JP2003235590A - 核酸類縁体並びに診断薬および分析方法におけるその使用方法 - Google Patents

核酸類縁体並びに診断薬および分析方法におけるその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 一つまたはそれ以上の化学的または微生物的個体単位に
ついてその捕捉、認識、検出、同定または定量化に使用
する核酸類縁体であって、（ａ）主鎖に沿ったそれぞれ
空間を置いた異なる位置において複数のリガンドを有す
るポリアミド主鎖から構成されるペプチド核酸（ＰＮ
Ａ）において、前記リガンドがそれぞれ独立して天然の
核酸塩基、非天然の核酸塩基または核酸塩基結合基であ
り、前記リガンドは各々前記主鎖の窒素原子に直接また
は間接に結合せしめられ、かつ前記リガンドが４つから
８つまでの介在する原子によって前記主鎖のなかで相互
に分離された窒素原子を有するものである、前記ペプチ
ド核酸（ＰＮＡ）、（ｂ）核酸類縁体であって、相補的
配列の核酸とハイブリッド形成して、前記類縁体に相当
する従来公知のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸と
の間で形成されたハイブリッドよりも熱による変性に対
する安定性がより高いハイブリッドを形成する能力を有
する前記核酸類縁体；または（ｃ）一本鎖が前記類縁体
に相補的である配列を有する二重鎖核酸とハイブリッド
形成して、かくして前記一本鎖からもう一方の鎖を置換
せしめる能力を有する前記核酸類縁体、及びこれらの核
酸類縁体を診断薬および分析方法に用いる前記方法が記
載される。好ましい化合物は、以下の式を有する： 【化学式ＩＩＩ】 なお本式において：Ｌはそれぞれ独立して、水素、フェ
ニル、例えば一つ、二つまたは三つのリングの異項環、
天然の核酸塩基および非天然の核酸塩基から成る群から
選択される；Ｒ７’はそれぞれ独立して、水素および天
然のアルファアミノ酸の側鎖から成る群から選択され
る；ｎは、１から６０までの整数である；ｋ、ｌおよび
ｍのそれぞれは独立して、ゼロまたは１から５までの整
数である；好ましくは、ｋとｍとの和は１または２であ
り、最も好ましくは１である；Ｒｈは、ＯＨ、ＮＨ２ま
たは−ＮＨＬｙｓＮＨ２である；およびＲｉはＨまたは
ＣＯＣＨ３である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】本発明は、診断薬の分野におい
て、例えば一つまたはそれ以上の化学的または微生物学
的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定または
定量化などを行うために幾つかの核酸類縁体を使用する
ことに関する。
【０００２】
【従来の技術】オリゴジオキシリボヌクレオチド（オリ
ゴ−ＤＮＡ類）は、診断薬の手法においてますます頻繁
に用いられおり、例えば、特異的な微生物の確認を行う
試験、例えば疾病など一般的な素因を確認するための試
験、法医学分野および微生物学全般などにおいて用いら
れている。このような分野におけるオリゴ−ＤＮＡ類の
用途は、当然のことながら、かかるオリゴ−ＤＮＡ類が
相補的核酸の塩基配列とハイブリドを形成することがで
きる能力に依拠している。例として挙げれば、標識した
オリゴ−ＤＮＡプロ−ブは、固定化した標的ＤＮＡ類を
探索して特異的な塩基配列の存在を確認するためのハイ
ブリダイゼ−ション測定法に用いられている。増幅操作
法においては、オリゴ−ＤＮＡ類の有するこのようなハ
イブリダイゼ−ション特性を利用して、増幅するべき鋳
型分子にオリゴ−ＤＮＡプライマ−をハイブリッドさせ
でいるのである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】長さが１００塩基対に
達するオリゴ−ＤＮＡ類は現在、固体支持体法を用いて
合成されており、完全自動合成装置が幾つか市販されて
いる。しかしながら、これまで注目が払われてきたの
は、塩基配列に特異的に天然ＤＮＡとハイブリド形成し
ながら、なおＤＮＡそれ自体とは有利に異なる化学的特
性を有する能力がある合成ＤＮＡ類縁体を構築・構成す
ることが出来るか否かということであった。このような
研究は大半は、 ”アンチセンス”治療薬にこのような
化合物が用いる可能性があるのではないかという動機の
基づいているのであるが、この場合従来のオリゴ−ＤＮ
Ａ類を使用すると幾つかの困難が伴うのである。その理
由は、このような非修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレ
ア−ゼが天然に存在するため生体内（インビボ）で半減
期が短く、また量の多少を問わず製造コストが高くしか
も細胞膜透過性能が劣るからである。
【０００４】例えば、国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ８６
／０５１８号において、おそらくは天然の核酸と塩基配
列に特異的にハイブリダイゼ−ションする能力を有する
リガンドの、典型的にはヌクレオチド塩基の配列を有す
る主鎖を持ったＤＮＡ類縁体が開示されており、また主
鎖として、異なったものが数多く開示されている。この
ような化合物を提供する方法について、具体的な例示は
一切示されておらず、請求されている化合物のＤＮＡに
対する親和性を示すデ−タも一切ない。国際特許出願
（ＰＣＴ）ＷＯ８６／０５５１９号は、同種のＤＮＡ類
縁体から成る診断薬試薬および診断薬システムを特許請
求しているが、やはりここでも具体的な例示は全くな
い。
【０００５】国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ８９／１２０
６０号においては、合成の原料たる種々の構成単位に基
づいたオリゴヌクレオチド類縁体が記載されている。こ
のような構成単位の例示はなされているが、これら構成
単位からオリゴヌクレオチド類縁体を現実に製造する実
施例は全くなく、従ってこのような類縁体の有する性能
について明示も一切されていない。
【０００６】更には、ヌクレア−ゼに対する抵抗性を高
めかつアンチセンセンス治療方法に用いるＤＮＡの安定
性を全般的に改良する目的で、ＤＮＡ主鎖を修飾するこ
とが知られている。またＤＮＡ類縁体を設計する別の試
みも幾つか、上記したＷＯ８６／０５５１８の導入部に
おいて議論されている。
【０００７】一般的な経験としては、天然ＤＮＡの主鎖
を修飾すると、修飾されたオリゴヌクレオチドとその相
補的である通常のオリゴヌクレオチドとの間において形
成されるハイブリッドの安定性は、Ｔｍ値の測定によっ
て求めた場合低下する、ということであった。従って、
この領域における従来の知恵は、主鎖を種々に修飾する
と、必ずハイブリッドが不安定になる、即ちＴｍ値が低
下することになるということであり、従って、実現可能
な最良の結果としてＴｍ値を若干低下させたハイブリッ
ドを得るために、このような修飾は出来るだけ少なくす
るべきであるということである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、好ましくは、
相補的配列の従来公知の核酸とハイブリッドを形成し、
而もそのハイブリッドのＴｍ値における安定性を相当す
る配列を持つ従来公知の核酸が形成するハイブリッドよ
りも高くするような特性および／または相当する配列を
持つ前記従来公知の相当する核酸よりも不適合の程度に
関与する配列と比較した相補的配列に対する選択性をよ
り大きくする特性といった、従来知られていない特性を
有する新規な構造の核酸類縁体及びを診断薬または分析
にかかる核酸類縁体を使用する方法に関する。
【０００９】
【発明の実施形態】本発明は、一つまたはそれ以上の化
学的または微生物学的個体単位についてその捕捉、認
識、検出、同定または定量化を行うために使用する核酸
類縁体であって、かかる類縁体が以下であるものを提供
する：即ち、（ａ）主鎖に沿ったそれぞれ空間を置いた
異なる位置において複数のリガンドを有するポリアミド
主鎖から構成されるペプチド核酸（ＰＮＡ）において、
前記リガンドがそれぞれ独立して天然の核酸塩基、非天
然の核酸塩基または核酸塩基結合基であり、前記リガン
ドは各々前記主鎖の窒素原子に直接または間接に結合せ
しめられ、かつ前記リガンドが４つから８つまでの介在
する原子によって前記主鎖のなかで相互に分離された窒
素原子を有するものである、前記ペプチド核酸（ＰＮ
Ａ）、（ｂ）核酸類縁体であって、相補的配列の核酸と
ハイブリッド形成して、前記類縁体に相当する従来公知
のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸との間で形成さ
れたハイブリッドよりも熱による変性に対する安定性が
より高いハイブリッドを形成する能力を有する前記核酸
類縁体；または（ｃ）核酸類縁体であって、一本鎖が前
記類縁体に相補的である配列を有する二重鎖核酸とハイ
ブリッド形成して、かくして前記一本鎖からもう一方の
鎖を置換せしめる能力を有する前記核酸類縁体。
【００１０】上記第（ａ）項において定義された核酸類
縁体（ＰＮＡ類）の主鎖に原子を有する該窒素の分離
は、好ましくは五つの原子によって行われるのが好まし
い。式（Ｉ）（下記）を有する核酸類縁体において、か
かる分離によって、ＤＮＡに対する親和性が最も強くな
ることが見出されたのである。しかしながら、一つまた
はそれ以上のリガンドを最適以下の間隔で間に入れるこ
とによって、即ち５つ以上の原子の間隔、例えば１４個
までの原子おいて間に入れることによって、該ＰＮＡ類
とＤＮＡとの間の結合力を減少させるのが所望される場
合もある。リガンド間の間隔の２５％以下が６個の原子
またはそれ以上であるのが好ましい。更に好ましくは、
リガンド間の間隔の１０ないし１５％以下が、６個の原
子またはそれ以上である。該リガンドを有する（直接ま
たは結合基を介して）アザ窒素原子はそれ自体は、上記
した間隔においてカウントしない。
【００１１】ＤＮＡ結合力を減少させる別の方法または
もう一つの方法は、このようなリガンドの内幾つかを除
外し、その代わりに例えば水素のようなＤＮＡの結合に
殆どまたは全く寄与しない原子部を導入することであ
る。好ましくは、このようなリガンド位置の２５％以下
は、例えば１０から２５％以下が非結合性原子部によっ
て占められる。
【００１２】典型的なリガンドとしては、四つの主要天
然ＤＮＡ塩基（即ち、チミン、シトシン、アデニンまた
はグアニン）またはその他の天然の核酸塩基（例えば、
イノシン、ウラシル、５−メチルシトシンまたはチオウ
ラシル）または適当な結合基を介してペプチド主鎖に結
合された人工の塩基類（例えば、ブロモウラシル、アザ
アデニン類またはアザグアニン類など）が挙げられる。
【００１３】好ましい実施態様において、本発明におい
て使用される核酸類縁体は、以下の一般式（Ｉ）を有す
る：
【００１４】
【化学式Ｉ】
【００１５】なお上式において：ｎは、少なくとも２で
ある、Ｌ1−Ｌnのそれぞれは独立して、水素、ヒドロキ
シ、（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル、天然の核酸塩基類、非
天然の核酸塩基類、芳香族原子残基、ＤＮＡ挿入基、核
酸塩基結合基およびリポ−タリガンドから構成される群
から選択されるが、Ｌ 1−Ｌnの内の少なくとも一つは、
天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基、ＤＮＡ挿入基また
は核酸塩基結合基である；Ａ1−Ａnのそれぞれは、一重
結合、メチレン基または下記式（ＩＩａ）又は（ＩＩ
ｂ）で表される基である：
【００１６】
【化学式ＩＩａ】
又は
【００１７】
【化学式ＩＩｂ】
【００１８】なお本式において；Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、
ＮＲ3、ＣＨ2またはＣ（ＣＨ3）2である；Ｙは、一重結
合、Ｏ、ＳまたはＮＲ4である；ｐおよびｑのそれぞれ
は、１から５までの整数であり、ｐ＋ｑの和は、１０以
下である；ｒおよびｓのそれぞれは、ゼロまたは１から
５までの整数であり、ｒ＋ｓの和は、１０以下である；
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシも
しくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換されてい
てもよい（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキ
シ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンから構成され
る群から選択される；またＲ3およびＲ4のそれぞれは独
立して、水素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシもし
くはアルコキシもしくはアルキルチオで置換された（Ｃ
1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル
チオおよびアミノから構成される群から選択される；Ｂ
1−Ｂnのそれぞれは、ＮまたはＲ3Ｎ+であり、ここにお
いてＲ3は上記において定義された通りである；Ｃ1−Ｃ
nのそれぞれは、ＣＲ6Ｒ7、ＣＨＲ6ＣＨＲ7またはＣＲ6
Ｒ7ＣＨ2であり、ここにおいてＲ6は、水素でありまた
Ｒ7は、天然のアルファアミノ酸の側鎖から構成される
群から選択され、またはＲ6およびＲ7は独立して、水
素、（Ｃ2−Ｃ6）アルキル、アリ−ル、アラルキル、ヘ
テロアリ−ル、ヒドロキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、
（Ｃ1−Ｃ6）アルキルチオ、ＮＲ3Ｒ4およびＳＲ5から
構成される群から選択されるが、ここにおいてＲ3およ
びＲ4は、上記において定義された通りであり、Ｒ5は、
水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロキシもしくはアル
コキシもしくはアルキルチオで置換された（Ｃ1−Ｃ6）
アルキルであり、またはＲ6およびＲ7とは一緒になっ
て、脂環系または異項環系を形成する；Ｄ1−Ｄnのそれ
ぞれは、ＣＲ6Ｒ7、ＣＨ2ＣＲ6Ｒ7またはＣＨＲ6ＣＨＲ
7であり、ここにおいてＲ6およびＲ7は、上記において
定義された通りである；Ｇ1−Ｇn-1のそれぞれは、いず
れかの方向での−ＣＯＮＲ3−、ＣＳＮＲ3−、−ＳＯＮ
Ｒ3−または−ＳＯ2ＮＲ3−であって、なおここにおい
てＲ3は、上記において定義した通りである；Ｑは、−
ＣＯ2Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ"、−ＳＯ3Ｈもしくは−ＳＯ2
ＮＲ'Ｒ"または−ＣＯ2Ｈもしくは−ＳＯ3Ｈの活性化誘
導体である；またＩは、−ＮＨＲ"'Ｒ""または−ＮＲ"'
Ｃ（Ｏ）Ｒ""であり、ここ においてＲ'、Ｒ"、Ｒ'"お
よびＲ""は独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、
リポ−タリガンド、挿入基、キレ−ト化剤、ペプチド、
タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌク
レオチドならびに可溶および不溶のポリマ−から構成さ
れる群から選択されるものであって、何れも一つの検出
可能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめ
られたものである Ｌ1
【００１９】好ましいペプチド核酸は、以下の一般式
（ＩＩＩ）を有する：
【００２０】
【化学式ＩＩＩ】
【００２１】なお本式において：Ｌはそれぞれ独立し
て、水素、フェニル、天然の核酸塩基および非天然の核
酸塩基から構成される群から選択される；Ｒ7'は、水素
および天然のアルファアミノ酸の側鎖から構成される群
から選択される；ｎは、１から６０までの整数である；
ｋおよびｍのそれぞれは独立して、ゼロまたは１であ
る；またｌは独立して、ゼロから５である；Ｒhは、Ｏ
Ｈ、ＮＨ2または−ＮＨＬｙｓＮＨ2である；およびＲi
は、ＨまたはＣＯＣＨ3であって、何れも一つの検出可
能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめら
れたものである．
【００２２】特に好ましいのは、式（ＩＩＩ）において
Ｌが独立して、核酸塩基であるチミン（Ｔ）、アデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシ
ル（Ｕ）とから成る群から選択され、特にチミンであ
り、またｎが１から３０ までの整数であり、特に４か
ら２０までの整数である化合物である。このような化合
物の一例は第１図に示してあるが、この図によれば、か
かる化合物と一本鎖ＤＮＡとの間の構造上の類似性が明
らかである。
【００２３】本発明のペプチド核酸類は、溶液中または
固相上の何れかで標準ペプチド合成方法を採用して合成
してもよい。用いたこれらのシントンは、特別に設計し
たモノマ−アミノ酸またはそれらの活性化誘導体であっ
て、標準的な保護基で保護されたものであればよい。こ
のようなオリゴヌクレオチド類縁体はまた、相当する二
酸とジアミンを用いることによって合成することもでき
る。
【００２４】即ち、本発明に使用する化合物を得るため
に用いたモノマ−シントンは、以下の一般式（ＩＶ）、
（Ｖ）及び（ＶＩ）でそれぞれ表されるアミノ酸、二酸
およびジアミンから成る群から選択されてもよい。
【００２５】
【化学式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）】
【００２６】なお本式においてＬ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ
は、上記のいて定義した通りである。但し、本式におけ
るアミノ基は全て、アミノ保護基によって保護されてい
てもよい；Ｅは、ＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ
2ＯＨまたはこれらの活性化された誘導体であればよ
い；およびＦは、ＮＨＲ3またはＮＰｇＲ3であり、ここ
においてＲ3は上記において定義された通りであり、Ｐ
ｇはアミノ保護基である。
【００２７】好ましいモノマ−シントンは、以下の式
（ＶＩＩ）を有するアミノ酸である：
【００２８】
【化学式ＶＩＩ】
【００２９】またはアミノ−保護酸および／またはこれ
らの末端活性化誘導体であるが、ここにおいてＬは、水
素、フェニル、異項環、天然の核酸塩基、非天然の核酸
塩基およびこれらの保護された誘導体から成る群から選
択される；およびＲ7は独立して、水素および天然のア
ルファアミノ酸の側鎖から成る群から選択される。特に
好ましいのは、式（４）においてＲ7'が水素でありかつ
Ｌは核酸塩基であるチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シ
トシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）な
らびにこれらの保護された誘導体から成る群から選択さ
れるシントンである。
【００３０】本発明に従えば、一つまたはそれ以上の化
学的または微生物学的個体単位についてその捕捉、認
識、検出、同定または定量化などを行うために上記にお
いて定義された核酸類縁体を使用することが包含され
る。検出されるかかる個体単位としては先ず第一に、核
酸でありかつ前記固体単位はハイブリダイゼ−ションに
よってその特異的な核酸塩基配列を経由して検出される
ことが、通常は意図される。
【００３１】前記において定義された核酸類縁体は、固
体支持体に固定化された本発明において用いられる核酸
類縁体にハイブリッド形成条件下で核酸に接触せしめる
ことから成る核酸を捕捉する方法において、該固定化核
酸類縁体が、補足されるべき前記核酸または核酸類縁体
とハイブリッド形成に適したリガンドの配列を有してい
る前記核酸捕捉方法に使用してもよい。
【００３２】該固体支持体は、親和性捕捉に使用する従
来公知のオリゴヌクレオチドを固定化することに関連し
て公知である種々の形態を取ってもよい。固体支持体は
例えば、プレ−ト、フィルタ−、マルチウェルプレ−ト
またはディップスティックであればよく、またビ−ズの
ような個別の粒子の形状を取ってもよく、かかる粒子は
カラムに保持し、次いで核酸を含有する溶液をこのカラ
ムに流して所望の種を溶液から捕捉させればよい。
【００３３】捕捉された核酸は、極めて多くの方法によ
って認識され、検出され、同定されまたは定量化される
ことが出来る。洗浄後はかかる捕捉された核酸は系内に
残留する唯一の核酸であり得るので、捕捉された配列に
特異的か否かを問わず、核酸の存在を証明するのに適し
た試薬系であれば如何なるものによっても検出され得
る。即ち、例として挙げれば、捕捉された核酸がＤＮＡ
でありかつ比較的短いＰＮＡによって一本鎖の形態で捕
捉された場合、懸垂状態の一重鎖ＤＮＡは、ヌクレア−
ゼによって消化してもよく、かつこのような消化物は通
常の方法に依って検出すればよい。このＤＮＡが二本鎖
でありかつ該ＰＮＡが再び比較的短い場合は、該ＤＮＡ
のうち当初の二本鎖の形態で残留している（即ち、ＰＮ
Ａによって変位・置換されていない）部分は、ＰＮＡ−
ＤＮＡ二重らせんには結合しない通常のＤＮＡ挿入基に
よって検出することが出来る。核酸を認識する抗体を、
固定化した核酸類縁体に結合せしめた核酸（ＲＮＡ、ｄ
ｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ）を検出するために使用して
もよい。
【００３４】固体支持体に固定化した通常のオリゴヌク
レオチドを用いて核酸種のアフィニティ−（親和性）捕
捉を行うに際しては、標的核酸を生成することが通常は
必要である。試料中に含まれてもよいヌクレア−ゼは、
固定化した核酸を攻撃する傾向がある。実際において
は、非特異性が極めて高い結合を用いると、特定な結合
は殆ど得られない。更には、当該捕捉が生起しないうち
に、かかるＤＮＡを一本鎖にまで編変性せることが必要
である。
【００３５】上記式Ｉの核酸類縁体は、ヌクレア−ゼの
攻撃を受けにくく、典型的には相補的配列の核酸に対す
る親和性が高いため、固定化した種として通常のオリゴ
ヌクレオチドを用いて得た場合よりもより高度の特異的
結合を与えるのである。更には、本発明に従って使用さ
れた核酸類縁体は定型的には、相補的配列の核酸とハイ
ブリッドを形成する能力を有しているが、かかる核酸を
先ず一本鎖に変性せしめることはない。一旦標的核酸が
捕捉されると、固定化された核酸類縁体および捕捉され
た核酸を例えば加熱とジメチルホルムアミドなどのよう
な脱ハイブリダイゼ−ションの条件に供することによっ
て、固定化された核酸類縁体から開放・放出させればよ
い。
【００３６】例として挙げれば、かかる固定化した核酸
類縁体は、ｍＲＮＡのポリＡ尾部とハイブリッド形成可
能であってかくして当該ｍＲＮＡを捕捉する、例えばチ
ミンなど連続リガンドから構成されていればよい。
【００３７】本発明は、上記したような固定化した核酸
類縁体から構成される親和性捕捉カラムを包含する。
【００３８】すなわち、本発明はまた、固相生化学（例
えば、”Ｓｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ − Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈ
ｅｔｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ”、 Ｗ．Ｈ． Ｓｃｏｕｔ
ｅｎ編著、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ、１９８３を参照）、特に固相バイオシス
テム、特にバイオアッセイまたは種々の固相技法であっ
て、診断的検出／定量化または相補的核酸の親和性生成
に関するもの（例えば、”ＡｆｆｎｉｔｙＣｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ − Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ”、Ｐ．Ｄ．Ｇ． Ｄｅａｎ、Ｗ．Ｓ．Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｆ．Ａ．Ｍｉｄｄｌｅ編著、Ｉ
ＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ １９８
６；”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ − Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａ
ｃｈ”、Ｂ．Ｄ． Ｈａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈ
ｉｇｇｉｎｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、Ｏｘｆ
ｏｒｄ １９８７を参照）に係ることが、理解可能であ
ろう。かかるバイオアッセイまたは精製法を実行する今
日的方法は、セルロ−ス、気孔率をコントロ−ルしたも
のを含むガラスビ−ズ（Ｍｉｚｕｔａｎｉ、ｅｔ ａ
ｌ．。Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９８６、３５
６、２０２）ビ−ドにした固体支持体、”Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ”、”Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ”、アガロ−ス、ポリア
クリルアミド、多孔性粒状アルミナ、メタアクリル酸ヒ
ドロキシアルキルエステルのゲル、ジオ−ル結合シリ
カ、多孔性セラミック、またはナイロンやニトロセルロ
−スのフィルタ−ディスクなどの連続材料に物理的に吸
着させたかまたは実質的に永久的な共有結合によるアン
カリング結合を介して結合させた”通常の”または若干
修飾したオリゴヌクレオチドを用いるのが殆ど専らであ
る。一つの例において、ｍＲＮＡを含むポリＡテイルを
親和性単離するためのセルロ−スビ−ズ上でオリゴ−ｄ
Ｔを化学的に合成することを用いている（”Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”におけるＧｉｌｈ
ａｍ、Ｌ． ＧｒｏｓｓｍａｎｎおよびＫ． Ｍｏｌｄ
ａｖｅ編著、２１巻、ｐａｒｔ Ｄ、ペ−ジ１９１、Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎ
ｄ Ｌｏｎｄｏｎ、１９７１）。上記した方法は全て、
本発明の文脈において適用可能である。しかしながら、
可能ならば、共有結合の方が、該当する分子の物理的吸
着よりも好ましいのである。その理由は、後者の方法に
は、固定化した分子の内のいくつかがハイブリダイゼ−
ションまたは親和性過程において洗い流され得る（脱着
される）という欠点があるからである。すなわち、支持
体材料の表面に吸着された種は、支持体が当該バイオア
ッセイ／精製方法の過程において供される種々の処理の
間において失われるのであるが、そのような逸失の程度
を制御することが殆ど出来ない。このような問題の重大
さは勿論ことながら、吸着された種と”遊離状態の”種
との間における平衡が確立する差異の速度に大幅に依存
して変わるであろう。場合によっては、許容可能な精度
および／または再現性をもって定量的なバイオアッセイ
を実施することは、実際上不可能であるかもしれない。
このような支持体を体液、水性試薬または洗浄媒体で処
理する過程において吸着された種が逸失することは、一
般的にいえば分子量が比較的低い種について最も深刻と
なることが期待されるであろう。オリゴヌクレオチドと
比較して、ＰＮＡ分子は、強度に求核性および／または
親電子性の中心を包含しているために固体支持体により
付着し易いのである。更には、固体支持体の上において
オリゴヌクレオチドを直接的に組み立て・構築すること
は、固定化した分子をロ−ドするに際して極めてわずか
しかロ−ド出来ないという欠点が生じるのである。その
理由は主として、オリゴヌクレオチドを構築するために
の最高技術水準であるホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学の利用を可能ならしめる種
々の物質・材料の表面性能・能力が低くなるためである
（Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９８１、２２、
１８５９；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９
８５、２３２、２８１）。またこのようなことには、表
面／ロ−ディング性能が高い固体支持体に適している別
のフォスファイトトリエステル法を用いることによって
（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｍａｈａｄｅｖａｎ、
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７６、９８、３６
５５）、比較的短いオリゴヌクレオチドしか得ることが
出来ないという事実が伴う。しかしながら、通常の固相
ペプチド合成に関しては、後者の支持体は、固定化した
ＰＮＡ分子を構築するうえで優れた材料である（側鎖保
護基は、このような鎖を固体支持体に保持するアンカ−
リング結合を開裂させることなく、合成されたＰＮＡか
ら除去することが可能である）。すなわち、ＰＮＡ種
は、相補的核酸に対する結合親和性が極めて高いことに
関して、上記した固相技法から利点を受け、また二重鎖
構造で存在する核酸をさらにユニ−クに配列特異的に認
識すること（およびかかる核酸に強力な結合すること）
をからも利点を受けるのである。このようなＰＮＡ種は
また、大量に固体支持体にロ−ドすることが可能であ
り、かくして当該固相法の感度／能力を増大せしめるこ
とになる。更には、固相生化学でのＰＮＡの使用に関す
るいくつかの種類の研究が、最近報告された”光−指示
された、空間的に取組可能な、平衡化学的合成”技術、
すなわち固相化学と写真石版術とを組み合わせて実質的
に同時に極めて多種の、但し同定可能で、永久的に固定
化された化合物（例えばペプチド）を精製せしめる技法
を利用することによって着手され、容易にされまたは大
いに加速されることが可能である。
【００３９】式ＩのＰＮＡ類は、以前では認められたこ
とがなかった特性を示すことが見出されたのである。す
なわち、かかる核酸類縁体が二本鎖の形態で存在する通
常の核酸とハイブリッドを形成する能力を有しておりま
たこのような条件下において、当該類縁体に相補的な配
列を有する鎖とハイブリッドを形成しかつ当初の核酸二
重らせんからもう一方の鎖を置換せしめる能力を有して
いるということである。このような認識は、塩基対とし
て５−６０対の長さであるｄｓＤＮＡ配列に対して行い
得るのである。塩基が１０と２０との間にある配列は、
原核細胞および真核細胞のＤＮＡの独自配列が認められ
る範囲に相当するので、興味深いのである。１７−１８
の塩基を認識する試薬は、ヒトゲノムにおける独自配列
の長さに相当するので、特に興味の対象となる。
【００４０】このようなハイブリダイゼ−ション反応を
溶液中で行うと、該核酸類縁体の最初の鎖配と同じ配列
を有する二番目の鎖もやはり、相補的配列を有する核酸
鎖とハイブリッドを形成し、その結果ＰＮＡの二つの鎖
が通常の核酸の単一鎖とハイブリッドせしめられている
三重らせん構造を形成することが見出されたのである。
この最初のＰＮＡ鎖が通常の型式の塩基間水素結合によ
ってハイブリダイゼ−ションを行い、他方ではＰＮＡの
二番目の鎖がＨｏｏｇｓｔｅｅｎの対合によって当初の
二重らせんの主要な溝の中で受容されることが観察され
ている。ＰＮＡが固体支持体に固定化された場合、二本
鎖核酸とのハイブリダイゼ−ションが、一本鎖がそれか
ら置換・変位さするのを伴って観察されるが、三重らせ
ん構造の形成は、該ＰＮＡの固定化によって阻止され得
るのである。
【００４１】本発明は、検出可能な標識を包含するかま
たはこれと接合した上記において定義された核酸類縁体
を包含する。目下のところ公知であるペプチド、ＤＮＡ
および／またはＲＮＡを標識化する方法は、一般的にＰ
ＮＡ類にも適用され得る。すなわち、標識化の方法は、
放射性同位元素標識、酵素標識、ビオチン、スピン標
識、 発蛍光団、化学発光標識、抗原標識または抗体標
識を使用することからなるであろう。
【００４２】上記した標識ＰＮＡ類は、標的核酸を認識
し、検出しまたは定量化する方法において、充分相補的
配列を有する上記において定義した標識核酸類縁体に前
記標的をハイブリダイゼ−ションさせて、かくしてハイ
ブリッドする条件においてハイブリダイゼ−ションを起
こさせ、次いでこうして前記標的にハイブリッドさせた
該核酸類縁体の前記標識を検出するかまたは定量化する
ことから成る前記認識、検出または定量化方法に使用し
てもよい。
【００４３】好ましくは、該標的は、該ハイブリダイゼ
−ションを行う前に基質に固定化させてもよい。
【００４４】このような方法において、このような標的
は、該標的の第一の領域を前記第一の領域に充分相補的
である配列を有しかつそれ自体前記基質に固定化されて
いる捕捉核酸または核酸類縁体にハイブリダイゼ−ショ
ンさせて、かくしてハイブリッドさせることによって基
質に固定化させてもよく、次いで標識核酸類縁体を該標
的の第二の領域にハイブリッドさせればよい。
【００４５】本発明に従った少なくとも好ましい核酸類
縁体が、二本鎖標的核酸とハイブリッドしかつその一本
の鎖を置換させることが出来る能力については、上記に
おいて記載した通りである。本発明は、核酸の二重らせ
んから一本鎖を置換する方法において、前記二重ラセン
から一本鎖を置換することができる程充分な、前記二重
らせんの内のもう一方の鎖に対する親和性を有する上記
において定義した核酸類縁体を前記二重らせんにハイブ
リッドさせることから成る前記置換方法を包含する。
【００４６】本発明は、前記において定義した置換核酸
類縁体に相補的な配列を一方の鎖が有する二本鎖標的か
ら他の一本鎖を置換する能力がある前記核酸類縁体を二
本鎖標的にハイブリッドさせるに際して、前記置換核酸
類縁体が、ハイブリダイゼ−ションさせるに充分な、前
記二本鎖標的の内の前記もう一方の鎖に対する相補的配
列を有しており、その結果一本鎖の形態における前記標
的の前記一本鎖を置換するものであり、次いで前記二本
鎖標的からの置換後に前記一本鎖の存在を検出しまたは
これを定量化することから成る、二本鎖標的核酸を検出
し、同定しまたは定量化する方法を包含する。
【００４７】このように置換された一本鎖を断片に破断
し、次いで前記斑だの存在を検出してもよい。置換され
た一本鎖は好ましくは、ヌクレア−ゼによる作用によっ
て破断させてもよい。すなわち、特異的な二本鎖標的核
酸配列の存在の検出を、該標的核酸配列に相補的ＰＮＡ
をハイブリッドさせて鎖置換を行わしめ、かくして該反
応混合物中において一本鎖ＤＮＡを生成せしめ、次いで
ヌクレア−ゼを用いて一本鎖ＤＮＡを消化させてヌクレ
オチド類を生成させることによって行うことが出来る
が、この際かかるヌルレオチドの存在を、当該標的二本
鎖ＤＮＡが当初に存在していたという指標・標識として
検出することが可能である。
【００４８】本発明は更には、上記において定義した核
酸類縁体を少なくとも一種組み込んで成り、かつ好まし
くはかかる核酸類縁体を標識化したものを少なくとも一
種、例えば一つの標識ＰＮＡおよび前記標識を検出する
のに使用する検出試薬を少なくとも一種とを含んで成る
診断薬に使用出来るキットを包含する。
【００４９】一般的にいって、かかる核酸類縁体は、ハ
イブリダイゼ−ション緩衝液として溶液状で提供され
る。このようなキットは通常は、洗浄緩衝溶液を少なく
とも一種包含する。
【００５０】該核酸類縁体を例えばビオチンで間接的に
標識化した場合、当該キットは、酵素標識と該核酸類縁
体の標識と結合する能力がある物質、例えばアビジンと
の間の抱合体を含有して成るものであってもよい。
【００５１】該核酸類縁体を直接的または間接的に酵素
で標識化した場合は、該キットは、該酵素によって仲介
されるモニタ−可能な反応を行うに適している該酵素の
基質を包含して成るものであってもよい。
【００５２】
【発明の好ましい実施態様】式Ｉで表されるＰＮＡ類お
よびその製造に用いたモノマ−シントンにおいて、リガ
ンドＬは主として、自然界において見出される位置、す
なわちアデニンまたはグアニンについては９位の位置ま
たチミンまたはシトシンについては１位の位置に結合さ
せた天然の核酸塩基である。その代わりに、これらリガ
ンドＬの内のいくつかはそれぞれ、非天然の核酸塩基
（核酸塩基類縁体）、他の塩基結合性原子部、芳香族原
子部、（Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル、ヒドロキシまたは水
素であってもよい。いくつかの典型的な核酸塩基リガン
ドおよび具体的な合成リガンドは、第２図に示してあ
る。更には、Ｌは、ＤＮＡ挿入基、例えば発蛍光団、ラ
ジオ標識、スピン標識、ハプテンなどのリポ−タ−リガ
ンド、またはビオチンなどのタンパク質認識リガンドで
あり得る。
【００５３】モノマ−シントンにおいては、Ｌには、保
護基を設けていてもよい。このことは、第４図に図示し
てあるが、本図においてＰｇ１は、酸、塩基または例え
ばｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメ
チルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−ニトロベ
ンジル（２Ｎｂ）などの水素分解性もしくは光化学的に
開裂可能な保護基である。
【００５４】結合基Ａは、例えば−ＣＲ1Ｒ2ＣＯ−、−
ＣＲ1Ｒ2ＣＳ、ＣＲ1Ｒ2Ｃｓｅ−、−ＣＲ1Ｒ2ＣＮＨＲ
3−、−ＣＲ1Ｒ2Ｃ＝ＣＨや−ＣＲ1Ｒ2Ｃ＝Ｃ（ＣＨ3）
2−、−なおＲ1 、Ｒ2およびＲ3は上記において定義し
た通りである−などの種々の基であり得る。Ａは、メチ
レンカルボニル（−ＣＨ2ＣＯ−）である。また、Ａ
は、プロパノイル、ブタノイルまたはペンタノイルなど
のより長鎖の原子部またはそれに相当する誘導体であっ
て、その酸素原子がその他のＸで表される原子で置換さ
れるかまたはその原子鎖がＲ1Ｒ2で置換されるかＹを含
む不均一であるものであってもよい。さらに、Ａは、
（Ｃ2−Ｃ6）アルキレン鎖、Ｒ1Ｒ2で置換された（Ｃ2
−Ｃ6）アルキレン鎖であってもよく、またはＹを含む
不均一なものであってもよい。場合によっては、Ａは単
に一重結合であればよい。
【００５５】本発明の好ましい形態においては、Ｂは窒
素原子であり、かくしてアキラル主鎖の可能性が生じ
る。ＢはまたＲ3Ｎ＋−本式においてＲ３は上記におい
て定義した通りである−であってもよい。
【００５６】本発明の好ましい形態においては、Ｃは−
ＣＲ6Ｒ7−であるが、また二つの炭素単位、すなわち−
ＣＨＲ6ＣＨＲ7−または−ＣＲ6ＣＲ7ＣＨ2−−本式に
おいて、Ｒ6およびＲ7は上記において定義された通りで
ある−であってもよい。Ｒ6およびＲ7はまた、例えばピ
ロ−ロリル、フリル、チオニル、イミダゾリル、ピリジ
ル、ピリミジニル、インドリルなどのヘテロアリ−ル基
であってもよく、または両者は共同して例えば１、２−
シクロブタンジイル、１、２−シクロペンタンジイルま
たは１、２−シクロヘキサンヂイルなどの脂環系を形成
してもよい。
【００５７】本発明の好ましい形態においては、モノマ
−シントンにおけるＥはＣＯＯＨまたはその活性化され
た誘導体であり、またオリゴマ−におけるＧは、−ＣＯ
ＮＲ 3−である。（好ましくは、式Ｉにおける−Ｒ3ＮＯ
Ｃの方向において）。上記において定義したように、Ｅ
はまた、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ2ＯＨ、またはそれ
らの活性化された誘導体であってもよく、またこの時オ
リゴマ−におけるＧは、−ＣＳＮＲ3−、−ＳＯＮＲ3−
および−ＳＯ2ＮＲ3−となる。かかる活性化は、例えば
酸無水物または活性エステル誘導体を用いて行えばよ
く、この際Ｅで表される基における水素は、成長する主
鎖を精製させるために適した解離する基によって置換さ
れている。
【００５８】かかる主鎖を形成するアミノ酸は、同じで
もまたは異なっていてもよい。本発明者らは、２−アミ
