DE69232055T2 - Peptidnukleinsäuren - Google Patents

Peptidnukleinsäuren

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DE69232055T2
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Michael Egholm
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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Verbindungen, die keine Polynukleotide sind, aber dennoch an komplementäre DNA- oder RNA-Stränge stärker binden als die entsprechende bzw. korrespondierende DNA. Die Erfindung betrifft insbesondere Verbindungen, in denen natürlich vorkommende Nukleobasen oder andere Nukleobase-bindende Einheiten kovalent an ein Polyamid-Gerüst gebunden sind.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Oligodesoxyribonukleotide werden routinemäßig bis zu einer Länge von 100 Basenpaaren (Bp) durch Festphasen-Verfahren unter Verwendung kommerziell verfügbarer, voll automatischer Syntheseapparaturen synthetisiert. Die chemische Synthese von Oligoribonukleotiden ist jedoch noch längst keine Routine. Oligoribonukleotide sind zudem weitaus weniger stabil als die Oligodesoxyribonukleotide, eine Tatsache, die zu der vorrangigeren Verwendung von Oligodesoxyribonukleotiden, beispielsweise in der auf die Gentherapie oder die Regulation der Transkription oder Translation gerichteten medizinischen und biologischen Forschung, beigetragen hat.
  • Die Funktion eines Gens beginnt durch die Transkription seiner Information an eine Messenger-RNA (mRNA), die - durch Wechselwirkung mit dem ribosomalen Komplex - die Synthese eines durch ihre Sequenz zu kodierenden Proteins lenkt. Der Synthesevorgang ist als Translation bekannt. Die Translation erfordert die Anwesenheit verschiedener Cofaktoren und Bausteine, den Aminosäuren und ihren Transfer- RNAs (tRNA), die alle in normalen Zellen vorhanden sind.
  • Die Initiierung der Transkription erfordert die spezifische Erkennung einer Promotor- DNA-Sequenz durch das RNA-synthetisierende Enzym, die RNA-Polymerase. In vielen Fällen geht dieser Erkennung in prokaryontischen Zellen und möglicherweise in allen Fällen in eukaryontischen Zellen die sequenzspezifische Bindung eines Proteintranskriptionsfaktors an den Promotor voraus. Andere Proteine, die an den Promotor binden, deren Bindung jedoch die Wirkung einer RNA-Polymerase verhindert, sind als Repressoren bekannt. Somit wird die Genaktivierung im allgemeinen durch Transkriptionsfaktoren positiv und durch Repressoren negativ reguliert.
  • Die meisten herkömmlichen Arzneistoffe wirken durch die Wechselwirkung mit und durch die Modulation von einem oder mehreren endogenen Zielproteinen, wie z.B. Enzymen. Derartige Arzneistoffe sind jedoch im allgemeinen nicht spezifisch für Zielproteine, denn sie gehen auch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen ein. Es muß somit eine verhältnismäßig große Dosis des Arzneistoffs angewendet werden, um ein Zielprotein wirksam zu modulieren. Typische tägliche Dosen dieser Arzneistoffe betragen 10&supmin;&sup5;-10&supmin;¹ Millimol pro Kilogramm Körpergewicht oder 10&supmin;³-10 Millimol für eine Person von 100 kg Körpergewicht. Wenn diese Modulation statt dessen durch die Wechselwirkung mit und durch die Inaktivierung von mRNA erreicht werden könnte, dann könnte wahrscheinlich eine starke Verringerung der notwendigen Menge des notwendigen Arzneistoffs erreicht werden, und auch eine entsprechende Verringerung der Nebenwirkungen. Weitere Verringerungen könnten erzielt werden, wenn eine derartige Wechselwirkung ortsspezifisch gestaltet werden könnte. Unter der Voraussetzung, daß ein Gen ständig mRNA erzeugt, wäre es vorteilhafter, wenn die Gentranskription insgesamt inhibiert werden könnte.
  • Oligodesoxynukleotide bieten solche Möglichkeiten. Synthetische Oligodesoxynukleotide könnten beispielsweise als Antisense-Sonden verwendet werden, um die mRNA zu blockieren und möglicherweise zu ihrem Abbruch zu führen. Synthetische DNA könnte somit die Translation in vivo unterdrücken. Es könnte auch möglich sein, das Genom eines Tieres z.B. durch die Tripelhelixbildung unter Verwendung von Oligonukleotiden oder anderer DNA-erkennender Mittel zu modulieren. Mit der Tripelhelixbildung sind jedoch zahlreiche Nachteile verbunden. Sie kann beispielsweise nur für Homopurinsequenzen angewendet werden und erfordert unphysiologisch hohe Ionenstärken und niedrige pH-Werte.
  • Weiterhin können nicht-modifizierte Oligonukleotide weder für das Antisense- Verfahren noch für das Tripelhelix-Verfahren eingesetzt werden, da sie in vivo geringe Halbwertszeiten aufweisen und es schwierig ist, sie in Mengen, die den Milligrammbereich überschreiten, herzustellen und sie somit unbezahlbar sind, zudem sind sie schlechte Zellpenetratoren.
  • Diese Probleme führten zu einer ausgedehnten Suche nach Verbesserungen und Alternativen. Beispielsweise wurden die Probleme, die sich in Verbindung mit der Erkennung von doppelsträngiger DNA (dsDNA) durch Tripelhelixbildung ergeben, durch eine geschickte chemische "switch back"-Verknüpfung verringert, wobei eine Sequenz eines Polypurins auf einem Strang erkannt wird und durch "switching back" kann eine Homopurinsequenz auf dem anderen Strang erkannt werden kann. Siehe z.B. McCurdy, Moulds und Froehler, Nucleosides, im Druck. Eine gute Helixbildung ist auch durch synthetische Basen erreicht worden, wodurch die Bindungsbedingungen im Hinblick auf die Ionenstärke und den pH-Wert verbessert wurden.
  • Um sowohl die Halbwertszeit als auch die Membranpenetration zu verbessern, sind zahlreiche Variationen in den Polynukleotidgerüsten vorgenommen worden, obwohl bei weitem nicht mit den erwünschten Ergebnissen. Diese Variationen schließen die Anwendung von Methylphosphonaten, Monothiophosphaten, Dithiophosphaten, Phosphoramidaten, Phosphatester, verbrückten Phosphoramidaten, verbrückten Phosphorthioaten, verbrückten Methylenphosphonaten, Dephospho-Internukleotidanalogen mit Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylesterbrücken, Acetamidbrücken, Carbamatbrücken, Thioether-, Sulfoxy-, Sulfonobrücken, verschiedene "plastische" DNA's, α-anomere Brücken und Boranderivate ein.
  • Die Internationale Patentanmeldung WO 86/05518 beansprucht weitestgehend eine polymere Zusammensetzung, die an ein einsträngiges Polynukleotid wirksam bindet, welches eine Basen-Zielsequenz enthält. Es wird behauptet, daß die Zusammensetzung nicht-homopolymere, im wesentlichen stereoreguläre Polymermoleküle der Form:
  • worin
  • (a) R&sub1;-Rn Erkennungseinheiten sind, ausgewählt aus Purin-, Purin-ähnlichen, Pyrimidin- und Pyrimidin-ähnlichen Heterocyclen, die durch Watson/Crick- Paarung wirksam an korrespondierende in-Sequenz-Basen in der Zielsequenz binden;
  • (b) n derart ist, daß die Gesamtzahl der zwischen einem Polymermolekül und der Zielsequenz gebildeten Watson/Crick-Wasserstoffbindungen mindestens etwa 15 ist;
  • (c) B ~ B Gerüsteinheiten sind, die vorrangig durch chemisch stabile, im wesentlichen ungeladene, vorrangig achirale Verknüpfungen verbunden sind;
  • (d) die Länge der Gerüsteinheiten im Bereich von 5 bis 7 Atomen liegt, wenn die Gerüsteinheiten eine cyclische Struktur aufweisen und im Bereich von 4 bis 6 Atomen liegt, wenn die Gerüsteinheiten eine acyclische Struktur aufweisen; und
  • (e) die Gerüsteinheiten die Erkennungseinheiten in einer Position tragen, welche die Watson/Crick-Basenpaarung zwischen den Erkennungseinheiten und den korrespondierenden in-Sequenz Basen der Zielsequenz ermöglicht.
  • Gemäß WO 86/05518 sind die Erkennungseinheiten verschiedene natürliche Nukleobasen und Nukleobasen-Analoge und die Gerüsteinheiten sind entweder cyclische Gerüsteinheiten, die Furan- oder Morpholinringe oder acyclische Gerüsteinheiten der nachfolgenden Formen umfassen:
  • worin E -CO- oder -SO&sub2;- ist. Die Beschreibung der Anmeldung liefert allgemeine Beschreibungen für die Synthese von Subeinheiten, für Gerüst-Kupplungsreaktionen und für Strategien zur Zusammensetzung von Polymeren. Die Beschreibung liefert jedoch kein Beispiel, worin eine beanspruchte Verbindung oder Struktur tatsächlich hergestellt wird. Obwohl WO 86/05518 darauf hinweist, daß die beanspruchten Polymer-Zusammensetzungen an Zielsequenzen binden können und daß sie im Ergebnis diagnostische und therapeutische Anwendungsmöglichkeiten besitzen, enthält die Anmeldung keine Daten, welche die Bindungsaffinität eines beanspruchten Polymers betreffen.
  • Die Internationale Patentanmeldung WO 86/05519 beansprucht diagnostische Reagenzien und Systeme, welche die in WO 86/05518 beschriebenen Polymere umfassen, jedoch an einen festen Träger gebunden sind. WO 86/05519 liefert auch keine Beispiele, welche die tatsächliche Herstellung eines beanspruchten diagnostischen Reagenzes betreffen, geschweige denn Daten, welche die diagnostische Wirksamkeit eines derartigen Reagenzes zeigen.
  • Die Internationale Patentanmeldung WO 89/12060 beansprucht verschiedene Bausteine zur Synthese von Oligonukleotid-Analogen sowie Oligonukleotid-Analoge, die durch die Verbindung derartiger Bausteine in einer definierten Sequenz gebildet werden. Die Bausteine können entweder "starr" (einen Ring enthaltend) oder "beweglich" (Fehlen eines Ringes) sein. In beiden Fällen enthalten die Bausteine eine Hydroxy- und eine Mercaptogruppe, mittels der die Bausteine unter Bildung von Oligonukleotid-Analogen verbunden sind. Die Verknüpfungseinheit in den Oligonukleotid-Analogen ist aus der Gruppe, bestehend aus Sulfid (-S-), Sulfoxid (-SO-), und Sulfon (-SO&sub2;-), ausgewählt. WO 89/12060 liefert eine allgemeine Beschreibung, welche die Synthese der Bausteine und die Kupplungsreaktionen zur Synthese der Oligonukleotid-Analogen betrifft, zusammen mit Versuchsbeispielen, die die Herstellung der Bausteine beschreiben. Die Anmeldung liefert jedoch kein Beispiel, das auf die Herstellung eines beanspruchten Oligonukleotid-Analogen gerichtet ist und keine Daten, welche die spezifische Bindung eines Oligonukleotid-Analogen an ein Ziel- Oligonukleotid betreffen.
  • Des weiteren wurden die Oligonukleotide oder ihre Derivate zur Verbesserung der Bindung an Interkalatoren, zur Verbesserung der Bindung an sowohl doppelsträngige als auch einsträngige DNA an Polylysin oder andere basische Gruppen, und zur Verbesserung der Membranpenetration an Peptide verknüpft. Eine derartige Verknüpfung führte jedoch weder für doppelsträngige noch für einsträngige DNA zur zufriedenstellenden Bindung. Andere Probleme, die sich beispielsweise bei Methylphosphonaten und Monothiophosphaten ergeben, wären das Auftreten von Chiralität, unzureichenden Syntheseausbeuten oder Schwierigkeiten bei der Durchführung der Synthesen mittels Festphase.
  • In den meisten Fällen können nur wenige dieser Modifizierungen angewendet werden. Sogar dann können nur kurze Sequenzen - oft nur Dimere - oder Monomere erzeugt werden. Des weiteren wurde selten gezeigt, daß, die tatsächlich hergestellten Oligomere an DNA oder RNA binden oder sie sind nicht biologisch untersucht worden.
  • Wie die Auswertung der Tm-Werte zeigte, führte die Mehrheit dieser Gerüstmodifizierungen zu einer verringerten Stabilität von zwischen dem modifizierten Oligonukleotid und seinem komplementären nativen Oligonukleotid gebildeten Hybriden. Folglich ist es auf dem Fachgebiet selbstverständlich, daß Gerüstmodifikationen derartige Hybride destabilisieren, d.h. das sie zu niedrigeren Tm-Werten führen, und daher sollten sie auf ein Minimum reduziert werden.
    • Aufgaben der Erfindung
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verbindungen, die ssDNA- und RNA-Stränge unter Bildung stabiler Hybride binden.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verbindungen, die ssDNA- und RNA-Stränge stärker als die korrespondierende DNA binden.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verbindungen, worin natürlich vorkommende Nukleobasen oder andere Nukleobasebindende Einheiten kovalent an ein Peptidgerüst gebunden sind.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist außerdem die Bereitstellung von anderen Verbindungen als RNA, die an einen Strang eines doppelsträngigen Polynukleotids binden, indem sie den anderen Strang verdrängen.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist außerdem die Bereitstellung von Therapie- und Prophylaxeverfahren, die derartige Verbindungen anwenden.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neuartige Klasse von Verbindungen bereit, die als Peptidnukleinsäuren (PNAs) bekannt sind und die komplementäre ssDNA- und RNA-Stränge stärker als eine korrespondierende DNA binden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen im allgemeinen Liganden, die über einen Azastickstoff mit einem Peptidgerüst verknüpft sind. Repräsentative Liganden schließen entweder die vier natürlich vorkommenden DNA-Basen (d.h. Thymin, Cytosin, Adenin oder Guanin) oder andere natürlich vorkommende Nukleobasen (z.B. Inosin, Uracil, 5-Methylcytosin oder Thiouracil) oder synthetische Basen (z.B. Bromthymin, Azaadenine oder Azaguanine usw.) ein, die durch eine geeignete Verknüpfung an ein Peptidgerüst gebunden sind.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen weisen die Peptidnukleinsäuren der vorliegenden Erfindung die allgemeine Formel (I) auf:
  • wobei:
  • n mindestens 2 ist,
  • jedes L¹-Ln unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub4;)Alkanoyl, natürlich vorkommenden Nukleobasen, nicht-natürlich vorkommenden Nukleobasen, aromatischen Einheiten, DNA-Interkalatoren, Nukleobase-bindenden Gruppen und Reporterliganden ausgewählt ist, wobei mindestens eines von L¹-Ln eine natürlich vorkommende Nukleobase, eine nicht-natürlich vorkommende Nukleobase, ein DNA-Interkalator oder eine Nukleobase-bindende Gruppe ist;
  • jedes A¹-An eine Einfachbindung, eine Methylengruppe oder ein Rest der Formel (IIa)oder(IIb):
  • ist, wobei:
  • X O, S, Se, NR³, CH&sub2; oder C(CH&sub3;)&sub2; ist;
  • Y eine Einfachbindung, O, S oder NR&sup4; ist;
  • jedes von p und q eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, wobei die Summe p + q nicht größer als 6 ist;
  • jedes von r und s Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, wobei die Summe r + s nicht größer als 5 ist;
  • jedes R¹ und R² unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, welches Hydroxy- oder Alkoxy- oder Alkylthio-substituiert sein kann, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Amino oder Halogen, ausgewählt ist; und
  • jedes R³ und R&sup4; unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy- oder Alkoxy- oder Alkylthio-substituiertem (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio und Amino, ausgewählt ist;
  • jedes B¹-Bn N oder R³N&spplus; ist, wobei R³ wie vorstehend definiert ist;
  • jedes C¹-Cn CR&sup6;R&sup7;, CHR&sup6;CHR&sup7; oder CR&sup6;R&sup7;CH&sub2; ist, worin R&sup6; Wasserstoff ist und R&sup7; aus der Gruppe, bestehend aus den Seitenketten natürlich vorkommender alpha- Aminosäuren, ausgewählt ist, oder R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub2;-C&sub6;)Alkyl, Aryl, Araryl, Heteroaryl, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub6;)Alkoxy, (C&sub1;-C&sub6;)Alkylthio, NR³R&sup4; und SR&sup5;, ausgewählt sind, wobei R³ und R&sup4; wie vorstehend definiert sind und R&sup5; Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub6;)Alkyl, Hydroxy-, Alkoxy- oder Alkyltnio-substituiertes (C&sub1;-C&sub6;)Alkyl ist oder R&sup6; und R&sup7; zusammen ein alicyclisches oder heterocyclische System vervollständigen;
  • jedes D¹-Dn CR&sup6;R&sup7;, CH&sub2;CR&sup6;R&sup7; oder CHR&sup6;CHR&sup7; ist, wobei R&sup6; und R&sup7; wie vorstehend definiert sind;
  • jedes G¹-Gn-1 -NR³CO- in beiden Orientierungen ist, wobei R³ wie vorstehend definiert ist;
  • Q-CO&sub2;H, -CONR'R", -SO&sub3;H- oder -SO&sub2;NR'R" oder ein aktiviertes Derivat von -CO&sub2;H oder -SO&sub3;H ist; und
  • I -NHR'''R'''' oder -NR'''C(O)R'''' ist, wobei R', R", R''' und R'''' unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aminoschutzgruppen, Reporterliganden, Interkalatoren, Chelatbildnern, Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Steroiden, Oligonukleotiden und löslichen und nicht-löslichen Polymeren, ausgewählt sind.
  • Die Peptidnukleinsäuren der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich von den, in WO 86/05518 offenbarten darin, daß ihre Erkennungseinheiten an ein Azastickstoffatom im Gerüst, anstatt an ein Amidstickstoffatom, an eine Hydrazineinheit oder an ein Kohlenstoffatom im Gerüst gebunden sind.
  • Bevorzugte Peptidnukleinsäuren weisen die allgemeine Formel (III) auf:
  • wobei jedes L unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus den Nukleobasen Thymin. Adenin, Cytosin, Guanin und Uracil, ausgewählt ist;
  • jedes R&sup7; jeweils Wasserstoff ist;
  • n eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist;
  • Rh OH, NH&sub2; oder -NHLysNH&sub2; ist; und
  • Ri H und COCH&sub3; ist.
  • Die Peptidnukleinsäuren der vorliegenden Erfindung werden durch die Anpassung von standardmäßigen Peptidsyntheseverfahren entweder in Lösung oder an einer festen Phase synthetisiert. Die verwendeten Synthone sind besonders gestaltete monomere Aminosäuren oder ihre aktivierten Derivate, die durch herkömmliche Schutzgruppen geschützt sind. Die Oligonukleotid-Analogen können auch durch Verwendung der entsprechenden Disäuren und Diamine synthetisiert werden.
  • Die neuartigen erfindungsgemäßen monomeren Synthone sind somit aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuren, Disäuren und Diaminen mit den allgemeinen Formeln:
  • ausgewählt, wobei L, A, B, C und D wie vorstehend definiert sind, mit der Ausnahme, daß jede der darin enthaltenen Aminosäuren durch eine Aminoschutzgruppe geschützt sein kann; E COOH oder ein aktiviertes Derivat davon ist; und F NHR³ oder NPgR³ ist, wobei R³ wie vorstehend definiert ist und Pg eine Aminoschutzgruppe ist.
  • Bevorzugte monomere Synthone der vorliegenden Erfindung sind Aminosäuren mit der Formel (VII):
  • oder Aminoschutzgruppen-enthaltende und/oder Säure-endständig-aktivierte Derivate davon, wobei R&sup7; Wasserstoff ist und L aus der Gruppe, bestehend aus den Nukleobasen Thymin (T), Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Uracil (U) und den geschützten Derivaten davon, ausgewählt ist.
  • Diese Verbindungen sind in unerwarteter Weise auch in der Lage, Duplex-DNA zu erkennen, indem sie einen Strang verdrängen, wobei wahrscheinlich eine Doppelhelix mit dem anderen erzeugt wird. Eine derartige Erkennung kann an dsDNA- Sequenzen, die 5-60 Basenpaare lang sind, ablaufen. Sequenzen zwischen 10 und 20 Basen sind von Interesse, da dies der Bereich ist, in dem in Prokaryonten und Eukaryonten einmalig vorkommende DNA-Sequenzen gefunden wurden. Reagenzien, die 17-18 Basen erkennen, sind von besonderem Interesse, da dies die Länge der einmalig vorkommenden Sequenzen im humanen Genom ist. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sollten auch in der Lage sein, Tripelhelices mit dsDNA zu bilden.
  • Während die verbesserte Bindung dieser Verbindungen der vorliegenden Erfindung sie als ein Antisense-Mittel wirksam machen sollte, wird erwartet, daß ein großer Bereich von verwandten Reagenzien eine Strangverdrängung bewirken kann, wobei dieses überraschende und unerwartete neue Verhalten von dsDNA nun gefunden wurde.
  • Somit liefert die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur Inhibierung der Expression einzelner Gene in den Zellen eines Organismus, umfassend die Verabreichung eines wie vorstehend definierten, spezifisch an die Sequenzen der Gene bindenden Reagenzes an den Organismus.
  • Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Inhibierung der Transkription und/oder der Replikation einzelner Gene oder zur Induktion des Abbaus einzelner Abschnitte der doppelsträngigen DNA in den Zellen eines Organismus durch die Verabreichung des wie vorstehend definierten Reagenzes an den Organismus bereit.
  • Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Abtötung von Zellen oder eines Virus durch Inkontaktbringen der Zellen oder des Virus mit dem wie vorstehend definierten, spezifisch an die Sequenzen des Genoms der Zellen oder Viren bindenden Reagenzes bereit.
    • Zusammenfassung der Figuren
  • Die zahlreichen Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung können dem Fachmann besser anhand der beigefügten Figuren verständlich werden, in denen: Fig. 1 ein natürlich vorkommendes Desoxyribooligonukleotid (A) und eine Peptidnukleinsäure (PNA) der vorliegenden Erfindung (B) zeigt.
  • Fig. 2 liefert Beispiele für natürlich vorkommende und nicht-natürlich vorkommende Nukleobasen zur DNA-Erkennung und Reportergruppen.
  • Fig. 3 liefert eine schematische Veranschaulichung von (a) der Photospaltung durch Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; (Acr-T10-LysNH&sub2;); (b) dem Photofootprinting durch das Diazo-verknüpfte Acr¹-(Taeg)&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; und der bevorzugten KMnO&sub4;-Spaltung; (c) der durch die S&sub1;-Nuklease gesteigerten Spaltung und (d) der Mikrokokken- Nukleasespaltung der Acr¹-(Taeg)&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; Bindungsstelle.
  • Fig. 4 liefert Beispiele für monomere PNA-Synthone der vorliegenden Erfindung.
  • Fig. 5 zeigt den Acr¹-Liganden und eine PNA, Acr¹-(Taeg)&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;.
  • Fig. 6 liefert ein allgemeines Schema zur Herstellung monomerer Synthone.
  • Fig. 7 liefert ein allgemeines Schema zur Herstellung des Acr¹-Liganden.
  • Fig. 8 liefert ein allgemeines Schema zur Festphasen-PNA-Synthese, wobei die Herstellung linearer, keine Schutzgruppen-enthaltender PNA-Amide veranschaulicht wird.
  • Fig. 9 zeigt analytische HPLC-Chromatogramme von: (A) ungereinigtem H- [Taeg]&sub1;&sub5;-NH&sub2; nach der HF-Spaltung (vor der Gefriertrocknung); (B) ungereinigtem Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-NH&sub2; nach der HF-Spaltung (vor der Gefriertrocknung); und (C) gereinigtem Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-NH&sub2;. Puffer A, 5% CH&sub3;CN/95% H&sub2;O/0,0445% TFA; Puffer B, 60% CH&sub3;CN/40% H&sub2;O/0,0390% TFA; linearer Gradient, 0-100% B in 30 min. Strömungsgeschwindigkeit, 1,2 ml/min. Säule, Vydac C&sub1;&sub8; (5 um, 0,46 · 25 cm).
  • Fig. 10 veranschaulicht die analytischen HPLC-Chromatogramme von: (A) gereinigtem H-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; und (B) gereinigtem H-[Taeg]&sub5;-Caeg-[Taeg]&sub4;-Lys-NH&sub2; unter Anwendung der gleichen Bedingungen wie in Fig. 9.
  • Die Fig. 11a und 11b zeigen die Bindung von AcrT10-Lys an dA&sub1;&sub0;. 5'-³²P- markiertes Oligonukleotid (1) (5'-GATCCA&sub1;&sub0;G) wurde in Abwesenheit oder Anwesenheit von Acr-T10-LysNH&sub2; und in Abwesenheit oder Anwesenheit des Oligonukleotids (2) (5'-GATCCT&sub1;&sub0;G) inkubiert und die Proben wurden durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) und Autoradiographie unter "nativen Bedingungen" (Fig. 11a) oder unter "denaturierenden Bedingungen" (Fig. 11b) analysiert.
  • Die Fig. 12a-c zeigen die chemische, photochemische und enzymatische Sondenanalyse des dsDNA-Acr-T10-LysNH&sub2;-Komplexes. Die Komplexe zwischen Acr- T10-LysNH&sub2; und einem ³²P-endständig markierten DNA-Fragment, das eine dA&sub1;&sub0;/dT&sub1;&sub0;-Zielsequenz enthält, wurden durch Affinitäts-Photospaltung mittels Sonden analysiert (Fig. 12a, Spuren 1-3; Fig. 12b, Spuren 1-3), durch Photofootprinting (Fig. 12a, Spuren 5-6), durch Kaliumpermanganat-Sondenanalyse (Fig. 12b, Spuren 4-6) oder durch Staphylococcus-Nuklease (Fig. 12b, Spuren 8-10) oder durch S&sub1;-Nuklease mittels Sonden analysiert (Fig. 12c). Es wurden entweder der A-Strang (Fig. 12a) oder der T-Strang (Fig. 12b, c) mittels Sonden analysiert.
  • Fig. 13 liefert ein Verfahren zur Synthese von Schutzgruppen enthaltenden PNA- Synthonen.
  • Fig. 14 liefert ein Verfahren zur Synthese eines Schutzgruppen enthaltenden monomeren Adenin-Synthons.
  • Fig. 15 liefert ein Verfahren zur Synthese eines Schutzgruppen enthaltenden monomeren Guanin-Synthons.
  • Fig. 16 liefert Beispiele für PNA-Gerüst-Veränderungen.
  • Fig. 17 liefert ein Verfahren zur Synthese von monomeren Thymin-Synthonen mit Seitenketten, die mit normalen Aminosäuren korrespondieren.
  • Die Fig. 18a und 18b liefern Verfahren zur Synthese eines Aminopropyl- Analogen bzw. eines Propionyl-Analogen von einem monomeren Thymin-Analogen.
  • Fig. 19 liefert ein Verfahren zur Synthese eines Aminoethyl-β-Alanin-Analogen von einem monomeren Thymin-Synthon.
  • Fig. 20 zeigt eine PAGE-Autoradiographie, die veranschaulicht, daß die PNAs -T&sub1;&sub0;, -T&sub9;C und -T&sub8;C&sub2; mit hoher Sequenzspezifität an doppelsträngige DNA binden.
  • Fig. 21 zeigt eine graphische Darstellung, die auf der densitometrischen Auswertung von PAGE-Autoradiographien basiert und die die Kinetik der Bindung von PNA- T&sub1;&sub0; an ein doppelsträngiges Ziel veranschaulicht.
  • Fig. 22 zeigt eine graphische Darstellung, die auf der densitometrischen Auswertung von PAGE-Autoradiographien basiert und die die thermischen Stabilitäten von PNAs verschiedener Längen, die an ein A&sub1;&sub0;/T&sub1;&sub0;-doppelsträngiges-DNA-Ziel gebunden sind, veranschaulicht.
  • Fig. 23 zeigt die Färbung eines Elektrophoresegels, die veranschaulicht, daß die Restriktionsenzymaktivität gegen DNA inhibiert wird, wenn PNA proximal an die Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms gebunden ist.
  • Fig. 24 zeigt eine PAGE-Autoradiographie, die veranschaulicht, daß ¹²&sup5;I-markierte PNA-T&sub1;&sub0; an ein komplementäres dA&sub1;&sub0;-Oligonukleotid bindet.
  • Fig. 25 zeigt eine Peptidnukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Fig. 26 zeigt die Syntheserichtung für eine Peptidnukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Fig. 27 liefert einen Test für die Tosylgruppe als eine Stickstoff-Schutzgruppe bei der Synthese von Peptidnukleinsäuren.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In den Oligonukleotid-Analogen und den monomeren Synthonen gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Ligand L vorrangig eine natürlich vorkommende Nukleobase, die in der in der Natur gefundenen Position gebunden ist, d.h. die Position 9 für Adenin oder Guanin, und die Position 1 für Thymin oder Cytosin. Alternativ kann L eine nicht-natürlich vorkommende Nukleobase (Nukleobase-Analoges), eine andere Basen-bindende Einheit, eine aromatische Einheit, (C&sub1;-C&sub4;)Alkanoyl, Hydroxy oder sogar Wasserstoff sein. Einige typische Nukleobasen-Liganden und Anschauungsbeispiele für synthetische Liganden sind in Fig. 2 dargestellt. Des weiteren kann L ein DNA-Interkalator, ein derartiger Reporterligand, wie beispielsweise ein Fluorophor, eine Radiomarkierung, eine Spinmarkierung, ein Hapten oder ein Proteinerkennender Ligand, wie Biotin, sein.
  • In monomeren Synthonen kann L mit Schutzgruppen blockiert sein. Dies wird in Fig. 4 veranschaulicht, wobei Pg¹ eine Säure, eine Base oder eine hydrogenolytisch oder photochemisch spaltbare Schutzgruppe, wie beispielsweise t-Butoxycarbonyl (Boc), Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) oder 2-Nitrobenzyl (2Nb), ist.
  • Die Verknüpfungsgruppe A kann eine Vielzahl von Gruppen sein, wie -CR¹R²CO-, - CR¹R²CS-, -CR¹R²CSe-, -CR¹R²CNHR³-, -CR¹R²C=CH&sub2;- und -CR¹R²C=C(CH&sub3;)&sub2;-, wobei R¹, R² und R³ wie vorstehend definiert sind. A ist vorzugsweise Methylencarbonyl (-CH&sub2;CO-). A kann auch eine längere Ketteneinheit, wie Propanoyl, Butanoyl oder Pentanoyl, sein oder das entsprechende Derivat, worin 0 durch einen anderen X-Wert ersetzt ist, oder die Kette ist mit R¹R² substituiert oder sie ist heterogen und enthält Y. Des weiteren kann A eine (C&sub2;-C&sub6;)Alkylenkette, eine mit R¹R² substituierte (C&sub2;-C&sub6;)Alkylenkette oder heterogen sein, wobei sie Y enthält. In bestimmten Fällen kann A eine Einfachbindung sein.
  • In der bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung ist B ein Stickstoffatom, wobei die Möglichkeit eines achiralen Gerüsts gegeben ist. B kann auch R³N&spplus; sein, wobei R³ wie vorstehend definiert ist.
  • In der bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung ist C -CR&sup6;R&sup7;-, es kann jedoch auch eine zwei Kohlenstoffatome enthaltende Einheit sein, d.h. -CHR&sup6;CHR&sup7;- oder -CR&sup6;R&sup7;CH&sub2;-, wobei R&sup6; und R&sup7; wie vorstehend definiert sind. R&sup6; und R&sup7; können auch eine derartige Heteroarylgruppe, wie beispielsweise Pyrrolyl, Furyl, Thienyl, Imidazolyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Indolyl, sein, oder sie können zusammen ein alicyclisches System, wie beispielsweise 1,2-Cyclobutandiyl, 1,2-Cyclopentandiyl oder 1,2- Cyclohexandiyl, vervollständigen.
  • In einer bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung ist E in dem monomeren Synthon COOH oder ein aktiviertes Derivat davon, und G ist in dem Oligomer -CONR³-. Die Aktivierung kann beispielsweise durch Verwendung eines Säureanhydrids oder eines wirksamen Esterderivats erreicht werden, worin, der durch E dargestellte Wasserstoff in den Gruppen durch eine Fluchtgruppe ersetzt ist, welche zur Erzeugung eines wachsenden Gerüsts geeignet ist.
  • Die das Gerüst bildenden Aminosäuren können identisch oder verschieden sein. Es wurde festgestellt, daß diejenigen, die auf 2-Aminoethylglycin basieren, für den Zweck der vorliegenden Erfindung besonders geeignet sind.
  • In einigen Fällen kann es von Interesse sein, Liganden an einen der Termini (Q, I) zu binden, um die Bindungscharakteristika der PNAs zu modulieren. Repräsentative Liganden schließen DNA-Interkalatoren, welche die dsDNA-Bindung verbessern, oder basische Gruppen, wie Lysin oder Polylysin, welche die Bindung von PNA über elektrostatische Wechselwirkungen stärken, ein. Um die negativ geladenen Gruppen zu verringern, können Gruppen, wie Carboxy- oder Sulfogruppen, verwendet werden. Die Gestaltung der Synthone ermöglicht weiterhin die Lokalisation solcher Einheiten in nicht-terminalen Positionen.
  • Hinsichtlich eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung sind PNA-Oligomere mit niedermolekularen Effektorliganden, wie mit Liganden, die Nukleaseaktivität oder alkylierende Aktivität besitzen, oder mit Reporterliganden (fluoreszierend, Spinmarkiert, radioaktiv, Protein erkennende Liganden, z.B. Biotin oder Haptene) konjugiert.
  • Hinsichtlich eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung sind die PNAs mit Peptiden oder Proteinen konjugiert, wobei die Peptide Signalaktivität aufweisen und die Proteine sind beispielsweise Enzyme, Transkriptionsfaktoren oder Antikörper. Die PNAs können auch an wasserlösliche oder nicht-wasserlösliche Polymere gebunden sein. Hinsichtlich eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung sind die PNAs mit Oligonukleotiden oder Kohlenhydraten konjugiert. Falls erwünscht, kann ein PNA-Oligomer auf einigen Einheiten (z.B. eine Peptidkette, Reporter, Interkalator oder andere Typen von Ligand-enthaltenden Gruppen) synthetisiert werden, die an einen festen Träger gebunden sind.
  • Derartige Konjugate können zur Genmodulation (z.B. auf ein Gen zielende Arzneistoffe), zur Diagnostik, für die Biotechnologie und für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden.
  • Hinsichtlich eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung können PNAs auch zur Bindung an RNA und ssDNA verwendet werden, um sowohl Gen-regulierende Einheiten des Antisense-Typs als auch Hybridisierungssonden zur Identifizierung und Reinigung von Nukleinsäuren herzustellen. Weiterhin können die PNAs derart modifiziert werden, daß sie Tripelhelices mit dsDNA bilden können. Reagenzien, die sequenzspezifisch an dsDNA binden, besitzen Anwendungsmöglichkeiten als auf ein Gen zielende Arzneistoffe. Diese werden als außerordentlich geeignete Arzneistoffe zur Behandlung von Krankheiten, wie Krebs, AIDS und anderen Virusinfektionen, angesehen und können sich auch zur Behandlung einiger genetischer Erkrankungen als wirksam erweisen. Weiterhin können diese Reagenzien auch in der Forschung und zum diagnostischen Nachweis und zur Isolierung von spezifischen Nukleinsäuren angewendet werden.
  • Es wird vermutet, daß das tripelhelikale Prinzip das einzige, auf dem Fachgebiet bekannte Prinzip zur sequenzspezifischen Erkennung von dsDNA ist. Die Tripelhelix- Bildung ist jedoch auf die Erkennung von Homopurin-Homopyrimidin-Sequenzen beschränkt. Die Strangverdrängung ist der Triplehelix-Erkennung überlegen, da sie die Erkennung jeglicher Sequenz durch die Anwendung der vier natürlichen Basen gestattet. Auch bei der Strangverdrängung erfolgt die Erkennung bei physiologischen Bedingungen, das sind neutraler pH-Wert, Umgebungstemperatur (20-40ºC) und mittlere Ionenstärke (100-150 mM).
  • Auf ein Gen zielende Arzneistoffe werden mit einer Nukleobase-Sequenz (10-20 Einheiten enthaltend) gestaltet, die zum regulierenden Abschnitt (der Promotor) des Zielgens komplementär ist. Daher bindet der Arzneistoff bei seiner Verabreichung an den Promotor und blockt dabei erfolgreich die RNA-Polymerase. In der Konsequenz wird keine mRNA und somit kein Genprodukt (Protein) hergestellt. Wenn sich das Ziel bzw. Target innerhalb eines vitalen Gens für einen Virus befindet, werden keine lebensfähigen Virusteilchen hergestellt. Alternativ kann sich das Ziel bzw. Target strangabwärts vom Promotor befinden, was bewirkt, das die RNA-Polymerase in dieser Position abbricht, somit wird ein verkürztes RNA/Protein gebildet, das nicht funktionsfähig ist.
  • Die sequenzspezifische Erkennung von ssDNA durch Basen-komplementäre Hybridisierung kann in ähnlicher Weise an zielspezifischen Genen und Viren ausgeführt werden. In diesem Fall ist die Zielsequenz derart in der mRNA enthalten, daß die Bindung des Arzneistoffs an das Ziel die Wirkung der Ribosomen und in der Konsequenz die Translation der mRNA zum Protein behindert. Die Peptidnukleinsäuren der vorliegenden Erfindung sind den vorhergehenden Reagenzien überlegen, da sie eine wesentlich höhere Affinität für komplementäre ssDNA aufweisen. Sie besitzen auch keine Ladung und sind wasserlöslich, was die zelluläre Aufnahme erleichtert und sie enthalten Amide nicht-biologischer Aminosäuren, die sie biostabil und gegenüber dem enzymatischen Abbau von beispielsweise Proteasen resistent machen.
  • Bestimmte biochemische/biologische Eigenschaften von PNA-Oligomeren werden durch die nachfolgenden Versuche veranschaulicht.
    • 1. Sequenzunterscheidung auf dem dsDNA-Niveau (Beispiel 63, Fig. 20)
  • Unter Verwendung des S&sub1;-Nuklease-Sonden-Verfahrens wurde die Unterscheidung der Bindung von T&sub1;&sub0;-, T&sub5;CT&sub4;(T&sub9;C)- & T&sub2;CT&sub2;CT&sub4;(T&sub8;C&sub2;)-PNA an die Erkennungssequenzen A&sub1;&sub0;, A&sub5;GA&sub4; (A&sub9;G) & A&sub2;GA&sub2;GA&sub4; (A&sub8;G&sub2;), die in die BamHI-, SaII- oder PstI- Stelle des Plasmids pUC9 Moniert sind, analysiert. Die Ergebnisse (Fig. 20) zeigen, daß die drei PNAs mit den nachfolgenden relativen Wirksamkeiten an ihre entsprechenden Erkennungssequenzen binden: PNA -T&sub1;&sub0;: A&sub1;&sub0; > A&sub9;G > > A&sub8;G&sub2;, PNA -T&sub9;C: A&sub9;G > A&sub1;&sub0; A&sub8;G&sub2;, PNA -T&sub8;C&sub2;: A&sub8;G&sub2; ≥ A&sub9;G > > A&sub1;&sub0;. Somit führt bei 37ºC ein nicht- Treffer innerhalb der zehn zu einer verringerten Wirksamkeit (5-10mal bestimmt), wohingegen zwei nicht-Treffer nicht akzeptiert werden.
    • 2. Kinetik der PNA-T&sub1;&sub0;-dsDNA-Strangverdrängungs-Komplexbildung (Beispiel 66, Fig. 21)
  • Die Komplexbildung wurde durch S&sub1;-Nuklease zu verschiedenen Zeiten nach dem Mischen von PNA und einem ³²P-markiertem dsDNA-Fragment mittels Sonden analysiert (Fig. 21).
    • 3. Stabilität des PNA-dsDNA-Komplexes (Beispiel 67, Fig. 22)
  • Es wurden Komplexe zwischen PNA-Tn und dem ³²P-dsDNA (A&sub1;&sub0;/T&sub1;&sub0;)-Ziel gebildet (60 min. 37ºC). Die Komplexe wurden dann bei der erwünschten Temperatur 10 min in Anwesenheit eines Überschusses an Oligo-dA&sub1;&sub0; inkubiert, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit KMnO&sub4; mittels Sonden analysiert. Die Ergebnisse (Fig. 22) zeigen, daß die thermische Stabilität der PNA-dsDNA-Komplexe die der PNA- Oligonukleotid-Komplexe, ausgedrückt als Tm-Wert, widerspiegelt.
    • 4. Inhibierung der Restriktionsenzym-Spaltung durch PNA (Beispiel 65, Fig. 23)
  • Das Plasmidkonstrukt, pT10, enthält einen dA&sub1;&sub0;/dT&sub1;&sub0;-Trakt, der in die BamHI-Stelle in pUC10 kloniert ist. Somit führt die Spaltung vom pT10 mit BamHI und Pvull zu zwei kleinen DNA-Fragmenten von 211 Bp bzw. 111 Bp. In Anwesenheit von PNA- T&sub1;&sub0; wird ein 336 Bp Fragment erhalten, was der Spaltung nur durch Pvull entspricht (Fig. 23). Somit ist die Spaltung durch BamHI durch PNA, das proximal an die Restriktionsenzymstelle gebunden ist, inhibiert. Die Ergebnisse zeigen auch, daß der PNA-dsDNA-Komplex in 100%iger Ausbeute gebildet werden kann. Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn das pT8C2-Plasmid und PNA-T&sub8;C&sub2; verwendet werden.
    • 5. Bindung von ¹²&sup5;I-markierter PNA an Oligonukleotide (Beispiel 63, Fig. 24)
  • Ein Tyr-PNA-T&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; wurde unter Verwendung von Na ¹²&sup5;I und Chloramin-T mit ¹²&sup5;I markiert und mittels HPLC gereinigt. Durch PAGE und Autoradiographie wurde gezeigt, daß das ¹²&sup5;I-PNA-T&sub1;&sub0; an Oligo-dA&sub1;&sub0; bindet (Fig. 24). Die Bindung kann durch einen Überschuß an denaturierter Kalbsthymus-DNA verdrängt werden.
  • Die sequenzspezifische Erkennung von dsDNA wird durch die Bindung einer PNA, die aus 10 Thymin-substituierten 2-Aminoethylglycyl-Einheiten besteht, welche am C-terminalen Ende ein Lysinamid und am N-terminalen Ende einen 9-Aminoacridin- Komplexliganden (9-Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;, Fig. 11a, 11b) enthält, an einer dA&sub1;&sub0;/dT&sub1;&sub0;-Zielsequenz veranschaulicht. Das Ziel ist in einem 248 Bp ³²P-endständig markierten DNA-Fragment enthalten.
  • Die Strangverdrängung wurden durch die nachfolgenden Experimente ermittelt:
  • 1) Von dem 9-Acr¹-Ligand (Fig. 5), der mit einer 4-Nitrobenzamid-Gruppe ausgestattet ist, um die DNA-Spaltung durch Bestrahlung zu gewährleisten, wird erwartet, daß er die DNA nur in enger proximaler Stellung zu seiner Bindungsstelle spaltet. Nach der Bestrahlung der PNA mit dem vorstehend genannten 248 Bp DNA- Fragment wird eine selektive Spaltung an der dA-&sub1;&sub0;/dT-&sub1;&sub0;-Sequenz beobachtet (Fig. 3a)
  • 2) In einem sogenannten Photofootprinting-Assay, in dem ein synthetisches Diazoverknüpftes Acridin unter Bestrahlung DNA spaltet (ausgenommen, die DNA ist durch die Bindungssubstanz geschützt), durch Wechselwirkung mit DNA in Anwesenheit einer DNA-bindenden Substanz.
  • Ein derartiger Versuch wurde mit dem vorstehend genannten 248 Bp dsDNA- Fragment, das einen eindeutigen Schutz gegen die Photospaltung der PNA- Bindungsstelle zeigte, durchgeführt (Fig. 3b).
  • 3) In einem ähnlichem Versuch zeigte das DNA-spaltende Enzym Mikrococcus- Nuklease, welches auch durch die meisten DNA-bindenden Reagenzien in seiner Wirkung behindert wird, eine erhöhte Spaltung an dem T&sub1;&sub0;-Ziel (Fig. 3c).
  • 4) In einem noch anderen Versuchstyp wurde die gut bekannte, hohe Anfälligkeit von einsträngigen Thyminliganden (im Vergleich zu doppelsträngigen Thyminliganden) gegen die Kaliumpermanganat-Oxidation ausgenutzt. Das 248 Bp Fragment zeigte in Anwesenheit des Reagenz nur am T&sub1;&sub0;-Strang des Ziels eine Oxidation (Fig. 3b).
  • 5) In einem ähnlichen Typ der Veranschaulichung zeigte die Einstrangspezifität der S&sub1;-Nuklease eindeutig, daß nur der T&sub1;&sub0;-Strang des Ziels angegriffen wurde (Fig. 3d).
  • Die äußerst wirksame Bindung von [Taeg]&sub1;&sub0;, (Taeg)&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; und Acr¹-(Taeg)&sub1;&sub0;- Lys-NH&sub2; (Fig. 11a, 11b) an das korrespondierende dA&sub1;&sub0; wurde des weiteren auf zwei Wegen veranschaulicht:
  • 1. Die Ligand-Oligonukleotid-Komplexe migrieren in der Elektrophorese in Polyacrylamidgelen langsamer als die nackten Oligonukleotide. Folglich wurden derartige Versuche mit Acr¹-(Taeg)&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; und endständig ³²P-markiertem dA&sub1;&sub0; durchgeführt. Diese zeigte sowohl unter Bedingungen, in denen ein normaler dA&sub1;&sub0;/dT&sub1;&sub0;- Duplex stabil ist, als auch unter Bedingungen, in denen ein derartiger Duplex instabil ist (denaturierendes Gel), eine verzögerte Migration. Mit einem Gemisch aus Acr¹- (Taeg)&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; und endständig ³²P-markiertem dT&sub1;&sub0; wurde ein Kontrollversuch durchgeführt, der unter den vorstehend genannten Bedingungen keine Verzögerung zeigte.
