OCOOH,CONH）;1250s（Ｃ−O,COOH）;1170s（Ｃ−
O,COOtBu）;863m（∂CH,Br−Ｃ＝Ｃ−Ｈ）。
FAB−MS m/z（帰属、相対強度）;449/451（Ｍ＋H,7
0）;349/351（Ｍ＋2H−Boc,100）;231/233（Ｍ−バッグ
ボーン,20）。
実施例113 ウラシル−N1−メチルアセテート ウラシル（10.0g;89.2ミリモル）および炭酸カリウム
（24.7g;178ミリモル）をDMF（250ml）に懸濁した。５
分以上かけてブロモ酢酸メチル（8.45ml;89.2ミリモ
ル）を添加した。懸濁液は窒素下室温で一夜撹拌した後
濾過した。TLC（10％メタノールを含むメチレンクロリ
ド）はウラシルの不完全な変換を示した。固形残渣を２
回DMFで洗浄し、合併した濾液は真空下蒸発乾固させ
た。沈殿を水（60ml）に懸濁し、pH＝２までHCl（2.5m
l;4M）を加えた。懸濁液は０℃で30分撹拌した後濾過し
た。沈殿した表記化合物は水で洗浄し、真空下シカペン
ト上で乾燥した。収量:9.91g（60％）。M.p.182〜183
℃。元素分析；C6H8N2O4として実測値（計算値）:C:45.
38（45.66）;H:4.29（4.38）;N:15.00（15.21）。1 H−NMR（DMSO−d6,250MHz,JHz）;1.47（1H,s,NH）;7.6
8（1H,d,JH-C ＝ C-H＝7.9,CH＝（CHN）;5.69（1H,d,J
H-C=C-H＝7.9,CＨ＝CHN）;4.59（2H,s,NCH 2COOMe）;3.7
6（3H,s,COOCH 3）。13 C−NMR（DMSO−d6,250MHz）;168.8（COOMe）;164.0
（Ｃ＝Ｃ−CON）;151.1（NCON）;146.1（COCH＝CHN）;1
01.3（COCH＝CHN）;52.5（COOCH3）;48.7（NCH2COOM
e）。
UV（メタノール；maxnm）;226;261。
IR（KBr;cm-1）;3164s（NH）;1748vs（Ｃ＝O,COOMe）;1
733vs（Ｃ＝O,CONH）;1450vs（∂CH,CH3O）;1243vs（Ｃ
−O,COOMe）;701m（∂CH,H−Ｃ＝Ｃ−Ｈ）。
FAB−MS m/z（帰属）;185（Ｍ＋Ｈ）。
実施例114 ウラシル酢酸 実施例113の生成物（8.76g;47.5ミリモル）に水（90m
l）、続いて水酸化ナトリウム（2M,40ml）を加えた。す
べてのメチルエステルが反応するまで混合物を加熱した
（40分）。０℃で15分撹拌した後、pH＝2.0まで塩酸を
加えた（4M,25ml）。表記化合物が沈殿し、２〜３時間
後に濾過した。沈殿は母液で１回および冷水で２回洗浄
し、真空下シカペント上で乾燥した。収量6.66g（82
％）。M.p.288〜289℃。元素分析；C6H6N2O4として実測
値（計算値）:C:42.10（42.36）;H:3.43（3.55）;N:16.