ノエチルグリシンに基づいたものが本発明の目的に特に
適していることを見出したのである。
【００５９】場合によっては、何れかの端末（Ｑ、Ｉ）
においてリガンドを結合させて、ＰＮＡ類の結合特性を
変調させることは興味深いことであり得る。代表的なリ
ガンドとしては、ｄｓＤＮＡの結合を改善するＤＮＡ挿
入基または例えばリシンまたはポリリシンなどの、静電
的相互作用によってＰＮＡの結合を強化する塩基性基が
挙げられる。カルボキシやスルフォ基などのマイナスに
荷電した基を減少させる基を使用することも可能であろ
う。シントンの設計によって更には、その他の原子部を
端末でない位置に移動させることもできる。
【００６０】ＰＮＡオリゴマ−は、例えばヌクレア−ゼ
活性またはアルキル化活性を有するリガンドまたはリポ
−タ−リガンドなどの（発蛍光団、スピン標識、放射性
物質、タンパク質認識リガンド、たとえばビオチンまた
はハプテン）低分子量の作動リガンドに共軛・接合させ
てもよい。本発明のまた別の局面においては、このよう
なＰＮＡ類は、ペプチドまたはタンパク質に共軛・接合
させるのであるが、かかるペプチドは信号発信活性を有
しかつかかるタンパク質はたとえば酵素、転写因子また
は抗体である。また、ＰＮＡ類は、水溶性または非水溶
性のポリマ−に結合させることもできる。本発明の別の
局面において、これらのＰＮＡ類は、オリゴヌクレオチ
ドまたは炭水化物に共軛・接合させられる。保証された
場合は、ＰＮＡオリゴマ−は、固体支持体に結合された
何らかの原子部（たとえば、ペプチド鎖、リポ−タ−、
挿入基またはその他の種類のリガンド含有基）の上にお
いて合成することも出来る。
【００６１】本発明に使用されるこれらのＰＮＡ類の合
成は、以下において詳細に議論されるが、ここにおいて
第１図は好ましいＰＮＡの例の一つを表し、その構造を
相補的ＤＮＡの構造になぞらえている。
【００６２】ＰＮＡオリゴマ−およびポリマ−の合成 分子を固体マトリックスにアンカ−止めする原理は、化
学変化の過程において中間生成物を解明するうえで役に
立つのであるが、固相合成またはメリフィ−ルド合成と
して知られている（たとえば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．、１９６３、８５、２１４９およびＳＣＩＥＮＣ
Ｅ、１９８６、２３２、３４１を参照のこと）。アミノ
酸を段階的にまたは断片的に組み立ててペプチドにする
方法として確立されているのは通常は、若干架橋処理さ
れたスチレン−ジビニルベンゼンコポリマ−から成るビ
−ズにしたマトリックスを用いるが、このような架橋処
理したコポリマ−は、ジビニルベンゼン類の混合物を添
加したスチレンをパ−ル重合させることによって形成さ
せられたものである。架橋密度・程度として１−２％が
通常は用いられ、かかるマトリックスも、本発明に従っ
て固相ＰＮＡ合成に使用することが出来る（第１図）。
【００６３】このような固相を当初において機能化させ
ることに関して、五十以上の方法が、従来の固相ペプチ
ド合成に関連して記載されている（たとえば、”Ｔｈｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ” Ｖｏｌ．２におけるＢａｒａｎ
ｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９、ｐｐ．１−
２８４、およびＳｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎ
ｇ、”Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ”、２ｎｄ Ｅｄ．、ＰｉｅｒｃｅＣｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、１
９８４）。クロロメチル官能性（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄ
ｒｅｓｉｎ；クロロメチルメチルエ−テル／ＳｎＣｌ４
反応を経由），アミノメチル官能性（Ｎ−ヒドロキシメ
チルフタルイミド反応を経由して；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ
ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９７６、
３７９５）およびベンゾヒドリルアミノ官能性（Ｐｉｅ
ｔｔａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７０、６５
０）を導入する反応が、最も広く用いられている。その
本質如何に拘らず、このような官能性の目的は、通常は
かかるコポリマ−の固体支持体とその固体支持体にカッ
プリング結合させるべき第一のアミノ酸のＣ−末端との
間にアンカ−止め結合を形成させることである。官能基
の”濃度”をグラム当たりミリモル（ｍｍｏｌｅ／ｇ）
で表すことが一般的には好都合である。当初に導入した
他の反応性官能性としては、４−メチルベンゾヒドリル
アミノおよび４−メトキシベンゾヒドリルアミノが挙げ
られる。これらの確立された方法は全て、原則として本
発明の文脈の範囲内において有用である。ＰＮＡ合成の
好ましい方法は、当初官能性としてアミノメチルを使用
するが、それは、アミノメチルが、スペ−サ−形成試薬
の一端においてカルボキシル酸へのアミド結合を本質的
に定量的に形成させることに関連してアミノメチル官能
性のアミノ基が持つ反応性が高いために”スペ−サ−”
または”ハンドル（ｈａｎｄｌｅ）”基を導入すること
に関して有利であるから。該当するスペ−サ−またはハ
ンドル形成性二官能性基について膨大な数の基が記載さ
れている（Ｂａｒｒａｎｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、１９８７、３０、７
０５を参照）が、特にたとえばアミノメチル官能におい
て見出されているようなアミノ基に対する反応性の高い
試薬が記載されている。代表的な二官能性試薬として
は、たとえば４−（ブロモメチル）フェニル酢酸などの
４−（ハロアルキル）アリ−ル−低級アルカン酸、たと
えばＢｏｃ−アミノアシル−４−（オキシメチル）フェ
ニル酢酸などのＢｏｃ−アミノアシル−４−（オキシメ
チル）アリ−ル−低級アルカノン酸、たとえばＮ−Ｂｏ
ｃ−ｐ−グルタロイルベンゾヒドリルアミンなどのＮ−
Ｂｏｃ−ｐ−アシルベンゾヒドリルアミン、たとえばＮ
−Ｂｏｃ−４’−メチル−ｐ−グルタロイルベンゾヒド
リルアミンなどのＮ−Ｂｏｃ−４’−低級アルキル−ｐ
−アシルベンゾヒドリルアミン、たとえばＮ−Ｂｏｃ−
４’−メトキシ−ｐ−グルタロイル−ベンゾヒドリリル
アミンなどのＮ−Ｂｏｃ−４’−低級アルコキシ−ｐ−
アシルベンゾヒドリルアミン、および４−ヒドロキシメ
チルフェノキシ酢酸が挙げられる。本発明の文脈の範囲
内において特に該当するスペ−サ−基の一種類は、フェ
ニルアセトアミドメチル（Ｐａｍ）ハンドル（Ｍｉｔｃ
ｈｅｌｌ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ｏｒ
ｇ．Ｃｈｅｍ．、１９７６、４１、２０１５）であり、
これは４−フェニルアセトアミドメチル基の電子吸引効
果から派生して、Ｂｏｃ−アミノ脱保護試薬であるトリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）に対する古典的なベンジルエス
テル結合よりもほぼ１００倍安定である。
【００６４】ＰＮＡ鎖のＣ−末端がアミドの形態となる
ように合成したＰＮＡ鎖を固体支持体から開裂させる目
的のために導入させてもよいいくつかの官能性（たとえ
ば、ベンゾヒドリルアミノ、４−メチルベンゾヒドリル
アミノおよび４−メトキシベンゾヒドリルアミノ）は、
スペ−サ−基の導入を一切必要としない。このような官
能性は何れも、有利には本発明の文脈において使用する
ことが出来る。
【００６５】スペ−サ−またはハンドル基の導入に関す
るもう一つの戦略は、所謂”予備形成したハンドル”戦
略（Ｔａｍら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９７９、９５５
−９５７を参照）であって、これは、第一のアミノ酸を
カップリング結合させることを完璧に制御することが出
来またペプチドまたはＰＮＡ合成に関係しない所望しな
い官能基が存在することから起因する複雑な状況が生ず
る可能性を排除するものである。この戦略においては、
スペ−サ−またはハンドル基は、前記したものと同様の
種類の基であるがこれらを固体支持体に結合させたいと
希望する第一のアミノ酸と反応させるが、該アミノ酸は
Ｎ−保護されておりかつ随意には所望のＰＮＡ鎖の伸張
について該当しないその他の側鎖において保護される。
すなわち、スペ−サ−またはキハンドル基が望ましい場
合においては、固体支持体にカップリングさせるべき第
一のアミノ酸は、当初に導入した官能性（たとえば、ア
ミノメチル基）に導入させておいたスペ−サ−基の遊離
の反応性末端にカップリング・結合させることが出来る
かまたはスペ−サ−形成試薬と反応させることが出来
る。スペ−サ−形成性試薬は、次いで当初に導入した官
能性と反応させる。他の有用なアンカ−止めスキ−ムと
しては、”多重脱離可能な（ｍｕｌｔｉ−ｄｅｔａｃｈ
ａｂｌｅ）”樹脂（Ｔａｍら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．、１９７９、４９３５およびＪ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８０、１０２、６１１；Ｔａ
ｍ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、５０５２９
１））であり、この樹脂は、一つ以上の放出・解離型式
が可能であり、かくして合成デザインにおいて一層の柔
軟性をもたらすものである。
【００６６】Ｎ−保護のための適当な選択策としては、
通常は側鎖の保護のためのベンジルに関連した基と組合
せて用いる第三級−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）
基（Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、
１９５７、７９、４４２７；ＭｃＫａｙら、Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５７、７９、４６８６；Ａｎ
ｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９
５７、７９、６１８０）および如何なる側鎖をも保護す
るための第三級ブチル（ｔＢｕ）と組合せて用いる９−
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基
（Ｃａｒｐｉｎｏら、Ｊ．Ａｍ．ＣＨｅｍ．Ｓｏｃ．、
１９７０、９２、５７４８およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．、１９７２、３７、３４０４）である。尤も、通常
の固相ペプチド合成において公知であるその他の多くの
可能性がある。すなわち、種々のその他のアミノ保護基
が存在するのであり、その内のいくつかは、Ａｄｏｃ
（Ｈａｓｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６
６、８８、１９８８）。Ｂｐｏｃ（Ｓｉｅｂｅｒ、Ｈｅ
ｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．、１９６８、５１、６１
４）、Ｍｃｂ（Ｂｒａｄｙら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．、１９７７、４２、１４３），Ｂｉｃ（Ｋｅｐｍ
ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９７５、４６２４），
ｏ−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）（Ｚｅｒｖ
ｅｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６３、８
５、３６６０）およびジチアスクシノイル（Ｄｔｓ）
（Ｂａｒａｎｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，、１
９７７、９９、７３６３）である。これらのアミノ保護
基は、特にウレタン官能性に基づく保護基は、大半のア
ルファ−アミノ酸のカップリングの過程においてラセミ
化（容易に生成するオキサゾリノン（アスラクトン）中
間体の互変異性化によって仲介される）を成功裏に抑止
する。このようなアミノ保護基以外に、それ以外では”
無用の”非ウレタン型式のアミノ保護基の全体は、ＰＮ
Ａ分子、特にアキラル単位から構築したＰＮＡ分子を構
築するに際しては適用可能である。すなわち、上記した
アミノ保護基（またはこれらの基から誘導されたもの）
は、本発明の文脈の範囲内において有用であるばかりで
なく、以下の要件をほぼ満たすアミノ保護基の実際上全
てのものが有用である：（１）温和な酸に対する安定性
（カルボキシル基によって有意に攻撃されない）；
（２）温和な酸または求核試薬に対する安定性（問題と
なるアミノ基によって有意に攻撃されない）；（３）ア
セチル化に対する抵抗性（活性化されたアミノ基によっ
て有意に攻撃されない）；さらに（４）該保護基は、重
大な副反応を伴うことなく定量的な除去可能性に近いも
のでなくてはならない；および（５）導入されるアミノ
酸の光学的完全さが、好ましくはカップリングに際して
高度に保存されるべきである。最後に、側鎖保護基の選
択は一般的に、側鎖官能性の保護は繰り返されるアミノ
脱保護サイクルの条件に耐えるものでなくてはならない
ので、アミノ保護基の選択に依存して異なる。ＰＮＡを
化学的に構築する全般的な戦略が、たとえばアミノと側
鎖保護基の特異的な酸安定性に依拠しようとも（たとえ
ば上記した”Ｂｏｃ−ベンジル”の手法）、または直交
的な、すなわち化学選択的な保護スキ−ムを用いようと
も（たとえば、上記した”Ｆｍｏｃ−ｔＢｕ”手法の当
てはまる）、このことは真実である。
【００６７】第一のアミノ酸をカップリングさせた後、
固相合成の次ぎの工程は、所望するＰＮＡ鎖を系統的に
合成することである。このような合成は、繰り返し行う
脱保護／カップリングサイクルを包含する。たとえばＢ
ｏｃやＦｍｏｃ基などの、最後にカップリングしたアミ
ノ酸の暫定的な保護基は、たとえばＢｏｃの場合はトリ
フルオロ酢酸を用いた酸分解、Ｆｍｏｃの場合はピペリ
ジンを用いた塩基処理などの適当な処理に依って定量的
に除去し、かくしてＮ−末端アミノ機能を遊離せしめる
のである。
【００６８】所望一歩前のＮ−保護されたアミノ酸は次
いで、最後にカップリングさせたアミノ酸のＮ−末端に
カップリングさせる。アミノ酸のＣ−末端に最後にカッ
プリングさせたアミノ酸のＮ−末端をこのようにカップ
リングさせることは、いくつかの方法で行い得る。たと
えば、２、４、５−トリクロロフェニルエステル（Ｐｌ
ｅｓｓら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９６３、
４６、１６０９）、フタルイミドエステル（Ｎｅｆｋｅ
ｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．、１９６１、８
３、１２６３）、ペンタクロロフェニルエステル（Ｋｕ
ｐｒｙｓｚｅｗｓｋｉ、Ｒｏｃｚ．Ｃｈｅｍ．、１９６
１、３５、５９５）、ペンタフロロフェニルエステル
（Ｋｏｖａｃｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１
９６３、８５、１８３）、ｏ−ニトロフェニルエステル
（Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、Ｎａｔｕｒｅ、１９５５、１７
５、６８５）、イミダゾ−ルエステル（Ｌｉら、Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７０、９２、７６０８）
および３−ヒドロキシ−４−オキソ−３、４−ジヒドロ
キナゾリン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）エステル（Ｋｏｎｉｇ
ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．、１９７３、１０３、２０２４
および２０３４）などの活性エステル誘導体を当初に形
成させること、またはたとえば対称無水物などの無水物
を当初に形成させることを含む、いくつかの方法の何れ
を用いてある形態の導入アミノ酸にカルボキシル基を付
与する事によって結合させることが出来る。その代わり
に、導入するアミノ酸のカルボキシル基には直接的に、
たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｓｅｅｈａ
ｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９５５、７
７、１０７６）またはその誘導体などの縮合試薬を用い
て最後にカップリングしたアミノ酸のＮ−端末と反応さ
せることが出来る。ベンゾトリアゾリル Ｎ−オキシト
リス−ジメチルアミノホスホニウム ヘキサフルオロホ
スフェ−ト（ＢＯＰ）、すなわち”カストロの試薬”
（たとえば、Ｒｉｖａｉｌｌｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ、１９８０、３６、３４１３）が、第二級アミノ基
を含むＰＮＡ分子を構築する場合勧められる。最後に、
最近報告されたアミノ酸弗化物（Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９０、１１２、９６５
１）ｎｉｒｕｉｊｉｓｉｔａ活性化ＰＮＡモノマ−も、
ＰＮＡ合成においても使用できる相当な見込みがある。
【００６９】保護基を含む所望のＰＮＡ鎖を構築した
後、次ぎの工程は、通常はＰＮＡ鎖のアミノ酸部位の脱
保護と合成したＰＮＡを固体支持体から開裂させること
であろう。これらのプロセスは、実質的に同時に生起さ
せて、その結果所望の形状で遊離のＰＮＡ分子を得るこ
とが可能である。その代わりに、これら二つの別々に合
成されたＰＮＡ鎖を縮合させねばならない場合は、合成
のスタ−ト時に適当なスペ−サ−基を選択して、かくし
て所望のＰＮＡ鎖をそれぞれの固体支持体から開裂させ
（両方のペプチド鎖ともなおそれぞれ側鎖保護基を含ん
でいる）、次いで最後に、たとえば二つの側鎖保護され
たペプチド鎖をカップリングさせた後側鎖保護基を除去
して、かくしてより長いＰＮＡ鎖を形成せしめることに
よって、このような反応は可能である。
【００７０】上記した”Ｂｏｃ−ベンジル”保護スキ−
ムにおいて、側鎖の最終的な脱保護およびＰＮＡ分子の
固体支持体からの開放は、たとえば無水ＨＦ（Ｓａｋａ
ｋｉｂａｒａら、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐ
ｎ．、１９６５、３８、４９２１）、トリス（トリフル
オロ酢酸）ホウ素（Ｐｌｅｓｓら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉ
ｍ．Ａｃｔａ、１９７３、４６、１６０９）およびトリ
フルオロメタンスルホン酸やメタンスルホン酸（Ｙａｊ
ｉｍａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｃｈｅｍ．
Ｃｏｍｍ．、１９７４、１０７）などのスルホン酸類な
どの強酸を使用することに依って実施されるのがもっと
も多い。このような通常の強酸（たとえば、無水ＨＦ）
による脱保護方法は、極めて反応性の強いカルボカチオ
ンを生成し、それによってＰＮＡ鎖の中における敏感な
残基のアルキル化やアシル化が起きる可能性がある。こ
のような副反応は、アニソ−ル、フェノ−ル、ジメチル
サルファイドやメルカプトエタノ−ルなどのスカベンジ
ャ−（捕捉剤）を存在させることによっては部分的にし
か回避出来ないので、従ってサルファイドを用いた酸加
水分解的ＳＮ2脱保護法（Ｔａｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．、１９８３、１０５、６４４２およびＪ．
Ａｍ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８６、１０８、５２４
２），所謂”低い”方法は、有害なカルボカチオンの前
駆体を除いて、不活性なスルフォニウム塩を形成させる
のであるが、ペプチドやＰＮＡ合成においては単独でま
たは”高い”方法と組合せて頻繁に用いられる。それ程
頻繁ではないが、特別の場合には、脱保護することおよ
び／またはＰＮＡ−固体支持体との結合を最終的に開裂
させるために用いられる方法としては、たとえば、塩基
接触アルコ−ル分解（Ｂａｒｔｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．ｓｏｃ．、１９７３、９５、４５０１）やアンモ
ニア分解ならびにヒドラジン分解（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ
ら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．、１９６４、１４２３）、水素
分解（Ｊｏｎｅｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．、１９７７、２８５３およびＳｃｈｌａｔｔｅｒ
ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９７７、
２８６１）および光分解（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｇｕｒｗ
ａｒａ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．、１９７５、９
７、１５７５）などの方法が挙げられる。
【００７１】最後に、”通常の”ペプチドの化学的合成
と異なって、たとえばアミノエチルグリシル主鎖単位に
基づいたＰＮＡ類などのアキラルＰＮＡ類の段階的鎖構
築は、かかるカップリング反応はラセミ化を伴わないの
で、Ｎ−端末またはＣ−端末の何れかから出発すること
が出来る。
【００７２】大半の走査は、固相ペプチド合成の合成サ
イクルにおけるのと同一である（固相ＰＮＡ合成につい
ても当てはまるように）事実を認識することに基づい
て、新規のマトリックス、すなわちＰＥＰＳ が多数の
ペプチド類の合成を容易にするために最近導入された
（Ｂｅｒｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８
９、１１１、８０２４および国際特許出願ＷＯ ９０／
０２７４９号）。このようなマトリックスは、長鎖のポ
リスチレン（ＰＳ）グラフト（１０6のオ−ダ−の分子
量）をぶら下げたポリエチレン（ＰＥ）フィルムから構
成される。このフィルムのロ−ディングの能力は、ビ−
ズマトリックスと同じ程度に高いが、ＰＥＰＳには、多
段合成に同時に適合させる別の柔軟性がある。すなわ
ち、新規な固相ペプチド合成方法においては、かかるＰ
ＥＰＳフィルムは、不連続の標識されたシ−トに加工さ
れるが、それぞれのシ−トは、個別の分画部として機能
する。このような合成サイクルの同一の工程の全てにお
いて、これらのシ−トは、単一の反応容器の中において
一体に保持され、かくして通常の方法による単一ペプチ
ドの合成と近似した速度で複数のペプチド合成を同時に
実施せしめることが可能である。
【００７３】このＰＥＰＳフィルム支持体は、該当する
特殊化学に適合せしめられた結合基またはスペ−サ−基
を含んで成り、複数のＰＮＡ分子の合成において特に有
用で貴重であるはずと推定された。それというのも、四
つの”プソイド−ヌクレオチド”単位のそれぞれに対し
て一つずつ、僅かに四つの異なる反応分画部しか通常は
必要とされないので、概念上合成が簡単であるからであ
る。すなわち、ＰＥＰＳフィルム支持体は、平行したか
つ実質的に同時の態様でかす多くのＰＮＡ合成において
試験されて、何れも成功している。ＰＥＰＳから得られ
た製品の収率と品質は、伝統的なポリスチレンビ−ズ支
持体を使用することによって得られた収率と品質に比肩
し得るものであった。また、たとえば不織フェルト、編
みネット、スティックまたはマイクロウエルプレ−トな
どその他の外観形状のＰＥＰＳポリマ−を用いた実験の
意結果では、合成効率に何等の制限もないことが判って
いる。多数のペプチドを同時に合成するために提案され
た他の二つの方法もやはり、多数の異なるＰＮＡ分子を
調製製造するために適用され得る。これらの方法の最初
の方法は（Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｏｒｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、１９８４、８４、３９９８）、
アクリル酸グラフトポリエチレン製ロッドおよび９６個
のマイクロリットルウエルを用いて、成長するペプチド
鎖を固定化しかつ分画化した合成を実施するものであ
る。この方法は、極めて効率がよいものの、マイクログ
ラムのスケ−ルでのみ適用可能であるに過ぎない。第二
の方法は（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、８２、５１３
１）、伝統的に使用されてきたポリマ−ビ−ズを用いる
ものである。その他多重ペプチドまたはＰＮＡ合成のた
めに提案された方法で、本発明の文脈の範囲内に入る方
法には、密度の異なる二つの相異なる支持体を同時に用
いる方法（Ｔｒｅｇａｅｒ、”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａ
ｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓ”、Ｊ．
Ｍｅｉｅｒｈｏｆｅｒ編著、Ａｎｎ ＡｒｂｏｒＳｃ
ｉ，Ｐｕｂｌ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、１９７２ ｐ
ｐ．１７５−１７８）、マニホルドを介して異なる反応
容器を組み合わせる方法（Ｇｏｒｍａｎ、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．、１９８４、１３６、３９７）、マルチ
カラム固相合成法（たとえば、Ｋｒｓｃｎａｋら、Ｉｎ
ｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、
１９８９、３３、２０９およびＨｏｌｍ ａｎｄ Ｍｅ
ｌｄａｌ、”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
２０ｔｈ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍ
ｐｏｄｉｕｍ”、Ｇ．ＪｕｎｇおよびＥ．Ｂａｙｅｒ編
著、Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ＆ Ｃ
ｏ．、Ｂｅｒｌｉｎ、１９８９ｐｐ２０８−２１０）お
よびセルロ−スペ−パ−を使用する方法（Ｅｉｃｈｌｅ
ｒら、Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．、１９８９、５４、１７４６）がある。従来か
らある架橋スチレン／ジビニルベンゼンコポリマ−マト
リックスおよびＰＥＰＳ支持体が目下とのところ固相Ｐ
ＮＡ合成の文脈において好ましいのであるが、該当し得
る固体支持体の例として、これに限定されないリストに
は以下のものが含まれる：すなわち（１）既知量のＮ−
第三級−ブトキシカルボニル−ベ−タ−アラニル−Ｎ’
−ヘキサメチレンジアミンを含むＮ、Ｎ’−ビサクリロ
イルエチレンジアミンで架橋されたジメチルアクリルア
ミドのコポリマ−を用いた粒子。いくつかのスペ−サ−
分子は、典型的にはベ−タアラニル基を介して、次いで
アミノ酸残基によって付加される。また、このベ−タア
ラニル含有モノマ−は、重合過程においてアクロイルサ
ルコシンモノマ−で置換して、樹脂ビ−ズを形成するの
である。かかる重合を行ったあとで、ビ−ズにエチレジ
アミンを反応させて、共有結合で結合させた官能基とし
て一級アミンを含有する樹脂粒子を形成する。このポリ
アクリルアミドを用いた支持体は、相対的にポリスチレ
ンを用いた支持体よりも親水性が高く、ジメチルホルム
アミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン
などを含む極性の高い、非水性の溶媒とともに通常は使
用される（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．、１９７５、９７、６５８４、Ｂｉｏｏｒｇ．
Ｃｈｅｍ．、１９７９、８、３５１およびＪ．Ｃ．
Ｓ．、Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ、５３８（１９８１）を参
照）；（２）第二の固体支持体のグル−プは、たとえ
ば、多孔質のガラスビ−ズやシリカゲルなどのシリカ含
有粒子を用いるものである。一つの例は、Ｗａｔｅｒｓ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、Ｍ
Ａ、ＵＳＡが”ＰＯＲＡＳＩＬ”なる商標で市販されて
いるトリクロロ−［３−（−クロロメチル）−フェニ
ル］プロピルシランおよび多孔質のガラスビ−ズとの反
応生成物（Ｐａｒｒ ａｎｄ Ｇｒｏｈｍａｎｎ、Ａｎ
ｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｅｄ．、１９７
２、１１、３１４を参照）である。同様に、１，４−ジ
ヒドロキシメチルベンゼンとシリカとのモノエステル
（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓによって”ＢＩ
ＯＰＡＫ”なる商標で販売されている）が、有用である
と報告されている（Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｊｕｎｇ、Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９７０、４５０
３）；（３）有用な固体支持体の三番目の種類は、二種
の主要成分を含有しているという意味で複合物と称する
ことが出来る：すなわち、樹脂および使用した有機合成
反応条件に対して実質的にに不活性であるたの材料であ
る。一つの複合物の例は（Ｓｃｏｔｔら、Ｊ．Ｃｈｒｏ
ｍ．Ｓｃｉ、１９７１、９、５７７を参照）、疎水性の
架橋処理したクロロメチル基を含むスチレンポリマ−で
被覆したガラス粒子を用いたものであり、Ｈａｍｄｅ
ｎ、ＣＴ、ＵＳＡのＮｏｒｔｈｇａｔｅＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．によって製造販売されていたもの
である。もう一つの複合物の例は、ポリスチレンがグラ
フトされているフッ素化エチレンポリマ−のコア−を含
有するものである（Ｋｅｎｔ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉ
ｅｌｄ、Ｉｓｒａｅｌ Ｊ．Ｃｈｅｍ．、１９７８、１
７、２４３およびｖａｎＲｉｅｔｓｃｈｏｔｅｎ，”Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ １９７４”、Ｙ．Ｗｏｌｍａｎ編著、
Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１
９７５、ｐｐ．１１３−１１６を参照）；（４）たとえ
ばコトンシ−トなどのＰＥＰＳ以外の同一種に属する固
体支持体（Ｌｅｂｌ ａｎｄ Ｅｉｃｈｌｅｒ、Ｐｅｐ
ｔｉｄｅＲｅｓ．、１９８９、２、２３２）およびヒド
ロキシプロピルアクリレ−トでコ−トされたポリプロピ
レン膜（Ｄａｎｉｅｌｓら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．、１９８９、４３４５）もＰＮＡ合成に適し
ている。
【００７４】操作が手動または自動であれ、本発明の文
脈における固相ＰＮＡ合成は、通常はバッチ法で行われ
る。しかしながら、このような合成の大半は、支持体を
カラムに充填して（Ｂａｙｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９７０、４５０３およびＳｃｏｔ
ｔら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．、１９７
１、９、５７７）連続フロ−の型式で同様に実施しても
よい。連続フロ−固相合成に関して、硬質のポリ（ジメ
チルアクリルアミド）−珪藻土（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈ
ｒ）支持体（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕ．、１９８１、１１５１）
が、特に成功しているように見えるが、もう一つの有用
で貴重な方法は、標準的なコポリ（スチレン−１％−ジ
ビニルベンゼン）支持体のために工夫されたものに関す
るものである（Ｋｒｃｈｎａｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９８７、４４６９）。
【００７５】固相方法は目下のところＰＮＡ合成の文脈
において好ましいのであるが、その他の方法論またはた
とえばそれらとこのような固相法との組合せも適用され
る：すなわち、（１）ペプチドの古典的な溶液相法（た
とえば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ １９８４）であって段階的な構築法によるか
またはセグメント／フラグメント縮合法によるものが、
ＰＮＡ化合物の特に大規模な製造（グラム。キログラム
またはトンまでも）を考慮する場合に特別に該当する；
（２）所謂”液相”戦略であって、たとえば線状ポリス
チレンなどの溶解性ポリマ−支持体（Ｓｈｅｍｙａｋｉ
ｎら、Ｔｅｔｒａｈｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９６５、
２３２３）やポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）（Ｍｕ
ｔｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅ
ｍ．、Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、１９７４、１３、８
８）を用いるものが有用である；（３）種々の分子量の
（”ｐｏｌｙ−ｄｉｓｐｅｒｓｅ”）ペプチドまたはＰ
ＮＡ分子を生成するランダム重合（たとえば、Ｏｉｄａ
ｎ、”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ”、 ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９７０）を参照）抗ウイルス効果のスクリ
−ニングの目的のために特に該当する；（４）ポリマ−
に支持されたアミノ酸の活性エステル（Ｆｒｉｄｋｉｎ
ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６５、８７、
４６４６）を使用した方法であって、”逆Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ合成法”または”ポリメリック試薬合成法”と
も称される方法には、中間物の単離および精製ができる
という利点があり、従って、中間の大きさの任意に保護
されたＰＮＡ分子で、後刻引き続いてフラグメント縮合
してより大きいサイズのＰＮＡ分子に変換することが出
来るＰＮＡ ｂｕｎｓｉを合成するための特に適した方
法を提供し得るものである；（５）ＰＮＡ分子をたとえ
ばプロテア−ゼまたは新規な特異性を有するその誘導体
（たとえばタンパク質工学などの人工的手段によって得
られる）を用いて酵素的に構築することが見込まれる。
また、数多くのＰＮＡフラグメントを縮合して極めて大
きなＰＮＡ分子に変えるための”ＰＮＡリガ−ゼ”を開
発することも見込むことが出来る；（６）抗体は、興味
の対象とする実質的に如何なる分子としても生成させる
ことが出来るので、Ｌｅｒｎｅｒ（Ｔｒａｍａｎｔａｎ
ｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６、２３４、１５６６）
とＳｃｈｕｌｔｚ（Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、１９８６、２３４、１５７０））のグル−プによっ
て同時に発見された、最近開発された接触抗体（ａｂｚ
ｙｍｅｓ）も、ＰＮＡ分子を構築するための潜在的な候
補として考慮されるべきであろう。すなわち、アシル−
トランスファ−反応を接触・触媒するａｂｚｙｍｅｓを
産生させるのに顕著な成功が成されている（たとえば、
Ｓｈｏｋａｔら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、３３８、２
６９およびそれに引用されている文献を参照）．ｓａｉ
ｇｏｎｉ、対細菌Ｓｔｅｗａｒｔのグル−プ（Ｈａｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０、２４８、１５４４）に
よって開拓された完全に人工的な酵素を、ＰＮＡ合成に
適するように開発することも出来るであろう。
【００７６】一般的に適用可能な酵素、リガ−ゼおよび
接触抗体など、特異的なカップリング反応を仲介するこ
とが可能なものの設計は、”通常の”ペプチド合成より
もＰＮＡ合成のための方がより容易に実施されるはずで
ある。その理由は、ＰＮＡ分子は、ペプチドを構成する
二十個の天然の（タンパク質生成性−ｐｒｏｔｅｉｎｏ
ｇｅｎｉｃ−）アミノ酸と比較して、僅か四つの異なる
アミノ酸（四つの天然の塩基のそれぞれの一つに対応す
るもの）から構成されている場合が多いからである。結
論として、特異的なＰＮＡ分子を合成するためには単一
の戦略では如何なるものも適合することはなく、従って
時にはいくつかの方法の組合せが最善に機能することが
あり得るであろう。
【００７７】（ａ）モノマ−構成単位の合成実験 これらのモノマ−は好ましくは、第８図において概略を
示した一般的スキ−ムによって合成される。この合成
は、実施例２１−２３において記載した保護／脱保護方
法を用いて（Ｂｏｃアミノエチル）グリシンのメチルま
たはエチルエステルの何れかの製造を包含して成る。チ
ミンモノマ−の合成は、実施例２４−２５において記載
されており、また保護されたシトシンモノマ−の合成は
実施例２６において記載されている。
【００７８】保護されたアデニンモノマ−の合成（第１
４図）は、臭化酢酸エチルによるアルキル化（実施例２
７）およびＸ線結晶学を用いた置換位置の確認−所望と
する９位−を包含して成るものであった。次いでＮ６−
アミノ基をＮ−エチル−ベンジルオキシカルボニルイミ
ダゾ−ル テトラフルオロ硼酸エステル試薬を用いてベ
ンジルオキシカルボニル基で保護した（実施例２８）。
このエステル生成物を単に加水分解すると、Ｎ６−ベン
ジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニン
が得られ、これを次ぎに標準方法に用いた（実施例１０
−１１、第８図）。このアデニンモノマ−を構築して、
二つの異なるＰＮＡ−オリゴマ−とした（実施例３０お
よび３１）。
【００７９】保護されたＧ−モノマ−の合成を、第１５
図において概略を示してある。この出発物質である２−
アミノ−６−クロロプリンを臭化酢酸でアルキル化し
（実施例３２）、次いでこの塩素原子をベンジルオキシ
基で置換した（実施例３６）。得られた酸を試薬ＰｙＢ
ｒｏｐｔｍを用いて（Ｂｏｃアミノエチル）グリシンメ
チルエステル（実施例３６）とカップリングさせ、次い
で得られれたエステルを加水分解した（実施例２３）。
このＯ６−ベンジル基をＰＮＡ−オリゴマ−の合成にお
いて最終のＨＦ−開裂工程で除去した。開裂は、縮合剤
としてジイソプロピルカルボジイミドを用いてＰＮＡ−
