KR20110059743A - 펩티드 핵산 단량체 및 올리고머 - Google Patents

펩티드 핵산 단량체 및 올리고머 Download PDF

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Abstract

펩티드 핵산 단량체는 물론 대응하는 펩티드 핵산 분자가 기술된다. 단량체는 말단 아미노기 및 말단기 A를 포함한다. 말단 아미노기 및 말단기 A는 지방족 모이어티에 의해 연결된다. 이 지방족 모이어티의 주쇄는 생리적 환경 하에서 전하를 띠는 기를 포함하지 않는다. 말단기 A는 -COOH, -COOR3, -COX, -COSR3, -CN, -CONH2, -CONHR3, -CONR3, R4 중 하나이고, 이때 R3 및 R4는 H 또는 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족 또는 아릴지환족기이고, X는 할로겐 원자이다. 말단 아미노기는 적어도 2개의 탄소 원자 및 선택적으로 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 0 내지 약 2개의 헤테로원자의 주쇄를 갖는 지방족기로 치환된다. 주쇄는 극성 두부기 Z를 갖는다.

Description

펩티드 핵산 단량체 및 올리고머{PEPTIDE NUCLEIC ACID MONOMERS AND OLIGOMERS}
본 발명은 펩티드 핵산, 특히 펩티드 핵산 단량체뿐만 아니라 대응하는 펩티드 핵산 분자에 관한 것이다.
1991년에 닐센 등 (Nielsen et al.)에 의해 최초로 보고된, 펩티드 핵산 (PNA)은 리보스-포스포다이에스테르 골격이 전형적으로 N-(2-아미노에틸)글리시닐 (aeg) 아미드 결합으로 치환되고 핵염기가 천연 DNA/RNA에서와 대략 동일한 거리에서 메틸렌 카르보닐 모이어티를 통해 aeg 골격의 α-질소에 연결되는 합성 DNA/RNA 모방체이다 (도 1A; 또는 Nielsen, P.E., et al., Science (1991) 254, 1497 참고). 이러한 분자적 고안은 PNA가 높은 친화성 및 특이성으로 왓슨-크릭 염기 짝짓기 (Watson-Crick base pairing)를 통해 상보적 DNA/RNA를 인식하여 혼성화하는 것을 가능케 한다. 비-펩티드 비-핵산 특성으로 인해, PNA는 뉴클리아제 또는 펩티다제에 의해 분해되지 않으므로 생체 내에서 매우 안정하다. PNA는 비장성 (achiral), 아미노산-유사 단량체로 만들어지기 때문에, 거울상이성체 분술물의 문제없이 잘 확립된 펩티드 합성 프로토콜을 이용해 용이하게 제조될 수 있다. 이러한 놀라운 특성으로 인해, PNA는 항원 및 안티센스 적용에 선도 제제가 될 수 있는 가능성을 가지고 있다.
그러나, 유사한 천연의 다수의 거대 올리고머 화합물과 같이, PNA는 생의학적 연구에 있어 이들의 사용을 심각하게 제한하는 불량한 세포막 투과성을 갖고 있다 (Koppelhus, U., & Nielsen, P. E., Advanced Drug Delivery Reviews (2003) 55, 267). 지난 십 년간 PNA의 세포 내 유입을 개선하기 위해 상당한 노력이 이루어졌다. PNA-전달 벡터로서 세포-투과성 펩티드를 사용하는 것은 대중적인 접근법이다. PNA에 부착될 때, 이들 펩티드는 다양한 시험관 내 연구에서 생존 세포 내로 PNA 화물 (cargo)을 전달하는데 효과적인 것으로 확인되었다. 대안적으로, 더욱 매력적인 전략은 PNA 골격 위에 세포-투과성 펩티드의 막 전위 특성의 도입을 통해 조립형 (built-in) 세포 투과성을 갖는 신규한 PNA 분자를 고안하는 것이다. 다양한 목적으로 골격-개조된 PNA 유사체들을 서술하는 많은 연구들이 발표되었다. 이들 중에서, aeg 골격의 α- 또는 γ- 위치에 라이신, 오르니틴 또는 아르기닌과 같은, 양전하를 띠는 아미노산 쇄의 도입 (도 1B 및 도 1C)은 수 용해도 및 세포 내 유입을 개선시킨다. 놀랍게도, aeg α-탄소에 L-Arg 또는 D-Arg 측쇄를 갖는 PNA, 즉, D-Arg α-PNA 및 L-Arg α-PNA가 우수한 세포 투과성을 갖는 것으로 보고되었다 (Zhou, P., et al., J. Am. Chem. Soc. (2003) 125, 6878; Dragulescu-Andrasi, A., et al., Chem. Comm. (2005) 244). 지금까지, 거의 모든 변형은 불가피하게 키랄 중심을 생성하는 골격 탄소에 초점이 맞추어져 있으며, 2개의 입체이성질체는 종종, 아마도 2개의 형상에 의해 야기되는 상이한 쇄간 (interstrand) 또는 쇄내 (intrastrand) 입체적 상호작용의 결과로서, 상보적인 DNA 또는 RNA에 대해 오히려 상이한 결합 양상을 나타낸다 (Sforza, S., et al., Chirality (2002) 14, 591). 따라서, 단량체 합성 및 올리고머 조립 도중에 이성체화를 방지하는 것은 PNA 유사체의 광학적 순도를 보장하는데 가장 중요하다.
이에 본 발명의 목적은 이러한 단점들의 적어도 일부분을 극복하는 특성을 갖는 PNA 분자를 제공하는 것이다.
제1 양태에 따르면, 본 발명은 펩티드 핵산 단량체를 제공한다. 펩티드 핵산 단량체는 말단 아미노기 및 말단기 A를 포함한다. 말단 아미노기와 말단기 A는 지방족 모이어티에 의해 연결된다. 말단 아미노기와 말단기 A를 연결하는 지방족 모이어티는 생리적 조건 하에서 하전된 기를 포함하지 않는다. 말단기 A는 -COOH, -COOR3, -COX, -COSR3, -CN, -CONH2, -CONHR3 및 -CONR3R4 중 하나이다. -COOR3, -COSR3, -CONHR3 및 -CONR3R4에서 R3 및 -CONR3R4에서 R4는 H, 및 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 O 내지 약 3개의 헤테로원자를 포함하는 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 및 아릴지환족기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. -COX에서 X는 할로겐 원자이다. 말단 아미노기는 적어도 2개의 탄소 원자의 주쇄를 갖는 지방족 모이어티로 치환된다. 이 주쇄는 선택적으로 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 O 내지 약 2개의 헤테로원자를 추가로 포함한다. 말단 아미노기에서 지방족 모이어티의 주쇄는 추가로 극성 두부기 Z를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이 기 Z는 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있다.
제2 양태에서, 본 발명은 펩티드 핵산 단량체를 형성하는 방법을 제공한다. 방법은 제1 이관능성 화합물을 제공하는 것을 포함한다. 제1 이관능성 화합물은 적어도 2개의 탄소 원자의 주쇄를 갖는 지방족 화합물이다. 이 주쇄는 추가로 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 O 내지 약 2개의 헤테로원자를 선택적으로 포함한다. 이 주쇄의 각 말단은 극성 두부기를 포함한다. 한쪽 말단 위의 극성 두부기는 아미노기이다. 다른 쪽 말단 위의 극성 두부기는 기 Z이다. 본 방법은 또한 제2 이관능성 화합물을 제공하는 것을 포함한다. 제2 이관능성 화합물은 또한 지방족 화합물이다. 본 방법은 제1 이관능성 화합물의 아미노기를 제2 이관능성 화합물과 반응시키는 것을 포함한다. 그로 인해 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자가 형성된다. 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자는 말단 아미노기 및 말단기 A를 포함한다. 말단 아미노기와 말단기 A는 지방족 모이어티에 의해 연결된다. 말단 아미노기는 적어도 2개의 탄소 원자의 주쇄 및 선택적으로 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 0 내지 약 2개의 헤테로원자를 갖는 지방족 모이어티로 치환된다. 지방족 모이어티의 이 주쇄는 선택적으로 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 0 내지 약 2개의 헤테로원자를 포함한다. 지방족 모이어티의 주쇄는 추가로 극성 두부기 Z를 포함한다. 또한, 본 방법은 핵염기를 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자에 연결하는 것을 포함한다. 그 결과, 펩티드 핵산 단량체가 형성된다.
제3 양태에 따르면, 본 발명은 펩티드 핵산 분자를 제공한다. 펩티드 핵산 분자는 생리적 조건 하에서 적어도 실질적으로 변하지 않는 지방족 골격을 포함한다. 펩티드 핵산 분자의 지방족 골격은 아미드기를 포함한다. 하나 이상의 아미드기의 아미노 부분은 적어도 2개의 탄소 원자를 갖는 주쇄를 포함하는 지방족 모이어티로 치환된다. 알킬 쇄는 또한 극성 두부기 Z를 포함한다.
본 발명은 신규한 관능성 PNA 단량체 및 이 PNA 단량체를 형성하기 위한 효과적인 합성 방법을 제공한다. 이 단량체를 사용하여 올리고머 또는 중합체 PNA 분자를 형성할 수 있다. PNA 분자는 그의 골격이 인 당 (phospho sugar)이 아닌 슈도펩티드인 핵산 분자이다. 따라서, PNA는 예를 들어 DNA 또는 RNA와는 달리 일반적으로 전하 중성 골격을 갖는다. 그럼에도 불구하고, PNA는, 예컨대, DNA 또는 RNA와 마찬가지로, 그에게 PNA가 구조적 모방체로 인식되는, 적어도 상보적이고 실질적으로 상보적인 핵산 가닥에 혼성화할 수 있다. PNA 분자는 중성 골격을 갖기 때문에, 표적 핵산과의 혼성화는 더욱이 쇄내 음전하 정전기적 반발에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서 DNA 및 RNA 표적에 대한 PNA의 결합은 DNA 대 DNA 또는 RNA 대 RNA의 결합보다 강하다. PNA/DNA 또는 PNA/ RNA 혼성체는 상대적으로 높은 온도에서도 매우 안정한 형성, 및 매우 높은 결합 친화도를 나타낸다. 부가적으로, 반복적으로 하전된 골격의 부재는 또한 보통 폴리음이온에 친화도를 나타내는 단백질에 PNA 분자가 결합하는 것을 방지한다. 따라서, PNA의 사용은 비-특이적 상호작용의 주요 공급원을 예방한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산 분자"는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 이들의 조합과 같은, 임의의 가능한 형상의 임의의 핵산을 지칭한다. 핵산에는 예를 들어 DNA 분자, RNA 분자, 뉴클레오티드 유사체 또는 핵산 화학을 이용해 형성된 DNA 또는 RNA의 유사체, 폐쇄 (locked) 핵산 분자 (LNA), PNA 분자 (상동) 및 텍토 (tecto)-RNA 분자 (예컨대, Liu, B., et al., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126, 4076-4077)가 포함된다. LNA 분자는 C4'과 O2' 사이에 메틸렌 다리를 갖는 변형된 RNA 골격을 포함하는데, 이는 N-유형의 형상에서 퓨라노스 고리를 폐쇄하여 더 높은 두가닥 (duplex) 안정성 및 뉴클리아제 내성을 갖는 개별적인 분자를 제공한다. PNA 분자와는 달리, LNA 분자는 하전된 골격을 갖는다. DNA 또는 RNA는 유전체 또는 합성 기원일 수 있고 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 이러한 핵산은 예컨대 mRNA, cRNA, 합성 RNA, 유전체 DNA, cDNA 합성 DNA, DNA와 RNA의 공중합체, 올리고뉴클레오티드 등일 수 있다. 개별적인 핵산은 나아가 비-천연 뉴클레오티드 유사체를 포함하고/하거나 친화성 태그 또는 표지에 연결될 수 있다.
다수의 뉴클레오티드 유사체가 알려져 있고 본 발명의 분자 및 방법에 존재하고/하거나 사용될 수 있다 (하기 참조). 뉴클레오티드 유사체는 예를 들어 염기, 당, 또는 인산염 모이어티에 변형을 포함하는 뉴클레오티드이다. 예시적인 실례로서, siRNA의 2'-OH 잔기의 2'F, 2'O-ME 또는 2'H 잔기로의 치환은 개별적인 RNA의 생체 내 안정성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 염기 모이어티의 변형에는 A, C, G, 및 T/U, 우라실-5-일, 하이포크산틴-9-일, 및 2-아미노아데닌-9-일과 같은 다른 퓨린 또는 피리미딘 염기뿐만 아니라 비-퓨린 또는 비-피리미딘 뉴클레오티드 염기의 천연 및 합성 변형이 포함된다. 다른 뉴클레오티드 유사체는 범용 염기를 제공한다. 범용 염기에는 3-니트로피롤 및 5-니트로인돌이 포함된다. 범용 염기는 임의의 다른 염기와 염기 쌍을 형성할 수 있다. 염기 변형은 종종, 예컨대, 증가된 두가닥 안정성과 같은 독특한 특성을 획득하기 위해, 예를 들어 당 변형, 예컨대 예를 들어 2'-O-메톡시에틸과 조합될 수 있다.
PNA 분자는, 예컨대, DNA 또는 RNA에 존재하는 포스포다이에스테르 골격이 아미노 말단과 카르복실 말단을 갖는 짧은 지방족 모이어티의 반복적 단위로 치환되어, 올리고머 또는 중합체 내 아미드 결합을 형성하는 슈도펩티드 골격을 갖는 합성 핵산 유사체이다. 이 골격의 짧은 지방족 모이어티에, 핵염기, 보통 퓨린 및 피리미딘 염기가 측쇄, 일반적으로 메틸 카르보닐 링커를 통해 부착된다. 본 발명에 따른 PNA 분자에서 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함하는, 임의의 바람직한 핵염기가 사용될 수 있다. 적합한 퓨린 및 피리미딘 염기의 예시에는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 시토신, 5-메틸시토신, 구아닌, 아데닌, 티민, 우라실, 5,6-다이하이드로우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 리보티민, 7-메틸구아닌 또는 7-아이소부틸구아닌이 포함된다. "변형된" 핵염기로 명명될 수도 있는, 여분의 적합한 설명에 도움이 되는 핵염기의 예시가 최근에 우즈치코브스키 및 허드슨 (Wojciechowski & Hudson)에 의해 검토되었다 (Current Topics in Medicinal Chemistry (2007) 7, 667-679). 이들은 그 중에서도 4-(1,2,4-트라이아졸릴)티민, 5-알키닐우라실, 5-아이오도우라실, 티오우라실, 5-(프로파길 알코올)우라실, 아이소-시토신, 슈도아이소시토신, 5-(페로세닐프로파길카르복스아미드)우라실, N6-알킬아데닌, N7-크산틴, 3-니트로피롤, 6-티오구아닌, 페녹사진, 2-아미노퓨린 또는 2,6-다이아미노퓨린을 포함한다.
개별적인 PNA 단량체를 비롯한, 본 발명에 따른 PNA 분자에서, 전형적으로 각 단량체 단위의 핵염기는 측쇄를 통해 골격에, 또는 골격의 측쇄의 일부분에 결합된다. 따라서, 일부 실시형태에서 핵염기는 개별적인 측쇄의 말단에 결합되는 반면, 다른 실시형태에서 핵염기는 측쇄의 길이를 따라 다른 위치에 결합된다. 측쇄의 이 부분, 또는 일부 실시형태에서 이 측쇄는, 2개의 탄소 원자 길이의 전형적인 실시형태에서 본 발명에 따른 PNA 분자 내이다. 일부 실시형태에서, 측쇄는 주쇄/골격의 헤테로원자를 통해 PNA 단량체의 주쇄에, 또는 개별적으로 PNA 분자의 골격에 결합된다. 측쇄는 예를 들어 아미드 결합을 통해 주쇄에 결합될 수 있다. 따라서, 주쇄는 질소 헤테로원자를 포함할 수 있다. 이 질소 원자는 아미드 결합을 통해 측쇄의 카르보닐에 결합될 수 있다.
헤테로원자는 탄소와 다른 임의의 원자이다. 예시에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, N, O, P, S, Si 및 Se가 포함된다. 여러 개의 헤테로원자가 본 발명에 따른 방법의 반응물 또는 생성물의 모이어티 내에 존재하는 경우, 이들은 독립적으로 선택된다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, PNA 분자 내 각 PNA 단량체 내 짧은 지방족 모이어티는 전형적으로 N-(2-아미노에틸) 글리신 (aeg)의 단위이다 (상동, 도 1A 참고). 본 발명에 따른 PNA 분자의 PNA 단량체 단위는 이 단량체 단위를 근거로 할 수 있다. 따라서, 도 1A, 1B 또는 1C에 도식된 바와 같은 단량체 단위는, 예를 들어 본 발명에 따른 PNA 분자의 골격뿐만 아니라, 대응하는 PNA 단량체의 주쇄를 정의할 수 있다. 하기에 추가로 설명되는 바와 같이, 본 발명의 분자에서 이들 도면에 도식된 주쇄의 아미노기는 도 1D에 예시된 바와 같은, 부가적인 치환기에 결합된다.
올리고머 PNA 분자는 약 6 내지 약 15개의 단량체 단위를 갖는 분자인 것으로 이해된다. PNA 골격은 DNA 또는 RNA에서와 같이 반복 단위당 대략 동일한 길이를 유지하고 첨부된 핵염기는 골격으로부터 돌출되어 표적 핵산 분자와 안정한 이중 또는 삼중 헬릭스 복합체를 형성한다. 따라서, PNA에서 핵염기 사이의 거리는 DNA 또는 RNA와 비교하여 보존되고, 이는 높은 서열 특이성 및 친화성으로 표적 핵산 서열에 대한 PNA의 결합을 가능케 한다.
만약 여분의 치환기가 단량체(들)의 주쇄의 탄소 원자에 존재하지 않는다면PNA 분자 및 대응하는 PNA 단량체 모두의 골격은 추가로 비장성일 수 있다. PNA 분자 내 아미드 결합은 높은 생물학적 활성을 제공한다. 나아가, DNA/RNA 및 단백질 모두와 화학적으로 현저히 다른 PNA의 비-천연 특성은 PNA 분자에 프로테아제 및 뉴클리아제 공격에 대한 높은 내성을 부여한다.
본 발명에 따른 PNA 단량체는 그의 말단 각각에 관능기를 갖는 지방족 주쇄를 갖는다. 용어 "지방족"은, 달리 언급되지 않는 한, 포화되거나 단일- 또는 고도-불포화될 수 있고 헤테로원자를 포함할 수 있는, 직쇄 또는 분지된 탄화수소쇄를 의미한다 (하기 참조). 불포화 지방족기는 하나 이상의 이중 및 삼중 결합 (알케닐 또는 알키닐 모이어티)을 포함한다. 탄화수소쇄의 가지는 비-방향족 환상 성분뿐만 아니라 선형쇄를 포함할 수 있다. 탄화수소쇄는, 달리 언급되지 않는 한, 임의의 길이일 수 있고, 임의의 개수의 가지를 포함할 수 있다. 전형적으로, 탄화수소 (주)쇄는 1 내지 약 4개, 1 내지 약 5개, 1 내지 약 6개, 1 내지 약 7개, 1 내지 약 8개, 2 내지 약 4개, 2 내지 약 5개, 2 내지 약 6개, 3 내지 약 4개, 3 내지 약 5개, 3 내지 약 6개, 1 내지 약 10개 또는 2 내지 약 10개의 탄소 원자를 포함한다. 알케닐 라디칼의 예시는 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지된 탄화수소 라디칼이다.
알케닐 라디칼은 보편적으로 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자 및 하나 이상, 예를 들어 2개의 이중 결합, 예컨대 약 2 내지 약 10개의 탄소 원자, 및 1개의 이중 결합을 포함한다. 알키닐 라디칼은 보편적으로 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자 및 하나 이상의, 예를 들어 2개의 삼중 결합, 예컨대 2 내지 10개의 탄소 원자, 및 1개의 삼중 결합을 포함한다. 알키닐 라디칼의 예시는 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지된 탄화수소 라디칼이다. 알킬기의 예시는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 이들 라디칼의 n 이성체, 아이소프로필, 아이소부틸, 아이소펜틸, sec-부틸, tert-부틸, 네오펜틸 및 3,3-다이메틸부틸이다. 가지뿐만 아니라 주쇄 모두 예를 들어 N, O, S, Se 또는 Si와 같은 헤테로 원자를 추가로 포함할 수 있고, 또는 탄소 원자가 이들 헤테로원자로 치환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩티드 핵산 단량체의 지방족 주쇄는 이러한 헤테로원자를 0 내지 약 4개, 예컨대 0 내지 약 3개 또는 1 내지 약 3개 포함한다. 일부 실시형태에서 핵염기는 연결 모이어티를 통해 PNA 단량체의 주쇄의 헤테로원자에 연결된다. 상기에 설명한 바와 같이, 대응하는 헤테로원자는 질소일 수 있고 연결 모이어티는 아미드 결합을 통해 질소 원자에 결합될 수 있다.