25（16.47）。1 H−NMR（DMSO−d6,250MHz,JHz）:13.19（1H,s,COOH）;
11.41（1H,s,NH）;7.69（1H,d,JH-C=C-H＝7.8,J
H-C-C-H-H＝2.0,coch＝chn）;4.49（2H,s,NCH 2COOH）。13 C −NMR（DMSO−d6,2509MHz）;169.9（COOH）;163.9
（CH＝CHCON）;151.1（NCON）;146.1（COCH＝CHN）;10
0.9（COCH＝CHN）;48.7NCH 2COOH。
UV（メタノール；maxnm）;246;263。
IR（KBr;cm-1）;3122s（NH）;1730vs（Ｃ＝O,COOH）;16
98vs,1692vs（Ｃ＝O,CONH）;1205s（Ｃ−O,COOH）;676
（∂CH,H−Ｃ＝Ｃ−Ｈ）。
FAB−MS m/z（帰属）;171（Ｍ＋Ｈ）。
実施例115 Ｎ−（Bocアミノエチル）−Ｎ−（ウラシル−N1−メチ
レンカルボノイル）グリシンエチルエステル （Bocアミノエチル）グリシンエチルエステル（2.00
g;8.12ミリモル）をDMF（10ml）に溶解した。Dhbt−OH
（1.46g;8.93ミリモル）を加えると沈殿が生成した。す
べてが溶解するまでDMFを加えた（２×10ml）。実施例1
14の生成物（1.52g;8.93ミリモル）を沈殿を避けるため
ゆっくりと加えた。メチレンクロリド（30ml）を加え、
混合物を０℃に冷却した後DDC（2.01g;9.74ミリモル）
を加えた。混合物は０℃で１時間、室温で２時間撹拌し
た後、濾過した。沈殿したDCUはメチレンクロリドで２
回洗浄した。合併した濾液にメチレンクロリド（100m
l）を加え、半飽和NaHCO3溶液（３×100ml,H2O：飽和Na
HCO3溶液,1:1,v/v）、続いて希KHSO4溶液（２×100ml,H
2O：飽和KHSO4溶液,4:1,v/v）、および最後に飽和NaCl
溶液（１×100ml）で洗浄した。有機相は硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、真空下蒸発乾固した（約15mmHg、続いて
約1mmHg）。残渣はメチレンクロリド（32ml）に懸濁
し、室温で35分、および０℃で30分撹拌した後濾過し
た。沈殿物（DCU）はメチレンクロリドで洗浄した。合
併した濾液に０℃で石油エーテル（２容量）を加えたら
油状物が分離した。混合物はデカントし、残った油状物
はメチレンクロリド（20ml）に溶解し、石油エーテル
（２容量）を加えることにより再び沈殿された。不純物
が除去されるまでこの操作を５回繰返した。10％MeOH/C
H2Cl2を展開溶媒とするTLCにより不純物が観察できた。
得られた油状物はメチレンクロリド（20ml）に溶解し、
真空下蒸発乾固すると表記化合物の固形化を起こした。
収量:1.71g（53％）。M.p.68.5〜75.5℃。元素分析：C
17H26N4O7として、実測値（計算値）:C:50.61（51.2
5）;H:6.48（6.58）;N:13.33（14.06）。1 H−NMR（DMSO−d6,250MHz,JHz）;11.36（1H,s,C＝ONＨ
Ｃ＝Ｏ）;7.51＆7.47（1H,d,JH-C=C-H＋6.1;COCH＝Ｘ＝
Ｈ）;7.00＆6.80（1H,t,b,BocNH）;5.83＆5.66（1H,d,J
H-C=C-H＝5.7,COCH＝CH）;4.78＆4.60（2H,s,NCH 2CO
N）;4.37＆4.12（2H,s,NCH 2COOEt）;4.30＆4.15（2H,
m′s,COOCH 2CH3）;3.49−3.46（2H,m′s,BocNHCH2CH
2n）;3.27−3.23＆3.11−3.09（2H,m′s,BocNHCH2CH
2N）;1.46（9H,s,tBu）;1.39−1.23（3H,m′s,COOCH2CH
3）。13 C−NMR（DMSO−d6,2509MHz）;169.4＆149.0（tBuOC＝
Ｏ）;167.6＆167.3（COOEt）;163.8（CH＝CHCON）;155.
8（NCH2 CON）;151.0（NCON）;146.3（COCH＝CHN）;100.