オリゴマ−に組み込んだ場合、最終のＰＮＡ−オリゴマ
−の予期した量を測定することによって確認した（実施
例５２）。以下に記載する略記号を実験実施例において
使用する：ＤＭＦ、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド；Ｄ
ＣＣ、Ｎ、Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＣ
Ｕ、Ｎ、Ｎ−ジシクロヘキシル尿素；ＴＨＦ、テトラヒ
ドロフラン；ａｅｇ、Ｎ−アセチル（２’−アミノエチ
ル）グリシン；ｐｆｐ、ペンタフルオロフェニル；Ｂｏ
ｃ、第三級−ブトキシカルボニル；Ｚ、ベンジルオキシ
カルボニル；ＮＭＲ、核磁気共鳴；ｓ、一重項；ｄ、二
重項；ｔ、三重項；ｑ、四重項；ｍ、多重項；ｂ、ブロ
−ド；δ、化学シフト。
【００８０】ＮＭＲスペクトルは、テトラメチルシラン
を内部標準として用いてＪＥＯＬＦＸ ９０Ｑ 分光計
またはＢｒｕｋｅｒ ２５０ＭＨｚで記録した。質量分
光測定は、ＶＧ ＦＡＢ源およびプロ−ブを備えたＭａ
ｓｓＬａｂ ＶＧ １２−２５０四極子装置で行った。
融点は、Ｂｕｃｈｉ融点測定装置で記録し、補正は行わ
なかった。Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドは、４Åモレ
キュラ−シ−ブで乾燥し、蒸留し次いで４Åモレキュラ
−シ−ブ上で保存した。ピリジン（ＨＰＬＣグレ−ド）
は、４Åモレキュラ−シ−ブ上で乾燥し、保存した。そ
の他の溶媒は、入手可能な最高級品質のものかまたは使
用前に蒸留した。ジオキサンは、使用前に塩基性アルミ
ナを通した。Ｂｏｃ無水物、４−ニトロフェノ−ル、臭
化酢酸メチル、塩化ベンジルオキシカルボニル、ペンタ
フルオロフェノ−ルは全て、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙを介して入手した。チミン、
シトシン、アデニンは全て、Ｓｉｇｍａ を介して入手
した。
【００８１】薄層クロマトグラフィ−（Ｔｌｃ）は、以
下の溶媒系を用いて行った：（１）クロロホルム：トリ
エチルアミン：メタノ−ル、７：１：２；（２）塩化メ
チレン：メタノ−ル、９：１；（３）クロロホルム：メ
タノ−ル：酢酸 ８５：１０：５。スポットは、ＵＶ
（２５４ｎｍ）によってまたは／および１２０℃におい
て５分間加熱後ニンヒドリン溶液（１００ｍｌの１−ブ
タノ−ルおよび３０ｍｌ酢酸中に３ｇニンヒドリン）を
噴霧し次いで噴霧後再度加熱することによって可視化さ
せた。
【００８２】鎖延長した主鎖 グル−プＡ、ＣおよびＤ（第１６図）の変化は、モノマ
−構成単位を合成し、ＰＮＡ−オリゴマ−に組み入れる
ことによって証明される。一つの例において、グル−プ
ＣはＣＨ（ＣＨ3）基である。相応するモノマ−の合成
は、第１７図において概略を示すが、Ｂｏｃ−保護され
た１−アミノ−２、３−プロパンジオ−ル（実施例３
５）の製造を包含して成り、このものは、過ヨウ素酸塩
で開裂してｂｏｃアミノアセトアルデヒドとし、このも
のを直接次の反応に用いる。このｂｏｃアミノアセトア
ルデヒドを種々のアミンと縮合させることが出来る；実
施例３６において、アラニンエチルエステルを使用し
た。実施例１７−１９において、相当するチミンモノマ
−類を調製した。このようなモノマ−は、ＤＣＣ−カッ
プリングプロトコ−ルによって８−量体に組み入れた
（実施例３０および３１）。
【００８３】別の例において、第−グル−プは（Ｃ
Ｈ2）3である。相当するモノマ−の合成は、第１８ａ図
において概略を示し、かつ実施例４０および４６におい
て記載してある。
【００８４】また別の例において、Ｃグル−プは、（Ｃ
Ｈ2）2ＣＯ基である。チミンおよび保護されたシトシン
モノマ−の合成は、第１９図および実施例４６から５１
にまでにおいて概略を示してある。一つのユニットを包
含するＰＮＡ−オリゴマ−を用いたハイブリダイゼ−シ
ョン実験は、実施例６１に記載しており、これによれ
ば、親和性が著しく低下しているが特異性は保持されて
いることが示される。
【００８５】
【実施例】
【００８６】実施例１ ４−ニトロフェニル炭酸第三級−ブチルエステル 炭酸ナトリウム（２９．１４ｇ；０．２７５ｍｏｌ）お
よび４−ニトロフェノ−ル（１２．７５ｇ；９１．６ｍ
ｏｌ）をジオキサン（２５０ｍｌ）と混合した。Ｂｏｃ
−無水物（２０．０ｇ：９１．６ｍｏｌ）をジオキサン
（５０ｍｌ）ｔとともにこの混合物に移した。この混合
物を１時間還流し、０℃にまで冷却し、ろ過し、１／３
にまで濃縮し、次いで０℃において水（３５０ｍｌ）に
注いだ。１／２時間攪拌した後、この生成物を濾取し、
水で洗浄し、次いで真空下でｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥
した。収率、２１．３ｇ（９７％）。ｍ．ｐ．７３．０
−７４．５℃（ｌｉｔｔ．７８．５−７９．５℃）。元
素分析、Ｃ11Ｈ13ＮＯ5、実験値（理論値） Ｃ：５
５．２０（５５．２３） Ｈ：５．６１（５．４８）
Ｎ：５．８２（５．８５）
【００８７】実施例２ （Ｎ’−Ｂｏｃ−２’−アミノエチル）グリシン（２） 表題化合物をＨｅｉｍｅｒらによる方法の変法によって
調製した。Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン（１、
３．００ｇ；２５．４ｍｏｌ）を水（５０ｍｌ）に溶解
し、ジオキサン（５０ｍｌ）を加え、次いでｐＨを２Ｎ
水酸化ナトリウムで１１．２に調節した。第三級−ブチ
ル−４−ニトロフェノ−ル炭酸エステル（７．２９ｇ；
３０．５ ｍｍｏｌ）をジオキサン（４０ｍｌ）に溶解
し、２時間かけて滴下したが、この間においてｐＨは２
Ｎ水酸化ナトリウムで１１．２に維持した。ｐＨは、３
時間以上定期的に１１．２に調節し、次いで溶液を一夜
放置した。溶液を０℃にまで冷却し、ｐＨを注意深く
０．５Ｍ塩酸で３．５に調節した。この水溶液を０．５
Ｍクロロホルム（３ ｘ ２００ｍｌ）で洗浄し、ｐＨ
を２Ｎ水酸化ナトリウムで９．５に調節し、この溶液を
真空下で（１４ｍｍＨｇ）蒸発乾凅した。残渣をＤＭＦ
（２５＋２ｘ１０ｍｌ）で抽出し、抽出液をろ過して、
過剰の塩を除去した。こうすることによって、表題化合
物の溶液が収率約６０％でかつｔｌｃ（溶媒系１、ニン
ヒドリンで可視化した、Ｒｆ＝０．３）による純度が９
５％以上で得られる。この溶液をこれ以上精製すること
なく以後のＢｏｃ−ａｅｇの製造に使用した。
【００８８】実施例３ Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（４） この方法は、文献奇さの方法とは異なるが、より容易簡
単であり、高い収率が得られ、製品中に未反応のチミン
が残留しない。ＤＭＦ（９００ｍｌ）中にチミン（３、
４０．０ｇ；０．３１７ｍｏｌ）および炭酸カリウム
（８７．７ｇ；０．６３４ｍｍｏｌ）を分散させた分散
液に、臭化酢酸メチルエステル（３０．００ｍｌ；０．
３１７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を窒素雰囲気下
で一夜激しく攪拌した。この混合物をろ過し、真空下で
蒸発乾凅した。固形の残渣を水（３００ｍｌ）および４
Ｎ塩酸（１２ｍｌ）で処理し、０℃において１５分間攪
拌し、ろ過し、水（２ｘ７５ｍｌ）で洗浄した。沈殿物
を水（１２０ｍｌ）および２Ｎ水酸化ナトリウム（６０
ｍｌ）で処理し、１０分間沸騰させた。この混合物を０
℃に冷却し、ろ過し、次いで純粋の表題化合物を４Ｎ塩
酸（７０ｍｌ）を添加することによって沈殿させた。ｓ
ｉｃａｐｅｎｔ上で真空下乾燥させた後での収率、３
７．１ｇ（６４％）。１Ｈ− ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；Ｄ
ＭＳＯ−ｄ６）：１１．３３ ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ）；７．４９（ｄ，Ｊ＝０．９２Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ
Ｈ）；４．３８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ 2；１．７６（ｄ，Ｊ
＝０．９２Ｈｚ，Ｔ−ＣＨ 3）。
【００８９】実施例４ Ｎ−１−カルボキシメチルチミン ペンタフルオロフェ
ニル エステル（５） Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（４、１０．０ｇ；５
４．３ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノ−ル（１
０．０ｇ；５４．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍｌ）
中に溶解し、氷水で０℃にまで冷却した。ＤＣＣ（１
３．４５ｇ；６５．２ｍｍｏｌ）を次ぎに添加した。温
度が５℃以下になったとき、氷浴を取り除き、混合物を
常温で３時間攪拌した。沈殿したＤＣＵをろ過して除去
し、ＤＭＦ（２ ｘ １０ｍｌ）で二度洗浄した。濾液
を合わせてエ−テル（１４００ｍｌ）に注ぎ、０℃にま
で冷却した。石油エ−テル（１４００ｍｌ）を添加し、
混合物を一夜放置した。表題化合物をろ過して単離し、
石油エ−テルで完全に洗浄した。収率：１４．８ｇ（７
８％）。この製品は、次ぎの反応を実施する出来るほど
純粋であったが、分析用サンプルを２−プロパノ−ルか
ら再結晶して得た。ｍ．ｐ．２００．５−２０６℃。元
素分析、Ｃ13Ｈ7Ｆ5Ｎ2Ｏ4、実験値（理論値）Ｃ：４
４．７９（４４．５９） Ｈ：２．１４（２．０１）
Ｎ：８．１３（８．００）。ＦＡＢ−ＭＳ：４４３（Ｍ
＋１＋グリセリン）、３５１（Ｍ＋１）。 1 Ｈ−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．
５２ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．６４（ｓ，１Ｈ，
ＡｒＨ）；４．９９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ 2）；１．７６
（ｓ，３Ｈ，ＣＨ 3）。
【００９０】実施例５ １−（Ｂｏｃ−ｓｅｇ）チミン（６） ＤＭＦ−溶液に上から、トリエチルアミン（７／０８ｍ
ｌ；５０．８ｍｍｏｌ）を加え、次いでＮ−１−カルボ
キシメチルチミン ペンタフルオロフェニルエステル
（５、４．４５ｇ；１２．７ｍｍｏｌ）を加えた。生じ
た溶液は、１時間攪拌し、０℃に冷却しカチオン交換物
質（”Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ−８”、４０ｇ）で２０
分間処理した。このカチオン交換物質をろ過して除去
し、ジクロロメタン（２ ｘ １５ｍｌ）で洗浄し、ジ
クロロメタン（１５０ｍｌ）を加えた。生じた溶液を飽
和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で
乾燥し、真空下で蒸発乾凅したが、先ず水アスピレ−タ
で、次いでオイルポンプで行った。残渣を水（５０ｍ
ｌ）で振盪し、蒸発乾凅した。この方法をもう一度繰り
返した。残渣を次いでメタノ−ル（７５ｍｌ）に溶解
し、エ−テル（６００ｍ）と石油エ−テル（１．４Ｌ）
に注いだ。一夜攪拌した後で、白色固体をろ過して単離
し、石油エ−テルで洗浄した。真空下でｓｉｃａｐｅｎ
ｔ上で乾燥して、３．５０ｇ（７１．７％）が得られ
た。ｍ．ｐ．１４２−１４７℃。元素分析、Ｃ16Ｈ24Ｎ
4Ｏ7、実験値（理論値） Ｃ：４９．５９（５０．０
０） Ｈ：６．４３（６．２９） Ｎ：１４．５８（１
４．５８）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−
ｄ６）。二級アミド結合の周囲の回転が限定されている
ため、シグナルのいくつかが、２：１の比率で二重化し
た（リストにおいて大きい方はｍｊでまた小さい方はｍ
ｉで示してある）。１２．７３ｐｐｍ（ｂ，１Ｈ，−Ｃ
ＯＯＨ）；１１．２７ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，イミド）；
１１．２５ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，イミド）；７．３０ｐ
ｐｍ（ｓ，ｍｊ．，ＡｒＨ）；７．２６ｐｐｍ（ｓ，ｍ
ｉ．，ＡｒＨ）；６．９２ｐｐｍ（ｕｎｒｅｓ．ｔ，ｍ
ｊ．，ＢｏｃＮＨ）；６．７３ｐｐｍ（ｕｒｅｓ．ｔ；
ｍｉ．，ＢｏｃＮＨ）４．６４ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，Ｔ
−ＣＨ2−ＣＯ−）；４．４７ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，Ｔ
−ＣＨ2−ＣＯ−）；４．１９ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，Ｃ
ＯＮＲＣＨ 2ＣＯ2Ｈ）；３．９７ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，
ＣＯＮＲＣＨ 2ＣＯ2Ｈ）；３．４１−２．８９ｐｐｍ
（ｕｒｅｓ．ｍ，−ＣＨ2ＣＨ2−および水）；１．７５
ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ，Ｔ−ＣＨ3）；１．３８ｐｐｍ
（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）；13Ｃ−ＮＭＲ：１７０．６８
ｐｐｍ（ＣＯ）；１７０．３４（ＣＯ）；１６７．４７
（ＣＯ；１６７．０８（ＣＯ）；１６４．２９（Ｃ
Ｏ）；１５０．９（Ｃ５”）；１４１．９２（Ｃ
６”）；１０８．０４（Ｃ２’）；７７．９５および７
７．６８（Ｔｈｙ−ＣＨ 2ＣＯ）；４８．９６、４７．
４５および４６．７０（−ＣＨ 2ＣＨ 2−およびＮＣＨ 2
ＣＯ2）；３７．９８（Ｔｈｙ−ＣＨ 3）；２８．０７
（ｔ−Ｂｕ）。ＦＡＢ−ＭＳ：４０７（Ｍ＋Ｎａ+）；
３８５（Ｍ＋Ｈ+）。
【００９１】実施例６ １−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミンペンタフルオロフェニル
エステル（７、Ｂｏｃ−Ｔａｅｇ．０Ｐｆｐ） １−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミン（６）（２．００ｇ；
５．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、次い
で塩化メチレン（１５ｍｌ）を加えた。ペンタフルオロ
フェノ−ル（１．０５ｇ；５，７２ｍｍｏｌ）を炭化
し、溶液を氷浴中で０℃にまで冷却した。次いでＤＤＣ
を加え（１．２９ｇ；６．２４ｍｍｏｌ）、次いで２分
後に氷浴を取りはずした。常温で攪拌しつつ３時間経過
後、沈殿したＤＣＵをろ過して除去し、塩化メチレンで
洗浄した。濾液を合わせて、重炭酸ナトリウム溶液で二
度洗浄しまた飽和塩化ナトリウム溶液で一度洗浄し、硫
酸マグネシウムで乾燥し、真空化で蒸発乾凅した。固体
の残渣をジオキサン（１５０ｍｌ）に溶解し、０℃で水
（２００ｍ）に注いだ。表題化合物をろ過して単離し、
水で洗浄し真空化でｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥した。収
率：２．２０ｇ（７７％）。分析用試料を２−プロパノ
−ルから再結晶化して得た。ｍ．ｐ．１７４−１７５．
５℃。元素分析、Ｃ22Ｈ23Ｎ4Ｏ7Ｆ5、実験値（理論
値） Ｃ：４８．２２（５０．００） Ｈ：４．６４
（４．２１） Ｎ：９．６７（１０．１８）。 1 Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：二級アミド
結合の周囲の回転が限定されているため、シグナルのい
くつかが、６：１の比率で二重化した（リストにおいて
大きい方はｍｊでまた小さい方はｍｉで示してある）。
７．０１ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，ＡｒＨ）；６．９９ｐｐ
ｍ（ｓ，ｍｊ．，ＡｒＨ）；５．２７ｐｐｍ（ｕｎｒｅ
ｓ．ｔ，ＢｏｃＮＨ）；４．６７ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ．，
Ｔ−ＣＨ2−ＣＯ−）；４．６０ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，
Ｔ−ＣＨ2−ＣＯ−）；４．４５（ｓ，ｍｊ．，ＣＯＮ
ＲＣＨ 2ＣＯ2Ｐｆｐ）；４．４２ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ．，
ＣＯＮＲＣＨ 2ＣＯ2Ｐｆｐ）；３．６４ｐｐｍ（ｔ，２
Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ2ＣＨ 2−）；３．８７ｐｐｍ（”
ｑ”，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ 2ＣＨ2−）；１．４４
（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。ＦＡＢ−ＭＳ：５５１（１
０；Ｍ＋１）；４９５（１０；Ｍ＋１−ｔＢｕ）；４５
１（８０；−Ｂｏｃ）．
【００９２】実施例７ Ｎ4−ベンジルオキシカルボニルシトシン（９） ほぼ１時間かけて、塩化ベンジルオキシカルボニル（５
２ｍｌ；０．３６ｍｏｌ）を、乾燥ピリジン（１０００
ｍｌ）にシトシン（８、２０．０ｇ；０．１８ｍｏｌ）
を分散させた分散液に０℃において、オ−ブンで乾燥さ
せた装置の中で窒素雰囲気中にて滴下した。この溶液を
一夜攪拌し、その後このピリジン分散液を真空下で蒸発
乾凅させた。水（２００ｍｌ）と４Ｎ塩酸を添加して、
ｐＨ〜１にした。生じた白色沈殿をろ過して除き、水で
洗浄し、空気をサクションして部分的に乾燥した。まだ
湿潤している沈殿を無水アルコ−ル（５００ｍｌ）と一
緒に１０分間沸騰させ、０℃にまで冷却し、ろ過し、エ
−テルデで 完全に洗浄し、真空下で乾燥した。収率、
２４．７ｇ（５４％）。ｍ．ｐ．＞２５０℃。元素分
析、Ｃ14Ｈ11Ｎ3Ｏ3、実験値（理論値） Ｃ：５８．５
９（５８．７７） Ｈ：４．５５（４．５２） Ｎ：１
７．１７（１７．１３）。ＮＭＲスペクトルは、本製品
を溶解出来なかったため一切記録しなかった。
【００９３】実施例８ Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ１−カルボキシメ
チルシトシン（１０） メカニカル攪拌装置と窒素封入装置を備えた三口丸底フ
ラスコに臭化酢酸メチルエステル（７．８２ｍｌ；８
２．６ｍｍｏｌ）およびＮ４−ベンジルオキシカルボニ
ルシトシン（９、２１．０ｇ；８２．６ｍｍｏｌ）と炭
酸カリウム（１１．４ｇ；８２．６ｍｍｏｌ）を乾燥Ｄ
ＭＦ（９００ｍｌ）中に分散させた分散液を入れた。こ
の混合物を一夜激しく攪拌し、ろ過し、真空下で蒸発乾
凅した。水（３００ｍｌ）と４Ｎ塩酸（１０ｍｌ）とを
加え、混合物を０℃で１５分間攪拌し、ろ過し、水（２
ｘ ７５ｍｌ）で洗浄した。単離した沈殿を水（１２
０ｍｌ）、２Ｎ水酸化ナトリウム（６０ｍｌ）処理し、
３０分間攪拌し、ろ過し、０℃に冷却し４Ｎ塩酸（３５
ｍｌ）を加えた。表題化合物をろ過して単離し、よく水
で洗浄し、メタノ−ル（１０００ｍｌ）から再結晶し、
よくエ−テルで洗浄した。こうして、７．７０ｇ（３１
％）の純品を得た。再結晶母液を２００ｍｌの容積にま
で濃縮し、０℃に冷却した。こうすることによって、さ
らに２．３０ｇの物質を得たが、このものは、ｔｌｃで
純品でありことが判り、淡赤色を呈していた。ｍ．ｐ．
２６６−２７４℃。元素分析、Ｃ14Ｈ13Ｎ3Ｏ5、実験値
（理論値） Ｃ：５５．４１（５５．４５） Ｈ：４．
２３（４．５３２） Ｎ：１４．０４（１３．８６）。
1Ｈ− ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）：
８．０２ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−
６）；７．３９（ｓ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．０１（ｄ，Ｊ
＝７．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．１９（ｓ，２
Ｈ，ＰｈＣＨ 2−）；４．５２（ｓ，２Ｈ）。
【００９４】実施例９ Ｎ４−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ１−カルボキシメ
チルシトシンペンタフルオロフェノ−ルエステル（１
１） Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−カルボキシメチ
ルシトシン（１０、４．００ｇ；１３．２ｍｍｏｌ）お
よびペンタフルオロフェノ−ル（２．６７ｇ；１４．５
ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７０ｍ）と混合し、氷浴で０℃に
まで冷却し、ＤＣＣ（３．２７ｇ；１５．８ｍｍｏｌ）
を添加した。この氷浴を３分後に取りはずし、混合物を
室温で３時間攪拌した。沈殿したＤＣＵをろ過して除去
し、ＤＭＦで洗浄し、次いで濾液を真空下で（０．２ｍ
ｍＨｇ）蒸発乾凅した。固体の残渣を塩化メチレン（２
５０ｍｌ）で処理し、１５分間激しく攪拌し、溶かし、
希重炭酸ナトリウム溶液で二度また飽和塩化ナトリウム
液で一度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で
蒸発乾凅した。固体の残渣を２−プロパノ−ル（１５０
ｍｌ）で再結晶し、結晶をよくエ−テルで洗浄した。収
率、３．４０ｇ（５５％）。ｍ．ｐ．２４１−２４５
℃。元素分析、Ｃ20Ｈ12Ｎ3Ｆ5Ｏ5、実験値（理論値）
Ｃ：５１．５６（５１．１８） Ｈ：２．７７（２．
５８） Ｎ：９．２４（８．９５）。 1Ｈ− Ｎ
ＭＲ（９０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）：７．６６ｐｐｍ
（ｄ，Ｊ＝７．６３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３７
（ｓ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．３１（ｄ，Ｊ＝７．６３Ｈ
ｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．２１（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ 2
−）；４．９７（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ 2）。ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ：４７０（Ｍ＋１）。
【００９５】実施例１０ Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ−ａｅｇ
−シトシン（１２） 上記において調製した（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチ
ル）グリシン（２）をＤＭＦ に溶かした溶液に、トリ
エチルアミン（７．００ｍｌ；５０．８ｍｍｏｌ）およ
びＮ４−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ１−カルボキシ
メチルシトシンペンタフルオロフェノ−ルエステル（１
１、２，７０ｇ；５，７５ｍｍｏｌ））を加えた。この
溶液を室温で１時間攪拌した後、塩化メチレン（１５０
ｍｌ）、飽和塩化ナトリウム液（２５０ｍｌ）、および
ｐＨ〜１までの４Ｎ塩酸を加えた。有機層を分離し、飽
和塩化ナトリウム液で二度洗浄し、硫酸マグネシウムで
乾燥し、真空下で蒸発乾凅したが、先ず最初は水アスピ
レ−タ−、次ぎにオイルポンプを用いて蒸発乾凅した。
油状の残渣を水（２５ｍｌ）で処理し、再度、真空下で
蒸発乾凅した。この方法を繰り返した。油状残渣（２．
８０ｇ）を次ぎに塩化メチレン（１００ｍｌ）に溶解
し、石油エ−テル（２５０ｍｌ）を加え、この混合物を
一夜攪拌した。表題化合物をろ過して単離し、石油エ−
テルで洗浄した。Ｔｌｃ（溶媒系１）の結果、実際量の
ペンタフルオロフェノ−ルが存在することが判ったが、
これを除去しようとする試みは行わなかった。収率：
１，７２ｇ（５９％）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、
ＣＤＣｌ3）。二級アミド結合の周囲の回転が限定され
ているため、シグナルのいくつかが、２：１の比率で二
重化した（リストにおいて大きい方はｍｊでまた小さい
方はｍｉで示してある）。７．８８ｐｐｍ（ｄｄ，１
Ｈ，Ｈ−６）；７．３９（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．００
（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５）；６．９２（ｂ，１Ｈ，Ｂｏｃ
ＮＨ）；６．７４（ｂ，１Ｈ，ＺＮＨ）−？；５．１９
（ｓ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ 3）；４．８１ｐｐｍ（ｓ，ｍ
ｊ．，Ｃｙｔ−ＣＨ2−ＣＯ−）；４．６２ｐｐｍ
（ｓ，ｍｉ．，Ｃｙｔ−ＣＨ−ＣＯ＝）；４．２３
（ｓ，ｍｉ．，ＣＯＮＲＣＨ 2ＣＯ2Ｈ）；３．９８ｐｐ
ｍ（ｓ，ｍｊ．，ＣＯＮＲＣＨ 2ＣＯ2Ｈ）；３．４２−
３．０２（ｕｎｒｅｓ．ｍ，−ＣＨ2ＣＨ2−および
水）；１．３７（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）。ＦＡＢ−ＭＳ：
５０４（Ｍ＋１）；４４８（Ｍ＋１−ｔＢｕ）。
【００９６】実施例１１ Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ−ａｅｇ
−シトシンペンタフルオロフェノ−ルエステル（１３） Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ−ａｅｇ
−シトシン（１２、１．５０ｇ；２．９８ｍｍｏｌ））
およびペンタフルオロフェノ−ル（５４８ｍｇ；２．９
８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍ）に溶解し、塩化メチレ
ン（１０ｍｌ）を添加し、反応混合物を氷浴中で０℃に
まで冷却し、ＤＤＣ（６７６ｍｇ；３．２８ｍｍｏｌ）
を添加した。この氷浴を３分後に取り除き、混合物を常
温で３時間攪拌した。沈殿をろ過して単離し、塩化メチ
レンで一度洗浄した。この沈殿を、沸騰ジオキサン（１
５０ｍｌ）に溶解し、生じた溶液を１５℃にまで冷却し
たが、この際ＤＣＵが沈殿した。このＤＣＵをろ過して
除去し、生じた濾液を０℃において水（２５０ｍｌ）に
注いだ。表題化合物をろ過して単離し、水で洗浄し真空
下においてｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥した。収率：１．
３０ｇ（６５％）。元素分析、Ｃ29Ｈ28Ｎ5Ｏ8Ｆ5、実
験値（理論値） Ｃ：５２．６３（５２．０２） Ｈ：
４．４１（４．２２） Ｎ：１０．５５（１０．４
６）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：
本質的の上記酸のスペクトルを示したが、該エステルが
加水分解したことに起因するのが最も可能性が高い。Ｆ
ＡＢ−ＭＳ：６７０（Ｍ＋１）；６１４（Ｍ＋１−ｔＢ
ｕ）．
【００９７】実施例１２ ４−クロロカルボキシ−９−クロロアクリジン ４−カルボキシアクリジン（６．２５ｇ；２６．１ｍｍ
ｏｌ）、塩化チオニル（２５ｍｌ）および４滴のＤＭＦ
を、固体の物質が全て溶解するまで窒素を流しながら緩
やかに加熱した。次いでこの溶液を４０分間還流し、過
剰の塩化チオニルを真空下で除去した。塩化チオニルの
最後の痕跡量を乾燥ベンゼン（Ｎａ−Ｐｂで乾燥）と一
緒に二度蒸発させて除去した。残留する黄色の粉末を直
接次ぎの反応にそまま用いた。
【００９８】実施例１３ ４−（５−メトキシカルボニルペンチルアミドカルボニ
ル）−９−クロロアクリジン ６−アミノヘキサノン酸メチル塩酸塩（４．７０ｇ；２
５．９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（９０ｍｌ）に溶解
し、０℃にまで冷却し、トリエチルアミン（１５ｍｌ）
を加え、生じた溶液を直ちに酸の塩化物に上から加え
た。この酸塩化物を入れた丸底のフラスコを氷浴中で０
℃にまで冷却した。この混合物を０℃で３０分間また室
温で３時間激しく攪拌し、この混合物をろ過して残留す
る固形物除去したが、この固形物を塩化メチレン（２０
ｍｌ）で洗浄した。この赤−茶色の塩化メチレンろ液を
飽和重炭酸ナトリウムで二度洗浄しまた飽和塩化ナトリ
ウムで一度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下
で蒸発乾凅した。得られた油状の物質に、乾燥ベンゼン
（３５ｍｌ）およびリグロイン（６０−８０℃、Ｎａ−
Ｐｂで乾燥）を加えた。この混合物を還流するまで加熱
した。活性炭およびセライトを加えて、この混合物を３
分間還流した。ろ過した後で、表題化合物は、磁気攪拌
下で冷却すると結晶化した。この藻をろ過して単離し、
石油エ−テルで洗浄した。本品は、固形の水酸化カリウ
ム上で保存した。収率：５．０ｇ（５０％）。
【００９９】実施例１４ ４−（５−メトキシカルボニルペンチル）アミドカルボ
ニル）−９−［６’−（４”−ニトロベンズアミド）ヘ
キシルアミノ］−アミノアクリジン ４−（５−メトキシカルボニルペンチルアミドカルボニ
ル）−９−クロロアクリジン（１．３０ｇ；３．３８ｍ
ｍｏｌ）およびフェノ−ル（５ｇ）を、窒素気流下で３
０分間で８０℃にまで加熱し、その後６−（４’−ニト
ロベンズアミド）−１−ヘキシルアミン（８９７ｍｇ；
３，３８ｍｍｏｌ）を加えた。温度は２時間で１２０℃
まで上昇した。反応混合物を冷却し、塩化メチレン（８
０ｍｌ）を加えた。生じた溶液は２Ｎ水酸化ナトリウム
（６０ｍｌ）で三度また水で一度洗浄し、硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、真空下で蒸発乾凅した。得た赤色オイル
（１．８ｇ）を塩化メチレン（４０ｍｌ）に溶解し、０
℃にまで冷却した。エ−テル（１２０ｍｌ）を加え、出
た溶液を一夜攪拌した。こうすることによって、固形物
質とオイルの混合物が得られた。この固形ブツヲろ過し
て単離した。固形物とオイルとを塩化メチレン（８０ｍ
ｌ）に再度溶解し、冷エ−テル（１５０ｍｌ）に滴下し
た。２０分間攪拌したあと、表題化合物をろ過してオレ
ンジ色の結晶として単離した。本品をエ−テル出洗浄
し、水酸化カリウム上で真空にて乾燥した。収率：１．
６０ｇ（７７％）。ｍ．ｐ．１４５−１４７℃。
【０１００】実施例１５ ４−（５−カルボキシペンチル）アミドカルボニル）−
９−［６’−（４”−ニトロベンズアミド）ヘキシルア
ミノ］−アミノアクリジン ４−（５−メトキシカルボニルペンチル）アミドカルボ
ニル）−９−［６’−（４”−ニトロベンズアミド）ヘ
キシルアミノ］−アミノアクリジン（５０３ｍｇ；０．
８２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解し、２Ｎ水
酸化ナトリウム（３０ｍｌ）を添加した。１５分間攪拌
した後、２Ｎ塩酸（３５ｍｌ）および水（５０ｍｌ）を
０℃で加えた。３０分間攪拌したあとで、溶液をデカン
トしたところ、オイル状の物質が得られ、これを沸騰メ
タノ−ル（１５０ｍｌ）に溶解し、ろ過し、 １／３の
容積にまで濃縮した。このメタノ−ル溶液に、エ−テル
（１２５ｍｌ）およびエタノ−ルに溶かした塩酸５−６
滴を加えた。この溶液を０℃において１時間攪拌した後
でデカントした。オイル状の物質を再びメタノ−ル（２
５ｍｌ）に溶解し、エ−テル（１５０ｍｌ）で沈殿させ
た。一夜攪拌した後で表題化合物が黄色結晶として単離
された。収率：４１７ｍｇ（８０％）。ｍ．ｐ．１７３
℃（分解）。
【０１０１】実施例１６ （ａ）４−（５−ペンタフルオロフェニルメオシカルボ
ニルペンチル）アミドカルボニル）−９−［６’−
（４”−ニトロベンズアミド）ヘキシルアミノ］−アミ
ノアクリジン（Ａｃｒ１Ｏｐｆｐ） 上記の酸（３００ｍｇ；０．，４８０ｍｍｏｌ）をＤＭ
Ｆ（２ｍｌ）と塩化メチレン（８ｍｌ）に溶解し、ペン
タフルオロフェノ−ル（９７ｍｇ；０．５３ｍｍｏｌ）
を２ ｘ ２ｍｌの塩化メチレンと共に移して添加し
た。生じた溶液を０℃まで冷却し、この後ＤＣＣ（１２
４ｍｇ；０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を５分後に
取り除き、混合物を一夜攪拌しつつ放置した。沈殿した
ＤＣＵを遠心分離して除去し、遠心分離液を真空下で蒸
発乾凅したが、先ず水アスピレ−タで次いでオイルポン
プで蒸発乾凅した。残渣を塩化メチレン（２０ｍｌ）中
に溶解し、ろ過し、真空にて蒸発乾凅した。残渣を再び
塩化メチレンと石油エ−テル（１５０ｍｌ）に溶解し
た。エ−テル中の５Ｎ塩酸１ｍｌを添加し、０℃で３０
分間攪拌した後、溶媒をデカンテ−ションで除去した。
残留するオイル状物質を塩化メチレン（１００ｍｌ）に
溶解し、石油エ−テルを加え、混合物を一夜攪拌しつつ
放置した。翌日、黄色の沈殿結晶物をろ過して単離し、
大量の石油エ−テルで洗浄した。収率：３００ｍｇ（７
８％）、乾燥後。ｍ．ｐ．９７，５℃（分解）。全ての
試料は、帰属するべき元素分析結果、1Ｈ−および13Ｃ
−ＮＭＲおよび質量スペクトルを示した。
【０１０２】（ｂ）ＰＮＡ化合物の合成実験、第８図を
参照。 材料：Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）、ベンゾヒドリルアミ
ン−コポリ（スチレン−１％−ジビニルベンゼン）樹脂
（ＢＨＡ樹脂）およびｐ−メチルベンゾヒドリルアミン
−コポリ（スチレン−１％−ジビニルベンゼン）樹脂
（ＭＢＨＡ樹脂）をＰｎｅｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓから購入した。その他の試薬および溶媒
は、それぞれ以下から購入した：即ち、Ｂｉｏｇｒａｄ
ｅのトリフルオロ酢酸は、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ社から；ジイソプロピルエチルアミン（９
９％；これ以上蒸留しなかった）およびＮ−アセチルイ
ミダゾ−ル（９８％）は、Ａｌｄｒｉｃｈ社から；Ｈ２
Ｏは、二度蒸留した；無水ＨＦは、Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒ
ｂｉｄｅ社から；合成グレ−ドのＮ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミドおよび分析グレ−ドの塩化メチレン（これ以上
蒸留しなかった）は、Ｍｅｒｃｋ社から；ＨＰＬＣグレ
−ドのアセトニトリルは、Ｌａｂ−Ｓｃａｎ社から；ｐ
ｕｒｕｍグレ−ドのアニソ−ル、Ｎ、Ｎ−ジシクロヘキ
シルカルボジイミドおよびｐｕｒｉｓｓ．グレ−ドの
２、２、２−トリフルオロエタノ−ルは、Ｆｌｕｋａ社
から購入した。
【０１０３】（ｂ）一般的方法および注記 別段に特記しない限り、以下を適用する。ＰＮＡ化合物
は、”一時的な”Ｎ−保護のためにＴＦＡ−反応活性な
第三級−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を用い
（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃ
ｏ，、１９６４、８６、３０４）また”永久的な”側鎖
保護のためにもっと酸に安定なベンジルオキシカルボニ
ル（Ｚ）および２−クロロベンジルオキシカルボニル
（ＣｌＺ）を用いて段階的固相方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅ
ｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６３、８
５、２１４９）によって合成した。Ｃ−末端アミドを得
るために、ＰＮＡ類は、ＨＦ−反応活性なＢＨＡまたは
ＭＢＨＡ樹脂（このＭＢＨＡ樹脂は、未置換ＢＨＡ樹脂
を基準として最終ＨＦ開裂を受け易い（Ｍａｔｓｕｅｄ
ａら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１９８１、２、４５））の上
において構築した。全ての反応は（ＨＦ反応を除い
て）、粗いガラスフリットを備えた、手動操作する標準
固相反応容器において行った（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８２、２１、５０
２０）。元来”通常の”アミノ酸を包含するペプチドの
ためにＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄおよびその共同研究者（Ｓ
ａｒｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８１、
１１７、１４７）によって開発された定量的なニンヒド
リン反応が、全ての樹脂に対して”通常”用いられてき
た有効吸光係数ε＝１５０００Ｍ-1ｃｍ-1を用いると、
うまく適用され、個別のカップリングの完結度ならびに
成長するペプチド鎖の数を測定出来た。カップリング時
の残留基ｎの理論的置換度Ｓｎ−１は（合成サイクルの
過程において脱保護とカップリングが完璧でありかつＰ
ＮＡの鎖終了もその逸失も一切ないことを前提とす
る）、以下の式から算定される：
【０１０４】Ｓｎ＝Ｓｎ−１ ｘ （１ ＋ （Ｓｎ−
１ ｘΔＭＷ ｘ １０-3 ｍｍｏｌ／ｍｏｌ））-1
【０１０５】なお本式において、ΔＭＷは、分子量の増
大分（［ΔＭＷ］＝ｇ／ｍｏｌ）であり、またＳｎ−１
は、先行する残留基ｎ−１のカップリング時の理論的置
換度である（［Ｓ］＝ｍｍｏｌ／ｇ）。個別のカップリ
ングの程度の推定値（％）は、測定した置換度を基準と
して算出され（Ｓが決定されない限り）かつ先立つサイ
クルのあとの残留する遊離アミノ酸基の数について補正
はしていない。ＨＦ反応は、Ｔｏｈｏ Ｋａｓｅｉ（Ｏ
ｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）製のＤｉａｆｌｏｎＨＦ装置で
実施した。Ｖｙｄａｃ Ｃ１８（５ミクロン、０．４６
ｘ ２５ｃｍおよび５ミクロン。１ ｘ ２５ｃｍ）
逆相カラムは、それぞれＳＰ８０００計器において分析
用および半−合成用ＨＰＬＣに用いた。緩衝液液Ａは、
１リットル当たり４４５マイクロリットルのトリフルオ
ロ酢酸を含む６０容量％のアセトニトリル／水溶液であ
り、また緩衝液Ｂは、１リットル当たり３９０マイクロ
リットルのトリフルオロ酢酸を含む６０容量％のアセト
ニトリル／水溶液である。直線勾配は、３０分で０−１
００％の緩衝液Ｂで、流速は１．２ｍｌ／分（分析用）
と５ｍｌ／分（半製造用）であった。溶出液は２１５ｎ
ｍ（分析用）と２３０ｎｍ（半製造用）においてモニタ
−した。ＰＮＡ類の分子量は、最も多い同位元素の平均
値から252Ｃｆプラズマ脱着の飛行時間質量分光測定法
によって決定した。
【０１０６】実施例１７ Ａｃｒ１−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2およびより短い誘導
体の固相合成 （ａ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂の段階的合
成 この合成は、事前膨潤させ、中和したＢＨＡ樹脂１００
ｍｇの上で（定量的ニンヒドリン反応によって０．５７
ｍｍｏｌ／ＮＨ2／ｇ含有する旨決定された）、３．２
等量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐをほぼ３３％のＤＭＦ
／ＣＨ２Ｃｌ２中で用いて開始した。個別のカップリン
グ反応は、手動操作する、６ｍｌの標準固相反応容器内
で少なくとも１２時間振盪することによって実施し、未
反応のアミノ基は、合成の選択された段階でアセチル化
することによってブロックした。鎖延長の過程は、定量
的ニンヒドリン反応によっていくつかの段階でモニタ−