  • 2. Bei der Bildung von DNA-Duplexen (dsDNA) aus einsträngiger DNA sinkt der Extinktionskoeffizient (Hypochromizität). Somit kann die Denaturierung von DNA durch Veränderungen in der Absorption verfolgt werden, beispielsweise als Funktion von Tm, die Temperatur, bei der aus 50% eines Duplexes Einstränge entstanden sind.
  • Aus den nachstehend aufgeführten einsträngigen Oligodesoxyribonukleotiden und PNAs wurden Duplexe gebildet. Im allgemeinen wurden 0,3 OD&sub2;&sub6;&sub0; des T-reichen Stranges mit 1 Äquivalent des anderen Stranges durch 5 minütiges Erhitzen auf 90ºC, Abkühlen und 30 minütigem Belassen bei Raumtemperatur und abschließend Aufbewahren in einem Kühlschrank bei 5ºC für mindestens 30 min hybridisiert. Die verwendeten Puffer enthielten alle 10 mM Phosphat und 1 mM EDTA.
  • Die Puffer mit niedrigem Salzgehalt enthielten kein Natriumchlorid, wohingegen die Puffer mit mittlerem Salzgehalt 140 mM NaCl und die Puffer mit hohem Salzgehalt 500 mM NaCl enthielten. Der pH-Wert aller Puffer betrug 7,2. Die Schmelztemperatur der Hybride wurde mit einer Gilford-Response-Apparatur bestimmt. Die nachfolgenden Extinktionskoeffizienten wurden verwendet A: 15,4 ml/uMol cm; T: 8,8; G: 11,7 und C: 7,3, sowohl für normale Oligonukleotide, als auch für PNA. Die Schmelzkurven wurden in Schritten von 0,5ºC/min verfolgt. Die Tm-Werte wurden aus dem Maximum des ersten Derivats durch die Gegenüberstellung von A&sub2;&sub6;&sub0; gegen die Temperatur bestimmt.
    • Liste der Oligodesoxyribonukleotide:
  • 1. 5'-AAA-AAA-AA
  • 2. 5'-AAA-AAA-AAA-A
  • 3. 5'-TTT-TTT-TTT-T
  • 4. 5'-AAA-AAG-AAA-A
  • 5. 5'-AAG-AAG-AAA-A
  • 6. 5'-AAA-AGA-AAA-A
  • 7. 5' AAA-AGA-AGA-A
  • 8. 5'-TTT-TCT-TTT-T
  • 9. 5'-TTT-TCT-TCT-T
  • 10. 5'-TTT-TTC-TTT-T
  • 11. 5'-TTT-TTC-TTC-T
  • 12. 5'-TTC-TTC-TTT-T
  • 13. 5'-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT
  • 14. 5'-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA
    • Liste der PNAs
  • a. TTT-TTT-TTT-T-Lys-NH&sub2;
  • b. TTT-TTT-TT-Lys-NH&sub2;
  • c. TTT-TTC-TTT-T-Lys-NH&sub2;
  • d. TTC-TTC-TTT-T-Lys-NH&sub2;
  • e. Acr-TTT-TTT-TTT-T-Lys-NH&sub2;
  • f. Ac-TTT-TTT-TTT-T-Lys-NH&sub2;
  • * = Es wurden zwei verschiedene Schmelztemperaturen beobachtet, was auf ein lokales Schmelzen vor der vollständigen Denaturierung hinweist
  • Das zwischen RNA-A (Poly rA) und PNA-T&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; gebildete Hybrid schmilzt bei einer derart hohen Temperatur, daß diese nicht meßbar war (> 90ºC). Die spezifische Hybridisierung wird jedoch durch die große Verschiebung in A&sub2;&sub6;&sub0; veranschaulicht, die beim Mischen mit RNA-A erfolgt, nicht aber beim Mischen mit G, C und U. Der Versuch wird ausgeführt, indem 1 ml einer Lösung der PNA und 1 ml einer Lösung der RNA, jeweils mit einer A&sub2;&sub6;&sub0; = 0,6, gemischt werden und anschließend die Absorption bei 260 nm gemessen wird. Danach wird die Probe 5 min auf 90ºC erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und 30 min bei dieser Temperatur belassen und anschließend 30 min bei 5ºC gelagert.
  • Aus den vorstehend genannten Messungen können die folgenden Schlußfolgerungen abgeleitet werden. Es gibt ein "Base stacking", da eine Schmelzkurve beobachtet wird. Das PNA-DNA-Hybrid ist stabiler als das normale DNA-DNA-Hybrid und das PNA-RNA-Hybrid ist sogar noch stabiler. Fehlende Treffer bewirken ein wesentliches Abfallen im Tm-Wert, unabhängig davon, ob sich die ungepaarte Base im DNA- oder im PNA-Strang befindet. Der Tm-Wert ist im Gegensatz zu den normalen Oligonukleotiden nur geringfügig von der Ionenstärke abhängig.
  • Die Synthese der PNAs gemäß der vorliegenden Erfindung wird im einzelnen nachfolgend diskutiert, wobei Fig. 1 eines der bevorzugten PNA-Beispiele veranschaulicht und seine Struktur mit der einer komplementären DNA vergleicht.
    • Synthese von PNA-Oligomeren und Polymeren
  • Das Prinzip der Verankerung von Molekülen auf einer festen Matrix, welches dazu dient, die Zwischenprodukte während der chemischen Umsetzungen zu berücksichtigen, ist als Festphasen-Synthese oder Merrifield-Synthese bekannt (siehe z.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149 und Science, 1986, 232, 341): Etablierte Verfahren zur schrittweisen oder fragmentweisen Festphasen-Zusammensetzung von Aminosäuren zu Peptiden werden normalerweise an einer kugelförmigen Matrix aus einem gering vernetzten Styrol-Divinylbenzol-Copolymer durchgeführt, wobei das vernetzte Copolymer durch Perlpolymerisation eines Styrol-Monomers dem ein Gemisch aus Divinylbenzolen zugesetzt wurde, gebildet wurde. Üblicherweise wird eine Vernetzung von 1-2% angewendet. Eine derartige Matrix kann gemäß der vorliegenden Erfindung auch bei der PNA-Festphasen-Synthese verwendet werden (Fig. 8).
  • Bezüglich der anfänglichen Funktionalisierung der festen Phase wurden in Verbindung mit der traditionellen Festphasen-Peptidsynthese mehr als fünfzig Verfahren beschrieben (siehe z.B. Barany und Merrifield in "The Peptides" Bd. 2, Academic Press, New York, 1979, S. 1-284 und Stewart und Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Ausg., Pierce Chemical Company, Illinois, 1984). Am häufigsten werden Reaktionen zur Einführung einer Chlormethyl-Funktionalität (Merrifield-Harz; über eine Chlormethylmethylether/SnCl&sub4;-Reaktion), einer Aminomethyl-Funktionalität (über eine N-Hydroxymethylpthalimid-Reaktion; siehe Mitchell, et al., Tetrahedron Lett., 1976, 3795) und einer Benzhydrylamino-Funktionalität (Pietta, et al., J. Chem. Soc., 1970, 650) angewendet. Ungeachtet ihrer Natur ist es normalerweise der Zweck der Funktion, eine Verankerungsverknüpfung zwischen dem festen Copolymer-Träger und dem C-terminalen Ende der ersten Aminosäure, die an den festen Träger gekuppelt werden soll, zu bilden. Wie man erkennen wird, können die Verankerungsverknüpfungen auch zwischen dem festen Träger und dem N-terminalen Ende der Aminosäure gebildet werden. Es ist im allgemeinen günstig, die "Konzentration" einer funtionellen Gruppe als Millimol pro Gramm (mMol/g) auszudrücken. Andere reaktive Funktionen, die anfänglich eingeführt worden sind, schließen 4- Methylbenzhydrylamino und 4-Methoxybenzhydrylamino ein. Alle diese etablierten Verfahren sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung prinzipiell geeignet. Bevorzugte Verfahren zur PNA-Synthese wenden Aminomethyl als anfängliche Funktion an, da Aminomethyl einen besonderen Vorteil bezüglich des Einbaus der "Spacer"- oder "Handle"-Gruppe aufweist, im Hinblick auf die Reaktivität der Aminogruppe der Aminomethyl-Funktion bezüglich der im wesentlichen quantitativen Bildung von Aminobindungen an eine Carboxylgruppe an einem Ende des Spacerbildenden Reagenz. Es sind eine große Zahl von relevanten Spacer- oder Handlebildenden Gruppen beschrieben worden (siehe Barany, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 30, 705), insbesondere Reagenzien, die gegenüber derartigen Aminogruppen, wie sie in der Aminomethyl-Funktion festgestellt wurden, reaktiv sind. Repräsentative bifunktionelle Reagenzien schließen 4-(Halogenalkyl)aryl-Niederalkansäuren, wie 4-(Brommethyl)phenylessigsäure, Boc-aminoacyl-4-(oxymethyl)aryl- Niederalkansäuren, wie Boc-aminoacyl-4-(oxymethyl)phenylessigsäure, N-Boc-p- acylbenzhydrylamine, wie N-Boc-p-glutaroylbenzhydrylamin, N-Boc-4'-Niederalkyl-p- acylbenzhydrylamine, wie N-Boc-4'-methyl-p-glutaroylbenzhydrylamin, N-Boc-4'- Niederalkoxy-pacylbenzhydrylamine, wie N-Boc-4'-methoxy-p-glutaroyl-benzhydrylamin und 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure, ein. Ein innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung relevanter Spacergruppen-Typ ist die Phenylacetamidomethyl (Pam)-Handle-Gruppe (Mitchell und Merrifield, J. Org. Chem., 1976, 41, 2015), welche infolge der elektronenziehenden Wirkung der 4-Phenylacetamidomethyl-Gruppe etwa 100mal stabiler als die klassische Benzylester-Verknüpfung gegen das Boc-amino-Schutzgruppen-entfernende Reagenz Trifluoressigsäue (TFA) ist.
  • Bestimmte Funktionalitäten (z.B. Benzhydrylamino, 4-Methylbenzhydrylamino und 4- Methoxybenzhydrylamino), die zum Zweck einer derartigen Spaltung einer synthetisierten PNA-Kette von dem festen Träger einbezogen werden können, so daß das C-terminale Ende der PNA-Kette in der Amidform vorliegt, erfordern keine Einführung einer Spacergruppe. Jede derartige Funktion im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft angewendet werden.
  • Eine alternative Strategie bezüglich der Einführung von Spacer- oder Handle- Gruppen ist die sogenannte "performed handle"-Strategie (siehe Tarn, et al., Synthesis, 1979, 955-957), die eine vollständige Steuerung der Kupplung der ersten Aminosäure bietet und die Möglichkeit Komplikationen auszuschließen, welche sich aus der Anwesenheit unerwünschter funktioneller Gruppen ergeben, die keinen Bezug zur Peptid- oder PNA-Synthese besitzen. Bei dieser Strategie werden die Spacer- oder Handle-Gruppen, des gleichen, wie vorstehend beschriebenen Typs mit der ersten Aminosäure, von der erwünscht wird, daß sie an den festen Träger bindet, umgesetzt, die Aminosäure enthält N-Schutzgruppen und enthält gegebenenfalls an den anderen Seitenketten, die im Hinblick auf das Wachstum der erwünschten PNA- Kette nicht von Bedeutung sind, Schutzgruppen. Somit kann in den Fällen, in denen eine Spacer- oder Handle-Gruppe erwünscht ist, die an den festen Träger zu kuppelnde Aminosäure entweder an das freie reaktive Ende einer Spacergruppe, die an der anfänglich eingeführten Funktion gebunden ist (z.B. eine Aminomethyl-Gruppe), gekuppelt werden oder sie kann mit dem Spacerbildenden Reagenz umgesetzt werden. Das Spacer-bildende Reagenz wird dann mit der anfänglich eingeführten Funktion umgesetzt. Andere geeignete Verankerungs-Schemata schließen die "multi separat abtrennbaren" Harze ein (Tarn, et al., Tetrahedron Lett., 1979, 4935 und J. Am. Soc., 1980, 102, 611; Tarn, J. Org. Chem., 1985, 50, 5291), welche mehr als einen Freisetzungsmodus liefern und daher eine größere Flexibilität in der synthetischen Gestaltung gestatten.
  • Eine geeignete Wahl zum N-Schutz sind die tert-Butyloxycarbonyl (Boc)-Gruppe (Carpino, J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 4427; McKay, et al., J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 4686; Andersen, et al., J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 6180), normalerweise in Kombination mit Benzyl-basierenden Gruppen zum Schutz von Seitenketten und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe (Carpino, et al., J. Am. Chem. Soc., 1970, 92, 5748 und J. Org. Chem., 1972, 37, 3404), normalerweise in Kombination mit tert-Butyl (tBu) zum Schutz jeglicher Seitenketten, obwohl es viele andere Möglichkeiten gibt, die bei der herkömmlichen Festphasen-Peptidsynthese gut bekannt sind. Es gibt somit eine Vielzahl anderer geeigneter Amino-Schutzgruppen, einige davon sind Adoc (Hass, et al., J. Am. Chem. Soc., 1966, 88, 1988), Bpoc (Sieber, Helv. Chem. Acta, 1968, 51, 614), Mcb (Brady, et al., J. Org. Chem., 1977, 42, 143), Bic (Kemp, et al., Tetrahedron, 1975, 4624), das o-Nitrophenylsulfenyl (Nps) (Zervas, et al., J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 3660) und das Dithiasuccinoyl (Dts) (Barany, et al., J. Am. Chem. Soc., 1977, 99, 7363). Diese Amino- Schutzgruppen, insbesondere die, die auf der häufig verwendeten Urethangruppe basieren, verhindern während der Kupplung der meisten α-Aminoäuren erfolgreich die Racemisierung (vermittelt durch die Tautomerisierung der leicht gebildeten Oxazolinon (Azlacton)-Zwischenprodukte (Goodman, et al., J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 2918)). Beim Aufbau der PNA-Moleküle können zusätzlich zu derartigen Amino- Schutzgruppen eine Vielzahl andersartiger "wertloser" Amino-Schutzgruppen, die nicht zum Urethan-Typ gehören, angewendet werden, insbesondere die, die aus einer achiralen Einheit bestehen. Somit sind nicht nur die vorstehend erwähnten Amino-Schutzgruppen (oder die, die sich von jeder dieser Gruppen ableiten) im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung geeignet, sondern praktisch jede Amino- Schutzgruppe, welche zum großen Teil die nachfolgenden Anforderungen erfüllt: (1) Stabilität gegenüber milden Säuren (nicht wesentlich durch Carboxylgruppen angegriffen); (2) Stabilität gegenüber milden Basen und Nukleophilen (nicht wesentlich durch die in Frage kommenden Aminogruppen angegriffen); (3) Resistenz gegenüber Acylierung (nicht wesentlich durch aktivierte Aminosäuren angegriffen). Zudem: (4) muß sich die Schutzgruppe fast quantitativ, ohne verschiedene Nebenreaktionen entfernen lassen und (5) die optische Integrität, falls überhaupt, der einzubauenden Aminosäuren sollte nach der Kupplung vorzugsweise stark bewahrt werden. Schließlich hängt die Auswahl der Seitenketten-Schutzgruppen im allgemeinen von der Wahl der Amino-Schutzgruppen ab, da der Schutz der Seitenketten-Funktionalitäten den Bedingungen der wiederholten Amino-Schutzgruppen entfernenden Reaktionszyklen widerstehen muß. Dies gilt, unabhängig davon ob die Gesamtstrategie zur chemischen Zusammensetzung von PNA-Molekülen beispielsweise auf der unterschiedlichen Säurestabilität der Amino- und Seitenketten-Schutzgruppen beruht (wie es der Fall für das vorstehend erwähnte "Boc-benzyl"-Verfahren ist) oder sie eine orthogonale Strategie, das bedeutet, ein chemoselektives Schutzschema anwendet (wie es der Fall für das vorstehend erwähnte "Fmoc-tBu"-Verfahren ist).
  • Nach der Kupplung der ersten Aminosäure ist der nächste Schritt der Festphasen- Synthese der systematische Aufbau der gewünschten PNA-Kette. Dieser Aufbau beinhaltet wiederholte Schutzgruppen-Entfernungs/Kupplungszyklen. Die zeitweilige Schutzgruppe, wie eine Boc- oder Fmoc-Gruppe, an der zuletzt gekuppelten Aminosäure wird durch eine geeignete Behandlung quantitativ entfernt, beispielsweise durch Azidolyse, wie mit Trifluoressigsäure bei Boc oder durch Behandlung mit einer Base, wie mit Piperidin im Fall von Fmoc, um die N-terminale Aminfunktion freizusetzen.
  • Anschließend wird die nächste gewünschte N-Schutzgruppen enthaltende Aminosäure an das N-terminale Ende der zuletzt gekuppelten Aminosäure gekuppelt. Diese Kupplung des C-terminalen Endes einer Aminosäure mit dem N-terminalen Ende der zuletzt gekuppelten Aminosäure kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Die Carboxylgruppe der eintretenden Aminosäure kann beispielsweise direkt mit dem N-terminalen Ende der zuletzt gekuppelten Aminosäure mit Hilfe eines Kondensationsreagenzes, wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (Sheehan & Hess, et al., J. Am. Chem. Soc., 1955, 77, 1067) und Diisopropylcarbodiimid (DIC) (Sraantakis et al., Biochem. biophys. res. Commun., 1976, 73, 336) oder Derivaten davon, umgesetzt werden. Alternativ kann es gebunden werden, indem die eintretende Aminosäure in einer Form bereitgestellt wird, in der die Carboxylgruppe durch eines der verschiedenen Verfahren aktiviert ist, einschließlich der anfänglichen Bildung eines aktiven Esterderivats, wie ein 2,4,5-Trichlorphenylester (Pless, et al., Helv. Chim. Acta, 1963, 46, 1609), ein Phthalimidester (Nefkens, et al., J. Am. Chem. Soc., 1961, 83, 1263), ein Pentachlorphenylester (Kupryszewski, Rocz. Chem., 1961, 35, 595), ein Pentafluorphenylester (Kovacs, et al., J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 183), ein o-Nitrophenylester (Bodanzsky, Nature, 1955, 175, 685), ein Imidazolester (Li, et al., J. Am. Chem. Soc., 1970, 92, 7608) und ein 3-Hydroxy- 4-oxo-3,4-dihydrochinonazolin (Dhbt-OH)-ester (Konig, et al., Chem. Ber., 1973,103, 2024 und 2034) oder der anfänglichen Bildung eines Anhydrids, wie ein symmetrisches Anhydrid (Wieland, et al., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1971, 10, 336). Benzotriazolyl-N-oxytrisdimethylaminophosphoniumhexafluorphosphat (BOP), "Castro's Reagenz" (siehe z.B. Rivaille, et al., Tetrahedron, 1980, 36, 3413) wird empfohlen, wenn die sich zusammensetzenden PNA-Moleküle sekundäre Aminosäuren enthalten. Schließlich sind auch aktivierte monomere PNA-Analoge zu den kürzlich beschriebenen Aminosäurefluoriden (Carpino, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 9651) zur Verwendung in der PNA-Synthese vielversprechend.
  • Nach dem Aufbau der erwünschten PNA-Kette einschließlich der Schutzgruppen ist der nächste Schritt normalerweise die Entfernung der Schutzgruppen von den Aminosäureeinheiten der PNA-Kette und die Spaltung der synthetisierten PNA von dem festen Träger. Diese Abläufe können im wesentlichen gleichzeitig ablaufen, wodurch das freie PNA-Molekül in der erwünschten Form bereitgestellt wird. Alternativ ist es in den Fällen, in denen die Kondensation von zwei getrennt synthetisierten PNA- Ketten abläuft, möglich, durch die Wahl einer geeigneten Spacer-Gruppe am Anfang der Synthese die erwünschten PNA-Ketten von ihren entsprechenden festen Trägern abzuspalten (beide Peptidketten enthalten noch ihre Seitenketten-Schutzgruppen) und schließlich zur Bildung einer längeren Peptidkette die Seitenketten- Schutzgruppen zu entfernen, beispielsweise nach der Kupplung der zwei, in den Seitenketten Schutzgruppen enthaltenden Peptidketten.
  • In dem vorstehend erwähnten "Boc-benzyl"-Schutzschema wird die abschließende Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten und die Freisetzung des PNA- Moleküls von dem festen Träger meistens durch Anwendung starker Säuren, wie wasserfreie HF (Sakakibara, et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1965, 38, 4921), Bortris(trifluoracetat) (Pless, et al., Helv. Chim. Acta, 1973, 46, 1609) und Sulfonsäuren, wie Trifluormethansulfonsäure und Methansulfonsäure (Yajima, et al., J. Chem. Soc., Chem. Comm., 1974, 107), durchgeführt. Dieses übliche Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppen mittels starker Säuren (z.B. wasserfreie HF) liefert sehr reaktive Carbokationen, die zur Alkylierung und Acylierung von empfindlichen Resten in der PNA-Kette führen können. Derartige Nebenreaktionen können nur teilweise durch die Anwesenheit von Fängern, wie Anisol, Phenol, Dimethylsulfid und Mercaptoethanol, vermieden werden, deshalb wird häufig das durch Sulfid unterstützte, azidolytische SN2-Schutzgruppen-Entfernungsverfahren (Tarn, et al., J. Am. Chem. Soc., 1983, 105, 6442 und J. Am. Chem. Soc., 1986, 108, 5242), das sogenannte "low", das die Vorstufen der schädlichen Carbokationen unter Bildung inerter Sulfoniumsalze entfernt, bei der Peptid- und PNA-Synthese angewendet, entweder allein oder in Verbindung mit den "high" Verfahren. Weniger häufige, in besonderen Fällen angewendete andere Verfahren zur Entfernung von Schutzgruppen und/oder zur abschließenden Spaltung der PNA/festen Träger-Bindung sind beispielsweise Verfahren, wie die Basen-katalysierte Alkoholyse (Barton, et al., J. Am. Chem. Soc., 1973, 95, 4501) und die Ammonolyse, wie auch die Hydrazinolyse (Bodanszky, et al., Chem. Ind., 1964, 1423), die Hydrogenolyse (Jones, Tetrahedron Lett., 1977, 2853 und Schlatter, et al., Tetrahedron Lett., 1977, 2861) und die Photolyse (Rich und Gurwara, J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, 1575).
  • Schließlich kann im Gegensatz zur chemischen Synthese von "normalen" Peptiden die schrittweise Kettenbildung von achiralen PNAs, wie der auf den Aminoethylglycyl-Gerüsteinheiten basierenden, entweder am N-terminalen Ende oder am C- terminalen Ende beginnen, da bei den Kupplungsreaktionen keine Racemisierung stattfindet. Der Fachmann wird erkennen, daß dort, wo die Synthesen am C- terminalen Ende beginnen, im allgemeinen Schutzgruppen enthaltende Aminogruppen und freie oder aktivierte Säuregruppen angewendet werden, und bei Synthesen, die am N-terminalen Ende beginnen, im allgemeinen die Schutzgruppen enthaltende Säuregruppen und freie oder aktivierte Aminogruppen angewendet werden.
  • Basierend auf der Erkenntnis, daß die meisten Abläufe in den Synthesezyklen der Festphasen-Peptidsynthese identisch sind (wie es auch für die Festphasen-PNA- Synthese der Fall ist), wurde kürzlich eine neue Matrix, PEPS, eingeführt (Berg, et al., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 8024 und Internationale Patentanmeldung WO 90/02749), um die Herstellung einer Vielzahl von Peptiden zu erleichtern. Diese Matrix besteht aus einem Polyethylen (PE) - Film mit seitenständigen langkettigen Polystyrol (PS) - Pfropfungen (Molekulargewicht in der Größenordnung von 106). Die Beladungskapazität des Films ist ebenso hoch wie die einer kugelförmigen Matrix, aber PEPS besitzt die zusätzliche Flexibilität, mehrere Synthesen gleichzeitig zu gestatten. Somit ist der PEPS-Film in einer neuen Konfiguration für die Festphasen- Peptidsynthese in Form von einzelnen, markierten Blättern gestaltet, die jeweils als ein einzelnes Teil dienen. Während der gesamten identischen Schritte der Synthesezyklen werden die Folien gemeinsam in einem einzelnen Reaktionsgefäß belassen, um die gleichzeitige Herstellung einer Vielzahl von Peptiden bei einer Geschwindigkeit zu gestatten, die nahe jener der Herstellung eines einzelnen Peptids durch ein Standardverfahren ist. Es wurde geschlußfolgert, daß der PEPS- Filmträger, der Linker- oder Spacer-Gruppen umfaßt und der der in Frage kommenden besonderen Chemie angepaßt ist, besonders geeignet zur Synthese von multiplen PNA-Molekülen sein könnte, diese sind begreiflicherweise einfach zu synthetisieren, da normalerweise nur vier verschiedene Reaktionsbestandteile erforderlich sind, einer für jeden der vier "pseudo-Nukleotid"-Einheiten. Der PEPS-Filmträger wurde somit in einer Vielzahl von PNA-Synthesen, welche parallel und im wesentlichen gleichzeitig abliefen, erfolgreich getestet. Die Ausbeute und Qualität der von PEPS erhaltenen Produkte ist denen vergleichbar, die unter Verwendung traditioneller kugelförmiger Polystyrol-Träger erhalten wurden. Es wurden auch Versuche mit anderen Geometrien des PEPS-Poylmers durchgeführt, wie z.B. Vliesfilz, geknüpftes Netz, Kleber oder Mikrotiterplatten, die auf keine Einschränkung der Synthesewirksamkeit hinwiesen.
  • Zwei andere, für die gleichzeitige Synthese einer Vielzahl von Peptiden vorgeschlagene Verfahren wenden gleichfalls die Herstellung multipler, unterschiedlicher PNA- Moleküle an. Das erste dieser Verfahren (Geysen, et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA, 1984, 81, 3998) nutzt Acrylsäure-gepfropfte Polyethylen-Stangen bzw. Stäben und 96-Well-Mikrotiterplatten, um die wachsenden Peptidketten zu immobilisieren und die in einzelnen Gefäßen stattfindende Synthese durchzuführen. Während das Verfahren sehr wirksam ist, ist es jedoch nur im Mikrogramm-Bereich anwendbar. Das zweite Verfahren (Houghten, Proc. Natl. Acad. Bei. USA, 1985, 82, 5131) nutzt einen "Teebeutel", der traditionell verwendbare Polymerkügelchen enthält. Andere relevante Vorschläge zur multiplen Peptid- oder PNA-Synthese im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung schließen die gleichzeitige Anwendung von zwei verschiedenen Trägern mit verschiedenen Dichten (Tregaer, in "Chemistry and Biology of Peptides", J. Meienhofer, Hrsg., Ann Arbor Bei. Publ., Ann Arbor, 1972, S. 175- 178), die Kombination von Reaktionsgefäßen über ein Leitungssystem (Gorman, Anal. Biochem., 1984, 136, 397), Multisäulen-Festphasen-Synthese (z.B. Krchnak, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1989, 33, 209 und Holm und Meldal, in "Proceedings of the 20th European Peptide Symposium", G. Jung und E. Bayer, Hrsg., Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1989, S. 208-210) und die Anwendung von Cellulosepapier (Eichler, et al., Collect. Czech. Chem. Commun., 1989, 54,1746) ein.
  • Während die herkömmliche vernetzte Styrol/Divinylbenzol-Copolymer-Matrix und der PEPS-Träger gegenwärtig im Zusammenhang mit einer Festphasen-PNA-Synthese bevorzugt sind, folgt eine nicht abgeschlossene Liste mit Beispielen für feste Träger, die von Bedeutung sein können: (1) Teilchen, basierend auf Copolymeren aus Dimethylacrylamid, vernetzt mit N,N'-Bisacryloylethylendiamin, einschließlich einer bekannten Menge an N-tert-Butoxycarbonyl-beta-alanyl-N'-aryloylhexamethylendiamin. Verschiedene Spacer-Moleküle werden im allgemeinen über die beta-Alanylgruppe hinzugefügt, dem die Aminosäurerest-Subeinheit nachfolgt. Während der Polymerisation zur Bildung von Harzkügelchen kann das beta-Alanyl enthaltende Monomer auch durch ein Acryloylsarcosin-Monomer ersetzt werden. Der Polymerisation folgt die Reaktion der Kügelchen mit Ethylendiamin unter Bildung von Harzteilchen, die primäre Amine als kovalent verknüpfte Funktionalität enthalten. Die auf Polyacrylamid basierenden Träger sind verhältnismäßig hydrophiler als die auf Polystyrol basierenden Träger und sie werden üblicherweise mit polaren aprotischen Lösungsmitteln, einschließlich Dimethylformamid, Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon und ähnlichen (siehe Atherton, et al., J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, 6584, Bioorg. Chem., 1979, 8, 351 und J. C. S. Perkin I 538 (1981)) verwendet; (2) eine zweite Gruppe von festen Trägern basiert auf Silizium-enthaltenden Teilchen, wie porösen Glaskügelchen und Silicagel. Ein Beispiel ist das Reaktionsprodukt aus Trichlor-[3-(4- chlormethyl)phenyl]propylsilan und porösen Glaskügelchen (siehe Parr und Grohman, Angew. Chem. Internal. Ed., 1972, 11, 314), die unter dem Handelsnamen "PORASIL E" von Waters Associates, Framingham, MA, USA, erhältlich sind. In ähnlicher Weise wurde ein Monoester aus 1,4-Dihydroxymethylbenzol und Siliziumdioxid (verkauft unter dem Handelsnamen "BIOPAK" von Waters Associates) als geeignet beschrieben (siehe Bayer und Jung, Tetrahedron Lett., 1970, 4503); (3) ein dritter allgemeiner Typ geeigneter fester Träger kann als Verbundmaterial bezeichnet werden, da er zwei Hauptinhaltsstoffe enthält: ein Harz und ein anderes Material, das im wesentlichen auch inert gegen die bei der organischen Synthese angewendeten Bedingungen ist. Ein Beispiel für ein Verbundmaterial (siehe Scott, et al., J. Chrom. Bei., 1971, 9, 577) verwendet Glasteilchen, die mit einem hydrophoben, vernetzten Styrolpolymer, das reaktive Chlormethylgruppen enthält, beschichtet sind und es wurde von Northgate Laboratories, Inc., of Hamden, CT, USA bezogen. Ein anderes Beispiel für ein Verbundmaterial enthält einen Kern aus fluoriertem Ethylenpolymer, das auf das Polystyrol aufgepfropft wurde (siehe Kent und Merrifield, Israel J. Chem., 1978, 17, 243 und von Rietschoten in "Peptides 1974", Y. Wolman, Hrsg., Wiley and Sons, New York, 1975, S. 113-116); und (4) andere sich berührende feste Träger als PEPS, wie Baumwollbögen (Lebl und Eichler, Peptide Res., 1989, 2, 232) und Hydroxypropylacrylat-beschichtete Polypropylenmembranen (Daniels, et al., Tetrahedron Lett., 1989, 4345) sind gleichfalls für die PNA-Synthese geeignet.
  • Obwohl sie manuell oder automatisch ausgeführt werden kann, wird die Festphasen- PNA-Synthese normalerweise chargenweise durchgeführt. Die meisten Synthesen können auch gleich gut in einem kontinuierlichem Fließmodus ausgeführt werden, wobei der Träger in Säulen gefüllt ist (Bayer, et al., Tetrahedron Lett., 1970, 4503 und Scott, et al., J. Chromatogr. Bei., 1971, 9, 577). Im Hinblick auf die kontinuierliche Fließ-Festphasen-Synthese scheint der starre Poly(dimethylacrylamid)-Kieselgur-Träger (Atherton, et. al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1981, 1151) besonders geeignet zu sein, eine andere wertvolle Konfiguration betrifft jedoch die, die für den herkömmlichen Copoly(styrol-1%-divinylbenzol)-Träger ausgearbeitet wurde (Krachnak, et. al., Tetrahedron Lett., 1987, 4469).
  • Obwohl die Festphasen-Technologie im Zusammenhang mit der PNA-Synthese gegenwärtig bevorzugt ist, können auch andere Verfahrensweisen oder Kombinationen davon, beispielsweise in Kombination mit der Festphasen-Technologie angewendet werden: (1) die klassischen Flüssigphasen-Verfahren zur Peptidsynthese (z.B. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Berlin-New York, 1984), entweder durch schrittweise Zusammensetzung oder durch Segment/Fragment- Kondensation, sind von besonderer Bedeutung, besonders wenn die Großproduktion von PNA-Verbindungen in Betracht gezogen wird (Gramm, Kilogramm und sogar Tonnen); (2) die sogenannte "Flüssigphasen"-Strategie, die lösliche polymere Träger, wie lineares Poylstyrol (Shemyakin, et al., Tetrahedron Lett., 1965, 2323) und Polyethylenglykol (PEG) (Mutter und Bayer, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1974, 13, 88) verwendet, ist geeignet; (3) die statistische Polymerisation (siehe, z.B. Odian, "Principles of Polymerization", McGraw-Hill, New York (1970), die Gemische aus Peptid- oder PNA-Molekülen vieler Molekulargewichte ("Polydisperse") liefert, ist besonders für Zwecke, wie zum Screening auf antivirale Wirkungen geeignet; (4) eine Technologie, basierend auf der Anwendung von Polymer-gestützten aktiven Aminosäureestern (Fridkin, et al., J. Am. Chem. Soc., 1965, 87, 4646), die manchmal als "inverse Merrifield-Synthese" oder als "polymere Reagenzsynthese" bezeichnet wird, bietet den Vorteil der Isolierung und Reinigung von Zwischenprodukten und kann somit ein besonders geeignetes Verfahren zur Synthese von gegebenenfalls Schutzgruppen enthaltenden PNA-Molekülen mittlerer Größe, die nachfolgend zur Fragmentkondensation in große PNA-Moleküle genutzt werden können, bereitstellen.; (5) es ist vorstellbar, daß die PNA-Moleküle enzymatisch durch derartige Enzyme, wie durch Proteasen oder durch Derivate davon, mit neuartigen Spezifitäten (erhalten beispielsweise durch derartige artifizielle Mittel, wie durch Proteinengineering) zusammengesetzt werden können. Man kann sich auch "PNA-Ligasen" zur Kondensation einer Vielzahl von PNA-Fragmenten zu sehr großen PNA-Molekülen vorstellen; (6) da für tatsächlich jedes interessante Molekül Antikörper erzeugt werden können, sollten die kürzlich entwickelten katalytischen Antikörper (Abzyme), die gleichzeitig von den Gruppen von Lerner (Tramantano, et al., Science, 1986, 234, 1566) und von Schultz (Pollack, et al., Science, 1986, 234, 1570) entdeckt wurden, als potentielle Kandidaten zur Zusammensetzung von PNA-Molekülen angesehen werden. Es gab somit beträchtlichen Erfolg bei der Herstellung von Abzymen, welche die Acyl-Übertragungungsreaktionen katalysieren (siehe beispielsweise Shokat, et al., Nature, 1989, 338, 269 und hier aufgeführte Bezugnahmen). Abschließend können vollständig artifizielle Enzyme, welche kürzlich durch die Gruppe von Stewart eingeführt wurden (Hahn, et al., Science, 1990, 248, 1544), für die geeignete PNA- Synthese entwickelt werden. Die Gestaltung der allgemein anwendbaren Enzyme, Ligasen und katalytischen Antikörper, welche die spezifischen Kupplungsreaktionen vermitteln können, sollte für die PNA-Synthese schneller möglich sein, als für die "normale" Peptidsynthese, da die PNA-Moleküle häufig nur vier verschiedene Aminosäuren umfassen (eine für jede der vier nativen Nukleobasen), im Vergleich zu den Peptiden, welche die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren enthalten (proteinogen). Es wird die Schlußfolgerung gezogen, daß keine einzelne Strategie völlig zur Synthese eines spezifischen PNA-Moleküls geeignet ist, und deshalb ist manchmal eine Kombination der Verfahren das Beste.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die therapeutische oder prophylaktische Anwendung von Peptidnukleinsäuren. Solche therapeutischen und prophylaktischen Ziele schließen den Herpes simplex Virus (HSV), den humanen Papillomavirus (HPV), den humanen immundefizitären Virus (HIV), Candida albicans, den Influenzavirus, den Cytomegalovirus (CMV), intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAM), 5- Lipoxygenase (5-LO), Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;), Protein Kinase C (PKC) und RAS- Onkogene ein. Potentielle Anwendungen für derartige Ziele schließen Behandlungen für okulare, labiale, genitale und systemische Herpes simplex I und II-Infektionen; genitale Warzen; Zervixkrebs; herkömmliche Warzen; Kaposi Sarkom; AIDS; Haut- und systemische Pilzinfektionen; Grippe; Pneumonie; Retinitis und Pneumonitis bei immunsuppressiven Patienten; Mononukleose; okulare, Haut- und systemische Entzündungen; kardiovaskuläre Erkrankung; Krebs; Asthma; Psoriasis; kardiovaskulären Kollaps; Herzinfarkt; gastrointestinale Erkrankung; Nierenerkrankung; rheumatische Arthritis; Arthrose, akute Pankreatitis; septischen Schock; und Crohn'sche Krankheit ein.
  • Zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung können die Peptidnukleinsäuren der vorliegenden Erfindung zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden, die Träger, Verdickungsmittel, Verdünnungsmittel, Puffer, Konservierungsmittel, grenzflächenaktive Mittel und ähnliche einschließen kann. Pharmazeutische Zusammensetzungen können auch zusätzlich zu der Peptidnukleinsäure einen oder mehrere wirksame Inhaltsstoffe, wie antimikrobielle Mittel, entzündungshemmende Mittel, Anästetika und ähnliche, enthalten.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auf einer Vielzahl von Wegen verabreicht werden, abhängig davon, ob eine lokale oder systemische Behandlung erwünscht ist und abhängig von dem zu behandelnden Gebiet. Die Verabreichung kann äußerlich erfolgen (einschließlich ophthalmisch, vaginal, rektal, intranasal), oral durch Inhalation oder parenteral, beispielsweise durch einen intravenösen Tropf oder durch subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion.
  • Formulierungen für die äußerliche Anwendung können Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Zäpfchen, Sprays, Flüssigkeiten und Pulver einschließen. Herkömmliche pharmazeutische Träger, wässrige, pulverige oder ölige Grundlagen, Verdickungsmittel und ähnliche sind notwendig oder erwünscht. Beschichtete Kondome können auch geeignet sein.
  • Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung schließen Pulver oder Granulate, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder in nicht-wässrigen Medien, Kapseln, Säckchen oder Tabletten ein. Verdickungsmittel, Geschmacksstoffe, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Dispergierhilfen oder Bindemittel können erwünscht sein.
  • Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können sterile wässrige Lösungen einschließen, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusätze enthalten können.
  • Die Dosierung ist von der Schwere und dem Ansprechen des zu behandelnden Leidens abhängig, aber es werden normalerweise eine oder mehrere Dosen pro Tag sein, wobei der Behandlungsverlauf von mehreren Tagen bis mehreren Monaten dauern kann oder bis eine Genesung eingetreten ist oder eine Abnahme des Krankheitszustandes erreicht wurde. Der Durchschnittsfachmann kann die optimalen Dosierungen, die Verfahrensweise der Dosierung und die Raten der Einnahme in einfacher Weise bestimmen.
  • Behandlungen dieses Typs können in einer Vielzahl von Organismen, die von einzelligem prokaryontischem und eukaryontischem Organismus bis zum vielzelligen eukaryontischen Organismus reichen, praktiziert werden. Jeder Organismus, der die DNA-RNA-Transkription oder die RNA-Protein-Translation als einen fundamentalen Teil seiner Vererbung nutzt, ist für die metabolische oder zelluläre Steuerung zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung anfällig. Scheinbar können diverse Organismen, wie Bakterien, Hefen, Protozoen, Algen, alle Pflanzen und alle höheren Tierformen, einschließlich der Warmblüter, behandelt werden. Des weiteren kann jede einzelne Zelle von vielzelligen Eukaryonten behandelt werden, da sie sowohl die DNA-RNA-Transkription als auch die RNA-Protein-Translation als vollständigen Teil ihrer zellulären Wirkung einschließen. Weiterhin schließen viele der Organellen (z.B. Mitochondrien und Chloroplasten) von eukaryontischen Zellen ebenfalls den Transkriptions- und Translationsmechanismus ein. Somit können auch einzelne Zellen, Zellpopulationen oder Organellen in die Definition von Organismen, die mit therapeutischen oder diagnostischen Phosphorthioat-Oligonukleotiden behandelt werden können, eingeschlossen werden. Der Begriff therapeutisch schließt hier in seiner Bedeutung die Beseitigung eines Krankheitszustandes durch Abtötung von Organismen oder durch Steuerung des ungeregelten oder schädlichen zellulären Wachstums oder der zellulären Expression ein.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorteilhafte Anwendung von PNA- Molekülen in der Festphasen-Biochemie (siehe z.B. "Solid-Phase Biochemistry - Analytical and Synthetic Aspects", W. H. Scouten, Hrsg., John Wiley & Sons, New York, 1983), besonders in Festphasen-Biosystemen, insbesondere bei Bioassays oder Festphasen-Technologien, welche den/die diagnostische(n) Nachweis/Quantifizierung oder die Affinitätsreinigung komplementärer Nukleinsäuren (siehe z.B. "Affinity Chromatography - A Practical Approach", P. D. G. Dean, W. S. Johnson und F. A. Middle, Hrsg., IRL Press Ltd., Oxford, 1988; "Nucleic Acid Hybridization - A Practical Approach", B. D. Harnes und S. J. Higgins, IRL Press Ltd., Oxford 1987) betreffen. Gegenwärtige Verfahren zur Durchführung derartiger Bioassays oder Reinigungstechnologien nutzen fast ausschließlich "normale" oder geringfügig modifizierte Oligonukleotide, die entweder physikalisch absorbiert werden oder durch eine im wesentlichen permanente kovalente Verankerungsverknüpfung an kugelförmige feste Träger gebunden werden, wie an Cellulose, Glaskügelchen, einschließlich jene, mit kontrollierter Porosität (Mizutani, et al., J. Chromatogr., 1986, 356, 202), an "Sephadex", "Sepharose", Agarose, Polyacrylamid, poröse Aluminiumoxidteilchen, Hydroxyalkylmethacrylat-Gele, Diol-gebundenes Siliziumdioxid, poröse Keramiken oder angrenzende ("contiguous") Materialien, wie an Filterscheiben aus Nylon und Nitrocellulose. Ein Beispiel wendet die chemische Synthese von Oligo-dT an Cellulosekügelchen für die Affinitätsisolierung von Poly A-Schwanz enthaltender mRNA an (Gilham in "Methods in Enzymology", L. Grossmann und K. Moldave, Hrsg., Bd. 21, Teil D, Seite 191, Academic Press, New York und London, 1971). Alle vorstehend erwähnten Verfahren sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung anwendbar. Wenn möglich, ist jedoch die kovalente Verknüpfung der in Frage kommenden Moleküle gegenüber der physikalischen Adsorption bevorzugt, da das letztgenannte Verfahren den Nachteil hat, daß einige der immobilisierten Moleküle während des Hybridisierungs- oder Affinitätsvorgangs ausgewaschen werden können (desorbiert). Es gibt daher nur eine geringe Kontrolle über den Verlust einer an der Oberfläche des Trägermaterials absorbierten Spezies während der verschiedenen Behandlungen, denen der Träger im Verlauf des Bioassay/Reinigungsverfahrens unterworfen wird. Die Schwere dieses Problems hängt natürlich zum großen Teil von der Zeit ab, in der sich das Gleichgewicht zwischen adsorbierten und "freien" Spezies eingestellt hat. In bestimmten Fällen ist es tatsächlich unmöglich, ein quantitatives Assay mit annehmbarer Genauigkeit und/oder Reproduzierbarkeit durchzuführen. Es wird im allgemeinen erwartet, daß der Verlust von adsorbierten Spezien während der Behandlung des Trägers mit Körperflüssigkeiten, wässrigen Reagenzien oder Waschmedien am häufigsten bei Spezien mit verhältnismäßig geringem Molekulargewicht auftritt. Im Gegensatz zu den Oligonukleotiden sind die PNA-Moleküle leichter an feste Träger zu binden, da sie stärkere nukleophile und/oder elektrophile Zentren enthalten. Zudem leidet die direkte Zusammensetzung von Oligonukleotiden auf festen Trägern an der außerordentlich geringen Beladung des immobilisierten Moleküls, hauptsächlich infolge der geringen Oberflächenkapazität des Materials, das die erfolgreiche Anwendung des gegenwärtigen Kenntnisstands der Phosphoramidit-Chemie zur Konstruktion von Oligonukleotiden ermöglicht (Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859; Caruthers, Science, 1985, 232, 281). Sie leidet auch an der Tatsache, daß bei der Anwendung des alternativen Phosphittriester-Verfahrens (Letsinger und Mahadevan, J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 3655), welches für feste Träger mit einer hohen Oberfläche/Beladungskapazität geeignet ist, nur verhältnismäßig kurze Oligonukleotide erhalten werden können. Hinsichtlich der herkömmlichen Festphasen-Peptidsynthese sind die letztgenannten Träger jedoch ausgezeichnete Materialien zum Aufbau immobilisierter PNA-Moleküle (die Seitenketten-Schutzgruppen werden von der synthetisierten PNA-Kette ohne Spaltung der Verankerungsverknüpfung, welche die Kette am festen Träger hält, entfernt). Somit sind die PNA-Spezies der vorstehend beschriebenen Festphasen- Technologie im Hinblick auf die viel höhere (und noch sequenzspezifische) Bindungsaffinität für komplementäre Nukleinsäuren und infolge der zusätzlichen einheitlichen sequenzspezifischen Erkennung von (und starke Bindung an) Nukleinsäuren, wie sie in doppelsträngigen Strukturen vorhanden sind, begünstigt. Sie können auch in großer Menge auf feste Träger gebunden werden und erhöhen somit die Empfindlichkeit/Kapazität der Festphasen-Technologie. Des weiteren können bestimmte Arten von Untersuchungen, welche die Anwendung von PNA in der Festphasen- Biochemie betreffen, angewendet und erleichtert oder sehr gesteigert werden, indem die kürzlich beschriebene "Licht-gerichtete, räumlich adressierbare, parallele chemische Synthese"-Technologie (Fodor, et al., Science, 1991, 251, 767) angewendet wird, eine Technologie, welche die Festphasen-Chemie und die Photolithographie kombiniert, um Tausende von sehr verschiedenen, aber identifizierbaren, permanent immobilisierten Verbindungen (wie Peptide) auf einem im wesentlichen gleichzeitigen Weg herzustellen.