용어 "지환족"은 또한 "환상지방족"으로 언급될 수 있고, 달리 언급되지 않는 한, 포화되거나 단일- 또는 고도-불포화될 수 있는, 비-방향족 환상 모이어티 (예컨대, 탄화수소 모이어티)를 의미한다. 환상 탄화수소 모이어티는 또한 데칼린 (decalin)과 같은 융합된 환상 고리 시스템을 포함할 수 있고 쇄 성분뿐만 아니라 비-방향족 환상 성분으로 치환될 수 있다. 환상 탄화수소 모이어티의 주쇄는, 달리 언급되지 않는 한, 임의의 길이일 수 있고 임의의 개수의 비-방향족 환상 및 쇄 성분을 포함할 수 있다. 전형적으로, 탄화수소 (주)쇄는 하나의 환상 내에 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 주쇄 원자를 포함한다. 이러한 모이어티의 예에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 또는 사이클로옥틸이 포함된다. 환상 탄화수소 모이어티 및, 존재하는 경우, 임의의 환상 및 쇄 치환기는 모두 예를 들어 N, O, S, Se 또는 Si와 같은 헤테로원자를 추가로 포함할 수 있고, 또는 탄소 원자가 이들 헤테로원자로 치환될 수 있다. 용어 "지환족"은 또한, 일반적으로 약 3 내지 약 8개의 고리 탄소 원자, 예를 들어 5개 또는 6개의 고리 탄소 원자를 포함하는 불포화된 환상 탄화수소인 사이클로알케닐 모이어티를 포함한다. 사이클로알케닐 라디칼은 전형적으로 각각의 고리 시스템 내에 이중 결합을 갖는다. 교대로 사이클로알케닐 라디칼이 치환될 수 있다.
상기에서 이미 지시된 바와 같이, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "지방족" 및 "지환족" 모두는 각각의 모이어티의 치환되고 비치환된 형태 모두를 포함하는 것을 의미한다. 치환기는 -COOH (카르복시), -OH (하이드록시), -SH (티올-), 다이티안-, -SeH (셀레노-), -CHO (알데하이드), -CO- (카르보닐), -OSO- (설포닐), 설포-, 설피도-, -O- (옥소), 설페이트 (-OSO3H), -NH2 (아미노), -NO (니트로), -NS, -NSe, -Br (브로모), -Cl (클로로) 또는 -F (플로오로)와 같은 할로겐, 아미노-, 이미노-, 아미도-, 이미도-, 아지도-, 다이아조-, 시아노-, 아이소시아노-, 티오시아노-, 니트로-, 니트로소-, 설포닐- (예컨대, 트라이플루오로메틸 설포닐-, p-톨루엔설포닐-, 브로모벤젠설포닐-, 니트로벤젠설포닐-, 또는 메탄-설포닐), 실릴-, 실라노- 또는 실록시-기와 같은 임의의 관능기일 수 있다.
말단 아미노기 및 말단기 A를 연결하는 펩티드 핵산 단량체의 지방족 모이어티는 하나 이상의 가지를 포함할 수 있다. 각각의 가지는 펩티드 핵산 단량체의 지방족 모이어티에 다시 결합될 수 있고, 그로써 환상 모이어티를 정의한다. 펩티드 핵산 단량체의 지방족 모이어티의 주쇄는 생리적 조건 하에서, 즉 특히 pH 값에 있어서 숙주 또는 세포 내의 생리적 환경과 닮은 조건 하에서 전하를 띠는 기를 포함하지 않는다 (또한 하기 참조). 따라서, 약 ~ 6.0 내지 ~ 8.5, 예컨대 약 ~ 6.8 내지 ~ 7.5의 pH 값을 갖는 수성 용액 중에서, 펩티드 핵산 단량체의 지방족 모이어티는 적어도 실질적으로 전하를 띠지 않는다. 그러므로 대응하는 단량체로부터 형성된 펩티드 핵산 분자는 적어도 실질적으로 하전되지 않은 골격을 갖는다 (또한 하기 참조).
본 발명에 따른 PNA 단량체의 지방족 주쇄의 말단에서 하나의 관능기는 아미노기이다. 이 말단 아미노기는 일반적으로 이차 및 삼차 아미노기 중의 하나이다. 아미노기를 갖는 하나의 치환기는 지방족 모이어티이다. 이 지방족 모이어티는 직쇄 또는 분지된 것일 수 있고 선택적으로 0 내지 약 3개의 헤테로원자, 예컨대 1개의 헤테로원자를 비롯한 0 내지 약 2개의 헤테로원자를 포함한다. 지방족 모이어티의 주쇄는 적어도 2개의 탄소 원자를 갖는다. 주쇄는 예를 들어 약 2 내지 약 12개의 탄소 원자, 예컨대 2 내지 약 10개의 탄소 원자, 약 2 내지 약 8개의 탄소 원자, 약 2 내지 약 7개의 탄소 원자, 약 2 내지 약 6개의 탄소 원자, 약 2 내지 약 5개의 탄소 원자, 약 2 내지 약 4개의 탄소 원자, 약 3 내지 약 10개의 탄소 원자, 약 3 내지 약 8개의 탄소 원자, 약 3 내지 약 7개의 탄소 원자, 약 3 내지 약 6개의 탄소 원자, 약 3 내지 약 5개의 탄소 원자, 약 4 내지 약 10개의 탄소 원자, 약 4 내지 약 8개의 탄소 원자 또는 약 4 내지 약 6개의 탄소 원자, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 탄소 원자 길이를 가질 수 있다.
PNA 단량체의 지방족 주쇄의 아미노기의 질소에 결합된 지방족 모이어티의 주쇄는 추가로 극성 두부기 Z를 포함한다. 기 Z는 임의의 극성기, 예컨대 하이드록실기 (-OH), 티오기 (-SH), 셀레노기 (-SeH), 포스포네이트기 (
Figure pct00001
), 설포네이트기 (
Figure pct00002
), 에스테르기 또는 아미드기, 예컨대, 화학식 -CONHR3 또는 -CONR3R4 (여기서, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 0 내지 약 3개의 헤테로원자를 포함하는 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 및 아릴-지환족기 중의 하나로부터 선택됨)일 수 있다 (또한 상기 참조). 기 Z는 또한 카르보닐기를 포함할 수 있다. 예를 들어 알데하이드기 또는 카르복실기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 기 Z는 수성 용액 중에서 양전하 또는 음전하와 같은 전하를 띨 수 있다. 기 Z는 예를 들어 펩티드 핵산 단량체가 일정 기간 동안 적어도 실질적으로 안정하고, 펩티드 핵산 단량체가 검출 또는 결합 반응을 포함하는 바람직한 화학적 또는 생화학적 반응을 수행할 수 있는 조건 하에서 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있다. PNA 단량체가 PNA 분자에 포함되는 경우, 기 Z는 일정 기간 동안 적어도 실질적으로 안정하고, 펩티드 핵산 단량체가 검출 또는 결합 반응, 예컨대 혼성화를 포함하는 바람직한 화학적 또는 생화학적 반응을 수행할 수 있는 조건 하에서 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있다. 기 Z는 약 5 내지 약 11의 pH 범위, 예컨대 약 5.5 내지 약 10의 pH 범위, 약 5.5 내지 약 9 또는 약 6 내지 약 8의 pH 범위인 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있다. 일부 실시형태에서, 기 Z는 생리적 조건 하에서, 즉 예를 들어 세포 내 또는 숙주 유기체 내의 생리적 환경과 닮은 조건 하에서 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있다. 구체적으로, 생리적 조건은 약 7의 pH 값에 근접한 pH 값을 지칭한다. 각각의 극성 두부기 Z의 3종의 도식적인 예시는 아미노기, 구아니딘기 및 이미다졸기이다.
이와 관련하여, 용어 "구아니딘기"는 하기 화학식 중 하나의 모이이터를 지칭한다:
Figure pct00003
전술한 화학식 중 첫 번째에서 R14 내지 R17은, 독립적으로 선택된, H, 실릴기, 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 또는 아릴지환족기일 수 있다.
용어 "방향족" 및 "아릴"은, 달리 언급되지 않는 한, 단일 고리일 수 있거나 다중 융합 또는 공유적으로 연결된 고리, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 융합 고리를 포함할 수 있는, 공액 이중 결합의 평면 환상 탄화수소 모이어티를 의미한다. 용어 방향족은 또한 알킬아릴을 포함한다. 전형적으로, 탄화수소 (주)쇄는 하나의 환상 내에 5, 6, 7 또는 8개의 주쇄 원자를 포함한다. 이러한 모이어티의 예시에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 사이클로펜타디에닐, 페닐, 나프탈레닐-, [10]아눌레닐-(1,3,5,7,9-사이클로데카펜타에닐-), [12]아눌레닐-, [8]아눌레닐-, 페날렌 (페리나프텐), 1,9-다이하이드로피렌, 크리센 (1,2-벤조페난트렌)이 포함된다. 알킬아릴 모이어티의 예시는 벤질이다. 환상 탄화수소 모이어티의 주쇄는, 달리 언급되지 않는 한, 임의의 길이일 수 있고 임의의 개수의 헤테로원자, 예를 들어 N, O 및 S를 포함할 수 있다. (당해 기술분야의 숙련자에게 알려진) 헤테로방향족 모이어티의 예시에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 푸라닐-, 티오페닐-, 나프틸-, 나프토푸라닐-, 안트라-티오페닐-, 피리디닐-, 피롤릴-, 퀴놀리닐, 나프토퀴놀리닐-, 퀴녹살리닐-, 인돌일-, 벤즈인돌일-, 이미다졸일-, 옥사졸일-, 옥소닌일-, 옥세피닐-, 벤조세피닐-, 아제피닐-, 티에피닐-, 셀레네피닐-, 티오닌일-, 아제시닐- (아자사이클로데카펜타에닐-), 다이아제시닐-, 아자사이클로도데카-1,3,5,7, 9,11-헥사엔-5,9-다이일-, 아조지닐-, 다이아조시닐-, 벤즈아조시닐-, 아제시닐-, 아자운데시닐-, 티아-[11]아눌레닐-, 옥사사이클로트라이데카-2,4,6,8,10,12-헥사에닐- 또는 트라이아자안트라세닐-모이어티가 포함된다.
용어 "아릴지방족"은 하나 이상의 방향족 모이어티가 하나 이상의 지방족기로 치환된 탄화수소 모이어티를 의미한다. 따라서, 용어 "아릴지방족"은 또한 2개의 이상의 아릴기가 임의의 길이의 하나 이상의 지방족 쇄 또는 쇄들, 예를 들어 메틸렌기를 통해 연결되는 탄화수소 모이어티를 포함한다. 전형적으로, 탄화수소 (주)쇄는 방향족 모이어티의 각 고리 내에 5, 6, 7 또는 8개의 주쇄 원자를 포함한다. 아릴지방족 모이어티의 예시에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 1-에틸-나프탈렌, 1,1'-메틸렌비스-벤젠, 9-아이소프로필안트라센, 1,2,3-트라이메틸-벤젠, 4-페닐-2-부텐-1-올, 7-클로로-3-(1-메틸에틸)-퀴놀린, 3-헵틸-푸란, 6-[2-(2,5-다이에틸페닐)에틸]-4-에틸-퀴나졸린 또는, 7,8-다이부틸-5,6-다이에틸-아이소퀴놀린이 포함된다.
용어 "지방족" 및 "지환족" (상동)과 유사하게, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "방향족", "아릴" 및 "아릴지방족"은 각각의 모이어티의 치환 및 비치환 형태 모두를 포함하는 것을 의미한다. 치환기는 상기에 예시된 바와 같은, 임의의 관능기이거나 이를 포함할 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 일부 실시형태에서 PNA 단량체의 말단 아미노기는 삼차 아미노기이다. 따라서, 이러한 실시형태에서 적어도 2개의 탄소 원자의 알킬 쇄에 더하여 여분의 치환기가 아미노기에 결합한다. 일반적으로 이러한 여분의 치환기는 잔존하는 PNA 단량체가 적어도 실질적으로 온전하게 남는 조건 하에서 아미노기로부터 이들의 제거를 가능케 하는 성질이 있다. 이러한 치환기의 제거 시, PNA 단량체 내에 존재하는 관능기를 차폐하는 보호기는, 예를 들어 잔여 PNA 단량체가 변화하지 않는 동안에 제거될 수 있다. 따라서, 이러한 여분의 치환기는 전형적으로 아미노 보호기이다. 적합한 보호기의 예시에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 카바메이트기, 메틸아릴기 (예컨대, 프탈로일- 또는 테트라클로로프탈로일-), 아세트아미도기, 트라이플루오로아세트아미도기, 아릴설포닐기 (예컨대, p-톨루설포닐-), o-니트로페닐설페닐기, 트라이플루오로아세틸기, 트리틸기, 알릴기, 9-페닐플로오레닐기, 다이-티아석시닐기, 트라이아진아논기, N-비스(메틸티오)메틸렌기 또는 N-다이페닐메틸렌기가 포함된다. 카바메이트기의 예시에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 메톡시카르보닐-, 에톡시카르보닐-, 벤질카르보닐-, 벤질옥시카르보닐-, 니트로벤질옥시카르보닐-, 벤즈하이드릴옥시카르보닐, 알릴옥시카르보닐-, 터트-부톡시카르보닐-, 9-플루오레닐메톡시카르보닐-, 2-(트라이메틸실릴)에톡시카르보닐-, 2,2,2-트라이클로로에톡시카르보닐- 및 2-(4-트라이플루오로메틸페닐설포닐)에톡시카르보닐기가 포함된다. 통상적인 PNA 분자의 합성에 일반적으로 사용되는 아미노 보호기의 예시는 9-플루오레닐메톡시-카르보닐- 및 벤즈하이드릴옥시카르보닐기이다 (예컨대, 문헌 [Shakeel, S., et al., J. Chem. Technol. Biotechnol. (2006) 81, 892-899] 참조).
본 발명에 따른 PNA 단량체의 지방족 주쇄의 다른 말단기에 위치한 관능기는 카르복실기이거나 이로 전환될 수 있는 관능기이다. 따라서 말단기 A로도 명명된, 이 기는 카르복실기, -COOH, 그 자체일 수 있다. 이 기 A는 또한 예를 들어 -COOR3, -COX, -COSR3, -CN, -CONH2, -CONHR3 또는 -CONR3R4일 수 있다. 이들 기 -COOR3, -COSR3, -CONHR3 및 -CONR3R4 내 R3은 H, 또는 O 내지 약 3개의 헤테로원자, 즉 탄소와는 다른 원자를 포함하는 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족 또는 아릴지환족기일 수 있다. 적합한 헤테로원자의 예시에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, N, O, S, Se 및 Si가 포함된다. 유사하게, -CONR3R4에서 R4는 H, 및 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 O 내지 약 3개의 헤테로원자를 포함하는 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 및 아릴지환족기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. -COX에서 X는 F, Cl, Br 또는 I와 같은 할로겐 원자이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 펩티드 핵산 단량체는 일반 구조 화학식 (Id)를 갖는다:
Figure pct00004
이 화학식에서, Q는 선형 또는 분지된 것일 수 있는 지방족 다리이다. 이는 약 2 내지 약 12개의 탄소 원자, 예컨대 약 3 내지 약 10개의 탄소 원자, 약 3 내지 약 8개의 탄소 원자, 약 4 내지 약 8개의 탄소 원자, 또는 약 3 내지 약 6개의 탄소 원자 길이의 주쇄를 갖는다. 지방족 다리 Q의 주쇄는 선택적으로 0 내지 약 2개의 헤테로원자, 예컨대 N, O, S, Se 및 Si를 포함한다. 지방족 다리 Q는 예를 들어 도 7D에 나타낸 하기 예시에서와 같은 아미드 결합을 포함할 수 있다:
Figure pct00005
상기 화학식 (Id)에서 R2는 실릴기, 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 또는 아릴지환족기이다. 일부 실시형태에서, R2는 제거가능한 아미노-보호기이다 (예를 들어 상기 참조). Z는 일부 실시형태에서 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있는, 예컨대 아미노기, 아미도기, 카르복실기, 에스테르기, 하이드록실기, 티오기, 셀레노기, 포스포네이트기, 설포네이트기, 구아니딘 또는 이미다졸기일 수 있는 극성 두부기이고, R1은 H, 실릴기 또는 메틸기일 수 있다. E는 핵염기이고 E는 개별적으로 선택된 핵염기일 수 있다. 말단기 A는 이미 상기에서 정의된 바 있다.
상기 화학식 (Id)에서, 만약 R1이 H가 아니라면 R1 및 핵염기가 결합되는 탄소 원자는 키랄 중심을 정의한다. 이 탄소 원자와 R1 사이의 결합은 PNA 분자의 임의의 입체이성체 또는 이러한 입체이성체의 혼합물뿐만 아니라 PNA 단량체의 임의의 거울상이성체가 선택될 수 있도록 임의의 형상을 가질 수 있다.
R1이 H인 실시형태에서, 펩티드 핵산 단량체는 또한 일반 구조 화학식 (I)로 표시될 수 있다:
Figure pct00006
일부 실시형태에서 본 발명에 따른 펩티드 핵산 단량체는 일반 구조 화학식 (Ic)를 갖는다:
Figure pct00007
이 화학식에서 n은 약 2 내지 약 15, 예컨대 약 2 내지 약 9, 약 2 내지 약 9, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 8 또는 약 4 내지 약 6, 예를 들면 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10과 같은 정수이다. E 및 Z는 상기에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서 본 발명에 따른 펩티드 핵산 단량체는 일반 구조 화학식 (Ia) 및 (Ib) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00008
이들 화학식에서, n, E, Z, R1 및 R2는 상기에서 정의된 바와 같다. 화학식 (Ia)에서 R5 및 화학식 (Ib)에서 R6은 기 N, O, S, Se 및 S로부터 선택된 0 내지 약 4개의 헤테로원자를 포함하는 실릴기, 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 아릴지환족기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 따라서, R5 및 R6은 또한 하나 이상의 관능기를 가질 수 있다. 모이어티 R5 및 R6이 결합되는 탄소 원자가 키랄 중심을 정의함이 주목된다. 각각의 결합은 PNA 분자의 임의의 입체이성체 또는 이러한 입체이성체의 혼합물뿐만 아니라 PNA 단량체의 임의의 거울상이성체가 선택될 수 있도록 임의의 형상을 가질 수 있다. 치환기 R5 및 R6이 요구되는 바와 같이 선택될 수 있는 반면, 각각의 치환기는 예를 들어 극성기를 제공함으로써 본 발명에 따른 PNA 단량체 및 PNA 분자의 세포 투과성을 향상시키도록 요구된다.
본 발명에 따른 PNA 단량체를 형성하는 방법은 PNA 단량체의 소정의 바람직한 구조적 부분으로부터 개시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 주쇄가 제공될 수 있고, 그의 아미노기에, 적합한 연결 모이어티를 갖는 핵염기뿐만 아니라, 극성 두부기 Z를 보유하는 측쇄가 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서 합성은, 최종 PNA 단량체에서, 그 단량체의 주쇄의 아미노기에 결합되고 극성 두부기 Z를 보유하는 측쇄로부터 개시된다. 일부 실시형태에서, PNA 단량체 내 기 Z를 보유하는 전체 지방족 모이어티는 반응물의 형태로 제공될 것이다. 상기에 언급된 바와 같이, 이 모이어티는 헤테로원자 및 측쇄 또는 가지를 포함할 수 있다. 이러한 일 실시형태에서 최종 PNA 단량체의 주쇄는 단계적으로 형성된다. 제1 단계에서 원자, 예를 들어 헤테로원자, 또는 각각의 (헤테로)원자로 전환될 수 있는 관능기를 포함하는, 주쇄의 전구체가 제공된다. 제2 단계에서 주쇄가 완성되고 말단기 A가 제공되거나 형성되고, 또는 관능기가 말단기 A로 전환될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서 PNA 단량체를 형성하는 방법은 기 Z를 보유하고 일부 실시형태에서는, 측쇄로 명명될 수 있는 지방족 모이어티를 정의하는, 제1 이관능성 화합물을 제공하는 것을 포함한다. 따라서, 제1 이관능성 화합물은 N, O, S, Se 및 Si와 같은 헤테로원자를 포함할 수 있는 지방족 화합물이다 (상기 참조). 제1 이관능성 화합물은, 예를 들어 이관능성 실라알칸, 이관능성 실라알켄, 티오-, 셀레노- 또는 텔루로-알칸과 같은 이관능성 칼코게노 알칸, 이관능성 칼코게노 알켄 또는 이관능성 아자-, 또는 옥사-알칸일 수 있다. 이러한 제1 이관능성 화합물의 주쇄는 적어도 2개의 탄소 원자를 갖는다. 제1 극성 두부기인 기 Z 이외에, 제1 이관능성 화합물은 제2 극성 두부기를 갖는다. 제2 극성 두부기는 아미노기이다. 아미노기는 일반적으로 일차 또는 이차 아미노기이다. 아미노기가 이차 아미노기인 경우, 제2 극성 두부기는, 예를 들어, 일부 실시형태에서 제거가능한 아미노-보호기일 수 있는, 모이어티 R2 (상동)에 결합될 수 있다. 2개의 극성 두부기는 적어도 2개의 탄소 원자, 예컨대 약 2 내지 약 8개, 약 2 내지 약 7개 또는 약 3 내지 약 7개의 탄소 원자의 알킬쇄의 양 말단에 결합한다 (또한 상기 참조).