した（第Ｉ表を参照）。保護されたＢｏｃ−［Ｔａｅ
ｇ］5−ＢＨＡ、Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−ＢＨＡおよ
びＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡの一部を、それぞれ
５、１０および１５の残基を構築した後で取り出した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】（ｂ）Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ
樹脂の合成 残留Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂（推定乾燥重
量はほぼ３０ｍｇ；０．００２ｍｍｏｌ成長鎖）の脱保
護を行ったあと、３ｍｌの固相反応容器において、Ｈ−
［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂を６６％ほぼＤＭＦ／ＣＨ
2Ｃｌ2１ｍｌ中ほぼ５０当量（８０ｍｇ；０．１１ｍｍ
ｏｌ）のＡｃｒ１−ＯＰｆｐ（即ち、ペンタフルオロフ
ェノ−ル０．１１Ｍ溶液）に反応させた。定量的ニンヒ
ドリン反応によって判定されたように、アクリジン部の
カップリングはほぼ定量的に近似していた。
【０１０９】（ｃ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2の開
裂、精製および同定 保護されたＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−ＢＨＡ樹脂の一部
を、塩化メチレン中５０％のトリフルオロ酢酸と反応さ
せて、ＨＦ開裂に先だってＮ−末端Ｂｏｃ（これは、潜
在的に有害な三級−ブチルの前駆体である）を除去し
た。中和しかつ洗浄し（”合成実験記録”工程２−４の
方法と同様の方法で）次いで真空で２時間乾燥した後、
生じた６７．１ｍｇ（乾燥重量）のＨ−［Ｔａｅｇ］15
−ＢＨＡ樹脂を０℃において６０分間攪拌しつつ５ｍｌ
のＨＦ：アニソ−ルで開裂させた。ＨＦを除去した後、
残渣を乾燥ジエチルエ−テル（４ ｘ １５ｍｌ、それ
ぞれ１５分間）とともに攪拌して、アニソ−ルを除去
し、フリット処理したガラス漏とで重力ろ過し、乾燥さ
せた。ＰＮＡを次ぎに６０ｍｌ（４ ｘ １５ｍｌ、そ
れぞれ１５分間攪拌）の酢酸水溶液に抽出した。この溶
液のいくつかのアリコ−トを分析用逆相ＨＰＬＣによっ
て分析して、この粗製ＰＮＡの純度を測定した。１３．
０分における主ピ−クは、前吸光率のほぼ９３％を占め
ていた。残りの溶液は、凍らせ、次いで凍結乾燥する
と、粗製物がほぼ２２．９ｍｇが得られた。最後に、１
９．０ｍｇのこの粗製物をそれぞれ１ｍｌの水に３．８
ｍｇを含む五つのバッチから精製した。この主ピ−ク
は、半合成用逆相カラムを用いて集めた。アセトニトリ
ルをスピ−ドｖａｃで除き、残留溶液を凍結し（ドライ
アイス）、その後凍結乾燥させると、９９％以上の純度
のＨ−［Ｔａｅｇ］5−ＮＨ2が１３．１ｍｇ得られた。
このＰＮＡ分子は、直ちに水に溶解し、質量分光分析に
よる測定に基づいて正確な分子量を有していた。（Ｍ＋
Ｈ）+について、計算したｍ／ｚ値は１３４９．３であ
りまた測定したｍ／ｚ値は１３４７．８であった。
【０１１０】（ｄ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−ＮＨ2の開
裂、精製および同定 保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−ＢＨＡの一部を上記
（ｃ）項において記載したように処理し、１８．９ｍｇ
の乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂する
と１１．０ｍｇの粗製物が得られた。１５．５分におけ
る主ピ−クは、全吸光度のほぼ５３％を占めていた。ほ
ぼ１ｍｇのこの粗製物を繰り返して（下記する理由によ
って）、少なくとも８０％の、恐らくは９９％以上の純
度のＨ−［Ｔａｅｇ］10−ＮＨ2がほぼ１ｍｇ得られ
た。標的ピ−クの後で溶出しかつ全吸光度のほぼ２０％
を占めるもう少しブロ−ドのテイル部は、繰り返し精製
しても除去出来なかった（若干減少しただけ）。質量ス
ペクトルは正確な分子量のＨ−［Ｔａｅｇ］10−ＮＨ2
の存在を確認するものであったが、そのスペクトルから
判定して、このようなテイル現象は、多少とも充分に定
義された、いくつかの凝集／配座状態にある標的分子に
よるものである。従って、この粗製物は、標的分子を上
記した５３％以上は含有している可能性がある。Ｈ−
［Ｔａｅｇ］10−ＮＨ2は、水に容易に溶解する。（Ｍ
＋Ｈ）+については、計算ｍ／ｚ値は２６７９．６であ
りかつ測定ｍ／ｚ値は２６８１．５であった。
【０１１１】（ｅ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2の開
裂、精製および同定 保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−ＢＨＡ樹脂の一部を
（ｃ）項において記載したと同様に処理して、１３．９
ｍｇの乾燥Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂をＨＦ
開裂して３．２ｍｇの粗製物を得た。２２．６分におけ
る主ピ−クは、ブロ−ドな膨れ部に位置し、全吸光度の
ほぼ６０％を占めていた（第１２ａ図）。再び（前項を
参照）、この膨れ部は、質量スペクトルによってこの集
積した”膨れ部”を分析したところ、他の分子の存在が
ないことが判ったので、いくつかの凝集／配座状態の標
的分子Ｈ−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2によるものである。
この粗製物を全て”膨れ部”を集めて精製したところ、
ほぼ２．８ｍｇの物質を得た。（Ｍ＋Ｈ）＋について
は、計算ｍ／ｚ値は４０３３．９でありかつ測定ｍ／ｚ
値は４０３２．９であった。
【０１１２】（ｆ）Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2の
開裂、精製および同定 保護されたＡｃｒ１−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂の一
部を（ｂ）項において記載したように処理して２９．７
ｍｇの乾燥Ａｃｒ１−［Ｔａｅｇ］15−ＢＨＡ樹脂をＨ
Ｆ開裂して１４．３ｍｇの粗製物を得た。全て合わせる
と、２３．７に分における主ピ−クおよび２９．２分に
おける”ダイマ−”（下記を参照）は、全吸光度のほぼ
４０％を占めていた（第１２ｂ図）。この粗製物を繰り
返し精製して、恐らくは９９％以上の純度のＡｃｒ１−
［Ｔａｅｇ］15−ＮＨ2 −２７．４分、２９．２分お
よび最後に１００％緩衝液Ｂで溶出する大きく、ブロ−
ドな膨れ部として溶出する自己凝集分子で”汚染され
た”−がほぼ１ｍｇ得られた（第１２ｃ図）。このよう
な解釈は、これらのピ−クが酢酸水溶液中において放置
すると（数時間）成長し、最後に定量的に下降するとい
う観察結果と一致する。（Ｍ＋Ｈ）＋については、計算
ｍ／ｚ値は４５９３．６でありかつ測定ｍ／ｚ値は４５
８８．７であった。
【０１１３】（ｇ）合成実験記録１ （１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢ
ｏｃ−脱保護、３ｍｌ、３ｘ１分および１ｘ３０分；
（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分；
（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）によ
る中和、３ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2による洗
浄、３ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−ン；
（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、完全
に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換度を測定
する；（６）１ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した３．２当量
の（０．１８ｍｍｏｌ；１００ｍｇ）ＢｏｃＴａｅｇ−
ＯＰｆｐを添加し、次いで０．５ｍｌのＤＭＦ（最終の
ペンタフルオロフェノ−ル濃度＾０．１２Ｍ））を添加
する；（７）ＤＭＦによる洗浄、３ｍｌ、１ｘ２分；
（８）ＣＨ 2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、４ｘ１分；
（９）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）によ
る中和、３ｍｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ2Ｃｌ2による
洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇの保護Ｐ
ＮＡ樹脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に
供し、さらに２−５ｍｇをよく乾燥してニンヒドリン定
量分析に供して、カップリング度を測定する（サイクル
７、１０および１５の後で、未反応アミノ基を塩化メチ
レン中でＮ−アセチルイミダゾ−ルによるアセチル化を
行いブロックした）。
【０１１４】実施例１８ Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ−ＮＨ2および短鎖誘
導体の固相合成
【０１１５】（ａ）Ａｃｒ１−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ
（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の段階的構築 この合成は、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）を予め膨潤さ
せ、中和したＢＨＡ樹脂（０．５７ｍｍｏｌＮＨ2／
ｇ）１００ｍｇに定量的にロ−ディング（純ＣＨ２Ｃｌ
２中での標準的ＤＣＣによるｉｎ−ｓｉｔｕカップリン
グ）することによって開始した。この保護したＰＮＡ樹
脂鎖をさらに延長するために、ほぼ３３％ＤＭＦ／ＣＨ
2Ｃｌ2中３．２当量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを用い
て、サイクル１から５までおよび１０から１５までにつ
いて単一カップリング（”合成実験記録２”）を用い
た。サイクル５から１０までは、ほぼ３３％ＳＭＦ／Ｃ
Ｈ2Ｃｌ2中遊離の酸ＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨをまた別のス
トレ−トＤＣＣ（即ち、ｉｎ ｓｉｔｕ）カップリング
させる方法を用いた。全てのアカップリング反応を手動
操作式の６ｍｌ標準固相反応容器中において少なくとも
１２時間振盪することによって実施した。未反応のアミ
ノ基を、実施例１７において行ったと同様に、この合成
の同じ段階においてアエチル化することによってブロッ
クした。保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（Ｃ
ＩＺ）−ＢＨＡ樹脂およびＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌ
ｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂を一部ずつ、５および１０
ＰＮＡ残基を組み立てた後で取り出した。Ｂｏｃ−［Ｔ
ａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の分析用Ｈ
ＰＬＣクロマトグラムから判定して（（ｅ）項を参
照）、ＰＮＡ残基５から１０までにさらに”遊離酸”カ
ップリングさせても、実施例１７における完全単一カッ
プリングした残基と比較して、合成収率は改善されるこ
とはなかった。
【０１１６】（ｂ）Ａｃｒ１−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ
（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の合成 Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹
脂の一部を脱保護した後で（推定乾燥重量はほぼ９０ｍ
ｇ；＾０．０１ｍｍｏｌの成長鎖）、このＨ−［Ｔａｅ
ｇ］15−ＢＨＡ樹脂に３ｍｌの固相反応容器のおいてほ
ぼ６６％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中ほぼ２０当量の（１４１
ｍｇ；０．１９ｍｍｏｌ）のＡｃｒ１−ＯＰｆｐを反応
させた。定量的ニンヒドリン反応から判定して、アクリ
ジン部のカップリングは、定量的に近かった。
【０１１７】（ｃ）Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ
（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の合成 残留Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨ
Ａ樹脂（推定乾燥重量はほぼ７０ｍｇ；０．００５ｍｍ
ｏｌ成長鎖）を脱保護したあとで、このＨ−［Ｔａｅ
ｇ］15−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂に３ｍｌの固相
反応容器のおいてほぼ６６％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中ほぼ
２５当量の（９１ｍｇ；０．１２ｍｍｏｌ）のＡｃｒ１
−ＯＰｆｐを反応させた。定量的ニンヒドリン反応から
判定して、アクリジン部のカップリングは、定量的に近
かった。
【０１１８】（ｄ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−ＮＨ2の開裂、
精製および同定 保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−
ＢＨＡ樹脂の一部を実施例１７ｃにおいて記載したよう
に処理し、１９．０ｍｇの乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌ
ｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂すると８．９ｍ
ｇの粗製物が得られた。１２．２分における主ピ−クは
（１０％酢酸溶液の代わりに水溶液から注入すると１
４．２分において溶出）、全吸光度のほぼ９０％を占め
ていた。ほぼ２．２ｍｇの粗製物を精製すると、９９％
純度のＨ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ−ＮＨ２がほぼ１．
５ｍｇ得られた。
【０１１９】（ｅ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ
2の開裂、精製および同定 保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−
ＢＨＡ樹脂の一部を実施例１７ｃにおいて記載したよう
に処理し、７．０ｍｇの乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］ 10−Ｌｙ
ｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂すると１．７ｍｇ
の粗製物が得られた。１５．１分における主ピ−クは
（１０％酢酸溶液の代わりに水溶液から注入すると１
７．０分において溶出）、全吸光度のほぼ５０％を占め
ていた。ほぼ１．２ｍｇの粗製物を精製すると、９５％
以上の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほ
ぼ０．２ｍｇ得られた。（Ｍ＋Ｈ）+については、計算
ｍ／ｚ値は２８０７．８でありかつ測定ｍ／ｚ値は２８
０８．２であった。
【０１２０】（ｆ）Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ
−ＮＨ2の開裂、精製および同定 保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−
ＢＨＡ樹脂の９９．１ｍｇ（乾燥重量）を実施例１７ｃ
において記載したように処理し、４２．２ｍｇの粗製物
を得た。２５．３分における主ピ−クは（１０％酢酸溶
液の代わりに水溶液から注入する２３．５分において溶
出）、全吸光度のほぼ４５％を占めていた。８．８７ｍ
ｇの粗製物を精製すると、９７％以上の純度のＨ−［Ｔ
ａｅｇ］ 10−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ５．３ｍｇ得られ
た。（Ｍ＋Ｈ）+については、計算ｍ／ｚ値は２８５
０．８でありかつ測定ｍ／ｚ値は２８４９．８であっ
た。
【０１２１】（ｇ）Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ
−ＮＨ2の開裂、精製および同定 保護したＡｃｒ１−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）
−ＢＨＡ樹脂の７８．７ｍｇ（乾燥重量）を実施例１
（ｃ）項において記載したように開裂させ、３４．８ｍ
ｇの粗製物を得た。２３．５分における主ピ−ク（１０
％酢酸溶液の代わりに水溶液から注入しても同じ溶出時
刻において溶出）および２８．２分における”ダイマ
−”は、全吸光度のほぼ３５％を占めていた。ほぼ４．
５ｍｇの粗製物を精製すると、９５％以上の純度のＨ−
［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ１．６ｍｇ得ら
れた。この化合物は、”ダイマ−”ピ−クを無くすこと
は出来ず、酢酸水溶液中に放置すると増大した。
【０１２２】（ｈ）合成実験記録２ （１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢ
ｏｃ−脱保護、３ｍｌ、３ｘ１分および１ｘ３０分；
（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分；
（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）によ
る中和、３ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2による洗
浄、３ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−ン；
（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、完全
に乾燥してニンヒドリン定量分析に供する；（６）サイ
クル１から５までおよびサイクる１０から１５までに就
いては、カップリング反応は、１ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶
解した３．２当量の（０．１８ｍｍｏｌ；１００ｍｇ）
ＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを添加し、次いで０．５ｍｌ
のＤＭＦ（最終のペンタフルオロフェノ−ル濃度＾０．
１２Ｍ））を添加することによって実施した；このカッ
プリング反応は、振盪しつつ全体として１２−２４時間
進行させた；サイクル５から１０までは、１．５ｍｌの
ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：２、ｖ／ｖ）中で０．１２Ｍ
ＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨをさらに０．１２ＭＤＣＣでカッ
プリングさせた；（７）ＤＭＦによる洗浄、３ｍｌ、１
ｘ２分；（８）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、３ｍｌ、４ｘ１
分；（９）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）
による中和、３ｍｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ２Ｃｌ２
による洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇの
保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量
試験に供し、さらに２−５ｍｇをよく乾燥してニンヒド
リン定量分析に供してる（サイクル７、１０および１５
の後で、未反応アミノ基を塩化メチレン中でＮ−アセチ
ルイミダゾ−ルによるアセチル化を行いブロックし
た）。
【０１２３】実施例１９ Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2の改善された固相
合成 保護されたＰＮＡをＭＢＨＡ樹脂の上で、前記実施例に
おいて使用したＢＨＡ樹脂のロ−ディングのほぼ半分を
用いて構築した。更には、一つのサイクルを除いて全て
のサイクルは、カップリングしないアミノ基をアセチル
化することによってこれに従った。以下にこの合成法を
詳細に記述する：
【０１２４】（ａ）当初置換度が０．３ｍｍｏｌ／ｇの
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＮＨ−ＣＨ（ｐ−ＣＨ3−
Ｃ6Ｈ4）−Ｃ６Ｈ４樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）の製造 Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の所望の置換
度は０．２５−０．３０ｍｍｏｌ／ｇであった。この数
値を得るために、１．５ｍｍｏｌのＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃ
ＩＺ）を、６０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中にて単一ｉｎ−ｓｉ
ｔｕカップリング（１．５ｍｍｏｌのＤＣＣ）剤を用い
て、中和し、事前に膨潤させたＭＢＨＡ樹脂（定量ニン
ヒドリン反応によって０．６４ｍｍｏｌＮＨ２／ｇを含
有することが測定された）５．０ｇにカップリングさせ
た。この反応は、手動操作式の２２５ｍｌ標準固相反応
容器の中において３時間振盪することによって実施し
た。未反応のアミノ基を無水酢酸．ピリジン／ＣＨ2Ｃ
ｌ2（１：１：２、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物を用いて１８
時間アセチル化してブロックした。中和した樹脂の上で
の定量的ニンヒドリン反応を行ったところ、僅か０．０
００９３ｍｍｏｌ／ｇの遊離アミンが残留すること（第
Ｉ表を参照）、即ち原初のアミノ基の０．１５が残留し
ていることが判った。置換度は、脱保護しニンヒドリン
分析して決定したが、中和したＨ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−
ＭＢＨＡ樹脂について０．３２ｍｍｏｌ／ｇであること
が判った。０．３０ｍｍｏｌＢｏｃ０Ｌｙｓ（ＣＩＺ）
／ｇ樹脂なる定量的カップリングに対する最大値０．２
８ｍｍｏｌ／ｇと充分に比肩できるものである（第ＩＩ
表を参照）。
【０１２５】（ｂ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］3−Ｌｙｓ
（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の段階的構築 （ａ）項で製造したＨ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹
脂の全バッチをそのまま（同じ反応容器中において）用
いて、２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを純ＣＨ
2Ｃｌ2中において用いて単一カップリング（”合成実験
記録３”）によってＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］3−Ｌｙｓ
（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂を構築した。定量的ニンヒド
リン反応を、この合成全体にわたって適用した（第ＩＩ
表を参照）。
【０１２６】（ｃ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ
（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の段階的合成 湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］3−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢ
ＨＡ樹脂ほぼ４．５ｇ（＾０．３６ｍｍｏｌの成長鎖；
（ｂ）項において製造した全部で１９ｇの湿潤樹脂から
取り出した）を、５５ｍｌのＳＰＰＳ反応容器のなかに
入れた。Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−
ＭＢＨＡ樹脂を、ほぼ３０％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中にお
いて２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを用いて単
一カップリング（”合成実験記録４”）で構築した。合
成の進行は、全ての段階において定量的ニンヒドリン反
応によってモニタ−した（第ＩＩ表を参照）。
【０１２７】（ｄ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ
（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の段階的構築 湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］3−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢ
ＨＡ樹脂ほぼ１ｇ（０．０９ｍｍｏｌｏの成長鎖；
（ｃ）項におい手製造した全部で４ｇの湿潤樹脂から取
り出した）を、２０ｍｌのＳＰＰＳ反応容器のなかに入
れた。Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−Ｍ
ＢＨＡ樹脂を、ほぼ３０％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中におい
て２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを用いて前記
した項において使用した単一カップリング合成実験記録
によって構築した。反応容量は３ｍｌであった（激しく
振盪）。合成は、定量的ニンヒドリン反応によってモニ
タ−した（第ＩＩ表を参照）。
【０１２８】
【表ＩＩ】
【０１２９】（ｅ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ
（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の合成 Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ
樹脂の一部を（推定乾燥重量はほぼ４５ｍｇ）脱保護し
た後、この樹脂を３ｍｌの固相反応容器の中において無
水酢酸／ピリジン／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１：１、ｖ／ｖ／
ｖ）の混合液２ｍｌを用いて２時間定量的にアセチル化
した。
【０１３０】（ｆ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ
2の開裂、精製および同定 保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−
ＢＨＡ樹脂の一部を実施例１７ｃにおいて記載したよう
に処理して、７６ｍｇの乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］ 5−Ｌｙ
ｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂すると２４ｍｇの
粗製物が得られた。１５．２分における主ピ−クは（欠
失ペプチドや種々の副生物などの不純物を含む）、全吸
光度のほぼ７８％を占めていた。このピ−クはまた、”
主ピ−クおよび欠失ピ−ク”吸光度のほぼ８８％を占め
ていたが、このことは、第ＩＩ表における個別のカップ
リング収率をまとめて得た全推定カップリング収率とし
ての９０．１％と用く合致している。７．２ｍｇの粗製
物を二つのバッチから半合成用逆相カラムを用いて精製
した（主ピ−クをドライアイス／２−イソプロパノ−ル
で冷却したビ−カ−に集める）。それぞれは、Ｈ2Ｏ１
ｍｌ中に３．６ｍｇを含有していた。凍結した溶液をそ
のまま凍結乾燥して（ｓｐｅｅｄ ｖａｃにおいてアセ
トニトリルを予め除去することなく）８２％純度のＨ−
［Ｔａｅｇ］ 10−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ４．２ｍｇ得ら
れた。
【０１３１】（ｇ）Ａｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−Ｎ
Ｈ2の開裂、精製および同定 保護したＡｃ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−Ｂ
ＨＡ樹脂の４００．０ｍｇ（乾燥重量）を実施例１７ｃ
において記載したように開裂させたが、ＴＦＡ処理を行
うことはせずに、１１．９ｍｇの粗製物を得た。１５．
８分における主ピ−クは、全吸光度のほぼ７５％を占め
ていた。４．８ｍｇの粗製物を精製すると、９５％以上
の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ
３．５ｍｇ得られた。（Ｍ＋Ｈ）+については、計算ｍ
／ｚ値は２８４９．８でありかつ測定ｍ／ｚ値は２８４
８．８であった。
【０１３２】（ｈ）合成実験記録３ （１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢ
ｏｃ−脱保護、３ｍｌ、３ｘ１分および１ｘ３０分；
（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、１００ｍｌ、６ｘ１分；
（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）によ
る中和、１００ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2によ
る洗浄、１００ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−
ン；（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、
完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、置換度
を測定する；（６）３５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した
２．５当量の（３．７５ｍｍｏｌ；２．０６４ｇ）Ｂｏ
ｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを添加（最終ペンタフルオロフェ
ノ−ルの濃度は〜０．１Ｍ）；カップリング反応は、振
盪しつつ合わせて２０−２４時間進行させた；（７）Ｄ
ＭＦによる洗浄、１００ｍｌ、１ｘ２分（ＢｏｃＴａｅ
ｇ−ＯＨの沈殿を除去するため）；（８）ＣＨ2Ｃｌ2に
よる洗浄、１００ｍｌ、４ｘ１分；（９）ＤＩＥＡ／Ｃ
Ｈ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、１００ｍ
ｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、１００
ｍｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂
試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に供し、さ
らに２−５ｍｇをよく乾燥してニンヒドリン定量分析に
供してカップリング度を測定；（１２）無水酢酸／ピリ
ジン／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）の混合液
１００ｍｌを用いて２時間アセチル化を行って未反応ア
ミノ基をブロックする；（１３）ＣＨ2Ｃｌ2による洗
浄、１００ｍｌ、６ｘ１分；（１４）２ ｘ ２−５ｍ
ｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、ＤＩＥＡ／ＣＨ2
Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）で中和し次いでＣＨ2Ｃｌ2
で洗浄してニンヒドリン定性および定量分析に供する。
【０１３３】（ｉ）合成実験記録４ （１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢ
ｏｃ−脱保護、２５ｍｌ、３ｘ１分および１ｘ３０分；
（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２５ｍｌ、６ｘ１分；
（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）によ
る中和、２５ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2による
洗浄、２５ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−ン；
（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、完全
に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、置換度を測
定する；（６）６ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した２．５当
量の（０．９２ｍｍｏｌ；０．５０６ｇ）ＢｏｃＴａｅ
ｇ−ＯＰｆｐを添加ｓｉ，次いで３ｍｌのＤＭＦを添加
（最終ペンタフルオロフェノ−ルの濃度は〜０．１
Ｍ）；カップリング反応は、振盪しつつ合わせて２０−
２４時間進行させた；（７）ＤＭＦによる洗浄、２５ｍ
ｌ、１ｘ２分；（８）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２５ｍ
ｌ、４ｘ１分；（９）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１
９、ｖ／ｖ）による中和、１００ｍｌ、２ｘ２分；（１
０）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２５ｍｌ、６ｘ１分；（１
１）２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、迅速
ニンヒドリン定量試験に供し、さらに２−５ｍｇをよく
乾燥してニンヒドリン定量分析に供してカップリング度
を測定；（１２）無水酢酸／ピリジン／ＣＨ2Ｃｌ
2（１：１：２、ｖ／ｖ／ｖ）の混合液２５ｍｌを用い
て２時間アセチル化を行って未反応アミノ基をブロック
する（最初のサイクルの後は除く）；（１３）ＣＨ2Ｃ
ｌ2による洗浄、１００ｍｌ、６ｘ１分；（１４）２
ｘ ２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、ＤＩ
ＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）で中和し次いで
ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄してニンヒドリン定量分析に供する。
【０１３４】実施例２０ Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ
−ＮＨ2の固相合成
【０１３５】（ａ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ
−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂の
段階的合成 湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］3−Ｃａｅｇ−Ｌｙｓ（ＣＩ
Ｚ）−ＭＢＨＡ樹脂をほぼ２．５ｇ（残留するほぼ１６
ｇの全湿潤樹脂の〜１／６；〜０．７５ｇ乾燥樹脂〜
０．１５ｍｍｏｌの成長鎖）６ｍｌのＳＰＰＳ反応容器
に入れた。Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａ
ｅｇ］4−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂を、ほぼ３
０％のＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2２．５ｍｌの中において通常
の２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを用いて全て
のＴａｅｇ残基を二重カップリングさせて構築した。但
し、最初の残基は単一カップルさせた。Ｃ（Ｚ）ａｅｇ
−残基の導入は、ＴＨＦ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：２、ｖ／
ｖ）中においてＢｏｃＣ（Ｚ）ａｅｇ−ＯＰｆｐの２当
量でカップリングさせて行った。この合成の進行は、定
量的ニンヒドリン反応によって全ての段階でモニタ−し
た（表ＩＩＩ）。
【０１３６】
【表ＩＩＩ】
【０１３７】（ｂ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−
［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定 保護したＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅ
ｇ］4−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の一部を実施例
１の第ｃ項において記載したように処理し、６６．９ｍ
ｇの乾燥したＨ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅ
ｇ］4−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂をＨＦで開裂さ
せて１４．４ｍｇの粗製物を得た。１４．５分における
主ピ−クは、全吸光度のほぼ５０％を占めていた。１０
０ｍｇの粗製物を精製すると（８バッチ；それぞれ１ｍ
ｌのＨ2Ｏに溶解）、９６％の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］5
−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ2がほぼ９．
１ｍｇ得られた。（Ｍ＋Ｈ）＋については、計算ｍ／ｚ
値は２７９３．８でありかつ測定ｍ／ｚ値は２７９０．
６であった。
【０１３８】実施例２１ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−（ｂｏｃアミノエ
チル）グリシン アミノエチルグリシン（５２．８６ｇ；０．４４７ｍｏ
ｌ）を水（９００ｍｌ）に溶解し、ジオキサン（９００