8（COＣＨ＝CHN）;78.1（Me3C）;61.2＆60.6（COOCH 2CH
3）;49.1（NCH2COOEt）;47.8＆47.0（NCH2CON）;38.6Bo
cNHCH2 CH2N）;38.1＆37.7（BocNHCH2CH2N）;28.2（C(CH
3)3）;14.1（CO−OCH2 CH3）。
UV（メタノール；maxnm）;226;264。
IR（KBr;cm-1）;3053m（NH）;1685vs非常に幅広（Ｃ＝
O,COOH,CONH）;1253s（Ｃ−O,COOEt）;1172s（Ｃ−O,CO
OtBu）;718w（∂CH,C−Ｃ−Ｃ−Ｈ）。
FAB−MS m/z（帰属，相対強度）;399（Ｍ＋H,35）;343
（Ｍ＋2H−tBu,100）;299（Ｍ＋2H−Boc,100）;153（Ｍ
−バックボーン,30）。
実施例116 Ｎ−（Bocアミノエチル）−Ｎ−（ウラシルメチレンカ
ルボノイル）グリシン 実施例115の生成物（1.56g;3.91ミリモル）をメタノ
ール（20ml）に溶解させ０℃に冷却した。水酸化ナトリ
ウム（2M,20ml）を加え、混合物は０℃で75分撹拌し
た。pH＝2.0まで塩酸を加えた（1M,46ml）。水相を酢酸
エチルで抽出した（３×50ml＋７×30ml）。合併した酢
酸エチル抽出液は飽和NaCl溶液で洗浄した（360ml）。
酢酸エチル相は硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後真空
下で蒸発乾固させた。残渣をメタノールに溶解し、真空
下蒸発乾固させた。収量:0.55g（38％）。M.p.164〜170
℃。元素分析；C15H22N4O7として実測値（計算値）:C:4
6.68（48.65）;H:6.03（5.99）;N:14.61（15.13）。1 H−NMR（DMSO−d6,250MHz,JHz）:12.83（1H,s,COOH）;
11.36（1H,s,C＝ONH＝Ｏ）;7.52−7.45（1H,m′s,COCH
＝CHN）;7.00＆6.82（1H,t,b,BocNH）;5.67−5.62（1H,
M′s,COCH＝CHN）;4.76＆4.58（2H,s,NCH2CON）;4.26＆
4.05（2H,s,NCH2COON）;3.46−3.39（2H,m′s,BocNHCH2
CH2N）;3.25−3.23＆3.15−3.09（2H,m′s,BocNHCH 2CH2
N）;1.46（9H,s,tBu）。13 C−NMR（DMSO−d6,250MHz）;170.5（tBuOC＝Ｏ）;16
7.2（COOH）;163.9（Ｃ＝Ｃ−ＣON）;155.8（NCH2 CO
N）;151.1（NCON）;146.4（COCH＝CHN）;100.8（COCH＝
CHN）;78.1（Me3 C）;49.1＆47.8（NCH2COOH）;47.6＆4
6.9（NCH2CON）;38.6（BocNHCH2 CH2N）;38.1＆37.6（Bo
cNHCH2CH2N）;28.2（C(CH3)3）。
UV（メタノール；maxnm）;226;264。
IR（KBr;cm-1）;3190（NH）;1685vs非常に幅広（Ｃ＝O,
COOH,CONH）;1253s（Ｃ−O,COOH）;1171s（Ｃ−O,COOtB
u）;682w（∂CH,H−Ｃ＝Ｃ−Ｈ）。
FAB−MS m/z（帰属，相対強度）;371（Ｍ＋H,25）;271
（Ｍ＋Ｈ−Boc,100）。
実施例117 Ｈ−U10−LysNH2 表記化合物の合成は“合成プロトコール10"を用いて
達成された。合成は約100mgのLys（ClZ）−MHBA樹脂で
始められた。粗生成物（12mg）はハイブリダイゼーショ
ン研究のためには十分にきれいであった。５′−（dA）
10およびＨ−U10間のハイブリッドは67.5℃のTmを持っ
ていた。
実施例118 トリフルオロメタンスルホン酸（TFMSA）によるＨ−〔C
aeg〕10−Lys−NH2の脱保護および切断。フッ化水素（H
F）による脱保護および切断の別法 （ａ）“低酸度"TFMSA−TFA−DMS法による側鎖保護基の
脱保護 約0.4gの湿潤Boc−〔Caeg〕10−Lys（ClZ）−MHBA樹
脂（前の実施例の内の一つで製造された）を5mlの固相
反応容器に入れた。Ｎ末端Boc基は次のプロトコールに
より除去された：（１）50％TFA/CH2Cl2,2×１分および
１×30分；（２）100％TFA、２×１分および脱溶媒。ベ
ンジルに基づく側鎖保護基を脱保護するため、いわゆる
“低−酸度"TFMSA法が以下のように実施された:5mlのTF