  • Weitere Aufgaben, Vorteile und neue Merkmale der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann durch das Studium der nachfolgenden Beispiele, welche die Erfindung jedoch nicht einschränken, ersichtlich.
    • Synthese monomerer Bausteine
  • Die Monomere werden vorzugsweise entsprechend dem in Fig. 13 aufgeführten Schema synthetisiert. Dieses beinhaltet die Herstellung von entweder Methyl- oder Ethylester von (Bocaminoethyl)glycin durch ein in den Beispielen 24-26 beschriebenes Schutz/Schutzgruppenentfernungs-Verfahren. Die Synthese des Thyminmonomers ist in den Beispielen 27-28 beschrieben, und die des Schutzgruppenenthaltenden Cytosin-Monomers ist im Beispiel 29 beschrieben.
  • Die Synthese des Schutzgruppen enthaltenden Adenin-Monomers (Fig. 14) beinhaltet die Alkylierung mit Bromessigsäureethylester (Beispiel 30) und den Nachweis der Substitutionsposition, d.h. ob es die erwünschte 9-Position ist, durch Röntgenkristallographie. Die N&sup6;-Aminogruppe wurde dann durch Anwendung des Reagenz N- Ethyl-benzyloxycarbonylimidazol-tetrafluoroborat mit der Benzyloxycarbonyl-Gruppe geschützt (Beispiel 31). Durch die einfache Hydrolyse des Esterprodukts (Beispiel 32) entstand N&sup6;-Benzyloxycarbonyl-9-carboxymethyladenin, das anschließend in dem Standardverfahren verwendet wurde (Beispiele 33-34, Fig. 13). Das Adenin- Monomer wurde in zwei verschiedene PNA-Oligomere eingebaut (Beispiele 56, 57, 71 und 73).
  • Die Synthese des Schutzgruppen enthaltenden G-Monomers ist in Fig. 15 angeführt. Das Ausgangsmaterial, 2-Amino-6-chlorpurin, wurde mit Bromessigsäure alkyliert (Beispiel 35) und das Chloratom wurde dann mit einer Benzyloxy-Gruppe substituiert (Beispiel 36). Die entstehende Säure wurde mit dem Mittel PyBropTM an den (Bocaminoethyl)glycinmethylester (aus Beispiel 26) gekuppelt und der entstehende Ester wurde hydrolysiert (Beispiel 37). Die O&sup6;-Benzylgruppe wurde in dem abschließenden HF-Spaltungsschritt der PNA-Oligomer-Synthese entfernt. Die Spaltung wurde nachgewiesen, indem die erwartete Masse des PNA-Oligomer-Endprodukts beim Einbau in ein PNA-Oligomer unter Anwendung von Diisopropylcarbodiimid als Kondensationsmittel (Beispiele 55 und 71) gefunden wurde.
    • Ausgedehnte Gerüste
  • Abänderungen der Gruppen A, C und D (Fig. 16) werden durch die Synthese von monomeren Bausteinen und den Einbau in PNA-Oligomere veranschaulicht.
  • In einem Beispiel war die C-Gruppe ein CH(CH&sub3;)-Rest. Die Synthese des entsprechenden Monomers ist in Fig. 17 ausgeführt. Sie beinhaltet die Herstellung von Boc-Schutzgruppen enthaltenden 1-Amino-2,3-propandiol (Beispiel 38), das durch Periodat gespalten wird, wobei Bocaminoacetaldehyd entsteht, der direkt im nächsten Reaktionsschritt eingesetzt wird. Der Bocaminoacetaldehyd kann mit einer Vielzahl von Aminen kondensiert werden; im Beispiel 39 wurde Alaninethylester verwendet. In den Beispielen 40-42 wurden die entsprechenden Thymin-Monomere hergestellt. Das Monomer wurde gemäß dem DCC-Kupplungsprotokoll (Beispiele 56 und 57) in ein 8-mer (Beispiel 60) eingebaut.
  • In einem anderen Beispiel ist die D-Gruppe ein (CH&sub2;)&sub3;-Rest. Die Synthese des entsprechenden Monomers ist in Fig. 18A ausgeführt und in den Beispielen 43-44 beschrieben.
  • In einem anderen Beispiel ist die A-Gruppe ein (CH&sub2;)&sub2;CO-Rest. Die Synthese des entsprechenden Thymin-Monomers ist in Fig. 18B ausgeführt und in den Beispielen 46 bis 48 beschrieben.
  • In einem anderen Beispiel ist die C-Gruppe außerdem ein (CH&sub2;)&sub2;-Rest. Die Synthese des Thymin- und des Schutzgruppen enthaltenden Cytosin-Monomers ist in Fig. 19 ausgeführt und in den Beispielen 49 bis 54 beschrieben. Die Hybridisierungsversuche mit einer ein PNA-Oligomer-enthaltenden Einheit sind in den Beispielen 61 und 81 beschrieben, die eine wesentliche Verringerung der Affinität, jedoch eine Beibehaltung der Spezifität zeigen.
    • Allgemeine Anmerkungen
  • In den Versuchsbeispielen werden die nachfolgenden Abkürzungen verwendet:
  • DMF, N. N-Dimethylformamid; DCC, N,N-Dicyclohexylcarbodiimid; DCU, N,N- Dicyclohexylharnstoff; THF, Tetrahydrofuran; aeg, N-Acetyl(2'-aminoethyl)glycin; pfp, Pentafluorphenyl; Boc, tert-Butoxycarbonyl; Z, Benzyloxycarbonyl; NMR, Kernmagnetresonanz; s, Singulett; d, Duplett; dd, Duplett von Dupletts; t, Triplett; q, Quartett; m, Multiplett; b, breit; δ, chemische Verschiebung.
  • Die NMR-Spektren wurden entweder mit einem JEOL FX 90Q Spektrometer oder mit einem Bruker 250 MHz Spektrometer mit Tetramethylsilan als innerer Standard aufgezeichnet. Die Massenspektrometrie wurde mit einem MassLab VG 12-250 Quadrupol-Instrument, das mit einer VG FAB Quelle und Sonde ausgerüstet war, durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden mit einem Büchi-Schmelzpunktapparat aufgezeichnet und sind nicht korrigiert. N,N-Dimethylformamid wurde über 4 Å- Molekularsieben getrocknet, destilliert und über 4 Å-Molekularsieben gelagert. Pyridin (HPLC-Qualität) wurde getrocknet und über 4 Å-Molekularsieben gelagert. Die anderen verwendeten Lösungsmittel wiesen entweder die höchste erhältliche Qualität auf oder sie wurden vor der Anwendung destilliert. Dioxan wurde vor der Anwendung über basisches Aluminium geleitet. Bocanhydrid, 4-Nitrophenol, Bromessigsäuremethylester, Benzyloxycarbonylchlorid, Pentafluorphenol wurden alle von Aldrich Chemical Company bezogen. Thymin, Cytosin, Adenin wurden alle von Sigma bezogen.
  • Dünnschichtchromatographie (DC) wurde unter Verwendung der nachfolgenden Lösungsmittelsysteme durchgeführt: (1) Chloroform : Triethylamin : Methanol, 7 : 1 : 2; (2) Methylenchlorid : Methanol, 9 : 1; (3) Chloroform : Methanol : Essigsäure, 85 : 10 : 5. Die Flecke bzw. Spots wurden durch UV (254 nm) oder/und Sprühen mit einer Ninhydrinlösung (3 g Ninhydrin in 1000 ml 1-Butanol und 30 ml Essigsäure), nach 5minütigem Erhitzen auf 120ºC und erneutem Erhitzen nach dem Sprühen sichtbar gemacht.
    • Beispiel 1 tert-Butyl-4-nitrophenylcarbonat
  • Natriumcarbonat (29,14 g; 0,275 Mol) und 4-Nitrophenol (12,75 g; 91,6 mMol) wurden mit Dioxan (250 ml) gemischt. In das Gemisch wurde Bocanhydrid (20,0 g; 91,6 mMol) mit Dioxan (50 ml) überführt. Das Gemisch wurde 1 h unter Rückfluß erhitzt, auf 0ºC abgekühlt, filtriert und auf 1/3 konzentriert und anschließend bei 0ºC in Wasser (350 ml) gegossen. Nach halbstündigem Rühren wurde das Produkt durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und anschließend über Sicapent im Vakuum getrocknet. Ausbeute 21,3 g (97%). Fp. 73,0-74,5ºC (Lit. 78,5-79,5ºC). Anal, für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub3;NO&sub5;, gefunden (ber.) C: 55,20 (55,23) H: 5,61 (5,48) N: 5,82 (5,85).
    • Beispiel 2 (N'-Boc-2'-aminoethyl)glycin (2)
  • Die Titelverbindung wurde durch Modifizierung des Verfahrens von Heimer, et al. Int. J. Pept., 1984, 23, 203-211, hergestellt. N-(2-Aminoethyl)glycin (1, 3,00 g; 25,4 mMol) wurde in Wasser (50 ml) gelöst, es wurde Dioxan (50 ml) zugesetzt und der pH-Wert wurde mit 2 N Natriumhydroxid auf 11,2 eingestellt. tert-Butyl-4- nitrophenylcarbonat (7,29 g; 30,5 mMol) wurde in Dioxan (40 ml) gelöst und tropfenweise, über einen Zeitraum von 2 h, während dem der pH-Wert mit 2 N Natriumhydroxid auf 11,2 gehalten wurde, zugesetzt. Der pH-Wert wurde in Intervallen für weitere drei Stunden auf 11,2 eingestellt und anschließend wurde die Lösung über Nacht stehen lassen. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und der pH-Wert wurde mit 0,5 M Salzsäure sorgfältig auf 3,5 eingestellt. Die wässrige Lösung wurde mit Chloroform gewaschen (3 · 200 ml), der pH-Wert wurde mit 2 N Natriumhydroxid auf 9,5 eingestellt und die Lösung wurde im Vakuum (14 mmHg) bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde mit DMF extrahiert (25 + 2 · 10 ml) und die Extrakte wurden zur Entfernung von überschüssigem Salz filtriert. Dies führte zu einer Lösung der Titelverbindung in etwa 60% Ausbeute und mehr als 95% Reinheit gemäß DC (System 1 und Anfärbung mit Ninhydrin, Rf = 0,3). Die Lösung wurde nachfolgend zur Herstellung der Boc-aeg-Derivate ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Beispiel 3 N-1-Carboxymethylthymin (4)
  • Dieses Verfahren unterscheidet sich von der aus der Literatur bekannten Synthese, es ist jedoch einfacher, liefert höhere Ausbeuten und es verbleibt kein nicht- umgesetztes Thymin im Produkt. Einer Suspension aus Thymin (3, 40,0 g; 0,317 Mol) und Kaliumcarbonat (87,7 g; 0,634 mMol) in DMF (900 ml) wurde Bromessigsäuremethylester (30,00 ml; 0,317 mMol) zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht unter Stickstoff kräftig gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wurde mit Wasser (300 ml) und mit 4 N Salzsäure (12 ml) behandelt, 15 min bei 0ºC gerührt, filtriert und mit Wasser gewaschen (2 · 75 ml). Der Niederschlag wurde mit Wasser (120 ml) und mit 2 N Natriumhydroxid (60 ml) behandelt und 10 Minuten gekocht. Das Gemisch wurde auf 0ºC abgekühlt, filtriert und die reine Titelverbindung wurde durch Zugabe von 4 N Salzsäure (70 ml) ausgefällt. Ausbeute nach dem Trocknen im Vakuum über Sicapent: 37,1 g (64%). ¹H-NMR: (90 MHz; DMSO-d&sub6;): 11,33 ppm (s, 1H. NH); 7,49 (d, J = 0,92 Hz, 1H, ArH); 4,38 (s, 2H, CH&sub2;); 1,76 (d, J = 0,92 Hz, T-CH&sub3;).
    • Beispiel 4 N-1-Carboxymethylthyminpentafluorphenylester (5)
  • N-1-Carboxymethylthymin (4, 10,0 g; 54,3 mMol) und Pentafluorphenol (10,0 g; 54,3 mMol) wurden in DMF (100 ml) gelöst und in Eiswasser auf 5ºC abgekühlt. Anschließend wurde DCC (13,45 g; 65,2 mMol) zugesetzt. Als die Temperatur unter 5ºC absank, wurde das Eisbad entfernt und das Gemisch wurde 3 h bei Umgebungstemperatur gerührt. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtration entfernt und zweimal mit DMF gewaschen (2 · 10 ml). Die vereinten Filtrate wurden in Ether (1400 ml) gegossen und auf 0ºC abgekühlt. Es wurde Petrolether (1400 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht stehen lassen. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert und sorgfältig mit Petrolether gewaschen. Ausbeute: 14,8 g (78%). Das Produkt war ausreichend rein, um den nächsten Reaktionsschritt durchzuführen, es wurde jedoch eine Analysenprobe durch Umkristallisation aus 2- Propanol erhalten. Fp. 200,5-260ºC. Anal, für C&sub1;&sub3;H&sub7;F&sub5;N&sub2;O&sub4; gefunden (ber.): C: 44,79 (44,59); H: 2,14 (2,01); N: 8,13 (8,00). FAB-MS: 443 (M + 1 + Glycerin), 351 (M + 1). ¹H-NMR (90 MHz; DMSO-d&sub6;): 11,52 ppm (s, 1H, NH); 7,64 (s, 1H, ArH); 4,99 (s, 2H, CH&sub2;); 1,76(s, 3H, CH&sub3;).
    • Beispiel 5 1-(Boc-aeg)thymin (6)
  • Der vorstehend genannten DMF-Lösung wurde Triethylamin (7,08 ml; 50,8 mMol) und anschließend N-1-Carboxymethylthyminpentafluorphenylester (5, 4,45 g; 12,7 mMol) zugesetzt. Die entstehende Lösung wurde 1 h gerührt. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und 20 min. mit dem Kationenaustausch-Material ("Dowex 50 W X-8", 40 g) behandelt. Das Kationenaustausch-Material wurde durch Filtration entfernt, mit Dichlormethan gewaschen (2 · 15 ml) und es wurde Dichlormethan (150 ml) zugesetzt. Die entstehende Lösung wurde mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, zunächst durch eine Wasserstrahlpumpe und anschließend durch eine Ölpumpe. Der Rückstand wurde mit Wasser (50 ml) geschüttelt und bis zur Trockne eingeengt. Dieses Verfahren wurde einmal wiederholt. Der Rückstand wurde dann in Methanol (75 ml) gelöst und in Ether (600 ml) und Petrolether (1,4 l) gegossen. Nach dem Rühren über Nacht wurde der weiße Feststoff durch Filtration isoliert und mit Petrolether gewaschen. Die Trocknung im Vakuum über Sicapent ergab 3,50 g (71,1%). Fp. 142-147ºC, Anal, für C&sub1;&sub6;H&sub2;&sub4;N&sub4;O&sub7;, gefunden (ber.) C: 49,59 (50,00); H: 6,34 (6,29); N: 14,58 (14,58). ¹H-NMR (250 MHz; DMSO-d&sub6;): Infolge der eingeschränkten Rotation um die sekundäre Amidbindung, wurden mehrere der Signale im Verhältnis 2 : 1 verdoppelt (in der Liste gekennzeichnet durch mj. für Hauptpeak und mi. für Nebenpeak). 12,73 ppm (b, 1H, -CO&sub2;H); 11,27 ppm (s, mj., Imid); 11,25 ppm (s, mi., Imid); 7,30 ppm (s, mj., ArH); 7,26 ppm (s, mi., ArH); 6,92 ppm (nicht aufgel. t, mj., BocNH); 6,73 ppm (nicht aufgel. t; mi., BocNH); 4,64 ppm (s, mj., T-CH&sub2;-CO-); 4,47 ppm (s, mi., T-CH&sub2;-CO-); 4,19 ppm (s, mi., CONRCH&sub2;CO&sub2;H); 3,97 ppm (s, mj., CONRCH&sub2;CO&sub2;H); 3,41-2,89 ppm (nicht aufgel. m, -CH&sub2;CH&sub2;- und Wasser); 1,75 ppm (s, 3H, T-CH&sub3;); 1,38 ppm (s, 9H, t-Bu). ¹³C-NMR: 170,68 ppm (CO); 170,34 (CO), 167,47 (CO); 167,08 (CO); 164,29 (CO); 150,9 (C5"); 141,92 (C6"); 108,04 (C2'); 77,95 und 77,68 (Thy-CH&sub2;CO); 48,96, 47,45 und 46,70 (-CH&sub2;CH&sub2;- und NCH&sub2;CO&sub2;H); 37,98 (Thy-CH&sub3;); 28,07 (t-Bu). FAB-MS: 407 (M + Na&spplus;); 385 (M + H&spplus;).
    • Beispiel 6 1-(Boc-aeg)thyminpentafluorphenylester (7, Boc-taeg.OPfp)
  • 1-(Boc-aeg)thymin (6) (2,00 g; 5,20 mMol) wurde in DMF (5 ml) gelöst und es wurde Methylenchlorid (15 ml) zugesetzt. Es wurde Pentafluorphenol (1,05 g; 5,72 mMol) zugesetzt und die Lösung wurde in einem Eisbad auf 0ºC abgekühlt. Anschließend wurde DDC zugesetzt (1,29 g; 6,24 mMol) und nach 2 min wurde das Eisbad entfernt. Nach 3stündigem Rühren bei Umgebungstemperatur wurde das ausgefallene DCU durch Filtration entfernt und mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinten Filtrate wurden zweimal mit wässrigem Natriumhydrogencarbonat und einmal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wurde in Dioxan (150 ml) gelöst und bei 0ºC in Wasser (200 ml) gegossen. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und über Sicapent im Vakuum getrocknet. Ausbeute; 2,20 g (77%). Eine Analysenprobe wurde durch Umkristallisation aus 2- Propanol erhalten. Fp. 174-175,5ºC. Analyse für C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub3;N&sub4;O&sub7;F&sub5;, gefunden (ber.): C: 48,22 (48,01); H: 4,64 (4,21); N: 9,67 (10,18). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl&sub3;): Infolge der eingeschränkten Rotation um die sekundäre Amidbindung, wurden mehrere der Signale im Verhältnis 6 : 1 verdoppelt (in der Liste gekennzeichnet durch mj. für Hauptpeak und mi. für Nebenpeak). 7,01 ppm (s, mi., ArH); 6,99 ppm (s, mj., ArH); 5,27 ppm (nicht aufgel. t, BocNH); 4,67 ppm (s, mj., T-CH&sub2;-CO-); 4,60 ppm (s, mi., T- CH&sub2;-CO-); 4,45 ppm (s, mj., CONRCH&sub2;CO&sub2;Pfp); 4,42 ppm (s, mi., CONRCH&sub2;CO&sub2;Pfp); 3,64 ppm (t, 2H BocNHCH&sub2;CH&sub2;-); 3,87 ppm ("q", 2H, BocNHCH&sub2;CH&sub2;-); 1,44 (s, 9H, t-Bu). FAB-MS: 551 (10; M + 1); 495 (10; M + 1-tBu); 451 (80; -Boc).
    • Beispiel 7 N&sup4;-Benzyloxycarbonylcytosin (9)
  • Benzyloxycarbonylchlorid (52 ml; 0,36 Mol) wurde über einen Zeitraum von etwa 1 h bei 0ºC tropfenweise zu einer Suspension aus Cytosin (8, 20,0 g; 0,18 Mol) in trockenem Pyridin (1000 ml) unter Stickstoff in einer ofengetrockneten Apparatur gegeben. Die Lösung wurde anschließend über Nacht gerührt, danach wurde die Pyridinsuspension im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Um einen pH-Wert von annähernd 1 zu erhalten, wurden Wasser (200 ml) und 4 N Salzsäure zugesetzt. Der entstehende weiße Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und teilweise unter einem Luftstrom getrocknet. Der noch feuchte Niederschlag wurde 10 min mit absoluten Ethanol (500 ml) gekocht, auf 0ºC abgekühlt, filtriert, sorgfältig mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 24,7 g (54%). Fp. > 250ºC. Anal, für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub1;N&sub3;O&sub3;, gefunden (ber.); C: 58,59 (58,77); H: 4,55 (4,52); N: 17,17 (17,13). Es wurde kein NMR-Spektrum aufgenommen, da es nicht möglich war, das Produkt zu lösen.
    • Beispiel 8 N&sup4;-Benzyloxycarbonyl-N¹-carboxymethylcytosin (10)
  • In einen mit einer mechanischen Rührung und Stickstoffzuleitung ausgestatteten Dreihalsrundkolben wurden Bromessigsäuremethylester (7,82 ml; 82,6 mMol) und eine Suspension aus N&sup4;-Benzyloxycarbonylcytosin (9, 21,0 g; 82,6 mMol) und Kaliumcarbonat (11,4 g; 82,6 mMol) in trocknem DMF (900 ml) gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht kräftig gerührt, filtriert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Es wurden Wasser (300 ml) und 4 N Salzsäure (10 ml) zugegeben, das Gemisch wurde 15 Minuten bei 0ºC gerührt, filtriert und mit Wasser gewaschen (2 · 75 ml). Der isolierte Niederschlag wurde mit Wasser (120 ml) und 2 N Natriumhydroxid (60 ml) behandelt, 30 min gerührt, filtriert, auf 0ºC abgekühlt und es wurde 4 N Salzsäure (35 ml) zugesetzt. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert, sorgfältig mit Wasser gewaschen, aus Methanol (1000 ml) umkristallisiert und unverzüglich mit Ether gewaschen. Dies erbrachte 7,70 g (31%) der reinen Verbindung. Die Stammlösung aus der Umkristallistion wurde auf ein Volumen von 200 ml reduziert und auf 0ºC abgekühlt. Dies erbrachte zusätzlich 2,30 g eines Materials, das gemäß DC rein war, jedoch eine rötlich Farbe besaß. Fp. 266-274ºC. Anal, für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub3;N&sub3;O&sub5;, gefunden (ber.); C: 55,41 (55,45); H: 4,23 (4,32); N: 14,04 (13,86). ¹H-NMR (90 MHz; DMSO-d&sub6;): 8,02 ppm (d, J = 7,32 Hz, 1H, H-6); 7,39 (s, 5H, Ph); 7,01 (d, J = 7,32 Hz, 1H, H-5); 5,19 (s, 2H, PhCH&sub2;-); 4,52 (s, 2H).
    • Beispiel 9 N&sup4;-Benzyloxycarbonyl-N¹-carboxymethyl-cytosinpentafluorphenylester (11)
  • N&sup4;-Benzyloxycarbonyl-N¹-carboxymethylcytosin (10, 4,00 g; 13,2 mMol) und Pentafluorphenol (2,67 g; 14,5 mMol) wurden mit DMF (70 ml) gemischt, in Eiswasser auf 0ºC abgekühlt und es wurde DCC (3,27 g; 15,8 mMol) zugesetzt. Das Eisbad wurde nach 3 min entfernt und das Gemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtration entfernt, mit DMF gewaschen und das Filtrat wurde im Vakuum (0,2 mmHg) bis zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid (250 ml) behandelt, 15 min kräftig gerührt, filtriert, zweimal mit verdünntem Natriumhydrogencarbonat und einmal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wurde aus 2-Propanol (150 ml) umkristallisiert und die Kristalle wurden sorgfältig mit Ether gewaschen. Ausbeute 3,40 g (55%). Fp. 241-245ºC. Anal, für C&sub2;&sub0;H&sub1;&sub2;N&sub3;F&sub5;O&sub5;F, gefunden (ber.) C: 51,56 (51,18); H: 2,77 (2,58); N: 9,24 (8,95). ¹H-NMR (90 MHz; CDCl&sub3;): 7,66 ppm (d, J = 7,63 Hz, 1H, H-6); 7,37 (s, 5H, Ph); 7,31 (d, J = 7,63 Hz; 1H, H-5); 5,21 (s, 2H, PhCH&sub2;-); 4,97 (s, 2H, NCH&sub2;-). FAB-MS: 470 (M + 1).
    • Beispiel 10 N&sup4;-Benzyloxycarbonyl-1-Boc-aeg-cytosin (12)
  • Zu einer Lösung aus (N-Boc-2-aminoethyl)glycin (2) in DMF, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wurden Triethylamin (7,00 ml; 50,8 mMol) und N&sup4;- Benzyloxycarbonyl-N¹-carboxymethyl-cytosinpentafluorphenylester (11, 2,70 g; 5,75 mMol) gegeben. Nach einstündigem Rühren der Lösung bei Raumtemperatur wurden Methylenchlorid (150 ml), gesättigtes Natriumchlorid (250 ml) und 4 N Salzsäure bis zum pH-Wert von annähernd 1 zugesetzt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und zweimal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, zunächst mit einer Wasserstrahlpumpe und anschließend mit einer Ölpumpe. Der ölige Rückstand wurde mit Wasser (25 ml) behandelt und erneut im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Dieses Verfahren wurde anschließend wiederholt. Der ölige Rückstand (2,80 g) wurde dann in Methylenchlorid (100 ml) gelöst, es wurde Petrolether (250 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert und mit Petrolether gewaschen. Die DC (System 1) weist auf wesentliche Mengen an Pentafluorphenol hin, aber es wurde kein Versuch unternommen, dieses zu entfernen. Ausbeute 1,72 g (59%). Fp. 156ºC (zersetzt). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl&sub3;): Infolge der eingeschränkten Rotation um die sekundäre Amidbindung, wurden mehrere der Signale im Verhältnis 2 : 1 verdoppelt (in der Liste gekennzeichnet durch mj. für Hauptpeak und mi. für Nebenpeak). 7,88 ppm (dd, 1H, H-6); 7,39 (m, 5H, Ph); 7,00 (dd, 1H, H-5); 6,92 (b, 1H, BocNH); 6,74 (b, 1H, ZNH)-?; 5,19 (s, 2H, Ph-CH&sub3;); 4,81 ppm (s, mj., Cyt-CH&sub2;-CO-); 4,62 ppm (s, mi.; Cyt-CH&sub2;-CO-); 4,23 (s, mi., CONRCH&sub2;CO&sub2;H); 3,98 ppm (s, mj., CONRCH&sub2;CO&sub2;H); 3,42-3,02 (nicht aufgel. m, -CH&sub2;CH&sub2;- und Wasser); 1,37 (s, 9H, tBu). FAB-MS: 504 (M + 1); 448 (M + 1 + tBu).
    • Beispiel 11 N&sup4;-Benzyloxycarbonyl-1-Boc-aeg-cytosinpentafluorphenylester (13)
  • N&sup4;-Benzyloxycarbonyl-1-Boc-aeg-cytosin (12, 1,50 g; 2,98 mMol) und Pentafluorphenol (548 mg; 2,98 mMol) wurden in DMF (10 ml) gelöst, Methylenchlorid (10 ml) wurde zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad auf 0ºC abgekühlt und es wurde DCC (676 mg; 3,28 mMol) zugesetzt. Das Eisbad wurde nach 3 min entfernt und das Gemisch wurde 3 h bei Umgebungstemperatur gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration isoliert und einmal mit Methylenchlorid gewaschen. Der Niederschlag wurde in kochendem Dioxan (150 ml) gelöst und die Lösung wurde auf 15ºC abgekühlt, wobei DCU ausfiel. Das DCU wurde durch Filtration entfernt und das entstehende Filtrat wurde bei 0ºC in Wasser (250 ml) gegossen. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute 1,30 g (65%). Analyse für C&sub2;&sub9;H&sub2;&sub8;N&sub5;O&sub8;F&sub5;, gefunden (ber.); C: 52,63 (52,02); H: 4,41 (4,22); N: 10,55 (10,46). ¹H-NMR (250 MHz; DMSOd&sub6;): zeigte im wesentlichen das Spektrum der vorstehend genannten Säure, wahrscheinlich infolge der Hydrolyse des Esters. FAB-MS: 670 (M + 1); 614 (M + 1 + tBu).
    • Beispiel 12 4-Chlorcarboxy-9-chloracridin
  • 4-Carboxyacridon (6,25 g; 26,1 mMol), Thionylchlorid (25 ml) und 4 Tropfen DMF wurden vorsichtig unter einem Stickstoffstrom erhitzt, bis sich alle festen Materialien gelöst hatten. Die Lösung wurde dann 40 min unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt und überschüssiges Thionylchlorid wurde im Vakuum entfernt. Die letzten Spuren an Thionylchlorid wurden durch zweimaliges Einengen, gemeinsam mit trockenem Benzol (getrocknet über Na-Pb), entfernt. Das verbleibende gelbe Pulver wurde direkt im nächsten Reaktionsschritt verwendet.
    • Beispiel 13 4-(5-Methoxycarbonylpentylamidocarbonyl)-9-chloracridin
  • Methyl-6-aminohexanoathydrochlorid (4,70 g; 25,9 mMol) wurde in Methylenchlorid (90 ml) gelöst, auf 0ºC abgekühlt, es wurde Triethylamin (15 ml) zugesetzt und die entstehende Lösung wurde anschließend sofort zu dem vorstehend genannten Säurechlorid gegeben. Der Säurechlorid enthaltende Rundhalskolben wurde im Eisbad bei 0ºC gekühlt. Das Gemisch wurde 30 min kräftig bei 0ºC und 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Das entstehende Gemisch wurde filtriert, um die verbleibenden Feststoffe zu entfernen, welche mit Methylenchlorid (20 ml) gewaschen wurden. Das rotbraune Methylenchlorid-Filtrat wurde nachfolgend zweimal mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und einmal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Zu der entstehenden öligen Substanz wurde trockenes Benzol (35 ml) und Ligroin (60-80ºC, getrocknet über Na-Pb) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Rückfluß erhitzt. Es wurden aktivierter Kohlenstoff (Aktivkohle) und Celit zugesetzt und das Gemisch wurde 3 min unter Rückfluß erhitzt. Nach der Filtration wurde die Titelverbindung durch Kühlen unter Magnetrührung auskristallisiert. Sie wurde durch Filtration isoliert und mit Petrolether gewaschen. Das Produkt wurde über festem Kaliumhydroxid gelagert. Ausbeute 5,0 g (50%).
    • Beispiel 14 4-(5-Methoxycarbonylpentyl)amidocarbonyl-9-[6'-(4"- nitrobenzamido)hexylamino]-aminoacridin
  • 4-(5-Methoxycarbonylpentylamidocarbonyl)-9-chloracridin (1,30 g; 3,38 mMol) und Phenol (5 g) wurden 30 min unter einem Stickstoffstrom auf 80ºC erhitzt, danach wurde 6-(4'-Nitrobenzamido)-1-hexylamin (897 mg; 3,38 mMol) zugesetzt. Die Temperatur stieg für 2 h auf 120ºC. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und Methylenchlorid (80 ml) wurde zugesetzt. Die entstehende Lösung wurde dreimal mit 2 N Natriumhydroxid (60 ml Portionen) und einmal mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Das entstehende rote Öl (1,8 g) wurde in Methylenchlorid (40 ml) gelöst und auf 0ºC abgekühlt. Es wurde Ether (120 ml) zugesetzt und die entstandene Lösung wurde über Nacht gerührt. Dies führte zu einem Gemisch von festem Material und einem Öl. Der Feststoff wurde durch Filtration isoliert. Der Feststoff und das Öl wurden wieder in Methylenchlorid (80 ml) gelöst und tropfenweise kaltem Ether (150 ml) zugesetzt. Nach 20minütigem Rühren wurde die Titelverbindung in Form von orangen Kristallen durch Filtration isoliert. Das Produkt wurde mit Ether gewaschen und im Vakuum über Kaliumhydroxid getrocknet. Ausbeute 1,60 g (77%). Fp. 145-147ºC.
    • Beispiel 15 4-(5-Carboxypentyl)amidocarbonyl-9-[6'-(4"-nitrobenzamido)hexylamino]- aminoacridin
  • 4-(5-Methoxycarbonylpentyl)amidocarbonyl-9-[6'-84"-nitrobenzamido)hexylamino]- aminoacridin (503 mg; 0,82 mMol) wurde in DMF (30 ml) gelöst und 2 N Natriumhydroxid (30 ml) wurde zugesetzt. Nach 15minütigem Rühren wurden 2 N Salzsäure (35 ml) und Wasser (50 ml) bei 0ºC zugesetzt. Nach 30minütigem Rühren wurde die Lösung dekantiert, wobei ein ölige Substanz verblieb, die in kochendem Methanol (150 ml) gelöst wurde und filtriert und auf ein 1/3 des Volumens konzentriert wurde. Zu der Methanollösung wurden Ether (125 ml) und 5-6 Tropfen HCl in Ethanol zugesetzt. Die Lösung wurde nach 1 h Rühren bei 0ºC dekantiert. Die ölige Substanz wurde erneut in Methanol (25 ml) gelöst und mit Ether (150 ml) ausgefällt. Die Titelverbindung wurde nach dem Rühren über Nacht als gelbe Kristalle isoliert. Ausbeute 417 mg (80%). Fp. 173ºC (zersetzt).
    • Beispiel 16 (a) 4-(5-Pentafluorphenyloxycarbonylpentyl)-amidocarbonyl-9-[6'-(4"- nitrobenzamido)-hexylamino]-aminoacridin (Acr¹OPfp)
  • Die vorstehend genannte Säure (300 mg; 0,480 mMol) wurde in DMF (2 ml) gelöst und es wurde Methylenchlorid (8 ml) zugesetzt. Es wurde Pentafluorphenol (97 mg; 0,53 mMol) zugesetzt, das mit 2 · 2 ml Methylenchlorid überführt wurde. Die entstehende Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt, danach wurde DCC (124 mg; 0,60 mMol) zugesetzt. Das Eisbad wurde nach 5 Minuten entfernt und das Gemisch wurde über Nacht rühren lassen. Das ausgefallene DCU wurde durch Zentrifugation entfernt und das Zentrifugat wurde im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, zunächst mit einer Wasserstrahlpumpe und anschließend mit einer Ölpumpe. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (20 ml) gelöst, filtriert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde erneut in Methylenchlorid und Petrolether (150 ml) gelöst. Es wurde 1 ml 5 M HCl in Ether zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde nach 30minütigem Rühren bei 0ºC durch Dekantieren entfernt. Die verbleibende ölige Substanz wurde in Methylenchlorid (100 ml) gelöst. Es wurde Petrolether (150 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht rühren lassen. Am nächsten Tag wurde das ausgefallene gelbe kristalline Material durch Filtration isoliert und mit reichlichen Mengen an Petrolether gewaschen. Ausbeute nach der Trocknung 300 mg (78%). Fp. 97,5ºC (zersetzt). Alle Proben zeigten die zufriedenstellenden Elementaranalysen, ¹H-NMR, ¹³C-NMR- und Massenspektren.
    • (b) Versuch zur Synthese der PNA-Verbindungen der Fig. 8
  • Materialien: Boc-Lys (CIZ), Benzhydrylamin-copoly(styrol-1%-divinylbenzol)-Harz (BHA-Harz) und p-Methylbenzylhydrylamin-copoly(styrol-1%-divinylbenzol)-Harz (MBHA-Harz) wurden von Peninsula Laboratories bezogen. Andere Reagenzien und Lösungsmittel waren: bioreine Trifluoressigsäure von Halocarbon Products; Diisopropylethylamin (99%, wurde nicht weiter destilliert) und N-Acetylimidazol (98%) von Aldrich; H&sub2;O wurde zweimal destilliert; wasserfreie HF von Union Carbide; synthesereines N,N-Dimethylformamid und analysenreines Methylenchlorid (wurde nicht weiter destilliert) von Merck; HPLC-reines Acetonitril von Lab-Scan; reines Anisol, N,N-Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid, hochreines 2,2,2-Trifluorethanol von Fluka und Trifluormethansulfonsäure von Flourad.
    • (b) Allgemeine Verfahren und Anmerkungen
  • Wenn nicht anders festgelegt, wird die nachfolgende Vorgehensweise angewendet. Die PNA-Verbindungen wurden durch das schrittweise Festphasen-Verfahren synthetisiert (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149), unter Anwendung der herkömmlichen Peptidchemie durch Verwendung der TFA-labilen tert-Butyloxycarbonyl (Boc)-Gruppe zum "zeitweiligen" N-Schutz (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 304) und der säurestabileren Benzyloxycarbonyl- (Z) und 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (CIZ)-Gruppen zum "permanenten" Schutz der Seitenketten. Zur Gewinnung der Cterminalen Amide wurden die PNAs auf HF-labilen BHA- oder MBHA-Harzen zusammengesetzt (das MBHA-Harz weist eine höhere Anfälligkeit gegen die abschließende HF-Spaltung auf im Vergleich zu dem unsubstituierten BHA-Harz (Matsueda, et al., Peptides, 1981, 2, 45). Alle Reaktionsschritte (ausgenommen die HF- Reakionsschritte) wurden in manuell zu bedienenden standardmäßigen Reaktionsgefäßen, die mit einer groben Glasfritte ausgerüstet waren, ausgeführt (Merrifield, et al., Biochemistry, 1982, 21, 5020). Die ursprünglich von Merrifield und Mitarbeitern entwickelte (Sarin, et al., Anal. Biochem., 1981, 117, 147) quantitative Ninhydrin- Reaktion (Kaiser-Test) für Peptide, die "normale" Aminosäuren enthalten, wurde erfolgreich (siehe Tabelle I-III), unter Nutzung des "normal" verwendeten wirksamen Extinktionskoeffizienten ε = 15000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹ für alle Reste angewendet, um die Vollständigkeit der einzelnen Kupplungen zu bestimmen, als auch zur Messung der Zahl der wachsenden Peptidketten. Die theoretische Substituion Sn-1 bei der Kupplung der Reste n (unter Annahme, sowohl der vollständigen Entfernung der Schutzgruppen und der Kupplung, als auch weder des Kettenabbruchs noch des Verlusts von PNA- Ketten während des Reaktionszyklus) wird gemäß folgender Gleichung berechnet:
  • Sn = Sn-1 · (1 + (Sn-1 · ΔMW · 10&supmin;³ mMol/Mol))&supmin;¹
  • worin ΔMW dem Molekulargewichtsgewinn entspricht ([ΔMW] = g/Mol) und Sn-1 der theoretischen Substitution bei der Kupplung des vorhergehenden Restes n-1 ([S] = mMol/g). Der geschätzte Wert (%) zum Ausmaß der einzelnen Kupplung wird im Verhältnis zur gemessenen Substitution bestimmt (sofern S nicht bestimmt wurde) und schließt die Korrektur für die Zahl der verbleibenden freien Aminogruppen nach dem vorhergehenden Zyklus ein. Die HF-Reaktionsschritte wurden in einem Diaflon- HF-Apparat von Toho Kasei (Osaka, Japan) ausgeführt. Für die analytische bzw. die halb-präparative HPLC mit einem SP8000 Gerät wurden Vydac C&sub1;&sub8;(5 um, 0,46 · 25 cm und 5 um, 1,0 · 25 cm) Umkehrphasen-Säulen verwendet. Puffer A war 445 ul Trifluoressigsäure pro Liter enthaltendes 5 Vol-% Acetonitril in Wasser und Puffer B war 390 ul Trifluoressigsäure pro Liter enthaltendes 60 Vol-% Acetonitril in Wasser. Der lineare Gradient betrug 0-100% Puffer B in 30 min. Strömungsgeschwindigkeit 1,2 ml/min (analytisch) und 5 ml/min (halb-präparativ). Die Eluenten wurden bei 215 nm (analytisch) und bei 230 nm (halb-präparativ) verfolgt Die Molekulargewichte der PNAs wurden durch ²&sup5;²Cf-Plasma-Desorptions-Zeit-of-flight-Massenspektrometrie aus den Mittelwerten der am häufigsten vorkommenden Isotope bestimmt.
    • Beispiel 17 Festphasen-Synthese von Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-NH&sub2; und kürzeren Derivaten (a) Schrittweiser Zusammenbau von Boc-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA-Harz
  • Die Synthese wurde an 100 mg vorgequollenem und neutralisiertem BHA-Harz begonnen (enthält 0,57 mMol NH&sub2;/g, wie durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion bestimmt), indem einzelne Kupplungen angewendet wurden ("Syntheseprotokoll 1"), unter Anwendung von 3,2 Äquivalenten BocTaeg-OPfp in etwa 33% DMF/CH&sub2;Cl&sub2;. Die einzelnen Kupplungsschritte wurden durch Schütteln für mindestens 12 h in einem manuell bedienbaren standardmäßigen Festphasen-Reaktionsgefäß durchgeführt und die nicht-umgesetzten Aminogruppen wurden durch Acetylierung in ausgewählten Stadien der Synthese blockiert. Der Fortschritt der Kettenverlängerung wurde in verschiedenen Stadien durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion verfolgt (siehe Tabelle I). Teilmengen der Schutzgruppen enthaltenden Boc-[Taeg]&sub5;-BHA-, Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-BHA- und Boc-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA-Harze wurden entnommen, nachdem 5, 10 bzw. 15 Reste zusammengesetzt worden waren.
    • (b) Synthese von Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA-Harz
  • Nach der Entfernung der Schutzgruppen von dem verbleibenden Boc-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA- Harz (bestimmtes Trockengewicht beträgt etwa 30 mg; 0,002 mMol wachsende Ketten) wurde das H-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA-Harz mit etwa 50 Äquivalenten (80 mg; 0,11 mMol) Acr¹-OPfp in 1 ml etwa 66% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; umgesetzt (d.h. eine 0,11 M Lösung des Pentafluorphenylesters) in einem 3 ml Festphasen-Reaktionsgefäß umgesetzt. Die Auswertung der qualitativen Ninhydrin-Reaktion ergab, daß die Kupplung der Acridin-Einheit nahezu quantitativ war.
    • (c) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub5;-NH&sub2;
  • Ein Teil des Schutzgruppen enthaltenden Boc-[Taeg]&sub5;-BHA-Harzes wurde mit 50% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid behandelt, um die N-terminale Boc-Gruppe (die eine Vorstufe des potentiell schädlichen tert-Butyl-Kations ist) vor der HF-Spaltung zu entfernen. Nach der Neutralisation und dem Waschen (ausgeführt in ähnlicher Weise, wie bei den Schritten 2-4 in "Syntheseprotokoll 1") und 2 h Trocknen im Vakuum wurden die entstehenden 67,1 mg (Trockengewicht) H-[Taeg]&sub5;-BAH-Harz mit 5 ml HF : Anisol (9 : 1, v/v) unter 60minütigem Rühren bei 0ºC gespalten. Nach der HF- Entfernung wurde der Rückstand mit trocknem Diethylether gerührt (4 · 15 ml, jeweils 15 min) um das Anisol zu entfernen, unter Schwerkraft durch eine Glasfritte filtriert und getrocknet. Die PNA wurde anschließend in 60 ml (4 · 15 ml, jeweils 15 min Rühren) 10% wässrige Essigsäurelösung extrahiert. Aliquote Mengen dieser Lösung wurden durch analytische Umkehrphasen-HPLC analysiert, um die Reinheit der ungereinigten PNA zu bestimmen. Der Hauptpeak bei 13,0 min entsprach etwa 93% der Gesamtabsorption. Die verbleibende Lösung wurde gefroren und gefriergetrocknet und es entstanden 22,9 mg eines Rohmaterials. Abschließend wurden 19,0 mg des Rohprodukts aus fünf Ansätzen, von denen jeder 3,8 mg in 1 ml H&sub2;O enthielt, gereinigt. Der Hauptpeak wurde durch Anwendung einer halb-präparativen Umkehrphasen-Säule gesammelt. Acetonitril wurde mit einer Speedvac entfernt und die verbleibende Lösung wurde tiefgefroren (Trockeneis) und anschließend gefriergetrocknet, wodurch 13,1 mg eines > 99% reinen H-[Taeg]&sub5;-NH&sub2; erhalten wurden. Das PNA- Molekül war in Wasser leicht löslich und hatte basierend auf der Massenspektrometrie das genaue Molekulargewicht. Für (M + H)&spplus; betrug der berechnete m/z-Wert 1349,3 und der gemessene m/z-Wert betrug 1347,8.
    • (d) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub1;&sub0;-NH&sub2;
  • Ein Teil des Schutzgruppen enthaltenden Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-BHA-Harzes wurde wie in Abschnitt (c) beschrieben behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 18,9 mg trockenem H-[Taeg]&sub1;&sub0;-BHA-Harz 11,0 mg an Rohmaterial. Der Hauptpeak bei 15,5 min entspricht etwa 53% der Gesamtabsorption. Etwa 1 mg des Rohprodukts wurde wiederholt gereinigt (aus den nachstehend beschriebenen Gründen) und ergaben annähernd 0,1 mg an mindestens 80%, aber vermutlich > 99% reinem H-[Taeg]&sub1;&sub0;- NH&sub2;. Ein eher breiter Verzögerungspeak, der nach dem Zielpeak eluierte und etwa 20% der Gesamtabsorbtion entsprach, konnte durch die wiederholte Reinigung nicht entfernt werden (nur geringfügig verringert). Die Beurteilung des Massenspektrums, das nur die Anwesenheit des korrekten Molekulargewichts von H-[Taeg]&sub1;&sub0;-NH&sub2; bestätigt, ergab, daß das Phänomen des Verzögerungspeaks den mehr oder weniger gut definierten Aggregations/Konformationszuständen des Zielmoleküls zuzuschreiben ist. Es ist daher wahrscheinlich, daß das Rohprodukt mehr als die vorstehend erwähnten 53% des Zielmoleküls enthält. H-[Tag]&sub1;&sub0;-NH&sub2; ist in Wasser leicht löslich. Für (M + H)&spplus; betrug der berechnete m/z-Wert 2679,6 und der gemessene m/z-Wert betrug 2681,5.
    • (e) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub1;&sub5;-NH&sub2;
  • Ein Teil des Schutzgruppen enthaltenden Boc-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA-Harzes wurde, wie in Abschnitt (c) beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 13,9 mg trocknem H-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA-Harz 3,2 mg des Rohmaterials. Der Hauptpeak bei 22,6 min lag in einer breiten Ausweitung und entsprach etwa 60% der Gesamtabsorption (Fig. 12a). Dieser Ausweitung wird wiederum (siehe den vorhergehenden Abschnitt) den Aggregations/Konformationszuständen des Zielmoleküls H-[Taeg]&sub1;&sub5;-NH&sub2; zugeschrieben, da die Spektralanalyse der gesammelten "Ausweitung" nicht wesentlich auf die Anwesenheit anderer Moleküle hinwies. Das gesamte Rohprodukt wurde gereinigt, indem die "Ausweitung" gesammelt wurde und es entstanden annähernd 2,8 mg Material. Für (M + Na) betrug der berechnete m/z-Wert 4033,9 und der gemessene m/z-Wert betrug 4032,9.