ｍｌ）を加えた。このｐＨを２Ｎ−ＮａＯＨで１１．２
に調節した。ｐＨを１１．２に保持しつつ、三級−ブチ
ル−ｐ−ニトロフェニル炭酸エステル（１２８．４ｇ；
０．５３７ｍｏｌ）をジオキサン（７２０ｍｌ）に溶解
し、２時間かけて滴下した。このｐＨを少なくともさら
に３時間保持し、次いで攪拌しつつ一夜放置した。黄色
の溶液を０℃に冷却し、次いでｐＨを２Ｎ−ＨＣｌで
３．５に調節した。混合物をクロロホルム（４ ｘ １
００ｍｌ）で洗浄し、水相のｐＨを０℃で２Ｎ−ＮａＯ
Ｈで再び９．５に調節した。塩化ベンジルオキシカルボ
ニル（７３．５ｍｌ； ０．５１５ｍｌ）を、ｐＨを２
Ｎ−ＮａＯＨで９．５に保持しつつ半時間かけて添加し
た。このｐＨをこの後４時間頻繁に調節し、この溶液を
攪拌しつつ一夜放置した。翌日、この溶液をエ−テル
（３ ｘ ６００ｍｌ）で洗浄し、そのｐＨを０℃にお
いて２Ｎ−ＨＣｌで１．５に調節した。表題化合物を酢
酸エチル（５ ｘ １０００ｍｌ）で抽出して単離し
た。この酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、
真空において蒸発乾凅した。こうして１３８ｇが得られ
たが、こののもをエ−テル（３００ｍｌ）に溶解し、石
油エ−テル（１８００ｍｌ）を加えて沈殿させた。収
率：１２４．７ｇ（７９％）。ｍ．ｐ．６４．５−８５
℃。Ｃ17Ｈ24Ｎ2Ｏ6の元素分析、測定値（理論値）
Ｃ：５８．４０（５７．９４）；Ｈ：７．０２（６．８
６）；Ｎ：７．９４（７．９５）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５
０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3） ７．３３ ＆ ７．３２（５
Ｈ，Ｐｈ）；５．１５ ＆ ５．１２（２Ｈ，ＰｈＣＨ
2）；４．０３ ＆ ４．０１（２Ｈ．ＮＣＨ2ＣＯ
Ｈ）；３．４６（ｂ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ2ＣＨ2）；
３．２８（ｂ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ2ＣＨ2）；１．４
３ ＆ １．４０（９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。ＨＰＬＣ（２６
０ｎｍ） ２０．７１ｍｉｎ．（８０．２％）および２
１．５７ｍｉｎ．（１９．８％）。ＵＶ−スペクトル
（２００ｎｍ−３００ｎｍ）は同一であり、小さいピ−
クはＢｉｓ−Ｚ−ＡＥＧから成ることが明かとなってい
る。
【０１３９】実施例２２ Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシネチルエ−テル Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ’−（ｂｏｃアミノ
エチル）グリシン（６０．０ｇ；０．１７０ｍｏｌ）お
よびＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（６．００
ｇ）を無水エタノ−ル（５００ｍｌ）に溶解し、０℃に
冷却して、その後にＤＣＣ（４２．２ｇ；０．２０４ｍ
ｏｌ）を添加した。５分後に氷浴を取り除いて、攪拌を
さらに２時間継続した。沈殿したＤＣＵ（乾燥して３
２．５ｇ）をろ過して除去し、エ−テル（３ ｘ １０
０ｍｌ）で洗浄した。濾液を併せて、希硫酸水素ナトリ
ウム液（２ ｘ ４００ｍｌ）、希炭酸水素ナトリウム
液（２ ｘ ４００ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム液
（１ ｘ ４００ｍｌ）で次々に洗浄した。有機相をろ
過し、次いで硫酸マグネシウムで乾燥し、真空において
蒸発乾凅し、その結果ＤＣＵを含有するオイル状物質６
６．１ｇが得られた。この油状物を無水エタノ−ル（６
００ｍｌ）に溶解し、パラジムカ−ボン（６．６ｇ）を
加えた。この溶液を大気圧で水素添加したが、この際保
存容器は２Ｎ−水酸化ナトリウムで満たした。４時間
後、４．２Ｌの理論値に比較して、３．３Ｌが費消され
た。この反応混合物をセライトでろ過し、真空において
蒸発乾凅したところ、油状物質が３９．５ｇ（９４％）
が得られた。この油状物質１３ｇをシリカゲル（６００
ｇ ＳｉＯ2）クロマトグラフィ−で精製した。塩化メ
チレン中２０％の石油エ−テル３００ｍｌで溶出した後
で、表題化合物を塩化メチレン中５％メタノ−ル１７０
０ｍｌで溶出させた。溶媒を満足するべき純度のフラク
ションから真空において揮散させた。収率は８．４９ｇ
であった。その代わりに、粗製物１０ｇをＫｕｇｅｌ
Ｒｏｈｒ蒸留で精製した。１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨ
ｚ、ＣＤ3ＯＤ）４．７７（ｂ，ｓＮＨ）； ４．１８
（ｑ，２Ｈ，ＭｅＣＨ2−）；３．３８（ｓ，２Ｈ，Ｎ
ＣＨ2ＣＯ2Ｅｔ）；３．１６（ｔ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣ
Ｈ2ＣＨ2）；２．６８（ｔ，２Ｈ．ＢｏｃＮＨＣＨ2Ｃ
Ｈ2）；１．４３（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）および１．２６
（ｔ，３Ｈ，ＣＨ3）。13Ｃ−ＮＭＲ１７１．４（Ｃ
ＯＥｔ）；１５６．６（ＣＯ）；７８．３（（ＣＨ3）
Ｃ）；５９．９（ＣＨ2）；４９．０（ＣＨ2）；３９．
０（ＣＨ2）；２６．９（ＣＨ2）および１２．６（ＣＨ
3）。
【０１４０】実施例２３ Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエ−テル メタノ−ルをエタノ−ルの代わりに変えて、上記した方
法を用いた。最終製品は、カラム精製法で精製した。
【０１４１】実施例２４ １−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミンエチルエステル Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエ−テル
（１３．５ｇ；５４．８ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ
（９．８４ｇ；６０．３ｍｍｏｌ）および１−カルボキ
シメチルチミン（１１．１ｇ；６０，３ｍｍｏｌ）をＤ
ＭＦ（２１０ｍｌ）に溶解した。塩化メチレン（２１０
ｍｌ）を次に加えた。この溶液をエタノ−ル／氷浴で０
℃にまで冷却し、ＤＣＣ（１３．６ｇ；６５．８ｍｍｏ
ｌ）を加えた。氷浴を１時間後に取り除き、攪拌をさら
に常温で２時間続行した。沈殿したＤＣＵをろ過して除
き、塩化メチレン（２ ｘ ７５ｍｌ）で二度洗浄し
た。濾液を合わせて、これにさらに塩化メチレン（６５
０ｍｌ）を加えた。この溶液を稀重炭酸ナトリウム液
（３ ｘ ５００ｍｌ）、希硫酸水素ナトリウム液（２
ｘ５００ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム液（１ ｘ
５００ｍｌ）で連続して洗浄した。若干の沈殿をろ過
して有機相から除去し、有機相を硫酸マグネシウムで乾
燥し、真空において蒸発乾凅した。オイル状の残渣を塩
化メチレン（１５０ｍｌ）に溶解し、ろ過し、表題化合
物を０℃において石油エ−テル（３００ｍｌ）を加えて
沈殿させた。この塩化メチレン／石油エ−テルの方法を
もう一度繰り返し、これによって物質１６．０ｇ（７１
％）が得られたが、これは、ＨＰＬＣによって９９％以
上の純度であった。
【０１４２】実施例２５ １−（Ｂｏｃ−ａｅｇ）チミン 上記で得た物質をＴＨＦ（１９４ｍｌ．０．２Ｍ溶液が
得られる）中に溶解し、１Ｍの水酸化リチウム水溶液
（１１６ｍｌ）を加えた。この混合物を常温で４５分間
攪拌し、次いでろ過して残留ＤＣＵを除去した。水（４
０ｍｌ）をこの溶液に加え、次に塩化メチレン（３００
ｍｌ）で洗浄した。さらに追加の水（３０ｍｌ）を加
え、このアルカリ性の溶液をさらにもう一度塩化メチレ
ン（１５０ｍｌ）で洗浄した。この水溶液を０℃にまで
冷却し、ｐＨを１Ｎ−ＨＣｌ（ほぼ１１０ｍｌ）を滴下
して２に調節した。表題化合物を酢酸エチル（９ ｘ
２００ｍｌ）で抽出し、抽出液を併せて、硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、真空中において蒸発乾凅した。残渣をも
う一度メタノ−ルから蒸発させて、一夜乾燥させると、
無色のガラス様の固体が得られた。収率：９．５７ｇ
（６４％）。ＨＰＬＣ＞９８％ ＲT ＝ １４．８ｍ
ｉｎ。元素分析、Ｃ16Ｈ24Ｎ4Ｏ7Ｃ・０．２５Ｈ2Ｏ、
実験値（理論値） Ｃ：４９．２９（４９．４２）
Ｈ：６．５２（６．３５）； Ｎ：１４．１１（１４．
４１）。二級アミド結合の周囲の回転が限定されている
ため、シグナルのいくつかが２：１の比率で二重化した
（リストにおいて大きい方はｍｊでまた小さい方はｍｉ
で示してある）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳ
Ｏ−ｄ6）：１２．７５（ｂ．ｓ，１Ｈ，ＣＯ2Ｈ）；１
１．２８（ｓ，”１Ｈ”，ｍｊ．，ｉｍｉｄｅＮＨ）；
１１．２６（ｂ．ｓ．．１Ｈ，ＣＯ 2Ｈ）；７．３０
（ｓ，”１Ｈ”，ｍｊ．，Ｔ Ｈ−６）；７．２６
（ｓ，”１Ｈ”，ｍｉ．，Ｔ Ｈ−６）；６．９２
（ｂ．ｔ．，”１Ｈ”，ｍｊ．，ＢｏｃＮＨ））；６．
７３（ｂ．ｔ．，”１Ｈ”，ｍｉ．，ＢｃｏＮＨ））；
４．６４（ｓ，”２Ｈ”，ｍｊ．，ＣＨ 2ＣＯＮ）；
４．４６（ｓ，”２Ｈ”，ｍｊ．，ＣＨ 2ＣＯＮ）；
４．１９（ｓ，”２Ｈ”，ｍｉ．，ＣＨ 2ＣＯ2Ｈ）；
３．９７（ｓ，”２Ｈ”，ｍｊ．，ＣＨ 2ＣＯ2Ｈ）；
３．６３−３．０１（分解されないｍ，水を含む，ＣＨ
2ＣＨ 2）；１．７５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ 3）および（ｓ，
９Ｈ，ｔＢｕ）。
【０１４３】実施例２６ Ｎ4−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅ
ｇ）シトシン Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエステル
（５．００ｇ；２０．３ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ
（３．６４ｇ；２２．３ｍｍｏｌ）およびＮ4−ベンジ
ルオキシカルボニル−１−カルボキシメチルシトシン
（６．７７ｇ；２２．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍ
ｌ）に分散させた。塩化メチレン（１００ｍｌ）を次に
加え、この溶液を０℃にまで冷却し、ＤＣＣ（５．０３
ｇ；２４．４ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後に氷浴を
取り除き、攪拌を常温でさらに１時間継続した。この反
応混合物を真空において蒸発乾凅し、残渣をエ−テル
（１００ｍｌ）中に分散させ、３０分間激しく攪拌し
た。固形物をろ過して単離し、エ−テル洗浄処理方法を
二度繰り返した。希重炭酸ナトリウム液（ほぼ４％溶
液、１００ｍｌ）とともに１５分間激しく攪拌し、ろ過
して、水で洗浄した。この方法をもう一度繰り返し、乾
燥後、放置すると淡黄色の固体物質が１７．９ｇ得られ
た。この固体をジオキサン（２００ｍｌ）とともに煮沸
し、熱時ろ過した。冷却後、水（２００ｍｌ）を加え
た。沈殿した物質をろ過して単離し、水で洗浄して、乾
燥した。ＨＰＬＣ（２６０ｎｍにおいて観察）によれ
ば、この物質は、ＤＣＵの他に純度として９９％であっ
た。このエステルをＴＨＦ（１００ｍｌ）中に分散さ
せ、０℃にまで冷却して、１Ｎ−ＬｉＯＨ（６１ｍｌ）
を加えた。１５分間攪拌した後で、混合物をろ過し、濾
液を塩化メチレン（２ ｘ １５０ｍｌ）で洗浄した。
このアルカリ性の溶液を０℃にまで冷却し、ｐＨを１Ｎ
−ＨＣｌで２．０に調節した。表題化合物をろ過して単
離して、水で一度洗浄すると、乾燥後に白色の粉体が１
１．３ｇが得られた。この物質を塩化メチレン（３００
ｍｌ）中に懸濁させ、石油エ−テル（３００ｍｌ）を加
えた。ろ過し、次いで洗浄すると、乾燥後で７．１ｇ
（６９％）が得られた。ＨＰＬＣの結果、ＲＴ＝１９．
５分で純度が９９％でありまた１２．６分において、恐
らくはＺ−で保護されたモノマ−である不純物（ほぼ１
％）があることが判った。元素分析、Ｃ23Ｈ29Ｎ5Ｏ8、
実験値（理論値） Ｃ：５４．１６（５４．８７）
Ｈ：５．７６（５．８１）； Ｎ：１３．６５（１３．
９１）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ6）：１０．７８（ｂ．ｓ，１Ｈ，ＣＯ2Ｈ）；７．８
８（二つのオ−バ−ラップする二重線，”１Ｈ”，Ｃｙ
ｔＨ−５）；７．４１−７．３２（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；
７．０１（二つのオ−バ−ラップする二重線，”１
Ｈ”，ＣｙｔＨ−５）；６．９４ ＆ ６．７８（ｕｎ
ｒｅｓ．三重線、１Ｈ，ＢｏｃＮＨ）；５．１９（ｓ，
２Ｈ，ＰｈＣＨ 2））；４．８１ ＆ ４．６２（ｓ，
２Ｈ，ＣＨ 2ＣＯＮ）；４．１７＆ ３．９８（ｓ，２
Ｈ，ＣＨ 2ＣＯ2Ｈ）；３．４２−３．０３（ｍ，水を含
有，ＣＨ 2ＣＨ 2）および１．３８ ＆ １．３７（ｓ，
９Ｈ，ｔＢｕ）。13Ｃ−ＮＭＲ、１５０．８８；１２
８．５２；１２８．１８；１２７．９６；９３．９０；
６６．５３；４９．５８および２８．２２。ＩＲ：周波
数、ｃｍ−１（強度）。３４２３（２６．４，３０３５
（５３．２）、２９７８（４１．４））、１７３６（１
７．３）、１６５８（３．８）、１５６３（２３．
０）、１５０１（６。８）および１４５６（２６．２）
【０１４４】実施例２７ ９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル アデニン（１０．０ｇ；７４ｍｍｏｌ）および炭酸カリ
ウム（１０．２９ｇ；７４．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦに懸
濁させ、臭化酢酸エチル（８．２４ｍｌ；７４ｍｍｏ
ｌ）を加えた。この懸濁液を室温で窒素雰囲気下で２．
５時間攪拌し、次いでろ過した。固形の残渣をＤＭＦ
（１０ｍｌ）三酸度洗浄した。濾液を併せて、真空にお
いて蒸発乾凅し、黄−オレンジ色の固形物質を水（２０
０ｍｌ）に注ぎ、４Ｎ−ＨＣｌをｐＨ〜６になるように
加えた。０℃で１０分間攪拌した後で、固形物をろ過し
て除き、水で洗浄し、９６％エタノ−ルから再結晶し
た。表題化合物をろ過して単離し、エ−テルでよく洗浄
した．収率：３。４ｇ（２０％）。ｍ．ｐ． ２１５．
−２２０℃。元素分析、Ｃ9Ｈ11Ｎ5Ｏ2、実験値（理論
値） Ｃ：４８．８６（４８．６５） Ｈ：５．０１
（４．９１）； Ｎ：３１．６６（３１．４２）。1Ｈ
−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：（ｓ，２
Ｈ，Ｈ−２ ＆ Ｈ−８）；７．２５（ｂ．ｓ．，２
Ｈ，ＮＨ2）；５．０６（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ2））；４．
１７（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１１Ｈｚ，ＯＣＨ2）および
１．２１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１３Ｈｚ，ＮＣＨ2）。
13Ｃ−ＮＭＲ。１５２．７０、１４１．３０、６１．４
１、４３．９７および１４．０７。ＦＡＢ−ＭＳ．２２
２（ＭＨ＋）。ＩＲ：周波数、ｃｍ−１（強度）。３８
５５（５４．３），３２７４（１０．４）、３２４６
（１４．０））、３１１７（５．３）、２９８９（２
２．３）、２９４０（３３．９）、２８７６（４３．
４），２７５３（４９．０），２３４６（５６．１），
２１０６（５７．１），１８９９（５５．７），１７６
２（１４．２），１７４２（１４．２），１７４２
（１．０），１６７１（１．８），１６４４（１０．
９），１６０６（０．６），１５８２（７．１），１５
２２（４３．８），１４７７（７．２），１４４５（３
５．８）および１４２２（８．６）。アルキル化の位置
は、９６％エタノ−ルから再結晶して得た結晶について
のＸ−線結晶学によって確認した。
【０１４５】実施例２８ Ｎ6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチ
ルアデニンエチルエステル ９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（３．４
０ｇ；１５．４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５０ｍｌ）に
緩やかに加熱して溶解させて、２０ ℃にまで冷却し塩
化メチレン（５０ｍｌ）にＮ−エチルベンジルオキシカ
ルボニルイミダゾ−ルＮ−エチル テトラフルオロ硼酸
エステル（６２ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に氷で冷却し
ながら１５分かけて加えた。若干の沈殿が認められた。
氷浴を取り除いて、溶液を一夜攪拌した。この反応混合
物を飽和重炭酸ナトリウム液（１００ｍｌ）で処理し、
１０分間攪拌した後、二相を分離し、有機相を当量の
水、希流酸水素ナトリウム液（二度）で、および飽和塩
化ナトリウム液で連続して洗浄した。この溶液を硫酸マ
グネシウムで乾燥し、真空において蒸発乾凅したとこ
ろ、油状物１１ｇが得られた。この物質を塩化メチレン
（２５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、石油エ−テル
（５０ｍｌ）で沈殿させた。この方法をもう一度繰り返
して、表題化合物３．４５ｇ（６３％）が得られた。
ｍ．ｐ．１３２−３５℃。元素分析、Ｃ17Ｈ17Ｎ5Ｏ4、
実験値（理論値） Ｃ：５６．９５（５７．４６）
Ｈ：４．７１（４．８２）； Ｎ：１９．３５（１９．
７１）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：
８．７７（ｓ，１Ｈ，Ｈ−２ ＆ Ｈ−８）；７．９９
（ｓ．，１Ｈ，Ｈ−２またはＨ−８）；７．４５−７．
２６（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；５．３１（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ
2））；４．９６（ｓ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ 2）；４．２７
（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，ＣＨ 2ＣＨ2）および
１．３０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，ＣＨ2Ｃ
Ｈ 3）。13Ｃ−ＮＭＲ。１５３．０９；１４３．１１；
６７．８４；６２．５１；４４．２４および１４．０
９。ＦＡＢ−ＭＳ：３５６（ＭＨ＋）および３１２（Ｍ
Ｈ＋−ＣＯ2）。ＩＲ：周波数、ｃｍ−１（強度）。３
４２３（５２．１）；３１８２（５２．８）；３１１５
（５２．４））；３０３１（４７．９）；２９８１（３
８．６）；１７４７（１．１）；１６１７（４．８），
１５８７（８．４）；１５５２（２５．２）；１５１１
（４５．２）；１４９２（３７．９）；１６４５（１
４．０）および１４１３（３７．３）。
【０１４６】実施例２９ Ｎ6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチ
ルアデニン Ｎ6−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチ
ルアデニンエチルエステル（３．２０ｇ；９．０１ｍｍ
ｏｌ）をメタノ−ル（５０ｍｌ）と混合し、０℃に冷却
した。水酸化ナトリウム溶液（５０ｍｌ；２Ｎ）を加え
たところ、この物質が急速に溶解した。０℃において３
０分経過して、このアルカリ性溶液を塩化メチレン（２
ｘ ５０ｍｌ）で洗浄し、０℃において４Ｎ−ＪＣｌ
でｐＨ１．０に調節したところ、表題化合物が沈殿し
た。ろ過し、水で洗浄しかつ乾燥後の収率は、３．０８
ｇ（１０４％）であった。この製品は塩を含有してお
り、元素分析にこのことが反映されていた。元素分析、
Ｃ15Ｈ13Ｎ5Ｏ4、実験値（理論値） Ｃ：４６．３２
（５５．０５） Ｈ：４．２４（４．００）； Ｎ：１
８．１０（２１．４０）およびＣ／Ｎ：２．５７（２．
５６）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ
６）：８．７０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−２ ＆ Ｈ−８）；
７．５０−７．３５（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；５．２７
（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ 2）および５．１５（ｓ，２Ｈ，ｐ
Ｈ−ＣＨ 2）。13Ｃ−ＮＭＲ。１６８．７７；１５２．
５４；１５１．３６；１４８．７５；１４５．１３；１
２８．５１；１２８．１７；１２７．９８；６６．６７
および４４．６７。ＩＲ：周波数、（ＫＢｒ）。３４８
４（１８．３）；３１０９（１５．９）；３０８７（１
５．０））；２９６６（１７．１）；２９２７（１９．
９）；２３８３（５３．８）；１９６０（６２．７），
１７３９（２．５）；１６８８（５．２）；１６５５
（０．９）；１５９４（１１．７）；１５６０（１２．
３）；１５３０（２６．３）；１４９９（３０．５）；
１４７５（１０．４）；１４５５（１４．０）；１４２
９（２４．５）および１４１１（２３．６）。ＦＡＢ−
ＭＳ：３２８（ＭＨ＋）および２８４（ＭＨ＋−Ｃ
Ｏ2）。ＨＰＬＣ（２１５ｎｍ、２６０ｎｍ）、溶媒系
１：１５．１８分、マイナ−な不純物は全てで２％以
下。
【０１４７】実施例３０ Ｎ6−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅ
ｇ）アデニンエチルエステル Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエステル
（２．００ｇ；８．１２ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ
（１．４６ｇ；８．９３ｍｍｏｌ）およびＮ6−ベンジ
ルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニン８
２．９２ｇ；８．９３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）
に溶解した。塩化メチレン（１５ｍｌ）を加え、この溶
液をエタノ−ル／氷浴で０℃にまで冷却した。ＤＣＣ
（２．０１ｇ；９．７４ｍｍｏｌ）を加え、２．５時間
後に氷浴を取り除いて常温で１．５時間攪拌を継続し
た。沈殿したＤＣＵを濾して除去し、ＤＭＦ（１５ｍ
ｌ）で一度、塩化メチレン（２ ｘ １５ｍｌ）で二度
洗浄した。濾液を併せ、これにさらに塩化メチレン（１
００ｍｌ）を添加した。この溶液を希重炭酸ナトリウム
液（２ｘ １００ｍｌ）、希流酸水素カリウム液（２
ｘ １００ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム液（１ Ｘ
１００ ｍｌ）で連続して洗浄した。有機層を真空に
おいて蒸発乾凅し、こうして淡黄色の油状物質３．２８
ｇ（７３％）が得られた。この粗製物のＨＰＬＣの結
果、純度は僅かに６６％に過ぎず、主ピ−クよりも極性
が高いかまたは低い不純物がいくつか含まれていること
が判った。油状物を無視エタノ−ル（５０ｍｌ）に溶解
し、活性炭を加えた。５分間攪拌した後で、溶液をろ過
し、濾液を水（３０ｍｌ）と混合し一夜攪拌しつつ放置
した。翌日、白色の沈殿をろ過して除去して、水で洗浄
し、乾燥したところ、ＨＰＬＣによる純度が９８％以上
である物質１．１６ｇ（２６％）が得られた。母液に水
を加えたところ、純度がほぼ９５％である物質がさらに
０．５３ｇ得られた。元素分析、Ｃ26Ｈ33Ｎ7Ｏ7・Ｈ2
Ｏ、実験値（理論値） Ｃ：５５．０１（５４．４
４）；Ｈ：６．８５（６．１５）およびＮ：１６．４７
（１７．０９）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣ
ｌ3）：８．７４（ｓ，１Ｈ，ＡｄｅＨ−２）；８．１
８（ｂ．ｓ，１Ｈ，ＺＮＨ）；８．１０ ＆ ８．０４
（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８）；７．４６−７．３４（ｍ，５
Ｈ，Ｐｈ）；５．６３（ｕｎｒｅｓ．ｔ，１Ｈ，Ｂｏｃ
ＮＨ）；５．３０（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ2）；５．１６
＆ ５．００（ｓ，２Ｈ，ＣＨ 2ＣＯＮ）；４．２９
＆ ４．０６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ 2ＣＯ2Ｈ）；４．２０
（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ 2ＣＨ３）；３．６７−３．２９
（ｍ，４Ｈ，ＣＨ 2ＣＨ 2）；１．４２（ｓ，９Ｈ，ｔＢ
ｕ）および１．２７（ｔ，３Ｈ，ＯＣＨ 2ＣＨ 3）。スペ
クトルの結果、痕跡量のエタノ−ルおよびＤＣＵの存在
が明となった。
【０１４８】実施例３１ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅ
ｇ）アデニン Ｎ6−ベンジルオキシカルボニル−１−（Ｂｏｃ−ａｅ
ｇ）アデニンエチルエステル（１．４８ｇ；２．６６ｍ
ｍｏｌ）をＴＨＦ（１３ｍｌ）中に懸濁させ、混合物を
０℃に冷却した。水酸化リチウム（８ｍｌ；１Ｎ）を添
加し、１５分間攪拌した後で反応混合物をろ過し、さら
に水（２５ｍｌ）を添加し、この溶液を塩化メチレン
（２ ｘ ２５ｍｌ）で洗浄した。この水溶液のｐＨを
１Ｎ−ＨＣｌでｐＨ２．０に調節した。沈殿をろ過して
単離して、水で洗浄し、乾燥して、０．８２ｇ（５８
％）が得られた。本品を塩化メチレン／石油エ−テルで
二度再度沈殿させ、乾燥後０．７７ｇ（５５％）が得ら
れた。ｍ．ｐ．１１９℃（分解）。元素分析、Ｃ24Ｈ29
Ｎ7Ｏ7・Ｈ2Ｏ、実験値（理論値） Ｃ：５６．３２
（５２．８４） Ｈ：５．７１（５．７３）； Ｎ：１
７．６８（１７．９７）。ＦＡＢ−ＭＳ。５２８．５
（ＭＨ＋）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ6）：１２．７５（ｖｅｒｙ ｂ，１Ｈ，ＣＯ2Ｈ）；
１０．６５（ｂ．ｓ，１Ｈ，ＺＮＨ）；８．５９（ｄ，
１Ｈ，Ｊ＝２．１４Ｈｚ，Ａｄｅ Ｈ−２）；８．３１
（ｓ，１Ｈ，Ａｄｅ Ｈ−８）；７．４９−７．３１
（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．０３＆６．７５（ｕｎｒｅｓ
ｏｌｖ．ｔ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ）；５．３３ ＆ ５．
１６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＮ）；５．２２（ｓ，２
Ｈ，ＰｈＣＨ 2））；４．３４−３．９９（ｓ，２Ｈ，
ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）；３．５４−３．０３（ｍ’ｓ、水を含
有、ＣＨ 2ＣＨ 2）および１．３９ ＆ １．３７（ｓ，
９Ｈ，ｔＢｕ）。13Ｃ−ＮＭＲ。１７０．４；１６６．
６；１５２．３；１５１．５；１４９．５；１４５．
２；１２８．５；１２８．０；１２７．９；６６．３
２；４７．６３；４７．０３；４３．８７および２８．
２４。
【０１４９】実施例３２ ２−アミノ−６−クロロ−９−カルボキシメチルプリン ２−アミノ−６−クロロプリン（５．０２ｇ；２９．６
ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１２．９１ｇ；９３．５ｍ
ｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶かした溶液に、臭化
酢酸（４．７０ｇ；２２．８ｍｍｏｌ）を加えた。この
混合物を２０時間窒素雰囲気下で激しく攪拌し、水（１
５０ｍｌ）を添加し、溶液をセライトを通してろ過した
ところ、透明な黄色溶液が得られた。この溶液を４Ｎ−
塩酸でｐＨ３に酸性化し、沈殿物をろ過し、ｓｉｃａｐ
ｅｎｔ上で真空下で乾燥した。収率８３．０２ｇ；４
４．８％）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：ｄ＝４．
８８ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ）；６．９５（ｓ，２Ｈ）；８．
１０（ｓ，１Ｈ）。
【０１５０】実施例３３ ２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチ
ルプリン ナトリム（２．０ｇ；８７．０ｍｍｏｌ）をベンジルア
ルコ−ル（２０ｍｌ）に溶解し、１３０℃で２時間加熱
した。０℃にまで冷却したあとで、２−アミノ−６−ク
ロロ−９−カルボキシメチルプリン（４．０５ｇ；１
８．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８５ｍｌ）中に溶かした溶
液をゆっくりと添加し、生じた懸濁液を２０℃において
一夜攪拌した。水酸化ナトリウム溶液（１Ｎ、１００
ｍ）を加え、、透明な溶液を酢酸エチル（３ ｘ １０
０ｍｌ）で洗浄した。水相を４Ｎ塩酸でｐＨ３に酸性化
した。沈殿物を酢酸エチル（２００ｍｌ）にとり、水相
を酢酸エチル（２ ｘ １００ｍｌ）で抽出した。有機
層を併せて、飽和塩化ナトリウム液（２ ｘ ７５ｍ
ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で
蒸発乾凅させた。残渣をエタノ−ルから再結晶化させ
た。真空下でのｓｉｃａｐｅｎｔ上での乾燥後の収率：
２，７６ｇ（５２％）。ｍ．ｐ．１５９−６５℃。元素
分析、実験値（理論値） Ｃ：（５６．１８；５５．９
７） Ｈ（４．３８；４．３２）、 Ｎ（２３．４；２
３．１０）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−
ｄ6）：４．８２ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ）；５．５１（ｓ，
２Ｈ）；６．４５（２，２Ｈ）；７．４５（ｍ，５
Ｈ）；７．８２（ｓ，１Ｈ）。
【０１５１】実施例３４ Ｎ−（［２−アミノ−６−ベンジルオキシ−プリン−９
イル］−アセチル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチ
ル）−グリシン［ＢｏｃＧａｅｇ−ＯＨモノマ−］ ２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチ
ルプリン（０．０５０ｇ；１．６７ｍｍｏｌ）、メチル
−Ｎ（２−［第三級−ブトキシカルボニルアミノ］エチ
ル）−グリシンエステル（０．６５ｇ；２．８０ｍｍｏ
ｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５４ｇ；４．
１９ｍｍｏｌ）およびブロモ−トリス−ピロリジノ−ホ
スホニウム−ヘキサフロロホスフェ−ト（ＰｙＢｒｏＰ
(R)）（０．７９８ｇ；１．７１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ
（２ｍｌ）中で４時間攪拌した。透明な溶液を重炭酸ナ
トリウムの氷冷液（３ ｘ ４０ ｍｌ）に注ぎ、酢酸
エチル（３ ｘ ４０ｍｌ）で抽出した。有機相を硫酸
水素カリウム溶液（１Ｎ；２ ｘ ４０ ｍｌ）、重炭
酸ナトリウム溶液（１Ｎ；１ ｘ ４０ｍｌ）および飽
和塩化ナトリウム溶液（６０ｍｌ）で洗浄した。無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、真空下で蒸発したあとで、固形
残渣を酢酸エチル／ヘキサン（２０ｍｌ（２：１））か
ら再結晶化して、収率６３％でメチルエステルを得た
（ＭＳ−ＦＡＢ５１４（Ｍ＋１）。このエステルを濃水
酸化ナトリウム液（１ｍｌ）を含むエタノ−ル／水（３
０ｍｌ（１：２））に溶解することによって加水分解を
行った。２時間攪拌した後で、この溶液をろ過し、４Ｎ
−塩酸を酸化してｐＨ３に酸性化した。表題化合物を、
ろ過して得た。収率：３７０ｍｇ（加水分解に対して７
２％）。ＨＰＬＣによる純度は、９９％以上であった。
二級アミドの回転が制限されていたために、シグナルの
いくつかは、２：１の比率で二重化した（リストにおい
ては、主要ピ−クについてｍｊ．でまた小さいピ−クは
ｍｉ．で表してある）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、
ＤＭＳＯ−ｄ6）：ｄ＝１．４ｐｐｍ．（ｓ，９Ｈ）；
３．２（ｍ，２Ｈ）；３．６（ｍ，２Ｈ）；４．１
（ｓ，ｍｊ．，ＣＯＮＲＣＨ 2ＣＯＯＨ）；４．４
（ｓ，ｍｉ．，ＣＯＮＲＣＨ 2ＣＯＯＨ）；５．０
（ｓ，ｍｊ．，Ｇｕａ−ＣＨ 2ＣＯ−）；５．２（ｓ，
ｍｊ．，Ｇｕａ−ＣＨ 2ＣＯ）；５．６（ｓ，２Ｈ）；
６．５（ｓ，２Ｈ）；６．９（ｍ，ｍｉ．，ＢｏｃＮ
Ｈ）；７．１（ｍ．ｍｊ．，ＢｏｃＮＨ）；７．５
（ｍ．，３Ｈ）；７．８（ｓ，１Ｈ）；１２．８（ｓ，
１Ｈ）。13Ｃ−ＮＭＲ。１７０．９５；１７０．５２；
１６７．２９；１６６．８５；１６０．０３；１５９．
７８；１５５．８４；１５４．８７；１４０．６３；１
３６．７６；１２８．４９；１２８．１０；１１３．０
４；７８．１９；７７．８６；６６．９５；４９．２
２；４７．７０；４６．９４；４５．９６；４３．６
２；４３．３１および２８．２５。
【０１５２】実施例３５ ３−Ｂｏｃ−アミノ−１、２−プロパンジオ−ル ３−アミノ−１、２−プロパンジオ−ル（４０．００
ｇ；０．４４０ｍｏｌ、１、０ｅｑ．）を水（１０００
ｍｌ）に溶解し、０℃にまで冷却した。ジ−三級−ブチ
ル炭酸エステル（１１５．０ｇ、０．５２６ｍｏｌ、
１，２ｅｑ．）を一度に加えた。この反応混合物を攪拌
しつつ水浴上で室温にまで加温した。ｐＨを水（１２０
ｍｌ）に溶かした水酸化ナトリウム（１７．５６ｇ、
０．４４０ｍｏｌ，１．０ｅｑ．）で１０．５に維持し
た。水酸化ナトリウム溶液を添加し終えたとき、反応混
合物を室温で一夜攪拌した。その後、酢酸エチル（７５
０ｍｌ）を反応混合物に加え、次に０℃に冷却した。ｐ
Ｈを激しく攪拌しつつ４Ｎ−硫酸で２．５に調節した。
二つの相を分離し、水相を別の酢酸エチル（６ ｘ ３
５０ｍｌ）で洗浄した。有機相の容量を減圧下で蒸発さ
せて９００ｍｌにまで減少させた。有機相を飽和硫酸水
素カリウム溶液を二倍量に希釈したもの（１ ｘ１００
０ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム溶液（１ ｘ ５０
０ｍｌ）で洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ
４）、減圧下で蒸発させて、表題化合物を５０．１２ｇ
（６０％）を得た。このものは、塩化メチレンから蒸発
させ次いで凍結させて、固化させることが出来た。1Ｈ
−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ）：ｄ＝１．４３（ｓ，
９Ｈ，Ｍｅ3Ｃ）、３．２５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、３．
５７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、３．７３（ｍ，１Ｈ，Ｃ
Ｈ）、13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＭＳ）：ｄ＝２
８．２（Ｍｅ3Ｃ）、４２．６（ＣＨ2）、６３．５、７
１．１（ＣＨ2ＯＨ，ＣＨＯＨ）、７９．５（Ｍｅ
3Ｃ）、１５７（Ｃ＝Ｏ）。
【０１５３】実施例３６ ２−（Ｂｏｃ−アミノ）エチル−Ｌ−アラニンメチルエ
ステル ３−Ｂｏｃ−アミノ−１、２−プロパンジオ−ル（２
０．７６ｇ；０．１０９０ｍｏｌ。１ｅｑ．）を水（１
５０ｍｌ）に溶解した。ｍ−過ヨウ素酸カリウム（２
４．９７ｇ；０．１９０ｍｏｌ、１ｅｑ．）を加え、反
応混合物を窒素雰囲気中で室温で２時間攪拌した。反応
混合物をろ過し、水相をクロロホルム（６ｘ ２５０ｍ
ｌ）で抽出した。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ2）、蒸発
させると無色の油状物としてＢｏｃ−アミノアセトアル
デヒドが殆ど定量的な収率で得られ、このものを精製す
ることなく次の処理法に用いた。パラジウム−カ−ボン
（１０％、０．８ｇ）を窒素雰囲気中で冷却し（０℃）
かつ激しく攪拌しつつＭｅＯＨ（２５０ｍｌ）に加え、
無水酢酸ナトリウム（４．４９ｇ；５４．７ｍｍｏｌ、
２ｅｑ．）およびＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩
（３．８２ｇ；２７．４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を加え
た。Ｂｏｃ−アミノアセトアルデヒド（４．７９ｇ；３
０．１ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）をＭｅＯＨ（１５０ｍ
ｌ）に溶かし、反応混合物に加えた。反応混合物を常
圧、常温で、水素吸収が止むまで水素添加した。反応混
合物をセライトを通してろ過させたが、セライトをさら
にＭｅＯＨで洗浄した。このＭｅＯＨを減圧下で除去
し、残渣を水（１５０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを激しく攪
拌しつつ０．５Ｎ−ＮａＯＨを滴下することによって
８．０に調節した。水相を塩化メチレン（４ ｘ ２５
０ｍｌ）で抽出し、有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ）、セラ
イトでろ過し、減圧下で蒸発させて透明で、若干黄色の
油状物として表題化合物が６．３６ｇ（９４％）得られ
た。ＭＳ（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ（％）＝２４７（１
００，Ｍ＋１，１９１（９０），１４７（１８）。１Ｈ
−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：１．１８
（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ，Ｍｅ）、１．３６（ｓ，
９Ｈ，Ｍｅ3Ｃ）、１．８９（ｂ，１Ｈ，ＮＨ）、２．
５１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ2）、２．６６（ｍ，１Ｈ，Ｃ
Ｈ2）、３．１０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、３．２７（、Ｊ
＝７．０Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、３．６４（ｓ，３Ｈ，Ｏ
Ｍｅ）、５．０６（ｂ，１Ｈ，カルバメ−トＮＨ）。
13Ｃ−ＮＭＲ ｄ＝１８．８（Ｍｅ）、２８．２（Ｍｅ
3Ｃ）、４０．１、４７．０（ＣＨ2）、５１．６（Ｍｅ
Ｏ），５６．０（ＣＨ），１５５．８（カルバメ−トＣ
＝Ｏ）、１７５．８（エステルＣ＝Ｏ）。
【０１５４】実施例３７ Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニルア
セチル）−Ｌ−アラニンメチルエステル Ｂｏｃ−アミノエチル−（Ｌ）−アラニンメチルエステ
ル（１．２３ｇ，５．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍ
ｌ）に溶かした溶液に、Ｄｈｂｔ−ＯＨ（０．／９０
ｇ，５．５２ｍｍｏｌ）および１−チミニル酢酸（１．
０１ｇ，５．４８ｍｍｏｌ）を添加した。１−チミニル
酢酸が溶解した時に、クロロメタン（１０ｍｌ）を加
え、溶液を氷浴で冷却した。この反応混合物が０に達し
た時に、ＤＣＣ（１．２４ｇ，６０１ｍｍｏｌ）を加
え、添加後５分でＤＣＵの沈殿が認められた。二時間後
に、ＴＬＣ分析の結果、反応が完結したのを確認した。
この混合物をろ過し、沈殿をジクロロメタン（１９９ｍ
ｌ）で洗浄した。得た溶液を５％重炭酸ナトリウム（１
５０ｍｌ）で二度、また飽和硫酸水素カリウム液（２５
ｍｌ）を水（１００ｍ）に溶かした液で二度洗浄した。
飽和塩化ナトリウム液で最終的に抽出した後、溶液を硫
酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させると、白色発泡物を
得た。この発泡物を、メタノ−ル傾斜のジクロロメタン
を溶出溶媒として用いてシリカゲルカラムクロマトグラ
フィ−によって精製した。これによって、純品を得た
（ＨＰＬＣで９９％以上）（１．０８ｇ，５２．８
％）。ＦＡＢ−ＭＳ＊４１３（Ｍ＋１）および４３１
（Ｍ＋１＋水）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：４．５
２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ’２）；３．７３（ｓ，３Ｈ，ＯＭ
ｅ）；３．２−３．６（ｍ，４Ｈ，エチルＣＨ
2‘ｓ）、１．９０（ｓ，３Ｈ，ＴにおけるＭｅ）；
１．４９（ｄ，３Ｈ，ＡｌａにおけるＭｅ）；１．４４
（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）。
【０１５５】実施例３８ Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）０Ｎ−（１−チミニルア
セチル）−Ｌ−アラニン 表題化合物のメチルエステル（２．０７ｇ，５．０２ｍ
ｍｏｌ）をメタノ−ル（１００ｍｌ）に溶解し、氷浴で
冷却し、２Ｎ水酸化ナトリウム（１００ｍｌ）を加え
た。１０分間攪拌した後で、混合物のｐＨを４Ｍ−塩化
水素で３に調節した。その後この溶液を酢酸エチル（３
ｘ １００ｍｌ）で抽出し、有機抽出液を併せて、硫
酸マグネシウムで乾燥した。蒸発後、得た発泡物を酢酸
エチル（４００ｍｌ）と数ｍｌのメタノ−ルに溶かし
て、この固形物を溶解した。石油エ−テルを沈殿物が生
成し始めるまで加え、−２０℃で一夜放置した後、沈殿
物をろ過して除いた。こうすることによって、純品を
１．０１ｇ（５０．５％）得た（ＨＰＬＣで９９％以
上）。この化合物を２−プロパノ−ルから再結晶した。
ＦＡＢ−ＭＳ：３９９（Ｍ＋１）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）：１１．３５（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯ）；７．
４２（ｓ，１Ｈ，Ｈ’6）；４．６９（ｓ，２Ｈ，Ｃ
Ｈ’2）；１．８３（ｓ，３Ｈ，ＴにおけるＭｅ）；
１．５０−１．４０（Ｍ、１２Ｈ、Ａｌａ ＋ Ｂｏｃ
におけるＭｅ）。
【０１５６】実施例３９
【０１５７】（ａ）Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ
−（１−チミニルアセチル）−Ｄ−アラニンメチルエス
テル Ｂｏｃ−アミノエチルアラニンメチルエステル（２．４
８ｇ；１０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶か
した溶液にＤｈｈｂｔ−ＯＨ（１．８０ｇ；１１．０ｍ
ｍｏｌ）およびチミニル酢酸（２．１４ｇ；１１．６ｍ
ｍｏｌ）を添加した。１−チミニル酢酸が溶解した後
で、塩化メチレン（２０ｍ）を加え、この溶液を氷浴で
冷却した。反応混合物が０℃に達した時に、ＤＣＣ
（２．８８ｇ；１４．０ｍｍｏｌ）を加えた。添加後５
分でＤＣＵの沈殿が認められた。３５分後に、氷浴を取
り除き、３．５時間後に反応混合物をろ過し、沈殿を塩
化メチレン（２００ｍｌ）で洗浄した。得た溶液を５％
重炭酸ナトリウム液（２００ｍｌ）で二度、また飽和流
酸水素カリウム水溶液（１００ｍｌ）で二度抽出し、飽
和塩化ナトリウム液（２５０ｍｌ）で最終的に抽出した
後で、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させると油状物
を得た。この油状物をメタノ−ル傾斜の塩化メチレンを
溶出溶媒として用いて、短いカラムシリカゲルクロマト
グラフィ−で精製した。こうすることによって、石油エ
−テルで沈殿させた後でＨＰＬＣによる純度が９６％の
化合物が得られた（１．０５ｇ；２５．３％）。ＦＡＢ
−ＭＳ：４１３（Ｍ＋１）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）：５．６４（ｔ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ，Ｊ＝５．８
９Ｈｚ）；４．５６（ｄ，２Ｈ，ＣＨ’2）；４．３５
（ｑ，１，Ｈ，ＡｌａにおけるＣＨ，Ｊ＝７．２５）；
３．７４（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ）；３．６４−３．２７
（ｍ，４Ｈ，エチルのＨ’）；１．９０（ｓ，３Ｈ，Ｔ
におけるＭｅ）；１．５２−１．４４（ｔ，１２Ｈ，Ａ
ｌａにけるＢｏｃ＋Ｍｅ）。
【０１５８】（ｂ）Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ
−（１−チミニルアセチル）−Ｄ−アラニン 表題化合物のメチルエステル（１．５７ｇ，３．８１ｍ
ｍｏｌ）をメタノ−ル（１００ｍｌ）に溶解し、氷浴で
冷却し、水酸化ナトリウム（１００ｍｌ；２Ｍ）を加え
た。１０分間攪拌した後で、混合物のｐＨを４Ｍ−塩化
水素で３に調節した。その後この溶液を酢酸エチル（３
ｘ １００ｍｌ）で抽出し、有機抽出液を併せて、硫
酸マグネシウムで乾燥した。蒸発後、得た油状物を酢酸
エチル（２００ｍｌ）に溶かし、石油エ−テルを沈殿物
が生成し始めるまで加え、−２０℃で一夜放置した後、
沈殿物をろ過して除いた。こうすることによって、表題
化合物を１．０２ｇ（６７．３％）得たが、純度はＨＰ
ＬＣで９９％以上であった。ＦＡＢ−ＭＳ：３９９（Ｍ
＋１）。1Ｈ−ＮＭＲ：１１．３４（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯ
Ｈ）；７．４２（ｓ，１Ｈ，Ｈ’6）；４．６９（ｓ，
２Ｈ，ＣＨ’2）；４．４０（ｑ，１Ｈ，Ａｌａにおけ
るＣＨ、Ｊ＝７。２０Ｈｚ）；１．８３（ｓ，３Ｈ，Ｔ
におけるＭｅ）；１．５２−１．４０（ｍ、１２Ｈ、Ａ
ｌａにおけるＢｏｃ＋Ｍｅ）。
【０１５９】実施例４０ Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノエチル）−Ｎ−
［（１−チミニル）アセチル］グリシンメチルエステル Ｎ（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノプロピル）グリシンメ
チルエステル（２．８４ｇ；０．０１１５ｍｏｌ）をＤ
ＭＦ（３５ｍｌ）に溶解し、その後ＤｈｂｔＯＨ（２．
０７ｇ；０．０１２７ｍｏｌ）と１−チミニル酢酸
（２．３４ｇ；０．０１２７ｍｏｌ）を加えた。塩化メ
チレン（３５ｍｌ）を加えて、混合物を氷浴で０℃に冷
却した。ＤＣＣ（２．８５ｇ；０．０１３８ｍｏｌ）を
加えた後、混合物を２時間０℃で攪拌し、その後室温で
１時間攪拌した。沈殿したＤＣＵをろ過して除去し、塩
化メチレン（２５ｍｌ）で洗浄し、更に追加量の塩化メ
チレン（１５０ｍｌ）を濾液に加えた。有機相を重炭酸
ナトリウム（飽和液を当量の水で希釈、６ ｘ ２５０
ｍｌ）で抽出し、硫酸カリウム（飽和液を４倍量の水で
希釈、３ ｘ ２５０ｍｌ）次いで飽和塩化ナトリウム
で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し真空下で蒸発乾凅
した。固体の残渣を塩化メチレン（３５ｍｌ）に懸濁さ
せて、１時間攪拌した。沈殿したＤＣＵは、ろ過して除
去し、塩化メチレン（２５ｍｌ）で洗浄した。濾液を真
空下で蒸発乾凅して、残渣をシリカゲルカラムクロマト
グラフィ−で、メタノ−ルと塩化メチレン（塩化メチレ
ン中３−７％メタノ−ルの傾斜）の混合物で溶出して精
製した。こうすることによって、表題化合物を白色固体
として得た（３．０５ｇ、６４％）。ｍ．ｐ．７６−７
９℃（分解）。元素分析、Ｃ18Ｈ28Ｎ4Ｏ7、実験値（理
論値） Ｃ：５２．０３（５２．４２） Ｈ：６．９０
（６．８４）； Ｎ：１３．２１（１３．５８）。この
化合物は、満足すべき1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクト
ルを示した。
【０１６０】実施例４１ Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノプロピル）−Ｎ−
［（１−チミニル）アセチル］グリシン Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノプロピル）−Ｎ−
［（１−チミニル）アセチル］グリシンメチルエステル
をメタノ−ル（２５ｍｌ）に溶解し、２Ｍ−水酸化ナト
リウム（２５ｍｌ）と共に１．５時間攪拌した。メタノ
−ルを真空下で蒸発させて除去し、ｐＨを４Ｍ−塩酸で
０℃において２に調節した。本製品をろ過して白色結晶
として単離し、水（３ ｘ １０ｍｌ）で洗浄し、真空
下でｓｉｃａｐｅｎｔで乾燥した。収率：２．１９（７
５％）。元素分析、Ｃ17Ｈ26Ｎ4Ｏ7・Ｈ2Ｏ、実験値
（理論値） Ｃ：４９．９５（４９．０３） Ｈ：６．
４７（６．２９）； Ｎ：１３．４３（１３．４５）。
この化合物は、満足すべき1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲス
ペクトルを示した。
【０１６１】実施例４２ ３−（１−チミニル）−プロパン酸メチルエステル チミン（１４．０ｇ；０．１１ｍｏｌ）をメタノ−ルに
懸濁させ、メタアクリル酸メチル（３９．６ｍｌ；０．
４４ｍｏｌ）を触媒量の水酸化ナトリウムとともに加え
た。この溶液を４５時間暗所で還流させ、真空下におい
て蒸発乾凅させ、残渣を加熱しつつメタノ−ル（８ｍ
ｌ）に溶解させた。氷浴で冷却した後、生成物をエ−テ
ル（２０ｍｌ）を加えて沈殿させ、ろ過して単離し、エ
−テル（２０ｍｌ）で洗浄し、真空下でｓｉｃａｐｅｎ
ｔ上で乾燥させた。収率；１１．２３ｇ（４８％）。
ｍ．ｐ． １１２−１１９℃。元素分析、Ｃ9Ｈ12Ｎ2Ｏ
4、実験値（理論値） Ｃ：５１．１４（５０．９４）
Ｈ：５．７８（５．７０）；Ｎ：１１．５２（１３．
２０）。この化合物は、満足すべき1Ｈ−および13Ｃ−
ＮＭＲスペクトルを示した。
【０１６２】実施例４３ ３−（１−チミニル）−プロパン酸 ３（１−チミニル）−プロパン酸メチル（１．０ｇ；
０．００４７ｍｏｌ）を２Ｍ−水酸化ナトリウム（１５
ｍｌ）に溶解し、１０分間煮沸させた。ｐＨを濃塩酸を
用いて０．３に調節した。この溶液を酢酸エチル（１０
ｘ ２５ｍｌ）で抽出し、有機層を飽和塩化ナトリウ
ム液で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で蒸
発乾凅させると、表題化合物が白色固体として得られた
（０．６６ｇ；７１％）。ｍ．ｐ．１１８−１２１℃。
元素分析、Ｃ8Ｈ10Ｎ2Ｏ4、実験値（理論値） Ｃ：４
８．３８（４８．４９） Ｈ：５．０９（５．０９）；
Ｎ：１３．９８（１４．１４）。この化合物は、満足
すべき1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
【０１６３】実施例４４ Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノエチル）−Ｎ−
［（１−チミニル）プロパノイル］グリシンエチルエス
テル Ｎ（Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル）グリシンエチルエス
テル（１．０ｇ；０．００４１ｍｏｌ）をＤＭＦ（１２
ｍｌ）に溶解し、その後ＤｈｂｔＯＨ（０．７３ｇ；
０．００４５ｍｏｌ）と１−チミニルプロパン酸（０．
８９ｇ；０．００４５ｍｏｌ）を加えた。塩化メチレン
（１２ｍｌ）を加えて、混合物を氷浴で０℃に冷却し
た。ＤＣＣ（１．０１ｇ；０．００４９ｍｏｌ）を加え
た後、混合物を２時間０℃で攪拌し、その後室温で１時
間攪拌した。沈殿したＤＣＵをろ過して除去し、塩化メ
チレン（２５ｍｌ）で洗浄し、更に追加量の塩化メチレ
ン（５０ｍｌ）を濾液に加えた。有機相を重炭酸ナトリ
ウム（飽和液を当量の水で希釈、６ ｘ １００ｍｌ）
で抽出し、硫酸カリウム（飽和液を４倍量の水で希釈、
３ ｘ １００ｍｌ）次いで飽和塩化ナトリウム（１
ｘ １００ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し
真空下で蒸発乾凅した。固体の残渣を塩化メチレン（１
５ｍｌ）に懸濁させて、１時間攪拌した。沈殿したＤＣ
Ｕは、ろ過して除去し、塩化メチレン（２５ｍｌ）で洗
浄した。濾液を真空下で蒸発乾凅して、残渣をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィ−で、メタノ−ルと塩化メチ
レン（塩化メチレン中３−７％メタノ−ルの傾斜）の混
合物で溶出して精製した。こうすることによって、表題
化合物を白色固体として得た（１．０２ｇ、５９％）。
元素分析Ｃ19Ｈ30Ｎ4Ｏ7、実験値（理論値） Ｃ：５
３．１５（５３．５１） Ｈ：６．９０（７．０９）；
Ｎ：１２．７６（１３．１３）。この化合物は、満足
すべき1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
【０１６４】実施例４５ Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノエチル）−Ｎ−
［（１−チミニル）プロパノイル］グリシン Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−３’−アミノエチル）−Ｎ−
［（１−チミニル）プロパノイル］グリシンエチルエス
テル（０．８３ｇ；０．００１９５ｍｏｌ）をメタノ−
ル（２５ｍｌ）に溶解した。水酸化ナトリウム（２５ｍ
ｌ；２Ｍ）を加え、この溶液を１時間攪拌した。メタノ
−ルを真空下で蒸発させて除き、ｐＨを４Ｍ−塩酸で０
℃において２に調節した。本品をろ過して単離し、エ−
テル（３ ｘ１５ｍｌ）で抽出し、真空下でｓｉｃａｐ
ｅｎｔの上で乾燥させた。収率：０．７６９ｇ（９９
％）。ｍ．ｐ．２１３℃（分解）
【０１６５】実施例４６ モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（２） 第三級−ブチル−４−ニトロフェニル炭酸エステル
（１）（１０．０ｇ；０．０４１８ｍｏｌ）をＤＭＦ
（５０ｍｌ）に溶解し溶液を、３０分かけてエチレンジ
アミン（２７．９ｍｌ；０．４１８ｍｏｌ）およびＤＭ
Ｆ（５０ｍｌ）の溶液に加え、一夜攪拌した。この混合
物を真空下で蒸発乾凅させて、得られた油状物を水（２
５０ｍｌ）に溶解した。０℃に冷却した後、ｐＨ を
４Ｍ−塩酸で３．５に調節した。この溶液をろ過し、ク
ロロホルム（３ ｘ ２５０ｍｌ）で抽出した。このｐ
Ｈを２Ｍ−水酸化ナトリウムで０℃において１２に調節
し、水溶液を塩化メチレン（３ ｘ ３００ｍｌ）で抽
出した。飽和塩化ナトリウム水溶液で（２５０ｍｌ）処
理した後で、塩化メチレン溶液を硫酸マグネシウム上で
乾燥し、ろ過して、生じた溶液を真空下で蒸発乾凅し
て、本品（油状物）９４．２２ｇが得られた。1Ｈ−Ｎ
ＭＲ（９０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）：δ１．４４（ｓ，９
Ｈ）；２．８７（ｔ，２Ｈ）；３．１（ｑ，２Ｈ）；
５．６２（ｓ，ｂｒｏａｄ）。
【０１６６】実施例４７ （Ｎ−Ｂｏｃ−３’−アミノエチル）−β−アラニンメ
チルエステル塩酸塩 モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（２）（１６．２８
ｇ；０．１０２ｍｏｌ）をアセトニトリル（４４０ｍ
ｌ）に溶解し、アクリル酸メチル（９１．５０ｍｌ；
１．０２ｍｏｌ）をアセトニトリル（２００ｍｌ）と一
緒にこの混合物に移した。この溶液を暗所で窒素雰囲気
下で一夜還流して、アクリル酸メチルの重合を回避し
た。真空下で蒸発乾凅した後で、水とエ−テルの混合物
（２００ ＋ ２００ｍｌ）を加え、生じた溶液をろ過
して、激しく攪拌した。水相をもう一度エ−テルで抽出
し、次いで凍結乾燥して、黄色の固体を得た。酢酸エチ
ルから再結晶して、表題化合物を１３．０９ｇを得た。
ｍ．ｐ．１３８−１４０℃。元素分析Ｃ11Ｈ23Ｎ2Ｏ4Ｃ
ｌ、実験値（理論値） Ｃ：４６．４９（４６．７２）
Ｈ：８．３８（８．２０）； Ｎ：９．８３（９．９
１）；Ｃｌ：１２．４５（１２．５４）。1Ｈ−ＮＭＲ
（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．３９ｓ，９Ｈ）；２．９
（ｍ．８Ｈ）；３．６４（ｓ，３Ｈ）．
【０１６７】実施例４８ Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］−Ｎ’−Ｂｏｃ−ア
ミノエチル−β−アラニンメチルエステル （Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ−エチル）−β−アラニンメチル
エステル・塩酸塩（３）（２．０ｇ；０．００７１ｍｏ
ｌ））および１−チミニル酢酸ペンタフルオロフェニル
エステル（５）（２．８２８ｇ；０．００８１２ｍｏ
ｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミ
ン（１．１２ｍｌ；０．００８１２ｍｏｌ）を加え、混
合物を一夜攪拌した。塩化メチレン（２００ｍｌ）を添
加後、有機層を重炭酸ナトリウム水溶液（３ ｘ ２５
０ｍｌ）、半飽和流酸水素カリウム水溶液（３ ｘ ２
５０ｍｌ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（２５０ｍｌ）
で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過し、次い
で真空下で蒸発乾凅すると、２．９ｇ（９９％）の収量
で生成物が得られた（油状物）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０
ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3：二級アミドの周囲の回転が制限さ
れるため、信号のいくつかが二重化した。δ１．４３
（ｓ，９Ｈ）；１．８８（ｓ，３Ｈ）；２．６３（ｔ，
１Ｈ）；２．７４（ｔ，１Ｈ）；３．２５−３．５５
（４ｘｔ，８Ｈ）；３．６５（２ｘｔ，２Ｈ）；３．６
６（ｓ，１．５）；３．７２（ｓ，１．５）；４．６１
（ｓ，１Ｈ）；５．７２（ｓ，２Ｈ）；５．５９（ｓ，
０．５Ｈ）；５．９６（ｓ，０．５Ｈ）；７．１１
（ｓ，１Ｈ）；１０．３３（ｓ，１Ｈ）。
【０１６８】実施例４９ Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］−Ｎ’−Ｂｏｃ−ア
ミノエチル−β−アラニン Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］−Ｎ’−Ｂｏｃ−ア
ミノエチル−β−アラニンメチルエステル（３．０ｇ；
０．００７３ｍｏｌ）を２Ｍ−水酸化ナトリウム（３０
ｍｌ）に溶解し、ｐＨを４Ｍ−塩酸で０℃において２に
調節し、溶液を２時間攪拌した。沈殿をろ過して単離
し、冷水で三度洗浄し、真空下においてｓｉｃａｐｅｎ
ｔ上で乾燥した。収率、２．２３ｇ（７７％）。ｍ．
ｐ．１７０−１７６℃。元素分析Ｃ17Ｈ26Ｎ4Ｏ7・Ｈ2
Ｏ、実験値（理論値） Ｃ：４９．４９（４９．０３）
Ｈ：６．３１（６．７８）； Ｎ：１３．８４（１
３．４５）；1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ１．３
８（ｓ，９Ｈ）；１．７６（ｓ，３Ｈ）；２．４４およ
び３．２９（ｍ，８Ｈ）；４．５５（ｓ，２Ｈ）；７．
３（ｓ，１Ｈ）；１１．２３（ｓ，１Ｈ）。ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ：３９９（Ｍ＋１）
【０１６９】実施例５０ Ｎ−［（１−（Ｎ４−Ｚ）−シトシル）アセチル］−
Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−β−アラニンメチルエス
テル （Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ−エチル）−β−アラニンメチル
エステル・塩酸塩（３）（２．０ｇ；０．００７１ｍｏ
ｌ）および１−（Ｎ−４−Ｚ）−シトシル酢酸ペンタフ
ルオロフェニルエステル（５）（３．３１９ｇ；０．０
０７１ｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解した。トリ
エチルアミン（０．９９ｍｌ；０．００７１ｍｏｌ）ｗ
ｏ加え、混合物を一夜攪拌した。塩化メチレン（２０
０，ｌ）を添加した後で、有機層を重炭酸ナトリウム水
溶液（３ ｘ ２５０ｍｌ）、半飽和硫酸水素カリウム
水溶液（３ ｘ ２５０ｍｌ）および飽和塩化ナトリウ
ム水溶液で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過
して、真空下で蒸発乾凅して、３．３６ｇの固体の化合
物が得られたが、このものをメタノ−ルから再結晶し
た。収率：２．４２ｇ（６４％）。ｍ．ｐ．１５８−１
６１℃。元素分析Ｃ25Ｈ 33Ｎ5Ｏ8、実験値（理論値）
Ｃ：５５．１９（５６．４９） Ｈ：６．１９（６．２
６）； Ｎ：１２．８６（１３．１８）。1Ｈ−ＮＭＲ
（２５０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3）：二級アミドの周囲の回
転が制限されるため、信号のいくつかが二重化した；δ
１．４３（ｓ，９Ｈ）；２．５７（ｔ，１Ｈ）；３．６
０−３．２３（ｍ’ｓ，６Ｈ）；３．６０（ｓ，１．５
Ｈ）；３．６６（ｓ，１．５Ｈ）；４．８０（ｓ，１
Ｈ）；４．８８（ｓ，１Ｈ）；５．２０（ｓ，２Ｈ）；
７．８０−７．２５（ｍ’ｓ，７Ｈ）。ＦＡＢ−ＭＳ：
５３２（Ｍ＋１）
【０１７０】実施例５１ Ｎ−［（１−（Ｎ４−Ｚ）−シトシル）アセチル］−
Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−β−アラニン Ｎ−［（１−（Ｎ４−Ｚ）−シトシル）アセチル］−
Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−β−アラニンメチルエス
テル（０．６２１ｇ；０．００１２ｍｏｌ）を２Ｍ−水
酸化ナトリウム（８．５ｍｌ）に溶解して２時間攪拌し
た。その後に、ｐＨを４Ｍ−塩酸で０℃において２に調
節し、この溶液を２時間攪拌した。沈殿をろ過して単離
して、冷水で三度洗浄し、真空下でｓｉｃａｐｅｎｔ上
で乾燥した。収率：０．３２６ｇ（５４％）。この白色
固体を２−プロパノ−ルから再結晶し、石油エ−テルで
洗浄した。ｍ．ｐ．１６３第（分解）。元素分析Ｃ24Ｈ
31Ｎ 5Ｏ8、実験値（理論値） Ｃ：４９．４９（４９．
０３） Ｈ：６．３１（６．７８）； Ｎ：１３．８４
（１３．４５）。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ；ＣＤＣ
ｌ3）：二級アミドの周囲の回転が制限されるため、信
号のいくつかが二重化した；δ１．４０（ｓ，９Ｈ）；
２．５７（ｔ，１Ｈ）；２．６５（ｔ，１Ｈ）；３．６
０−３．３２（ｍ’ｓ，６Ｈ）；４．８５（ｓ，１
Ｈ）；４．９８（ｓ，１Ｈ）；５．２１（ｓ，２Ｈ）；
５．７１（ｓ，１Ｈ，ｂｒｏａｄ）；７．９９−７．２
５（ｍ’ｓ，７Ｈ）。ＦＡＢ−ＭＳ：５１８（Ｍ＋１）
【０１７１】実施例５２ グアニン残基を有するＰＮＡ−オリゴマ−の例
【０１７２】（ａ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］５−［Ｇａｅｇ］
−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ２の固相合成 保護されたＰＮＡを、置換度がほぼ０．１５であるＢｏ
ｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）で修飾したＭＢＨＡ樹脂の上で構
築した（定量的ニンヒドリン反応で測定）。カップルし
ていないアミノ基のキャッピングは、ＢｏｃＢａｅｇ−
ＯＨモノマ−を導入する前に初めて行った。
【０１７３】（ｂ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−［Ｇａｅｇ］
−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ2の段階的合成（合成実
験記録） 合成は、予備膨潤（ＤＣＭ中で一夜）させかつ中和した
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂１０２ｍｇ
（乾燥重量）において開始した。実施した工程は以下の
通りである：（１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／
ｖ）によるＢｏｃ−脱保護、１ｘ２分および１ｘ１／２
時間、３ｍｌ；（２）ＤＣＭによる洗浄、４ｘ２０秒、
３ｍｌ；ＤＭＦによる洗浄、２ｘ２０秒、３ｍｌ；ＤＣ
Ｍによる洗浄、２ｘ２０秒、３ｍｌ、および３０秒間の
ドレ−ン；（３）ＤＩＥＡ／ＤＣＭ（１：１９、ｖ／
ｖ）による中和、２ｘ３分、３ｍｌ；（４）ＤＣＭによ
る洗浄、４ｘ２０秒、３ｍｌおよび１分間のドレ−ン；
（５）４当量のジイソプロピルカルボジイミド（０．０
６ｍｍｏｌ；９．７μｌ）および４当量（０．０６ｍｍ
ｏｌ；２４ｍｇ）のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨまたは（０．
０６ｍｍｏｌ；３０ｍｇ）のＢｏｃＧａｅｇ−ＯＨを
０．６ｍｌのＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ）に溶解
して添加、このカップリング反応は、室温で振盪させな
がら１／２時間進行させた；（６）サクションを２０秒
間適用した；（７）ＤＭＦによる洗浄、２ｘ２０秒及び
１ｘ２分、３ｍｌ；（８）ＤＩＥＡ／ＤＣＭ（１：１
９、ｖ／ｖ）による中和、２ｘ３分、３ｍｌ；（９）Ｄ
ＣＭによる洗浄、４ｘ２０秒、３ｍｌおよび１分間のド
レ−ン；（１０）定性的Ｋａｉｓｅｒ試験；（１１）未
反応アミノ基をＡｃ2Ｏ／ピリジン／ＤＣＭ（１：１：
２、ｖ／ｖ）。１ｘ１／２時間、３ｍｌ；および（１
２）ＤＣＭによる洗浄、４ｘ２０秒、２ｘ２分；２ｘ２
０秒。工程１−１２は、所望の配列が得られるまで繰り
返した。定性的Ｋａｉｓｅｒ試験は全て、マイナスであ
り（わら様の黄色、ビ−ズには一切着色しない）、カッ
プリング収率はほぼ１００％であることを示していた。
ＰＮＡ−オリゴマ−を開裂させ、通常の方法で精製し
た。ＦＡＢ−ＭＳ：２８３２．１１［Ｍ＋１］（計算値
２８３２．１５）。
【０１７４】実施例５３ Ｈ−Ｔａｅｇ−Ａａｅｇ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ−Ｎ
Ｈ２の固相合成
【０１７５】（ａ）Ｂｏｃ−Ｔａｅｇ−Ａ（Ｚ）ａｅｇ
−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡの固相
合成 湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢ
Ｈ樹脂ほぼ０．３ｇを３ｍｌのＳＰＰＳ反応容器に入れ
た。Ｂｏｃ−Ｔａｅｇ−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］
8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂を、２．５ｍｌの
５０％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2中０．１５Ｍ−ＤＣＣと共に
０．１９ＭのＢｏｃ（Ａ）（Ｚ）ａｅｇ−ＯＨを用いた
ｉｎ ｓｉｔｕＤＣＣカップリング（単一）および純Ｃ
Ｈ２Ｃｌ２中において０．１５ＭのＢｏｃＴａｅｇ−Ｏ
Ｐｆｐとの単一カップリングによって組み立て・構築し
た（”合成実験記録５”）。この合成は、定量的ニンヒ
ドリン反応によってモニタ−したが、これによってＡ
（Ｚ）ａｅｇの導入率はほぼ５０％でありまたＴａｅｇ
の導入率はほぼ９６％であることが明らかになった。
【０１７６】（ｂ）Ｈ−Ｔａｅｇ−Ａｅｇ−［Ｔａｅ
ｇ］8−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定 保護されたＢｏｃ−Ｔａｅｇ−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａ
ｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂を実施例４０
ｃにおいて記載したように処理して、乾燥Ｈ−Ｔａｅｇ
−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）
−ＢＨＡ樹脂５３．１ｍｇをＨＦ開裂すると粗製物質が
ほぼ１５．６ｍｇが得られた。１４．４分における主ピ
−クは、全吸光度の５０％以下を占めていた。この粗製
物０．５ｍｇを精製して、Ｈ−Ｔａｅｇ−Ａａｅｇ−
［Ｔａｅｇ］8−Ｌｙｓ−ＮＨ2が０．１ｍｇ得られた。
（ＭＨ＋）＋について、計算ｍ／ｚ値は、２８１６．１
６でありかつ測定ｍ／ｚ値は２８１６．２８。
【０１７７】（ｃ）合成実験記録５ （１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢ
ｏｃ−脱保護、２．５ｍｌ、３ｘ１分および１ｘ３０
分；（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２．５ｍｌ、６ｘ１
分；（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）
による中和、２．５ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2
による洗浄、２．５ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のド
レ−ン；（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出
し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換
度を測定する；（６）１．２５ｍｌのＤＭＦに溶解した
０．４７ｍｍｏｌ（０．２５ｇ）のＢｏｃＴａｅｇ−Ｏ
Ｈを添加し、次いで１．２５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶かし
た０．４７ｍｍｏｌ（１ｇ）のＤＣＣまたは２．５ｍｌ
のＣＨ2Ｃｌ2に溶かした０．３６ｍｍｏｌ（０．２０
ｇ）のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＰｆｐを添加する；カップリ
ング反応は、振盪しつつ全部で２０−２４時間進行させ
た；（７）ＤＭＦによる洗浄、２．５ｍｌ、１ｘ２分；
（８）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２．５ｍｌ、４ｘ１分；
（９）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）によ
る中和、２．５ｍｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ2Ｃｌ2に
よる洗浄、２．５ｍｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇ
の保護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、よく乾燥してニンヒ
ドリン定量分析に供して、カップリング度を測定する；
（１２）未反応アミノ基を無水酢酸／ピリジン／ＣＨ2
Ｃｌ2（１：１：２、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物２５ｍｌ用
いて２時間アセチル化することによってブロックする
（最後のサイクルを除く）；および（１３）ＣＨ２Ｃｌ
２による洗浄、２．５ｍｌ、６ｘ１分；（１４）保護さ
れたＰＮＡ−樹脂の２ｘ２−５ｍｇ試料を取り出し、Ｄ
ＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和
し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄してニンヒドリン分析を行った。
【０１７８】実施例５４ Ｈ−［Ｔａｅｇ］2−Ａａｅｇ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ
−ＮＨ2の固相合成
【０１７９】（ａ）Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］2−Ａ（Ｚ）
ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ
樹脂の段階的合成 湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢ
ＨＡ樹脂ほぼ０．５ｇを５ｍｌのＳＰＰＳ反応容器に入
れた。Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］2−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔ
ａｅｇ］8−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂を、２ｍ
ｌの／ＣＨ2Ｃｌ 2中の当量のＤＣＣと共に０．１５Ｍか
ら０．２０Ｍの保護されたＰＮＡモノマ−（遊離酸）を
用いたＡ（Ｚ）ａｅｇとＴａｅｇ残基とのｉｎ ｓｉｔ
ｕＤＣＣカップリングを行うことによって組み立て・構
築した（”合成実験記録６”）。この合成は、定量的ニ
ンヒドリン反応によってモニタ−したが、これによって
三回のカップリングを行った後でＡ（Ｚ）ａｅｇの導入
率はほぼ８２％であり（一回目のカップリングでは、導
入率はほぼ５０％であった；５０％ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2
中での四回目のＨＯＢｔ仲介カップリングでは、全カッ
プリング収率は有意には増大しなかった）またＴａｅｇ
残基の導入率は定量的であることが明らかになった。
【０１８０】（ｂ）Ｈ−Ｔａｅｇ−Ａｅｇ−［Ｔａｅ
ｇ］2−Ｌｙｓ−ＮＨ2の開裂、精製および同定 保護されたＢｏｃ−［Ｔａｅｇ］2−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−
［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂を実施
例４０ｃにおいて記載したように処理して、乾燥Ｈ−
［Ｔａｅｇ］2−Ａ（Ｚ）ａｅｇ−［Ｔａｅｇ］5−Ｌｙ
ｓ（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂１０２．５ｍｇをＨＦ開裂す
ると粗製物質がほぼ１６．２ｍｇが得られた。この粗製
物の一部を精製した。（ＭＨ＋）+について、計算ｍ／
ｚ値は、２０５０．８５でありかつ測定ｍ／ｚ値は２０
５０．９０であった。
【０１８１】（ｃ）合成実験記録６ （１）ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、ｖ／ｖ）によるＢ
ｏｃ−脱保護，２ｍｌ，３ｘ１分および１ｘ３０分；
（２）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２ｍｌ、６ｘ１分；
（３）ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）によ
る中和、２ｍｌ、３ｘ２分；（４）ＣＨ2Ｃｌ2による洗
浄、２．５ｍｌ、６ｘ１分、および１分間のドレ−ン；
（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り出し、完全
に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換度を測定
する；（６）１．５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した０．４
４ｍｍｏｌ（０．２３ｇ）のＢｏｃＡ（Ｚ）ａｅｇ−Ｏ
Ｈを添加し、次いで０．５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶かした
０．４７ｍｍｏｌ（１ｇ）のＤＣＣまたは１．５ｍｌの
ＣＨ2Ｃｌ2に溶かした０．３３ｍｍｏｌ（０．１３ｇ）
のＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨを添加する；カップリング反応
は、振盪しつつ全部で２０−２４時間進行させた；
（７）ＤＭＦによる洗浄、２ｍｌ、１ｘ２分；（８）Ｃ
Ｈ 2Ｃｌ2による洗浄、２ｍｌ、４ｘ１分；（９）ＤＩＥ
Ａ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１９、ｖ／ｖ）による中和、２ｍ
ｌ、２ｘ２分；（１０）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２ｍ
ｌ、６ｘ１分；（１１）２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試
料を取り出し、よく乾燥してニンヒドリン定量分析に供
して、カップリング度を測定する；（１２）未反応アミ
ノ基を無水酢酸／ピリジン／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１：２、
ｖ／ｖ／ｖ）の混合物２５ｍｌ用いて２時間アセチル化
することによってブロックする（最後のサイクルを除
く）；（１３）ＣＨ2Ｃｌ2による洗浄、２ｍｌ、６ｘ１
分；および（１４）保護されたＰＮＡ−樹脂の２ｘ２−
５ｍｇ試料を取り出し、ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１
９、ｖ／ｖ）による中和し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄してニン
ヒドリン分析を行った。
【０１８２】実施例５５ ”ゼロ塩基”置換の例。
【０１８３】
【化学式ＶＩＩ−１】
【０１８４】
【表ＩＶ】
【０１８５】即ち、Ｈ−Ｔ10−ＬｙｓＮＨ2と比べて、
一つのチミンリガンドをＨで置換すると、Ｔｍが７３℃
から４８℃まで低下することが判る。また単一塩基ミス
マッチを導入する効果も示してある。
【０１８６】ＰＮＡオリゴマ−のいくつかの生化学的／
生物学的性質を、以下の実験によって説明する。
【０１８７】１．ｄｓＤＮＡレベルの配列識別（実施例
６３、第２０図） Ｓ１−ヌクレア−ゼプロ−ビング技法を用いて、プラス
ミドｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ、ＳａｌＩまたはＰＳＴＩ
にクロ−ンした認識配列Ａ10、Ａ5ＧＡ4（Ａ9Ｇ）＆Ａ2
ＧＡ2ＧＡ4（Ａ8Ｇ2）に対するＴ10、Ｔ5ＣＴ4（Ｔ
9Ｃ）＆Ｔ2ＣＴ2ＣＴ 4（Ｔ8Ｃ2）ＰＮＡの結合の識別を
解析した。この結果（第２０図）、三つのＰＮＡは、以
下の相対的な効率でそれぞれの認識配列に結合すること
が判った：ＰＮＡ−Ｔ10：Ａ10＞Ａ9Ｇ≫Ａ8Ｇ2、ＰＮ
Ａ−Ｔ9Ｃ：Ａ9Ｇ＞Ａ10≫Ａ8Ｇ2、ＰＮＡ−Ｔ8Ｃ2：Ａ
8Ｇ2≧Ａ9Ｇ≫Ａ10。即ち、３７℃において、１０につ
き１のミスマッチがあると、効率が減少し（５−１０倍