A−DMS−Ｍ−クレゾール（2:6:2,v/v/v）を含む保存溶
液（Ａ）およびTFA−TFMSA（8:2,v/v）を含む保存溶液
（Ｂ）が調製された。次に以下の工程が実施された；
（３）反応容器中のPNA樹脂に1mlの保存溶液（Ａ）を加
える。振とう２分間、脱溶媒なし；（４）10分毎に200
μｌの保存溶液（Ｂ）（氷／水で冷却）を40分にわたっ
て加え、さらに50分振とうを続ける；（５）脱溶媒し10
0％TFAで洗浄,5×１分，脱溶媒。
（ｂ）“高酸度"TFMSA−TFAS法による樹脂の切断 樹脂から上記の脱保護されたPNAを切断するために、
いわゆる“高酸度"TFMSA法が以下のように実施された:m
−クレゾール−TFA（2:8,v/v）を含む保存溶液（Ｃ）が
調製された。次に以下の工程が実施された；（６）SPPS
容器中の脱保護されたPNA樹脂に1mlの保存溶液（Ｃ）が
加えられた。振とうしながら、２分；（７）1mlの保存
溶液（Ｂ）（氷／水で冷却）を30分以上かけて200μｌ
ずつ加え、さらに150分振とうを続ける；（５）反応容
器中の2ml溶液はフィルターを通してドライアイス／イ
ソプロパノールで冷却した20mlのジエチルエーテル内へ
“吹き出させる”。沈殿過程を完全にするため酸−エー
テル混合物へ200μｌの無水ピリジンを滴下する；
（８）3000rpmで５分間遠心分離；（ａ）上澄液をデカ
ントし、沈殿を３回冷ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥
して水に溶解させ凍結乾燥する。
（ｃ）Ｈ−〔Caeg〕10−Lys−NH2の精製および同定 分析HPLCクロマトグラムは高純度の良好な粗生成物を
示しておりそのプロフィールはＨ−〔Caeg〕10−Lys−N
H2のHF切断から得られたものとほとんど同じであった
が、ただし、当然クロマトグラムの初期に溶出するピリ
ジンのTFMSA塩に起因する追付のピークがあった。精製
および同定は通常の方法により実施された。
当業者は本発明の好適な実施態様に多くの変形および
修正ができることを理解するであろうし、そのよう変形
および修正は本発明の精神から離れることなくできるで
あろう。従って付随する請求の範囲は本発明の真の精神
および範囲にあるすべてのそのような均等な変形を含む
つもりである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 9/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 14/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０５１０／９２ (32)優先日 1992年４月15日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） 前置審査 (73)特許権者 999999999 ベルグ，ロルフ・ヘンリック デンマーク王国2000 フレゼレグスベル ク，ランゲランズヴェイ 20 ベー，３ テーヴェー (72)発明者 ブシャート，オレ デンマーク王国3500 ベルラーゼ，サナ ーゴールスヴェイ 73 (72)発明者 イゴールム，ミハエル デンマーク王国2000 フレゼレグスベル ク，シンシュビルヴェイ ５，３． テ ーヴェー (72)発明者 ニールセン，ペーター・イジル デンマーク王国2980 コッケデール，ヨ ルテヴァンゲト 509 (72)発明者 ベルグ，ロルフ・ヘンリック デンマーク王国2000 フレゼレグスベル ク，ランゲランズヴェイ 20 ベー，３ テーヴェー (56)参考文献 特開 昭62−502338（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−99095（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−156895（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C08G 69/02 - 69/10 C07H 21/04 C07K 9/00 C07K 14/00 C07K 5/00 - 7/66 C12Q 1/68 C08L 77/00 - 77/12

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】主鎖中に位置するアミン窒素原子に別個に
    結合した複数のリガンドを保有するポリアミド主鎖から