PNA 단량체를 형성하는 이러한 실시형태에서, 제2 이관능성 화합물이 제공될 수 있다. 제2 이관능성 화합물은 또한 지방족 화합물이다. 제2 이관능성 화합물의 2개의 관능기는 예를 들어 각각의 지방족 화합물의 주쇄의 두 말단에 결합된 2개의 두부기일 수 있다. 2개의 관능기 중 하나는 일반적으로 제1 이관능성 화합물의 아미노기와 반응할 수 있다. 다른 관능기는 임의의 관능기일 수 있다. 이러한 관능기는 일부 실시형태에서 화학적 반응, 예를 들어 전환에 사용될 수 있는 특성이 있다. 이러한 전환은, 핵염기가 연결 모이어티를 통해 그에 연결되는, PNA 단량체 주쇄의 헤테로원자의 형성을 유발할 수 있다 (상동). 이러한 전환은 또한 PNA 단량체의 말단기 A의 형성을 유발할 수 있다. 일부 실시형태에서 제2 이관능성 화합물의 주쇄는 제2 이관능성 화합물을 제공함으로써 제공된다 (또한 상기 참조). 이러한 주쇄는 핵염기가 연결 모이어티를 통해 결합될 수 있는 헤테로원자를 포함할 수 있다.
제2 이관능성 화합물은 제1 이관능성 화합물의 아미노기와 반응한다. 따라서, 제1 이관능성 화합물의 아미노기가 일차 아미노기인 실시형태에서는, 이차 아미노기로 전환된다. 제1 이관능성 화합물의 아미노기가 이차 아미노기인 실시형태에서는, 일반적으로 삼차 아미노기로 전환된다. 일부 실시형태에서, 제1 이관능성 화합물의 이차 아미노기는 제2 이관능성 화합물과의 반응 도중에 절단되거나 제거될 수 있는, 분해가능 보호기에 결합되었을 수 있다. 이러한 실시형태에서, 각각의 제1 이관능성 화합물의 이차 아미노기는 또 다른 이차 아미노기로 전환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 이관능성 화합물의 아미노기는 일차 아미노기이고 이차 아미노기로 전환되며, 연속적으로 또는 동시에 삼차 아미노기로 전환된다. 예시로서, 적합한 보호기로 보호되는, 이차 아미노기가 형성될 수 있다.
제1 및 제2 이관능성 화합물 사이의 반응의 결과로서, 말단 아미노기 및 말단기 A를 포함할 수 있는, 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자가 형성될 수 있다. 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자는 예를 들어 일반 구조 화학식 (VI)를 가질 수 있다:
Figure pct00009
이 화학식에서, Q, A 및 Z는 상기에 정의된 바와 같다. R2'은 적어도 실질적으로는 펩티드 핵산 전구체 분자의 잔여 구조 및 관능기에 영향을 미치지 않거나 이를 훼손하지 않으면서 R2로 전환될 수 있는 모이어티를 나타낼 수 있다. 도식적인 예시로서, R2'의 R2로의 전환 시, 분자 내에 존재하는 임의의 보호기, 예컨대 에스테르, 아미드 또는 에테르는 대응하는 유리 관능기, 예를 들어, 카르복실산, 아민 또는 하이드록실기로 전환될 수 있는 반면, 분자 내 임의의 비-보호 관능기 또는 다른 모이어티는 달라지지 않는다. 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자의 말단 아미노기와 말단기 A를 연결하는 지방족 모이어티는 선택적으로 N, O, S, Se 및 Si와 같은 헤테로원자를 0 내지 3개 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자는 일반 구조 화학식 (VIa)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00010
이 화학식에서, n, A, Z 및 R2'는 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명에 따른 PNA 단량체를 형성하는 방법 도중에 핵염기가 추가로 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자에 결합한다. 그로써, 펩티드 핵산 단량체가 형성될 수 있다. 상기에서 이미 설명한 바와 같이, 일부 실시형태에서, PNA 단량체 전구체 분자의 주쇄는, 그에, 또는 그의 위치에, 핵염기가 연결되는 헤테로원자를 갖는다. 이러한 실시형태에서, 헤테로원자는 예를 들어 N 또는 Si일 수 있다. 연결 모이어티는 핵염기를 보유하는 헤테로원자의 위치에 결합하여, 그로 인해 펩티드 핵산 단량체의 측쇄를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵염기를 주쇄에 연결하는 측쇄의 일부분으로 전환되는 연결 모이어티의 일부분은 2개의 탄소 원자의 길이를 갖는다. 상기에서 이미 지시된 바와 같이, 핵염기를 주쇄에 연결하는 측쇄는 아미드 결합을 통해 주쇄에 연결될 수 있다. 따라서, 이러한 아미드 결합은 측쇄를 주쇄의 헤테로원자에 연결하는 방법 도중에 형성될 수 있다. 이러한 실시형태에서 헤테로원자는 일반적으로 질소 원자이다.
최종 PNA 단량체의 주쇄가 단계적으로 형성되는 실시형태에서, 중간체 화합물이 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 이관능성 화합물의 아미노기와 제2 이관능성 화합물의 관능기의 반응 시에 이러한 중간체 화합물이 형성된다. 제2 이관능성 화합물은 또한 지방족 화합물이다. 형성된 중간체 화합물은 말단 아미노기 및 말단 관능기 G를 포함할 수 있다. 이러한 2개의 기는 지방족 모이어티에 의해 연결될 수 있다. 나아가, 말단 아미노기는 적어도 2개의 탄소 원자의 주쇄 및 선택적으로 0 내지 약 2 헤테로원자 (상동)를 갖는 지방족 모이어티로 치환된다. 적어도 2개의 탄소 원자를 갖는 후자의 알킬 주쇄는, 일부 실시형태에서 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있는 극성 두부기 Z를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 중간체 화합물의 말단 관능기 G는 핵염기를 보유하는 연결 모이어티가 연결되는 최종 PNA 단량체 내 헤테로원자의 위치를 정의할 수 있다.
관능기 G는 또한 다른 모이어티로 전환될 수 있고, 그로 인해 최종 PNA 단량체 내 각각의 헤테로원자의 위치에 대응하는, 위치가 도입될 수 있다. 관능기 G는 제3 이관능성 화합물의 관능기와 반응할 수 있다. 제3 이관능성 화합물 또한 지방족 화합물이다.
그 결과, 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자가 형성될 수 있다. 그로 인해 중간체 화합물의 말단 관능기 G는 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자의 헤테로원자로 전환될 수 있다.
상기에 상세히 설명된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 펩티드 핵산 단량체는 일반 구조 화학식 (I)(상동)에 의해 정의된다. 이러한 펩티드 핵산 단량체를 형성하는 방법에서, 펩티드 일반 구조 화학식 (III)의 핵산 전구체 분자가 사용될 수 있다:
Figure pct00011
상기에 설명된 바와 같이, R2'는 R2와 동일할 수 있거나, 예를 들어 R2의 차폐 형태일 수 있고, R2'는 R2로 전환가능하다. 유사하게, 상기 화학식 (III)에서 A'은 또한 A와 동일할 수 있거나 A의 차폐 형태일 수 있고, A'은 A로 전환가능하다. 또한, Z'은 Z와 동일할 수 있거나, 예를 들어 Z의 차폐 형태일 수 있고, Z'은 로 전환가능하다. n은 상기에 정의된 바와 같은 정수이다.
펩티드 핵산 전구체 분자는 일반 화학식 (IV)의 화합물과 반응하여 일반 구조 화학식 (I)의 펩티드 핵산 단량체를 형성할 수 있다 (상기 참조).
Figure pct00012
상기 화학식 (IV)에서 Y는 -COOH, -COOR3, -COX, -COSR3, -CN, -CONH2, -CONHR3 또는 -CONR3R4일 수 있다. -COOR3, -COSR3, CONHR3 및 -CONR3R4에서 모이어티 R3과, -CONR3R4에서 모이어티 R4는 독립적으로 선택된 H, 또는 O 내지 약 3개의 헤테로원자, 예컨대 N, O, S, Se 및 Si를 포함할 수 있는 지방족, 지환족, 방향족, 및 아릴지환족기이다. -COX에서 X는 할로겐 원자, 예를 들어 F, Cl, Br 또는 I이다. R1은 H, 실릴기 또는 메틸기일 수 있다. E는 개별적으로 선택된 핵염기일 수 있다.
일부 실시형태에서, 펩티드 일반 구조 화학식 (III)의 핵산 전구체 분자는 일반 화학식 (VII)의 화합물로부터 수득될 수 있다:
Figure pct00013
일반 화학식 (VII) 화합물의 일차 아미노기는 예를 들어 화학식 L-CH2-A'의 화합물과 반응할 수 있는데, 상기 식에서 L은 아미노기와의 반응에 적합한 이탈기이다. 그로 인해 일반 화학식 (III)의 화합물이 수득될 수 있다.
일부 실시형태에서, 일반 화학식 (VII)의 화합물은 일반 화학식 (VIIa)의 화합물일 수 있다:
Figure pct00014
일부 실시형태에서, 펩티드 일반 구조 화학식 (III)의 핵산 전구체 분자는 일반 화학식 (VIII)의 화합물로부터 수득될 수 있다:
Figure pct00015
이 화학식 (VIII)에서, 모이어티 R7은 분자로부터 편리하게 제거될 수 있는 적합한 보호기일 수 있다 (예를 들어, 상기 참조). R2', A', Z' 및 n은 상기에서 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 일반 화학식 (VIII)의 화합물은 일반 화학식 (VIIIa)의 화합물일 수 있다:
Figure pct00016
일부 실시형태에서, 펩티드 일반 구조 화학식 (III)의 핵산 전구체 분자는 일반 화학식 (V)의 중간체 화합물로부터 수득될 수 있다:
Figure pct00017
이 화학식 (V)에서, R2', Z' 및 n은 상기에서 정의된 바와 같다. 모이어티 G는 포밀기, 할로겐메틸렌기, 아세탈, 티오아세탈 및 셀레노아세탈 중 하나일 수 있다. 일부 실시형태에서, 일반 화학식 (V)의 화합물은 일반 화학식 (Va)의 화합물일 수 있다:
Figure pct00018
일반 화학식 (V)의 중간체 화합물과 글리신 또는 글리신의 에스테르와 반응시킴으로써, 일반 구조 화학식 (III)의 핵산 전구체 분자가 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 PNA 분자는 생리적 조건 하에서 적어도 실질적으로 변하지 않는 지방족 골격을 포함한다. 지방족 골격은 전형적으로 PNA 분자의 단량체 소단위들을 연결하는 아미드기를 포함한다. 이들 아미드 결합의 아미노 부분은 하나의 단량체 소단위 내에 포함될 수 있는 반면, 카르보닐 부분은 다른 단량체 소단위 내에 포함될 수 있다. 일반적으로 PNA 분자의 지방족 골격의 하나 이상의 아미드기가 지방족 모이어티에 의해 연결된다. 따라서, 이러한 지방족 모이어티는 전형적으로 PNA 분자의 골격 내에 포함된다. 이러한 지방족 모이어티는 0 내지 3개의 헤테로원자, 예컨대 N, O, S, Se 및 Si를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 PNA 분자에서, 하나 이상의 아미드기의 아미노 부분이 적어도 2개의 탄소 원자의 알킬 측쇄로 치환된다. 이러한 알킬 쇄는, 일부 실시형태에서 수성 용액 중에서 전하, 예를 들어 양전하 또는 음전하를 띨 수 있는, 극성 두부기 Z를 갖는다. 일부 실시형태에서, 극성 두부기 Z는 생리적 조건 하에서 전하를 띨 수 있다 (상동). 극성 두부기 Z는 예를 들어 아미노기, 구아니딘기 또는 이미다졸기일 수 있다.
본 발명에 따른 PNA 분자는 복수 개의 펩티드 핵산 단량체들을 반응시키는 것을 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 이러한 방법은 또한 고체 지지체 상에 성장하는 PNA 분자를 고정화하는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, PNA 분자의 형성에 있어서, 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법뿐만 아니라, 임의의 표준 방법이 사용될 수 있다. 본 방법의 임의의 단계 또는 단계들의 조합이 또한 자동화 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 PNA 분자는 일반 구조 화학식 (II)으로 표시될 수 있는 단량체 단위를 가질 수 있다:
Figure pct00019
일반 화학식 (II)에서, Q는 약 2 내지 약 12개의 탄소 원자 길이의 주쇄를 포함하는 지방족 다리이다. 부가적으로, 이는 선택적으로 0 내지 약 2개의 헤테로원자, 예컨대 N, O, S, Se 및 Si를 포함할 수 있다. E는 개별적으로 선택된 핵염기이다. Z는, 일부 실시형태에서 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있는, 개별적으로 선택된 극성 두부기이다.
일부 실시형태에서, 일반 화학식 (V)의 화합물은 일반 화학식 (IIa)의 화합물일 수 있다:
Figure pct00020
일반 화학식 (IIa)에서, n은 2 내지 약 9, 예컨대 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 6, 약 4 내지 약 7 또는 약 4 내지 약 6, 예컨대 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8인 개별적으로 선택된 정수이다.
도식적인 예시로서, 본 발명에 따른 PNA 분자는 하기와 같이 나타낼 수 있는하부구조를 포함할 수 있다:
Figure pct00021
상기 예시적인 하부구조에서, 모이어티 E1 내지 E3은 개별적으로 선택된 핵염기이다. Z1 내지 Z3은 개별적으로 선택된 극성 두부기이다. 이러한 극성 두부기는 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있다. R11 내지 R13은 H, 실릴기 또는 메틸기일 수 있는 개별적으로 선택된 모이어티이다.
PNA 분자는 일반적으로 수성 용액 중에서 용해도가 불량하다. 그러므로 당해 분야의 숙련자는 일반적으로 극성 두부기 Z의 존재가 통상적인 PNA 분자와 비교했을 때 본 발명에 따른 PNA 분자의 용해도를 실질적으로 개선하는 효과를 나타냄을 인식할 것이다.
PNA 분자는 서열-특이적인 방식으로 상보적인 DNA 및 RNA 표적 모두에 혼성화하여 왓슨-크릭 수소 결합 모식도에 따른 PNA/DNA 및 PNA/RNA 두가닥 구조를 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이 또한 본 발명의 PNA 분자에 적용된다. DNA와는 달리, PNA는 평행 또는 역평행 방식으로 결합할 수 있다. 그러나, 역평행 결합이 평행 결합보다 약간 더 선호되며 더 높은 열적 안정성을 갖는다.
일반적인 PNA로서, 본 발명에 따른 PNA 분자는 다양한 응용에 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 분자생물학 및 유전공학에서 분자적 도구로서 제공될 수 있고, 또는 유전자 전사를 억제함으로써, 즉 전형적으로 안티센스 응용에서 유전자-표적 약물의 개발뿐만 아니라 치료적 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들은 또한 다양한 응용에서 각각의 중합효소에 의해 핵산 프라이머, 특히 DNA 프라이머의 신장을 억제하는데 사용될 수 있다. 다른 예시로서, 이들은 진단 목적으로 또는 바이오센서의 개발에 사용될 수 있다. 또한, 이들은 펩티드, 약학적 화합물 또는 분자 추척자를 플라스미드 벡터에 연결하기 위한 연결기로 사용될 수 있다.
본 발명이 용이하게 이해되고 실행될 수 있도록 하기 위해, 이제 특정 실시형태가 하기 비-제한적인 실시예에 의해 기술될 것이다.
본 발명은 신규한 관능성 PNA 단량체 및 이 PNA 단량체를 형성하기 위한 효과적인 합성 방법을 제공한다.
본 발명은 비-제한적인 실시예 및 첨부된 도면과 함께 고려될 때 상세한 설명에 관하여 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1은 N-(2-아미노에틸)글리시닐 (aeg) PNA 및 다른 PNAs의 구조를 도식적으로 나타낸다. A: aegPNA; B: Cα-치환된 PNA; C: Cγ-치환된 PNA; D: Nγ-치환된 PNA.
도 2는 AP-PNA 및 GP-PNA 단량체의 합성을 위한 전반적인 전략을 나타낸다. 중간체 화합물 1과 반응할 수 있는 적합한 핵염기-함유 화합물의 예시가 묘사된다 (여분의 예시에 대해서는 도 6 참조).
도 3은 아실 보호된 카르복시메틸 핵염기의 합성을 나타낸다: (a) 벤조일 클로라이드/피리딘; (b) 에틸 브로모아세테이트, NaH/DMF; (c) NaOH, H2O; (d) 아이소부티릴 클로라이드, DIEA/DMF; (e) 에틸 브로모아세테이트, Na2CO3/DMF.
도 4는 AP-PNA 단량체의 합성을 나타낸다: (a) (BOC)2O, DCM, 0℃; (b) 글리시돌, THF, 45℃; (c) Fmoc-OSu, ACN; (d)NaIO4, THF/H2O; (e) H-Gly-OMe, NaCNBH3, THF/MeOH; (f) BCH2COOH, HATU, DIEA, DMF; (g) (i) NaOH; (ii) KHSO4. B = T, 티민; C, N4-벤조일시토신; A, N6-벤조일아데닌; G, N2-아이소부티릴구아닌.
도 5는 aegPNA 단량체의 합성을 나타낸다: (a) t-부틸 브로모아세테이트, DCM; (b) i. Fmoc-Cl, TEA, DCM; ii. 희석 HCl; (c) 핵염기, HATU, NMM, DMF; (d) 95% TFA, DCM. B = T, 티민; C, N4-벤조일시토신; A, N6-벤조일아데닌; G, N2-아이소부티릴구아닌.
도 6은 본 발명에 따른 PNA 단량체를 형성하기 위해 핵염기를 도입하는데 사용될 수 있는 적합한 화합물의 추가적인 예시를 나타낸다. 도 6A: 2-(아데닌-9-일)프로파노산, 화학초록집 (Chemical Abstracts) No. 87620-89-1; 도 6B: 2-아미노-9H-퓨린-9-아세트산, CAS No. 933477-63-5; 도 6C: 9-카르복시메틸하이포크산틴, CAS No. 6298-53-9; 도 6D: 2-아미노-1,6-다이하이드로-6-티옥소-9H-퓨린-9-아세트산, CAS-No 156006-84-7; 도 6E: 2-아미노-1,6-다이하이드로-6-옥소-9H-퓨린-9-아세트산, CAS-No 281676-77-5; 도 6F: 3,4-다이하이드로-5-메틸-4-옥소-2-티옥소-1(2H)-피리미딘아세트산, CAS-No 84768-19-4; 도 6G: 4-아미노-a-메틸-2-옥소-1(2H)-피리미딘아세트산, CAS No. 102716-43-8; 도 6H: 3,4-다이하이드로-5-메틸-2,4-다이옥소-1(2H)-피리미딘아세트아미드; CAS No. 195819-71-7. 바람직하다면, 잠재적 반응성 관능기, 예컨대 도 6A, 도 6B, 도 6D, 도 6E 또는 도 6G에서의 아미노기가 적합한 관능기에 의해 보호될 수 있다.
도 7은 PNA/DNA 및 PNA/RNA 두가닥의 열적 안정성 (Tm/℃)을 나타낸다. 도 7A 내지 7D에 사용된 PNA 분자는 각 표의 상부에 나타낸 바와 같이, PNA 분자의 지방족 골격 내 아미드기의 아미노 부분에 결합된 알킬 쇄의 길이가 다르다. 도 7E에서 선택된 AP- 및 GP-PNA 분자 (6-, 5-, 4-, 3- 또는 2-C 스페이서를 가짐)가 사용되었다.
도 8은 6 μM의 농도에서 aegPNA, AP-PNA (A) 또는 GP-PNA (B)와 역-평행 DNA 사이의 두가닥의 원평광 이색성 (CD) 스펙트럼을 나타낸다. 도 8A: 1: aegPNA/DNA; 2: AP-PNA 6-5/DNA; 3: AP-PNA 6-4/DNA; 4: AP-PNA 6-3/DNA; 5: AP-PNA 6-2/DNA; 6: AP-PNA 6-1/DNA; 도 8B: 1: aegPNA/DNA; 2: GP-PNA 6-5/DNA; 3: GP-PNA 6-4/DNA; 4: GP-PNA 6-3/DNA; 5: GP-PNA 6-2/DNA; 6: GP-PNA 6-1/DNA.
도 9는 0.5 μM의 농도로 HeLa 세포와 24시간 동안 인큐베이션된 플루오레세인 (FAM)-표지 aegPNA (도 9A), AP-PNA (도 9B), GP-PNA (도 9C) 및 TAT 도메인 (도 9D)의 유입의 형광 공초점 현미경 이미지를 나타낸다. DIC 및 형광 이미지의 중첩.
도 10은 예를 들어 형성된 AP-PNA 및 GP-PNA 올리고머의 예측 및 측정 질량을 나타내는 표이다.
실시예
재료 및 방법