    • (f) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-NH&sub2;
  • Ein Teil des Schutzgruppen enthaltenden Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA-Harzes wurde, wie in Abschnitt (b) beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 29,7 mg trocknem Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA-Harz 14,3 mg des Rohmaterials. Zusammengenommen entsprachen der Hauptpeak bei 23,7 min und ein "Dimer" (siehe nachstehend) bei 29,2 min etwa 40% der Gesamtabsorption (Fig. 12b). Das Rohprodukt wurde wiederholt gereinigt und es entstanden annähernd 1 mg an vermutlich > 99% reinem Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-NH&sub2;, "verunreinigt" mit selbst-aggregierten Molekülen, die bei 27,4 min. 29,2 min und abschließend als riesige breite Ausweitung, die mit 100% Puffer B eluierte, eluierten (Fig. 12c). Diese Interpretation stimmt mit der Beobachtung überein, daß diese Peaks durch Stehen in wässriger Essigsäurelösung (für Stunden) anwachsen und abschließend quantitativ ausfallen. Für (M + H)&spplus; betrug der berechnete m/z-Wert 4593,6 und der gemessene m/z-Wert betrug 4588,7.
    • (g) Syntheseprotokoll 1
  • (1) Entfernung der Boc-Schutzgruppen mit TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1, v/v), 3 ml, 3 · 1 min und 1 · 30 min. (2) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 3 ml, 6 · 1 min. (3) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 3 ml, 3 · 2 min. (4) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 3 ml, 6 · 1 min und 1 min Abtropfen; (5) 2-5 mg Probe an PNA-Harz wurden entnommen und sorgfältig für die quantitative Ninhydrin-Analyse getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Zugabe von 3,2 Äquiv. (0,18 mMol; 100 mg) BocTaeg-OPfp, gelöst in 1 ml CH&sub2;Cl&sub2;, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml DMF (Endkonzentration an Pentafluorphenylester 0,12 M); die Kupplungsreaktion konnte in einer Gesamtzeit von 12-24 h durch Schütteln bei Raumtemperatur ablaufen; (7) Waschen mit DMF, 3 ml, 1 · 2 min. (8) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 3 ml, 4 · 1 min. (9) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 3 ml, 2 · 2 min. (10) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 3 ml, 6 · 1 min. (11) 2-5 mg des Schutzgruppen enthaltenden PNA-Harzes wurden für einen schnellen quantitativen Ninhydrin-Test entnommen und weitere 2-5 mg wurden sorgfältig für eine qualitative Ninhydrin-Analyse getrocknet, um das Ausmaß der Kupplung zu bestimmen (nach den Zyklen 7, 10 und 15 wurden nicht-umgesetzte Aminogruppen durch Acetylierung mit N-Acetylimidazol in Methylenchlorid blockiert).
    • Beispiel 18 Festphasen-Synthese von Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-Lys-NH&sub2; und kürzerer Derivate (a) Schrittweise Zusammensetzung von Boc-[Taeg]&sub1;&sub5;-Lys(CIZ)-BHA-Harz
  • Die Synthese wurde durch quantitative Beladung (standardmäßige in situ Kupplung von Standard-DCC in unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2;) von Boc-Lys(CIZ) auf 100 mg vorgequollenem und neutralisiertem BHA-Harz (0,57 mMol NH&sub2;/g) initiiert. Die weitere Ausdehnung der Schutzgruppen enthaltenden PNA-Kette wendet für die Zyklen 1 bis 5 und die Zyklen 10 bis 15 einzelne Kupplungen an ("Syntheseprotokoll 2"), unter Verwendung von 3,2 Äquiv. an BocTaeg-OPfp in etwa 33% DMF/CH&sub2;Cl&sub2;. Die Zyklen 5 bis 10 wendeten eine extra direkte (d.h. in situ) DCC-Kupplung der freien Säure BocTaeg-OH in etwa 33% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; an. Alle Kupplungsschritte wurden durch Schütteln für mindestens 12 h in einem manuell bedienbaren 6 ml Festphasen- Reaktionsgefäß durchgeführt. Nicht-umgesetzte Aminogruppen wurden durch Acetylierung in den gleichen Stadien der Synthese blockiert, wie es in Beispiel 17 erfolgte. Teilmengen der Schutzgruppen enthaltenden Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-BHA- und Boc- [Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-BHA-Harze wurden nach der Zusammensetzung von 5 bzw. 10 PNA-Resten entnommen. Wie durch das analytische HPLC-Chromatogramm des ungereinigten Spaltprodukts aus dem Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-BHA-Harz (siehe Abschnitt (e)) beurteilt, ergab zusätzliche "freie Säure" Kupplung der PNA-Reste 5 bis 10 keine wesentliche Verbesserung der Syntheseausbeute, verglichen mit den durchweg einzel-gekuppelten Resten im Beispiel 17.
    • (b) Synthese von Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-BHA-Harz
  • Nach der Entfernung der Schutzgruppen von einem Teil des Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)- BHA-Harzes (bestimmtes Trockengewicht beträgt etwa 90 mg; 0,01 Mol wachsende Ketten), wurde das H-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA-Harz mit etwa 20 Äquivalenten (141 mg; 0,19 mMol) Acr¹-OPfp in 1 ml etwa 66% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; in einem 3 ml Festphasen- Reaktionsgefäß umgesetzt. Die Auswertung einer qualitativen Ninhydrin-Reaktion ergab, daß die Kupplung der Acridin-Einheit nahezu quantitativ war.
    • (c) Synthese von Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-Lys(CIZ)-BHA-Harz
  • Nach der Entfernung der Schutzgruppen von dem verbleibenden Boc-[Taeg]&sub1;&sub5;- Lys(CIZ)-BHA-Harz (bestimmtes Trockengewicht beträgt etwa 70 mg; 0,005 Mol wachsende Ketten) wurde das H-[Taeg]&sub1;&sub5;-BHA-Harz mit etwa 25 Äquivalenten (91 mg; 0,12 mMol) Acr¹-OPfp in 1 ml etwa 66% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; in einem 3 ml Festphasen- Reaktionsgefäß umgesetzt. Die Auswertung einer qualitativen Ninhydrin-Reaktion ergab, daß die Kupplung der Acridin-Einheit nahezu quantitativ war.
    • (d) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;
  • Ein Teil des Schutzgruppen enthaltenden Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-BHA-Harzes wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 19,0 mg trockenem H-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-BHA-Harz 8,9 mg an Rohmaterial. Der Hauptpeak bei 12,2 min (eluierte bei 14,2 min. wenn es aus einer wässrigen Lösung anstatt aus einer 10% wässrigen Essigsäurelösung injiziert wurde) entsprach etwa 90% der Gesamtabsorption. Etwa 2,2 mg des Rohprodukts wurden gereinigt und es entstanden annähernd 1,5 mg eines 99% reinen H-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;.
    • (e) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub1;&sub0;-LysNH&sub2;
  • Ein Teil des Schutzgruppen enthaltenden Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-BHA-Harzes wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und ergab nach der HF-Spaltung von 7,0 mg trockenem H-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-BHA-Harz 1,7 mg an Rohmaterial. Der Hauptpeak bei 15,1 min (eluierte bei 17,0 min. wenn es aus einer wässrigen Lösung anstatt aus einer 10% wässrigen Essigsäurelösung injiziert wurde) entsprach etwa 50% der Gesamtabsorption. Etwa 1,2 mg des Rohprodukts wurden gereinigt und es entstanden annähernd 0,2 mg eines > 95% reinen H-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)&spplus; betrug der berechnete m/z-Wert 2807,8 und der gemessene m/z-Wert betrug 2808,2.
    • (f) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub0;-LysNH&sub2;
  • 99,1 mg des Schutzgruppen enthaltenden Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-BHA-Harzes (Trockengewicht) wurden, wie in Beispiel 17c beschrieben, gespalten und lieferten 42,2 mg an Rohmaterial. Der Hauptpeak bei 25,3 min (eluierte bei 23,5 min. wenn es aus einer wässrigen Lösung anstatt aus einer 10% wässrigen Essigsäurelösung injiziert wurde) entsprach etwa 45% der Gesamtabsorption. Eine Menge von 8,87 mg an Rohprodukt wurde gereinigt und es entstanden annähernd 5,3 mg eines > 97% reinen H-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)&spplus; betrug der berechnete m/z-Wert 2850,8 und der gemessene m/z-Wert betrug 2849,8.
    • (g) Spaltung und Reinigung von Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-Lys-NH&sub2;
  • Eine Menge von 78,7 mg an Schutzgruppen-enthaltendem Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub5;-Lys(CIZ)- BHA-Harz (Trockengewicht) wurde wie in Beispiel 1 Abschnitt (c) beschrieben, gespalten und lieferte 34,8 mg an Rohmaterial. Der Hauptpeak bei 23,5 min (etwa die gleiche Elutionszeit, wenn es aus einer wässrigen Lösung anstatt aus einer 10% wässrigen Essigsäurelösung injiziert wurde) und ein "Dimer" bei 28,2 min entsprachen etwa 35% der Gesamtabsorption. Etwa 4,5 mg des Rohprodukts wurden gereinigt und es entstanden annähernd 1,6 mg eines vermutlich > 95% reinen H-[Taeg]&sub1;&sub0;- Lys-NH&sub2;. Diese Verbindung konnte nicht von dem "Dimer"-Peak befreit werden, der beim Stehen in wässriger Essigsäurelösung anstieg.
    • (h) Syntheseprotokoll 2
  • (1) Entfernung der Boc-Schutzgruppen mit TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1, v/v), 3 ml, 3 · 1 min und 1 · 30 min. (2) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 3 ml, 6 · 1 min. (3) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 3 ml, 3 · 2 min. (4) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 3 ml, 6 · 1 min und 1 min Absaugen; (5) 2-5 mg Probe an PNA-Harz wurden entnommen und sorgfältig für eine qualitative Ninhydrin-Analyse getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) für die Zyklen 1 bis 5 und die Zyklen 10 bis 15 wurde die Kupplungsreaktion durch Zugabe von in 1 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelösten 3,2 Äquiv. (0,18 mMol; 100 mg) BocTaeg-OPfp ausgeführt, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml DMF (Endkonzentration an Pentafluorphenylester 0,12 M); die Kupplungsreaktion konnte in einer Gesamtzeit von 12-24 h durch Schütteln ablaufen; die Zyklen 5 bis 10 wendeten eine zusätzliche 0,12 M DCC-Kupplung von 0,12 M BocTaeg-OH in 1,5 ml DMF/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 2, v/v) an; (7) Waschen mit DMF, 3 ml, 1 · 2 min. (8) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 3 ml, 4 · 1 min. (9) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 3 ml, 2 · 2ml; (10) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 3 ml, 6 · 1 min. (11) 2-5 mg des Schutzgruppenenthaltenden PNA-Harzes wurden für einen schnellen qualitativen Ninhydrin-Test entnommen (nach den Zyklen 7, 10 und 15 wurden nicht-umgesetzte Aminogruppen durch Acetylierung mit N-Acetylimidazol in Methylenchlorid blockiert).
    • Beispiel 19 Verbesserte Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen enthaltende PNA wurde an einem MBHA-Harz zusammengesetzt, unter Verwendung von annähernd der Hälfte der Beladung, die in den vorstehend genannten Beispielen bei dem BHA-Harz verwendet wurde. Des weiteren folgte allen Zyklen, mit Ausnahme eines, die Acetylierung der ungekuppelten Aminogruppen. Im nachfolgenden wird die Synthese im einzelnen beschrieben:
    • (a) Herstellung von Boc-Lys(CIZ)-NH-CH-(p-CH&sub3;-C&sub6;H&sub4;)-Harz (MBHA-Harz) mit einer anfänglichen Substitution von 0,3 m Mol/g
  • Die erwünschte Substitution des Boc-Lys(CIZ)-MBHA-Harzes betrug 0,25-0,30 mMol/g. Um diesen Wert zu erreichen, wurden 1,5 mMol Boc-Lys(CIZ) an 5 g neutralisiertem und an vorgequollenem MBHA-Harz gekuppelt (enthält 0,64 mMol NH&sub2;/g, wie durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion bestimmt), indem eine einzelne "in situ" Kupplung (1,5 mMol DCC) in 60 ml CH&sub2;Cl&sub2; angewendet wurde. Die Reaktion wurde durch 3stündiges Schütteln in einem manuell bedienbaren, 225 ml- Festphasen-Reaktionsgefäß durchgeführt. Nicht-umgesetzte Aminogruppen wurden anschließend durch 18stündige Acetylierung mit einem Gemisch aus Essigsäureanhydrid/Pyridin/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1 : 2, v/v/v) blockiert. Eine quantitative Ninhydrin-Reaktion aus dem neutralisierten Harz zeigte, daß nur 0,00093 mMol/g freies Amin verblieben (siehe Tabelle I), d.h. 0,15% der ursprünglichen Aminogruppen. Der Substitutionsgrad wurde durch Entfernung der Schutzgruppen und Ninhydrin-Analyse bestimmt und er betrug für das neutralisierte H-Lys(CIZ)-MBHA-Harz 0,32 mMol/g. Dies stimmt gut mit dem Maximalwert von 0,28 mMol/g für eine quantitative Kupplung von 0,30 mMol Boc-Lys(CIZ)/g Harz überein (siehe Tabelle II).
    • (b) Schrittweise Zusammensetzung von Boc-[Taeg]&sub3;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Der Gesamtansatz des in Abschnitt (a) hergestellten H-Lys(CIZ)-MBHA-Harzes wurde direkt (im gleichen Reaktionsgefäß) zur Zusammensetzung des Boc-[Taeg]3- Lys(CIZ)-MBHA-Harzes durch einzelne Kupplungen ("Syntheseprotokoll 3") verwendet, unter Anwendung von 2,5 Äquivalenten BocTaeg-OPfp in unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2;. Die quantitative Ninhydrin-Reaktion wurde während der Synthese durchgeführt (siehe Tabelle II).
    • (c) Schrittweise Zusammensetzung von Boc-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 4,5 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub3;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz ( 0,36 mMol wachsende Ketten; entnommen aus einer Gesamtmenge von 19 g des feuchten, in Abschnitt (b) hergestellten Harzes) wurden in ein 55 ml SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Das Boc- [Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch einzelne Kupplungen ("Syntheseprotokoll 4"), unter Verwendung von 2,5 Äquivalenten BocTaeg-OPfp in etwa 30% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt. Der Fortschritt der Synthese wurde in allen Stadien durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion verfolgt (siehe Tabelle II).
    • (d) Schrittweise Zusammensetzung von Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 1 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz ( 0,09 mMol wachsende Ketten; entnommen aus einer Gesamtmenge von 4 g des feuchten, in Abschnitt (c) hergestellten Harzes) wurde in ein 20 ml-SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Das Boc- [Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch das Einzel-Kupplungsprotokoll, wie sie im vorhergehendem Abschnitt angewendet wurden, unter Verwendung von 2,5 Äquivalenten BocTaeg-OPfp in etwa 30% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt. Das Reaktionsvolumen betrug 3 ml (kräftiges Schütteln). Die Synthese wurde durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion verfolgt (siehe Tabelle II).
    • (e) Synthese von Ac-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Nach der Entfernung der Schutzgruppen von einem Teil des Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)- MBHA-Harzes (das bestimmte Trockengewicht betrug etwa 45 mg) wurde das Harz als nächstes über einen Zeitraum von 2 h in einem 3 ml-Festphasen-Reaktionsgefäß quantitativ mit einem 2 ml Gemisch aus Essigsäureanhydrid/Pyridin/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1 : 2, v/v/v) acetyliert.
    • (f) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;
  • Ein Teil des Schutzgruppen enthaltenden Boc[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-BHA-Harzes wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte durch die HF-Spaltung von 76 mg trockenem H-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-BHA-Harz etwa 24 mg an Rohmaterial. Der Hauptpeak bei 15,2 min (der derartige Verunreinigungen, wie Deletionspeptide und verschiedene Nebenprodukte, einschließt) entsprach etwa 78% der Gesamtabsorption. Der Hauptpeak entsprach auch etwa 88% der Absorption des "Hauptpeaks plus des Deletionspeaks", was gut mit der nachgewiesenen Gesamt-Kupplungs-Ausbeute von 90,1% übereinstimmt, die durch die Summation der einzelnen Kupplungsausbeuten in Tabelle II erhalten wurde. Ein Menge von 7,2 mg des Rohprodukts wurde aus zwei Ansätzen unter Verwendung einer halb-präparativen Umkehrphasen-Säule gereinigt (indem der Hauptpeak in einem Becherglas gesammelt wurde, das mit Trockeneis/2-Propanol gekühlt wurde). Jedes enthielt 3,6 mg in 1 ml H&sub2;O. Die gefrorene Lösung wurde direkt gefriergetrocknet (ohne vorherige Entfernung des Acetonitrils in einer Speedvak) und es entstanden 4,2 mg eines 82% reinen H-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys- NH&sub2;.
    • (g) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von Ac-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;
  • Eine Menge von 400 mg des Schutzgruppen enthaltenden Ac-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)- BHA-Harzes (Trockengewicht) wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, gespalten mit Ausnahme der TFA-Behandlung und lieferte 11,9 mg an Rohmaterial. Der Hauptpeak bei 15,8 min entsprach etwa 75% der Gesamtabsorption. Eine Menge von 4,8 mg des Rohprodukts wurde gereinigt und es entstanden annähernd 3,5 mg eines > 95% reinen Ac-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)&spplus; betrug der berechnete m/z-Wert 2849,8 und der gemessene m/z-Wert betrug 2848,8.
    • (h) Syntheseprotokoll 3
  • (1) Entfernung der Boc-Schutzgruppen mit TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1, v/v), 100 ml, 3 · 1 min und 1 · 30 min. (2) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 100 ml, 6 · 1 min. (3) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 100 ml, 3 · 2 min. (4) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 100 ml, 6 · 1 min und 1 min Abtropfen; (5) 2-5 mg Probe an PNA-Harz wurden entnommen und sorgfältig für eine quantitative Ninhydrin-Analyse getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Zugabe von in 35 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelösten 2,5 Äquiv. (3,75 mMol; 2,064 g) BocTaeg-OPfp (Endkonzentration an Pentafluorphenylester 0,1 M); die Kupplungsreaktion konnte in einer Gesamtzeit von 20-24 h durch Schütteln ablaufen; (7) Waschen mit DMF, 100 ml, 1 · 2 min (um den BocTaeg-OH-Niederschlag zu entfernen); (8) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 100 ml, 4 · 1 min. (9) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 100 ml, 2 · 2 min. (10) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 100 ml, 6 · 1 min. (11) 2-5 mg des Schutzgruppen enthaltenden PNA-Harzes wurden für einen schnellen qualitativen Ninhydrin-Test entnommen und weitere 2-5 mg wurden sorgfältig für eine quantitative Ninhydrin-Analyse getrocknet, um das Ausmaß der Kupplung zu bestimmen; (12) Blockierung der nicht-umgesetzten Aminogruppen durch 2stündige Acetylierung mit einem 100 ml Gemisch aus Essigsäureanhydrid/Pyridin/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1 : 2; v/v/v); (13) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 100 ml, 6 · 1 min. (14) 2 · 2-5 mg Proben des Schutzgruppen enthaltenden PNA-Harzes wurden für die qualitativen und quantitativen Ninhydrin-Analysen entnommen, mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v) neutralisiert und mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen.
    • (i) Syntheseprotokoll 4
  • (1) Entfernung der Boc-Schutzgruppen mit TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1, v/v), 25 ml, 3 · 1 min und 1 · 30 min. (2) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 25 ml, 6 · 1 min. (3) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 25 ml, 3 · 2 min. (4) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 25 ml, 6 · 1 min und 1 min Abtropfen; (5) 2-5 mg Probe an PNA-Harz wurden entnommen und sorgfältig für eine quantitative Ninhydrin-Analyse getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Zugabe von in 6 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelösten 2,5 Äquiv. (0,92 mMol; 0,506 g) BocTaeg-OPfp, gefolgt von der Zugabe von 3 ml DMF (Endkonzentration an Pentafluorphenylester 0,1 M); die Kupplungsreaktion konnte in einer Gesamtzeit von 20-24 h durch Schütteln ablaufen; (7) Waschen mit DMF, 25 ml, 1 · 2 min; (8) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;) 25 ml, 4 · 1 min. (9) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 25 ml, 2 · 2 min. (10) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 25 ml, 6 · 1 min. (11) 2-5 mg des Schutzgruppen-enthaltenden PNA-Harzes wurden für einen schnellen qualitativen Ninhydrin-Test entnommen und weitere 2-5 mg wurden sorgfältig für eine quantitative Ninhydrin-Analyse getrocknet, um das Ausmaß der Kupplung zu bestimmen; (12) Blockierung der nicht-umgesetzten Aminogruppen durch 2stündige Acetylierung mit einem 25 ml Gemisch aus Essigsäureanhydrid/Pyridin/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1 : 2; v/v/v) (ausgenommen, nach dem ersten Zyklus) (13) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 25 ml, 6 · 1 min. (14) 2 · 2-5 mg Proben des Schutzgruppen enthaltenden PNA-Harzes wurden für die qualitativen und quantitativen Ninhydrin-Analysen entnommen, mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v) neutralisiert und mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen.
    • Beispiel 20
  • Festphasensynthese von H-[Taeg]&sub5;-Caeg-[Taeg]&sub4;-Lys-NH&sub2;
    • (a) Schrittweise Zusammensetzung von Boc-[Taeg]&sub5;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub4;-Lys(CIZ)- MBHA-Harz
  • Etwa 2,5 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub3;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz (1/6 des gesamt verbleibenden etwa 16 g feuchten Harzes; 0,75 g trockenes Harz 0,15 mMol wachsende Ketten) wurden in einen 6 ml-SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub5;-Caeg- [Taeg]&sub4;-Lys-(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch doppelte Kupplung aller Taeg-Reste zusammengesetzt, unter Verwendung der üblichen 2,5 Äquivalente an BocTaeg-OPfp in 2,5 ml etwa 30% DMF/CH&sub2;Cl&sub2;, mit der Ausnahme, daß der erste Rest einzeln gekuppelt wurde. Der Einbau des C(Z)aeg-Restes erfolgte durch Kupplung mit 2,0 Äquivalenten BocC(Z)aeg-OPfp in TFE/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 2, v/v). Der Fortschritt der Synthese wurde in allen Stadien durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion verfolgt (siehe Tabelle III).
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub5;-Caeg-[Taeg]&sub4;-Lys- NH&sub2;
  • Ein Teil des Schutzgruppen enthaltenden Boc-[Taeg]&sub5;-Caeg-[Taeg]&sub4;-Lys(CIZ)-BHA- Harzes wurde, wie in Beispiel I Abschnitt (c) beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 66,9 mg trockenem H-[Taeg]&sub5;-Caeg-[Taeg]&sub4;-Lys(CIZ)- BHA-Harz etwa 14,4 mg an Rohmaterial. Der Hauptpeak bei 14,5 min entsprach etwa > 50% der Gesamtabsorption. Eine Menge von 100,0 mg an Rohprodukts wurde gereinigt (8 Ansätze; jeder gelöst in 1 ml HaO) und es entstanden annähernd 9,1 mg eines 96% reinen H-[Taeg]&sub5;-Caeg-[Taeg]&sub4;-Lys-NH&sub2; (Fig. 13b). Für (M + H)&spplus; betrug der berechnete m/z-Wert 2793,8 und der gemessene m/z-Wert betrug 2790,6.
    • Beispiel 21 Bindung von Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; an dA&sub1;&sub0; (Fig. 11a)
  • Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys (100 ng) wurde 15 min bei Raumtemperatur mit 50 cps 5'-[³²P]- endständig-markiertem Oligonukleotid [d(GATCCA&sub1;&sub0;G)] in 20 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) inkubiert. Die Probe wurde in Eis gekühlt (15 min) und durch Gelelektrophorese in Polyacrylamid (PAGE) analysiert. 10 ul der Probe wurden 2 ul 50% Glycerin, 5 TBE (TBE = 90 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA, pH 8,3) zugesetzt und die Probe wurde durch PAGE (15% Acrylamid, 0,5% Bisacrylamid) in TBE- Puffer bei 4ºC analysiert. Eine Menge von 10 l der Probe wurde gefriergetrocknet und erneut in 10 ul 80% Formamid, 1 TBE gelöst, auf 90ºC erhitzt (5 min) und durch Harnstoff/PAGE (15% Acrylamid, 0,5% Bisacrylamid, 7 M Harnstoff) in TBE analysiert. Die [³²P]-enthaltenden DNA-Banden wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht, unter Verwendung von Röntgenfilmen und Agfa Curix RPI Röntgenfilmen, die 2 h bei -80ºC belichtet wurden.
  • Die Oligonukleotide wurden mit einem Biosearch 7500 DNA-Synthesizer synthetisiert, mit γ[³²P]-ATP (Amersham, 5000 Ci/mMol) und mit Polynukleotidkinase markiert und mittels PAGE, unter Anwendung von Standardverfahren analysiert (Maniatis et al. (1986): A laboratory manual, Gold Spring Habor Laboratories).
    • Beispiel 22 Bildung des Strangverdrängungskomplexes
  • Eine dA&sub1;&sub0;-dT&sub1;&sub0;-Zielsequenz, die in einer Plasmid-DNA-Sequenz enthalten ist, wurde mittels Standardverfahren durch Klonierung von zwei Oligonukleotiden (d(GATCCA&sub1;&sub0;G) + d(GATCCT&sub1;&sub0;G)) in die BamHI-Restriktionsenzym-Stelle von pUC19 konstruiert, unter Verwendung des Escherica coli Stamms JM101 (Maniatis et al., 1986). Das erwünschte Plasmid (gestaltetes pT10) wurde aus einem der entstehenden Klone isoliert und durch das alkalische Extraktionsverfahren und CsCl- Zentrifugation gereinigt (Maniatis et al., 1986). Durch Spaltung der pT10-DNA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Pvull, Markieren der gespaltenen DNA mit α[³²P]-dATP (4000 Ci/mMol, Amersham) unter Verwendung des Klenow-Fragments von E.coli DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) und Reinigen des 248 Bp DNA- Fragments durch PAGE (5% Acrylamid, 0,06% Bisacrylamid, TBE-Puffer) wurde ein die dA&sub1;&sub0;/dT&sub1;&sub0;-Zielsequenz enthaltendes, 3'-[³²P]-endständig-markiertes DNA- Fragment von 248 Bp erhalten. Durch Behandlung des EcoRI-gespaltenen pT10- Plasmids mit bakterieller alkalischer Phospathase (Boehringer Mannheim), Reinigen der Plasmid-DNA durch Gelelektrophorese in niedrig schmelzender Agarose und Markierung mit γ[³²P] ATP und Polynukleotidkinase wurde dieses DNA-Fragment mit [³²P]-endständiger Markierung am 5'-Ende erhalten. Nach der Behandlung mit Pvull wurde das 248 Bp DNA-Fragment wie vorstehend genannt gereinigt.
  • Der Komplex zwischen Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; und dem 248 Bp DNA-Fragment wurde durch 60minütige Inkubation von 50 ng Acr¹-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; mit 500 cps ³²P- markiertem 248 Bp Fragment und 0,5 ug Kalbsthymus-DNA in 100 ul Puffer bei 37ºC gebildet.
    • Beispiel 23 Sonden-Analyse des Strangverdrängungskomplexes mit: (a) Staphylococcus-Nuklease (Fig. 12b)
  • Der Strangverdrängungskomplex wurde, wie vorstehend beschrieben, in 25 mM Tris- HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM CaCl&sub2;, pH 7,4 gebildet. Der Komplex wurde 5 min bei 20ºC mit 750 U/ml Staphlococcus-Nuklease (Boehringer Mannheim) inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA bis zu einer Konzentration von 25 mM gestoppt. Die DNA wurde mit 2 Vol. Ethanol, 2% Kaliumacetat ausgefällt, in 80% Formamid, TBE gelöst, auf 90ºC erhitzt (5 min) und durch hochauflösende PAGE (10% Acrylamid, 0,3% Bisacrylamid, 7 M Harnstoff) und Autoradiographie analysiert.
    • (b) Affinitäts-Photospaltung (Fig. 12a + 12b)
  • Der Komplex wurde in TE-Puffer gebildet. Eine in einem Eppendorf-Röhrchen enthaltene Probe wurde von oben bei 300 nm 30 min bestrahlt (Philips TL 20 W/12 Fluoreszenzlichtröhre, 24 Jm&supmin;²s&supmin;¹). Die DNA wurde, wie vorstehend angeführt, ausgefällt, in 1 M Piperidin aufgenommen und 20 min auf 90ºC erhitzt. Nach der Gefriertrocknung wurde die DNA, wie vorstehend angeführt, durch PAGE analysiert.
    • (c) Kaliumpermanganat (Fig. 12b)
  • Der Komplex wurde in 100 ul TE gebildet und es wurden 5 ul 20 mM KMnO&sub4; zugesetzt. Die Reaktion wurde nach 5 s bei 20ºC durch Zugabe von 50 ul 1,5 M Natriumacetat, pH 7,0, 1 M 2-Mercaptoethanol gestoppt und, wie vorstehend angeführt, analysiert.
    • (d) Photofootprinting (Fig. 12b)
  • Der Komplex wurde in 100 ml TE gebildet und Diazoverknüpftes Acridin (0,1 ug/ul) (DNA, Nielsen et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16, 3877-88) wurde zugesetzt. Die Probe wurde bei 365 nm 30 min bestrahlt (Philips TL 20 W/09 N, 22 Jm&supmin;²s&supmin;¹) und die weitere Behandlung erfolgte wie für die "Affinitäts-Photospaltung" beschrieben.
    • (e) S&sub1;-Nuklease (Fig. 12c)
  • Der Komplex wurde in 50 mM Natriumacetat, 200 mM NaCl, 0,5% Glycerin, 1 mM ZnCl&sub2;, pH 4,5 gebildet und 5 min bei 20ºC mit 0,5 U/ml S&sub1;-Nuklease (Boehringer Mannheim) behandelt. Die Reaktion wurde gestoppt und die weitere Behandlung erfolgte wie in "Staphylococcus-Nuklease" beschrieben.
    • Beispiel 24 N-Benzyloxycarbonyl-N'-(bocaminoethyl)glycin
  • Aminoethylglycin (52,86 g; 0,447 mMol) wurde in Wasser (900 ml) gelöst und es wurde Dioxan (900 ml) zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit 2 N NaOH auf 11,2 eingestellt. Während der pH-Wert bei 11,2 gehalten wurde, wurde tert-Butyl-p- nitrophenylcarbonat (128,4 g; 0,537 Mol) in Dioxan (720 ml) gelöst und über einen Zeitraum von 2 h tropfenweise zugesetzt. Der pH-Wert wurde für mindestens drei Stunden auf 11,2 gehalten und dann wurde das Gemisch über Nacht rühren lassen. Die gelbe Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und der pH-Wert wurde mit 2 N HCl auf 3,5 eingestellt. Das Gemisch wurde mit Chloroform gewaschen (4 · 100 ml) und der pH-Wert der wässrigen Phase wurde mit 2 N NaOH bei 0ºC bei 9,5 eingestellt. Über einen Zeitraum von einer halben Stunde wurde Benzyloxycarbonylchlorid (73,5 ml; 0,515 Mol) zugesetzt, während der pH-Wert mit 2 N NaOH auf 9,5 gehalten wurde. Während der nächsten 4 Stunden wurde der pH-Wert häufig eingestellt und die Lösung wurde über Nacht rühren lassen. Am folgenden Tag wurde die Lösung mit Ether gewaschen (3 · 600 ml) und danach wurde der pH-Wert bei 0ºC mit 2 N HCl auf 1,5 eingestellt. Die Titelverbindung wurde durch Extraktion mit Essigsäureethylester (5 · 1000 ml) isoliert. Die Essigsäureethylesterlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Dies erbrachte 138 g, die in Ether (300 ml) gelöst wurden und durch Zugabe von Petrolether (1800 ml) ausgefällt wurden. Ausbeute 124,7 g (79%). Fp. 64,5-85ºC. Anal, für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub4;N&sub2;O&sub6;, gefunden (ber.) C: 58,40 (57,94); H: 7,02 (6,86); N: 7,94 (7,95). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl&sub3;) 7,33 & 7,32 (5H, Ph); 5,15 & 5,12 (2H, PhCH&sub2;); 4,03 & 4,01 (2H, NCH&sub2;CO&sub2;H); 3,46 (b, 2H, BocNHCH&sub2;CH&sub2;); 3,28 (b, 2H, BocNHCH&sub2;CH&sub2;); 1,43 & 1,40 (9H, tBu). HPLC (260 nm) 20,71 min (80,2%) und 21,57 min (19,8%). Die UV- Spektren (200 nm-300 nm) sind identisch, was darauf hinweist, daß der Nebenpeak aus Bis-Z-AEG besteht.
    • Beispiel 25 N'-Boc-aminoethylglycinethylesester
  • N-Benzyloxycarbonyl-N'-(bocaminoethyl)glycin (60,0 g; 0,170 Mol) und N,N- Dimethyl-4-aminopyridin (6,00 g) wurden in absolutem Ethanol (500 ml) gelöst und vor der Zugabe von DCC (42,2 g; 0,204 Mol) auf 0ºC abgekühlt. Das Eisbad wurde nach 5 Minuten entfernt und das Rühren wurde weitere 2 Stunden fortgesetzt. Das ausgefallene DCU (32,5 g, getrocknet) wurde durch Filtration entfernt und mit Ether (3 · 100 ml) gewaschen. Das vereinte Filtrat wurde schrittweise mit verdünntem Kaliumhydrogensulfat (2 · 400 ml), verdünntem Natriumhydrogencarbonat (2 · 400 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (1 · 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde filtriert, anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, was 66,1 g einer öligen Substanz lieferte, die etwas DCU enthielt.
  • Das Öl wurde in absolutem Ethanol (600 ml) gelöst und wurde 10% Palladium auf Kohlenstoff (6,6 g) zugesetzt. Die Lösung wurde unter Atmosphärendruck hydriert, wobei das Reservoir mit 2 N Natriumhydroxid gefüllt war. Nach 4 Stunden waren 3,3 l von theoretisch 4,2 l verbraucht. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, was 39,5 g (94%) einer öligen Substanz erbrachte. Eine Menge von 13 g der öligen Substanz wurde durch Silicagel- Chromatographie (600 g SiO&sub2;) gereinigt. Nach der Elution mit 300 ml 20% Petrolether in Methylenchlorid wurde die Titelverbindung mit 1700 ml 5% Methanol in Methylenchlorid eluiert. Das Lösungsmittel wurde aus den Fraktionen im Vakuum mit ausreichender Reinheit entfernt und die Ausbeute betrug 8,49 g. Alternativ wurden 10 g des Rohmaterials durch Kugelrohr-Destillation gereinigt. ¹H-NMR (250 MHz; CD&sub3;OD): 4,77 (b. s, NH); 4,18 (q, 2H, MeCH&sub2;-); 3,38 (s, 2H, NCH&sub2;CO&sub2;Et); 3,16 (t, 2H, BocNHCH&sub2;CH&sub2;); 2,68 (t, 2H, BocNHCH&sub2;CH&sub2;); 1,43 (s, 9H, tBu) und 1,26 (t, 3H, CH&sub3;). ¹³C-NMR 171,4 (COEt); 156,6 (CO); 78,3 ((CH&sub3;)&sub3;C); 59,9 (CH&sub2;); 49,0 (CH&sub2;); 48,1 (CH&sub2;); 39,0 (CH&sub2;); 26,9 (CH&sub2;) und 12,6 (CH&sub3;).
    • Beispiel 26 N'-Boc-aminoethylglycinmethylester
  • Das vorstehend genannte Verfahren wurde angewendet, wobei Ethanol durch Methanol ersetzt wurde. Das Endprodukt wurde durch Säulenreinigung gereinigt.
    • Beispiel 27 1-(Boc-aeg)thyminethylester
  • N'-Boc-aminoethylglycinethylester (13,5 g; 54,8 mMol), Dhbt-OH (9,84 g; 60,3 mMol) und 1-Carboxymethylthymin (11,1 g; 60,3 mMol) wurden in DMF (210 ml) gelöst. Anschließend wurde Methylenchlorid (210 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde in einem Ethanol/Eisbad auf 0ºC abgekühlt und DCC (13,6 g; 65,8 mMol) wurde zugesetzt. Das Eisbad wurde nach 1 Stunde entfernt und das Rühren wurde für weitere 2 Stunden bei Umgebungstemperatur fortgesetzt. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtration entfernt und zweimal mit Methylenchlorid gewaschen (2 · 75 ml). Den vereinten Filtraten wurde weiteres Methylenchlorid (650 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde schrittweise mit verdünntem Natriumhydrogencarbonat (3 · 500 ml), verdünntem Kaliumhydrogencarbonat (2 · 500 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (1 · 500 ml) gewaschen. Aus der organischen Phase wurde durch Filtration etwas Niederschlag entfernt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in Methylenchlorid (150 ml) gelöst, filtriert und die Titelverbindung wurde durch Zugabe von Petrolether (350 ml) bei 0ºC ausgefällt. Das Methylenchlorid/Petrolether-Verfahren wurde einmal wiederholt. Dies erbrachte 16,0 g (71%) eines Materials, das gemäß der HPLC eine Reinheit von mehr als 99% aufwies.
    • Beispiel 28 1-(Boc-aeg)thymin
  • Das vorstehend genannte Material wurde in THF (194 ml, ergibt eine 0,2 M Lösung) suspendiert und 1 M wässriges Lithiumhydroxid (116 ml) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde 45 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt und anschließend filtriert, um das verbliebene DCU zu entfernen. Der Lösung wurde Wasser (40 ml) zugesetzt und sie wurde anschließend mit Methylenchlorid (300 ml) gewaschen. Es wurde weiteres Wasser (30 ml) zugesetzt und die alkalische Lösung wurde ein weiteres Mal mit Methylenchlorid (150 ml) gewaschen. Die wässrige Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und der pH-Wert wurde durch tropfenweise Zugabe von 1 N HCl (annäh. 110 ml) auf 2 eingestellt. Die Titelverbindung wurde mit Essigsäureethylester (9 · 200 ml) extrahiert, die vereinten Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde einmal aus Methanol eingeengt, was nach dem Trocknen über Nacht einen farblosen glasartigen Feststoff erbrachte. Ausbeute 9,57 g (64%). HPLC > 98% RT = 14,8 min. Anal, für C&sub1;&sub6;H&sub2;&sub4;N&sub4;O&sub7;º0,25 H&sub2;O, gefunden (ber.) C: 49,29 (49,42); H: 6,52 (6,35); N: 14,11 (14,41). Infolge der eingeschränkten Rotation um die sekundäre Amidbindung wurden mehrere der Signale im Verhältnis 2 : 1 verdoppelt (in der Liste gekennzeichnet durch mj. für Hauptpeak und mi. für Nebenpeak). ¹H-NMR (250 MHz; DMSO-d&sub6;): 12,75 (b.s., 1H, CO&sub2;H); 11,28 (s, "1H", mj., Imid-NH), 11,26 (s, "1H", mi., Imid-NH); 7,30 (s, "1H", mj. T H-6); 7,26 (s, "1H", mi., T H-6); 6,92 (b.t., "1H", mj., BocNH); 6,73 (b.t., "1H", mi., BocNH); 4,64 (s, "2H", mj., CH&sub2;CON); 4,46 (s, "2H", mj., CH&sub2;CON); 4,19 (s, "2H", mi., CH&sub2;CO&sub2;H); 3,97 (s, "2H", mj., CH&sub2;CO&sub2;H); 3,63-3,01 (nicht aufgelöstes m, enthält Wasser, CH&sub2;CH&sub2;); 1,75 (s, 3H, CH&sub3;) und 1,38 (s, 9H, tBu).
    • Beispiel 29 N&sup4;-Benzyloxycarbonyl-1-(Boc-aeg)cytosin
  • N'-Bocamino-ethylglycinethylester (5,00 g; 20,3 mMol), Dhbt-OH (3,46 g; 22,3 mMol) und N&sup4;-Benzyloxycarbonyl-1-carboxymethylcytosin (6,77 g; 22,3 mMol) wurden in DMF (100 ml) suspendiert. Anschließend wurde Methylenchlorid (100 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und es wurde DCC (5,03 g; 24,4 mMol) zugesetzt. Das Eisbad wurde nach 2 h entfernt und das Rühren wurde für eine weitere Stunde bei Umgebungstemperatur fortgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde dann im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in Ether (100 ml) suspendiert und 30 min kräftig gerührt. Das feste Material wurde durch Filtration isoliert und das Ether-Waschverfahren wurde zweimal wiederholt. Das Material wurde anschließend mit verdünntem Natriumhydrogencarbonat (annäh. 4% Lösung, 100 ml) 15 min kräftig gerührt, filtriert und mit Wasser gewaschen. Dieses Verfahren wurde dann einmal wiederholt, nach dem Trocknen verblieben 17,0 g eines festen gelblichen Materials. Der Feststoff wurde anschließend mit Dioxan (200 ml) gekocht und heiß filtriert. Nach dem Abkühlen wurde Wasser (200 ml) zugesetzt. Das ausgefallene Material wurde durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Gemäß der HPLC (bei 260 nm beobachtet) wies dieses Material, trotz des DCU, eine Reinheit von mehr als 99% auf. Der Ester wurde dann in THF (100 ml) suspendiert, auf 0ºC abgekühlt und 1 N LiOH (61 ml) wurde zugesetzt. Nach 15minütigem Rühren wurde das Gemisch filtriert und das Filtrat wurde mit Methylenchlorid (2 · 150 ml) gewaschen. Die alkalische Lösung wurde dann auf 0ºC abgekühlt und der pH-Wert wurde mit 1 N HCl auf 2,0 eingestellt. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert und einmal mit Wasser gewaschen, wodurch nach dem Trocknen 11,3 g eines weißen Pulvers verblieben. Das Material wurde in Methylenchlorid (300 ml) suspendiert und es wurde Petrolether (300 ml) zugesetzt. Die Filtration und das Waschen erbrachten nach dem Trocknen 7,1 g (69%); HPLC zeigte eine Reinheit von 99% RT = 19,5 min. eine geringe Verunreinigung bei 12,6 min (annäh. 1%) entsprach wahrscheinlich dem Z-de Schutzgruppen enthaltenden Monomer. Anal, für C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub9;N&sub5;O&sub8;, gefunden (ber.) C: 54,16 (54,87); H: 5,76 (5,81) und N: 13,65 (13,91).
  • ¹H-NMR (250 MHz; DMSO-d&sub6;): 10,78 (b.s., 1H, CO&sub2;H); 7,88 (2 überlappende Dupletts, 1H, Cyt H-5); 7,41-7,32 (m, 5H, Ph); 7,01 (2 überlappende Dupletts, 1H, Cyt H-6); 6,94 & 6,78 (nicht aufgel. Tripletts, 1H, BocNH); 5,19 (s, 2H, PhCH&sub2;); 4,81 & 4,62 (s, 2H, CH&sub2;CON); 4,17 & 3,98 (s, 2H, CH&sub2;CO&sub2;H); 3,42-3,03 (m, schließt Wasser ein, CH&sub2;CH&sub2;) und 1,38 & 1,37 (s, 9H, tBu). ¹³C-NMR: 150,88; 128,52; 128,18; 127,96; 93,90; 66,53; 49,58 und 28,22. IR: Frequenz in cm&supmin;¹ (Intensität). 3423 (26,4); 3035 (53,2); 2978 (41,4); 1736 (17,3); 1658 (3,8); 1563 (23,0); 1501 (6,8) und 1456 (26,4).
    • Beispiel 30 9-Carboxymethyladeninethylester
  • Adenin (10,0 g; 74 mMol) und Kaliumcarbonat (10,29 g; 74 mMol) wurden in DMF suspendiert und Bromessigsäureethylester (8,24 ml; 74 mMol) wurde zugesetzt. Die Suspension wurde 2,5 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und anschließend filtriert. Der feste Rückstand wurde dreimal mit DMF (10 ml) gewaschen. Die vereinten Filtrate wurden im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Das gelb- orange feste Material wurde in Wasser (200 ml) gegossen und 4 N HCl wurde bis zum pH-Wert von annähernd 6 zugesetzt. Nach 10minütigem Rühren bei 0ºC wurde der Feststoff abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus 96% Ethanol (150 ml) umkristallisiert. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert und sorgfältig mit Ether gewaschen. Ausbeute 3,4 g (20%). Fp. 215,5-220ºC. Anal, für C&sub9;H&sub1;&sub1;N&sub5;O&sub2;, gefunden (ber.): C: 48,86 (48,65); H: 5,01 (4,91); N: 31,66 (31,42). ¹H-NMR (250 MHz; DMSO- d&sub6;): (s, 2H, H-2 & H-8), 7,25 (b.s., 2H, NH&sub2;), 5,06 (s, 2H, NH&sub2;), 4,17 (q, 2H, J = 7,11 Hz, OCH&sub2;) und 1,21 (t, 3H, J = 7,13 Hz, NH&sub2;). ¹³C-NMR: 152,70; 141,30; 61,41; 43,97 und 14,07. FAB-MS 222 (MH+). IR: Frequenz in cm&supmin;¹ (Intensität). 3855 (54,3); 3274 (10,4); 3246 (14,0); 3117 (5,3); 2989 (22,3); 2940 (33,9); 2876 (43,4); 2753 (49,0); 2346 (56,1); 2106 (57,1); 1899 (55,7); 1762 (14,2); 1742 (14,2); 1742 (1,0); 1671 (1,8); 1644 (10,9); 1606 (0,6); 1582 (7,1); 1522 (43,8); 1477 (7,2); 1445 (35,8) und 1422 (8,6). Die Position der Alkylierung wurde durch Röntgen-Kristallographie an Kristallen nachgewiesen, die durch Umkristallisation aus 96% Ethanol erhalten wurden.