    なる化合物であって、前記複数のリガンドは、水素、ヒ
    ドロキシ、(C1−C4)アルカノイル、天然核酸塩基、非天
    然核酸塩基、芳香族部分、DNA挿入体、複素環式部分、
    およびリポーターリガンドからなる群より独立して選択
    され、かつそれらのリガンドのうち少なくとも１個は天
    然核酸塩基、非天然核酸塩基、またはDNA挿入体である
    ことを特徴とする化合物。
  2. 【請求項２】アミン窒素原子が主鎖中において４−６個
    の介在原子により互いに分離されている、請求項１記載
    の化合物。
  3. 【請求項３】下記構造式を有する化合物： 式中： ｎは少なくとも２であり； L1−Lnはそれぞれ、水素、ヒドロキシ、(C1−C4)アルカ
    ノイル、天然核酸塩基、非天然核酸塩基、芳香族部分、
    DNA挿入体、複素環式部分、およびリポーターリガンド
    よりなる群から別個に選ばれ、少なくとも１個のL1−Ln
    は天然核酸塩基、非天然核酸塩基、またはDNA挿入体で
    あり； A1−Anはそれぞれ、単結合、メチレン基、または次式の
    基であり： ［これらの式中： ＸはＯ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはC(CH3)2であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑはそれぞれゼロまたは１−５の整数であり、
    ｐ＋ｑの和は10を越えず； ｒおよびｓはそれぞれゼロまたは１−５の整数であり、
    ｒ＋ｓの和は10を越えず； R1およびR2はそれぞれ、水素、ヒドロキシ−またはアル
    コキシ−またはアルキルチオ−置換されていてもよい(C
    1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチ
    オ、アミノおよびハロゲンよりなる群から別個に選ば
    れ；そして R3およびR4はそれぞれ、水素、(C1−C4)アルキル、ヒド
    ロキシ−またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換
    された(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ア
    ルキルチオおよびアミノよりなる群から別個に選ばれ
    る］； B1−BnはそれぞれＮまたはR3N+であり、ここでR3は上記
    に定めたものであり； C1−CnはそれぞれCR6R7、CHR6CHR7またはCR6R7CH2であ
    り、ここでR6は水素であり、かつR7は天然のα−アミノ
    酸の側鎖よりなる群から選ばれるか、またはR6およびR7
    は、水素、(C2−C6)アルキル、アリール、アルアルキ
    ル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、(C1−C6)アルコキ
    シ、(C1−C6)アルキルチオ、NR3R4およびSR5［ここでR3
    およびR4は上記に定めたものであり、R5は水素、(C1−C
    6)アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−またはアルキ
    ルチオ−置換された(C1−C6)アルキルである］よりなる
    群から別個に選ばれるか、またはR6とR7は一緒になって
    脂環式もしくは複素環式の系を完成し； D1−DnはそれぞれCR6R7、CH2CR6R7またはCHR6CHR7であ
    り、ここでR6およびR7は上記に定めたものであり； G1−Gn-1はそれぞれ、いずれの向きであってもよい−NR
    3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−であ
    り、ここでR3は上記に定めたものであり； Ｑは−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2NR′
    Ｒ″、または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化された誘導
    体であり；そして Ｉは−NHR″′Ｒ″″または−NHR″′Ｃ（Ｏ）Ｒ″″で
    あり、ここでＲ′、Ｒ″、Ｒ″′およびＲ″″は、水
    素、アルキル、アミノ保護基、リポーターリガンド、挿