사용된 모든 용매는 분석 등급이었다. 피리딘, DMF 및 DCM을 1 또는 2일간 무수 Na2SO4를 사용하여 건조시키고, 희석한 후 사용 전에 분자체 상에 보관하였다. NaH를 건조 헥산으로 세척하고 사용 전에 진공 하에 건조시켰다. 구아닌을 0.5 M NaOH에 용해시킨 후 이어서 1 M HCl을 사용해 용액의 pH를 pH 10으로 조정함으로써 정제하였다. 형성된 백색 침전물을 회수하고, 건조시킨 후 사용 전애 미세 분말로 분쇄하였다. 알드리치사, 머크사 및 랭카스터사에 의해 제공된 모든 다른 화학물질은 여분의 정제 없이 사용하였다.
콤비섬광 (CombiFlash) 시스템상에서 상업적인 실리카 칼럼 (Redisep)을 사용하여 섬광 크로마토그래피를 수행하였고, 실리카 겔 60 (랭카스터사, 0.040-0.063 mm)을 사용하여 수동 분취 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. PDA-100 광다이오드 어레이 검출기 및 C18 역상 칼럼 (아질리언트사, 4.6x150 mm)이 구비된 디오넥스 (DIONEX) 시스템상에서 분석 HPLC를 수행하였다. C18 반-분취 칼럼을 이용하는 쉬마츠 (SHIMADZU) 시스템상에서 반-분취 HPLC를 수행하였다. 2개 용매의 구배 혼합물을 사용하여 피분석물을 용출하였다: 용매 A는 0.045% TFA를 함유하는 희석된 탈이온수이고 용매 B는 0.04% TFA를 함유하는 희석된 탈이온수 중 90% ACN이다. 이동상 유속은 분석 HPLC의 경우에는 1 mL/분이고, 반-분취 HPLC의 경우에는 2.5 mL/분이며, 분리 온도는 23℃였다.
브루커 (Bruker) DRX-400 (400 MHz) NMR 분광광도계 상에서 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 기록하였다. 표준 ESI/APCI 소스가 구비된 탁상형 (bench-top) 이온 트랩 질량 분석기 (FINNIGAN LCQ DECA XP MAX)를 사용하여 ESI/APCI 질량 스펙트럼을 기록하였다. MS 반사기 양이온 방식으로 작동하고 α-시아노-4-하이드록시신남산을 매트릭스로 사용하는 4800 MALDI TOF/TOF 분석기 상에서 PNA 올리고머의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 기록하였다.
300 Bio UV-가시광선 분광광도계 상에서 열적 변성 연구 (Tm)를 수행하였다. 시그마 프롤리고사 (SIGMA PROLIGO)로부터 DNA 올리고를 구입하였다. 100 mM NaCl, 10 mM 소듐 포스페이트 및 0.1 mM EDTA (pH 7.0)를 포함하는 완충 용액 중에서 올리고머를 혼성화하였다. DNA, PNA, AP-PNA 및 GP-PNA 올리고머의 농도는 각각 2 μM이었다. 시료를 먼저 90℃에서 5분간 가열한 후, 이어서 측정 전에 실온으로 서서히 냉각시켰다. UV-흡광도는 분당 0.5℃의 속도로 85 내지 15℃로 냉각하면서 260 nm에서 측정하였다.
260 nm에서 PNA 용액의 흡광도 (A 260 )를 측정함으로써 PNAs의 농도를 정량하였다. 파나젠 (Panagene, http://www.panagene.com/source/?doc=Support_Me01_04)에 의해 권고되는 바와 같이 단일 계수의 몰흡광계수 (ε260)에 대한 값은 다음과 같다: ε260 (A) = 13.7 mL/(μmole·cm), ε260 (C)= 6.6 mL/(μmole x cm), ε260 (G) = 11.7 mL/(μmole x cm), ε260 (T) = 8.6 mL/(μmole x cm). PNA의 몰흡광계수는 올리고머를 포함하는 개별적인 염기의 몰흡광계수의 합으로서 표시된다. ε260 = Σ εi x ni, (εi = 염기의 몰흡광계수, ni = 염기의 개수).
어플라이드 포토피직스 키라스캔 (Applied™ photophysics Chirascan) 분광광도계 상에서 CD 스펙트럼을 기록하였다. 각 스펙트럼은 1 mm 광로 (optical path) 길이로 25℃에서 기록된, 5회 스캔의 평균이다. 100 mM NaCl, 10 mM 소듐 포스페이트, 및 0.1 mM EDTA (pH 7.0)를 함유하는 완충 용액 중에 시료를 보관하였다. 시료를 90℃에서 5분간 가열한 후, 이어서 CD 스펙트럼을 측정하기 전에 실온으로 서서히 냉각시켰다.
HeLa 세포의 배양 및 플루오레세인-표지 aegPNA, AP-PNA, GP-PNA 올리고머 및 Tat 펩티드로의 형질감염은 이전에 공개된 프로토콜에 따라 수행하였다 (Janowski, B. A., et al., Nature Protocols (2006) 1, 436; Shiraishi, T., &. Nielsen, P.E., Nature Protocols (2006) 1, 633). HeLa 세포를 항생제 무함유 하이클론 (Hyclone) 글루코스 DMEM/고 글루코스 배지를 포함하는 75-㎠ 배양 플라스크에서 5% CO2의 대기 하 37℃에서 성장시키고 DMEM 배지 중에서 6-웰 커버글라스 슬라이드 (6-well Lab-Tek chambered coverglass slides) 상에 웰당 100,000 세포씩 도말한 후 형질감염 전에 2일간 배양하였다. 1x PBS 완충액에서 200 μM 스톡 용액을 가온된 배지로 희석하여 올리고머 용액을 준비하였다. 세포 배지를 버리고 세포를 1X PBS 완충액으로 세척한 후 이어서 상기에서 준비된 0.5 μM 농도의 올리고머와 함께 5% CO2 대기 하, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거한 후 세포를 1x PBS 완충액 (2 mL x 3)으로 세척하고 37% 파라포롬알데하이드로 고정하였다. 세포를 쿨 스냅큐 (Cool SNAPHQ) 카메라가 장착된 올림푸스 1X51로 세포의 이미지를 관찰하고 메타모프 소프트웨어 (Metamorph software, Molecular Devices)를 이용해 분석하였다.
단량체 합성
N 4 - 벤조일시토신 (6). 벤조일 클로라이드 (2.3 mL, 20 mmol)를 건조 피리딘 중의 시토신 (1.1 g, 10 mmol)의 교반된 현탁액에 30분에 걸쳐서 한 방울씩 첨가하고, 실온에서 추가로 4시간 동안 계속 교반하였다. 소량의 메탄올을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 고형물을 여과하고, EtOH로 세척한 후 진공 중에 건조시켜 1.92 g의 목적 생성물 6 (90%)을 수득하였다.
1- 에톡시카르보닐메틸 - N4 - 벤조일 시토신 (7). 0℃에서 건조 DMF (100 mL) 중의 6 (1.92 g, 9 mmol)의 교반된 현탁액에, NaH (0.43 g, 18 mmol)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 에틸 브로모아세테이트 (1.5 g, 9 mmol)를 0℃에서 한 방울씩 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 메탄올 (2 mL)을 첨가하여 반응을 정지시키고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 수득된 잔사를 DCM에 용해시키고, 물 (3 x 50 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 용매를 증발시켜 백색 고형물로서 7 (1.38 g, 54%)을 수득하였다.
1- 카르복시메틸 - N4 - 벤조일 시토신 (3). 화합물 7 (1.38 g, 4.6 mmol) 및 NaOH (0.36 g, 9.2 mmol)를 물 (10 mL)에 용해시키고 그 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 pH를 1 M HCl을 이용하여 3으로 조정하였다. 형성된 침전물을 여과에 의해 분리하고, 5 mL 물로 세척한 후 진공 하에서 건조시켜 백색 고형물로서 3 (1.16 g, 92%)을 수득하였다; ESI-MS m/z 274 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, D2O, 나트륨염): δ7.78 (d, 1H, J= 7.2Hz), 7.75 (d, 2H, J= 7.2H), 7.55 (t, 1H, J= 7.2Hz), 7.39 (t, 2H, J= 7.2Hz), 7.19 (d, 1H, J= 7.2Hz), 4.31 (s, 2H).
N 6 - 벤조일아데닌 (8). 벤조일 클로라이드 (1.3 mL, 11 mmol)를 건조 피리딘 중의 아데닌 (1.35 g, 10 mmol)의 교반된 현탁액에 30분에 걸쳐서 한 방울씩 첨가하고, 추가 3시간 동안 100℃에서 교반을 계속한 후, 반응 혼합물을 밤새 실온에 놔두었다. 메탄올을 이용해 반응을 정지시킨 후 용매를 감압 하에 제거하였다. 뜨거운 아이소프로판올 중에서 잔사를 분쇄하고 진공 하에서 건조시켜 백색 고형물로서 8을 수득하였다: 수율 2.15 g (90%); MS (+ESI): m/z 240 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, d-DMSO): δ11.50 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.11 (d, 2H, J= 7.2Hz), 7.66 (t, 1H, J= 7.2Hz), 7.58 (t, 2H, J= 7.2Hz).
N 6 - 벤조일 -9- 에톡시카르보닐메틸아데닌 (9). 화합물 8 (2.39 g, 10 mmol)을 건조 DMF (100 mL)에 용해시키고, 0℃로 냉각시킨 후, 수소화나트륨 (0.48 g, 20 mmol)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 30분간 교반하였다. 에틸 브로모아세테이트 (1.22 mL, 11 mmol)를 1시간 동안 한 방울씩 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반을 계속한 후 메탄올 (2 mL)을 이용해 반응을 정지시켰다. 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH; 9.5/0.5)로 정제하여 백색 고형물로서 9를 수득하였다: 수율 1.3 g (40%); MS(+ESI): m/z 326 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ9.02 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 8.05 (d, 2H, J= 7.2Hz), 7.62 (t, 1H, J= 7.2Hz), 7.54 (t, 2H, J= 7.2Hz), 5.06 (s, 2H), 4.31 (q, 2H, J= 7.2Hz), 1.38 (t, 3H, J = 7.2Hz); 13C NMR (400 MHz, CDCl3): 5=166.76, 164.53, 152.96, 152,50, 149.83, 143.22, 133.68, 132.80, 128.89, 127.85, 122.56, 62.53, 44.33, 14.09.
N 6 - 벤조일 -9- 카르복시메틸아데닌 (4). 화합물 9 (1.63 g, 5 mmol) 및 NaOH (0.4 g, 10 mmol)를 물 (20 mL)에 용해시키고 그 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. pH를 1 M HCl을 사용해 3으로 조정하여, 생성물의 침전을 유도하였다. 침전물을 여과로 분리하고, 물로 세척한 후 진공 하에서 건조시켜 백색 고형물로서 4를 수득하였다: 수율 1.4 g (95%); MS(+ESI): m/z 298 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, d-DMSO): δ11.682 (s, 1H), 9.11 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.09 (d, 2H, J = 7.2Hz), 7.67 (t, 1H, J = 7.2Hz), 7.60 (t, 2H, J= 7.2Hz), 5.16 (s, 2H); 13C NMR (400 MHz, CDCl3): 0169.43, 166.34, 152.89, 152,09, 150.29, 145.63, 133.74, 132.98, 128.45, 122.56, 44.88.
N 2 - 아이소부티릴구아닌 (10). 아이소부티릴 클로라이드 (2.02 mL, 19.9 mmol)를 무수 피리딘 (40 mL) 중의 구아닌 (3.02 g, 20 mmol) 및 TEA (1.45 mL, 10.4 mmol)의 교반된 현탁액에 한 방울씩 첨가하였다. 혼합물을 100℃에서 3시간 동안 교반하였다. 메탄올을 이용해 반응을 정지시키고, 고형물을 여과하고, 메탄올로 세척한 후 진공 하에서 건조시켜 10을 수득하였다: 수율 2.67 g (60%); MS (+ESI): m/z 222 [M+H]+.
N 2 - 아이소부티릴 -9- 에톡시카르보닐메틸구아닌 (11). 화합물 10 (2.21 g, 10 mmol) 및 Na2CO3 (2.12 g, 20 mmol)을 건조 DMF 중에 현탁하고, 그 혼합물을 교반 하에 80℃로 가온하였다. 1시간 후 가열을 중지하고, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시킨 후 에틸 브로모아세테이트 (1.22 mL, 11 mmol)를 1시간 동안 한 방울씩 첨가하였다. 여분의 2시간 동안 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 여과하고 고형물을 DCM으로 세척하였다. 여과액을 감압 하에 농축하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피 (DCM/MeOH; 9.5/0.5)로 정제하여 백색 고형물로서 11을 수득하였다: 수율 0.77 g (25%); MS(+ESI): m/z 308 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ11.99 (s, 1H), 8.50(s, 1H), 7.71(s, 1H), 4.80 (s, 2H), 4.26 (q, 2H, J = 6.8Hz), 2.70 (septet, 1H, J = 6.8Hz), 1.31 (t, 3H, J = 6.8Hz), 1.28 (d, 6H, J = 6.8Hz); 13C NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 178.3, 166.9, 155.4, 148.5, 147.6, 139.2, 120.8, 62.3, 44.5, 36.5, 18.9, 14.1.
N 2 - 아이소부티릴 -9- 카르복시메틸구아닌 (5). 화합물 11 (3.07 g, 10 mmol) 및 NaOH (0.8 g, 20 mmol)를 물 (20 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 1 M HCl을 이용해 pH를 3으로 조정하여, 백색 침전물을 수득하였다. 용액을 여과하여 제거한 후, 침전물을 소량의 냉각수로 세척하고 진공 하에서 건조시켜 백색 고형물로서 5를 수득하였다: 수율 2.65 g (95%); MS(+ESI): m/z 280 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, d-DMSO): δ13.32 (s, 1H), 12.06 (s, 1H), 11.64 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 4.88 (s, 2H), 2.74 (septet, 1H, J= 6.8Hz), 1.10 (d, 6H, J= 6.8Hz); 13C NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 180.63, 169.52, 155.29, 149.47, 148.52, 140.78, 120.17, 44.88, 39.38,19.33.
N-1- Boc -1,6- 다이아미노헥산 (12). 100 mL DCM에 용해된 다이-터트-부틸 바이카보네이트 (12.3 g, 0.056 mol)를 150 mL DCM 중의 1,6-다이아미노헥산 (33 g, 0.28 mol)의 용액에 0℃에서 강력한 교반과 함께 4시간 동안 한 방울씩 첨가하였다. 반응물을 실온에서 추가 20분간 교반한 후 물 (4 x 100 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 건조될 때까지 증발시켜 14.3 g의 무색 오일을 수득하였다. 결과는 문헌 (Muller, D., et al., J Org Chem 1997, 62, 411)에서 확인할 수 있다.
1-[N- Fmoc -N-(6-N- Boc - 헥실 )]아미노프로판-2,3- 디올 (14). THF 중의 글리시돌 (4.85 mL, 73 mmol)을 THF 중의 12 (14.3 g, 66 mmol)의 용액에 실온에서 첨가하였다. 반응물을 2일간 실온에서 교반하였다. THF를 감압 하에 제거하고 고형 침전물 13을 여과한 후 DCM으로 세척하였다. 여과물을 농축하여 임의의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. FmocOSu (16.8 g, 0.05 mol)를 3시간의 기간 동안에 0℃에서 13의 용액에 부분적으로 첨가하였다. FmocOSu 첨가 도중에 TEA (7 mL, 0.05 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 후 밤새 실온에서 가온하였다. DCM을 감압 하에 제거하였다. 잔사를 DCM (100 mL)/H2O (100 mL)로 추출하였다. 유기상을 식염수로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 이를 섬광 칼럼 크로마토그래피로 정제하여; 백색 고형물로서 생성물 (9.7 g, 28%)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3): 7.68 (d, 2H), 7.48 (d, 2H), 7.32 (t, 2H), 7.23 (t, 2H), 4.51 (d, 2H), 4.14 (t, 1H), 3.64-2.87 (m, 14H), 1.37 (s, 9H); 13C NMR (CDCl3): 172.3, 158.5, 143.9, 141.4, 127.7, 127.1, 124.6, 120.0, 70.8, 67.1, 63.4, 49.9, 48.8, 47.4, 40.5, 29.9, 28.4, 28.1, 26.3, 25.4.
메틸 N-{2-[N- Fmoc -N-(6-N- Boc - 아미노헥실 )] 아미노에틸 } 글리시네이트 (16). 화합물 13 (2.5 g, 4.87 mmol)을 THF/H2O (10 mL, 5/1)에 용해시킨 후, 이어서 과요오드산 나트륨 (1.15 g, 5.36 mmol) 용액을 한 부분으로 첨가하였다. 혼합물을 15분간 통상의 초음파 중에서 처리한 후 실온에서 여분의 30분간 교반하였다. 그 후에 고형물을 여과로 제거한 후, 여과액을 농축하고 DCM/H2O로 추출하였다. 유기상을 식염수고 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 감압 하에 농축하였다. 이를 그 후에 THF (4 mL)에 용해시키고 MeOH 중의 글리신 메틸 에스테르 염산 (611 mg, 5.36 mmol) 용액에 부분적으로 첨가한 후 실온에서 Et3N (678 μL)를 이용해 pH를 7로 중화시켰다. 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 소듐 시아노보로하이드라이드 (918 mg, 14.61 mmol)를 0℃에서 상기 용액에 부분적으로 첨가한 후, 이어서 아세트산 (279 μL, 4.87 mmol)을 첨가하였다. 이를 실온에서 6시간 동안 교반하였다. H2O (10 mL)를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 유기용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 EtOAc/H2O로 추출한 후, 유기상을 식염수로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 제거한 후, 섬광 크로마토그래피로 정제하여 투명한 황색의 끈끈한 오일로서 1.32 g (49%)의 생성물을 수득하였다; MS (M+H+): 554.53; 1H NMR (CDCl3): 7.67 (d, 2H), 7.48 (d, 2H), 7.31 (t, 2H), 7.23 (t, 2H), 4.45 (d, 2H), 4.14 (t, 1H), 3.69 (s, 3H), 3.16 (m, 2H), 2.98 (m, 4H), 1.36 (s, 9H), 1.35-1.13 (m, 12H); 13C NMR (CDCl3): 172.7, 166.8, 156.0, 143.8, 141.4, 127.7, 127.1, 124.7, 120.0, 79.1, 67.4, 53.1, 48.4, 47.9, 47.3, 44.5, 40.4, 29.1, 28.4, 28.3, 26.4.
AP-PNA 단량체 (에스테르 형태) 17T, 17C, 17A, 17G의 합성을 위한 일반적인 과정