  • Alternativ kann der 9-Carboxymethyladeninethylester gemäß dem nachfolgenden Verfahren hergestellt werden. Zu einer Suspension aus Adenin (50,0 g; 0,37 Mol) in DMF (1100 ml) in einem 2 l-Dreihalskolben, der mit einer Stickstoff-Zuleitung, einem mechanischen Rührer und einem Tropftrichter ausgerüstet ist; wurden 16,4 g (0,407 Mol) einer mit Hexan gewaschenen Natriumhydrid-Mineralöl-Dispersion gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden kräftig gerührt, danach wurde über einen Zeitraum von 3 Stunden tropfenweise Bromessigsäureethylester (75 ml, 0,67 Mol) zugesetzt. Das Gemisch wurde eine weitere Stunde kräftig gerührt, wonach DC auf einen vollständigen Umsatz von Adenin hinwies. Das Gemisch wurde bei 1 mmHg bis zur Trockne eingeengt und dem öligen Rückstand wurde Wasser (500 ml) zugesetzt, welches eine Kristallisation der Titelverbindung bewirkte. Der Feststoff wurde aus 96% Ethanol (600 ml) umkristallisiert. Ausbeute nach der Trocknung 53,7 g (65,6%). HPLC (215 nm) Reinheit > 99,5%.
    • Beispiel 31 N&sup4;-Benzyloxycarbonyl-9-carboxymethyladeninethylester
  • 9-Carboxymethyladeninethylester (3,40 g; 15,4 mMol) wurde in trockenem DMF (50 ml) durch vorsichtiges Erhitzen gelöst, auf 20ºC abgekühlt und über einen Zeitraum von 15 min unter Eiskühlung einer Lösung aus N-Ethylbenzyl-oxycarbonylimidazoltetrafluoroborat (62 mMol) in Methylenchlorid (50 ml) zugesetzt. Es wurde etwas Niederschlag beobachtet. Das Eisbad wurde entfernt und die Lösung wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat (100 ml) behandelt. Nach 10minütigem Rühren wurden die Phasen getrennt und die organische Phase wurde schrittweise mit einem Volumen Wasser, verdünntem Kaliumhydrogensulfat (zweimal) und gesättigtem Natriumchlorid gewaschen. Die Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, was 11 g eines öligen Materials erbrachte. Das Material wurde in Methylenchlorid gelöst (25 ml); auf 0ºC abgekühlt und mit Petrolether (50 ml) ausgefällt. Dieses Verfahren wurde einmal wiederholt und es entstanden 3,45 g (63%) der Titelverbindung. Fp. 132-35ºC. Analyse für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub7;N&sub5;O&sub4;, gefunden (ber.): C: 56,95 (57,46); H: 4,71 (4,82); N: 19,35 (19,71). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl&sub3;): 8,77 (s, 1H, H-2 oder H-8); 7,99 (s, 1H, H-2 oder H-8); 7,45-7,26 (m, 5H, Ph); 5,31 (s, 2H, N- CH&sub2;); 4,96 (s, 2H, Ph-CH&sub2;); 4,27 (q, 2H, J = 7,15 Hz, CH&sub2;CH&sub3;) und 1,30 (t, 3H, J = 7,15 Hz, CH&sub2;CH&sub3;). ¹³C-NMR: 153,09; 143,11; 128,66; 67,84; 62,51; 44,24 und 14,09: FAB-MS: 356 (MH+) und 312 (MH+-CO&sub2;). IR: Frequenz in cm&supmin;¹ (Intensität). 3423 (52,1); 3182 (52,8); 3115 (52,1); 3031 (47,9); 2981 (38,6); 1747 (1,1); 1617 (4,8); 1587 (8,4); 1552 (25,2); 1511 (45,2); 1492 (37,9); 1465 (14,0) und 1413 (37,3).
    • Beispiel 32 N&sup6;-Benzyloxycarbonyl-9-carboxymethyladenin
  • N&sup6;-Benzyloxycarbonyl-9-carboxymethyladeninethylester (3,20 g; 9,01 mMol) wurde mit auf 0ºC abgekühltem Methanol (50 ml) gemischt. Es wurde Natriumhydroxidlösung (50 ml; 2 N) zugesetzt, wobei sich das Material schnell löste. Nach 30 min bei 0ºC wurde die alkalische Lösung mit Methylenchlorid gewaschen (2 · 50 ml). Die wässrige Lösung wurde mit 4 N HCl bei 0ºC auf einen pH-Wert von 1,0 gebracht, wodurch die Titelverbindung ausfiel. Die Ausbeute betrug nach der Filtration, dem Waschen mit Wasser und der Trocknung 3,08 g (104%). Das Produkt enthielt Salz und die Elementaranalyse spiegelt dies wider. Anal, für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub3;N&sub5;O&sub4; gefunden (ber.): C: 46,32 (55,05); H: 4,24 (4,00); N: 18,10 (21, 40) und C/N: 2,57 (2,56). ¹H-NMR (250 MHz; DMSO-d&sub6;): 8,70 (s, 2H, H-2 und H-8); 7,50-7,35 (m, 5H, Ph); 5,27 (s, 2H, N-CH&sub2;) und 5,15 (s, 2H, Ph-CH&sub2;). ¹³C-NMR: 168,77; 152,54; 151,36; 148,75; 145,13; 128,51; 128,17; 127, 98; 66,76 und 44,67. IR (KBr) 3484 (18,3); 3109 (15,9); 3087 (15,0); 2966 (17,1); 2927 (19,9); 2383 (53,8); 1960 (62,7); 1739 (2,5); 1688 (5,2); 1655 (0,9); 1594 (11,7); 1560 (12,3); 1530 (26,3); 1499 (30,5); 1475 (10,4); 1455 (14,0); 1429 (24,5) und 1411 (23,6). FAB-MS: 328 (MH+) und 284 (MH+-CO&sub2;). HPLC (215 nm, 260 nm) im System 1 : 15,18 min. geringfügige Verunreinigungen, insgesamt weniger als 2%.
    • Beispiel 33 N&sup6;-Benzyloxycarbonyl-1-(Boc-aeg)adeninethylester
  • N'-Boc-aminoethylglycinethylester (2,00 g; 8,12 mMol), Dhbt-OH (1,46 g; 8,93 mMol) und N&sup6;-Benzyloxycarbonyl-9-carboxymethyladenin (2,92 g, 8,93 mMol) wurden in DMF (15 ml) gelöst. Anschließend wurde Methylenchlorid (15 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde in einem Ethanol/Eisbad auf 0ºC abgekühlt. Es wurde DCC (2,01 g; 9,74 mMol) zugesetzt. Das Eisbad wurde nach 2,5 h entfernt und das Rühren wurde für weitere 1,5 Stunden bei Umgebungstemperatur fortgesetzt. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtration entfernt und einmal mit DMF (15 ml) und zweimal mit Methylenchlorid (2 · 15 ml) gewaschen. Den vereinten Filtraten wurde mehr Methylenchlorid (100 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde schrittweise mit verdünntem Natriumhydrogencarbonat (2 · 100 ml), verdünntem Kaliumhydrogensulfat (2 · 100 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (1 · 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, was 3,28 g (73%) einer gelblichen öligen Substanz erbrachte. HPLC des Rohprodukts zeigte nur eine Reinheit von 66% mit mehreren Verunreinigungen, welche mehr oder weniger polar als der Hauptpeak waren. Das Öl wurde in absoluten Ethanol (50 ml) gelöst und es wurde aktivierter Kohlenstoff zugesetzt. Nach 5minütigem Rühren wurde die Lösung filtriert. Das Filtrat wurde mit Wasser (30 ml) gemischt und über Nacht rühren lassen. Am nächsten Tag wurde der weiße Niederschlag durch Filtration entfernt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, was 1,16 g (26%) eines Materials erbrachte, dessen Reinheit gemäß der HPLC größer als 98% war. Die Zugabe von Wasser zur Stammflüssigkeit erbrachte weitere 0,53 g mit einer Reinheit von annäh. 95%. Anal, für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub3;N&sub7;C&sub7;ºH&sub2;O, gefunden (ber.) C: 55,01 (54,44); H: 6,85 (6,15) und N: 16,47 (17,09): ¹H-NMR (250 MHz; CDCl&sub3;) 8,74 (s, 1H, Ade H-2); 8,18 (b.s, 1H, ZNH); 8,10 & 8,04 (s, 1H, H-8); 7,46- 7,34 (m, 5H, Ph); 5,63 (nicht aufgel. t, 1H, BocNH); 5,30 (s, 2H, PhCH&sub2;); 5,16 & 5,00 (s, 2H, CH&sub2;CON); 4,29 & 4,06 (s, 2H, CH&sub2;CO&sub2;H); 4,20 (q, 2H, OCH&sub2;CH&sub3;); 3,67-3,29 (m, 4H, CH&sub2;CH&sub2;); 1,42 (s, 9H, tBu) und 1,27 (t, 3H, OCH&sub2;CH&sub3;). Das Spektrum zeigt Spuren an Ethanol und DCU.
    • Beispiel 34 N&sup6;-Benzyloxycarbonyl-1-(Boc-aeg)adenin
  • N&sup6;-Benzyloxycarbonyl-1-(Boc-aeg)adeninethylester (1,48 g; 2,66 mMol) wurde in THF (13 ml) suspendiert und das Gemisch wurde auf 0ºC abgekühlt. Es wurde Lithiumhydroxid (8 ml; 1 N) zugesetzt. Nach 15minütigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch filtriert, zusätzliches Wasser (25 ml) wurde zugesetzt und die Lösung wurde mit Methylenchlorid (2 · 25 ml) gewaschen. Der pH-Wert der wässrigen Lösung wurde mit 1 N HCl auf 2,0 eingestellt. Der Niederschlag wurde durch Filtration isoliert, mit Wasser gewaschen und getrocknet und die Trocknung erbrachte 0,82 g (58%). Das Produkt wurde zweimal mit Methylenchlorid/Petrolether umgefällt und es betrug nach der Trocknung 0,77 g (55%). Fp. 119ºC (zersetzt). Anal, für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub9;N&sub7;O&sub7;ºH&sub2;O, gefunden (ber.) C: 53,32 (52,84); H: 5,71 (5,73); N: 17,68 (17,97). FAB-MS: 528,5 (MH+). ¹H-NMR (250 MHz; DMSO-d&sub6;): 12,75 (sehr b, 1H, CO&sub2;H); 10,65 (b. s, 1H, ZNH); 8,59 (d, 1H, J = 2,14 Hz, Ade H-2); 8,31 (s, 1H, Ade H-8); 7,49-7,31 (m, 5H, Ph); 7,03 & 6,75 (nicht aufgel. t, 1H, BocNH); 5,33 & 5,16 (s, 2H, CH&sub2;CON); 5,22 (s, 2H, PhCH&sub2;); 4,34-3,99 (s, 2H, CH&sub2;CO&sub2;H); 3,54-3,03 (m's, enthält Wasser, CH&sub2;CH&sub2;) und 1,39 & 1,37 (s, 9H, tBu). ¹³C-NMR: 170,4; 166,6; 152,3; 151,5; 149,5; 145,2; 128,5; 128,0; 127,9; 66,32; 47,63; 47,03; 43,87 und 28,24.
    • Beispiel 35 2-Amino-6-chlor-9-carboxymethylpurin
  • Einer Suspension aus 2-Amino-6-chlorpurin (5,02 g; 29,6 mMol) und Kaliumcarbonat (12,91 g; 93,5 mMol) in DMF (50 ml) wurde Bromessigsäure (4,70 g; 22,8 mMol) zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 h unter Stickstoff kräftig gerührt. Es wurde Wasser (150 ml) zugesetzt und die Lösung wurde durch Celit filtriert und es entstand eine klare gelbe Lösung. Die Lösung wurde mit 4 N Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert. Der Niederschlag wurde filtriert und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute (3,02 g; 44,8%). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): δ = 4,88 ppm (s, 2H); 6,95 (s, 2H); 8,10 (s, 1H).
    • Beispiel 36 2-Amino-6-benzyloxy-9-carboxymethylpurin
  • Natrium (2,0 g; 87,0 mMol) wurde in Benzylalkohol (20 ml) gelöst und 2 h auf 130ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen auf 0ºC wurde langsam eine Lösung von 2-Amino-6- chlor-9-carboxymethylpurin (4,05 g; 18,0 mMol) in DMF (85 ml) zugesetzt und die entstehende Lösung wurde über Nacht bei 20ºC gerührt. Es wurde Natriumhydroxid (1 N, 100 ml) zugesetzt und die klare Lösung wurde mit Essigsäureethylester (3 · 100 ml) gewaschen. Anschließend wurde die Wasser-Phase mit 4 N Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert. Der Niederschlag wurde in Essigsäureethylester (200 ml) aufgenommen und die Wasser-Phase wurde mit Essigsäureethylester extrahiert (2 · 100 ml). Die vereinten organischen Phasen wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen (2 · 75 ml), mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und durch Einengen im Vakuum bis zur Trockne gebracht. Der Rückstand wurde aus Ethanol (300 ml) umkristallisiert. Ausbeute nach der Trocknung über Sicapent im Vakuum: 2,76 g (52%). Fp. 159-65ºC. Anal, (ber., gefunden): C (56,18; 55,97), H (4,38; 4,32), N (23,4; 23,10). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 4,82 ppm (s, 2H); 5,51 (s, 2H); 6,45 (s, 2H); 7,45 (m, 5H); 7,82 (s, 1H).
    • Beispiel 37 N-([2-Amino-6-benzyloxy-purin-9-yl]-actyl)-N-(2-Boc-aminoethyl)-glycin [BocGaeg-OH-Monomer]
  • 2-Amino-6-benzyloxy-9-carboxymethyl-purin (0,50 g; 1,67 mMol), Methyl-N(2-[tertbutoxycarbonylamino]ethyl)-glycinat (0,65 g; 2,80 mMol), Diisopropylethylamin (0,54 g; 4,19 mMol) und Brom-tris-pyrrolidino-phosphonium-hexafluor-phosphat (PyrBroP®) (0,798 g; 1,71 mMol) wurden 4 h in DMF (2 ml) gerührt. Die klare Lösung wurde in eine eisgekühlte Lösung aus Natriumhydrogencarbonat (1 N; 40 ml) gegossen und mit Essigsäureethylester extrahiert (3 · 40 ml). Die organische Schicht wurde mit Kaliumhydrogenphosphatlösung (1 N; 2 · 40 ml), Natriumhydrogencarbonatlösung (1 N; 1 · 40 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung (60 ml) gewaschen. Nach der Trocknung mit wasserfreiem Natriumsulfat und dem Einengen im Vakuum wurde der feste Rückstand aus Essigsäureethylester/Hexan umkristallisiert (20 ml (2 : 1)), und unter Gewinnung des Methylesters in einer Ausbeute von 63% (MS-FAB 514 (M + 1). Die Hydrolyse wurde durch Lösen des Esters in Ethanol/Wasser (30 ml (1 : 2)), das konz. Natriumhydroxid (1 ml) enthielt, vervollständigt. Nach 2stündigem Rühren wurde die Lösung filtriert und durch Zugabe von 4 N Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert. Die Titelverbindung wurde durch Filtration erhalten. Ausbeute: 370 mg (72% für die Hydrolyse). Die Reinheit gemäß HPLC betrug mehr als 99%. Infolge der eingeschränkten Rotation um die sekundäre Amidbindung wurden mehrere der Signale im Verhältnis 2 : 1 verdoppelt (in der Liste gekennzeichnet durch mj. für Hauptpeak und mi. für Nebenpeak). ¹H-NMR (250 MHz; DMSO-d&sub6;): δ = 1,4 ppm (s, 9H); 3,2 (m, 2H); 3,6 (m, 2H); 4,1 (s, mj., CONRCH&sub2;COOH); 4,4 (s, mi., CONRCH&sub2;COOH); 5,0 (s, mi., Gua-CH&sub2;CO-); 5,2 (s, mj., Gua-CH&sub2;CO); 5,6 (s, 2H); 6,5 (s, 2H); 6,9 (m, mi., BocNH); 7,1 (m, mj., BocNH); 7,5 (m, 3H); 7, 8 (s, 1H); 12,8 (s, 1H). ¹³C-NMR: 170,95; 170,52; 167,29; 166,85; 160,03; 159,78; 155,84; 154,87; 140,63; 136,76; 128,49; 128,10; 113,04; 78,19; 77,86; 66,95; 49,22; 47,70; 46,94; 45,96; 43,62; 43,31 und 28,25.
    • Beispiel 38 3-Boc-amino-1,2-propandiol
  • 3-Amino-1,2-propandiol (40,00 g; 0,440 Mol; 1,0 Äquiv.) wurde in Wasser (1000 ml) gelöst und auf 0ºC abgekühlt. Es wurde Di-tert-butyldicarbonat (115,0 g; 0,526 Mol; 1,2 Äquiv.) als eine Portion zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Wasserbad unter Rühren auf Raumtemperatur erwärmt. Der pH-Wert wurde mit einer Lösung aus Natriumhydroxid (17,56 g; 0,440 Mol; 1,0 Äquiv.) in Wasser (120 ml) auf 10,5 gehalten. Nach vollständiger Zugabe des wässrigen Natriumhydroxids wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde dem Reaktionsgemisch Essigsäureethylester (750 ml) zugesetzt, gefolgt von der Abkühlung auf 0ºC. Der pH-Wert wurde unter kräftigen Rühren mit 4 N Schwefelsäure auf 2,5 eingestellt. Die Phasen wurden getrennt und die Wasser-Phase wurde mit zusätzlichem Essigsäureethylester (6 · 350 ml) gewaschen. Das Volumen der organischen Phase wurde durch Einengen unter verringertem Druck auf 900 ml vermindert. Anschließend wurde die organische Phase mit einer gesättigten wässrigen Lösung aus Kaliumhydrogensulfat, die auf das zweifache ihres Volumens verdünnt worden ist (1 · 1000 ml) und mit gesättigtem wässrigem Natriumchlorid (1 · 500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und unter verringertem Druck eingeengt, was 50,12 g (60%) der Titelverbindung lieferte. Das Produkt konnte durch Einengen aus Methylenchlorid und nachfolgendem Einfrieren verfestigt werden. ¹H-NMR (CDCl&sub3;/TMS): δ = 1,43 (s, 9H, Me&sub3;C); 3,25 (m, 2H, CH&sub2;); 3,57 (m, 2H, CH&sub2;); 3,73 (m, 1H, CH). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;/TMS): δ = 28,2 (Me&sub3;C); 42,6 (CH&sub2;); 63,5, 71,1 (CH&sub2;OH, CHOH); 79,5 (Me&sub3;C); 157,0 (C=O).
    • Beispiel 39 2-(Boc-amino)ethyl-L-alaninmethylester
  • 3-Boc-amino-1,2-propandiol (20,76 g; 0,109 Mol; 1 Äquiv.) wurde in Wasser (150 ml) suspendiert. Es wurde Kalium-m-periodat (24,97 g; 0,109 Mol; 1 Äquiv.) zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und die Wasser-Phase wurde mit Chloroform extrahiert (6 · 250 ml). Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und eingeengt, was eine größtenteils quantitative Ausbeute an Boc-aminoacetaldehyd als ein farbloses Öl lieferte, das ohne weitere Reinigung im nachfolgenden Verfahren verwendet wurde.
  • Palladium auf Kohlenstoff (10%; 0,8 g) wurde mit Kühlung (0ºC) unter Stickstoff und kräftigem Rühren MeOH (250 ml) zugesetzt. Es wurden wasserfreies Natriumacetat (4,49 g; 54,7 mMol; 2 Äquiv.) und L-Alaninmethylesterhydrochlorid (3,82 g; 27,4 mMol; 1 Äquiv.) zugesetzt. Boc-aminoacetaldehyd (4,79 g; 30,1 mMol; 1,1 Äquiv.) wurde in MeOH (150 ml) gelöst und dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Atmosphärendruck und bei Raumtemperatur hydriert bis die Wasserstoffaufnahme beendet war. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert und mit zusätzlichem Methanol gewaschen. Das MeOH wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser (150 ml) suspendiert und der pH-Wert wurde durch tropfenweise Zugabe von 0,5 N NaOH unter kräftigem Rühren auf 8,0 eingestellt. Die Wasser-Phase wurde mit Methylenchlorid extrahiert (4 · 250 ml). Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO&sub4;), durch Celit filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt, was 6,36 g (94%) der Titelverbindung als ein klares, leicht gelbliches Öl lieferte. MS (FAB-MS): m/z (%) = 247 (100, M + 1, 191 (90), 147 (18). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl&sub3;): 1,18 (d, J = 7,0 Hz, 3H, Me); 1,36 (s, 9H, Me&sub3;C); 1,89 (b, 1H, NH); 2,51 (m, 1H, CH&sub2;); 2,66 (m, 1H, CH&sub2;); 3,10 (m, 2H, CH&sub2;); 3,27 (q, J = 7,0 Hz, 1H, CH); 3,64 (s, 3H, OMe); 5,06 (b, 1H, Carbamat-NH). ¹³C- NMR: δ = 18,8 (Me); 28,2 (Me&sub3;C); 40,1, 47,0 (CH&sub2;); 51,6 (OMe); 56,0 (CH); 155,8 (Carbamat-C=O); 175,8 (Ester-C=O).
    • Beispiel 40 N-(Boc-aminoethyl)-N-(1-thyminylacetyl)-L-alaninmethylester
  • Einer Lösung aus Boc-aminoethyl-(L)-alaninmethylester (1,23 g; 5,0 mMol) in DMF (10 ml) wurden Dhbt-OH (0,90 g; 5,52 mMol) und 1-Thyminylessigsäure (1,01 g; 5,48 mMol) zugesetzt. Nach Auflösung der 1-Thyminylessigsäure wurde Dichlormethan (10 ml) zugesetzt und die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt. Nachdem die Temperatur des Reaktionsgemisches 0ºC erreicht hatte, wurde DCC (1,24 g; 6,01 mMol) zugesetzt. Innerhalb von 5 min nach der Zugabe war ein DCU-Niederschlag sichtbar. Nach weiteren 5 min wurde das Eisbad entfernt. Zwei Stunden später zeigte die DC-Analyse, daß die Reaktion beendet war. Das Gemisch wurde filtriert und der Niederschlag wurde mit Dichlormethan (100 ml) gewaschen. Die entstehende Lösung wurde zweimal mit 5% Natriumhydrogencarbonat (150 ml) und zweimal mit gesättigtem Kaliumhydrogensulfat (25 ml) in Wasser (100 ml) gewaschen. Nach der abschließenden Extraktion mit gesättigtem Natriumchlorid (150 ml) wurde die Lösung über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt, wodurch ein weißer Schaum entstand. Der Schaum wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel unter Verwendung von Dichlormethan mit einem Methanol-Gradienten als Eluent gereinigt. Dies lieferte eine reine Verbindung (> 99% gemäß HPLC) (1,08 g; 52,4%).
  • FAB-MS: 413 (M + 1) und 431 (M + 1 + Wasser). ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 4,52 (s, 2H, CH'&sub2;); 3,73 (s, 3H, OMe); 3,2-3,6 (m, 4H, Ethyl-CH&sub2;'s); 1,90 (s, 3H, Me in T); 1,49 (d, 3H, Me in Ala, J = 7,3 Hz); 1,44 (s, 9H, Boc).
    • Beispiel 41 N-(Boc-aminoethyl)-N-(1-thyminylacetyl)-L-alanin
  • Der Methylester der Titelverbindung (2,07 g; 5,02 mMol) wurde in Methanol (100 ml) gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Es wurde 2 M Natriumhydroxid (100 ml) zugesetzt. Nach 10minütigem Rühren wurde der pH-Wert des Gemisches mit 4 M Salzsäure auf 3 eingestellt. Die Lösung wurde schrittweise mit Essigsäureethylester extrahiert (3 · 100 ml). Die vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach der Einengung wurde der entstehende Schaum in Essigsäureethylester (400 ml) gelöst und es wurden einige ml Methanol zugegeben, um das feste Material zu lösen. Anschließend wurde Petrolether zugesetzt bis die Fällung begann. Nach Stehen über Nacht bei -20ºC wurde der Niederschlag durch Filtration entfernt. Dies lieferte 1,01 g (50,5%) der reinen Verbindung (> 99% gemäß HPLC). Die Verbindung kann aus 2-Propanol umkristallisiert werden. FAB-MS: 399 (M + 1). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 11,35 (s, 1H, COO); 7,42 (s, 1H, H'&sub6;); 4,69 (s, 2H, CH'&sub2;); 1,83 (s, 3H, Me in T); 1,50-1,40 (m, 12H, Me in Ala + Boc).
    • Beispiel 42 (a) N-(Boc-aminoethyl)-N-(1-thyminylacetyl)-D-alaninmethylester
  • Einer Lösung aus Boc-aminoethylalaninmethylester (2,48 g; 10,1 mMol) in DMF (20 ml) wurden Dhbt-OH (1,80 g; 11,0 mMol) und Thyminylessigsäure (2,14 g; 11,6 mMol) zugesetzt. Nach der Auflösung der Thyminylessigsäure wurde Methylenchlorid (20 ml) zugesetzt und die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt. Als die Temperatur des Reaktionsgemisches 0ºC erreicht hatte, wurde DCC (2,88 g; 14,0 mMol) zugesetzt. Innerhalb von 5 min nach der Zugabe war ein DCU-Niederschlag sichtbar. Nach 35 min wurde das Eisbad entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde 3,5 h später filtriert und der Niederschlag wurde mit Methylenchlorid (200 ml) gewaschen. Die entstehende Lösung wurde zweimal mit 5% Natriumhydrogencarbonat (200 ml) und zweimal mit gesättigtem Kaliumhydrogensulfat in Wasser (100 ml) extrahiert. Nach der abschließenden Extraktion mit gesättigtem Natriumchlorid (250 ml) wurde die Lösung mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt, wobei ein Öl entstand. Das Öl wurde durch eine kurze Silicalgel-Chromatographie-Säule unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Methanol-Gradienten als Eluent gereinigt. Dies lieferte eine Verbindung, die gemäß der HPLC nach der Fällung mit Petrolether eine Reinheit von 96% aufwies (1,05 g; 25,3%). FAB-MS: 413 (M + 1). ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 5,64 (t, 1H, BocNH, J = 5,89 Hz); 4,56 (d, 2H, CH'&sub2;); 4,35 (q, 1H, CH in Ala, J = 7,25 Hz); 3,74 (s, 3H, OMe); 3,64-3,27 (m, 4H, Ethyl-H's); 1,90 (s, 3H, Me in T); 1,52-1,44 (t, 12H, Boc + Me in Ala).
    • (b) N-(Boc-aminoethyl)-N-(1-thyminylacetyl)-D-alanin
  • Der Methylester der Titelverbindung (1,57 g; 3,81 mMol) wurde in Methanol (100 ml) gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Es wurde Natriumhydroxid (100 ml; 2 M) zugesetzt. Nach 10minütigem Rühren wurde der pH-Wert des Gemisches mit 4 M Salzsäure auf 3 eingestellt. Die Lösung wurde anschließend mit Essigsäureethylester extrahiert (3 · 100 ml). Die vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach der Einengung wurde das Öl in Essigsäureethylester (200 ml) gelöst. Es wurde Petrolether zugesetzt bis die Fällung einsetzte (bis zu einem Gesamtvolumen von 600 ml). Nach dem Stehen über Nacht bei -20ºC wurde der Niederschlag durch Filtration entfernt. Dies erbrachte 1,02 g (67,3%) der Titelverbindung, die gemäß der HPLC eine Reinheit von 94% aufwies. FAB-MS: 399 (M + 1). ¹H- NMR: 11,34 (s, 1H, COOH); 7,42 (s, 1H, H'&sub6;); 4,69 (s, 2H, CH'&sub2;); 4,40 (q, 1H, CH in Ala, J = 7,20 Hz); 1,83 (s, 3H, Me in T); 1,52-1,40 (m, 12H, Boc + Me in Ala).
    • Beispiel 43 N-(N'-Boc-3'-aminopropyl)-N-[(1-thyminyl)acetyl]glycinmethylester
  • N-(N'-Boc-3'-aminopropyl)glycinmethylester (2,48 g; 0,0115 Mol) wurde in DMF (35 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von Dhbt-OH (2,07 g; 0,0127 Mol) und 1- Thyminylessigsäure (2,34 g; 0,0127 Mol). Es wurde Methylenchlorid (35 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde in einem Eisbad auf 0ºC abgekühlt. Nach der Zugabe von DCC (2,85 g; 0,0138 Mol) wurde das Gemisch 2 h bei 0ºC gerührt, gefolgt durch 1 h Rühren bei Raumtemperatur. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtration entfernt, mit Methylenchlorid (25 ml) gewaschen und dem Filtrat wurde eine weitere Menge Methylenchlorid (150 ml) zugesetzt. Die organische Phase wurde mit Natriumhydrogencarbonat (1 Volumen gesättigte Lösung, verdünnt mit 1 Volumen Wasser, 6 · 250 ml), Kaliumsulfat (1 Volumen gesättigte Lösung, verdünnt mit 4 Volumen Wasser, 3 · 250 ml) und gesättigtem wässrigem Natriumchlorid (1 · 250 ml) extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wurde in Methylenchlorid (35 ml) suspendiert und 1 h gerührt. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtration entfernt und mit Methylenchlorid (25 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt, wobei die Elution mit einer Mischung aus Methanol und Methylenchlorid erfolgte (Gradient von 3-7% Methanol in Methylenchlorid). Dies erbrachte die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (3,05 g, 64%). Fp. 76-79ºC (zersetzt). Anal, für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub8;N&sub4;O&sub7;, gefunden (ber.) C: 52,03 (52,42); H: 6,90 (6,84); N: 13,21 (13,58). Die Verbindung zeigte entsprechende ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren.
    • Beispiel 44 N-(N'-Boc-3'-aminopropyl)-N-[(1-thyminyl)acetyl]glycin
  • N-(N'-Boc-3'-aminopropyl)-N-[(1-thyminyl)acetyl]glycinmethylester (3,02 g,; 0,00732 Mol) wurde in Methanol (25 ml) gelöst und 1,5 h mit Natriumhydroxid (25 ml) gerührt. Das Methanol wurde durch Einengen im Vakuum entfernt und der pH-Wert wurde bei 0ºC mit 4 M Salzsäure auf 2 eingestellt. Das Produkt wurde durch Filtration als weiße Kristalle isoliert, mit Wasser gewaschen (3 · 10 ml) und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute 2,19 g (75%). Anal, für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub6;N&sub4;O&sub7;, H&sub2;O, gefunden (ber.) C: 49,95 (49,03); H: 6,47 (6,29); N: 13,43 (13,45). Die Verbindung zeigte entsprechende ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren.
    • Beispiel 45 3-(1-Thyminyl)-propansäuremethylester
  • Thymin (14,0 g, 0,11 Mol) wurde in Methanol suspendiert. Gemeinsam mit einer katalytischen Menge an Natriumhydroxid wurde Acrylsäuremethylester (39,6 ml; 0,44 Mol) zugesetzt. Die Lösung wurde im Dunklen 45 h unter Rückfluß erhitzt, im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde unter Erhitzen in Methanol (8 ml) gelöst. Nach der Abkühlung in einem Eisbad wurde das Produkt durch Zugabe von Ether (20 ml) ausgefällt, durch Filtration isoliert, mit Ether gewaschen (3 · 15 ml) und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute 11,23 g (48%). Fp. 112-119ºC. Anal, für C&sub9;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub4; gefunden (ber.) C: 51,14 (50,94); H: 5,78 (5,70); N: 11,52 (13,20). Die Verbindung zeigte entsprechende ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren.
    • Beispiel 46 3-(1-Thyminyl)-propansäure
  • 3-(1-Thyminyl)-propansäuremethylester (1,0 g; 0,0047 Mol) wurde in 2 M Natriumhydroxid (15 ml) suspendiert und 10 min gekocht. Der pH-Wert wurde mit konz. Salzsäure auf 0,3 eingestellt. Die Lösung wurde mit Essigsäureethylester extrahiert (10 · 25 ml). Die organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumchlorid extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, wodurch die Titelverbindung als ein weißer Feststoff entstand (0,66 g, 71%). Fp. 118-121ºC. Anal, für C&sub8;H&sub1;&sub0;N&sub2;O&sub4;, gefunden (ber.) C: 48,38 (48, 49); H: 5,09 (5,09); N: 13,93 (14, 14). Die Verbindung zeigte entsprechende ¹H- und ¹³C-NMR- Spektren.
    • Beispiel 47 N-(N'-Boc-aminoethyl-N-[(1-thyminyl)propanoyl]glycinethylester
  • N-(N'-Boc-aminoethyl)glycinethylester (1,0 g; 0,0041 Mol) wurde in DMF (12 ml) gelöst. Es wurden Dhbt-OH (0,73 g; 0,0045 Mol) und 3-(1-Thyminyl)propansäure (0,89 g; 0,0045 Mol) zugesetzt. Anschließend wurde Methylenchlorid (12 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde in einem Eisbad auf 0ºC abgekühlt. Nach der Zugabe von DCC (1,01 g; 0,0049 Mol), wurde das Gemisch 2 h bei 0ºC gerührt, gefolgt von 1 h Rühren bei Raumtemperatur. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtration entfernt, mit Methylenchlorid (25 ml) gewaschen und dem Filtrat wurde eine weitere Menge an Methylenchlorid (50 ml) zugesetzt. Die organische Phase wurde mit Natriumhydrogencarbonat (1 Volumen gesättigte Lösung, verdünnt mit 1 Volumen Wasser, 6 · 100 ml), Kaliumsulfat (1 Volumen gesättigte Lösung, verdünnt mit 4 Volumen Wasser, 3 · 100 ml) und gesättigtem wässrigem Natriumchlorid (1 · 100 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wurde in Methylenchlorid (15 ml) suspendiert und 1 h gerührt. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtration entfernt und mit Methylenchlorid gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt, wobei die Elution mit einem Gemisch aus Methanol und Methylenchlorid (Gradient von 1 bis 6% Methanol in Methylenchlorid) erfolgte. Dies erbrachte die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (1,02 g, 59%). Anal, für C&sub1;&sub9;H&sub3;&sub0;N&sub4;O&sub7;, gefunden (ber.) C: 53,15 (53,51); H: 6,90 (7,09); N: 12,76 (13,13). Die Verbindung zeigte entsprechende ¹H- und ¹³C-NMR- Spektren.
    • Beispiel 48 N-(N'-Boc-aminoethyl)-N-[(1-thyminyl)propanoyl]glycin
  • N-(N'-Boc-aminoethyl)-N-[(1-thyminyl)propanoyl]glycinethylester (0,83 g; 0,00195 Mol) wurde in Methanol (25 ml) gelöst. Es wurde Natriumhydroxid (25 ml; 2 M) zugesetzt. Die Lösung wurde 1 h gerührt. Das Methanol wurde durch Einengung im Vakuum entfernt und der pH-Wert wurde bei 0ºC mit 4 M Salzsäure auf 2 eingestellt. Das Produkt wurde durch Filtration isoliert, mit Ether gewaschen (3 · 15 ml) und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute 0,769 g (99%). Fp. 213ºC (zersetzt).
    • Beispiel 49 Mono-Boc-ethylendiamin (2)
  • In DMF (50 ml) gelöstes tert-Butyl-4-nitrophenylcarbonat (1) (10,0 g; 0,0418 Mol) wurde über einen Zeitraum von 30 min tropfenweise zu einer Lösung aus Ethylendiamin (27,9 ml; 0,418 Mol) und DMF (50 ml) gegeben und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und das entstehende Öl wurde in Wasser (250 ml) gelöst. Nach der Abkühlung auf 0ºC wurde der pH-Wert bei 0ºC mit 4 M Salzsäure auf 3,5 eingestellt. Die Lösung wurde anschließend filtriert und mit Chloroform extrahiert (3 · 250 ml). Der pH-Wert wurde mit 2 M Natriumhydroxid bei 0ºC auf 12 eingestellt und die wässrige Lösung wurde mit Methylenchlorid extrahiert (3 · 300 ml). Nach der Behandlung mit ges. wässrigem Natriumchlorid (250 ml) wurde die Methylenchlorid-Lösung über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach der Filtration wurde die Lösung im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, wodurch 4,22 g (63%) des Produkts (Öl) entstanden. ¹H-NMR (90 MHz; CDCl&sub3;): δ 1,44 (s, 9H); 2,87 (t, 2H); 3,1 (q, 2H); 5,62 (s, breit).
    • Beispiel 50 (N-Boc-aminoethyl)-β-alaninmethylester, HCl
  • Mono-Boc-ethylendiamin (2) (16,28 g; 0,102 Mol) wurde in Acetonitril (400 ml) gelöst und in die Lösung wurde Acrylsäuremethylester (91,50 g; 1,02 Mol) mit Acetonitril (200 ml) überführt. Die Lösung wurde im Dunklen, um die Polymerisation des Acrylsäuremethylesters zu verhindern, unter Stickstoff über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Nach der Einengung im Vakuum wurde ein Gemisch aus Wasser und Ether (200 ml + 200 ml) zugesetzt und die Lösung wurde filtriert und kräftig gerührt. Die wässrige Phase wurde ein weiteres Mal mit Ether extrahiert und anschließend gefriergetrocknet, was einen gelben Feststoff lieferte. Die Umkristallisation aus Essigsäureethylester lieferte 13,09 g (46%) der Titelverbindung. Fp. 138-140ºC. Anal, für C&sub1;&sub1;H&sub2;&sub3;N&sub2;O&sub4;Cl, gefunden (ber.) C: 46,49 (46,72); H: 8,38 (8,20); N: 9,83 (9,91); Cl: 12,45 (12,54). ¹H-NMR (90 MHz; DMSO-d&sub6;): δ 1,39 (s, 9H); 2,9 (m, 8H); 3,64 (s, 3H).
    • Beispiel 51 N-[(1-Thyminyl)acetyl]-N'-Boc-aminoethyl-β-alaninmethylester
  • (N-Boc-amino-ethyl)-β-alaninmethylester, HCl (3) (2,0 g; 0,0071 Mol) und 1- Thyminylessigsäurepentafluorphenylester (5) (2,828 g; 0,00812 Mol) wurden in DMF (50 ml) gelöst. Es wurde Triethylamin (1,12 ml; 0,00812 Mol) zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Nach der Zugabe von Methylenchlorid (200 ml) wurde die organische Phase mit wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 · 250 ml) und halb-gesättigtem wässrigem Natriumchlorid (250 ml) extrahiert und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Einengung im Vakuum führte zu 2,9 g (99%) Ausbeute (Öl). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl&sub3;): infolge der eingeschränkten Rotation um das sekundäre Amid wurden einige der Signale verdoppelt; δ 1,43 (s, 9H); 1,88 (s, 3H); 2,63 (t, 1H); 2,74 (t, 1H); 3,25-3,55 (4xt, 8H); 3,65 (2xt, 2H); 3,66 (s, 1,5); 3,72 (s, 1,5); 4,61 (s, 1H); 4,72 (s, 2H); 5,59 (s, 0,5H); 5,96 (s, 0,5H); 7,11 (s, 1H); 10,33 (s,1 H).
    • Beispiel 52 N-[(1-Thyminyl)acetyl]-N'-Boc-aminoethyl-β-alanin
  • N-[(1-Thyminyl)acetyl]-N'-Boc-aminoethyl-β-alaninmethylester (3,0 g; 0,0073 Mol) wurde in 2 M Natriumhydroxid (30 ml) gelöst, der pH-Wert wurde mit 4 M Salzsäure bei 0ºC auf 2 eingestellt und die Lösung wurde 2 h gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration isoliert, dreimal mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute 2,23 g (77%). Fp. 170-176ºC. Anal, für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub6;N&sub4;O&sub7;, H&sub2;O, gefunden (ber.) C: 49,49 (49,03); H: 6,31 (6,78); N: 13,84 (13,45). ¹H-NMR (90 MHz; DMSO-d&sub6;): δ 1,38 (s, 9H); 1,76 (s, 3H); 2,44 und 3,29 (m, 8H); 4,55 (s, 2H); 7,3 (s, 1H); 11,23 (s, 1H). FAB-MS: 399 (M + 1).
    • Beispiel 53 N-[(1-(N&sup4;-Z)-Cytosyl)acetyl]-N'-Boc-aminoethyl-β-alaninmethylester
  • (N-Boc-amino-ethyl)-β-alaninmethylester, HCl (3) (2,0 g; 0,0071 Mol) und 1-(N&sup4;- Z)Cytosylessigsäurepentafluorphenylester (5) (3,319 g; 0,0071 Mol) wurden in DMF (50 ml) gelöst. Es wurde Triethylamin (0,99 ml; 0,0071 Mol) zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Nach der Zugabe von Methylenchlorid (200 ml) wurde die organische Phase mit wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 · 250 ml), halb-gesättigtem wässrigem Kaliumhydrogensulfat (3 · 250 ml) und gesättigtem wässrigem Natriumchlorid (250 ml) extrahiert und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Einengung im Vakuum führte zu 3,36 g einer festen Verbindung, die aus Methanol umkristallisiert wurde. Ausbeute 2,42 g (64%). Fp. 158-161ºC. Anal, für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub3;N&sub5;O&sub8;, gefunden (ber.) C: 55,19 (56,49); H: 6,19 (6,26); N: 12,86 (13,18). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl&sub3;): infolge der eingeschränkten Rotation um das sekundäre Amid wurden einige der Signale verdoppelt; δ 1,43 (s, 9H); 2,57 (t, 1H); 3,60-3,23 (m's, 6H); 3,60 (s, 1,5H); 3,66 (s, 1,5H); 4,80 (s, 1H); 4,88 (s, 1H); 5,20 (s, 2H); 7,80-7,25 (m's, 7H). FAB-MS: 532 (M + 1).
    • Beispiel 54 N-[(1-(N&sup4;-Z)-Cytosyl)acetyl]-N'-Boc-aminoethyl-β-alanin
  • N-[(1-(N&sup4;-Z)-Cytosyl)acetyl]-N'-Boc-aminoethyl-β-alaninmethylester (0,621 g; 0,0012 Mol) wurde in 2 M Natriumhydroxid (8,5 ml) gelöst und 2 h gerührt. Nachfolgend wurde der pH-Wert mit 4 M Salzsäure bei 0ºC auf 2 eingestellt und die Lösung wurde 2 h gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration isoliert, dreimal mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute 0,326 g (54%). Der weiße Feststoff wurde aus 2-Propanol umkristallisiert und mit Petrolether gewaschen. Fp. 163ºC (zersetzt). Anal, für C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub1;N&sub5;O&sub8;, gefunden (ber.) C: 49,49 (49,03); H: 6,31 (6,78); N: 13,84 (13,45). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl&sub3;): infolge der eingeschränkten Rotation um das sekundäre Amid wurden einige der Signale verdoppelt; δ 1,40 (s, 9H); 2,57 (t, 1H); 2,65 (t, 1H); 3,60-3,32 (m's, 6H); 4,85 (s, 1H); 4,98 (s, 1H); 5,21 (s, 2H); 5,71 (s, 1H, breit); 7,99-7,25 (m's, 7H). FAB-MS: 518 (M + 1).
    • Beispiel 55 Beispiel eines PNA-Oligomers mit einem Guaninrest (a) Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub5;-[Gaeg]-[Taeg]&sub4;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen enthaltende PNA wurde an einem Boc-Lys(CIZ) modifizierten MBHA-Harz zusammengesetzt, mit einer Substitution von annähernd 0,15 mMol/g (bestimmt durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion). Die Inaktivierung (Verkappung) der nicht-gekuppelten Aminogruppen wurde nur vor dem Einbau des BocGaeg-OH- Monomers durchgeführt.
    • (b) Schrittweise Zusammensetzung von H-[Taeg]&sub5;-[Gaeg]-[Taeg]&sub4;-Lys-NH&sub2; (Syntheseprotokoll)
  • Die Synthese wurde auf 102 mg (Trockengewicht) vorgequollenem (über Nacht in DCM) und neutralisiertem Boc-Lys(CIZ)-MBHA-Harz initiiert. Die Schritte wurden wie folgt ausgeführt: (1) Abspaltung der Boc-Schutzgruppen mit TFA/DCM (1 : 1, v/v), 1 · 2 min und 1 · 1/2 h, 3 ml; (2) Waschen mit DCM, 4 · 20 s, 3 ml; Waschen mit DMF, 2 · 20 s, 3 ml; Waschen mit DCM, 2 · 20 s, 3 ml und 30 s Abtropfen; (3) Neutralisation mit DIEA/DCM (1 : 19, v/v), 2 · 3 min. 3 ml; (4) Waschen mit DCM, 4 · 20 s, 3 ml und 1 min Abtropfen; (5) Zugabe von 4 Äquiv. Diisopropylcarbodiimid (0,06 mMol; 9,7 ul) und 4 Äquiv. (0,06 mMol; 24 mg) BocTaeg-OH oder (0,06 mMol; 30 mg) BocGaeg- OH, gelöst in 0,6 ml DCM/DMF (1 : 1, v/v) (Endkonzentration des Monomers 0,1 M), die Kupplungsreaktion konnte durch 1/2stündiges Schütteln bei Raumtemperatur ablaufen; (6) 20 s Abtropfen; (7) Waschen mit DMF, 2 · 20 s und 1 · 2 min. 3 ml; Waschen mit DCM 4 · 20 s, 3 ml; (8) Neutralisation mit DIEA/DCM (1 : 19, v/v), 2 · 3 min, 3 ml; (9) Waschen mit DCM 4 · 20 s, 3 ml und 1 min Abtropfen; (10) qualitativer Kaiser-Test; (11) Abblocken der nicht-umgesetzten Aminogruppen durch Acetylierung mit Ac&sub2;O/Pyridin/DCM (1 : 1 : 2, v/v/v), 1 · ¹/&sub2; h, 3 ml; und (12) Waschen mit DCM, 4 · 20 s, 2 · 2 min und 2 · 20 s, 3 ml. Die Schritte 1-12 wurden wiederholt bis die erwünschte Sequenz erhalten wurde. Alle quantitativen Kaiser-Tests waren negativ (strohgelbe Farbe ohne Anfärbung der Kügelchen), was darauf hinweist, daß die Kupplungsausbeute nahezu 100% betrug. Das PNA-Oligomer wurde durch Standardverfahren gespalten und gereinigt. FAB-MS: 2832,11 [M* + 1] (ber. 2832,15).