    入体、キレーター、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂
    質、ステロイド、オリゴヌクレオチド、ならびに可溶性
    および不溶性ポリマーよりなる群から別個に選ばれる。
  4. 【請求項４】下記構造式を有する化合物： 式中： Ｌは天然核酸塩基または非天然核酸塩基であり、その際
    アミノ基はアミノ保護基により保護されていてもよく； Ａは単結合または次式の基であり： ［これらの式中： ＸはＯ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはC(CH3)2であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑはそれぞれゼロまたは１−５の整数であり、
    ｐ＋ｑの和は10を越えず； ｒおよびｓはそれぞれゼロまたは１−５の整数であり、
    ｒ＋ｓの和は10を越えず； R1およびR2はそれぞれ、水素、(C1−C4)アルキル、ヒド
    ロキシ−またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換
    された(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ア
    ルキルチオ、アミノおよびハロゲンよりなる群から別個
    に選ばれ；そして R3およびR4はそれぞれ、水素、(C1−C4)アルキル、ヒド
    ロキシ−またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換
    された(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ア
    ルキルチオおよびアミノよりなる群から別個に選ばれ
    る］ ただし、Ｌが水素である場合、Ａは単結合ではなく； ＢはＮまたはR3N+であり、ここでR3は上記に定めたもの
    であり； ＣはそれぞれCR6R7、CHR6CHR7またはCR6R7CH2であり、
    ここでR6は水素であり、かつR7は天然のα−アミノ酸の
    側鎖よりなる群から選ばれるか、またはR6およびR7は、
    水素、(C2−C6)アルキル、アリール、アルアルキル、ヘ
    テロアリール、ヒドロキシ、(C1−C6)アルコキシ、(C1
    −C6)アルキルチオ、NR3R4およびSR5［ここでR3およびR
    4は上記に定めたものであり、R5は水素、または(C1−
    C6)アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−もしくはア
    ルキルチオ−置換された(C1−C6)アルキルである］より
    なる群から別個に選ばれるか、またはR6とR7は一緒にな
    って脂環式もしくは複素環式の系を完成し； ＤはそれぞれCR6R7、CH2CR6R7またはCHR6CHR7であり、
    ここでR6およびR7は上記に定めたものであり； Ｅはそれぞれ−COOH、CSOH、SOOH、SO2OHまたはそれら
    の活性化もしくは保護された誘導体であり；そして ＦはそれぞれNHR3またはNPgR3であり、これらにおいてR
    3は前記に定めたものであり、Pgはアミノ保護基であ
    る。
  5. 【請求項５】下記構造式のいずれかを有する化合物： 式中： Ｌは天然核酸塩基または非天然核酸塩基であり、その際
    アミノ基はアミノ保護基により保護されていてもよく； Ａは単結合または次式の基であり： ［これらの式中： ＸはＯ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはC(CH3)2であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑはそれぞれゼロまたは１−５の整数であり、
    ｐ＋ｑの和は10を越えず； ｒおよびｓはそれぞれゼロまたは１−５の整数であり、
    ｒ＋ｓの和は10を越えず； R1およびR2はそれぞれ、水素、(C1−C4)アルキル、ヒド
    ロキシ−またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換
    された(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ア
    ルキルチオ、アミノおよびハロゲンよりなる群から別個
    に選ばれ；そして R3およびR4はそれぞれ、水素、(C1−C4)アルキル、ヒド