16 (554 mg, 1 mmol)을 DMF (3 mL)에 용해시키고, 카르복시메틸 핵염기 (1 mmol)를 첨가한 후, 이어서 0℃에서 NMM (4 mmol) 및 HATU (1.5 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후에 반응 혼합물을 냉각수 (40 mL)에 부어서 백색 침전물을 형성하였다. 침전물을 여과로 분리한 후 물 및 헥산으로 세척하여 백색 고형물로서 순수한 메틸 에스테르 생성물을 수득하였다.
17T: 수율: 94%; 1H NMR (CDCl3): 7.68 (d, 2H), 7.48 (d, 2H), 7.32 (t, 2H), 7.24 (t, 2H), 6.91 (s, 1H), 4.54-4.44 (m, 4H), 4.13 (t, 1H), 3.71 (s, 2H), 3.64 (s, 3H), 3.40-2.89 (m, 8H), 1.82 (t, 3H), 1.38 (s, 9H), 1.42-1.00 (m, 8H); MS (M+Na+): 743.57.
17A: 수율: 92%; 1H NMR (CDCl3): 8.64 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.94 (d, 2H), 7.66 (d, 2H), 7.47 (d, 2H), 7.43-7.19 (m, 7 H), 4.61-4.52 (m, 4H), 4.13 (t, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.40-2.98 (m, 10H), 1.35 (s, 9H), 1.91-1.00 (m, 8H); MS (M+H+): 833.38.
17C: 수율: 90%; 1H NMR (CDC13): 7.80 (d, 2H), 7.64 (d, 2H), 7.62-7.19 (m, 10H), 4.73-4.07 (m, 6H), 3.61 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.53-2.67 (m, 8H), 1.31 (s, 9H), 1.71-0.95 (m, 8H); MS (M+Na+): 831.56.
17G: 수율: 92%; 1H NMR (CDCl3): 7.67 (d, 2H), 7.55 (s, 1H), 7.49 (d, 2H), 7.37 (t, 2H), 7.28 (t, 2H), 4.48-3.94 (m, 5H), 3.71 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.67-2.71 (m, 9H), 1.35 (s, 9H), 1.31-1.13 (m, 14H); MS (M+H+): 815.12.
AP-PNA 단량체 (산 형태) 18T, 18C, 18A, 18G의 합성을 위한 일반적인 과정
단량체 메틸 에스테르 (1 mmol)를 0℃에서 THF (3 mL) 및 H2O (1 mL)의 혼합물에 용해시켰다. NaOH (2 M, 2 mmol)를 한 방울씩 첨가하고 20분간 이 온도에서 교반하였다. 반응이 종결된 후, 황산수소칼륨 용액 (1 M)을 조심스럽게 첨가하여 혼합물의 pH를 5로 조정하였다. THF를 감압 하에 제거하고, 잔사를 에틸 아세테이트 (30 mL x 3)로 추출하였다. 병합된 유기상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 감압 하에 농축하였다. 동결-건조 후 백색 또는 투명한 황색 분말로서 생성물을 수득하였다.
18T: 수율: 90%; 1H NMR (CDCl3): 7.68 (d, 2H), 7.49 (d, 2H), 7.31 (t, 2H), 7.23 (t, 2H), 6.91 (s, 1H), 4.48-4.04 (m, 5H), 3.46-2.99 (m, 10H), 1.97 (t, 3H), 1.37 (s, 9H), 1.38-0.81 (m, 8H); MS (M+ H+): 705.95.
18A: 수율: 88%; 1H NMR (CDCl3): 8.57 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.89 (d, 2H), 7.64 (d, 2H), 7.45 (d, 2H), 7.36-7.19 (m, 7 H), 4.44-4.11 (m, 6H), 3.67 (s, 2H), 3.38-2.97 (m, 8H), 1.35 (s, 9H), 1.96-0.80 (m, 8H); MS (M+ H+): 819.26.
18C: 수율: 85%; 1H NMR (CDCl3): 7.82 (d, 2H), 7.66 (d, 2H), 7.64-7.19 (m, 10H), 4.73-4.07 (m, 6H), 3.61 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.53-2.67 (m, 8H), 1.31 (s, 9H), 1.71-0.95 (m, 8H), 13C NMR (CDCl3): MS (M+ H+): 795.14.
18G: 수율: 84%; 1H NMR (CDCl3): 7.77-7.19 (m, 9H), 4.48-3.98 (m, 5H), 3.88-2.94 (m, 11H), 1.34 (s, 9H), 1.82-1.80 (m, 14H); MS (M+ H+): 801.18.
t-부틸 N-[2-(N-9- 플루오레닐메톡시카르보닐 ) 아미노에틸 ] 글리시네이트 염산 (19). 건조 DCM (10 mL) 중의 t-부틸 브로모아세테이트 (7.5 ml, 31 mmol)를 0℃에서 1.5시간에 걸쳐서 에틸렌다이아민 (30 mL, 450 mmol)의 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 결과로서 수득된 혼합물을 0℃에서 3시간 동안, 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (20 mL)으로 희석하고, 식염수 (20 mL)로 세척하한 후 [주의: 생성물 또한 물에 가용성임] 이를 DCM (3 X 20 mL)으로 재-추출하였다. 병합된 유기층을 식염수 (20 mL)로 세척하였다. TLC (닌하이드린에 의해 발색됨)는 에틸렌다이아민이 제거되었음을 나타낸다. 유기층을 건조시키고 제거하여 황색 오일 7.55 g (85%)을 수득하였다. 황색 오일을 DCM (25 mL)에 용해시키고 TEA (6 mL)를 첨가하였다. 이 용액에 DCM (50 mL) 중의 Fmoc-Cl (11.2 g) 용액을 0℃에서 2시간에 걸쳐서 한 방울씩 첨가하였다. 첨가 후, 반응물을 추가 12시간 동안 실온에서 교반하였다. 결과로서 수득된 용액을 1 M HCl (2 x 50 mL) 및 식염수 (50 mL)로 세척하였다. 유기층을 건조시키고 제거하여 밝은 확색 오일을 수득하였다. 밤새 냉각 (-20℃)하여 얻은 침전물을 여과로 회수한 후 고형물이 무색이 될 때까지 DCM으로 세척하였다. 여과액을 농축하고 냉각시켜 고형물을 더욱 수득하였다. 병합된 전체 고형물을 진공 하에 건조시켜 백색 고형물로서 5.53 g의 1을 수득하였다: 수율 45%. MS(+ESI): m/z 396.92 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ9.20 (s, 2H), 7.94 (d, 2H, J = 7.2Hz), 7.73 (d, 2H, J= 7.2Hz), 7.57 (t, 1H, J = 5.2Hz), 7.46 (t, 2H, J = 7.2Hz), 7.37 (t, 2H, J = 7.2Hz), 4.38 (d, 2H, J = 6.4Hz), 4.27(t, 1H, J = 6.4Hz), 3.91 (s, 2H), 3.37 (t, 2H, J = 6Hz), 3.03 (t, 2H, J = 6Hz). 13C NMR (400 MHz, DMSO): δ=166.27, 156.77, 144.27, 141.22, 128.32, 127.55, 125.59, 120.13, 83.50, 66.06, 47.79, 47.12, 46.89, 37.11, 28.09.
aegPNA 단량체 (에스테르 형태) 19T, 19C, 19A, 19G의 합성을 위한 일반적인 과정
염기-아세트산 (1 eq)을 건조 DMF 중에 용해시키고, HATU (1.5 eq) 및 NMM (5 eq)을 첨가하였다. 연두색 혼합물을 10분간 0℃에서 교반하였다. 화합물 1·HCl (1 eq)을 한 부분으로 첨가하고 30분간 0℃에서 계속 교반하였다. 반응물을 22시간 동안 실온에서 교반되게 하였다. HPLC 및 ESI MS로 반응의 진행을 관찰하였다. 출발 물질의 소모 후, 반응 혼합물을 진공 하에 농축하고 잔사를 DCM으로 희석한 후, 이를 1 M HCl (3 X 30 ml)로 세척하여 pH를 6 ~ 7로 조정하고 식염수 (1 x 30 ml)로 세척하였다. 유기층을 건조시키고 제거하여 황색 오일을 수득한 후 이를 섬광 칼럼 크로마토그래피 [DCM/MeOH = 9.5/0.5]로 정제하였다. 백색 고형물로서 에스테르를 분리하였다.
aegPNA 단량체 (산 형태) 2OT, 2OC, 2OA, 2OG의 합성을 위한 일반적인 과정
에스테르를 30분간 0℃에서 5 mL 95% TFA로 처리하였다. 혼합물을 12시간 동안 계속 교반하면서 실온으로 가온하였다. 반응의 진행을 HPLC 및 ESI-MS로 관찰하였다. 출발 물질의 소모 후, TFA를 제거하고 잔사를 DCM/H2O로 분리한 후, 수층을 DCM (3 X 30 ml)으로 재-추출하고, 병합된 DCM층을 각각 물 (2 X 50 ml) 및 식염수 (1 x 50 ml)로 세척하였다. 유기 용매를 제거하고 잔사를 진공 하에서 건조시켜 백색 고체로서 산을 수득하였다.
2OT: MS(+ESI) 506.89 [M+H]+, 529.10 [M+Na]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.23 (s, 1H), 7.81 (d, 2H, J = 7.2Hz), 7.61 (d, 2H, J= 7.2Hz), 7.34 (m, 3H), 7.25 (m, 2H), 7.24 (s, 1H), 4.57 (s, 1.2H), 4.40 (s, 0.8H), 4.25 (d, 2H, J = 6.4Hz), 4.13(t, 1H, J = 6.4Hz), 2.66-3.27 (m, 4H), 1.66 (s, 3H). 13C NMR (400 MHz, DMSO): 6=171.24, 170.88, 168.08, 167.68, 164.86, 156.79, 156.54, 151.45, 144.33, 142.58, 141.20, 128.09, 127.54, 125.60, 120.59, 108.53, 65.96, 49.47, 48.14, 47.19, 12.37.
2OC: MS(+ESI) 595.99 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ11.26 (s, 1H), 7.37-8.08 (m, 17H), 4.93 (s, 1.2H), 4.75 (s, 0.8H), 4.35-4.41 (m, 3H), 4.07 (s, 2H), 2.72-3.10 (m, 4H). 13C NMR (400 MHz, DMSO): 5=171.23, 170.89, 167.51, 167.12, 163.75, 156.83, 156.54, 151.65, 144.36, 141.21, 133.66, 133.16, 128.90, 128.08, 127.54, 125.61, 120.59, 96.19, 65.98, 50.10, 48.20, 47.37, 47.18.
2OA: MS(+ESI) 620.18 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ1.126 (s, 1H), 7.37-8.08 (m, 17H), 4.93 (s, 1.2H), 4.75 (s, 0.8H), 4.35-4.41 (m, 3H), 4.07 (s, 2H), 2.72-3.10 (m, 4H). 13C NMR (400 MHz, DMSO): 6=171.28, 170.77, 167.38, 166.90, 156.90, 156.61, 151.96, 145.97, 144.32, 141.21, 133.76, 132.98, 128.96, 128.08, 127.52, 125.57, 120.60, 65.98, 49.64, 48.18, 47.42, 47.20, 44.76.
2OG: MS(+ESI) 602.15 [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ1.198 (s, 1H), 11.56 (s, 0.5H), 11.49 (s, 0.5H), 7.24-7.82 (m, 10H), 4.04 (s, 1.2H), 4.88 (s, 0.8H), 4.16-4.29 (m, 3H), 3.94 (s, 2H), 2.26-3.42 (m, 5H), 1.03 (d, 6H, J = 6.0Hz). 13C NMR (400 MHz, DMSO): δ=180.59, 171.26, 170.85, 167.46, 166.92, 156.84, 155.334, 148.37, 144.32, 141.23, 128.07, 127.51, 125.57, 125.50, 120.59, 65.97, 48.30, 47.38, 47.20, 44.55, 35.12, 19.31.
올리고머 합성
AP-PNA 올리고머 조립을 위한 일반적인 과정
Fmoc/아실/Boc 또는 Fmoc/Bhoc/Boc 보호기 전략을 이용하는 링크 (Rink) 아미드 PEGA 수지 상에서 PNA 올리고머를 조립하였다. 50 mg Fmoc-링크 아미드 PEGA 수지를 2시간 동안 3 mL의 DMF/DCM (5/1)으로 팽창시켰다. Fmoc 기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 탈보호시키고 반응 용기를 5분간 흔들어주었다 (2회 반복). 수지를 DMF, DCM으로 세척한 후 카이저 검사 (Kaiser test)로 모니터링하였다. 단량체 (aegPNA 또는 AP-PNA)를 하기 두 방법에 따라 활성화시켰다. 방법 A: 단량체 (2 eq), PyBOP (2 eq) 및 DIEA (10 eq) 및 방법 B: 단량체 (2 eq), HATU (2 eq) 및 DIEA (10 eq) 실온에서 5분간. 유입되는 단량체가 일차 아민 상에서, 즉 aegPNA 단량체에 결합하는 경우에는 방법 A를 사용하였다. 반면, 유입되는 단량체가 이차 아민, 즉 AP-PNA 단량체에 결합하는 경우에는 방법 B를 사용하였다. 활성화된 혼합물을 Fmoc-탈보호된 수지에 직접 첨가하고 그 혼합물을 실온에서 4 또는 5시간 동안 교반한 후, 이어서 DMF/DCM으로 세척하고 닌하이드린 검사로 조사하였다. 완전한 서열이 조립될 때까지 Fmoc 탈보호 및 단량체 결합 주기를 반복하였다. 최종 Fmoc 탈보호 후, 말단 아민을 DMF 중의 5% 무수 아세트산 첨가에 의해 캡핑하고 그 혼합물을 15분간 교반하였다. 수지를 DMF/DCM으로 완전히 세척하고 진공 하에서 건조하였다. 건조 수지에 2 mL 95% TFA (2.5% TIS, 2.5% H2O)를 첨가하여 수지로부터 절단하고 수지 현탁액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 절단 칵테일을 여과하고 수지를 TFA (1 mL X 2)로 세척하였다. 15 mL의 냉각 다이에틸에테르를 첨가하여 병합된 여과액을 침전시키고, 원심분리하여 백색의 조 고형물을 수득하였다. 백색의 조 고형물을 밤새 동결-건조하였다. Fmoc/아실/Boc 보호기 전략을 이용하여 합성된 PNA에 대해서는, 건조된 고형물을 2 mL의 35% 암모니아 용액에 용해시키고 42℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 암모니아 용액을 건조시키고 그 결과로 수득된 잔사를 H2O에 재용해하고 반-분취 역상 HPLC로 정제하였다. Fmoc/Bhoc/Boc 보호기 전략을 이용하여 합성된 PNA에 대해서는, 암모니아 처리가 요구되지 않으며 TFA 절단 과정 후 조 생성물을 직접 HPLC로 정제하였다. 예상되는 생성물을 MALDI-TOF 질량 분광기로 검출하였다. 이어서 생성물을 동결-건조하여 백색 분말을 수득하였다. 모든 AP-PNA 올리고머에 대해 예상 및 관측된 질량을 도 10에 요약하였다.
AP-PNA 올리고머를 GP-PNA 올리고머로 전환시키는 일반적인 과정
순수 건조된 AP-PNA 올리고머 및 N,N'-비스Boc-S-메틸티오우레아 (아미노기당 10 eq)를 에펜도르프 튜브 내에서 50 μL DMF에 용해시키고, 트라이에틸아민 (아미노기당 2 eq)을 투명한 용액에 첨가하였다. TEA/ TFA 염으로 일부 침전물이 석출되었다. 이어서 혼합물을 42℃에서 밤새 방치한 후 DMF를 동결-건조에 의해 제거하고 건조 잔사를 헥산 (30 μL X 3 )으로 세척하여 과량의 N,N'-비스Boc-S-메틸티오우레아를 제거하였다. 그 후에 결과로 수득된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 95% TFA로 처리한 후, 이를 H2O로 희석하여 반-분취 역상 HPLC로 정제하였다. 예상되는 생성물을 MALDI-TOF 질량 분광기로 검출하였다. HPLC 분획을 동결-건조하여 백색 분말을 수득하였다. 모든 GP-PNA 올리고머에 대해 예상 및 관측된 질량을 도 10에 요약하였다.
본 발명자들은 관능성 두부기를 갖는 펩토이드 측쇄가 aegPNA 골격의 γ-질소에 도입되어 있는 새로운 유형의 PNA를 탐구하였다. 도식적 구조를 도 1D에 나타내었다. 이러한 변형은 키랄 중심을 생성하지 않으며, 두부기는 아민 또는 구아니딘 또는 다른 관능기일 수 있다. 본 발명자들의 고안은 다가양이온기, 특히 구아니디노기가 다수의 세포-투과성 중합체 화합물의 세포 내 유입을 매개하는데 결정적인 역할을 담당하고 (Nagahara, H., et al., Nat Med (1998) 4, 1449; Wender, P.A., et al., Proc Natl Acad Sd USA (2000) 97, 13003), 도입된 양전하가 또한 수 용해도를 증가시킬 수 있다 (Nielsen, P.E., et al., Angewandte Chemie International Edition in English (1996) 35, 1939)는 동일한 이유를 근거로 하였다. 지금까지, γ-질소-변형 PNA에 대해 단 하나의 연구만이 보고되었는데 (Haaima, G., et al., New Journal Of Chemistry (1999) 23, 833), 닐센 (Nielsen) 그룹은 aegPNA보다 변형된 단량체 단위당 1.5 내지 4.5℃의 낮은 열적 안정성을 가짐에도 불구하고 γ-질소 메틸화 PNA가 여전히 상보적 올리고뉴클레오티드 표적에 결합할 수 있고 역평행 방향으로 DNA에의 결합을 위한 aegPNA의 상대적 선호도가 또한 Nγ-메틸화의 정도에 따라서 Nγ-메틸화 DNA에 대해 감소하거나 심지어는 완벽히 파괴됨을 발견하였다 (Haaima, et al., 1999, 상동). 본 발명자들은 2가지 유형의 PNA 유사체, 다양한 길이의 펩토이드 측쇄를 갖는 아미노펩토이드-PNA (AP-PNA) 및 구아니디노펩토이드-PNA (GP-PNA)를 고안하고, 합성하여 평가하였다. 본 발명자들은 나아가 두부기와 골격 사이의 스페이서 길이가 상보적 DNA에의 결합에 있어서 이들 Nγ-변형된 PNAs의 열적 안정성을 결정하는데 결정적으로 중요한지, 즉, 스페이서 길이가 이들 PNA 유사체에 대해 2 내지 6개 원자로 증가하는 경우 결합 친화도가 증가하는지를 관찰하였다. 특히, 6-원자-스페이서 AP-PNA 또는 GP-PNA 단량체를 함유하는 PNA 올리고머는 비변형된 aegPNA의 열적 안정성과 동등한 수준의 열적 안정성을 갖는 역평행 상보적 DNA에 결합하고 역평행 DNA 올리고뉴클레오티드에 대한 우선적 결합 역시 대부분 보존된다. 가장 중요하게는, 6개 구아니디노-펩토이드 변형을 갖는 도데카머 PNA가 우수한 세포 투과성을 갖는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 서열 내에 하나 이상의 이러한 AP-PNA 또는 GP-PNA 단량체 단위를 포함하는 PNA 올리고머의 합성, 혼성화, CD 분석 및 세포 투과성을 증명한다.
AP-PNA (X = NH2) 단량체의 합성은, 도 2에 나타난 바와 같이, 펩토이드 골격 1 및 핵염기-아세트산 2-5의 합성으로 구분될 수 있다. 이전에 문헌에 보고된 방법에 따라 아실 보호 염기-아세트산을 합성하였다 (도 3; Will, D. W., et al., Tetrahedron (1995) 51, 12069; Timar, Z., et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1 (2000) 19; Finn, P. J., Nucleic Acids Res (1996) 24, 3357). 티민-1-아세트산 2는 상업적으로 입수하였다. 시토신을 벤조일 클로라이드와 반응시켜 N4-벤조일 시토신 6을 수득하고 이를 연속적으로 에틸 브로모아세테이트로 알킬화하여 7을 수득한 후, 이어서 수성 NaOH로 비누화 가수분해 (saponificative hydrolysis)를 수행하여 1-카르복시메틸-N4-벤조일 시토신 3을 제조하였다 .