    • Beispiel 56 Festphasen-Synthese von H-Taeg-Aaeg-[Taeg]&sub8;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweise Zusammensetzung von Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)- MBHA-Harz
  • Etwa 0,3 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 3 ml SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch in situ DCC-Kupplung (einzel) des A(Z)aeg-Restes unter Verwendung von 0,19 M BocA(Z)aeg-OH, gemeinsam mit 0,15 M DCC in 2,5 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; und einer Einzel-Kupplung mit 0,15 M BocTaeg-OPfp in unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt ("Syntheseprotokoll 5"). Die Synthese wurde durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion verfolgt, welche einen etwa 50%igen Einbau an A(Z)aeg und einen etwa 96%igen Einbau an Taeg zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Taeg-Aaeg-[Taeg]&sub8;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-BHA-Harz wurde, wie in Beispiel 40c beschrieben, behandelt und lieferte durch die HF- Spaltung von 53,1 mg trockenem H-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-BHA-Harz etwa 15,6 mg an Rohmaterial. Der Hauptpeak bei 14,4 min entsprach weniger als 50% der Gesamtabsorption. Eine Menge von 0,5 mg des Rohprodukts wurde gereinigt und es entstanden annähernd 0,1 mg an H-Taeg-Aaeg-[Taeg]&sub8;-Lys-NH&sub2;. Für (MH+)&spplus; betrug der berechnete m/z-Wert 2816,16 und der gemessene m/z-Wert betrug 2816,28.
    • (c) Syntheseprotokoll 5
  • (1) Abspaltung der Boc-Schutzgruppen mit TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1, v/v), 2,5 ml, 3 · 1 min und 1 · 30 min. (2) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 2,5 ml, 6 · 1 min. (3) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 2,5 ml, 3 · 2 min. (4) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 2,5 ml, 6 · 1 min und 1 min Abtropfen; (5) 2-5 mg Probe des PNA-Harzes wurden entnommen und sorgfältig für eine quantitative Ninhydrin-Analyse getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Zugabe von in 1,25 ml DMF gelösten 0,47 mMol (0,25 g) BocA(Z)aeg-OH, gefolgt von der Zugabe von 0,47 mMol (0,1 g) DCC in 1,25 ml CH&sub2;Cl&sub2; oder 0,36 mMol (0,20 g) BocTaeg-OPfp in 2,5 ml CH&sub2;Cl&sub2;; die Kupplungsreaktion erfolgte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h; (7) Waschen mit DMF, 2,5 ml, 1 · 2 min. (8) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 2,5 ml, 4 · 1 min. (9) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 2,5 ml, 2 · 2 min. (10) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 2,5 ml, 6 · 1 min. (11) 2-5 mg Probe des Schutzgruppen-enthaltenden PNA-Harzes wurden entnommen und sorgfältig für die quantitative Ninhydrin-Analyse getrocknet, um das Ausmaß der Kupplung zu bestimmen; (12) Abblocken der nicht-umgesetzten Aminogruppen durch 2stündige (ausgenommen des letzten Zyklus) Acetylierung mit 25 ml eines Gemisches aus Essigsäureanhydrid/Pyridin/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1 : 2, v/v/v); und (13) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 2,5 ml, 6 · 1 min. (14) 2 · 2-5 mg Proben des Schutzgruppen- enthaltenden PNA-Harzes wurden entnommen und für die Ninhydrin-Analysen mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v) neutralisiert und mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen.
    • Beispiel 57 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub2;-Aaeg-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweise Zusammensetzung von Boc-[Taeg]&sub2;-A(Z)aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)- MBHA-Harz
  • Etwa 0,5 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub2;-A(Z)aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch in situ DCC-Kupplung von sowohl des A(Z)aeg- und des Taeg-Restes unter Verwendung von 0,15 M bis 0,2 M an Schutzgruppen-enthaltendem PNA-Monomer (freie Säure), gemeinsam mit einer äquivalenten Menge an DCC in 2 ml unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2;, zusammengesetzt ("Syntheseprotokoll 6"). Die Synthese wurde durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion verfolgt, welche nach dreimaliger Kupplung insgesamt einen etwa 82%igen Einbau an A(Z)aeg (die erste Kupplung lieferte einen etwa 50%igen Einbau; eine vierte HOBt-vermittelte Kupplung in 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; erhöhte die Gesamt-Kupplung nicht wesentlich) und einen quantitativen Einbau (Einzel-Kupplungen) des Taeg-Restes zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub2;-Aaeg-[Taeg]&sub5;-Lys- NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub2;-A(Z)aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-BHA-Harz wurde, wie in Beispiel 40c beschrieben, behandelt und lieferte durch die HF- Spaltung von 102,5 mg trockenen H-[Taeg]&sub2;-A(Z)aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-BHA-Harz etwa 16,2 mg an Rohmaterial. Eine kleine Menge des Rohprodukts wurde gereinigt. Für (MH+)&spplus; betrug der berechnete m/z-Wert 2050,85 und der gemessene m/z-Wert betrug 2050,90.
    • (c) Syntheseprotokoll 6
  • (1) Abspaltung der Boc-Schutzgruppen mit TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1, v/v), 2 ml, 3 · 1 min und 1 · 30 min. (2) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 2 ml, 6 · 1 min. (3) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 2 ml, 3 · 2 min. (4) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 2 ml, 6 · 1 min und 1 min Abtropfen; (5) 2-5 mg Probe des PNA-Harzes wurden entnommen und sorgfältig für eine quantitative N in hydrin-Analyse getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Zugabe von in 1,5 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelösten 0,44 mMol (0,23 g) BocA(Z)aeg-OH, gefolgt von der Zugabe von 0,44 mMol (0,09 g) DCC in 0,5 ml CH&sub2;Cl&sub2; oder 0,33 mMol (0,13 g) BocTaeg-OH in 1,5 ml CH&sub2;Cl&sub2;, gefolgt von der Zugabe von 0,33 mMol (0,07 g) DCC in 0,5 ml CH&sub2;Cl&sub2;; die Kupplungsreaktion erfolgte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h; (7) Waschen mit DMF, 2 ml, 1 · 2 min. (8) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 2 ml, 4 · 1 min. (9) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 2 ml, 2 · 2 min. (10) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 2 ml, 6 · 1 min. (11) 2-5 mg Probe des Schutzgruppen-enthaltenden PNA-Harzes wurden entnommen und sorgfältig für eine quantitative Ninhydrin-Analyse getrocknet, um das Ausmaß der Kupplung zu bestimmen; (12) Abblocken der nicht-umgesetzten Aminogruppen durch 2stündige (ausgenommen des letzten Zyklus) Acetylierung mit 25 ml eines Gemisches aus Essigsäureanhydrid/Pyridin/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1 : 2, v/v/v); (13) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 2 ml, 6 · 1 min. und (14) 2 · 2-5 mg Proben des Schutzgruppen-enthaltenden PNA-Harzes wurden entnommen und für die Ninhydrin-Analysen mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v) neutralisiert und mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen.
    • Beispiel 58
  • Das PNA-Oligomer H-T&sub4;C&sub2;TCT-LysNH&sub2; wurde, wie in Beispiel 93 beschrieben, hergestellt. Die Hybridisierungsversuche mit dieser Sequenz sollten das Problem der Orientierung lösen, ob diese tatsächlich asymmetrisch ist. Derartige Versuche sollten auch die Probleme der pH-Abhängigkeit der Tm-Werte und die Stöchiometrie der gebildeten Komplexe lösen.
  • Die Hybridisierungsversuche mit dem PNA-Oligomer T&sub4;C&sub2;TCTC-LysNH&sub2; wurden wie folgt durchgeführt:
  • § = Stöchiometrie, bestimmt durch UV-Mischkurven
  • - = nicht bestimmt
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß eine tatsächlich gemischte Sequenz zu gut definierten Schmelzkurven führt. Die PNA-Oligomere können tatsächlich in beiden Orientierungen binden (vergleiche Reihe 1 und 4), obwohl es eine Bevorzugung für die N- terminale/5'-Orientierung gibt. Die Einführung eines einzelnen nicht-Treffers gegenüber entweder T oder C bewirkte eine Verringerung des Tm-Werts um mehr als 16ºC bei einem pH-Wert von 7,2; bei einem pH-Wert von 5,0 wurde der Tm-Wert um mehr als 27ºC verringert. Dies zeigt, daß es einen sehr hohen Grad einer Sequenz- Selektivität gibt, die ein allgemeines Merkmal aller PNA C/T-Sequenzen sein sollte.
  • Wie vorstehend ausgewiesen, gibt es eine sehr starke pH-Abhängigkeit der Tm- Werte, die darauf hinweist, daß, die Hoogsteen-Basenpaarung für die Bildung der Hybride wichtig ist. Es ist daher nicht überraschend, daß festgestellt wurde, daß die Stöchiometrie 2 : 1 beträgt.
  • Das Fehlen der Symmetrie in der Sequenz und die sehr große Verringerung der Tm- Werte bei Vorhandensein von nicht-Treffern zeigt, daß der Watson-Crick-Strang und der Hoogsteen-Strang zueinander parallel sind, wenn sie an komplementäre DNA gebunden sind. Dies gilt für beide Orientierungen, d.h. für die 5'/N-terminale und die 3'/N-terminale Orientierung.
    • Beispiel 59
  • Die Ergebnisse der Hybridisierungsversuche mit H-T&sub5;GT&sub4;-LysNH&sub2; wurden wie folgt durchgeführt:
  • Wie der Vergleich der Reihen 1, 3 und 6 mit den Reihen 2, 4, 5 und 7 zeigt, kann G auf diesem Weg zwischen C/A und G/T im DNA-Strang unterscheiden, d.h. eine Sequenzunterscheidung wird beobachtet. Es wurde des weiteren nachgewiesen, daß der Komplex in Reihe 3 2 PNA ist: 1 DNA-Komplex durch UV-Mischkurven.
    • Beispiel 60
  • Die Massen einiger synthetisierter PNA-Oligomere, die durch FAB-Massenspektrometrie bestimmt wurden, sind wie folgt:
    • Beispiel 61
  • Die Hybridisierungsdaten für ein PNA-Oligomer mit einer Einzeleinheit mit einem ausgedehnten Gerüst (die β-Alanin-Modifikation) sind wie folgt:
  • Obwohl die Schmelztemperatur sinkt, veranschaulichen die Daten, daß die basenspezifische Erkennung beibehalten wird.
    • Beispiel 62
  • Ein Beispiel mit einer "nicht Basen" Substitution.
  • d.h. L = H
    • Beispiel 63 Iodierungsverfahren
  • Eine Menge von 5 ug des Tyr-PNA-T&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; wird in 40 ul 100 mM Na-Phosphat pH 7,0 gelöst und es werden 1 mCi Na ¹²&sup5;I und 2 ul Chloramin-T (50 mM in CH&sub3;CN) zugesetzt. Die Lösung wird 10 min bei 20ºC stehen lassen und anschließend durch eine 0,5 + 5 cm Sephadex G10 Säule gegeben. Die ersten zwei Radioaktivität enthaltenden Fraktionen (jeweils 100 ul) wurden gesammelt und durch HPLC gereinigt: C-18 Umkehrphase unter Verwendung eines 0-60% CH&sub3;CN-Gradienten in 0,1% CF&sub3;COOH in H&sub2;O. Die ¹²&sup5;I-PNA eluiert rechts nach dem PNA-Peak. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt.
    • Beispiel 64 Bindung der PNAs-T&sub1;&sub0;/T&sub9;C/T&sub8;C&sub2; an doppelsträngige A&sub1;&sub0;/A&sub9;G/A&sub8;G&sub2;-DNA-Ziele (Fig. 20)
  • Ein Gemisch aus 200 cps ³²P-markiertem EcoRI-Pvull-Fragment (das große, am 3'- Ende der EcoRI-Stelle markierte Fragment) des bezeichneten Plasmids, 0,5 ug Kalbsthymus-DNA als Träger und 300 ng PNA in 100 ul Puffer (200 mM NaCl, 50 mM Na-Acetat, pH 4,5, 1 mM ZnSO&sub4;) wurde 120 min bei 37ºC inkubiert. Eine Menge von 50 Einheiten an S&sub1;-Nuklease wurde zugesetzt und 5 min bei 20ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3 ul 0,5 M EDTA gestoppt und die DNA wurde durch Zugabe von 250 ul 2% Kaliumacetat in Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde durch Elektrophorese in 10% Polyacrylamid-Sequenziergelen analysiert und die radioaktiv markierten DNA-Banden wurde durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • Die Ziel-Plasmide wurden durch Klonierung geeigneter Oligonukleotide in pUC19 hergestellt. A&sub1;&sub0;-Ziel: Oligonukleotide GATCCA&sub1;&sub0;G & GATCCT&sub1;&sub0;G, kloniert in die BamHI-Stelle (Plasmid, bezeichnet als pT10). A&sub5;GA&sub4;-Ziel: Oligonukleotide TCGACT&sub4;CT&sub5;G & TCGACA&sub5;GA&sub4;G, kloniert in die Sall-Stelle (Plasmid pT9C). A&sub2;GA&sub2;GA&sub4;-Ziel: Oligonukleotide GA&sub2;GA&sub2;GA&sub4;TGCA & GT&sub4;CT&sub2;CT&sub2;CTGCA, in die PstI-Stelle (Plasmid pT8C2). Die Positionen der Ziele im Gel sind durch Pfeile an der linken Seite gekennzeichnet. A/G ist eine A + G-Sequenzleiter des P10-Ziels.
    • Beispiel 65 Inhibierung der Spaltung von PNA durch Restriktionsenzyme (Fig. 23)
  • Eine Menge von 2 ug des Plasmids pT10 wurde mit der gekennzeichneten Menge an PNA-T&sub1;&sub0; in 20 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7,4) gemischt und 120 min bei 37ºC inkubiert. 2 ul 10 · Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM DTT). Es wurden Pvull (2 Einheiten) und BamHI (2 Einheiten) zugesetzt und die Inkubation wurde weitere 60 min fortgesetzt. Die DNA wurde durch Gelelektrophorese in 5% Polyacrylamid analysiert und die DNA wurde durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht.
    • Beispiel 66 Kinetik der PNA-T&sub1;&sub0;-dsDNA-Strangverdrängungs-Komplexbildung (Fig. 21)
  • Ein Gemisch aus 200 cps ³²P-markiertem EcoRI-Pvull-Fragment von pT10 (das große, am 3'-Ende der EcoRI-Stelle markierte Fragment), 0,5 g Kalbsthymus-DNA als Träger und 300 ng PNA-T&sub1;&sub0;-LysNH&sub2; in 100 ul Puffer (200 mM NaCl, 50 mM Na- Acetat, pH 4,5, 1 mM ZnSO&sub4;) wurde bei 37ºC inkubiert. Zu den gekennzeichneten Zeiten wurden jeder der 7 Proben 50 U S&sub1;-Nuklease zugesetzt und die Inkubation erfolgte für weitere 5 min bei 20ºC. Anschließend wurde die DNA durch Zugabe von 250 ul 2% K-Acetat in Ethanol ausgefällt und durch Elektrophorese in einem 10% Polyacrylamid-Sequenziergel analysiert. Die Menge an Strangverdrängungs- Komplex wurde aus der Intensität der S&sub1;Spaltung an der Zielsequenz bestimmt, die durch densitometrische Auswertung der Autoradiographien gemessen wurde.
    • Beispiel 67 Stabilität der PNA-dsDNA-Komplexe (Fig. 22)
  • Ein Gemisch aus 200 cps ³²P-pT10-Fragment, 0,5 ug Kalbsthymus-DNA und 300 ng der erwünschten PNA (entweder T&sub1;&sub0;-LysNH&sub2;, T&sub8;-LysNH&sub2; oder T&sub6;-LysNH&sub2;) wurde 60 min bei 37ºC in 100 ul 200 mM NaCl, 50 mM Na-Acetat, pH 4,5, 1 mM ZnSO&sub4; inkubiert. Es wurde eine Menge von 2 ug des Oligonukleotids GATCCA&sub1;&sub0;G zugesetzt und jede Probe wurde 10 min bei der angezeigten Temperatur erhitzt, 10 min auf Eis abgekühlt und auf 20ºC erwärmt. Eine Menge von 50 U an S&sub1;-Nuklease wurde zugesetzt und die Proben wurden behandelt und analysiert und die Ergebnisse wurden quantifiziert.
    • Beispiel 68 Inhibierung der Transkription durch PNA
  • Ein Gemisch aus 100 ng Plasmid-DNA (gespalten mit dem Restriktionsenzym Pvull (siehe nachstehend)) und 100 ng PNA in 15 ul 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 wurde 60 min bei 37ºC inkubiert. Nachfolgend wurden 4 ul 5 · konzentrierter Puffer (0,2 M Tris-HCl (pH 8,0), 40 mM MgCl&sub2;, 10 mM Spermidin, 125 mM NaCl) mit 1 ul NTP-Mix (10 mM ATP, 10 mM CTP, 10 mM GTP, 10 mM UTP, 0,1 uCi/ml ³²P-UTP, 5 mM DTT, 2 ug/ml tRNA, 1 ug/ml Heparin) und 3 Einheiten RNA-Polymerase gemischt. Die Inkubation wurde 10 min bei 37ºC fortgesetzt. Anschließend wurde die RNA durch Zugabe von 60 ul 2% Kaliumacetat in 96% Ethanol bei -20ºC ausgefällt und durch Elektrophorese in 8% Polyacrylamid-Sequenziergelen analysiert. Die RNA-Transkripte wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die nachfolgenden Plasmide wurden verwendet: pT8C2-KS/pA8G2-KS: Oligonukleotide GA&sub2;GA&sub2;GA&sub4;GTGAC & GT&sub4;CT&sub2;CT&sub2;CTGCA, Moniert in die PstI-Stelle von Bluescipt- KS&spplus;; pT10-KS/pA10-KS (es wurden beide Orientierungen des Inserts erhalten). PT10UV5: Oligonukleotide GATCCA&sub1;&sub0;G & GATCCT&sub1;&sub0;G, kloniert in die BamHI-Stelle eines pUC18-Derivats, in welches der lac UV5 E.coli-Promotor in die EcoRI-Stelle kloniert worden ist (Jeppesen, et al., Nucleic Res., 1988, 16, 9545).
  • Durch Verwendung von T&sub3;-RNA-Polymerase wurde mit PNA-T&sub8;C&sub2;-LysNH&sub2; und dem pA8G2-KS-Plasmid, welches die PNA-Erkennungssequenz auf dem Templat-Strang besitzt, eine Transkriptionsverlängerung erhalten, jedoch nicht mit dem pT8C2-KS, welches die PNA-Erkennungssequenz auf dem nicht-Templat-Strang besitzt. Ähnliche Ergebnisse wurden mit PNA-T10-LysNH&sub2; und den Plasmiden pA10-KS und pT10-KS erhalten (siehe Fig. 25). Unter Verwendung von E.coli RNA-Polymerase und dem pT10UV5-Plasmid (A&sub1;&sub0;-Sequenz auf dem Templat-Strang) wurde die Transkriptionsverlängerungsfestsetzung mit PNA-T&sub1;&sub0;-LysNH&sub2; erhalten.
    • Beispiel 69 Biologische Stabilität von PNA
  • Ein Gemisch aus PNA-T&sub5; (10 ug) und einem "normalen" Peptid (10 ug) als Kontrolle in 40 ul 50 mM Tris-HCl pH 7,4 wurde 10 min bei 37ºC mit verschiedenen Mengen an Peptidase aus Schweinedarmmucosa oder an Protease aus Streptomyces caespitosus behandelt. Die Menge an PNA und Peptid wurde durch HPLC-Analyse bestimmt (C-18 Umkehrphasen-Säule: 0-60% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure).
  • Bei Peptidase/Protease-Konzentrationen, bei denen ein vollständiger Abbau des Peptids beobachtet wurde (kein HPLC-Peak), war das PNA noch intakt.
    • Beispiel 70 Inhibierung der Genexpression
  • Ein bevorzugtes Assay, um die Fähigkeit der Peptidnukleinsäuren zu testen, die Expression der E2-RNA des Papillomavirus zu inhibieren, basiert auf den gut beschriebenen Transaktivierungseigenschaften von E2. Spaltholtz, et al., J. Virol., 1987, 61, 2128-2137. Um das E2-Ansprechelement zu enthalten, wurde ein Reporter-Plasmid (E2RECAT) konstruiert, welches als ein E2-abhängiger Beschleuniger funktioniert. E2RECAT enthält auch den frühen SV40-Promotor, ein frühes Polyadenylierungssignal, und das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen (CAT). Im Zusammenhang mit diesem Plasmid ist die CAT-Expression von der E2-Expression abhängig. Die Abhängigkeit der CAT-Expression von der Anwesenheit an E2 wurde durch die Transfektion dieses Plasmids in mit BPV-1 transformierten C127-Zellen, in nichtinfizierte C127-Zellen und in mit E2RECAT cotransfizierten C127-Zellen und einem E2-Expressionsvektor getestet.
    • A. Inhibierung der BPV-1 Expression
  • BPV-1 transformierte C127-Zellen wurden in 12-Well-Platten ausgesät. Vierundzwanzig Stunden vor der Transfektion mit E2RE1 wurden die Zellen durch Zugabe von Antisense-PNAs zu dem Wachstumsmedium bis zu einer Endkonzentration von 5, 15 und 30 mM vorbehandelt. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit 10 ug an E2RE1CAT durch Kaliumphosphat-Fällung transfiziert. Zehn Mikrogramm an E2RE1CAT und 10 ug an Träger-DNA (PUC 19) wurden mit 62 ul 2 M CaCl&sub2; in einem Endvolumen von 250 ul H&sub2;O gemischt, nachfolgend wurden 250 ul 2 · HBSP (1,5 mM Na&sub2;PO&sub2;, 10 mM KCl, 280 mM NaCl, 12 mM Glucose und 50 mM HEPES, pH 7,0) zugesetzt und das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Jedem Test-Well wurden einhundert Mikroliter dieser Lösung zugesetzt und 4 h bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen 1 min bei Raumtemperatur mit 15% Glycerin in 0,75 mM Na&sub2;PO&sub2;, 5 mM KCl, 140 mM NaCl, 6 mM Glucose und 25 mM HEPES, pH 7,0 Glycerin-geschockt. Nach dem Schocken wurden die Zellen zweimal mit serumfreien DMEM gewaschen und erneut mit DMEM, welches 10% fötales Kälberserum und Antisense-Oligonukleotid in der Ausgangskonzentration enthielt, kultiviert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und auf CAT-Aktivität geprüft.
  • Zur Bestimmung der CAT-Aktivität wurden die Zellen zweimal mit phospatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und durch Abkratzen gesammelt. Die Zellen wurden in 100 ul 250 mM Tris-HCl pH 8 resuspendiert und durch 3maliges Einfrieren-Auftauen gespalten. Für jedes Assay wurden vierundzwanzig Milliliter des Zellextrakts verwendet. Für jedes Assay wurde das nachfolgende in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gemischt und eine Stunde bei 37ºC inkubiert: 25 ul des Zellextrakts, 5 ul 4 mM Acetyl-Coenzym A, 18 ul H&sub2;O und 1 ul ¹&sup4;C-Chloramphenicol, 40-60 mCi/mM. Nach der Inkubation wird Chloramphenicol (die acetylierten und nicht-acetylierten Formen) mit Essigsäureethylester extrahiert und bis zur Trockne eingeengt. Die Proben wurden in 25 ul Essigsäureethylester resuspendiert, auf eine DC-Platte getropft und in Chloroform : Methanol (19 : 1) chromatographiert. Die Chromatogramme wurden durch Autoradiographie analysiert. Die dem acetylierten und nicht-acetylierten ¹&sup4;C- Chlormaphenicol entsprechenden Flecken wurden von der DC-Platte entnommen und für die Quantifizierung der CAT-Aktivität durch Flüssigszintillation gezählt. Die Peptidnukleinsäuren, die die CAT-Aktivität in dosisabhängiger Weise unterdrücken, werden als positiv angesehen.
    • B. Inhibierung der HPV E2 Expression
  • Das Assay zur Inhibierung des humanen Papillomavirus (HPV) E2 durch Peptidnukleinsäuren ist im wesentlichen das gleiche wie für BPV-1 E2. Für die HPV-Assays geeignete HPVs wurden entweder in CV-1- oder in A431-Zellen mit PSV2NEO, unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Calziumphosphat-Verfahrens transfiziert. Die Zellen, die DNA aufnehmen, werden für die Kultivierung in das Antibiotikum G418 enthaltendem Medium selektiert. G418-resistente Zellen werden dann auf HPV-DNA und -RNA analysiert. Die E2 exprimierenden Zellen werden als Zielzellen für die Antisense-Studien verwendet. Für jedes PNA werden die Zellen wie vorstehend genannt vorbehandelt, mit E2RE1CAT transfiziert und wie vorstehend genannt auf CAT-Aktivität analysiert. Die Peptidnukleinsäuren werden als eine positive Wirkung aufweisend angesehen, wenn sie die CAT-Aktivität in dosisabhängiger Weise unterdrücken.
    • Beispiel 71 Synthese von PNA 15-mer mit vier natürlich vorkommenden Nukleobasen; H- [Taeg]-[Aaeg]-[Gaeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Aaeg]-[Taeg]-[Caeg]-[Taeg]-[Caeg]-[Taeg]- [Aaeg]-[Taeg]-[Caeg]-[Taeg]-Lys-NH&sub2;
  • Die Schutzgruppen-enthaltende PNA wurde auf einem Boc-Lys(CIZ) modifizierten MBHA-Harz zusammengesetzt, mit einer Substitution von annähernd 0,145 mMol/g. Die Inaktivierung der nicht-gekuppelten Aminogruppen wurde nur vor dem Einbau des BocGaeg-OH-Monomers durchgeführt.
  • Die Synthese wurde auf 100 mg (Trockengewicht) neutralisiertem Boc-Lys(CIZ)- MBHA-Harz, das über Nacht in DCM vorgequollenen worden ist, initiiert. Der Einbau der Monomere folgte dem Protokoll des Beispiels 32, ausgenommen bei dem Schritt zum Einbau des BocAaeg-OH-Monomers. Für die vorliegende Synthese beinhaltet Schritt S die Zugabe von 4 Äquiv. Diisopropylcarbodiimid (0,06 mMol; 9,7 ul) und 4 Äquiv. BocAaeg-OH (0,06 mMol; 32 mg), die in 0,6 ml DCM/DMF (1 : 1, v/v) gelöst waren (Endkonzentration an Monomer 0,1 M). Die Kupplungsreaktion konnte 1 · 15 min und 1 · 60 min (Rekupplung) ablaufen.
  • Alle qualitativen Kaiser-Tests waren negativ (strohgelbe Farbe ohne Anfärbung der Kügelchen). Das PNA-Oligomer wurde entsprechend dem Standardverfahren gespalten und gereinigt. Mittlere FAB-MS Masse, gefunden (ber.) (M + H) 4145,1 (4146,1). Beispiel 72 Hybridisierung von H-TAGTTATCTCTATCT-LysNH&sub2;
  • Die Tatsache, daß es fast keinen Abfall im Tm-Wert während des pH-Wert-Verlaufs von 7,2 bis 9 gibt, weist darauf hin, daß die Hoogsteen-Basenpaarung nicht einbezogen ist. Der Anstieg im Tm-Wert während des pH-Wert-Verlaufs von 7,2 bis 5 ist für die parallele Orientierung groß und ist wahrscheinlich auf die Bildung eines 2 : 1 Komplexes zurückzuführen. Man nimmt an, daß die am meisten bevorzugte Orientierung in der Watson-Crick-Bindungseinheit die 3'/N-Orientierung ist und daß in der Hoogsteen-Einheit die 5'/N-Orientierung die stabilste ist. Es kann somit möglich sein, daß der stabilste Komplex der ist, in dem die zwei PNA-Stränge anti-parallel zueinander sind.
  • Es gibt anscheinend eine sehr starke Bevorzugung der parallelen Orientierung im Hoogsteen-Strang. Dies scheint zu erklären, warum sogar bei einem pH-Wert von 9 ein 2 : 1 Komplex mit der 5'/N-Orientierung beobachtet wurde. Des weiteren erklärt es den geringen Verlust während des pH-Wert-Verlaufs von 7,2 bis 9 im 3'/N, da es sich hierbei wahrscheinlich um einen 1 : 1 Komplex handelt.
    • Beispiel 73 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub2;-Aaeg-Taeg-Caeg-Aaeg-Taeg-Caeg-Taeg- Caeg-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweise Zusammensetzung von Boc-[Taeg]&sub2;-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg- A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 1 g feuchtes Boc-Lys(CIZ)-MBHA-Harz (0,28 mMol Lys/g) wurde in ein 5 ml- SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub2;-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-A(Z)aeg-Taeg- C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch in situ DCC-Kupplung der ersten fünf Reste unter Verwendung von 0,16 M BocC(Z)-OH, BocTaeg-OH oder BocA(Z)aeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9") und durch analoge in situ DIC-Kupplung der letzten fünf Reste ("Syntheseprotokoll 10") zusammengesetzt. Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion verfolgt, welche einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte, mit Ausnahme des ersten A(Z)aeg-Restes, der zweimal gekuppelt werden muß. Die Gesamt-Kupplungs-Ausbeute betrug etwa 96% (erste Kupplung, etwa 89% Wirksamkeit).
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub2;-Aaeg-Taeg-Caeg- Aaeg-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub2;-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-A(Z)aeg-Taeg- C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte durch die HF-Spaltung von etwa 166,1 mg trockenem Boc-[Taeg]&sub2;-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(CIZ)- BHA-Harz etwa 53,4 mg an ungereinigtem Material. Das Rohprodukt (53,4 mg) wurde gereinigt und es entstanden 18,3 mg H-[Taeg]&sub2;-Aaeg-Taeg-Caeg-Aaeg-Taeg- Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)&spplus;, berechneter m/z Wert = 2780,17 und der gemessene m/z-Wert = 2780,07.
    • Beispiel 74 Hybridisierungseigenschaften von H-TTA TCA TCT C-Lys-NH&sub2;
  • Die Titelverbindung wurde mit den nachfolgenden Oligonukleotiden hybridisiert:
  • *geringe Hypochromie Beispiel 75 Synthese einer PNA mit zwei parallelen, miteinander verbundenen Fäden
  • Eine Menge von 375 mg an MBHA-Harz (Beladung 0,6 mMol/g) konnte über Nacht in Dichlormethan (DCM) quellen. Nach einer Stunde in DMF/DCM wurde das Harz durch zweimaliges Waschen mit 5% Diisopropylethylendiamin in DCM (2 min), gefolgt von Waschen mit DCM (2 ml; 6 · 1 min) neutralisiert. In 2 ml DMF gelöstes N,N'-Boc-aminoethyl-glycin (41,9 mg; 0,132 mMol) wurde dem Harz zugesetzt, gefolgt von in 1 ml DCM gelöstem DCC (64,9 mg; 0,315 mMol). Nach 2,5 h wurde das Harz dreimal mit DMF (1 min) und einmal mit DCM (1 min) gewaschen. Anschließend wurden die nicht-umgesetzten Aminogruppen durch 72stündige Behandlung mit Essigsäureanhydrid/DCM/Pyridin (1 ml/2 ml/2 ml) inaktiviert. Nach dem Waschen mit DCM (2 ml; 4 · 1 min) zeigte ein Kaiser-Test, daß keine Aminogruppen mehr vorhanden waren. Die Schutzgruppen wurden von dem Harz entfernt und es wurde wie vorstehend beschrieben gewaschen. Dem folgte die Reaktion mit in DMF/DCM 1 : 1 (4 ml) gelöstem 6-(Bocamino)-hexansäure-DHBT-ester (255,8 mg; 67 mMol) über Nacht. Nach dem Waschen und der Neutralisation wurden ein Kaiser- Test und ein Isatin-Test durchgeführt. Beide waren negativ. Nach der Inaktivierung wurde die Verlängerung der PNA-Ketten gemäß den Standardverfahren für DCC- Kupplungen durchgeführt. Alle nach den Kupplungsreaktionen durchgeführten Kaiser-Tests waren negativ (Gelb). Nach der Entfernung der Schutzgruppen von den PNA-Einheiten Nummer 1, 2, 4 und 6 wurden qualitative Kaiser-Tests durchgeführt. Jeder Test war blau. Die PNA-Oligomere wurden gemäß den Standardverfahren gespalten und gereinigt.
  • Die Mengen an für jede Kupplung verwendetem Monomer und DCC waren wie folgt (Gesamtvolumen 4,5 ml):
  • Für die PNA mit der Struktur (70), worin R&sub7;&sub0; = T&sub6; ist, entstanden 24,5 mg an Rohprodukt, das nach der Reinigung zu 6,9 mg führte. Für das PNA, worin R&sub1; = T&sub8; ist, entstanden 28,8 mg an Rohprodukt, das nach der Reinigung zu 2,8 mg führte. Die Produkte wiesen eine große Tendenz zur Aggregation auf, worauf ein komplexes HPLC- Chromatogramm nach einigen Stunden bei Raumtemperatur in Konzentrationen oberhalb von 1 mg/ml hinweist. Die PNA-(T&sub6;)&sub2; und PNA-(T&sub8;)&sub2; wurden zu (dA)&sub6; bzw. (dA)&sub8; hybridisiert, mit aufgezeichneten Tm-Werten von 42ºC bzw. 59ºC.
    • Beispiel 76 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Das PNA-Oligomer wurde auf 500 mg (Trockengewicht) an MBHA-Harz, welches über Nacht in DCM vorgequollen wurde, zusammengesetzt. Das Harz wurde anfänglich mit annähernd 0,15 mMol/g Boc-Lys(CIZ) substituiert, wie durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion nachgewiesen wurde. Die schrittweise Synthese des Oligomers folgte dem in Beispiel 32 beschriebenen Protokoll, indem bei jeder Kupplung 0,077 g (0,2 mMol) BocTaeg-OH und 31,3 ul (0,2 mMol) Diisopropylcarbodiimid in 2 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; angewendet wurden. Die Inaktivierung der nicht-umgesetzten Aminogruppen wurde in jedem Schritt vor der Entfernung der Schutzgruppen durchgeführt. Alle qualitativen Kaiser-Tests waren negativ, was auf eine nahezu 100%ige Kupplungsausbeute hinweist.
    • Beispiel 77 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub4;-[apgT]-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;
  • Die Synthese wurde auf annähernd ¹/&sub4; des feuchten H-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA- Harzes aus Beispiel 76 initiiert. Die in situ-Diisopropylcarbodiimid (DIC)-Kupplungen von sowohl Boc-(apgT)-OH als auch BocTaeg-OH wurden in 1,2 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; durchgeführt, unter Verwendung von 0,048 g (0,12 mMol) bzw. 0,046 g (0,12 mMol) Monomer und 18,7 ul (0,12 mMol) Diisopropylcarbodiimid bei jeder Kupplung. Alle qualitativen Kaiser-Tests waren negativ, was auf eine nahezu 100%ige Kupplungsausbeute hinweist. Das PNA-Oligomer wurde gemäß den Standardverfahren gespalten und gereinigt. Für (M + H)&spplus; betrug der berechnete m/z Wert 2820,15 und der gemessene m/z Wert betrug 2820,92.
    • Beispiel 78 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub4;-[proT]-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;
  • Die Synthese wurde auf annähernd ¹/&sub4; des feuchten H-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA- Harzes aus Beispiel 76 initiiert. Die in situ-Diisopropylcarbodiimid (DIC)-Kupplungen von BocTaeg-OH wurden in 1,2 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; durchgeführt, unter Verwendung von 0,046 g (0,12 mMol) und 18,7 ul (0,12 mMol) Diisopropylcarbodiimid bei jeder Kupplung. Infolge von Löslichkeitsproblemen wurde Boc-(proT)-OH 0,048 g (0,12 mMol) vor der Kupplung in 2,5 ml 50% DMF/DMSO suspendiert, die Suspension wurde filtriert und annähernd 2 ml des Filtrats wurden für die Kupplung über Nacht verwendet. Alle qualitativen Kaiser-Tests waren negativ, was auf eine nahezu 100%ige Kupplungsausbeute hinweist. Das PNA-Oligomer wurde gemäß den Standardverfahren gespalten und gereinigt.
    • Beispiel 79 Hybridisierungseigenschaften von H-[Taeg]&sub4;-[proT]-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2; Oligodesoxynukleotid Tm (ºC)
  • 5'-AAA AAA AAA A 53,5
  • 5'-AAA AGA AAA A 44,0
  • 5'-AAA AAG AAA A 43,5
  • 5'-AAA ACA AAA A 46,5
  • 5'-AAA AAC AAA A 46,5
  • 5'-AAA ATA AAA A 46,5
  • 5'-AAA AAT AAA A 46,0
    • Beispiel 80 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub4;-[bC]-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;
  • Das PNA-Oligomer wurde auf 100 mg (Trockengewicht) MBHA-Harz, welches über Nacht in DCM vorgequollen worden ist, zusammengesetzt. Das Harz wurde anfänglich mit annähernd 0,25 mMol/g Boc-Lys(CIZ) substituiert, wie durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion bestimmt wurde. Die schrittweise Synthese des Oligomers folgte dem Syntheseprotokoll 9, indem bei jeder Kupplung 0,023 g (0,06 mMol) BocTaeg- OH, 0,062 g (0,12 mMol) BocbC(Z)-OH und 0,012 g (0,06 mMol) DCC in 1,2 ml 50% OMF/CH&sub2;Cl&sub2; angewendet wurden. Die Inaktivierung der nicht-umgesetzten Aminogruppen wurden in jedem Schritt vor der Entfernung der Schutzgruppen durchgeführt. Alle qualitativen Kaiser-Tests waren negativ, was auf eine nahezu 100%ige Kupplungsausbeute hinweist. Das PNA-Oligomer wurde gemäß den Standardverfahren gespalten und gereinigt.
    • Beispiel 81 Hybridisierungseigenschaften von H-T&sub4;bCT&sub5;-Lys-NH&sub2; Oligodesoxynukleotid Tm (ºC)
  • 5'-AAA AAA AAA A 43,5
  • 5'-AAA AGA AAA A 58,0
  • 5'-AAA AAG AAA A 60,0
  • 5'-AAA ACA AAA A 34,5
  • 5'-AAA AAC AAA A 34,5
  • 5'-AAA ATA AAA A 34,0
  • 5'-AAA AAT AAA A 36,0
    • Beispiel 82 Schrittweise Zusammensetzung von H-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Aaeg]- [Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-Lys-NH&sub2;
  • Die Synthese wurde auf einem Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz (aus Beispiel 76), welches über Nacht in DMF vorgequollen worden ist, initiiert. Das Harz setzte sich aus annähernd 100 mg (Trockengewicht) an Boc-Lys-(CIZ)-MBHA-Harz (Beladung 0,15 mMol/g) zusammen. Der Einbau der Monomere folgte dem Protokoll des Beispiels 55, ausgenommen für Schritt S (Einbau des BocA(Z)aeg-OH-Monomers). Der neue Schritt S (Einbau von A(Z)aeg) beinhaltete die Zugabe von 4 Äquiv. Diisopropylcarbodiimid (0,06 mMol; 9,7 ul) und 4 Äquiv. BocA(Z)aeg-OH (0,06 mMol; 32 mg), die in 0,6 ml DCM/DMF (1 : 1, v/v) gelöst waren (Endkonzentration an Monomer 0,1 M). Die Kupplungsreaktion konnte 1 · 15 min und 1 · 60 min (Rekupplung) ablaufen.
  • Die Inaktivierung der nicht-gekuppelten Aminogruppen wurde nur vor dem Einbau des BocA(Z)aeg-OH-Monomers durchgeführt. Die Kupplungsreaktion wurde durch die qualitative Ninhydrin-Reaktion (Kaiser-Test) verfolgt. Alle qualitativen Kaiser- Tests waren negativ (strohgelbe Farbe ohne Anfärbung der Kügelchen). Das PNA- Oligomer wurde gemäß den Standardverfahren gespalten und gereinigt.
    • Beispiel 84 Hybridisierungseigenschaften von H-T&sub4;AT&sub5;-Lys-NH&sub2; Oligodesoxynukleotid Tm (ºC)
  • 5'-AAA AAA AAA A 59,15
  • 5'-AAA AGA AAA A 45,0
  • 5'-AAA AAG AAA A 45,5
  • 5'-AAA ACA AAA A 48,0
  • 5'-AAA AAC AAA A 48,0
  • 5'-AAA ATA AAA A 52,0
  • 5'-AAA AAT AAA A 52,5
    • Beispiel 85 Schrittweiser Aufbau von H-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Gaeg]-[Gaeg]-[Taeg]- [Gaeg]-[Taeg]-[Gaeg]-Lys-NH&sub2;
  • Die Schutzgruppen-enthaltende PNA wurde auf einem Boc-Lys(CIZ) modifizierten MBHA-Harz zusammengesetzt, mit einer Substitution von 0,15 mMol/g. Der Einbau der Monomere folgte dem Protokoll des Beispiels 32, mit der Ausnahme, daß der Inaktivierungsschritt 11 und der Waschschritt 12 ausgelassen wurden. Nach dem Einbau und der Entfernung der Schutzgruppen des ersten, zweiten und vierten G(Bzl)aeg-Monomers gab es einige Schwierigkeiten hinsichtlich des ausreichenden Quellens des Harzes. Drei Stunden Schütteln in unverdünntem DCM führte zu einer akzeptablen Quellung. Für den Einbau der Reste Taeg-4, G(Bzl)aeg-6 und Taeg-7 bis Taeg-10 war eine Rekupplung erforderlich, um nahezu quantitative Kupplungsausbeuten zu erhalten. Taeg&sub4; (2 · in 50% DMF/DCM), Gaeg&sub6; (2 · in 50% DMF/DCM), Taeg&sub7; (2 · in 50% DMF/DCM, 1 · in 50% NMP/DCM und 1 · in unverdünntem DCM), Taeg&sub8; (1 · in 50% DMF/DCM und 2 · in unverdünntem DCM), Taeg&sub9; (2 · in 50% DMF/DCM), Taeg&sub1;&sub0; (2 · in 50% DMF/DCM). Alle qualitativen Kaiser- Tests waren negativ (strohgelbe Farbe ohne Anfärbung der Kügelchen). Das PNA- Oligomer wurde gemäß den Standardverfahren gespalten und gereinigt.
    • Beispiel 86 Hybridisierungseigenschaften des ungereinigten (annäh. 50%) H-T&sub4;G&sub2;TGTG- LysNH&sub2; Oligodesoxynukleotid Tm
  • 5'-A4C2ACAC 38
  • 5'-CACAC2A4 55
    • Beispiel 87 Großproduktions-Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub6;-Lys-NH&sub2;, H-[Taeg]&sub7;-Lys- NH&sub2;, H-[Taeg]&sub8;-Lys-NH&sub2;, H-[Tage]&sub9;-Lys-NH&sub2; und H-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz und kürzerer Fragmente
  • Etwa 9 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub3;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz (siehe Beispiel 19b) wurde in ein 60 ml-SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch Einzel-Kupplung beider Reste mit 0,15 M an BocTaeg-OPfp in 10 ml unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt ("Syntheseprotokoll 8"). Beide Kupplungsreaktionen konnten über Nacht ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin- Reaktion verfolgt, die einen nahezu quantitativen Einbau beider Reste zeigte. Nach der Entfernung der N-terminalen Boc-Schutzgruppe wurden etwa 4,5 g H-[Taeg]&sub5;- Lys(CIZ)-MBHA in ein 20 ml-SPPS-Reaktionsgefäß gegeben und über Nacht mit 0,2 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,2 M DCC in 7,5 ml unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2; durch eine einzelne in situ-DCC-Kupplung aller Reste (nahezu quantitativ, ausgenommen für Rest Nummer 8) zu Boc-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA verlängert ("Syntheseprotokoll 9"). Vor der Kupplung der Taeg-Reste Nummer sieben bzw. acht wurden kleine Mengen an H-[Taeg]&sub6;-Lys(CIZ)-MBHA bzw. H-[Taeg]&sub7;-Lys(CIZ)-MBHA für die HF- Spaltung entnommen.
  • Der Taeg-Rest Nummer acht wurde zweimal gekuppelt (über Nacht) und lieferte einen nahezu quantitativen Einbau. Nach der Entfernung der N-terminalen Boc- Schutzgruppen wurde eine große Menge an H-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA für die HF- Spaltung entnommen. Das Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch eine doppelte in situ-DCC-Kupplung von 0,16 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt ("Syntheseprotokoll 9"). Vor der Kupplung des abschließenden Restes wurde ein kleine Menge an H-[Taeg]&sub9;- Lys(CIZ)-MBHA für die HF-Spaltung entnommen.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub6;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub6;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 52,4 mg trockenem H-[Taeg]&sub6;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 14,0 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt wurde nicht gereinigt (etwa 99% Reinheit).
    • (c) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub7;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub7;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 58,4 mg trockenem H-[Taeg]&sub7;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 5,2 mg an Rohmaterial.
    • (d) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub8;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 604 mg trockenem H-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 114 mg an Rohmaterial.
    • (e) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub9;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub9;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 81,0 mg trockenem H-[Taeg]&sub9;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 19,3 mg an Rohmaterial.
    • (f) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 417 mg trockenem H-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harzetwa 141 mg an Rohmaterial
    • (g) Syntheseprotokoll 8 (Allgemeines Protokoll)
  • (1) Abspaltung der Boc-Schutzgruppen mit TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1, v/v), 3 · 1 min und 1 · 30 min. (2) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 6 · 1 min. (3) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 3 · 2 min. (4) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 6 · 1 min und 1 min Abtropfen; (5) in einigen Stadien der Synthese werden 2-5 mg Probe des PNA-Harzes entnommen und sorgfältig für eine Ninhydrin-Analyse getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Zugabe von Boc-Schutzgruppen-enthaltendem PNA-Monomer (Pfp-Ester); die Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt X h ablaufen; (7) Waschen mit DMF, 1 · 2 min. (8) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 4 · 1 min. (9) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 2 · 2 min. (10) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 6 · 1 min. (11) gegebenenfalls werden 2-5 mg Probe des Schutzgruppen-enthaltenden PNA-Harzes entnommen und sorgfältig für eine Ninhydrin-Analyse getrocknet, um das Ausmaß der Kupplung zu bestimmen; (12) in einigen Stadien der Synthese werden nichtumgesetzte Aminogruppen 2 h mit einer Mischung aus Essigsäureanhydrid/Pyridin/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1 : 2, v/v/v) blockiert, gefolgt von Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 6 · 1 min und gegebenenfalls Ninhydrin-Analyse.