と推定）、他方では二つのミスマッチは受け入れられな
い。
【０１８８】２．ＰＮＡｓＴ10／Ｔ9Ｃ／Ｔ8Ｃ2のハイ
ブリダイゼ−ションによるｄｓ−ＤＮＡからの単一鎖Ｄ
ＮＡの置換（第２０図）−実施例６３。
【０１８９】３．ＰＮＡ−Ｔ10−ｄｓＤＮＡの鎖置換複
合体形成の速度論（実施例６４、第２１図） 複合体形成は、ＰＮＡと３２Ｐ−ｅｎｄ標識ｄｓＤＮＡ
フラグメントを混合した後異なる時点でＳ１−ヌクレア
−ゼによってプロ−ブした（第２１図）。
【０１９０】４．ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体の安定性 ＰＮＡ−Ｔnと32Ｐ−ＤＳＤＮＡ（Ａ10／Ｔ10）標識と
の複合体を形成させた（６０分、３７℃）。これらの複
合体は、過剰のオリゴ−ｄＡ10の存在下所望の温度にお
いて培養し、室温に冷却しＫＭｎＯ4でプロ−ブした。
その結果（第２２図）、ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体の熱
安定性はＰＮＡオリゴヌクレオチド複合体の熱安定性
を”Ｔｍ”とういう点で反映していることが判る。
【０１９１】５．ＰＮＡによる制限酵素開列の抑制（実
施例６４、第２３図） プラスミド構成、ｐＴ１０は、ｐＵＣ１９中のＢａｍＨ
Ｉ部位にクロ−ンしたｄＡ10／ｄＴ10 ｔｒａｃｔを含
有している。即ち、ＢａｍＨＩおよびＰｖｕＩＩによる
ＰＴ１０の開裂を行うと、２１１と１１１ｂｐなる二つ
の小さいＤＮＡフラグメントが生じる。ＰＮＡ−Ｔ10の
存在下では、３３６ｂｐフラグメントが得られるが、こ
れはＰｖｕＩＩのみに因る開裂に相当する（第２３
図）。即ち、ＢあＭＩＩによる開裂は、制限酵素部位に
近接して結合したＰＮＡによって抑制される。このよう
な結果も、ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体を１００％収率で
形成させることが出来ることを示している。
【０１９２】６．125Ｉ−標識したＰＮＡのオリゴヌク
レチドへの結合（実施例６３、第２４図） Ｔｙｒ−ＰＮＡ−Ｔ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2をＮａ125Ｉおよ
びクロラミン−Ｔを用いて125Ｉで標識し、ＨＰＬＣで
精製した。この125Ｉ−ＰＮＡ−Ｔ10は、ＰＡＧＥおよ
びオ−トラジオグラフィ−によってオリゴ−ｄＡ１０に
結合することが判った。このような結合は、過剰の変成
した子牛胸腺ＤＮＡによって拮抗させることが出来た。
【０１９３】上記（１）項に戻って論じると、ｄｓＤＮ
Ａの配列特異的認識は、１０のチミン置換２−アミノエ
チルグリシル単位から成るＰＮＡ−そのＣ−終末はリシ
ンアミドでありまたＮ−終末は複合９−アミノアクリジ
ンリガンド（９−Ａｃｒ１−（ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−
ＮＨ2、第１１ａおよび１１ｂ図）である−がｄＡ10／
ｄＴ10標的配列に結合することよって説明される。この
標的は、２４８ ｂｐ32Ｐ−ｅｎｄ（末端）−標識ＤＮ
Ａ−フラグメントに含まれる。 １）この９−Ａｃｒ1は（第５図）、照射時のＤＮＡの
開裂を確実にするため４−ニトロベンズアミドを付して
おり、その結合部位に極めて近接してＤＮＡを開裂させ
ることが予期されるに過ぎない。上記２４８ ｂｐ Ｄ
ＮＡフラグメントとともにＰＮＡを照射すると、ｄＡ10
／ｄＴ10配列における選択的開裂が認められる（第３ａ
図）。
【０１９４】２）所謂ホトフットプリンティング検定に
おいて、合成ジアゾ結合アクリジンは紫外線照射下にお
いて、ＤＮＡと相互作用した場合にＤＮＡを開裂させる
（但し、ＤＮＡが前記結合性物質で保護されている場合
は除く）。このような実験は、上記した２４８ｂｐｄｓ
ＤＮＡを用いて行ったが、その結果ＰＮＡ結合部位の光
開裂に対する保護が明らかとなった（第３ｂ図）。
【０１９５】３）様様な種類の実験において、ＤＮＡ−
開裂性酵素であるＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼ
は、矢張り大抵のＤＮＡ−結合性試薬によってその作用
が阻害されるが、Ｔ10−標識における開裂を増大させた
（第３ｃ図）。
【０１９６】４）また別の種類の実験において、一本鎖
チミンリガンドは（二本鎖チミンリガンドとは異なっ
て）過マンガン酸カリウムによる酸化を極めて受け易い
のであるが、この性質を利用した。この試薬の存在下で
２４８ｂｐを酸化したところ、標的のＴ10−鎖の酸化の
みが起こることが判った（第３ｂ図）。
【０１９７】５）同種の証明実験において、Ｓ１ヌクレ
ア−ゼが持つ一本鎖特異性によって、標的のＴ10−鎖の
みが攻撃されたことが判った（第３ｄ図）。
【０１９８】（Ｔａｅｇ）10、（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ
−ＮＨ2およびＡｃｒ1−（ｔａｅｇ） 10−Ｌｙｓ−ＮＨ
2（第５図）が相当するｄＡ10に極めて効率よく結合す
ることは、以下の二つの方法で説明・証明された：
【０１９９】１．以下の実施例５６ におい手示す様
に、ＰＮＡ−オリゴヌクレオチッド複合体は、ポリアク
リルアミドゲル中での電気泳動を行うと一本鎖オリゴヌ
クレオチッドよりも泳動速度が遅いはずである。従っ
て、このような実験は、Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌ
ｙｓ−ＮＨ2および32Ｐ−ｅｎｄで標識したｄＴ10につ
いて行った。この結果、通常のｄＡ10／ｄＴ10二重らせ
んが安定である条件においてはまたこのような二重らせ
んが不安定である（変成性ゲル）条件下においても泳動
が遅延することが判った。対照実験を、Ａｃｒ1−（Ｔ
ａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2と32Ｐ−ｅｎｄで標識した
ｄＴ10との混合物で行ったが、その結果上記した条件下
では全く遅延しないことが判った。
【０２００】２．一本鎖ＤＮＡからＤＮＡ二重らせん
（ｄｓＤＮＡ）を形成させると、吸光度係数は減少する
（淡色効果）。即ち、ＤＮＡの変性は、吸光率の変化を
たとえば、二重らせんの５０％が消失して一本鎖を生じ
る温度であるＴｍを函数として測定することによって追
跡することができる。二重らせんは、一本鎖オリゴデオ
キシリブヌクレオチドと以下に列挙するＰＮＡ類とから
形成した。典型的には、Ｔ−リッチ鎖の０．３ＯＤ260
を１当量の他の鎖と、９０℃において５分間加熱し、次
いで室温にまで冷却することによハイブリダイゼ−ショ
ンさせ、次いで３０分間保持し、最後に５℃の冷蔵庫に
少なくとも３０分間保存した。使用した緩衝液は全て、
りん酸が１０ｍＭかつＥＤＴＡが１ｍＫであった。低塩
緩衝液は塩化ナトリウムを一切含有しておらず、一方中
塩緩衝液は、１４０ｍＭのＮａＣｌを含有しまた高塩緩
衝液は５００ｍＭのＮａＣｌを含有していた。これら緩
衝液の全ては、ｐＨが７．２であった。ハイブリッドの
融点は、Ｇｉｌｆｏｒｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ装置で測定
した。以下に記載する吸光度係数を用いた：通常のオリ
ゴヌクレオチッドおよびＰＮＡの双方とも、Ａ：１５．
４ｍｌ／μｍｏｌ・ｃｍ；Ｔ：８，８；Ｇ：１１．７お
よびＣ：７．３とした。融解曲線を０．５℃／分刻みで
記録した。Ｔｍは、Ａ260と温度との曲線の一次微分係
数も最大値から求めた。
【０２０１】オリゴデオキシリボヌクレオチッドのリス
ト： １．５’−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡ ２．５’−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡＡ−Ａ ３．５’−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ ４．５’−ＡＡＡ−ＡＡＧ−ＡＡＡ−Ａ ５．５’−ＡＡＧ−ＡＡＧ−ＡＡＡ−Ａ ６．５’−ＡＡＡ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−Ａ ７．５’−ＡＡＡ−ＡＧＡ−ＡＧＡ−Ａ ８．５’−ＴＴＴ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−Ｔ ９．５’−ＴＴＴ−ＴＣＴ−ＴＣＴ−Ｔ １０．５’−ＴＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−Ｔ １１．５’−ＴＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＣ−Ｔ １２．５’−ＴＴＣ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−Ｔ １３．５’−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ １４．５’−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡＡ
【０２０２】ＰＮＡ類のリスト ａ．ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ2 ｂ．ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ2 ｃ．ＴＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ2 ｄ．ＴＴＣ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ2 ｅ．Ａｃｒ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−Ｎ
Ｈ2 ｆ．Ａｃ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ
2
【０２０３】
【表Ｖ】
【０２０４】ＲＮＡ−Ａ（ポリｒＡ）とＰＮＡ−Ｔ10−
Ｌｙｓ−ＮＨ2との間のハイブリッドは、測定出来ない
ほどの高温で融解する（＞９０℃）。しかし、特異的な
ハイブリダイゼ−ションは、ＲＮＡ−Ａ−但しＧ、Ｃお
よびＵではない−と混合した時のＡ260が大幅に低下す
ることによって証明される。実験は、ＰＮＡ溶液１ｍｌ
とＲＮＡ溶液１ｍｌ−何れもＡ260＝０．６−とを混合
し、次いで２６０ｎｍにおける吸光度を測定することに
よって行う。その後、試料を９０℃に５分間加熱し、室
温にまで冷却し、この温度に３０分間保持子、最後に５
℃において３０分間保存する。
【０２０５】
【表ＶＩ】
【０２０６】上記の測定値から、以下の結論を下すこと
が出来る。融解曲線が認められるので、塩基スタッキン
グがある。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの方が、通常の
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも安定性が高く、而も
ＰＮＡ−ＲＮＡはさらにこれよりも安定である。ミスマ
ッチによって、誤対合した塩基がＤＮＡ鎖にあるかまた
はＰＮＡ鎖にあるかに拘らず、Ｔｍが大幅に低下する。
このＴｍ値は、通常のオリゴヌクレオチドとは異なりイ
オン強度にわずかしか依存していない。
【０２０７】実施例５６ Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2 のｄＡ10へ
の結合（第１１ａ図） Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ（１００ｎｇ）を２
０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、ｐＨ７．４）中において５０ｃｐｓの５’−［
32Ｐ］−ｅｎｄ−で標識したオリゴヌクレオチッドと一
緒に室温で１５分間培養した。試料を氷で冷却し（１５
分間）、ポリアクリルアミド中でのゲル電気泳動法（Ｐ
ＡＧＥ）で分析した。試料の１０μｌに、２μｌの５０
％のグリセリン、５μｌのＴＢＥ（ＴＢＥ＝９０ｍＭト
リス硼酸塩、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）を加え、試
料を４℃においてＴＢＥ緩衝液中でのＰＡＧＥ（１５％
アクリルアミド、０．５％ビスアクリルアミド）によっ
て分析した。この試料１０μｌを凍結乾燥して、１０μ
ｌの８０％ホルムアミド、１ＴＢＥに再度溶解し、９０
℃に加熱（５分間）し、尿素／ＴＢＥ緩衝液中でのＰＡ
ＧＥ（１５％アクリルアミド、０．５％ビスアクリルア
ミド）によって分析した。［32Ｐ］−含有ＤＮＡバンド
を増幅スクリ−ンおよび−８０℃において２時間露光し
たアグファクリックス（Ａｇｆａ Ｃｕｒｉｘ）ＲＰＩ
Ｘ−線フィルムを用いて、オ−トラジオグラフィ−で可
視化した。
【０２０８】オリゴヌクレオチッドを、γ［32Ｐ］−Ａ
ＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と
ポリヌクレオチドキナ−ゼで標識したＢｉｏｓｅｒａｃ
ｈ７５００ＤＮＡ合成装置で合成し、標準技法を用いて
ＰＡＧＥで精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８
５）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）。第１１ａ図および第１１ｂ図において、
５’−32Ｐで標識したオリゴヌクレオチド１は、５’−
ＧＡＳＴＣＣＡ10Ｇであり、Ａｃｒ−Ｔ10−Ｌｙｓ−Ｎ
Ｈ2の不存在下（レ−ン１および４）または存在下（レ
−ン２および５、２５ｐｍｏｌ；レ−ン３および６、７
５ｐｍｏｌ））で培養し、また５’−ＧＡＴＣＣＴ10Ｇ
である”オリゴ−２”の不存在化（レ−ン１から３ま
で）または存在化（レ−ン４から６まで）で培養した。
５’−32Ｐで標識したオリゴ２は、同じＰＮＡの不存在
下（レ−ン７） または存在下（レ−ン８、２５ｐｍｏ
ｌ；レ−ン９、７５ｐｍｏｌ）で培養し、上記において
詳細に記載したようなＰＡＧＥで分析した。第１１ａ図
に示した結果によれば、ＰＮＡでハイブリダイゼ−ショ
ンしたと同様に（レ−ン１から３まで）ｓｓＤＮＡの遅
延化が明らかであり、ＰＮＡが、標識した相補オリゴヌ
クレオチド（レ−ン４から６まで）に対してＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドと競合・拮抗する能力を有していること
が判る。ｄｓＤＮＡに起因するバンドの強度は、ＰＮＡ
濃度を上げるに応じてより急速に増大し、泳動速度が遅
いＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを表すバンドで置換され
る。レ−ン７から９までは、このＰＮＡは、相補的でな
いＴ10オリゴＤＮＡには影響を及ぼさないことを示す。
第１１ｂ図においては、ＤＮＡ変成条件で行ったもので
あるが、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重らせんが未変成のままであ
る。
【０２０９】実施例５７ 鎖置換複合体の生成 プラスミドＤＮＡに含有されるｄＡ10−ｄＴ10標的配列
を、標準的方法に従い（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８
６）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１株
を用いて二つのオリゴヌクレオチド（ｄ（ＧＡＴＣＣＡ
10Ｇ）＋ｄ（ＧＡＴＣＣＴ10Ｇ）））をｐＵＣ１９のＢ
ａｍＨＩ制限酵素部位にクロ−ンすることによって構成
した。所望のプラスミド（ｐＴ１０と称する）を得られ
たクロ−ンの一つから単離し、アルカリ性抽出法および
ＣｓＣｌ遠心分離法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８６）
によって精製した。ｄＡ10／ｄＴ10標的配列を含む２４
８ｂｐの３’−［32Ｐ］−ｅｎｄ（末端）で標識したＤ
ＮＡフラグメントを、このｐＴ１０ＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで開裂し、次にＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）のＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いてこの開
裂したＤＮＡをα［32Ｐ］−ｄＡＴＰ（４０００Ｃｉ／
ｍｍｏｌ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）で標識し、２４８ｂｐ
ＤＮＡフラグメントをＰＡＥＧ（１５％アクリルアミ
ド、０．５％ビスアクリルアミド、ＴＢＥ緩衝液）によ
って精製して得た。このＤＮＡフラグメントは、Ｅｃｏ
ＲＩで開裂したｐＴ１０プラスミドをバクテリア性アル
カリ性ホスファタ−ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）で処理し、このプラスミドＤＮＡを低融点
アガロ−スでのゲル電気泳動法で精製し、次いでγ［32
Ｐ］ＡＴＰとポリヌクレオチドキナ−ゼで標識すること
によって、５’−ｅｎｄにおける［32Ｐ］標識を付して
得た。ＰｖｕＩＩで処理した後、２４８ｐｂＤＮＡを上
記のように精製した。Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙ
ｓ−ＮＨ2と２４８ｂｐＤＮＡフラグメントとの複合体
を、Ａｃｒ１−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2５０ｎ
ｇを５００ｃｐｓのＰ−標識した２４８ ｂｐフラグメ
ントと０．５μーｇの子牛胸腺ＤＮＡとともに、下記に
おいてさらに詳細に述べるように、１００μｌの２５ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．１ｍＭＣ
ａＣｌ2、ｐＨ７．４中において３７℃において６０分
間培養することによって形成させた。
【０２１０】実施例５８ 以下を用いた鎖置換複合体のプロ−ビング
【０２１１】（ａ）スタフィロコッカスヌクレア−ゼ
（第１２ｂ図レ−ン８から１０）。鎖置換複合体を上記
したように生成させた。この複合体を２０℃において５
分間７５０ Ｕ／ｍｌのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ヌクレア−ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理し、この反応をＥＤ
ＴＡを２５ｍＭまで添加することによって停止させた。
このＤＮＡを２容量のエタノ−ル−２％酢酸カリウム−
で沈殿させ、８０％ホルムアミド、ＴＢＥに再溶解さ
せ、９０℃に加熱し（５分間）、高分解ＰＡＧＥ（１０
％アクリルアミド、０．３％ビスアクリルアミド、７Ｍ
尿素）とオ−トラジオグラフィ−によって分析した。レ
−ン８は、ＰＮＡを含有せず、レ−ン９は４０ｐｍｏｌ
またレ−ン１０は１２０ｐｍｏｌのＰＮＡを含有してい
る。ＰＮＡが含有されているので、フットプリントの生
成が認められ、この結果スタフィロコッカスヌクレア−
ゼによって消化を受け易くなることおよび従ってｄｓＤ
ＮＡからｓｓＤＮＡの置換が増大することが判る。
【０２１２】（ｂ）アフィニティ−光開裂（第１２図＋
第１２ｂ図；何れの場合もレ−ン１から３まで） 複合体をＴＥ緩衝液中で生成させた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ管に入れた試料に３００ｎｍにおいて（Ｐｈｉｌｉｐ
ｓ ＴＬ）２０Ｗ／１２蛍光灯、２４３Ｊｍ-2／ｓ）３
０分間ＵＶ照射した。ＤＮＡは、上記したように沈殿さ
せ、１Ｍピペリジンに取り、９０℃にまで２０分間加熱
した。凍結乾燥した後で、ＤＮＡは、上記したＰＡＧＥ
によって分析した。もう一度、それぞれの場合におい
て、レ−ン１は、ＰＮＡは一切含有せず、レ−ン２およ
び３は、それぞれ４０ｐｍｏｌと１２０ｐｍｏｌのＰＮ
Ａを含有する。ＰＮＡに結合したＤＮＡ鎖（Ａ１０鎖）
は、アクリジンエステルの位置において（第１２ａ図の
レ−ン１から３まで）開裂して、新しいバンドを与える
が、またＰＮＡによって置換された鎖は（Ｔ１０鎖）ラ
ンダムに開裂子、フットプリントを与える。
【０２１３】（ｃ）過マンガン酸カリウム（第１２Ｂ図
レ−ン４から６まで） 複合体を１００μｌのＴＥ中で生成させ、２０ｍＭＫＭ
ｎＯ4を５μｌ添加した。２０℃において１５秒経過
後、１．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１Ｍ２−メ
ルカプトエタノ−ルを添加して反応を停止させた。ＤＮ
Ａを沈殿させ、ピペリジンで処理して、上記した様に分
析した。レ−ン４から６までにおいては、レ−ン１から
３までと同様のＰＮＡ濃度を用いた。かくして再び、過
マンガン酸塩により置換されたｓｓＤＮＡの開裂を示す
フットプリントの生成を認める。
【０２１４】（ｄ）光フットプリンティング（第１２ａ
図レ−ン５から６まで） 複合体を１００μｌＴＥにおいて生成させ、ジアゾ−結
合アクリジン（０．１μｇ／μｌ）（ＤＨＡ、Ｎｉｅｌ
ｓｅｎら（１９８８）、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１６、３８７７−８８）を添加した。試料を３６５ｎｍ
（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＴＬ ２０Ｗ／０９Ｎ、２２Ｊｍ-2
／ｓ）で３０分間照射し、上記した様に処理して、”ア
フィニティ−光開裂”に供した。ＰＮＡの存在下におい
て、（レ−ン６）このＤＮＡは、保護されておりかつ保
護された領域において開裂に相当するバンドは消滅す
る。
【０２１５】（ｅ）Ｓ１−ヌクレア−ゼ（第１２ｃ図レ
−ン１から３） 複合体を５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭＮａｃｌ、
０．５％グリセリン、１ｍＭＺｎＣｌ2、ｐＨ４．５に
おいて生成させ、０．５Ｕ／ｍｌにおいてヌクレア−ゼ
Ｓ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で２
０℃において５分間処理した。反応を停止させ、さらに
上記”スタフィロコッカスヌクレア−ゼ”項において記
載した様に処理した。使用したＰＮＡの量は、ゼロ（レ
−ン１から３まで）または１２０ｐｍｏｌ（レ−ン４か
ら６まで）であり、レ−ン７がサイズの標準を示す。か
くして再び、ＰＮＡで置換されたＴ１０ＤＮＡ鎖の開裂
が認められる。
【０２１６】実施例５９ （１）配向、（２）ｐＨおよび（３）配列ミスマッチに
対するハイブリダイゼ−ションの感度 ＰＮＡオリゴマ−Ｈ−Ｔ4Ｃ2ＴＣＴＣ−ＬｙｓＮＨ2を
合成実験記録６によって製造し、逆相ＨＰＬＣによって
精製し、ＦＡＢ−ｍａｓｓ分光分析法によって同定し
た；実験値（理論値）：２７４６．８（２４４７．１
５）。この配列を用いたハイブリダイゼ−ション実験に
よって、実際のところ非対照であるので、配向の問題が
解決される。このような実験によって、Ｔｍの温度依存
性や生成した複合体の化学量論の問題も解決される。Ｐ
ＮＡ−オリゴマ−Ｈ−Ｔ4Ｃ2ＴＣＴＣ−ＬｙｓＮＨ2を
用いたハイブリダイゼ−ション実験を以下のように行っ
た：
【０２１７】
【表ＶＩＩ】
【０２１８】これらの結果から、真に混合された配列が
明確な輪郭の融解曲線をもたらしたことが明らかとなっ
た。ＰＮＡ−オリゴマ−は実際に両方の配向において結
合することが可能である（第１列と第４列を比較のこ
と）。尤もＮ−末端／５’−配向に対する優先性が認め
られる。ＴまたはＣに対向する単一ミスマッチを導入し
た結果、ｐＨ ７．２において１６℃以上もＴｍが低下
することになった；ｐＨ５．０においては、このＴｍ値
は、２７℃以上も低下した。このことは、極めて高度の
配列選択性があることを示している。
【０２１９】上記したように、Ｔｍ 値には極めて強度
のｐＨ依存性が認められ、Ｈｏｏｇｓｔｅｎの塩基対合
がハイブリッドを形成する上で重要であることを示して
いる。従って、化学量論が２：１であることが判明した
ことは、驚くに当たらない。配列に対称性がないことお
よびミスマッチが存在した場合Ｔｍが極めて大きく低下
することは、相補的ＤＮＡに結合した場合Ｗａｔｓｏｎ
−Ｃｒｉｃｋ鎖およびＨｏｏｇｓｔｅｎ鎖が平行するこ
とを示している。このことは、双方の配向・方向、即ち
５’／Ｎ−末端および３’／Ｎ−末端についても当ては
まるのである。
【０２２０】実施例６０ ハイブリダイゼ−ションにおける配列識別 Ｈ−Ｔ5ＧＴ4−ＬｙｓＮＨ2を用いたデオキシオリゴヌ
クレオチドに対するハイブリダイゼ−ション実験結果を
以下に示す：
【０２２１】
【表ＶＩＩＩ】
【０２２２】第１、３および６列を第２、４、５および
７列を比較すると明らかなように、Ｇは、このような態
様においてＤＮＡ−鎖におけるＣ／ＡとＧ／Ｔとを識別
することが可能であり、即ち配列識別が認められる。第
３列における複合体は更には、ＵＶ−混合曲線から２Ｐ
ＮＡ：１ＤＮＡ複合体であることが決定された。
【０２２３】実施例６１ 修飾された主鎖を用いたハイブリダイゼ−ションにおけ
る配列特異性 延長された主鎖（β−アラニン修飾）を有する単一ユニ
ットのＰＮＡ−オリゴマ−に対するハイブリダイゼ−シ
ョンデ−タは、以下の通りである：
【０２２４】
【表ＩＸ】
【０２２５】融点が低下するにつれて、これらのデ−タ
から、塩基特異的認識が保持されていることが明らかで
ある。
【０２２６】実施例６２ ヨウ素化方法−放射能標識 Ｔｙｒ−ＰＮＡ−Ｔ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2の５μｇを１０
０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ７．０の４０μｌ中に溶
解し、１ｍＣｉのＮａ125Ｉと２μｌのクラミン−Ｔ
（ＣＨ3ＣＮ中５０ｍＭ）を添加する。この溶液を２０
℃に１０分間放置し、次いで０．５＋５ｃｍのセファデ
ックスＧ１０カラムに通す。放射能を含む最初の二つの
フラクション（それぞれ１００μｌ）を集め、ＨＰＬＣ
で精製する：即ち、１％のＣ3ＦＣＯＯＨ水溶液中０−
６０％ＣＨ3ＣＮ勾配を用いた逆相Ｃ−１８である。125
Ｉ−ＰＮＡは、ＰＮＡピ−クの直後に溶出する。溶媒は
減圧下で除去する。
【０２２７】実施例６３ 二本鎖ＤＮＡ標的Ａ10／Ａ9Ｇ／Ａ8Ｇ2に対するＰＮＡ
ｓ−Ｔ10／Ｔ9Ｃ／Ｔ8Ｃ2の結合（第２０図） 表示したプラスミドの二本鎖、32Ｐで標識したＥｃｏＲ
Ｉ−ＰｖｕＩＩフラグメント（ＥｃｏＲＩ部位の３’−
末端で標識した大きいフラグメント）２００ｃｐｓ、キ
ャリア−子牛胸腺ＤＮＡ０．５μｇおよび１００μｌ緩
衝液（２００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、
ｐＨ４．５、１ｍＭＺｎＳＯ4）中の表示したＰＮＡ３
００ｎｇから成る混合物を３７℃において１２０分間培
養した。ヌクレア−ゼＳ１を５０単位を加え、２０℃に
おいて５分間培養した。０．５ＭＥＤＴＡ３μｌを添加
することによって反応を停止させ、エタノ−ル中２％の
酢酸カリウム液２５０μｌを加えることによってＤＮＡ
を沈殿させた。このＤＮＡを１０％ポリアクリルアミド
配列決定ゲルにおける電気泳動法によって分析し、放射
能標識したＤＮＡバンドをオ−トラジオグラフィ−で可
視化した。得られた完全なバンドパタ−ンから、鎖置換
によって一本鎖ＤＮＡが生成していることが明らかとな
っているが、このものは、ヌクレア−ゼによって攻撃さ
れ、より短鎖のオリゴヌルレオチドの混合物が得られ
る。それぞれの場合に使用した三種のＰＮＡについて得
られた結果を比較した結果、得られるそれぞれの標的に
対する選択性があることが明らかとなっている。ｐＵＣ
１９に適当なオリゴヌクレオチドをクロ−ンすることに
よって標的プラスミドを調製した。標的Ａ10：ＢａｍＨ
Ｉ部位（ｐＴ10と称するプラスミド）にクロ−ンしたオ
リゴヌクレオチドＧＡＴＣＣＡ10Ｇ＆ＧＡＴＣＣＴ
10Ｇ。標的Ａ 5ＧＡ4：ＳａｌＩ部位（プラスミドｐＴ９
Ｃ）にクロ−ンしたオリゴヌクレオチドＴＣＧＡＣＴ4
ＣＴ5Ｇ＆ＴＣＧＡＣＡ5ＧＡ4Ｇ。標的Ａ2ＧＡ2ＧＡ4：
ＰｓｔＩ部位（プラスミドｐＴ2Ｃ2）にクロ−ンしたオ
リゴヌクレオチドＧＡ2ＧＡ2ＧＡ4ＴＧＣＡ＆ＧＴ4ＣＴ
2ＣＴ2ＣＴＧＣＡ。ゲル中におけるこれらの標的の位置
は、左方へのバ−によって示される。Ａ／Ｇは、標的Ｐ
１０のＡ＋Ｇ配列ラダ−である。
【０２２８】実施例６４ 制限酵素開裂のＰＮＡによる抑制・阻害（第２３図） プラスミドｐＴＴ１０の２μｇを２０μｌのＴＥ緩衝液
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ
７．４）中のｐＮＡ−Ｔ10の表示量と混合し、３７℃に
おいて１２０分間培養した。２μｌ ｘ濃縮緩衝液（１
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ、Ｍｇ
Ｃｌ2、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ）およびＰｖ
ｕＩＩ（２単位）とＢａｍＨＩ（２単位）を添加し、培
養を６０分間継続した。このＤＮＡを５％ポリアクリル
アミド中でのゲル電気泳動法によって分析し、このＤＮ
Ａを臭化エチジウム染色法によって可視化した。有意比
率のＰＮＡの存在下では（０．２、０．６）、酵素Ｂａ
ｍＨＩの開裂パタ−ンは、変化せず、この酵素は開裂部
位に添ってＰＮＡの存在によって抑制阻害されることが
判る。
【０２２９】実施例６５ ＰＮＡ−Ｔ10−ｄｓＤＮＡ鎖置換複合体形成の速度論
（第２１図） ｐＴ１０の二本鎖、32Ｐで標識したＥｃｏＲＩ−Ｐｖｕ
ＩＩフラグメント（ＥｃｏＲＩ部位の３’−末端で標識
した大きいフラグメント）２００ｃｐｓ、キャリア−子
牛胸腺ＤＮＡ０．５μｇおよび１００μｌ緩衝液（２０
０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．
５、１ｍＭＺｎＳＯ4）中の表示したＰＮＡ−Ｔ10−Ｌ
ｙｓＮＨ2３００ｎｇから成る混合物を３７℃において
１２０分間培養した。表示した時間において、ヌクレア
−ゼＳ１を５０単位を７つの試料のそれぞれに加え、２
０℃において５分間培養した。鎖置換によって生成した
一本鎖ＤＮＡをこのヌクレア−ゼによって消化した。エ
タノ−ル中２％の酢酸カリウム液２５０μｌを加えるこ
とによってＤＮＡを沈殿させ、１０％ポリアクリルアミ
ド配列決定ゲルにおける電気泳動法によって分析した。
鎖置換複合体の量を、標的配列におけるＳ１−開列の強
度をオ−トラジオグラフをデンシトメ−タ−で走査して
測定し、これに基づいて任意の単位で算定した。時間の
経過とともにこの複合体の生成が認められる。
【０２３０】実施例６６ ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体の安定性（第２２） ２００ｃｐｓの32Ｐ−ｐＴ１０フラグメント（実施例６
５ｎｉおけると同様のもの）、子牛胸腺ＤＮＡ０．５μ
ｇおよび３００ｎｇの所望のＰＮＡ（Ｔ10−ＬｙｓＮＨ
2、Ｔ8−ＬＹＳＮＨ2またはＴ6−ＬＹＳＮＨ2）とから
成る混合物を、１００μの２００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、１ｍＭＺｎＳＯ4中３
７℃において６０分間培養した。オリゴヌクレオチドＧ
ＡＴＣＣＡ10Ｇを２μｇを加え、標識オリゴヌクレオチ
ドに対するＰＮＡと拮抗させ、各試料を表示した温度に
おいて１０分間加熱し、氷で１０分間冷却し、次いで２
０℃に加温した。Ｓ１ヌクレア−ゼを５０単位加え、単
一ヌクレオチドとして放出遊離された放射能の量を測定
した。Ｔ10ＤＮＡ二重らせんに対する予期Ｔｍ値は、２
０℃であり、またＴ8については１６℃であり、Ｔ6につ
いては１２℃であった。相当するＰＮＡ／ＤＮＡ値は、
Ｔ10＞７０℃であり、Ｔ8については６０℃であり、ま
たＴ6については３７℃であった。
【０２３１】実施例６７ ＰＮＡの固定化 ＰＮＡ−セファロ−スを製造するために、臭化ジシアン
で活性化したセファロ−ス（Ｓｉｇｍａ）１０ｍｇを１
０μｇのＰＮＡとともに５０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．５において３７℃で６０分間培養した。このセフ
ァロ−スは、遠心分離によって単離し、５０ｍＭりん酸
ナトリウム、ｐＨ７．５の２５０μｌで三回洗浄した。
【０２３２】実施例６８ ＰＮＡ−セファロ−スへの５’−３２Ｐ−末端標識オリ
ゴヌクレオチドの結合 １００μのＴＥ中１ｍｇのＰＮＡ−セファロ−ス（実施
例６７）を32Ｐで標識したオリゴヌクレオチドの５０ｃ
ｐｓ（１００ｎｇ）と共に２０℃において１６時間培養
した。このセファロ−スを遠心分離して単離し、５００
μｌのＴＥで二回洗浄した。結合したオリゴヌルレオチ
ドを、”Ｃｅｒｅｎｋｏｖ”方法を用いて液体シンチレ
−ションカウンティングによって求めた。三種の異なる
ＰＮＡ−セファロ−スと４種のオリゴ−ＤＮＡについ
て、得られた結果を下記の表に示す。 この固定
化したＰＮＡによる捕捉の特異性が明確に求められる
が、なお塩基対ミスマッチは一つだけ許容される。
【０２３３】
【表Ｘ】
【０２３４】この表において、Ａ１０は、５’−ＧＡＴ
ＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧであり、Ａ９Ｇは、５’−
ＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧであり、Ａ８Ｇ２
は、５’−ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＣであり、ま
たｍｉｘは、５’−ＧＡＴＣＡＣＧＣＧＴＡＴＡＣＧＣ
ＧＴある。ＰＮＡ類は、以下の通り：Ｔ１０：Ｈ−Ｔ10
ＬｙｓＮＨ2、Ｔ９Ｃ：Ｈ−Ｔ5ＣＴ4−ＬｙｓＮＨ2、Ｔ
８Ｃ２：Ｈ−Ｔ2ＣＴ2ＣＴ4−ＬｙｓＮＨ2、なし：エタ
ノ−ルアミン。
【０２３５】実施例６９（第２５ａ、ｂおよびｃ図） ＰＮＡ−セファロ−スへの32Ｐ−オリゴヌクレオチドの
結合安定性の温度依存性オリゴヌクレオチド類を実施例
６７および６８において記載したようにｐＮＡ−セファ
ロ−ズに結合した。何れの場合においても、得られたＰ
−オリゴヌクレオチド−ＰＮＡ−セファロ−スを高温で
洗浄し、セファロ−スを遠心分離して単離し、放射能
を”Ｃｅｒｅｎｋｏｖ”カウンティングによって測定
し、セファロ−スを再び５００μｌにとり、以下に記載
する温度において培養し、遠心分離した。この図には、
当初結合に正規化した結果を示す。オリゴヌクレオチド
およびセファロ−スは、実施例６８の表に記載した通り
であった。これら曲線間における変位は、ミスマッチが
一つ生じた場合オリゴヌクレオチド結合安定性が低下し
たことを示す。
【０２３６】実施例７０ ＰＮＡによる転写の抑制・阻害（第２６図） １００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（制限酵素ＰｖｕＩＩ
（以下を参照）で開裂した）と１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の１５μｌ中での１０
０ｎｇのＰＮＡとを３７℃において６０分間培養した。
次いで、４μｌ５ｘ 濃縮緩衝液（０．２ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭＭｇＣｌ2、１０ｍＭ
スペルミジン、１２５ｍＭＮａＣｌ）を１μｌのＮＴＰ
−ｍｉｘ（１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴＰ、１０
ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、０．１μＣｉ／μｌ
３２Ｐ−ＵＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌ ｔＲ
ＮＡ、１μＧ／ｍｌへパリン）および３単位のＲＮＡポ
リメラ−ゼと混合した。培養を３７℃において１０分間
継続した。このＲＮＡを−２０℃において９６％エタノ
−ル中の２％酢酸カリウム液６０μｌを添加して沈殿さ
せ、８％ポリアクリルアミド配列決定ゲルにおける電気
泳動法によって分析した。ＲＮＡ転写物をオ−トラジオ
グラフィ−で可視化した。使用したプラスミドは以下の
通りであった：レ−ン１から５まで；ｐＡ１０ＫＳ（Ａ
１０標的は、転写された鎖の上に位置する）。レ−ン６
から１０まで：ｐＴ１０ＫＳ（Ａ１０標的は、転写され
ていない鎖の上に位置する）。このプラスミドは、実験
に先だって以下の制限酵素で処理した：レ−ン１，４，
６および９：ＰｖｕＩＩ；レ−ン２、５、７および１
０：Ｘｈａ Ｉ；レ−ン３および８：ＢａｍＩＩ。レ−
ン４、５、９および１０の試料は、ＰＮＡを含有してい
たが、その他は、含有していなかった。ＰＮＡＴ10をプ
ラスミドの転写された鎖に結合した場合、ＲＮＡの転写
は、ＰＮＡ結合部位において阻止されることが、ゲルか
ら認めることが出来る。このＰＮＡをプラスミドの転写
されていない鎖に結合すると、転写は阻止されないので
ある。
【０２３７】実施例７１ アフィニティＰＮＡ−セファロ−ス（第２７図） １００μｌのＴＥ中のＰＮＡ−Ｔ10セファロ−ス（実施
例６７を参照）１ｍｇを以下の32Ｐ−５’−末端標識し
たオリゴヌクレオチドの５０ｃｐｓと共に２０℃におい
て１６時間培養した： １：５’−ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＣＡ ＡＡＴ ＣＧＧ
ＣＡＡ ＴＡＣ ＧＧＣＡＴＡ ＡＣＧ ＧＣＴ ＡＡ
Ａ ＣＧＴ ＣＴＴ ＴＡＣ ＧＧＣＴＴＡ
ＴＣＧ ＧＣＴ ＡＴＴ ＣＧＧ ＣＡＴ ＴＴＣ Ｇ
ＧＣＡＡＴ ＴＣＧ、 ２：５’−ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＣＴ ＴＡＡ ＣＧＧ
ＣＡＡ ＴＴＣ ＧＣＴＴＡＴ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＡ
Ｔ ＣＧＧ ＣＴＡ ＡＴＣ ＧＧＣＡＴＴ
ＡＣＧ ＧＣＴ ＴＴＴ ＣＧＧ Ｇ、 ３：５’−ＧＡＣ ＡＡＡ ＣＡＴ ＡＣＡ ＡＴＴ
ＴＣＡ ＡＣＡ ＧＡＡＣＣＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡ
Ａ ＡＡＡ Ａ、 ４：５’−ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＡＣ ＣＴＡ ＧＧＴ
ＴＴＡ ＣＣＧ ＴＧＣＣＡＧ ＴＣＡ ５：５’−ＧＡＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＡＧＣ ＴＧＣ
Ａ このセファロ−スを遠心分離して単離し、ＴＥで三回洗
浄した。オリゴヌクレオチドを次に温度を上げつつ５０
０μｌのＴＥで洗浄して、除去し、１ｍｌのエタノ−
ル、２％酢酸カリウムで沈殿させ、ＴＢＥ緩衝液中２０
％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素ゲルにおける電気泳動
法で分析し、オ−トラジオグラフィ−（−７０℃、１６
時間、増幅スクリ−ン）で検出した。結果を第２６図に
示す。
【０２３８】レ−ン１：セファアデックスに結合してい
ないオリゴヌクレオチド レ−ン２：４０℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチド レ−ン３：６０℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチド レ−ン４：８０℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチド
【０２３９】プラスミド３のみが、このＰＮＡに相補的
である。８０℃までの温度において洗浄すると、相補的
プラスミドのみがＰＮＡ−セファロ−ズ上に保持される
ことが、理解することできる。この実施例によって、Ｐ
ＮＡを用いたアフィニティ捕捉法によって混合物から一
つのオリゴヌクレオチドを抽出出来ることが証明され
る。
【０２４０】実施例７２ ｐＮＡ−鎖置換によるｄｓプラスミド中のＤＮＡ配列に