아데닌을 벤조일 클로라이드와 반응시켜 N6-벤조일 아데닌 8을 수득하고 이를 에틸 브로모아세테이트로 알킬화하여 1-대-2 비율로 2개의 이성체, N7-이성체 및 N9-이성체 9를 형성함으로써 N6-벤조일-9-카르복시메틸아데닌 4를 형성하였다. 2개의 이성체를 2D NMR HMBC 실험으로 동정하였다. INEPT 실험으로 치환된 퓨린 내 13C 신호의 부위화학적 할당 (regiochemical assignment)을 확인한다 (Osterman, R. M., et al., Tetrahedron Letters (1992) 33, 4867; Hudson, R.H.E., et al., Synlett (2005) 1442). N9- 및 N7-이성체는 CH2COOEt 단편의 메틸렌 양성자와 C4 및 C5 탄소의 결합으로부터 야기되는 교차-피크에 의해 구분될 수 있다. N9-이성체의 경우, 메틸렌 양성자 (δ= 5.07 ppm에서 단일항)는 C5가 아닌 C4 및 C8 탄소 모두에 결합하는 반면, N7-이성체의 유사체 메틸렌 양성자 (δ= 5.50 ppm에서 단일항)는 C4가 아닌 C5 및 C8에 결합한다. 칼럼 크로마토그래피로 정제된, 바람직한 N9-이성체 9를 비누화 조건에 적용시켜 N6-벤조일-9-카르복시메틸아데닌 4를 수득하였다. 유사한 방식으로 N2-아이소부티릴-9-카르복시메틸구아닌 5를 합성하고 분석하였다. 10을 제공하기 위해 아이소부티릴 보호기를 건조 피리딘 중의 DIEA 존재 하에서 아이소부티릴 클로라이드와 반응시켜 구아닌의 N2-위치에 도입한 후, 이를 연속적으로 에틸 브로모아세테이트로 알킬화하여 2-대-3 비율로 2개의 이성체, N7-이성체 및 N9-이성체 11을 형성하였다. 2D NMR HMBC 실험에 의해 동정된, 바람직한 N9-이성체 11을 비누화 조건에 적용하여 N2-아이소부티릴-9-카르복시메틸-구아닌 5를 수득하였다. 아실 보호기는 올리고머화 후 40℃에서 35% 암모늄 처리에 의해 제거될 수 있었다. 이들은 Fmoc 및 Boc 화학적 성질 모두에 친화성을 나타내므로, PNA 올리고머의 합성에 매우 유용하다.
N-메틸 단량체의 합성을 위해 닐센 등에 의해 사용된 방법 (Haaima, G., et al., New Journal Of Chemistry (1999) 23, 833)을 AP-PNA 단량체의 합성에 적용하였다. 아미노 두부기를 골격에 연결하는 6-C 스페이서를 갖는 AP-PNA 단량체의 제조를 위한 반응 단계를 도 4에 나타내었다. 상이한 스페이서 길이를 갖는 다른 AP-PNA 단량체를 합성하기 위해 동일한 화학적 성질이 사용되었다. 펩토이드 측쇄 아민에 대해 Boc 보호기를 선택하였고, 그로부터 올리고머가 연장되는 골격 2° 아미노기에 대해 Fmoc 보호기를 선택하였다. 따라서, (Boc)2O를 과량의 1,2-다이아미노헥산과 반응시켜 터트-부틸 (6-아미노헥실)카바메이트 또는 6-(t-Boc-아미노)헥실 아민 12를 형성하였다. 이어서 화합물 12를 글리시돌과 반응시켜 13을 생성하고, 골격 아민의 Fmoc 보호 후, 이를 NaIO4를 이용해 산화적으로 절단하여 15를 생성하였다. 화합물 15를 연속적으로 중성 pH에서 글리신 메틸 에스테르 염산과 반응시켜 대응하는 이민을 수득하였고, 이를 인 시튜에서 NaBH3CN으로 환원시켜 바람직한 AP-PNA 골격, Nγ-(6-아미노헥실)aeg 16을 수득하였다. HATU 및 NMM의 존재 하에서 개별적으로 아실-보호된 핵염기-아세트산 2-5를 골격 16과 결합시켜 17을 수득하고, 이는, 알칼리 가수분해 후, 대응하는 4개의 AP-PNA 단량체 18을 생성하였다.
GP-PNA의 합성을 위해, 단량체 단계 또는 올리고머 단계에서 구아니디노기가 AP-PNA 펩토이드 측쇄에 도입될 수 있다. 만약 단량체 단계에서 도입된다면, Pmc 또는 Pbf와 같은 특별하고 값비싼 구아니딘 보호기가 요구된다. 만약 올리고머 단계에서 도입된다면, 과량의 구아니딜화 시약, 예컨대 N,N'-비스Boc-S-메틸티오우레아로의 처리에 의해 우수한 수율로 아민-탈보호된 폴리아민 AP-PNA를 폴리구아니딘 GP-PNA로 전환시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, GP-PNAs를 합성하기 위해 후자, 즉 포괄적인 구아니딜화 방법이 사용되었다.
비변형된 aegPNA 단량체의 합성은 또한 두 부분, aeg 링커 및 아실 보호된 핵염기를 포함한다. 공지된 과정에 따라 Fmoc-보호된 aeg 링커를 제조하였다 (Thomson, S.A., et al., Tetrahedron (1995) 51, 6179). 적절히 보호된 핵염기-아세트산 2-5를 19와 결합시킴으로써 aegPNA 단량체를 용이하게 수득하였다.
올리고머 합성
표준 역상 Fmoc 펩티드 합성 프로토콜에 따라 링크아미드 PEGA 수지를 사용하여 AP-PNA 올리고머를 합성하였다. 결합 시약은 aegPNA 잔사에 대한 결합용으로는 PyBOP/NMM이고, 또는 NMP 내 AP-PNA 잔사에 대한 결합용으로는 HATU/NMM이다. 올리고머 조립 후, 먼저 PNA-수지를 TFA로 처리하여 펩토이드 측쇄 아민으로부터 Boc 보호기를 제거하고 수지로부터 올리고머를 절단한 후, 이어서 35% 암모니아로 처리하여 엑소환상 핵염기 보호기를 제거하였다. 반대 방향으로 최종 탈보호/절단을 수행할 수도 있는데, 즉 먼저 수지를 TFA로 처리한 후, 이를 짧은 (2 또는 3개의 탄소) 펩토이드 측쇄를 갖는 AP-PNA에 대해 사용할 수 있다. 물론, Bhoc가 핵염기에 대해 보호기로 사용된 경우에는, 암모니아 처리 단계가 요구되지 않는다. 조 AP-PNAs를 역상 HPLC로 정제하고 MALDI-TOF 질량 분광계로 특성을 분석하였다. DMF 중의 DIEA의 존재 하에서 대응하는 순수한 AP-PNA 올리고머를 과량의 N,N'-비스Boc-S-메틸티오우레아로 처리한 후, 이어서 TFA 처리에 의해 Boc를 제거하고 HPLC로 정제하여 GP-PNA 올리고머를 수득하였다. 정제된 GP-PNAs의 특성을 MALDI-TOF 질량 분광계로 분석하였다.
두가닥 형성 및 안정성
상보적 역-평행 RNA 및 하나의 단일-염기 부정합 RNA뿐만 아니라 상보적 역-평행 DNA, 평행 DNA 및 하나의 단일-염기 부정합 DNA와의 두가닥 형성 연구에 데카머 aegPNA, AP-PNA, 혼합된 피리미딘-퓨린 서열의 GP-PNA 올리고머를 사용하였다. 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형된 단량체가 포함되고 교대로 또는 따로따로 aegPNA 단량체로 간격을 둔, AP-PNA 및 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소의 펩토이드 스페이서를 갖는 GP-PNA 올리고머의 5개 시리즈를 합성하였다. 도 7은 이들 PNAs 및 DNA 또는 RNA 사이에 형성된 두가닥의 예시의 열적 안정성 (Tm, ℃)을 나타낸다. 이들 데이터로부터, 평균적으로, 더 긴 펩토이드 스페이서 (6, 5 또는 4개의 탄소 원자)를 갖는 시리즈가 더 짧은 스페이서 (3 또는 2개의 탄소 원자)를 갖는 시리즈보다 상보적 DNA 또는 RNA에 대해 더욱 우수한 결합 친화도를 나타냄을 알 수 있다. 도 7A로부터, 상보적 DNA에 대한 결합에 있어서 6-C AP-PNA 및 GP-PNA 시리즈가 비변형된 aegPNA의 열적 안정성에 거의 대등한 열적 안정성을 가짐을 알 수 있다. 예를 들어, 데카머 내 1 또는 2개의 변형된 단량체를 포함하는 6-C AP-PNAs의 경우에, 비변형된 aegPNA와 비교하여 오히려 약간 증가된 열적 안정성을 나타내었다. 따라서, N-메틸 단위당 1.8-4.5℃의 열적 안전성의 감소를 초래하는 것으로 보고된 N-메틸화와 비교하여 (Haaima, G., et al., New Journal Of Chemistry (1999) 23, 833), N-아미노- 또는 N-구아니디노헥실화는 상보적 DNA에 대한 결과물 PNA의 결합 친화도를 유의미하게 변화시키지는 않았다. N-메틸기의 불안정화 효과가 음으로 하전된 DNA 골격과의 정전기적 상호작용을 가질 수 있는 펩토이드 측쇄 상에서 양으로 하전된 두부기의 존재에 의해 보상되는 것으로 믿고 싶은 생각이 들 수 있다. 그러나, 2개의 AP-PNAs (AP-PNA 6-1, AP-PNA 6-2) 상에서의 N-아세틸화에 의한 양전하(들)의 제거는 결합 친화도의 유의미한 저하를 유발하지 않으면서 2개의 중성 PNAs (acAP-PNA 6-1, 다이-acAP-PNA 6-2)를 생성하였다. 역-평행 상보적 DNA 두가닥을 갖는 acAP-PNA 6-1의 Tm은 AP-PNA 6-1의 Tm보다 단지 약간 낮은 반면, 다이-acAP-PNA 6-2/DNA의 Tm은 AP-PNA 6-2/DNA의 Tm과 거의 동일하였다. 따라서, 펩토이드 측쇄 상의 양전하는 PNA/DNA 두가닥의 열적 안정성을 결정하는데 결정적인 역할을 담당하는 것으로 보이지는 않는다. 이러한 설명은 또한 γ-Lys-PNAs에 대한 개별적인 연구와도 일치한다 (Englund, E. A., & Appella, D. H., Angewandte Chemie International Edition in English (2007) 46, 1414). 이 연구는 수소 결합 및 가닥 내 입체 상호작용과 같은 다른 요인들이 또한 이러한 PNA/DNA 두가닥의 열적 안정성에 영향을 미칠 수 있음을 제안한다. AP- 및 GP-PNAs의 경우, 펩토이드 측쇄의 길이는 매우 결정적인 것으로 보인다. 짭은 펩토이드 측쇄를 갖는 것은 이들 PNA 유사체의 결합 친화도에 불리하다. 열적 안정성에 있어 매우 큰 폭의 저하가 이렇게 가장 짧은 2-C 스페이서를 갖는 AP-PNA 및 GP-PNA 시리즈에서 관찰되었기 때문에, PNA-DNA 두가닥 안정성에 대한 N-아미노에틸화 또는 N-구아니디노에틸화의 불안정화 효과가 N-메틸화의 효과보다 더욱 현저함을 알 수 있다 (도 7D). AP-PNA2-1을 예를 들면, 잔사 6의 티민에 대한 단일 변형은 aegPNA에 비해 열적 안정성에 있어서 8℃ 이상으로 상보적 DNA에 대한 결합 친화도를 감소시켰다. 그러나, 아미노프로피오닐기 또는 β-알라닐이 AP-PNA 2-1의 펩토이드 아민 상에 도입된 경우에는, 측쇄가 3개 원자만큼 연장되고 (도 7D, 마지막 기록), 결과물 βAla-AP-PNA2-1은 AP-PNA 2-1보다 열적 안정성에 있어서 5℃ 더 높은 역평행 DNA에 대한 결합 친화도를 나타내었고, 이는 더 긴 스페이서의 유익한 효과를 다시 설명하는 것이다. 결합 친화도에 대한 짧은 펩토이드 스페이서의 부정적인 영향에도 불구하고, 도 7C 및 7D에 열거된 대부분의 AP-PNAs 및 GP-PNAs가 여전히 -33.5℃의 DNA/DNA 두가닥 열적 안정성을 갖는 대응하는 DNA 올리고뉴클레오티드에 비해 상보적 역평행 DNA에 더 잘 결합하고 (Haaima, et al., 1999, 상동) 이들이 또한 서열 선택적 방식으로 결합함은 주목할만하다. AP- 또는 GP-PN A3s과 같은 펩토이드 PNAs의 적당한 결합 친화도는 비변형된 PNA의 매우 단단한 결합 및 안티센스 올리고의 최적 길이 (-15-20 mer)를 고려하는 안티센스 적용에 유익한 수치일 수 있다 (Meier, C, & Engels, J.W., Angewandte Chemie International Edition in English (1992) 31, 1008). 이렇게 짧은-스페이서 펩토이드 변형의 도입에 의해, PNA의 혼성화 강도를 조절함으로써 생리적 온도에서 서열-특이적 표적화를 달성할 수 있다.
aegPNA와 유사하게, AP-PNAs 및 GP-PNAs는 또한 평행 DNA보다는 역평행 DNA에 대한 선호적인 결합을 나타낸다. 2가지 유형의 두가닥 사이의 열적 안정성의 차이는 대부분 경우에서 다소 유의미하다. AP-PNA 및 GP-PNA의 선택성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 또한 단일-염기 부정합을 포함하는 역평행 DNA에 대한 결합 시 AP-PNA 및 GP-PNA의 열적 안정성을 측정하였다. 약 40℃의 단일 가닥 PNA 자체의 뚜렷한 열적 전이가 있지만, 이들을 부정합 DNA와 인큐베이션할 경우 AP-PNA 및 GP-PNA에 대해 어떠한 선명하거나 약한 열적 전이도 관찰되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 약한 전이 지점으로부터 수집된 데이터는 완전히 정합된 역평행 DNA보다 상당히 더 낮은 열적 안정성을 나타내었다. 이는 aegPNA 내로의 펩토이드 측쇄의 도입이 결합 선택성을 훼손하지 않으며 AP-PNA 및 GP-PNA가 밀접하게 연관된 서열들을 구별하는 능력을 가짐을 명백히 나타내는 것이다.
흥미롭게도, AP-PNA 및 GP-PNA는 안티센스 DNA보다는 안티센스 RNA와 더욱 안정한 두가닥을 형성하는 것으로 보인다. 도 7E로부터, PNA/RNA 두가닥의 용해 온도는 대응하는 PNA/DNA 두가닥의 용해 온도보다 일반적으로 더 높다. 특히, 6-C 또는 5-C AP-PNAs 및 GP-PNAs으로부터 형성된 대부분의 두가닥의 경우, 이들의 안정성은 aegPNA/RNA 두가닥의 안정성보다 실제로 약간 더 높았다. 단일-염기 부정합 RNA로 형성된 두가닥의 상당히 더 낮은 Tm 값으로부터 알 수 바와 같이, 모든 펩토이드 PNAs는 또한 RNA에 대해 서열-선택적 결합을 나타내었다.
CD 분광기
γ-질소 골격 상에 아미노- 또는 구아니디노알킬기의 도입이 PNA/DNA 두가닥의 구조에 소정의 변화를 초래하는지 여부를 조사하기 위하여 CD 분광기를 사용하였다. 6-C 스페이서 시리즈 유래의 GP-PNA/DNA 및 AP-PNA/DNA 두가닥의 결과를 도 8에 나타내었다. PNAs를 6 μM의 농도로 상보적 역-평행 DNA와 혼성화하고 200 내지 320 nm에서 CD 스펙트럼을 기록하였다. 도 8A 및 8B에 나타난 결과는 모든 두가닥 구조가 aegPNA/DNA 두가닥의 CD 스펙트럼과 매우 유사한 CD 스펙트럼을 가짐을 명백히 나타내었는데, 이는 AP-PNA/DNA 또는 GP-PNA/DNA 두가닥에서 어떠한 주된 형태학적 변화도 유발되지 않았음을 나타내는 것이다. 따라서 모든 이러한 AP-PNA/DNA 및 GP-PNA/DNA 두가닥이 비변형된 PNA/DNA 두가닥과 유사한 우-선회 헬릭스를 채택하는 것으로 결론지을 수 있다 (Egholm, M., et al., Nature (1993) 365, 566; Sforza, S., et al., European Journal of Organic Chemistry (1999) 197-204).
FAM-표지 aegPNA, APPNA, GP-PNA 및 TAT의 세포 유입 연구
본 발명의 예시로서, 이들이 상보적 DNA와 복합체를 형성할 때 가장 강력한 결합 친화도를 나타내기 때문에 세포-유입 활성을 조사하기 위해 6-C 스페이서를 갖는 GP-PNA 및 AP-PNA를 선택하였다. 도데카머 aegPNA (F1-TAGTAGATCACT-Gly-NH2)(서열번호: 1), AP-PNA (F1-TA6aGT6aAG6aAT6aCA6aCT6a-Gly-NH2)(서열번호: 2), GP-PNA (F1-TA6aGT6aAG6aAT6aCA6aCT6a-Gly-NH2)(서열번호: 3) 올리고머 및 Tat 펩티드 (F1-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2)(서열번호: 4)를 합성하고 N-말단에 플루오레세인으로 표지하였다. 이들 올리고머를 37℃에서 24시간 동안 HeLa 세포와 인큐베이션하고 PBS (1x) 완충액으로 세척한 후 파라포롬알데하이드로 고정하였다. 이들의 유입 특성을 형광 공초점 현미경으로 결정하였다. 도 9는 이들 올리고머의 상대적 유입 효율을 나타낸다. aegPNA는 불량한 세포 유입 특성을 나타내었는데, HeLa 세포 내 형광 이미지는 검출되기에 너무 희미하였다. AP-PNA 올리고머는 세포 내부에서 형광이 뚜렷하게 관찰되어 aegPNA보다 우수한 유입 특성을 나타내지만, 모든 세포들이 형광 흡광도를 갖는 것은 아니며, 이는 AP-PNA가 모든 세포 내로 유입되는 것은 아님을 의미한다. GP-PNA 올리고머의 경우, 뚜렷하고 강렬한 형광 이미지가 대부분의 모든 세포 내에서 검출되었고 Tat 형질도입 펩티드가 그러한 것처럼 거의 효과적으로 세포막을 교차하였다 (도 9C 및 도 9D). 결론적으로, 골격 아미드 질소 유래 구아니디노기 펜던트는 변형된 PNAs에 세포-투과성을 부여한다.
결론
본 발명자들은 aeg 골격의 γ-질소 상에 펩토이드 측쇄를 함유하는 PNAs가 DNA에 대해 서열-특이적인 결합을 나타냄을 입증하였다.
흥미롭게도, 두부기와 골격 사이에 6-메텔렌 (6-methelene) 스페이서를 갖는 AP-PNAs 및 GP-PNAs는 DNA에 대한 결합에 있어 aegPNA만큼 우수하고 더 짧은 스페이서를 갖는 것들은 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 이러한 신규 PNA 유사체는 비변형된 PNA가 그러한 것처럼 DNA와 복합체를 형성할 때 동일한 이차 구조를 채택한다. 가장 중요하게는, 본 발명자들은 GP-PNA가 HeLa 세포에 의해 용이하게 흡수되는 반면, AP-PNA는 aegPNA에 비해 세포 유입 활성에 있어서 중간 수준의 증강을 제공함을 보여주었다. 이러한 발견은 PNA 골격 상의 변형이 혼성화 친화도가 생체 내 적용을 위한 유전자-특이적 표적화를 충족하도록 조정될 수 있는 새로운 세포-투과성 안티센스 분자를 형성할 수 있음을 제안한다.
본 명세서 내 이미 공개된 문헌의 열거 또는 논의는 반드시 상기 문헌이 종래 기술의 일부이거나 통상적인 주지 기술이라는 인식으로 받아들여져야 한다.
본 명세서에 예시적으로 기술된 발명은, 본 명세서에 구체적으로 기재되지는 않았지만, 임의의 요소 또는 요소들, 한정 또는 한정들의 부재 하에서 적절히 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는 (comprising)", "함유하는 (including)", "포함하는 (containing)", 등은 개방적이고 제한 없이 이해될 것이다. 부가적으로, 본 명세서에 사용된 용어 및 표현은 묘사적이고 제한적이지 않은 용어로서 사용되었고, 나타내고 서술된 특징의 임의의 등가물 또는 그의 일부분을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용에 아무런 의도가 없지만, 다양한 변형이 청구된 발명의 범주 내에서 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명이 예시적인 실시형태 및 최적의 특징에 의해 구체적으로 기술되었다고 하더라도, 본 명세서 내에 구체화된 발명의 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련자에 의해 재구성될 수 있고, 이러한 변경 및 변화가 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 고려됨이 이해되어야 한다.
본 발명은 본 명세서에 광범위하고 유전공학적으로 기재되었다. 포괄적인 기재에 속하는 더 좁은 종 및 아속 분류 각각이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 배제된 물질이 본 명세서에 구체적으로 열거되는지 여부와는 상관없이, 속으로부터 임의의 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 한정을 갖는 발명의 포괄적인 기재를 포함한다.
다른 실시형태가 하기 청구범위 내에 포함된다. 또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹의 형태로 기재되는 경우, 당해 분야의 숙련자는 본 발명이 또한 그로 인해 마쿠쉬 그룹의 구성원들의 임의의 개별적인 구성원 또는 아그룹에 관하여 기술되는 것임을 인식할 것이다.
<110> Nanyang Technological University <120> PEPTIDE NUCLEIC ACID MONOMERS AND OLIGOMERS <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 <400> 1 tagtagatca ct 12 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 <400> 2 tagtagatca ct 12 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 <400> 3 tagtagatca ct 12 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <400> 4 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10