    • Beispiel 88 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub4;-Caeg-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub4;-C[Z]aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 1 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde in ein 5 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub4;-C[Z]aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch in situ-DCC-Kupplung aller Reste unter Verwendung von 0,16 M Boc[Taeg]- OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; oder 0,16 M BocTaeg- OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt ("Syntheseprotokoll 9"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion verfolgt, welche einen etwa 98%igen Einbau von C[Z]aeg und einen nahezu quantitativen Einbau aller Taeg-Reste zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub4;-C[Z]aeg-[Taeg]&sub5;-Lys- NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub4;-C[Z]aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 128,2 mg trockenem H-[Taeg]&sub4;-C[Z]aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 22,5 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (5,8 mg) wurde gereinigt und lieferte 3,1 mg H- [Taeg]&sub4;-Caeg-[Taeg]&sub5;-Lys-N H&sub2;.
    • (c) Syntheseprotokoll 9 (Allgemeines Protokoll)
  • (1) Abspaltung der Boc-Schutzgruppen mit TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1, v/v), 3 · 1 min und 1 · 30 min. (2) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 6 · 1 min. (3) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 3 · 2 min. (4) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 6 · 1 min und 1 min Abtropfen; (5) in einigen Stadien der Synthese werden 2-5 mg Probe des PNA-Harzes entnommen und sorgfältig für eine Ninhydrin-Analyse getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Zugabe von Boc-Schutzgruppen enthaltendem PNA-Monomer (freie Säure) in x ml DMF, gefolgt von der Zugabe von DCC in x ml CH&sub2;Cl&sub2;; die Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt Y h ablaufen; (7) Waschen mit DMF, 1 · 2 min. (8) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 4 · 1 min. (9) Neutralisation mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 19, v/v), 2 · 2 min. (10) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 6 · 1 min. (11) gegebenenfalls werden 2-5 mg Probe des Schutzgruppen-enthaltenden PNA-Harzes entnommen und sorgfältig für eine Ninhydrin-Analyse getrocknet, um das Ausmaß der Kupplung zu bestimmen; (12) in einigen Stadien der Synthese werden nicht-umgesetzte Aminogruppen 2 h mit einer Mischung aus Essigsäureanhydrid/Pyridin/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1 : 2, v/v/v) blockiert, gefolgt durch Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2;, 6 · 1 min und gegebenenfalls Ninhydrin-Analyse.
    • Beispiel 89 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub4;-(NBaeg)-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;. (NB =COCH&sub3;) (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub4;-(NBaeg)-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 1 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub4;-(NBaeg)-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch in situ-DCC-Kupplung unter Verwendung von 0,16 M Boc(NBaeg)-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt oder 0,16 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h ablaufen. Der NBaeg-Rest wurden dreimal gekuppelt und die Taeg- Reste wurde alle einmal gekuppelt. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin- Reaktion verfolgt, welche einen > 99%igen Gesamteinbau von NBaeg (etwa 88% nach der ersten Kupplung und etwa 93% nach der zweiten Kupplung) und einen nahezu quantitativen Einbau aller Taeg-Reste zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub4;-(NBaeg)-[Taeg]&sub5;-Lys- NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub4;-(NBaeg)-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 108,9 mg trockenem H-[Taeg]&sub4;-(NBaeg)-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 33,6 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (20,6 mg) wurde gereinigt und lieferte 4,6 mg H-[Taeg]&sub4;-(NBaeg)-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2683,12 und der gemessene m/z Wert betrug 2683,09.
    • Beispiel 90 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub4;-aeg-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub4;-aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 1 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde in ein 5 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub4;-aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch einzelne in situ-DCC-Kupplung aller Reste zusammengesetzt, unter Verwendung von: (1) 0,16 M Bocaeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; oder (2) 0,16 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin- Reaktion verfolgt, welche einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub4;-aeg-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub4;-aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 126,0 mg trockenem H-[Taeg]4-aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 22,2 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (22,2 mg) wurde gereinigt und lieferte 7,6 mg H- [Taeg]&sub4;-aeg-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2641,11 und der gemessene m/z Wert betrug 2641,16.
    • Beispiel 91 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub4;-Gly-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub4;-Gly-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 1 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub4;-Gly-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch einzelne in situ-DCC-Kupplung aller Reste zusammengesetzt, unter Verwendung von: (1) 0,16 M BocGly-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; oder (2) 0,16 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/Ch&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin- Reaktion verfolgt, welche einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub4;-Gly-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub4;-Gly-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 124,1 mg trockenem H-[Taeg]&sub4;-Gly-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 45,0 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (40,4 mg) wurde gereinigt und lieferte 8,2 mg H- [Taeg]&sub4;-Gly-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;.
    • Beispiel 92 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub4;-Gly&sub2;-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub4;-Gly&sub2;-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 1 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub4;-[C[Z]aeg]&sub2;-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg- Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch einzelne in situ-DCC-Kupplung aller Reste zusammengesetzt, unter Verwendung von: (1) 0,16 M BocGly-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; oder (2) 0,16 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion verfolgt, welche einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub4;-Gly&sub2;-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub4;-Gly&sub2;-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 156,6 mg trockenem H-[Taeg]4-Gly&sub2;-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 32,6 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (30 mg) wurde gereinigt und lieferte 7,8 mg H- [Taeg]&sub4;-Gly&sub2;-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2655,09 und der gemessene m/z Wert betrug 2655,37.
    • Beispiel 93 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub4;-[Caeg]&sub2;-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub4;-[C[Z]aeg]&sub2;-Taeg-C[Z]aeg-Taeg- C[Z]aeg-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 1,5 g feuchtes Boc-Lys(CIZ)-MBHA-Harz (0,28 mMol Lys/g) wurden in ein 5 ml- SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub4;-[C[Z]aeg]&sub2;-Taeg-C[Z]aeg-Taeg- C[Z]aeg-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch einzelne in situ-DCC-Kupplung aller Reste zusammengesetzt, unter Verwendung von: (1) 0,16 M BocC[Z]-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; oder (2) 0,16 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion verfolgt, welche einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub4;-[Caeg]&sub2;-Taeg-Caeg- Taeg-Caeg-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub4;-[C[Z]aeg]&sub2;-Taeg-C[Z]aeg-Taeg- [C[Z]aeg]-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 216,7 mg trockenem H-[Taeg]&sub4;-[C[Z]aeg]&sub2;- Taeg-C[Z]aeg-Taeg-[C[Z]aeg]-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 52,1 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (30,6 mg) wurde gereinigt und lieferte 6,2 mg H-[Taeg]&sub4;-[Caeg]&sub2;- Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2747,15 und der gemessene m/z Wert betrug 2746,78.
    • Beispiel 94 Festphasen-Synthese von H-Caeg-Taeg-Caeg-Taeg-[Caeg-]&sub3;-Taeg-Caeg-Taeg- Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-[C[Z]aeg]&sub3;- Taeg-C[Z]aeg-Taeg-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 1,5 g feuchtes Boc-Lys(CIZ)-MBHA-Harz (0,28 mMol Lys/g) wurden in ein 5 ml- SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Boc-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-[C[Z]aeg]&sub3;-Taeg- C[Z]aeg-Taeg-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch einzelne in situ-DCC-Kupplung aller Reste zusammengesetzt, unter Verwendung von: (1) 0,16 M BocC[Z]-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; oder (2) 0,16 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 2,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion verfolgt, welche einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Caeg-Taeg-Caeg-Taeg- [Caeg]&sub3;-Taeg-Caeg-Taeg-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-[C[Z]aeg]&sub3;-Taeg- C[Z]aeg-Taeg-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 255,0 mg trockenem H-C[Z]aeg-Taeg- C[Z]aeg-Taeg-[C[Z]aeg]&sub3;-Taeg-C[Z]aeg-TaegLys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 56,1 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (85,8 mg) wurde gereinigt und lieferte 46,2 mg H- Caeg-Taeg-Caeg-Taeg-[Caeg]&sub3;-Taeg-Caeg-Taeg-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2717,15 und der gemessene m/z Wert betrug 2716,93.
    • Beispiel 95 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;, H-Caeg- [Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub2;-Lys-NH&sub2; und H-Tyr-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;- [Caeg]&sub2;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz, Boc-Caeg-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz und Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;- [C(Z)aeg]&sub2;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 3 g feuchtes Boc-Lys(CIZ)-MBHA-Harz (0,28 mMol Lys/g) wurden in ein 20 ml- SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch einzelne in situ-DCC-Kupplung aller Reste zusammengesetzt, unter Verwendung von: (1) 0,16 M BocC[Z]-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 3,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; oder (2) 0,16 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 3,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion verfolgt, welche einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte. Nach der Entfernung der N-terminalen Boc-Schutzgruppen, wurde die Hälfte des PNA-Harzes quantitativ an Tyr(BrZ)-OH gekuppelt und ein kleine Menge wurde quantitativ an einen zusätzlichen Caeg-Rest gekuppelt. Beide Kupplungen wendeten das vorstehend erwähnte Syntheseprotokoll an.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;- [Caeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub2;-Lys(CIZ)- MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 182,5 mg trockenem H-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 50,9 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (50,9 mg) wurde gereinigt und lieferte etwa 13,7 mg H-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2466,04; der m/z Wert wurde nicht gemessen.
    • (c) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Tyr-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;- [Caeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 188,8 mg trockenem H-Tyr(BrZ)-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;- [Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub2;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 60,8 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (60,8 mg) wurde gereinigt und lieferte 20,7 mg H-Tyr-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;- [Caeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2629,11 und der gemessene m/z Wert betrug 2629,11.
    • (d) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Caeg-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;- [Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-C(Z)aeg-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 42,0 mg trockenem H-C(Z)aeg-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;- [Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub2;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 11,7 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (11,6 mg) wurde gereinigt und lieferte 3,1 mg H-Caeg-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;- [Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2717,15; der m/z Wert wurde nicht gemessen.
    • Beispiel 96 Festphasen-Synthese von H-[Caeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;, H-Taeg- [Caeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys-NH&sub2; und H-Tyr-[Caeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;- [Taeg]&sub2;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz, Boc-Taeg-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys(CIZ)- MBHA-Harz und Boc-Tyr(BrZ)-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys(CIZ)- MBHA-Harz
  • Etwa 3 g feuchtes Boc-Lys(CIZ)-MBHA-Harz (0,28 mMol Lys/g) wurden in ein 20 ml- SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;--[C(Z)aeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch einzelne in situ-DCC-Kupplung aller Reste zusammengesetzt, unter Verwendung von: (1) 0,16 M BocC[Z]-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 3,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; oder (2) 0,16 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,16 M DCC in 3,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln für insgesamt 20-24 h ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion verfolgt, welche einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte. Nach der Entfernung der N-terminalen Boc-Schutzgruppen, wurde die Hälfte des PNA-Harzes quantitativ an Tyr(BrZ)-OH gekuppelt und ein kleine Menge wurde quantitativ an einen zusätzlichen Taeg-Rest gekuppelt. Beide Kupplungen wendeten das vorstehend erwähnte Syntheseprotokoll an.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;- [Taeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys(CIZ)- MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 172,7 mg trockenem H-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 57,6 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (57,8 mg) wurde gereinigt und lieferte 26,3 mg H-[Caeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2466,04; der m/z Wert wurde nicht gemessen.
    • (c) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Tyr-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;- [C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-Tyr(BrZ)-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 172,7 mg trockenem H-Tyr(BrZ)-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;- [C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 57,6 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (47,1 mg) wurde gereinigt und lieferte 13,4 mg H-Tyr-[Caeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[Caeg]&sub3;- [Taeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2629,11 und der gemessene m/z Wert betrug 2629,11.
    • (d) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Taeg-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;- [C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-Taeg-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;-[C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 42,4 mg trockenem H-Taeg-[C(Z)aeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;- [C(Z)aeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 53,4 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (11,9 mg) wurde gereinigt und lieferte 4,3 mg H-Taeg-[Caeg]&sub2;-[Taeg]&sub2;- [Caeg]&sub3;-[Taeg]&sub2;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2732,15; der m/z Wert wurde nicht gemessen.
    • (c) Syntheseprotokoll 10 (Allgemeines Protokoll)
  • Das gleiche Protokoll, wie "Syntheseprotokoll 9", mit der Ausnahme, daß DCC durch DIC ersetzt worden ist.
    • Beispiel 97 Synthese der Gerüsteinheit zur Großproduktion durch reduktive Aminierung (a) Herstellung von (Bocamino)acetaldehyd
  • 3-Amino-1,2-propandiol (80,0 g; 0,88 Mol) wurde in Wasser gelöst (1500 ml) und auf 4ºC abgekühlt, wonach Bocanhydrid (230 g; 1,05 Mol) mit einmal zugesetzt wurde. Die Lösung wurde mit einem Wasserbad langsam auf Raumtemperatur erwärmt. Der pH-Wert wurde durch tropfenweise Zugabe von Natriumhydroxid auf 10,5 gehalten. Während des Reaktionsverlaufs wurden insgesamt 70,2 g NaOH, gelöst in 480 ml Wasser, zugesetzt. Nach Rühren über Nacht wurde Essigsäureethylester (1000 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde auf 0ºC abgekühlt und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 4 M Salzsäure auf 2,5 eingestellt. Die Essigsäureethylester-Schicht wurde entfernt und die wässrige saure Lösung wurde mit mehr Essigsäureethylester (8 · 500 ml) extrahiert. Die vereinte Essigsäureethylester-Lösung wurde unter Anwendung eines Rotationsverdampfers auf ein Volumen von 1500 ml verringert. Die entstehende Lösung wurde mit halb-gesättigtem Kaliumhydrogensulfat (1500 ml) und anschließend mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen. Anschließend wurde sie über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Ausbeute 145,3 g (86%).
  • 3-Bocamino-1,2-propandiol (144,7 g; 0,757 Mol) wurde in Wasser (750 ml) suspendiert und es wurde Kaliumperiodat (191,5 g; 0,833 Mol) zugesetzt. Das Gemisch wurde 2,5 h unter Stickstoff gerührt und das ausgefallene Kaliumiodat wurde durch Filtration entfernt und einmal mit Wasser (100 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Chloroform extrahiert (6 · 400 ml). Die Chloroform-Extrakte wurden getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Ausbeute 102 g (93%) eines Öls. Der (Bocamino)acetaldehyd wurde in zwei Teilen durch Kugelrohr-Destillation bei 84ºC und 0,3 mmHg gereinigt. Die Ausbeute betrug 79 g (77%) eines farblosen Öls.
    • (b) Herstellung von (N'-Bocaminoethyl)glycinmethylester
  • Palladium auf Kohlenstoff (10%; 2,00 g) wurde bei 0ºC einer Lösung von (Bocamino)acetaldehyd (10,0 g; 68,9 mMol) in Methanol (150 ml) zugesetzt. Anschließend wurden Natriumacetat (11,3 g; 138 mMol) in Methanol (150 ml) und Glycinmethylesterhydrochlorid (8,65 g; 68,9 mMol) in Methanol (75 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde 2,5 h bei Atmosphärendruck hydriert, anschließend durch Celit filtriert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Das Material wurde in Wasser (150 ml) gelöst und der pH-Wert wurde mit 0,5 N NaOH auf 8,0 eingestellt. Die wässrige Lösung wurde mit Methylenchlorid extrahiert (5 · 150 ml). Die vereinten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Dies führte zu 14,1 g (88%) (N'-Bocaminoethyl)glycinmethylester. Das Rohmaterial wurde bei 120ºC und 0,5 mmHg durch Kugelrohr-Destillation gereinigt und es entstanden 11,3 g (70%) eines farblosen Öls. Das Produkt wies gemäß der DC-Analyse (10% Methanol in Methylenchlorid) eine Reinheit auf, die größer war als jene des in Beispiel 26 hergestellten Materials.
  • Alternativ kann Natriumcyanoborhydrid anstelle von Wasserstoff als Reduktionsmittel verwendet werden (mit Pd(C) als Katalysator), obwohl die Ausbeute (42%) geringer war.
    • (c) Herstellung von (N'-Bocaminoethyl)glycinethylester
  • Die Titelverbindung wurde gemäß dem vorstehend genannten Verfahren mit Glycinethylesterhydrochlorid anstelle von Glycinmethylesterhydrochlorid hergestellt. Als Lösungsmittel wurde auch Ethanol verwendet. Die Ausbeute betrug 78%.
    • Beispiel 98 Festphasen-Synthese von H-Tyr-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweise Zusammensetzung von Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA- Harz
  • Etwa 0,2 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde über Nacht durch die standardmäßige in situ DCC-Kupplung, unter Verwendung von 0,32 M BocCTyr(BrZ)-OH, gemeinsam mit 0,32 M DCC in 3,0 ml unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt. Die Ninhydrin-Reaktion zeigte einen etwa 97%igen Einbau von BocTyr(BrZ).
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Tyr-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 20,7 mg trockenem H-Tyr(BrZ)-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 5,5 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt wurde gereinigt und lieferte 2,5 mg H-Tyr-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys- NH&sub2;.
    • Beispiel 99 Festphasen-Synthese von Dansyl-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Dansyl-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 0,3 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Dansyl-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde über Nacht durch Kupplung von 0,5 M Dansyl-Cl in 2,0 ml unverdünntem Pyridin zusammengesetzt. Die Ninhydrin-Reaktion zeigte einen etwa 95%igen Einbau von Dansyl.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von Dansyl-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-MH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Dansyl-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 71,3 mg trockenem Dansyl-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 12 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt wurde gereinigt und lieferte 5,4 mg Dansyl-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;.
    • Beispiel 100 Festphasen-Synthese von Gly-Gly-His-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA- Harz
  • Etwa 0,05 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde über Nacht durch die standardmäßige doppelte in situ-DCC-Kupplung von Boc- Schutzgruppen-enthaltender Aminosäure (0,1 M) in 2,5 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt, ausgenommen der ersten Kupplung von BocHis(Tos), die unter Verwendung eines vorgeformten symmetrischen Anhydrids (0,1 M) in 25% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; durchgeführt wurde. Alle Kupplungsreaktionen wurden über Nacht durchgeführt und die Ninhydrin-Reaktionen wurden nicht durchgeführt.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von Gly-Gly-His-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA- Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF- Spaltung von 34,5 mg trockenem Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA- Harz etwa 10,3 mg an Rohmaterial (etwa 40% Reinheit). Ein kleine Menge des Rohprodukt (vor der Gefriertrocknung entnommen) wurde gereinigt und lieferte 0,1 mg Gly-Gly-His-[Taeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;.
    • Beispiel 101 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub5;-[Caeg]&sub2;-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub5;-[C(Z)aeg]&sub2;-MBHA-Harz
  • Etwa 0,2 g des MBHA-Harzes wurden in ein 3 ml-SPPS-Reaktionsgefäß gegeben und neutralisiert. Es wurde nachgewiesen, daß die Beladung etwa 0,64 mMol/g betrug. BocC(Z)aeg-OPfp wurde unter Verwendung einer Konzentration von 0,13 M in 2,5 ml 25% Phenol/CH&sub2;Cl&sub2; an das Harz gekuppelt. Die Ninhydrin-Analyse zeigte, daß die Kupplungsausbeute etwa 40% betrug. Die verbleibenden freien Aminosäuren wurden wie üblich acetyliert. Das Boc-[Taeg]&sub5;-[C(Z)aeg]&sub2;-MBHA-Harz wurde durch einzelne in situ-DCC-Kupplung des nächsten Restes, unter Verwendung von 0,11 M BocC(Z)aeg-OH, gemeinsam mit 0,11 M DCC in 2,5 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; und durch Kupplung der verbleibenden Reste mit 0,13 M BocTaeg-OPfp in unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt ("Syntheseprotokoll 8"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln über Nacht ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion verfolgt, die einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub5;-[Caeg]&sub2;-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub5;-[C(Z)aeg]&sub2;-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 94,8 mg trockenem H-[Taeg]&sub5;-[C(Z)aeg]&sub2;-MBHA-Harz etwa 21,7 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (7,4 mg) wurde gereinigt und lieferte 2,0 mg H-[Taeg]&sub5;-[Caeg]&sub2;-NH&sub2; (> 99%% Reinheit).
    • Beispiel 102 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub3;-Caeg-[Taeg]&sub4;-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub3;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub4;-MBHA-Harz
  • Etwa 0,2 g des vorstehend erwähnten MBHA-Harzes wurden in ein 5 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben und neutralisiert. Boc-[Taeg]&sub3;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub4;-MBHA-Harz wurde über Nacht durch die einzelne in situ-DCC-Kupplung des C(Z)aeg-Restes, unter Verwendung von 0,13 M BocC[Z]aeg-OH, gemeinsam mit 0,13 M DCC in 2,5 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; und durch Kupplung der Taeg-Reste mit 0,13 M BocTaeg-OPfp in 2,5 ml unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt. Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln über Nacht ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin- Reaktion verfolgt, die einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub3;-Caeg -[Taeg]&sub4;-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub3;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub4;-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 123 mg trockenem H-[Taeg]&sub3;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub4;-MBHA-Harz etwa 44,4 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (11,0 mg) wurde gereinigt und lieferte 3,6 mg H-[Taeg]&sub3;- Caeg-[Taeg]&sub4;-NH&sub2;.
    • Beispiel 103 Festphasen-Synthese von H-Taeg-Caeg-[Taeg]&sub8;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 0,3 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 3 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde über Nacht durch die einzelne in situ-DCC-Kupplung des C(Z)aeg-Restes ("Syntheseprotokoll 9"), unter Verwendung von 0,2 M BocC(Z)aeg-OH, gemeinsam mit 0,2 M DCC in 2,5 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; (der durch die Ninhydrin-Analyse bestimmte Einbau betrug etwa 80%; die verbleibenden freien Aminosäuren wurden acetyliert) und durch Kupplung des Taeg-Restes mit 0,15 M BocTaeg-OPfp über Nacht in 2,5 ml unverdünntem CH&sub2;Cl&sub2; zusammengesetzt (nahezu quantitativ).
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Taeg-Caeg-[Taeg]&sub8;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 76,5 mg trockenem H-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 22,3 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt (6,7 mg) wurde gereinigt und lieferte 2,6 mg H- Taeg-Caeg-[Taeg]&sub8;-Lys-NH&sub2;. Für (M + H)+ betrug der berechnete m/z Wert 2792,15 und der gemessene m/z Wert betrug 2792,21.
    • Beispiel 104 Festphasen-Synthese von H-Caeg-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2; und H-[Taeg]&sub2;-Caeg-[Taeg]&sub5;- Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub2;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 0,5 g feuchtes Boc-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml-SPPS- Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[Taeg]&sub2;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch die einzelne in situ-DCC-Kupplung aller Reste zusammengesetzt, unter Verwendung von: (1) 0,12 M BocC(Z)aeg-OH, gemeinsam mit 0,12 M DCC in 3,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; oder (2) 0,12 M BocTaeg-OH, gemeinsam mit 0,12 M DCC in 3,0 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9"). Jede Kupplungsreaktion konnte durch Schütteln über Nacht ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion verfolgt, die einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte. Während der Synthese wurde ein kleine Menge des H-C(Z)aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harzes für die HF-Spaltung entnommen.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Caeg-[Taeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-C[Z]aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 37,5 mg trockenem H-C[Z]aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 3,0 mg an Rohmaterial. Etwa 0,7 mg des Rohprodukts wurden gereinigt und lieferten etwa 0,5 mg an H-Caeg-[Taeg]&sub5;- Lys-NH&sub2;.
    • (c) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub2;-Caeg -[Taeg]&sub5;-Lys- NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub2;-C[Z]aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 118,6 mg trockenem H-[Taeg]&sub2;-C[Z]aeg-[Taeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 37,7 mg an Rohmaterial.
    • Beispiel 105 Festphasen-Synthese von H-[Caeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;, H-[Caeg]&sub6;-Lys-NH&sub2;, H-[Caeg]&sub8;- Lys-NH&sub2; und H-[Caeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[C(Z)aeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz und kürzerer Fragmente
  • Etwa 5 g feuchtes Boc-Lys(CIZ)-MBHA-Harz (Substitution = 0,3 mMol Lys/g) wurden in ein 30 ml-SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Boc-[C(Z)aeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde durch die einzelne in situ-DCC-Kupplung der ersten drei Reste mit 0,1 M BocC(Z)aeg-OH, gemeinsam mit 0,1 M DCC in 10 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 9") und durch einzelne in situ-DIC-Kupplung der verbleibenden Reste mit 0,1 M BocC(Z)aeg-OH, gemeinsam mit 0,1 M DIC in 10 ml 50% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; ("Syntheseprotokoll 10") zusammengesetzt. Alle Kupplungsreaktionen konnten durch Schütteln über Nacht ablaufen. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion verfolgt, die einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte.
  • Während der Synthese wurden kleine Mengen der kürzeren Fragmente H- [C(Z)aeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz, H-[C(Z)aeg]&sub6;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz, H-[C(Z)aeg]&sub7;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz, H-[C(Z)aeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz und H-[C(Z)aeg]&sub9;-Lys(CIZ)- MBHA-Harz für die HF-Spaltung entnommen.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Caeg]&sub5;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[C(Z)aeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 60,1 mg trockenem H-[C(Z)aeg]&sub5;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 10,8 mg an Rohmaterial.
    • (c) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Caeg]&sub6;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[C(Z)aeg]&sub6;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 56,2 mg trockenem H-[C(Z)aeg]&sub6;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 13,4 mg an Rohmaterial.
    • (d) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Caeg]&sub8;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[C(Z)aeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 65,6 mg trockenem H-[C(Z)aeg]&sub8;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 16,8 mg an Rohmaterial.
    • (e) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Caeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[C(Z)aeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 441 mg trockenem H-[C(Z)aeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 142,4 mg an Rohmaterial.
    • Beispiel 106 Festphasen-Synthese von H-[Taeg]&sub2;-Caeg-[Taeg]&sub2;-Caeg-[Taeg]&sub4;-Lys-NH&sub2; (a) Schrittweiser Aufbau von Boc-[Taeg]&sub2;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub2;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub4;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz
  • Etwa 0,3 g des feuchten H-[Taeg]&sub2;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub4;-Lys(CIZ)-MBHA-Harzes aus der früheren Synthese von Boc-[Taeg]&sub5;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub4;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml-SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Nach der fünfmaligen Kupplung des nächsten Restes wurde ein Einbau von BocC(Z)aeg von insgesamt 87% erhalten. Die fünf wiederholten Kupplungen wurden ausgeführt mit 0,18 M BocC(Z)arg-OPfp in 2 ml TFE/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 2, v/v), 2 ml TFE/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 2, v/v), 2 ml TFE/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 2, v/v) mit zwei Tropfen Dioxan und zwei Tropfen DIEA (unter dieser Bedingung entstand nur eine geringe prozentuale Kupplungsausbeute), 2 ml TFE/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 2, v/v) plus 0,5 g Phenol bzw. 1 ml CH&sub2;Cl&sub2; plus 0,4 g Phenol. Die zwei abschließenden Taeg-Reste wurden durch doppelte Kupplungen mit 0,25 M BocTaeg-OPfp in 25% Phenol/CH&sub2;Cl&sub2; nahezu quantitativ eingebaut. Alle Kupplungen konnten über Nacht ablaufen.
    • (b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]&sub2;-Caeg-[Taeg]&sub2;-Caeg- [Taeg]&sub4;-Lys-NH&sub2;
  • Das Schutzgruppen-enthaltende Boc-[Taeg]&sub2;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub2;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub4;- Lys(CIZ)-MBHA-Harz wurde, wie in Beispiel 17c beschrieben, behandelt und lieferte nach der HF-Spaltung von 80,7 mg trockenem H-[Taeg]&sub2;-C(Z)aeg-[Taeg]&sub2;-C(Z)aeg- [Taeg]&sub4;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz etwa 7 mg an Rohmaterial. Das Rohprodukt wurde gereinigt und es entstanden 1,2 mg H-[Taeg]&sub2;-Caeg-[Taeg]&sub2;-Caeg-[Taeg]&sub4;-Lys-NH&sub2; (> 99,9% Reinheit).
    • Beispiel 107 Synthese einer PNA mit zwei anti-parallelen, miteinander verbundenen Strängen Synthese von H-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Gaeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[6-AHA]- [aeg]-[6-AHA]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Aaeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-Lys-MH&sub2;. (6- AHA = 6-Aminohexansäure) (Fig. 26)
  • Die Schutzgruppen-enthaltende PNA wurde auf einem Boc-Lys(CIZ) modifizierten MBHA-Harz zusammengesetzt, mit einer Substitution von annähernd 0,30 mMol/g. Die Inaktivierung der nicht-gekuppelten Aminogruppen wurde nur vor dem Einbau des BocGaeg-OH-Monomers durchgeführt. Die Synthese wurde auf 1,00 g (Trockengewicht) vorgequollenem (über Nacht in DCM) und neutralisiertem Boc- Lys(CIZ)-MBHA-Harz initiiert. Der Einbau der Monomere folgte dem Protokoll der Beispiele 32 und 71. Die Kupplungsreaktion wurde durch die qualitative Ninhydrin- Reaktion (Kaiser-Test) verfolgt. Im Fall eines positiven Kaiser-Tests wurde die Kupplungsreaktion wiederholt, bis der Test keine Anfärbung der Kügelchen zeigte. Die abschließende Entfernung der Schutzgruppen, die Spaltung vom Träger und die Reinigung wurde gemäß den Standardverfahren durchgeführt.
    • Beispiel 108 Alternative Schutzgruppen-Strategie zur PNA-Synthese (Fig. 27) (a) Synthese der Testverbindungen
  • 2-Amino-6-O-benzylpurin. Einer Lösung von 2,5 g (0,109 Mol) Natrium in 100 ml Benzylalkohol wurden 10,75 g (0,063 Mol) 2-Amino-6-chlorpurin zugesetzt. Das Gemisch wurde 12 h bei 120ºC gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Essigsäure neutralisiert und mit 10 mal 50 ml 0,2 N Natriumhydroxid extrahiert. Die gesammelten Natriumhydroxid-Phasen wurden mit 100 ml Diethylether gewaschen und mit Essigsäure neutralisiert, wodurch die Ausfällung begann. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und der gelbe Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt. Die Umkristallisation aus Ethanol lieferte 14,2 g an 92% reinen weißen Kristallen der Zielverbindung. ¹H-NMR (250 MHz; DMSO-d&sub6;) δ ppm: 8-H, 7,92; aromatisches Benzyl, 7,60-7,40; 2-NH&sub2;, 6,36; Benzyl CH&sub2;, 5,57.
  • (2-Amino-6-O-benzylpurinyl)methylethanoat. Ein Gemisch aus 5 g (0,0207 Mol) 2- Amino-6-O-benzylpurin, 30 ml DMF und 2,9 g (0,021 Mol) Kaliumcarbonat wurde bei Raumtemperatur gerührt. Bromessigsäuremethylester (3,2 g; 1,9 ml; 0,0209 Mol) wurde tropfenweise zugesetzt. Die Lösung wurde nach 4 h filtriert und das Lösungsmittel wurde unter verminderten Druck (4 mmHg, 40ºC) entfernt. Der Rückstand wurde zweimal aus Essigsäureethylester umkristallisiert und es entstanden 3,7 g (57%) der Zielverbindung. ¹H-NMR (250 MHz; DMSO-d&sub6;) δ ppm: 8-H, 7,93; aromatisches Benzyl, 7,4-7,6; 2-NH&sub2;, 6,61; Benzyl CH&sub2;, 5,03; CH&sub2;, 5,59; OCH&sub3;, 3,78.
  • (2-N-p-Toluolsulfonamid-6-O-benzylpurinyl)methylethanoat. Einer Lösung aus 0,5 g (1,6 mMol) (2-Amino-6-O-benzylpurinyl)methylethanoat in 25 ml Methylenchlorid wurden 0,53 g (1,62 mMol) p-Toluolsulfonsäureanhydrid und 0,22 g (1,62 mMol) Kaliumcarbonat zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck (15 mmHg, 40ºC) entfernt. Dem öligen Rückstand wurde Diethylether zugesetzt. Die entstehende Lösung wurde über Nacht gerührt, wobei die Zielverbindung (0,415 mg; 55%) ausfiel und sie wurde durch Filtration gesammelt. ¹H-NMR (250 MHz; DMSOd&sub6;) δ ppm: 8-H, 8,97; aromatisch, 7,2-7,8; Benzyl CH&sub2;, 5,01; CH&sub2;, 4,24; OCH&sub3;, 3,73; CH&sub3;, 2,43.
    • (b) Stabilität des Tosyl-Schutzgruppen-enthaltenden Basen-Restes in TFA und HF
  • Das Material wurde den Standardbedingungen zur Entfernung der Schutzgruppen (TFA-Schutzgruppen-Entfernung) und den abschließenden Spaltungsbedingungen mit HF unterzogen. Die Produkte wurden anschließend der HPLC-Analyse unterzogen, unter Verwendung einer 4 u RCM 8 · 10 mit Nova gepackten Säule und den Lösungsmitteln A (0,1% TFA in Wasser) und B (0,1% TFA in Acetonitril) gemäß den nachfolgenden Zeitgradienten mit einem Fluß von 2 ml/min.
  • Die nachfolgenden Retentionszeiten wurden gefunden: (a) Verbindung 1 : 30,77 min. (b) Verbindung 2 : 24,22 min. und (c) Verbindung 3 : 11,75 min. Die Analyse zeigte, daß die O6-Benzylgruppe sowohl durch TFA als auch durch HF entfernt wurde, wohingegen es keine Spaltung der Tosylgruppe in TFA gab, jedoch eine quantitative Entfernung in HF unter den standardmäßigen Spaltungsbedingungen.
    • Beispiel 109
  • 5-Bromuracil-N¹-essigsäuremethylester
  • 5-Bromuracil (5,00 g; 26,2 mMol) und Kaliumcarbonat (7,23 g; 52,3 mMol) wurden in DMF (75 ml) suspendiert. Über einen Zeitraum von 5 min wurde Bromessigsäuremethylester (2,48 ml; 26,1 mMol) zugesetzt. Die Suspension wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Der feste Rückstand wurde zweimal mit DMF gewaschen und die vereinten Filtrate wurden im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand war ein Öl, das die Titelverbindung, DMF und einige nichtidentifizierte Verunreinigungen enthielt. Es ist nicht notwendig, die Titelverbindung vor der Hydrolyse zu reinigen. ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz): 8,55 (Verunreinigung); 8,27 (CBr=CHN); 8,02 (Verunreinigung); 4,76 (Verunreinigung); 4,70 (Verunreinigung); 4,62 (NCH&sub2;COOCH&sub3;); 3,78 (COOCH&sub3;); 2,96 (DMF); 2,80 (DMF). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz): 168,8 (COOCH&sub3;); 172,5 (CH=CBrCON); 161,6 (DMF); 151,9 (NCON); 145,0 (CO-CBr =CHN); 95,6 (COCBr=CHN); 52,6 (Verunreinigung); 52,5 (OCH&sub3;); 49,7 (Verunreinigung); 48,8 (NCH&sub2;COOMe); 43,0 (Verunreinigung); 36,0 (DMF). UV (Methanol; maxnm); 226; 278. IR (KBr; cm&supmin;¹; 3158s (-NH); 1743vs (-C=O, COOMe); 1701vs (-C=O, CONH); 1438vs (∂ CH, CH&sub3;O); 1223vs (-C-O, COOMe); 864 m (∂ CH, Br=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung): 265/263 (M + H).
    • Beispiel 110 (5-Bromuracil)essigsäure
  • Dem Öl des Rohprodukts aus Beispiel 109 wurde Wasser (30 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid (2 M, 60 ml) gelöst. Nach 10minütigem Rühren bei 0ºC wurde HCl (4 M, 45 ml) bis zu einem pH-Wert von 2 zugesetzt und die Titelverbindung fiel aus. Nach 50 min wurde der feste Rückstand durch Filtration isoliert, einmal mit kaltem Wasser gewaschen und anschließend im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 2,46 g (38%). Fp. 250-251ºC. Anal, für C&sub6;H&sub5;BrN&sub2;O&sub4;, gefunden (ber.): C: 28,78 (28,94); H: 2,00 (2,02); Br: 32,18 (32,09); N: 11,29 (11,25). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz): 12,55 (1H, s, COOH); 11,97 (1H, s, NH); 8,30 (1H, s, C=C-H); 4,49 (2H, s, NCH&sub2;COOH). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz): 169,4 (COOH); 159,8 (NHCOCBr=CH); 150,04 (NCON); 145,8 (COCBr=CHN); 94,6 (COCBr=CHN); 48,8 (NCH&sub2;COOH). UV (Methanol; maxnm); 226; 278. IR (KBr; cm&supmin;¹); 3187s (-NH); 1708vs (-C=O, COOH); 1687vs; 1654vs (-C=O, CONH); 1192 s (-C-O, COOH); 842 m (∂ CH, Br-C=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung, relative Intensität): 251/249 (M + H,5).
    • Beispiel 111 N-(Boc-aminoethyl)-N-(5-bromuracil)methylencarbonoylglycinethylester
  • Boc-aminoethylglycinethylester (1,80 g; 7,30 mMol) wurde in DMF (10 ml) gelöst. Es wurde Dhbt-OH (1,31 g; 8,03 mMol) zugesetzt, wobei sich ein Niederschlag bildete. Es wurde DMF (2 · 10 ml) zugesetzt, bis sich der Niederschlag löste. Das Produkt des Beispiels 110 (2,00 g; 8,03 mMol) wurde langsam zugesetzt, um eine Ausfällung zu vermeiden. Es wurde Methylenchlorid (30 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde auf 0ºC abgekühlt und anschließend filtriert. Der Niederschlag, DCU, wurde zweimal mit Methylenchlorid gewaschen. Dem vereinten Filtrat wurde Methylenchlorid (100 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde mit halb-gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (3 · 100 ml, H&sub2;O : gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung 1 : 1, v/v), anschließend mit verdünnter KHSO&sub4;- Lösung (2 · 100 ml, H&sub2;O : gesättigter KHSO&sub4;-Lösung 4 : 1, v/v) und abschließend mit gesättigter NaCl-Lösung (1 · 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat gewaschen, filtriert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt (etwa 15 mmHg und anschließend 1 mmHg). Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (35 ml) suspendiert, 45 min bei Raumtemperatur gerührt und filtriert (der Niederschlag war DCU). Dem Filtrat wurde bei 0ºC tropfenweise Petrolether (2 Volumen) zugesetzt, wobei ein Öl ausfiel. Die Flüssigkeit wurde dekantiert und das verbleibende Öl wurde in Methylenchlorid (20-50 ml) gelöst. Die Ausfällung wurde durch die Zugabe von Petrolether (2 Volumen) hervorgerufen. Dieses Verfahren wurde 5 mal wiederholt, bis eine Verunreinigung entfernt worden war. Die Verunreinigung kann auf DC, mit 10%MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; als Laufmittel, nachgewiesen werden. Das entstehende Öl wurde in Methylenchlorid (25 ml) gelöst und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, was die Verfestigung der Titelverbindung bewirkte. Ausbeute: 2,03 g (58%). Fp. 87-90ºC. Anal, für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub5;BrN&sub4;O&sub7;, gefunden (ber): C: 42,33 (42,78); H: 5,15 (5,28); Br: 17,20 (16,74); N: 1,69 (11,75). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz, J in Hz): 1,93 & 11,92 (1 H, s, C=ONHC=O); 8,09 & 8,07 (1 H, s, C=C-H); 7,00 & 6,80 (1 H, t, b, BocNH); 4,80 & 4,62 (2H, s, NCH&sub2;CON); 4,35 & 4,24 (2H, s, NCH&sub2;COOEt); 4,27-4,15 (2H, m's, COOCH&sub2;CH&sub3;O); 3,47-3,43 (2H, m's, BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 3,28- 3,25 & 3,12-3,09 (2H, m's, BocNHCH&sub2;CH&sub2;-N); 1,46 & 1,45 (9H, s, tBu); 1,26 & 1,32 (2H, t, J = 7,1, COOCH&sub2;CH&sub3;). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz): 169,3 & 169,0 (tBuOC=O); 167,4 & 167,1 (COOEt); 159,8 (C=C-CON); 155,9 (NCH&sub2;CON); 150,4 (NCON); 145,9 (COCBr-CHN); 94,5 (COCBr=CHN); 78,2 (Me&sub3;C); 61,3 & 60,7 (COCH&sub2;CH&sub3;); 49,1 & 48,0 (NCH&sub2;COOH); 48,0 & 47,0 (NCH&sub2;CON); 38,6 (BocNHCH&sub2;CH&sub2; N); 38,2 (BocNHCH&sub2;CH&sub2; N); 26,3 (C(CH&sub3;)&sub3;); 14,1 (COCH&sub2;CH&sub3;). UV (Methanol; maxnm): 226; 280. IR (KBr, cm&supmin;¹): 3200 ms, breit (-NH); 168vs, sehr breit (- C=O, COOH, CONH); 1250s (-C-O, COOEt); 1170 s (-C-O, COOtBu); 859m (∂ CH, Br-C=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung, relative Intensität): 479/477 (M+H.5); 423/421 (M + 2H - tBu, 8); 379/377 (M + 2H - Boc, 100): 233/231 (M - Gerüst, 20).
    • Beispiel 112 N-(Boc-aminoethyl)-N-(5-bromuracyl-N1-methylencarbonoyl)-glycin
  • Das Produkt des Beispiels 111 (1,96 g; 4,11 mMol) wurde durch Erhitzen in Methanol (30 ml) gelöst und anschließend auf 0ºC abgekühlt. Es wurde Natriumhydroxid (2 M, 30 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde 30 min gerührt. Es wurde HCl (1 M, 70 ml) bis zu einem pH-Wert von 2,0 zugesetzt. Die Wasser-Phase wurde mit Essigsäureethylester (3 · 65 ml + 7 · 40 ml) extrahiert. Die vereinten Essigsäureethylester- Extraktionen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung (500 ml) gewaschen. Die Essigsäureethylester-Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Ausbeute: 1,77 g (96%). Fp. 92-97ºC. Anal, für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub1;BrN&sub4;O&sub7;, gefunden (ber.): C: 40,79 (40,10); H: 5,15 (4,71); Br: 14,64 (17,70); N: 11,35 (12,47). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz; J in Hz): 12,83 (1H, s, COOH); 11,93 & 11,91 (1H, s, C=ONHC=O); 8,10 & 8,07 (1H, s, C=C-H); 7,00 & 6,81 (1H, t, b, BocNH); 4,79 & 4,61 (2H, s, NCH&sub2;CON); 4,37 & 4,25 (2H, s, NCH&sub2;COOH); 3,46-3,39 (2H, m's, BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 3,26-3,23 & 3,12-3,09 (2H, m's, BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 1,46 (9H, s, tBu). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz), 170,4 (tBuOC=O), 166,9 (COOH); 159,7 (C=C-CON); 155,8 (NCH&sub2;CON); 150,4 (NCON); 145,9 (COCBr=CHN); 94,4 (COCBr=CHN); 78,1 (Me&sub3;C); 49,1 & 48,0 (NCH&sub2;COOH); 47,7 & 47,8 (NCH&sub2;CON); 38,6 (BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 38,1 (BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 28,2 (C(CH&sub3;)&sub3;). UV (Methanol; maxnm); 226; 278. IR (KBr, cm&supmin;¹): 3194 ms, breit (-NH); 1686vs, sehr breit (-C=O COOH, CONH); 1250s (-C-O, COOH); 1170 s (-C-O, COOtBu); 863 m (∂ CH, Br-C=C- H). FAB-MS m/z (Zuordnung, relative Intensität): 449/451 (M + H, 70); 349/351 (M + 2H -Boc, 100); 231/233 (M - Gerüst, 20).
    • Beispiel 113 Uracil-N¹-essigsäuremethylester
  • Uracil (10,0 g; 89,2 mMol) und Kaliumcarbonat (24,7 g; 178 mMol) wurden in DMF (250 ml) suspendiert. Über einen Zeitraum von 5 min wurde Bromessigsäuremethylester (8,45 ml; 89,2 mMol) zugesetzt. Die Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und anschließend filtriert. Das DC (10% Methanol in Ethylenchlorid) wies auf eine unvollständige Umwandlung von Uracil hin. Der feste Rückstand wurde zweimal mit DMF gewaschen und die vereinten Filtrate wurden im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der Niederschlag wurde in Wasser (60 ml) suspendiert und es wurde HCl (2,5 ml; 4 M) bis zu einem pH-Wert von 2 zugegeben. Die Suspension wurde 30 min bei 0ºC gerührt und anschließend filtriert. Die ausgefallene Titelverbindung wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 9,91 g (60%). Fp. 182-183ºC. Anal, für C&sub6;H&sub8;N&sub2;O&sub4;, gefunden (ber.): C: 45,38 (45,66); H: 4,29 (4,38); N: 15,00 (15,21). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz; J in Hz): 1,47 (1H, s, NH); 7,68 (1H, d, JH-C=C-H = 7,9, CH=CHN); 5,69 (1H, d, JH- C=C-H = 7,9, CH=CHN); 4,59 (2H, s, NCH&sub2;COOMe); 3,76 (3H, s, COOCH&sub3;). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;, 250 MHz): 168,8 (COOMe); 164,0 (C=C-CON); 151,1 (NCON); 146,1 (COCH=CHN); 101,3 (COCH=CHN); 52,5 (COOCH&sub3;); 48,7 (NCH&sub2;COOMe). UV (Methanol; maxnm): 226; 261. IR (KBr; cm&supmin;¹): 3164s (-NH); 174Bvs (-C=O, COOMe); 1733vs (-C=O, CONH); 1450vs (∂ CH, CH&sub3;O); 1243vs (-C-O, COOMe); 701 m (∂ CH, H-C=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung): 185 (M + H).