    ロキシ−またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換
    された(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ア
    ルキルチオおよびアミノよりなる群から別個に選ばれ
    る］ ただし、Ｌが水素である場合、Ａは単結合ではなく； ＢはＮまたはR3N+であり、ここでR3は上記に定めたもの
    であり； ＣはそれぞれCR6R7、CHR6CHR7またはCR6R7CH2であり、
    ここでR6は水素であり、かつR7は天然のα−アミノ酸の
    側鎖よりなる群から選ばれるか、またはR6およびR7は、
    水素、(C2−C6)アルキル、アリール、アルアルキル、ヘ
    テロアリール、ヒドロキシ、(C1−C6)アルコキシ、(C1
    −C6)アルキルチオ、NR3R4およびSR5［ここでR3およびR
    4は上記に定めたものであり、R5は水素、または(C1−
    C6)アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−もしくはア
    ルキルチオ−置換された(C1−C6)アルキルである］より
    なる群から別個に選ばれるか、またはR6とR7は一緒にな
    って脂環式もしくは複素環式の系を完成し； ＤはそれぞれCR6R7、CH2CR6R7またはCHR6CHR7であり、
    ここでR6およびR7は上記に定めたものであり； Ｅはそれぞれ−COOH、CSOH、SOOH、SO2OHまたはそれら
    の活性化もしくは保護された誘導体であり；そして ＦはそれぞれNHR3またはNPgR3であり、これらにおいてR
    3は前記に定めたものであり、Pgはアミノ保護基であ
    る。
  6. 【請求項６】Ｌが、天然核酸塩基または非天然核酸塩基
    である、請求項４または５に記載の化合物
  7. 【請求項７】下記構造式を有する化合物： 式中： Ｌはそれぞれ、水素、フェニル、複素環式部分、天然核
    酸塩基、非天然核酸塩基よりなる群から別個に選ばれ；
    ただし少なくとも１個のＬは天然核酸塩基または非天然
    核酸塩基であり； R7′はそれぞれ、水素、および天然のα−アミノ酸の側
    鎖よりなる群から別個に選ばれ； ｎは１−60の整数であり； ｋ、ｌおよびｍはそれぞれ別個にゼロまたは１−５の整
    数であり； RhはOH、NH2または−NHLysNH2であり；そして RiはＨまたはCOCH3である。
  8. 【請求項８】請求項１記載の化合物の製造方法であっ
    て、下記の工程： Ａ）ポリマー系支持体を用意し、該ポリマーはアミノ酸
    との固定用結合を形成しうる化学基により官能化されて
    おり； Ｂ）固定用結合を介して該ポリマーを第１アミノ酸と結
    合させ、該第１アミノ酸は構造式（IV）を有するもので
    あり： ｛式中： Ｌは天然核酸塩基、非天然核酸塩基、芳香族部分、DNA
    挿入体、複素環式部分、およびリポーターリガンドより
    なる群から選ばれ、これらにおいてアミノ基はアミノ保
    護基により保護されていてもよく； Ａは単結合または次式の基であり： ［これらの式中： ＸはＯ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはC(CH3)2であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑはゼロまたは１−５の整数であり、ｐ＋ｑの
    和は10を越えず;rおよびｓはゼロまたは１−５の整数で
    あり、ｒ＋ｓの和は10を越えず；R1およびR2は、水素、
    (C1−C4)アルキル、ヒドロキシ−またはアルコキシ−ま
    たはアルキルチオ−置換された(C1−C4)アルキル、ヒド
    ロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロ
    ゲンよりなる群から別個に選ばれ；そして R3およびR4は、水素、(C1−C4)アルキル、ヒドロキシ−
    またはアルコキシ−またはアルキルチオ−置換された(C
    1−C4)アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチ
    オおよびアミノよりなる群から別個に選ばれる］； ＢはＮまたはR3N+であり、ここでR3は上記に定めたもの