Claims (54)

  1. 핵염기, 말단 아미노기 및 말단기 A를 포함하고, 말단 아미노기와 말단기 A가 지방족 모이어티에 의해 연결되고,
    말단 아미노기와 말단기 A를 연결하는 지방족 모이어티가 생리학적 조건 하에서 하전된 기를 포함하지 않는 주쇄를 포함하고,
    말단기 A가 -COOH, -COOR3, -COX, -COSR3, -CN, -CONH2, -CONHR3, -CONR3R4의 하나이고, 여기서, R3, 및 -CONR3R4에서 R4가, H, 및 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 O 내지 약 3개의 헤테로원자를 포함하는 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 및 아릴지환족 기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, -COX에서 X가 할로겐 원자이고,
    말단 아미노기가 적어도 2개의 탄소 원자 및 선택적으로 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 최대 2개의 헤테로원자를 갖는 지방족 모이어티로 치환되고, 지방족 모이어티의 주쇄가 극성 두부기 Z를 갖는 것인 펩티드 핵산 단량체.
  2. 제1항에 있어서, 말단 아미노기와 말단기 A를 연결하는 지방족 모이어티의 주쇄가 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 0 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 것인 펩티드 핵산 단량체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵염기가 말단 아미노기와 말단기 A를 연결하는 지방족 모이어티의 주쇄에 측쇄를 통해 연결되고, 핵염기를 상기 주쇄에 연결하는 측쇄의 일부분이 2개의 탄소 원자 길이를 갖는 것인 펩티드 핵산 단량체.
  4. 제3항에 있어서, 핵염기를 주쇄에 연결하는 측쇄가 아미드 결합을 통해 주쇄에 연결되는 것인 펩티드 핵산 단량체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 핵산 단량체가 일반 구조 화학식 (I)에 의해 정의되는 것인 펩티드 핵산 단량체:
    Figure pct00022