ついての定量的検定 ５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４の１０μｌ中で以下に示したそれぞれの制限酵素によ
って消化した３μｇのプラスミドＤＮＡを125Ｉ−ＰＮ
Ａ−Ｔ10−Ｔｙｒ５０００ｃｐｍ（１０ｎｇ）と以下に
おいて全ＰＮＡ量として表示した量の冷ＰＮＡＴ10Ｔｙ
ｒと共に３７℃において培養した。ＤＮＡを２５μｌの
エタノ−ル、２％酢酸ナトリウムで沈殿させ、ＴＢＥ緩
衝液中６％ポリアクリルアミドにおける電気泳動法によ
って分析した。このゲルを臭化エチジウムで染色し、そ
の後オ−トラジオグラフィ−に供した（−７０℃、１６
時間、増幅スクリ−ン）。得られた結果を第２８図に示
す。”Ａ”は、エチジウム染色ゲルであり、”ｂ”は、
相当するオ−トラジオグラムである。使用したプラスミ
ドは、以下の通りであった： レ−ン１から３まで：ｐＴ１０ ＋ ＨａｅＩＩＩ レ−ン４から６まで：ｐＴ１０ ＋ Ｈｉｎｆｌ レ−ン７から９まで：ｐＴ１０ ＋ ＰｖｕＩＩ。 それぞれの試料中のＰＮＡ−Ｔ10−Ｔｙｒの全量は、以
下の通りであった： レ−ン１、４および７： １０ｎｇ； レ−ン２、５および８： ２５ｎｇ； レ−ン３、６および９： ２５０ｎｇ； 臭化エチジウムゲル（ａ）は、生成したＤＮＡフラグメ
ント（ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドを含む）の大きさを
示す。オ−トラジオグラフ（ｂ）は、ゲル（ａ）中の何
れのバンドがＰＮＡを含有しているかを示す。鎖置換複
合体の存在は、レ−ン１において認めることが出来る
が、レ−ン２および３において冷ＰＮＡの比率を増大さ
せることによってこのバンドの強度に及ぼす影響を認め
ることが出来る。同様の結果がレ−ン４から６までおよ
びレ−ン７から９までにおいて他の二つのプラスミドの
それぞれについて認められる。それぞれの場合における
ＰＮＡ−ＤＮＡバンドの位置は、プラスミドを同定する
ために用いられ、またその強度は、存在するプラスミド
の量を定量化するために用いることが出来る。当業者
は、本発明の好ましい実施態様について多くの変更およ
び修正を行い得ることおよびかかる変更および修正は、
本発明の精神から逸脱することなく行い得ることを理解
するであろう。従って、添付する請求の範囲は、本発明
の真の精神および範囲に含まれる全ての等価の変更を包
含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】天然のデオキシリボヌクレオチド（Ａ）および
本発明のペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｂ）を示す。
【図２】ＤＮＡ認識のための天然および非天然の核酸塩
基およびリポ−タ−基を示す。
【図３】以下の概略図を示したものである：すなわち、
（ａ）Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2（Ａｃ
ｒＴ10Ｌｙｓ−ＮＨ2）による光開裂；Ａｃｒ 1−（Ｔａ
ｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2のジアゾ−結合アクリジンに
よるフォトフットプリントおよび好ましいＫＭｎＯ4−
開裂；および（ｃ）Ｓ1−ヌクレア−ゼで増進せしめら
れた開裂と（ｄ）Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−
ＮＨ2結合部位のミクロコッカスヌクレア−ゼによる開
裂。
【図４】ＰＮＡモノマ−シントンのいくつかの例を示
す。
【図５】Ａｃｒ1リガンドおよび一つのＰＮＡであるＡ
ｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2を示す。
【図６】モノマ−シントンを調製する一般的な概略図で
ある。
【図７】Ａｃｒ1リガンドを調製する一般的概略図であ
る。
【図８】線状の未保護ＰＮＡアミドの調製を図示する固
相ＰＮＡ合成の一般的概略図である。
【図９】以下の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示すもの
である：（Ａ）ＨＦ−開列後の粗製Ｈ−［Ｔａｅｇ］15
−Ｌｙｓ−ＮＨ2（凍結乾燥前）；（Ｂ）ＨＦ開裂後の
粗製Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ−ＮＨ2（凍結乾
燥前）；および（Ｃ）精製Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−
Ｌｙｓ−ＮＨ2・緩衝液Ａ、５％ＣＨ3ＣＮ／９５％ Ｈ
2Ｏ／０．０４４５％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ、６０％ＣＨ3Ｃ
Ｎ／４０％Ｈ2Ｏ／０．０３９０％ＴＦＡ；直線勾配、
３０分でＢが０−１００％；流量、 １．２ｍｌ／分；
カラム、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ （５μｍ、０．４６ ｘ
２５ｃｍ）。
【図１０】以下の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す：
すなわち、（Ａ）精製Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−Ｎ
Ｈ2および（Ｂ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａ
ｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ2−第９図におけると同一条件を
使用。
【図１１】第１１ａ図および第１１ｂ図は、ＡｃｒＴ10
−ＬｙｓのｄＡ10・５’−32Ｐで標識したオリゴヌクレ
オチドへの結合を示す；（１）（５’−ＧＡＴＣＣＡ10
Ｇ）をＡｃｒＴ10−Ｌｙｓの存在下または不存在下およ
びオリゴヌクレオチドの存在下または不存在下で培養し
た。（２）（５’−ＧＡＴＣＣＡ10Ｇ）および試料を”
自然の条件”下（第１１ａ図）または”変性条件”下
（第１１ｂ図）でポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分
析した。
【図１２】第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10
−Ｌｙｓ−ＮＨ2錯体についての化学的、光化学的およ
び酵素的プロ−ビングを示す。ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10
−Ｌｙｓ−ＮＨ2とｄＡ10／ｄＴ10標識配列を含む32Ｐ
−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、ア
フィニティ−光開裂（第１２ａ図、レ−ン１−３；第１
２ｂ図、レ−ン１−３）、過マンガン酸塩プロ−ビング
（第１２ｂ図、レ−ン４−６）またはＳｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼによるプロ−ビング（第１２
ｂ図、レ−ン８−１０）もしくはヌクレア−ゼＳ１によ
るプロ−ビング（第１２ｃ図）によってプロ−ブした。
Ａ鎖（第１２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ
図）をプロ−ブした。
【図１３】保護ＰＮＡシントンを合成する手法を示す。
【図１４】保護アデニンモノマ−シントンを合成する手
法を示す。
【図１５】保護グアニンモノマ−シントンを合成する手
法を示す。
【図１６】ＰＮＡ主鎖改変のいくつかの例を示す。
【図１７】通常のアミノ酸に相当する側鎖を有するチミ
ンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
【図１８】第１８ａ図および第１８図ｂはそれぞれ、チ
ミンモノマ−シントンのアミノプロピル類縁体およびプ
ロピオニル類縁体を合成する手法を示す。
【図１９】チミンモノマ−シントンのアミノエチル−β
−アラニン類縁体を合成する手法を示す。
【図２０】ＰＮＡｓ−Ｔ10、−Ｔ9Ｃおよび−Ｔ8Ｃ
2が、高い配列特異性をもって二本鎖ＤＮＡに結合する
ことを実証するＰＡＧＥラジオオ−トグラフを示す。
【図２１】Ａ10／Ｔ10二本鎖ＤＮＡ標的に結合した長さ
の異なるＰＮＡ類の熱安定性を示すＰＡＧＥオ−トラジ
オグラフのデンシトメ−タ−走査に基づくグラフであ
る。
【図２２】Ａ１０／Ｔ１０二重鎖ＤＮＡ標的に結合させ
た、長さの異なるＰＮＡの熱安定性を示す、ＰＡＧＥオ
ートラジオグラフのデンシトメトリ走査に基くグラフで
ある。
【図２３】ＤＮＡに対する制限酵素活性が、ＰＮＡを制
限酵素認識部位の近位に結合させた場合抑制されること
を実証する電気泳動ゲル染色を示す。
【図２４】125Ｉで標識したＰＮＡ−Ｔ10が相補的ｄＡ
10オリゴヌクレオチドに結合することを実証するＰＡＧ
Ｅオ−トラジオグラフを示す。
【図２５】第２５ａ図から第２５ｃ図は、固定化したＰ
ＮＡとマッチするまたは塩基一つがミスマッチしたオリ
ゴ−ＤＮＡ類との間で異なる温度において実現される結
合の百分率を示す。
【図２６】第２６図は、転写された鎖へのＴ10によるＲ
ＮＡポリメラ−ゼ転写抑制を示すオ−トラジオグラフで
ある。
【図２７】標識化プラスミドｄｓＤＮＡ類の一つに相補
的である固定化されたＤＮＡに捕捉されかつ異なる温度
において洗浄された標識化プラスミドｄｓＤＮＡ類の混
合物のオ−トラジオグラフである。
【図２８】第２８図は、ＰＮＡによる鎖置換を用いたプ
ラスミドｄｓＤＮＡの定量を実証する臭化エチジウムゲ
ルとそのオ−トラジオグラフとを組合せたものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 503001850 ニールセン、ピーター・アイギル デンマーク国、2980 コッケダール、ヒョ ルテベンゲト 509番 (71)出願人 503003784 ベルク、ロルフ・ヘンリク デンマーク国、2000 フレデリクスベル ク、 ランゲランドスベイ 20番ベー、３ テーハー (72)発明者 ブカルト、オーレ デンマーク国、3500 フェルレーセ、セン ダーガルドスベイ 73番 (72)発明者 エグホルム、ミカエル デンマーク国、2000 フレデリクスベル ク、シントシュビレベイ ５番、３ テー ベー (72)発明者 ニールセン、ピーター・アイギル デンマーク国、2980 コッケダール、ヒョ ルテベンゲト 509番 (72)発明者 ベルク、ロルフ・ヘンリク デンマーク国、2000 フレデリクスベル ク、 ランゲランドスベイ 20番ベー、３ テーハー Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 HA13 HA14 HA19 4B063 QA01 QA11 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR33 QR42 QR56 QR58 QR64 QR82 QS03 QS17 QS25 QS34 QS36 QX02 QX07

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリアミド主鎖上において４乃至８つの
    介在原子でそれぞれ分離されたアザ原子上にリガンドと
    して天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基または核酸塩基
    結合基を結合して有する、下記一般式を有するペプチド
    核酸（ＰＮＡ）であって、一つまたはそれ以上の化学的
    または微生物学的個体単位についてその捕捉、認識、検
    出、同定または定量化を行うために使用される核酸類縁
    体： 【化学式Ｉ】 但し上式において：ｎは、少なくとも２である;Ｌ1−Ｌ
    nのそれぞれは独立して、水素、ヒドロキシ、（Ｃ1−Ｃ
    4）アルカノイル、天然の核酸塩基類、非天然の核酸塩
    基類、芳香族原子残基、ＤＮＡ挿入基、核酸塩基結合基
    およびリポ−タリガンドから構成される群から選択され
    るが、Ｌ 1−Ｌnの内の少なくとも一つは、天然の核酸塩
    基、非天然の核酸塩基、ＤＮＡ挿入基または核酸塩基結
    合基である；Ａ1−Ａnのそれぞれは、一重結合、メチレ
    ン基または下記式で表される基である： 【化学式ＩＩａ】 又は 【化学式ＩＩｂ】 但し本式において；Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ3、ＣＨ2
    またはＣ（ＣＨ3）2である；Ｙは、一重結合、Ｏ、Ｓま
    たはＮＲ4である；ｐおよびｑのそれぞれは、１から５
    までの整数であり、ｐ＋ｑの和は、１０以下である；ｒ
    およびｓのそれぞれは、ゼロまたは１から５までの整数
    であり、ｒ＋ｓの和は、１０以下である；Ｒ1およびＲ2
    はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコ
    キシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ
    1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル
    チオ、アミノおよびハロゲンから構成される群から選択
    される；またＲ3およびＲ4のそれぞれは独立して、水
    素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシもしくはアルコ
    キシもしくはアルキルチオで置換された（Ｃ1−Ｃ4）ア
    ルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよび
    アミノから構成される群から選択される；Ｂ1−Ｂnのそ
    れぞれは、ＮまたはＲ3Ｎ+であり、ここにおいてＲ3は
    上記において定義された通りである；Ｃ1−Ｃnのそれぞ
    れは、ＣＲ6Ｒ7、ＣＨＲ6ＣＨＲ7またはＣＲ6Ｒ7ＣＨ2
    であり、ここにおいてＲ6は、水素でありまたＲ7は、天
    然のアルファアミノ酸の側鎖から構成される群から選択
    され、またはＲ6およびＲ7は独立して、水素、（Ｃ2−
    Ｃ6）アルキル、アリ−ル、アラルキル、ヘテロアリ−
    ル、ヒドロキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−
    Ｃ6）アルキルチオ、ＮＲ3Ｒ4およびＳＲ5から構成され
    る群から選択されるが、ここにおいてＲ3およびＲ4は、
    上記において定義された通りであり、Ｒ5は、水素、
    （Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシ
    もしくはアルキルチオで置換された（Ｃ1−Ｃ6）アルキ
    ルであり、またはＲ6およびＲ7とは一緒になって、脂環
    系または異項環系を形成する；Ｄ1−Ｄnのそれぞれは、
    ＣＲ6Ｒ7、ＣＨ2ＣＲ6Ｒ7またはＣＨＲ6ＣＨＲ7であ
    り、ここにおいてＲ6およびＲ7は、上記において定義さ
    れた通りである；Ｇ1−Ｇn-1のそれぞれは、いずれかの
    方向での−ＣＯＮＲ3−、ＣＳＮＲ3−、−ＳＯＮＲ3−
    または−ＳＯ2ＮＲ3−であって、なおここにおいてＲ3
    は、上記において定義した通りである；Ｑは、−ＣＯ2
    Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ"、−ＳＯ3Ｈもしくは−ＳＯ2ＮＲ'
    Ｒ"または−ＣＯ2Ｈもしくは−ＳＯ3Ｈの活性化誘導体
    である；またＩは、−ＮＨＲ"'Ｒ""または−ＮＲ"'Ｃ
    （Ｏ）Ｒ""であり、ここ においてＲ'、Ｒ"、Ｒ'"およ
    びＲ""は独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、リ
    ポ−タリガンド、挿入基、キレ−ト化剤、ペプチド、タ
    ンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレ
    オチドならびに可溶および不溶のポリマ−から構成され
    る群から選択されるものであって、何れも一つの検出可
    能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめら
    れたものである。
  2. 【請求項２】一つまたはそれ以上の化学的または微生物
    学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定また
    は定量化を行うために使用する核酸類縁体において、該
    核酸類縁体が、相補的配列を有する核酸にハイブリダイ
    ゼーションして、かくして前記類縁体に相当する従来公
    知のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸との間で形成
    されるハイブリッドよりも熱による変性に対して安定性
    がより高いハイブリッドを形成する能力を有する、請求
    項１において記載された核酸類縁体。
  3. 【請求項３】一つまたはそれ以上の化学的または微生物
    学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定また
    は定量化を行うために使用する核酸類縁体において、該
    核酸類縁体が、一本鎖が前記類縁体に相補的である配列
    を有する二重鎖核酸にハイブリダイゼーションして、か
    くして前記一本鎖からもう一方の鎖を置換せしめる能力
    を有するものである、請求項１において記載された核酸
    類縁体。
  4. 【請求項４】下の一般式を有する核酸類縁体を含んで成
    る、請求の範囲第１項において記載された、標識化され
    た核酸類縁体： 【化学式Ｉ】 但し上式において：Ａ1−Ａnのそれぞれは、一重結合ま
    たは下記式で表される基である： 【化学式ＩＩａ】 又は 【化学式ＩＩｂ】 但し本式において；ｎ、Ｌ1乃至Ｌnのそれぞれ、Ｘ、
    Ｙ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、請求項１において定義した通
    りである、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、水素、ヒ
    ドロキシもしくはアルコキシで置換されていてもよい
    （Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミ
    ノおよびハロゲンから構成される群から選択される；ま
    たＲ3およびＲ4のそれぞれは独立して、水素、（Ｃ1−
    Ｃ4）アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシで置換
    された（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ
    およびアミノから構成される群から選択される；Ｂ1−
    Ｂnのそれぞれは、ＮまたはＲ3Ｎ+であり、ここにおい
    てＲ3は、上記において定義された通りである；Ｃ1−Ｃ
    nのそれぞれは、ＣＲ6Ｒ7、ＣＨＲ6ＣＨＲ7またはＣＨ
    Ｒ6Ｒ7ＣＨ2であり、ここにおいて、Ｒ6は水素であり、
    またＲ7は、天然のアルファアミノ酸の側鎖から構成さ
    れる群から選択され、またはＲ6およびＲ7は独立して、
    水素、（Ｃ2−Ｃ6）アルキル、アリ−ル、アラルキル、
    ヘテロアリ−ル、ヒドロキシ、メトキシＮＲ3Ｒ4および
    ＳＲ5から構成される群から選択されるが、ここにおい
    てＲ3およびＲ4は、上記において定義された通りであ
    り、またＲ5は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロ
    キシもしくはアルコキシで置換された（Ｃ1−Ｃ6）アル
    キルであり、またはＲ6およびＲ7とは一緒になって、脂
    環系または異項環系を形成する；Ｄ1−Ｄnのそれぞれ
    は、ＣＨ2Ｒ6Ｒ7またはＣＨＲ6ＣＨＲ7であり、ここに
    おいてＲ6およびＲ7は、上記において定義された通りで
    ある；Ｇ1−Ｇn-1のそれぞれは、請求項１において定義
    された通りであり、何れも一つの検出可能な標識を含ん
    で成るか又は該標識に共役複合せしめられたものであ
    る。
  5. 【請求項５】以下の一般式を有する核酸類縁体を含んで
    成る、請求項２において記載された核酸類縁体： 【化学式ＩＩＩ】 但し本式において：Ｌはそれぞれ独立して、水素、フェ
    ニル、天然の核酸塩基および非天然の核酸塩基から構成
    される群から選択される；Ｒ7'は、水素および天然のア
    ルファアミノ酸の側鎖から構成される群から選択され
    る；ｎは、１から６０までの整数である；ｋおよびｍの
    それぞれは独立して、ゼロまたは１である；またｌは独
    立して、ゼロから５である；Ｒhは、ＯＨ、ＮＨ2または
    −ＮＨＬｙｓＮＨ2である；およびＲiは、ＨまたはＣＯ
    ＣＨ3であって、何れも一つの検出可能な標識を含んで
    成るか又は該標識に共役複合せしめられたものである。
  6. 【請求項６】以下の一般式を有する核酸類縁体を含んで
    成る、請求項３において記載された核酸類縁体： 【化学式ＩＸ】 但し本式において：Ｌ，Ｒ7'、ＲhおよびＲi並びにｎ
    は、請求項３において定義された通りであり、何れも一
    つの検出可能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複
    合せしめられたものである。
  7. 【請求項７】請求項６において記載された、標識化され
    た核酸類縁体において：Ｌがそれぞれ、核酸塩基である
    チミン、アデニン、シトシン、グアニン及びウラシルか
    ら構成される群から選択される；Ｒ7'は、水素である；
    またｎは、１乃至３０の整数である、前記核酸類縁体。
  8. 【請求項８】標識が、放射性同位元素標識、酵素標識、
    ビオチン、発蛍光団、化学発光標識、抗原、抗体または
    スピン標識である、前記請求項の内の何れか一項におい
    て記載された核酸類縁体。
  9. 【請求項９】前記リガンドが、チミン及び/又はシトシ
    ンである、請求項１乃至８の内の何れか一項において記
    載された核酸類縁体。
  10. 【請求項１０】ポリアミド主鎖上において4つ乃至8つ介
    在原子でそれぞれ分離されたアザ原子上にリガンドとし
    て天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基または核酸塩基結
    合基を結合して有する、下記一般式で表されるペプチド
    核酸（ＰＮＡ）を、一つまたはそれ以上の化学的または
    微生物学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同
    定または定量化を行うために使用する方法： 【化学式Ｉ】 但し上式において：ｎは、少なくとも２である、 Ｌ1−Ｌnのそれぞれは独立して、水素、ヒドロキシ、
    （Ｃ1−Ｃ4）アルカノイル、天然の核酸塩基類、非天然
    の核酸塩基類、芳香族原子残基、ＤＮＡ挿入基、核酸塩
    基結合基およびリポ−タリガンドから構成される群から
    選択されるが、Ｌ 1−Ｌnの内の少なくとも一つは、天然
    の核酸塩基、非天然の核酸塩基、ＤＮＡ挿入基または核
    酸塩基結合基である；Ａ1−Ａnのそれぞれは、一重結
    合、メチレン基または下記式で表される基である： 【化学式ＩＩａ】 又は 【化学式ＩＩｂ】 但し本式において；Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ3、ＣＨ2
    またはＣ（ＣＨ3）2である；Ｙは、一重結合、Ｏ、Ｓま
    たはＮＲ4である；ｐおよびｑのそれぞれは、１から５
    までの整数であり、ｐ＋ｑの和は、１０以下である；ｒ
    およびｓのそれぞれは、ゼロまたは１から５までの整数
    であり、ｒ＋ｓの和は、１０以下である；Ｒ1およびＲ2
    はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコ
    キシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ
    1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル
    チオ、アミノおよびハロゲンから構成される群から選択
    される；またＲ3およびＲ4のそれぞれは独立して、水
    素、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシもしくはアルコ
    キシもしくはアルキルチオで置換された（Ｃ1−Ｃ4）ア
    ルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよび
    アミノから構成される群から選択される；Ｂ1−Ｂnのそ
    れぞれは、ＮまたはＲ3Ｎ+であり、ここにおいてＲ3は
    上記において定義された通りである；Ｃ1−Ｃnのそれぞ
    れは、ＣＲ6Ｒ7、ＣＨＲ6ＣＨＲ7またはＣＲ6Ｒ7ＣＨ2
    であり、ここにおいてＲ6は、水素でありまたＲ7は、天
    然のアルファアミノ酸の側鎖から構成される群から選択
    され、またはＲ6およびＲ7は独立して、水素、（Ｃ2−
    Ｃ6）アルキル、アリ−ル、アラルキル、ヘテロアリ−
    ル、ヒドロキシ、（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1−
    Ｃ6）アルキルチオ、ＮＲ3Ｒ4およびＳＲ5から構成され
    る群から選択されるが、ここにおいてＲ3およびＲ4は、
    上記において定義された通りであり、Ｒ5は、水素、
    （Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシ
    もしくはアルキルチオで置換された（Ｃ1−Ｃ6）アルキ
    ルであり、またはＲ6およびＲ7とは一緒になって、脂環
    系または異項環系を形成する；Ｄ1−Ｄnのそれぞれは、
    ＣＲ6Ｒ7、ＣＨ2ＣＲ6Ｒ7またはＣＨＲ6ＣＨＲ7であ
    り、ここにおいてＲ6およびＲ7は、上記において定義さ
    れた通りである；Ｇ1−Ｇn-1のそれぞれは、いずれかの
    方向での−ＣＯＮＲ3−、ＣＳＮＲ3−、−ＳＯＮＲ3−
    または−ＳＯ2ＮＲ3−であって、なおここにおいてＲ3
    は、上記において定義した通りである；Ｑは、−ＣＯ2
    Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ"、−ＳＯ3Ｈもしくは−ＳＯ2ＮＲ'
    Ｒ"または−ＣＯ2Ｈもしくは−ＳＯ3Ｈの活性化誘導体
    である；またＩは、−ＮＨＲ"'Ｒ""または−ＮＲ"'Ｃ
    （Ｏ）Ｒ""であり、ここ においてＲ'、Ｒ"、Ｒ'"およ
    びＲ""は独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、リ
    ポ−タリガンド、挿入基、キレ−ト化剤、ペプチド、タ
    ンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレ
    オチドならびに可溶および不溶のポリマ−から構成され
    る群から選択されるものであって、何れも一つの検出可
    能な標識を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめら
    れたものである。
  11. 【請求項１１】相補的配列を有する核酸にハイブリダイ
    ゼーションして、かくして前記類縁体に相当する従来公
    知のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸との間で形成
    されるハイブリッドよりも熱による変性に対して安定性
    がより高いハイブリッドを形成する能力を有する、請求
    項１において記載された核酸類縁体を、一つまたはそれ
    以上の化学的または微生物学的個体単位についてその捕
    捉、認識、検出、同定または定量化を行うために使用す
    る方法。
  12. 【請求項１２】一本鎖が核酸類縁体に相補的である配列
    を有する二重鎖核酸にハイブリダイゼーションして、か
    くして前記一本鎖からもう一方の鎖を置換せしめる能力
    を有する、請求項１において記載された核酸類縁体を、
    一つまたはそれ以上の化学的または微生物学的個体単位
    についてその捕捉、認識、検出、同定または定量化を行
    うために使用する方法。
  13. 【請求項１３】 該核酸類縁体が、以下の一般式を有す
    るものである、請求項１０乃至１２の内の何れか一項に
    おいて記載された核酸類縁体を使用する方法： 【化学式Ｉ】 なお上式において：Ａ1−Ａnのそれぞれは、一重結合ま
    たは下記式で表される基である： 【化学式ＩＩａ】 又は 【化学式ＩＩｂ】 但し本式において；ｎ、Ｌ1乃至Ｌnのそれぞれ、Ｘ、
    Ｙ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、請求項１において定義した通
    りである、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、水素、ヒ
    ドロキシもしくはアルコキシで置換されていてもよい
    （Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミ
    ノおよびハロゲンから構成される群から選択される；ま
    たＲ3およびＲ4のそれぞれは独立して、水素、（Ｃ1−
    Ｃ4）アルキル、ヒドロキシもしくはアルコキシで置換
    された（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ
    およびアミノから構成される群から選択される；Ｂ1−
    Ｂnのそれぞれは、ＮまたはＲ3Ｎ+であり、ここにおい
    てＲ3は、上記において定義された通りである；Ｃ1−Ｃ
    nのそれぞれは、ＣＲ6Ｒ7、ＣＨＲ6ＣＨＲ7またはＣＨ
    Ｒ6Ｒ7ＣＨ2であり、ここにおいて、Ｒ6は水素であり、
    またＲ7は、天然のアルファアミノ酸の側鎖から構成さ
    れる群から選択され、またはＲ6およびＲ7は独立して、
    水素、（Ｃ2−Ｃ6）アルキル、アリ−ル、アラルキル、
    ヘテロアリ−ル、ヒドロキシ、メトキシＮＲ3Ｒ4および
    ＳＲ5から構成される群から選択されるが、ここにおい
    てＲ3およびＲ4は、上記において定義された通りであ
    り、またＲ5は、水素、（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ヒドロ
    キシもしくはアルコキシで置換された（Ｃ1−Ｃ6）アル
    キルであり、またはＲ6およびＲ7とは一緒になって、脂
    環系または異項環系を形成する；Ｄ1−Ｄnのそれぞれ
    は、ＣＨ2Ｒ6Ｒ7またはＣＨＲ6ＣＨＲ7であり、ここに
    おいてＲ6およびＲ7は、上記において定義された通りで
    ある；Ｇ1−Ｇn-1のそれぞれは、請求項１において定義
    された通りであり、何れも一つの検出可能な標識を含ん
    で成るか又は該標識に共役複合せしめられたものであ
    る。
  14. 【請求項１４】該核酸類縁体が、以下の一般式を有する
    ものである、請求項１０において記載された核酸類縁体
    を使用する方法： 【化学式ＩＩＩ】 Ｌはそれぞれ独立して、水素、フェニル、天然の核酸塩
    基および非天然の核酸塩基から成る群から選択される；
    Ｒ7'はそれぞれ独立して、水素および天然のアルファア
    ミノ酸の側鎖から成る群から選択される；ｎは、１から
    ６０までの整数である；ｋおよびｍのそれぞれは独立し
    て、ゼロまたは１である；ｌは、ゼロから５である；Ｒ
    hは、ＯＨ、ＮＨ2または−ＮＨＬｙｓＮＨ2である；お
    よびＲiは、ＨまたはＣＯＣＨ3である。
  15. 【請求項１５】該核酸類縁体が、以下の一般式を有する
    ものである、請求項１４において記載された核酸類縁体
    を使用する方法： 【化学式ＩＸ】 なお上式において：Ｌ，Ｒ7'，Ｒh、Ｒiおよびｎは、請
    求項１５において定義された通りである。
  16. 【請求項１６】請求項１５において記載された使用方法
    において、 Ｌがそれぞれ、核酸塩基であるチミン、アデニン、シト
    シン、グアニン及びウラシルから構成される群から選択
    される；Ｒ7'は、水素である；およびｎは、１乃至３０
    の整数である、前記使用方法。
  17. 【請求項１７】リガンドが、チミン及び/又はシトシン
    である、請求項１０、１１又は請求項１２乃至１６の内
    の何れか一項において記載された核酸類縁体を使用する
    方法。
  18. 【請求項１８】該核酸類縁体が、一つの検出可能な標識
    を含んで成るか又は該標識に共役複合せしめられたもの
    である、請求項１０乃至１７の内の何れか一項において
    記載された核酸類縁体を使用する方法。
  19. 【請求項１９】前記標識が、放射性同位元素標識、酵素
    標識、ビオチン、発蛍光団、化学発光標識、抗原、抗体
    またはスピン標識である、請求項１８において記載され
    た核酸類縁体を使用する方法。
  20. 【請求項２０】核酸を捕捉する方法において、固体支持
    体に固定化した、請求項１０乃至１９の内の何れか一項
    において記載された核酸類縁体にハイブリッド形成条件
    下において前記核酸を接触させるに際して、該核酸類縁
    体が、前記核酸とハイブリダイゼーションするに適した
    リガンドの配列を有するものである、核酸を捕捉する前
    記方法。
  21. 【請求項２１】捕捉された前記核酸が、前記固定化され
    た核酸類縁体に結合された状態にある核酸認識薬剤で処
    理することによって検出され、認識され、定量化されま
    たは同定される、請求項２０において記載された方法。
  22. 【請求項２２】捕捉された該核酸が、前記固定化された
    核酸類縁体にハイブリダイゼーションされた第一の領域
    およびそのようにハイブリダイゼーションされていない
    第二の領域であって、該第二の領域の少なくとも一部に
    ハイブリダイゼーションするように適合せしめられてい
    る標識核酸または核酸類縁体で処理された第二の領域を
    有しているものである、請求項２１において記載された
    方法。
  23. 【請求項２３】前記固定化された核酸類縁体が、加水分
    解してｍＲＮＡのポリＡ尾部とハイブリダイゼーション
    して、その結果前記ｍＲＮＡを捕捉することが可能であ
    る逐次リガンドを含んで成るものである、請求項２０に
    おいて記載された、ｍＲＮＡを捕捉する方法。
  24. 【請求項２４】前記逐次リガンドがチミンである、請求
    項２０において記載された方法。
  25. 【請求項２５】一旦捕捉された前記核酸が、固定化され
    た核酸類縁体と捕捉された核酸とを脱ハイブリダイゼー
    ションする条件に供することによって該固定化核酸類縁
    体から開放・放出される、請求項２０、２３又は２４の
    内の何れか一項において記載された方法。
  26. 【請求項２６】固体支持体に固定化された、請求項１０
    乃至１９の内の何れか一項において記載された核酸類縁
    体。
  27. 【請求項２７】アフィニティ捕捉カラムに導入された、
    請求項２６において記載された、固定化された核酸類縁
    体。
  28. 【請求項２８】ハイブリダイゼーションする条件下にお
    いてハイブリダイゼーションするに充分に相補的な配列
    を有する、請求項１乃至９の内の何れか一項において記
    載された核酸類縁体に標的をハイブリダイゼーションさ
    せ、かつ前記標的にハイブリダイゼーションさせた該核
    酸類縁体の前記標識を検出するかまたは定量化すること
    から成る、標的核酸を認識、検出または定量化する方
    法。
  29. 【請求項２９】前記標的核酸が、前記ハイブリダイゼー
    ションに先だって支持体に固定化される、請求項２８に
    おいて記載された方法。
  30. 【請求項３０】前記標的核酸が、前記支持体に固定化さ
    れるに際して、その第一の領域を、捕捉された核酸また
    は核酸類縁体であって、前記第一の領域に対してハイブ
    リダイゼーションするに充分に相補的である配列を有し
    かつそれ自体が前記支持体に固定化されている該捕捉核
    酸または核酸類縁体にハイブリダイゼーションさせ、か
    つ前記標識された核酸類縁体が、前記標的の第二の領域
    にハイブリダイゼーションする、請求項２９において記
    載された方法。
  31. 【請求項３１】核酸二重ラセンから一本鎖を置換する方
    法において、前記二重ラセンに対して、前記核酸のもう
    一方の鎖に対するアフィニティ−が前記一本鎖を置換す
    ることが可能であるほどに充分である核酸類類縁体をハ
    イブリダイゼーションさせることから成る前記置換方
    法。
  32. 【請求項３２】二本鎖標的核酸を検出し、同定しまたは
    定量化する方法において、置換されない鎖が、置換核酸
    類縁体に相補的な配列を有する二本鎖標的から一本鎖を
    置換することができる置換核酸類縁体を該標的核酸にハ
    イブリダイゼーションさせーなおその際、前記置換核酸
    類縁体の配列が、自らにハイブリダイゼーションするに
    充分に相補的あって、その結果、一本鎖の形態において
    前記標的の一本鎖を置換するものであるー、その後に前
    記置換された一本鎖を存在を検出するかまたは定量化す
    ることから成る、前記検出、同定または定量化する方
    法。
  33. 【請求項３３】置換された鎖をフラグメントに切断しか
    つ前記フラグメントの存在を検出する、請求項３２にお
    いて記載された方法。
  34. 【請求項３４】前記置換された鎖が、ヌクレア−ゼの攻
    撃によって切断される、請求項３２において記載された
    方法。
  35. 【請求項３５】オリゴヌクレオチド類縁体をある特異的
    核酸を検出するか又は単離するために使用する方法にお
    いて、該オリゴヌクレオチド類縁体が、その相補的な一
    本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖に対して相当するＤＮＡ又はＲ
    ＮＡよりもより強力に結合するものである前記方法。
  36. 【請求項３６】請求項１乃至９の内の何れか一項におい
    て記載された少なくとも一つの標識化された核酸類縁体
    および前記標識化された核酸類縁体を検出する少なくと
    も一つの検出試薬とを含んで成る、診断方法において使
    用されるキット。
  37. 【請求項３７】請求項１０乃至１６の内の何れか一項に
    おいて記載された核酸類縁体を更に固体支持体に固定化
    して成る、請求項３６において記載されたキット。
  38. 【請求項３８】請求項２６において記載された、固定化
    された核酸類縁体を、前記核酸類縁体を使用して捕捉さ
    れた核酸の存在を検出する少なくとも一つの核酸認識薬
    剤とを組合せて含んで成るキット。
  39. 【請求項３９】該核酸認識薬剤が、標識化された核酸ま
    たは標識化された核酸類縁体である、請求項３８におい
    て記載されたキット。
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