    であり； ＣはCR6R7、CHR6CHR7またはCR6R7CH2であり、ここでR6
    は水素であり、かつR7は天然のα−アミノ酸の側鎖より
    なる群から選ばれるか、またはR6およびR7は、水素、(C
    2−C6)アルキル、アリール、アルアルキル、ヘテロアリ
    ール、ヒドロキシ、(C1−C6)アルコキシ、(C1−C6)アル
    キルチオ、NR3R4およびSR5［ここでR3およびR4は上記に
    定めたものであり、R5は水素、または(C1−C6)アルキ
    ル、ヒドロキシ−、アルコキシ−もしくはアルキルチオ
    −置換された(C1−C6)アルキルである］よりなる群から
    別個に選ばれるか、またはR6とR7は一緒になって脂環式
    もしくは複素環式の系を完成し； ＤはCR6R7、CH2CR6R7またはCHR6CHR7であり、ここでR6
    およびR7は上記に定めたものであり； ＥはCOOHまたはその活性化もしくは保護された誘導体で
    あり；そして ＦはNPgR3であり、ここでR3は前記に定めたものであ
    り、Pgはアミノ保護基である｝； Ｃ）結合した第１アミノ酸からアミノ保護基を除去して
    遊離アミノ基を生成させ；そして Ｄ）この遊離アミノ基を式（IV）の第２アミノ酸と反応
    させて、ペプチド鎖を形成する； を含む方法。
  9. 【請求項９】二本鎖ポリヌクレオチドの配列特異性認識
    法であって、天然RNAと異なりかつ該ポリヌクレオチド
    の一方の鎖と結合しこれにより他方の鎖と置換する請求
    項１記載の化合物に、該ポリヌクレオチドを接触させる
    ことよりなる方法。
  10. 【請求項１０】ヒトを除く生物の遺伝子の発現を調節す
    る方法であって、該遺伝子から誘導されるDNAまたはRNA
    に特異的に結合する請求項１記載の化合物を該生物に投
    与することよりなる方法。
  11. 【請求項１１】ヒトを除く生物における望ましくない蛋
    白質産生に伴う状態を処置する方法であって、該蛋白質
    産生を制御する遺伝子から誘導されるDNAまたはRNAに特
    異的に結合する、有効量の請求項１記載の化合物に、該
    生物を接触させることよりなる方法。
  12. 【請求項１２】ヒトを除く生物の細胞中におけるDNAま
    たはRNAの分解を誘発する方法であって、該DNAまたはRN
    Aに特異的に結合する請求項１記載の化合物を該生物に
    投与することよりなる方法。
  13. 【請求項１３】細胞またはウイルスを死滅させる方法で
    あって、該細胞またはウイルスのゲノムの一部に特異的
    に結合する請求項１記載の化合物に、該細胞またはウイ
    ルスを接触させることよりなる方法。
  14. 【請求項１４】生物の遺伝子の発現を調節するための組
    成物であって、請求項１記載の化合物、および少なくと
    も１種の薬剤学的に有効なキャリヤー、結合剤、増粘
    剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤または界面活性剤を含む組
    成物。
  15. 【請求項１５】生物における望ましくない蛋白質産生に
    伴う状態を処置するための組成物であって、請求項１記
    載の化合物、および少なくとも１種の薬剤学的に有効な
    キャリヤー、結合剤、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤
    または界面活性剤を含む組成物。
  16. 【請求項１６】生物の細胞中におけるDNAまたはRNAの分
    解を誘発するための組成物であって、請求項１記載の化
    合物、および少なくとも１種の薬剤学的に有効なキャリ
    ヤー、結合剤、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤または
    界面活性剤を含む組成物。
  17. 【請求項１７】細胞またはウイルスを死滅させるための
    組成物であって、請求項１記載の化合物、および少なく
    とも１種の薬剤学的に有効なキャリヤー、結合剤、増粘
    剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤または界面活性剤を含む組
    成物。
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