    상기에서, Q는 약 2 내지 약 12개의 탄소 원자 길이의 주쇄를 갖고, 선택적으로 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 0 내지 약 2개의 헤테로원자를 포함하는 지방족 다리이고, R2는 제거가능한 아미노-보호기, 지방족기, 지환족기, 방향족기, 아릴지방족기, 아릴지환족기, 실릴기 및 H의 하나이고, A는 -COOH, -COOR3, -COX, -COSR3, -CN, -CONH2, -CONHR3, -CONR3R4의 하나이고, 여기서 R3, 및 -CONR3R4에서 R4는, H, 및 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 O 내지 약 3개의 헤테로원자를 포함하는 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 및 아릴지환족 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, -COX에서 X는 할로겐 원자이고, E는 핵염기이고, Z는 극성 두부기임.
  6. 제5항에 있어서, Q의 주쇄가 약 4 내지 약 8개의 탄소 원자 길이를 갖는 것인 펩티드 핵산 단량체.
  7. 제5항에 있어서, 펩티드 핵산 단량체가 일반 구조 화학식 (Ic)에 의해 정의되는 것인 펩티드 핵산 단량체:
    Figure pct00023

    상기에서, n은 2 내지 약 12의 정수임.
  8. 제7항에 있어서, n이 약 4 내지 약 8의 범위 내에서 선택되는 것인 펩티드 핵산 단량체.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 카바메이트기, 메틸아릴기 (프탈로일, 테트라클로로프탈로일), 아세트아미도기, 트라이플루오로아세트아미도기, 아릴설포닐기 (p-톨루설포닐-), o-니트로페닐-설페닐기, 트라이플루오로아세틸기, 트리틸기, 알릴기, 9-페닐플루오레닐기, 다이티아석시닐기, 트라이아진아논기, N-비스(메틸티오)메틸렌기 및 N-다이페닐메틸렌기 중의 하나인 것인 펩티드 핵산 단량체.
  10. 제9항에 있어서, 카바메이트가 메톡시-, 카르보닐-, 에톡시카르보닐-, 벤질카르보닐-, 벤질옥시카르보닐-, 니트로벤질옥시카르보닐-, 벤즈하이드릴옥시카르보닐-, 알릴옥시카르보닐-, 터트-부톡시카르보닐-, 9-플루오레닐- 메톡시카르보닐-, 2-(트라이메틸실릴)에톡시카르보닐-, 2,2,2-트라이클로로에톡시카르보닐- 및 2-(4-트라이플루오로메틸페닐설포닐)에톡시카르보닐 중의 하나인 것인 펩티드 핵산 단량체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 두부기 Z가 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있는 것인 펩티드 핵산 단량체.
  12. 제11항에 있어서, 극성 두부기 Z가 수성 용액 중에서 양전하를 띨 수 있는 것인 펩티드 핵산 단량체.
  13. 제12항에 있어서, 극성 두부기 Z가 생리학적 조건 하에서 양전하를 운반하는 것인 펩티드 핵산 단량체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 두부기 Z가 아미노기, 아미도기, 카르복실기, 에스테르기, 하이드록실기, 티오기, 셀레노기, 포스포네이트기, 설포네이트기, 구아니딘기 및 이미다졸기 중의 하나인 것인 펩티드 핵산 단량체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 두부기 Z가 아미노기 또는 구아니딘기인 것인 펩티드 핵산 단량체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 핵염기가 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기인 것인 펩티드 핵산 단량체.
  17. 하기 단계를 포함하는, 펩티드 핵산 단량체를 형성하는 방법:
    - 제1 이관능성 화합물을 제공하는 단계로, 제1 이관능성 화합물이 적어도 2개의 탄소 원자의 주쇄 및 선택적으로 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 최대 2개의 헤테로원자를 갖는 지방족 화합물이고, 주쇄의 각 말단이 극성 두부기를 갖고, 한쪽 말단 위의 극성 두부기는 아미노기이고, 다른 쪽 말단 위의 극성 두부기는 기 Z인 것인 단계,
    - 제1 이관능성 화합물의 아미노기를 제2 이관능성 화합물과 반응시키는 단계로, 제2 이관능성 화합물이 지방족 화합물이고, 그로써 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자를 형성하고, 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자가 말단 아미노기 및 말단기 A를 포함하고, 말단 아미노기와 말단기 A가 지방족 모이어티에 의해 연결되고, 말단 아미노기가 적어도 2개의 탄소 원자의 주쇄 및 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 0 내지 약 2개의 헤테로원자를 갖는 지방족 모이어티로 치환되고, 지방족 모이어티의 주쇄가 극성 두부기 Z를 갖는 것인 단계, 및
    - 핵염기를 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자에 연결하여, 펩티드 핵산 단량체를 형성하는 단계.
  18. 제17항에 있어서, 제1 이관능성 화합물의 한쪽 말단 위의 아미노기가 일차 아미노기인 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제1 이관능성 화합물의 아미노기와 제2 이관능성 화합물의 반응 시, 제1 이관능성 화합물의 일차 아미노기가 이차 아미노기로 전환되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자의 형성이 이차 아미노기를 적합한 보호기로 보호하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 극성 두부기 Z가 아미노기, 아미도기, 카르복실기, 에스테르기, 하이드록실기, 티오기, 셀레노기, 포스포네이트기, 설포네이트기, 구아니딘기 및 이미다졸기 중의 하나인 것인 방법.
  22. 제17항에 있어서, 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자의 형성이 극성 Z 기를 적합한 보호제로 보호하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 두부기 Z가 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 극성 두부기 Z가 수성 용액 중에서 양전하를 띨 수 있는 것인 방법.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자의 말단 아미노기와 말단기 A를 연결하는 지방족 모이어티의 주쇄가 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 0 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 것인 방법.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 핵염기가 헤테로원자의 위치에서 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자에 연결되고, 헤테로원자가 N 또는 Si이고, 헤테로원자가 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자의 말단 아미노기와 말단기 A를 연결하는 지방족 모이어티의 주쇄 내에 포함되는 것인 방법.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 핵염기가 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자에 측쇄를 통해 말단 아미노기와 말단기 A를 연결하는 지방족 모이어티에 연결되고, 핵염기를 상기 주쇄에 연결하는 측쇄의 위치가 2개의 탄소 원자 길이를 갖는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 핵염기를 주쇄에 연결하는 측쇄가 아미드 결합을 통해 측쇄에 연결되는 것인 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 그로써 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자를 형성하는, 제1 이관능성 화합물의 아미노기와 제2 이관능성 화합물의 반응이 하기를 포함하는 것인 방법:
    - 제1 이관능성 화합물의 아미노기를 제2 이관능성 화합물의 관능기와 반응시키는 단계로, 제2 이관능성 화합물이 지방족 화합물이고, 그로써 중간체 화합물이 형성되고, 중간체 화합물이 말단 아미노기 및 말단 관능기 G를 포함하고, 말단 아미노기와 말단 관능기 G가 지방족 모이어티에 의해 연결되고, 말단 아미노기가 추가로 적어도 2개의 탄소 원자의 알킬 쇄로 치환되고, 알킬 쇄가 수성 용액 중에서 양전하를 띨 수 있는 극성 두부기 Z를 갖는 것인 단계, 및
    - 중간체 화합물의 말단 관능기 G를 제3 이관능성 화합물의 관능기와 반응시키는 단계로, 제3 이관능성 화합물이 지방족 화합물이고, 그로써 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자를 형성하여, 중간체 화합물의 말단 관능기 G를 펩티드 핵산 단량체 전구체 분자의 헤테로원자로 전환시키는 단계.
  30. 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 핵산 단량체가 일반 구조 화학식 (I)에 의해 정의되는 것인 펩티드 핵산 단량체:
    Figure pct00024

    상기에서 Q는 약 2 내지 약 12개의 탄소 원자 길이의 주쇄를 갖고, 선택적으로 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 0 내지 약 2개의 헤테로원자를 포함하는 지방족 다리이고,
    R2는 제거가능한 아미노-보호기, 지방족기, 지환족기, 방향족기, 아릴지방족기, 아릴지환족기, 실릴기 및 H의 하나이고, A는 -COOH, -COOR3, -COX, -COSR3, -CN, -CONH2, -CONHR3, -CONR3R4의 하나이고, 여기서 R3, 및 -CONR3R4에서 R4는, H, 및 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 O 내지 약 3개의 헤테로원자를 포함하는 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 및 아릴지환족기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, -COX 내 X는 할로겐 원자이고,
    E는 핵염기이고,
    Z는 극성 두부기이고,
    일반 구조 화학식 (III)의 펩티드 핵산 전구체 분자를 일반 구조 화학식 (IV)의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00025

    상기에서, R2'은 R2와 동일하거나 R2의 차폐된 형태이고, R2'은 R2로 전환이능하고,
    A'은 A와 동일하거나 A의 차폐된 형태이고, A'은 A로 전환이능하고,
    Z'은 Z와 동일하거나 Z의 차폐된 형태이고, Z'은 Z로 전환이능하고,
    Figure pct00026

    상기에서 Y는 -COOH, -COOR3, -COX, -COSR3, -CN, -CONH2, -CONHR3, -CONR3R4의 하나이고, 여기서 R3, 및 -CONR3R4에서 R4는, H, 및 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택되는 O 내지 약 3개의 헤테로원자를 포함하는 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 및 아릴지환족기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, -COX 내 X는 할로겐 원자이고,
    그로써 일반 구조 화학식 (I)의 펩티드 핵산 단량체를 형성함.
  31. 제30항에 있어서, Q의 주쇄가 약 4 내지 약 8개의 탄소 원자 길이를 갖는 것인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 펩티드 핵산 단량체가 일반 구조 화학식 (Ic)에 의해 정의되고:
    Figure pct00027

    상기에서, n은 약 2 내지 약 12의 정수이고,
    일반 구조 화학식 (IIIa)의 펩티드 핵산 전구체 분자를 일반 구조 화학식 (IV)의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00028
  33. 제32항에 있어서, n이 약 4 내지 약 8의 범위 내에서 선택되는 것인 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 두부기 Z가 수성 용액 중에서 전하를 띨 수 있는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 극성 두부기 Z가 수성 용액 중에서 양전하를 띨 수 있는 것인 방법.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 일반 구조 화학식 (III)의 펩티드 핵산 전구체 분자가 일반 구조 화학식 (V)의 중간체 화합물로부터 수득되는 것인 방법:
    Figure pct00029

    상기에서, G는 포밀기, 할로겐메틸렌기, 아세탈, 티오아세탈 및 셀레노아세탈의 하나임.
  37. 제36항에 있어서, 일반 구조 화학식 (V)의 중간체 화합물이 일반 화학식 (Va)인 것인 방법:
    Figure pct00030

    상기에서, n은 약 2 내지 약 12의 정수임.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 일반 구조 화학식 (III)의 핵산 전구체 분자의 형성이 일반 구조 화학식 (V)의 중간체 화합물을 글리신 또는 글리신의 에스테르와 반응시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  39. 제17항에 있어서, 이차 아미노기를 적합한 보호기로 보호하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  40. 제17항에 있어서, 극성 두부기 Z를 적합한 보호기로 보호하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 보호제가 카바메이트기, 메틸아릴기 (프탈로일, 테트라클로로프탈로일), 아세트아미도기, 트라이플루오로아세트아미도기, 아릴설포닐기 (p-톨루설포닐-), o-니트로페닐설페닐기, 트라이플루오로아세틸기, 트리틸기, 알릴기, 9-페닐플로오레닐기, 다이티아석시닐기, 트라이아진아논기, N-비스(메틸티오)메틸렌기 및 N-다이페닐메틸렌기를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 카바메이트가 메톡시카르보닐-, 에톡시카르보닐-, 벤질카르보닐-, 벤질옥시카르보닐-, 니트로벤질옥시카르보닐-, 벤즈하이드릴- 옥시카르보닐-, 알릴옥시카르보닐-, 터트-부톡시카르보닐-, 9-플루오레닐메톡시카르보닐-, 2-(트라이메틸실릴)에톡시카르보닐-, 2,2,2-트라이클로로에톡시카르보닐- 및 2-(4-트라이플루오로-메틸페닐설포닐)에톡시카르보닐 중의 하나인 것인 방법.
  43. 생리적 환경에서 적어도 실질적으로 변하지 않는 지방족 골격을 갖고, 지방족 골격이 아미드기를 포함하며, 하나 이상의 아미드기의 아미노 부분이 적어도 2개의 탄소 원자 및 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 0 내지 약 2개의 헤테로원자의 주쇄를 갖는 지방족 모이어티로 치환되고, 지방족 모이어티의 주쇄가 극성 두부기 Z를 갖는 것인 펩티드 핵산 분자.
  44. 제43항에 있어서, 지방족 골격의 하나 이상의 아미드기가 지방족 모이어티에 의해 연결되고, 지방족 모이어티가 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 0 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 것인 펩티드 핵산 분자.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 극성 두부기 Z가 수송 용액 중에서 전하를 띨 수 있는 것인 펩티드 핵산 분자.
  46. 제45항에 있어서, 극성 두부기 Z가 수성 용액 중에서 양전하를 띨 수 있는 것인 펩티드 핵산 분자.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 두부기 Z가 생리적 환경 하에서 양전하를 띨 수 있는 것인 펩티드 핵산 분자.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 두부기 Z가 아미노기, 구아니딘기 및 이미다졸기 중의 하나인 것인 펩티드 핵산 분자.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 복수 개의 펩티드 핵산 단량체를 반응시키는 것을 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 것인 펩티드 핵산 분자.
  50. 제49항에 있어서, 방법이 제16항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 방법인 것인 펩티드 핵산 분자.
  51. 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 핵산 분자가 일반 구조 화학식 (II)의 단량체 단위를 포함하는 것인 펩티드 핵산 분자:
    Figure pct00031

    상기에서, Q는 약 2 내지 약 12개의 탄소 원자 길이의 주쇄를 갖고, 선택적으로 기 N, O, S, Se 및 Si로부터 선택된 0 내지 약 2개의 헤테로원자를 포함하는 지방족 다리이고,
    E는 개별적으로 선택된 핵염기이고,
    Z는 개별적으로 선택된 극성 두부기임.
  52. 제51항에 있어서, 펩티드 핵산 분자의 단량체 단위가 일반 구조 화학식 (IIa)를 갖는 것인 펩티드 핵산 분자:
    Figure pct00032

    상기에서, n은 개별적으로 선택된 약 2 내지 약 12의 정수임.
  53. 제52항에 있어서, n이 약 4 내지 약 8 범위 내에서 개별적으로 선택되는 것인 펩티드 핵산 분자.
  54. 제52항에 있어서, n이 약 3 내지 약 6의 범위 내에서 개별적으로 선택되는 것인 펩티드 핵산 분자.
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