    • Beispiel 114 Uracilessigsäure
  • Dem Produkt des Beispiels 113 (8,76 g; 47,5 mMol) wurde Wasser (90 ml), gefolgt von Natriumhydroxid (2 M, 40 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde 40 min erhitzt, bis sich der gesamte Methylester umgesetzt hatte. Nach 15minütigem Rühren bei 0ºC wurde Salzsäure (4 M, 25 ml) bis zu einem pH-Wert von 2 zugesetzt. Die Titelverbindung fiel aus und das Gemisch wurde nach 2-3 h filtriert. Der Niederschlag wurde einmal mit der Mutterlauge und zweimal mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute 6,66 g (82%). Fp. 288-289ºC. Anal, für C&sub6;H&sub6;N&sub2;O&sub4;, gefunden (ber.): C 42,10 (42,36); H: 3,43 (3,55); N: 16,25 (16,47). ¹H- NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz; J in Hz): 13,19 (1H, s, COOH); 11,41 (1H, s, NH); 7,69 (1H, d, JH-C=C-H = 7,8, JH-C-C-NH = 2,0, COCH=CHN); 4,49 (2H, s, NCH&sub2;COOH). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz): 169,9 (COOH); 163,9 (CH=CH-CON); 151,1 (NCON); 146,1 (COCH=CHN); 100,9 (COCH=CHN); 48,7 (NCH&sub2;COOH). UV (Methanol; maxnm): 246; 263. IR (KBr; cm&supmin;¹): 3122s (-NH); 1703vs (-C=O, COOH); 1698vs, 1692vs (-C=O, CONH); 1205vs (-C-O, COOH); 676 (∂ CH, H-C=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung): 171 (M + H).
    • Beispiel 115 N-(Bocaminoethyl)-N-(uracil-N¹-methylencarbonoyl)glycinethylester
  • (Bocaminoethyl)glycinethylester (2,00 g; 8,12 mMol) wurde in DMF (10 ml) gelöst. Es wurde Dhbt-OH (1,46 g; 8,93 mMol) zugesetzt und es bildete sich ein Niederschlag. Es wurde DMF (2 ml) zugesetzt, bis alles gelöst war. Das Produkt des Beispiels 114 (1,52 g; 8,93 mMol) wurde langsam zugesetzt, um eine Ausfällung zu vermeiden. Es wurde Methylenchlorid (30 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde auf 0ºC abgekühlt, wonach DDC (2,01 g: 9,74 mMol) zugesetzt wurde. Das Gemisch wurde 1 h bei 0ºC, 2 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Das ausgefallene DCU wurde zweimal mit Methylenchlorid gewaschen. Dem vereinten Filtrat wurde Methylenchlorid (100 ml) zugesetzt und die Lösung wurde mit halb-gesättigter NaHCO&sub3;- Lösung (3 · 100 ml, H&sub2;O : gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung 1 : 1, v/v), anschließend mit verdünnter KHSO&sub4;-Lösung (2 · 100 ml, H&sub2;O : gesättigter KHSO&sub4;-Lösung 4 : 1, v/v) und abschließend mit gesättigter NaCl-Lösung (1 · 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat gewaschen, filtriert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt (etwa 15 mmHg und anschließend etwa 1 mmHg). Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (32 ml) suspendiert und 35 min bei Raumtemperatur und 30 min bei 0ºC gerührt und anschließend filtriert. Der Niederschlag (DCU) wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Dem vereinten Filtrat wurde bei 0ºC tropfenweise Petrolether (2 Volumen) zugesetzt, wobei sich ein Öl abtrennte. Das Gemisch wurde dekantiert, das verbleibende Öl wurde anschließend in Methylenchlorid (20 ml) gelöst und dann erneut durch die Zugabe von Petrolether (2 Volumen) ausgefällt. Dieses Verfahren wurde 5 mal wiederholt, bis eine Verunreinigung entfernt worden war. Die Verunreinigung kann durch DC, mit 10% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; als Laufmittel, nachgewiesen werden. Das entstehende Öl wurde in Methylenchlorid (20 ml) gelöst und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, was die Verfestigung der Titelverbindung bewirkte. Ausbeute: 1,71 g (53%). Fp. 68,5-75,7ºC. Anal, für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub6;N&sub4;O&sub7;, gefunden (ber.): C: 50,61 (51,25); H: 6,48 (6,58); N: 13,33 (14,06). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;, 250 MHz; J in Hz): 11,36 (1H, s, C=ONHC=O); 7,51 & 7,47 (1H, d, JH-C=C-H = 6,1, COCH=X-H); 7,00 & 6,80 (1H, t, b, BocNH); 5,38 & 5,66 (1H, d, JH-C=C-H = 5,7, COCH=CH); 4,78 & 4,60 (2H, s, NCH&sub2;CON); 4,37 & 4,12 (2H, s, NCH&sub2;COOEt); 4,30- 4,15 (2H, m's, COOCH&sub2;CH&sub3;); 3,49-3,46 (2H, m's, BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 3,27-3,23 & 3,11-3,09 (2H, m's, BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 1,46 (9H, s, tBu); 1,39-1,23 (3H, m's, COOCH&sub2;CH&sub3;). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz): 169,4 & 169,0 (tBuOC=O); 167,6 & 167,3 (COOEt); 163,8 (CH=CHCON); 155,8 (NCH&sub2;CON); 151,0 (NCON); 146,3 (COCH=CHN); 100,8 (COCH=CHN); 78,1 (Me&sub3;C); 61,2 & 60,6 (COOCH&sub2;CH&sub3;); 49,1 (NCH&sub2;COOEt); 47,8 & 47,0 (NCH&sub2;CON); 38,6 (BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 38,1 & 37,7 (BocNHCH&sub2; N); 28,2 (C(CH&sub3;)&sub3;); 14,1 (CO-OCH&sub2;CH&sub3;). UV (Methanol; maxnm): 226; 264. IR (KBr; cm&supmin;¹): 3053m (-NH); 1685vs, sehr breit, (-C=O, COOH, CONH); 1253s (-C-O, COOEt); 1172s (-C-O, COOtBu); 718w (∂ CH, C-C-C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung, relative Intensität): 399 (M + H, 35); 343 (M + 2H -tBu, 100); 299 (M + 2H - BOG, 100); 153 (M - Gerüst, 30).
    • Beispiel 116 N-(Bocaminoethyl)-N-(uracilmethylencarbonoyl)-glycin
  • Das Produkt des Beispiels 115 (1,56 g; 3,91 mMol) wurde in Methanol (20 ml) gelöst und anschließend auf 0ºC abgekühlt. Es wurde Natriumhydroxid (2 M, 20 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde 75 min bei 0ºC gerührt. Es wurde HCl (1 M, 46 ml) bis zu einem pH-Wert von 2,0 zugesetzt. Die Wasser-Phase wurde mit Essigsäureethylester (3 · 50 ml + 7 · 30 ml) extrahiert. Die vereinten Essigsäuireethylester- Extraktionen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung (360 ml) gewaschen. Die Essigsäureethylester-Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Ausbeute: 0,55 g (38%). Fp. 164-170ºC. Anal, für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub2;N&sub4;O&sub7;, gefunden (ber.): C: 46,68 (48,65); H: 6,03 (5,99); N: 14,61 (15,13). ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz; J in Hz): 12,83 (1H, s, COOH); 11,36 (1H, s, C=ONHC=O); 7,52-7,45 (1H, m's, COCH=CHN); 7,00 & 6,82 (1H, t, b, BocNH); 5,67-5,62 (1H, m's, COH =CHN); 4,76 & 4,58 (2H, s, NCH&sub2;CON); 4,26 & 4,05 (2H, s, NCH&sub2;COOH); 3,46-3,39 (2H, m's, BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 3,25-3,23 & 3,15-3,09 (2H, m's, BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 1,46 (9H, s, tBu). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;; 250 MHz), 170,5 (tBuOC=O), 167,2 (COOH); 163,9 (C=C-CON), 155,8 (NCH&sub2;CON); 151,1 (NCON); 146,4 (COCH=CHN); 100,8 (COCH=CHN); 78,1 (Me&sub3;C); 49,1 & 47,8 (NCH&sub2;COOH); 47,6 & 46,9 (NCH&sub2;CON); 38,6 (BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 38,1 & 37,6 (BocNHCH&sub2;CH&sub2;N); 28,2 (C(CH&sub3;)&sub3;). UV (Methanol; maxnm); 226; 264. IR (KBr, cm&supmin;¹): 3190 (-NH); 1685vs, sehr breit (-C=O, COOH, CONH); 1253 (-C-O, COOH); 1171s (-C-O, COOtBu); 682w (∂ CH, H-C=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung, relative Intensität): 371 (M+ H, 25); 271 (M + H - Boc, 100).
    • Beispiel 117 H-U10-LysNH&sub2;
  • Die Synthese der Titelverbindung wurde unter Anwendung des "Syntheseprotokolls 10" durchgeführt. Die Synthese wurde auf annähernd 100 mg Lys(CIZ)-MBHA-Harz initiiert. Das Rohprodukt (12 mg) war für die Hybridisierungsversuche ausreichend rein. Das Hybrid zwischen 5'-(dA)10 und H-U10 wies einen Tm-Wert von 67,5ºC auf.
    • Beispiel 118 Entfernung der Schutzgruppen und Spaltung von H-[Caeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; durch Trifluormethansulfonsäure (TFMSA). Ein alternatives Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppen und Spaltung durch Fluorwasserstoff (HF) (a) Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen durch ein "low acidity" TFMSA-TFA-DMS-Verfahren
  • Eine Menge von ca. 0,4 g feuchtem Boc-[Caeg]&sub1;&sub0;-Lys(CIZ)-MBHA-Harz (hergestellt in einem der vorstehend genannten Beispiele) wurde in ein 5 ml-Festphasen- Reaktionsgefäß gegeben. Die N-terminale Boc-Gruppe wurde gemäß dem nachfolgenden Protokoll entfernt: (1) 50% TFA/CH&sub2;Cl&sub2;, 2 · 1 min und 1 · 30 min. (2) 100% TFA, 2 · 1 min und Abtropfen. Um die auf Benzyl-basierenden Seitenketten- Schutzgruppen zu entfernen, wurde ein sogenanntes "niedrig-saures" TFMSA- Verfahren wie folgt durchgeführt: Es wurden eine Stammlösung (A), enthaltend 5 ml TFA-DMS-m-Kresol (2 : 6 : 2, v/v/v) und eine Stammlösung (B), enthaltend TFA- TFMSA (8 : 2, v/v), hergestellt. Als nächstes wurden folgende Schritte durchgeführt: (3) 1 ml der Stammlösung (A) wurde unter 2minütigem Schütteln dem PNA-Harz in dem Reaktionsgefäß zugesetzt. Kein Abtropfen; (4) 1 ml der Stammlösung (B) (mit Eis/Wasser gekühlt) wurde über einen Zeitraum von 40 min in 200 ul-Portionen pro jeweils 10 Minuten zugesetzt und das Schütteln wurde weitere 50 min fortgesetzt; (5) Abtropfen und Waschen mit 100% TFA, 5 · 1 min und Abtropfen.
    • (b) Spaltung von dem Harz durch ein "high acidity" TFMSA-TFA-Verfahren
  • Um die vorstehend erwähnte Schutzgruppen-freie PNA von dem Harz zu spalten, wurde ein sogenanntes "hoch-saures" TFMSA-Verfahren wie folgt durchgeführt: Es wurde eine Stammlösung (C), enthaltend m-Kresol-TFA (2 : 8, v/v) hergestellt. Als nächstes wurden folgende Schritte durchgeführt: (6) 1 ml der Stammlösung (C) wurde unter 2minütigem Schütteln dem Schutzgruppen-freien PNA-Harz in dem SPPS- Reaktionsgefäß zugesetzt; (7) 1 ml der Stammlösung (B) (mit Eis/Wasser gekühlt) wurde über einen Zeitraum von 30 min in 200 ul-Portionen zugesetzt und das Schütteln wurde weitere 150 min fortgesetzt; (5) die 2 ml Lösung in dem Reaktionsgefäß wurde durch den Filter in eine 20 ml Diethylether-Lösung, die mit Trockeneis/Isopropanol gekühlt wurde, "ausgetrieben". Um den Ausfällungsverlauf zu vervollständigen, wurden dem Säure-Ether-Gemisch tropfenweise 200 ul wasserfreies Pyridin zugesetzt; (8) 5 min Zentrifugation bei 3000 U/min. (9) der Überstand wird dekantiert und der Niederschlag wird dreimal mit kaltem Diethylether gewaschen, getrocknet, in Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
    • (c) Reinigung und Identifizierung von H-[Caeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2;
  • Eine HPLC-Analyse zeigte ein gutes Rohprodukt mit guter Reinheit und einem Profil, das zum großen Teil mit dem identisch ist, wie es durch die HF-Spaltung von H- [Caeg]&sub1;&sub0;-Lys-NH&sub2; erhalten wurde, mit Ausnahme eines zusätzlichen Peaks, der natürlich auf das Pyridin-TFMSA-Salz zurückzuführen ist, das im Chromatogramm frühzeitig eluiert. Die Reinigung und Identifizierung wird gemäß den Standardverfahren durchgeführt.
  • Der Fachmann wird erkennen, daß zahlreiche Änderungen und Modifizierungen der bevorzugten Ausführungsformen möglich sind und daß derartige Veränderungen und Modifizierungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgen können. Es ist daher erwünscht, daß die beigefügten Ansprüche alle derartigen äquivalenten Variationen umfassen, soweit sie in den Erfindungsgedanken und Umfang der vorliegenden Erfindung fallen.

Claims (22)

1. Verbindung der Formel
wobei
n mindestens 2 ist,
jedes L¹-Ln unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub4;)Alkanoyl, natürlich vorkommenden Nukleobasen, nicht-natürlich vorkommenden Nukleobasen, aromatischen Einheiten, DNA- Interkalatoren, Nukleobase-bindenden Gruppen und Reporterliganden ausgewählt ist, wobei mindestens eines von L¹-Ln eine natürlich vorkommende Nukleobase, eine nicht-natürlich vorkommende Nukleobase, ein DNA- Interkalator oder eine Nukleobase-bindende Gruppe ist,
jedes A¹-An eine Einfachbindung, eine Methylengruppe oder ein Rest der Formel
ist, wobei
X O, S, Se, NR³, CH&sub2; oder C(CH&sub3;)&sub2; ist,
Y eine Einfachbindung, O, S oder NR&sup4; ist,
jedes von p und q eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, wobei die Summe p + q nicht größer als 6 ist,
jedes von r und s Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, wobei die Summe r + s nicht größer als 5 ist,
jedes R¹ und R² unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, welches Hydroxy- oder Alkoxy- oder Alkylthio-substituiert sein kann, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Amino und Halogen, ausgewählt ist, und
jedes R³ und R&sup4; unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy- oder Alkoxy- oder Alkylthio- substituiertem (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio und Amino, ausgewählt ist,
jedes B¹-Bn N oder R³N&spplus; ist, wobei R³ wie vorstehend definiert ist, jedes C¹-Cn CR&sup6;R&sup7;, CHR&sup6;CHR&sup7; oder CR&sup6;R&sup7;CH&sub2; ist, wobei R&sup6; Wasserstoff ist und R&sup7; aus der Gruppe, bestehend aus den Seitenketten natürlich vorkommender alpha-Aminosäuren, ausgewählt ist, oder R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub2;-C&sub6;)Alkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub6;)Alkoxy, (C&sub1;-C&sub6;)Alkylthio, NR³R&sup4; und SR&sup5;, ausgewählt sind, wobei R³ und R&sup4; wie vorstehend definiert sind und R&sup5; Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub6;)Alkyl, Hydroxy-, Alkoxy- oder Alkylthio-substituiertes (C&sub1;- C&sub6;)Alkyl ist, oder R&sup6; und R&sup7; zusammen ein alicyclisches oder heterocyclisches System vervollständigen,
jedes D¹-Dn CR&sup6;R&sup7;, CH&sub2;CR&sup6;R&sup7; oder CHR&sup6;CHR&sup7; ist, wobei R&sup6; und R&sup7; wie vorstehend definiert sind,
jedes G¹-Gn-1 -NR³CO- in beiden Orientierungen ist, wobei R³ wie vorstehend definiert ist,
Q -CO&sub2;H, -CONR'R", -SO&sub3;H oder -SO&sub2;NR'R" oder ein aktiviertes Derivat von -CO&sub2;H oder -SO&sub3;H ist und
I -NHR'''R'''' oder -NR'''C(O)R'''' ist, wobei R', R", R'''und R'''' unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aminoschutzgruppen, Reporterliganden, Interkalatoren, Chelatbildnern, Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Steroiden, Oligonukleotiden und löslichen und nicht-löslichen Polymeren, ausgewählt sind.
2. Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel
wobei jedes L unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus den Nukleobasen Thymin, Adenin, Cytosin, Guanin und Uracil, ausgewählt ist,
jedes R&sup7;' Wasserstoff ist und
n eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist,
Rh OH, NH&sub2; oder -NHLysNH&sub2; ist und
Ri H oder COCH&sub3; ist.
3. Verbindung einer der folgenden Formeln,
wobei
L aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub4;)Alkanoyl, natürlich vorkommenden Nukleobasen, nicht-natürlich vorkommenden Nukleobasen, aromatischen Einheiten, DNA-Interkalatoren, Nukleobasebindenden Gruppen und Reporterliganden, ausgewählt ist und Aminogruppen gegebenenfalls durch Aminoschutzgruppen geschützt sind,
A eine Einfachbindung oder ein Rest der Formel
ist, wobei
X O, S, Se, NR³, CH&sub2; oder C(CH&sub3;)&sub2; ist,
Y eine Einfachbindung, O, S oder NR&sup4; ist,
jedes von p und q Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, wobei die Summe p + q nicht größer als 10 ist,
jedes von r und s Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, wobei die Summe r + s nicht größer als 10 ist,
jedes R¹ und R² unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy- oder Alkoxy- oder Alkylthio- substituiertem (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Amino und Halogen, ausgewählt ist und
jedes R³ und R&sup4; unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy- oder Alkoxy- oder Alkylthio- substituiertem (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio und Amino, ausgewählt ist,
B N oder R³N&spplus; ist, wobei R³ wie vorstehend definiert ist,
jedes C CR&sup6;R&sup7;, CHR&sup6;CHR&sup7; oder CR&sup6;R&sup7;CH&sub2; ist, wobei R&sup6; Wasserstoff ist und R&sup7; aus der Gruppe, bestehend aus den Seitenketten natürlich vorkommender alpha-Aminosäuren, ausgewählt ist, oder R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub2;-C&sub6;)Alkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub6;)Alkoxy, (C&sub1;-C&sub6;)Alkylthio, NR³R&sup4; und SR&sup5;, ausgewählt sind, wobei R³ und R&sup4; wie vorstehend definiert sind, und R&sup5; Wasserstoff oder (C&sub1;-C&sub6;)Alkyl, Hydroxy-, Alkoxy-, oder Alkylthio- substituiertes (C&sub1;-C&sub6;)Alkyl ist, oder R&sup6; und R&sup7; zusammen ein alicyclisches oder heterocyclisches System vervollständigen,
jedes D CR&sup6;R&sup7;, CH&sub2;CR&sup6;R&sup7; oder CHR&sup6;CHR&sup7; ist, wobei R&sup6; und R&sup7; wie vorstehend definiert sind,
jedes E COOH oder ein aktiviertes oder geschütztes Derivat davon ist und
jedes F NHR³ oder NPgR³ ist, wobei R³ wie vorstehend definiert ist und Pg eine Aminoschutzgruppe ist.
4. Verbindung nach Anspruch 3 der Formel
wobei
L aus der Gruppe, bestehend aus den Nukleobasen Thymin, Adenin, Cytosin, Guanin, Uracil und geschützten Derivaten davon, ausgewählt ist,
R&sup7;' Wasserstoff ist,
E COOH oder ein aktiviertes oder geschütztes Derivat davon ist und
F NH&sub2; oder NHPg ist, wobei Pg eine Aminoschutzgruppe ist.
5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:
A) Bereitstellen eines Polymersubstrats, wobei das Polymer mit einer Gruppe funktionalisiert ist, die zur Ausbildung einer Verankerungsverknüpfung mit einer Aminosäure befähigt ist,
B) Koppeln des Polymers mit einer ersten Aminosäure durch die Verankerungsverknüpfung, wobei die erste Aminosäure die Formel (IV) aufweist
wobei
L aus der Gruppe, bestehend aus natürlich vorkommenden Nukleobasen, nicht-natürlich vorkommenden Nukleobasen, aromatischen Einheiten, DNA-Interkalatoren, Nukleobase-bindenden Gruppen, heterocyclischen Einheiten und Reporterliganden, ausgewählt ist und Aminogruppen gegebenenfalls durch Aminoschutzgruppen geschützt sind,
A eine Einfachbindung oder ein Rest der Formel
ist, wobei
X O, S, Se, NR³, CH&sub2; oder C(CH&sub3;)&sub2; ist,
Y eine Einfachbindung, O, S oder NR&sup4; ist,
p und q Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 sind, wobei die Summe p + q nicht größer als 10 ist,
r und s Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 sind, wobei die Summe r + s nicht größer als 10 ist,
R¹ und R² unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy- oder Alkoxy- oder Alkylthio-substituiertem (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Amino und Halogen, ausgewählt sind und
R³ und R&sup4; unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy- oder Alkoxy- oder Alkylthio-substituiertem (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio und Amino, ausgewählt sind,
B N oder R³N&spplus; ist, wobei R³ wie vorstehend definiert ist,
C CR&sup6;R&sup7;, CHR&sup6;CHR&sup7; oder CR&sup6;R&sup7;CH&sub2; ist, wobei R&sup6; Wasserstoff ist und R&sup7; aus der Gruppe, bestehend aus den Seitenketten natürlich vorkommender alpha-Aminosäuren, ausgewählt ist, oder R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C&sub2;- C&sub6;)Alkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub6;)Alkoxy, (C&sub1;- C&sub6;)Alkylthio, NR³R&sup4; und SR&sup5;, ausgewählt sind, wobei R³ und R&sup4; wie vorstehend definiert sind und R&sup5; Wasserstoff oder (C&sub1;-C&sub6;)Alkyl, Hydroxy-, Alkoxy-, oder Alkylthio-substituiertes (C&sub1;-C&sub6;)Alkyl ist, oder R&sup6; und R&sup7; zusammen ein alicyclisches oder heterocyclisches System vervollständigen,
D CR&sup6;R&sup7;, CH&sub2;CR&sup6;R&sup7; oder CHR&sup6;CHR&sup7; ist, wobei R&sup6; und R&sup7; wie vorstehend definiert sind,
E COOH oder ein aktiviertes oder geschütztes Derivat davon ist und F NPgR³ ist, wobei R³ wie vorstehend definiert ist und Pg eine Aminoschutzgruppe ist,
C) Entfernen der Aminoschutzgruppe von der gekoppelten ersten Aminosäure, um eine freie Aminogruppe zu erzeugen, und
D) Umsetzen der freien Aminogruppe mit einer zweiten Aminosäure der Formel (IV), um eine Peptidkette zu bilden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, weiter umfassend die Schritte:
E) Entfernen der Aminoschutzgruppe von der zweiten Aminosäure, um eine endständige freie Aminogruppe an der Peptidkette zu erzeugen, und
F) Umsetzen der freien Aminogruppe an der Peptidkette mit einer weiteren Aminosäure der Formel (IV), um die Peptidkette zu verlängern.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Schritte E und F mehrfach durchgeführt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6, weiter umfassend das Entfernen mindestens einer an den Aminosäureeinheiten der Peptidkette verbleibenden Schutzgruppe.
9. Verfahren nach Anspruch 5, weiter umfassend das Spalten der Verankerungsverknüpfung, ohne die Peptidkette wesentlich abzubauen.
10. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polymersubstrat Polystyrol, Polyacrylamid, Siliciumdioxid, ein Verbundmaterial, Baumwolle oder ein Derivat davon enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die zur Bildung der Verankerungsverknüpfung befähigte chemische Gruppe Chlor-, Brom- und Iod-substituiertes Alkyl, Amino-substituiertes Alkyl, Amino- und Aryl-substituiertes Alkyl, Amino- und Alkylaryl-substituiertes Alkyl, Hydroxy-substituiertes Alkyl oder ein Derivat davon mit einer Spacergruppe ist, welche im wesentlichen ohne Abbau des Polypeptids gespalten werden kann.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Chlorsubstituierte Alkyl Chlormethyl ist, das Amino-substituierte Alkyl Aminomethyl ist, das Amino- und Alkyl- substituierte Aryl α-Aminobenzyl ist, das Amino- und Alkylaryl-substituierte Alkyl aus der Gruppe, bestehend aus α-Amino-3- und α-Amino-4- methylbenzyl, ausgewählt ist und das Hydroxy-substituierte Alkyl Hydroxymethyl ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei
die chemische Gruppe von einer Amino-enthaltenden Einheit abgeleitet ist, die aus Amino-substituiertem Alkyl, Amino- und Aryl-substituiertem Alkyl und Amino- und Alkylaryl-substituiertem Alkyl ausgewählt ist, und
die chemische Gruppe eine Spacergruppe einschließt, die aus der Gruppe, bestehend aus 4-(Haloalkyl)aryl-Niederalkansäuren, Boc-Aminoacyl-4- (oxymethyl)aryl-Niederalkansäuren, N-Boc-p-acylbenzhydrylaminen, N-Boc- 4'-(Niederalkyl)-p-acylbenzhydrylaminen, N-Boc-4'-(Niederalkoxy)-p- acylbenzhydrylaminen und 4-Hydroxymethylphenoxy-Niederalkansäuren, abgeleitet ist.
14. Verfahren zur sequenzspezifischen Erkennung eines doppelsträngigen Polynukleotids, umfassend das Inkontaktbringen des Polynukleotids mit einer Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und welche an einen Strang des Polynukleotids bindet, wodurch der andere Strang verdrängt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Verbindung ein Oligomer ist, umfassend ein homogenes oder heterogenes Rückgrat, mit welchem natürlich vorkommende Nukleobasen, nicht-natürlich vorkommende Nukleobasen oder andere Liganden verknüpft sind, welche einzeln durch Wasserstoffbrückenbindungen an mindestens eine natürliche Nukleobase in dem Polynukleotidstrang binden.
16. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung in der Therapie.
17. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in der Modulation der Expression eines Gens in einem Organismus durch Verabreichung der Zusammensetzung an den Organismus, so daß die Verbindung spezifisch an sich von dem Gen ableitende DNA oder RNA bindet.
18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Modulation die Inhibierung der Transkription des Gens oder der Replikation des Gens umfaßt.
19. Verwendung nach Anspruch 17 oder Anspruch 18 in der Behandlung von Leiden, die mit der unerwünschten Produktion eines Proteins zusammenhängen, oder zur Induktion des Abbaus von RNA oder DNA in Zellen eines Organismus.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19 zum Abtöten von Zellen oder Viren.
21. Verfahren zum Abtöten von Viren oder Zellen in vitro, umfassend das Inkontaktbringen der Zellen oder des Virus mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welche spezifisch an einen Teil des Genoms der Zellen oder des Virus bindet.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und mindestens einen pharmazeutisch wirksamen Träger, ein Bindemittel, ein Verdickungsmittel, ein Verdünnungsmittel, einen Puffer, ein Konservierungsmittel oder ein grenzflächenaktives Mittel.
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Families Citing this family (361)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5852182A (en) * 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals Inc. Thiol-derivatized oligonucleosides
US5783682A (en) * 1990-07-27 1998-07-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mimics having nitrogen-containing linkages
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
DK51092D0 (da) * 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5641625A (en) * 1992-05-22 1997-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids
US5766855A (en) * 1991-05-24 1998-06-16 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity and sequence specificity
US6414112B1 (en) 1991-05-24 2002-07-02 Ole Buchardt Peptide nucleic acids having 2,6-diaminopurine nucleobases
US6441130B1 (en) 1991-05-24 2002-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linked peptide nucleic acids
US5539082A (en) * 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) * 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US6451968B1 (en) * 1991-05-24 2002-09-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acids
US7223833B1 (en) 1991-05-24 2007-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
US6713602B1 (en) * 1991-05-24 2004-03-30 Ole Buchardt Synthetic procedures for peptide nucleic acids
US6228982B1 (en) * 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
EP0616612A4 (de) 1991-12-12 1995-01-11 Gilead Sciences Inc Nukleasestabile und bindungsfähige oligomere und verfahren zu ihrer verwendung.
MX9207334A (es) * 1991-12-18 1993-08-01 Glaxo Inc Acidos nucleicos peptidicos y formulacion farma- ceutica que los contiene
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
DE69233599T2 (de) * 1991-12-24 2006-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad Unterbrochene 2'-modifizierte Oligonukleotide
US5700922A (en) * 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US6033884A (en) * 1992-03-20 2000-03-07 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporter systems and methods of use
US6770738B1 (en) 1992-05-22 2004-08-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Higher order structure and binding of peptide nucleic acids
GB9211979D0 (en) * 1992-06-05 1992-07-15 Buchard Ole Uses of nucleic acid analogues
US6350853B1 (en) 1993-04-26 2002-02-26 Peter E. Nielsen Conjugated peptide nucleic acids having enhanced cellular uptake
US7825215B1 (en) * 1993-04-26 2010-11-02 Peter E. Nielsen Substituted nucleic acid mimics
GB9311386D0 (en) * 1993-06-02 1993-07-21 Pna Diagnostics As Nucleic acid analogue assay procedures
WO1994028720A1 (en) * 1993-06-11 1994-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers for modulating ras oncogene
AU7523794A (en) * 1993-08-09 1995-02-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers for modulating viral processes
US5527675A (en) * 1993-08-20 1996-06-18 Millipore Corporation Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
DE4331012A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
DE4331011A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit C-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
EP0720615B1 (de) * 1993-09-21 2000-07-26 Amersham Pharmacia Biotech UK Limited Elongation, amplifikation und sequenzierung unter verwendung eines chimären oligonucleotids
US6710164B1 (en) * 1993-11-22 2004-03-23 Peter E. Nielsen Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
GB2284208A (en) * 1993-11-25 1995-05-31 Pna Diagnostics As Nucleic acid analogues with a chelating functionality for metal ions
GB2284209A (en) 1993-11-25 1995-05-31 Ole Buchardt Nucleic acid analogue-induced transcription of RNA from a double-stranded DNA template
GB2289677A (en) * 1993-12-06 1995-11-29 Pna Diagnostics As Labelling of nucleic acid analogue-peptide chimerae
GB2285445A (en) * 1993-12-06 1995-07-12 Pna Diagnostics As Protecting nucleic acids and methods of analysis
JPH11503713A (ja) * 1993-12-22 1999-03-30 パーセプティブ・バイオシステムズ・インコーポレーテッド ペプチド核酸合成用のグアニンシントンと、その調製方法
US6133444A (en) * 1993-12-22 2000-10-17 Perseptive Biosystems, Inc. Synthons for the synthesis and deprotection of peptide nucleic acids under mild conditions
DK145493D0 (da) * 1993-12-23 1993-12-23 Dako As Antistof
US5539083A (en) * 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US6919441B2 (en) 1994-03-14 2005-07-19 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Polyamide-oligonucleotide derivatives, their preparation and use
DE4408534A1 (de) * 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag Substituierte N-Ethyl-Glycinderivate zur Herstellung von PNA und PNA-/DNA-Hybriden
DE4408533A1 (de) 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag PNA-Synthese unter Verwendung einer basenlabilen Amino-Schutzgruppe
DE4408531A1 (de) * 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag PNA-Synthese unter Verwendung einer gegen schwache Säuren labilen Amino-Schutzgruppe
DE4408528A1 (de) * 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag Peptid-Oligonucleotid-Derivate, deren Herstellung und Verwendung
AU2369895A (en) * 1994-04-29 1995-11-29 Perseptive Biosystems, Inc. Activated esters of 1-phenylpyrazolin-5-one for labelling amine-functionalized molecules
JPH10500310A (ja) * 1994-05-19 1998-01-13 ダコ アクティーゼルスカブ 淋菌及びトラコーマ クラミジアの検出のためのｐｎａ プローブ
US5629152A (en) * 1994-08-01 1997-05-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Trisubstituted β-lactams and oligo β-lactamamides
DE4427980A1 (de) * 1994-08-08 1996-02-15 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere für Therapie und Diagnostik
US6558633B1 (en) * 1994-09-21 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chemical reaction apparatus and methods
ES2181799T3 (es) * 1994-10-06 2003-03-01 Isis Pharmaceuticals Inc Conjugados de acidos peptido nucleicos.
US5629178A (en) * 1994-10-28 1997-05-13 Genetics & Ivf Institute Method for enhancing amplification in the polymerase chain reaction employing peptide nucleic acid (PNA)
UA48150C2 (uk) * 1994-11-02 2002-08-15 Ай-Сі-Ен Фармасьютикалз Похідні амінокислот або аміноспиртів, олігонуклеотид
JPH10509947A (ja) * 1994-11-14 1998-09-29 カイロン コーポレイション サブモノマーアプローチによるペプチド核酸（ｐｎａ▲下ｓ▼）およびアナログの合成
EP0795032A2 (de) * 1994-12-22 1997-09-17 Abbott Laboratories Verfahren zur immobilisierung von oligonukleotiden auf festen trägermaterial und verfahren zur anwendung träger gebundener oligonukleotiden
DK0815259T3 (da) * 1995-03-04 2001-09-17 Pna Diagnostics As Modulation af nucleinsyre-bindingspartneres bindingsegenskaber
US6475721B2 (en) * 1995-03-04 2002-11-05 Boston Probes, Inc. Sequence specific detection of nucleic acids using a solid carrier bound with nucleic acid analog probes
US6465650B1 (en) 1995-03-13 2002-10-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Substituted N-ethylglycine derivatives for preparing PNA and PNA/DNA hybrids
US6251939B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Promega Biosciences, Inc. Carbamate-based cationic lipids
JP2001518054A (ja) * 1995-06-07 2001-10-09 パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレーテッド Ｐｎａ−ｄｎａキメラと、このキメラ合成用のｐｎａシントン
JPH11511642A (ja) * 1995-06-22 1999-10-12 ダコ アクティーゼルスカブ Ｐｎａ／核酸複合体に結合し得る組換え抗体
WO1996014341A1 (en) * 1995-06-22 1996-05-17 Dako A/S Monoclonal antibody capable of binding to pna/nucleic acid complexes
GB9519299D0 (en) * 1995-09-21 1995-11-22 Farrar Gwyneth J Genetic strategy
EP1477572A3 (de) * 1995-10-06 2006-02-15 Perseptive Biosystems, Inc. Verfahren und Testsystem zur Hybridisierungsanalyse unter Verwendung von Peptidnukleinsäure-sonden
DE69634696T2 (de) * 1995-10-06 2006-01-19 PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham Verfahren und testsystem zur hybridisierungsanalyse unter verwendung von peptidnukleinsäure-sonden
EP0870055B1 (de) 1995-10-12 2007-05-16 LANSDORP, Peter, M. Verfahren zum nachweis von mehrfachkopien einer wiederholungssequenz in einem nukleinsäuremolekül
US6001966A (en) * 1995-10-19 1999-12-14 Proligo Llc Method for solution phase synthesis of oligonucleotides and peptides
US5874532A (en) 1997-01-08 1999-02-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for solution phase synthesis of oligonucleotides and peptides
WO1997014793A1 (en) * 1995-10-20 1997-04-24 Trustees Of Boston University Nucleic acid clamps
US5888733A (en) * 1995-11-16 1999-03-30 Dako A/S In situ hybridization to detect specific nucleic acid sequences in eucaryotic samples
AU7210196A (en) * 1995-11-16 1997-06-05 Dako A/S In situ hybridization to detect specific nucleic acid sequences in eucaryotic samples
CA2190430A1 (en) * 1995-12-12 1997-06-13 Margret Barbara Basinski Method for measuring genetic messages
US6180767B1 (en) 1996-01-11 2001-01-30 Thomas Jefferson University Peptide nucleic acid conjugates
US20030069195A1 (en) * 1996-03-01 2003-04-10 Farrar Gwenyth Jane Suppression of polymorphic alleles
US6020126A (en) * 1996-03-21 2000-02-01 Hsc, Reasearch And Development Limited Partnership Rapid genetic screening method
CA2250923A1 (en) * 1996-03-26 1997-10-02 Gabriella Zupi Oligonucleotide treatments and compositions for human melanoma
US20040234999A1 (en) * 1996-04-02 2004-11-25 Farrar Gwenyth Jane Genetic suppression and replacement
US8551970B2 (en) * 1996-04-02 2013-10-08 Optigen Patents Limited Genetic suppression and replacement
GB9606961D0 (en) 1996-04-02 1996-06-05 Farrar Gwyneth J Genetic strategy III
GB9608803D0 (en) * 1996-04-27 1996-07-03 Univ Newcastle Mitochondrial dna defects
SE506700C2 (sv) 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
US9096636B2 (en) * 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050032068A1 (en) * 2002-11-05 2005-02-10 Prakash Thazha P. Sugar and backbone-surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050042647A1 (en) * 1996-06-06 2005-02-24 Baker Brenda F. Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050118605A9 (en) * 1996-06-06 2005-06-02 Baker Brenda F. Oligomeric compounds having modified bases for binding to adenine and guanine and their use in gene modulation
US20040171030A1 (en) * 1996-06-06 2004-09-02 Baker Brenda F. Oligomeric compounds having modified bases for binding to cytosine and uracil or thymine and their use in gene modulation
ATE311402T1 (de) * 1996-07-24 2005-12-15 Buchardt Dorte Peptidnukleinsäuren mit erhöhter bindungsaffinität, sequenzspezifität und löslichkeit
US5858683A (en) 1996-08-30 1999-01-12 Matritech, Inc. Methods and compositions for the detection of cervical cancer
DE19637339A1 (de) * 1996-09-13 1998-03-19 Hoechst Ag Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren
US5919638A (en) * 1996-10-08 1999-07-06 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting prostate tumors
US5908845A (en) * 1996-10-30 1999-06-01 Segev; David Polyether nucleic acids
US20050202499A1 (en) 1996-10-31 2005-09-15 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6444202B1 (en) 1996-11-25 2002-09-03 Bundesrepublic Deutschland, Vertreten Durch Den Bundesminister Fur Gesundheit Processed polypeptides with IL-16 activity, processes for their production and their use
US6117973A (en) 1997-02-24 2000-09-12 Georgia Tech Research Corp. PNA monomers with electron donor or acceptor
AU6822598A (en) * 1997-02-24 1998-09-09 Georgia Tech Research Corporation Method for determining a nucleic acid
US6692912B1 (en) * 1997-03-05 2004-02-17 Matrix Technologies Corporation Nucleic acid-containing polymerizable complex
US5932711A (en) * 1997-03-05 1999-08-03 Mosaic Technologies, Inc. Nucleic acid-containing polymerizable complex
US6015887A (en) * 1997-04-11 2000-01-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chiral peptide nucleic acids and methods for preparing same
SE522077C2 (sv) * 1997-09-05 2004-01-13 Lightup Technologies Ab Förfarande att välja sekvens hos sond för nukleinsyrahybridisering
US6617422B1 (en) 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
CA2291839A1 (en) * 1997-05-28 1998-12-03 Peter E. Nielsen Conjugated peptide nucleic acids having enhanced cellular uptake
DK0881228T3 (da) * 1997-05-30 2005-12-19 Pna Diagnostics As 2- eller 3-dimensionale geometriske strukturer af peptidnukleinsyrer
US5962665A (en) 1997-06-16 1999-10-05 Abbott Laboratories Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2
AU8147798A (en) * 1997-06-16 1999-01-04 University Of North Carolina At Chapel Hill, The Peptido oligonucleotides (pons) and their combinatorial libraries
JPH11332595A (ja) * 1997-07-09 1999-12-07 Masao Karube プローブｐｎａによるｄｎａの検出方法
DK0897991T3 (da) * 1997-08-22 2005-07-25 Pna Diagnostics Aps Små triplexdannende PNA-oligoer
US6300318B1 (en) 1997-09-16 2001-10-09 Peter E. Nielsen Antibacterial and antibiotic methods using peptide nucleic acids and pharmaceutical compositions therefor
DE19741739B4 (de) * 1997-09-22 2006-04-27 Nanogen Recognomics Gmbh Supramolekulares Paarungssystem, dessen Herstellung und Verwendung
US6723560B2 (en) 1998-10-08 2004-04-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
US6989270B1 (en) 1997-10-17 2006-01-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
US6007992A (en) * 1997-11-10 1999-12-28 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US6028183A (en) 1997-11-07 2000-02-22 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives and oligonucleotides containing same
DE19816550A1 (de) 1997-12-24 1999-06-24 Roche Diagnostics Gmbh Universell verwendbarer Aufbau eines Analysenelements und dessen Einsatz zur Analytbestimmung
US6030997A (en) * 1998-01-21 2000-02-29 Eilat; Eran Acid labile prodrugs
US6326479B1 (en) * 1998-01-27 2001-12-04 Boston Probes, Inc. Synthetic polymers and methods, kits or compositions for modulating the solubility of same
WO1999049293A2 (en) * 1998-03-24 1999-09-30 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to detection complexes
US20040186071A1 (en) * 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US20040063618A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Muthiah Manoharan Peptide nucleic acids having improved uptake and tissue distribution
DE19824900B4 (de) 1998-06-04 2006-05-04 Roche Diagnostics Gmbh DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
US6664045B1 (en) * 1998-06-18 2003-12-16 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of microorganisms
EP1095054B1 (de) 1998-07-09 2006-10-25 Biocept, Inc. Verfahren zur verwendung einer universellen bibliothek von peptid-nukleinsäuren zur optimierung der dns-hybridisierung
US6548651B1 (en) 1998-11-11 2003-04-15 Pantheco A/S Modified peptide nucleic acid (PNA) molecules
CA2366231C (en) * 1999-03-18 2010-05-11 Exiqon A/S One step sample preparation and detection of nucleic acids in complex biological samples
US20020049173A1 (en) * 1999-03-26 2002-04-25 Bennett C. Frank Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6824866B1 (en) 1999-04-08 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Porous silica substrates for polymer synthesis and assays
DE19927783A1 (de) 1999-06-18 2000-12-21 Roche Diagnostics Gmbh Element zur Bestimmung eines Analyts in einer Flüssigkeit, entsprechendes Bestimmungsverfahren unter Verwendung des Elementes sowie Kit zur Bestimmugn eines Analyts
AU6629200A (en) * 1999-08-25 2001-03-19 Philip P Garner Alpha-helical peptide nucleic acid alpha-pna
US7169553B1 (en) 1999-08-30 2007-01-30 Roche Diagnostics, Gmbh 2-Azapurine compounds and their use
US6348583B1 (en) * 1999-08-30 2002-02-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Poly(ether-thioether), poly(ether-sulfoxide) and poly(ether-sulfone) nucleic acids
CA2317179A1 (en) 1999-09-01 2001-03-01 Affymetrix, Inc. Macromolecular arrays on polymeric brushes and methods for preparing the same
US6660845B1 (en) 1999-11-23 2003-12-09 Epoch Biosciences, Inc. Non-aggregating, non-quenching oligomers comprising nucleotide analogues; methods of synthesis and use thereof
EP1997513B1 (de) 2000-02-10 2012-04-11 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Kombinationen und Zubereitung zur Anwendung in PDT zur Behandlung von Augenleiden mit unerwünschter choriodaler Neovascularisation
US6962906B2 (en) 2000-03-14 2005-11-08 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
CA2402319A1 (en) 2000-03-14 2001-09-20 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
US20040014644A1 (en) * 2000-03-14 2004-01-22 Vladimir Efimov Oligonucleotide analogues and methods of use for modulating gene expression
EP1294939B1 (de) 2000-04-03 2010-01-27 Cytyc Corporation Nachweis und typisierung des papillomavirus mittels pna-sonden
US6936443B2 (en) 2000-04-03 2005-08-30 Cytyc Corporation Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes
US7211381B1 (en) 2000-04-04 2007-05-01 Abbott Laboratories β2 andrenergic polymorphism detection
US6593092B2 (en) 2000-04-04 2003-07-15 Abbott Laboratories Beta 2 adrenergic polymorphism detection
DE10019135A1 (de) 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE10019136A1 (de) * 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US6887664B2 (en) 2000-06-06 2005-05-03 Applera Corporation Asynchronous primed PCR
EP1307469B1 (de) 2000-08-03 2008-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh Nukleinsäurebindende verbindungen mit pyrazolo¬3,4-d pyrimidinanalogen von purin-2,6-diamin und ihre verwendung
PT2078531E (pt) 2000-08-08 2012-08-06 Technion Res & Dev Foundation Composições farmacêuticas e métodos úteis para modular a angiogénese
US20030114410A1 (en) 2000-08-08 2003-06-19 Technion Research And Development Foundation Ltd. Pharmaceutical compositions and methods useful for modulating angiogenesis and inhibiting metastasis and tumor fibrosis
US7183394B1 (en) * 2000-08-11 2007-02-27 Garner Philip P Helical nucleopeptides
CA2437942C (en) * 2000-11-09 2013-06-11 Cold Spring Harbor Laboratory Chimeric molecules to modulate gene expression
US7282575B2 (en) 2000-12-26 2007-10-16 Credia Japan Co., Ltd. Functional peptide nucleic acid monomer and process for producing the same
AU2002230058B2 (en) 2001-01-29 2005-11-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid derivatives
GB0102388D0 (en) * 2001-01-31 2001-03-14 Secr Defence Polymers
EP1236804A1 (de) 2001-03-02 2002-09-04 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuren mittels einer Kontrolle
EP1748078B1 (de) 2001-03-09 2011-01-19 Boston Probes, Inc. Kombinationsoligomere betreffende Verfahren, Kits und Zusammensetzungen
EP2258842A1 (de) 2001-04-16 2010-12-08 Wyeth Holdings Corporation Polypeptidantigene codierende offene Leseraster aus Streptococcus Pneumoniae und Verwendungen davon
ATE527376T1 (de) 2001-05-18 2011-10-15 Boston Probes Inc Pna-sonden, sondensätze, verfahren und kits im zusammenhang mit dem nachweis von candida
WO2009003492A1 (en) 2007-07-03 2009-01-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers, methods for their generation, labeling and use
US20030207804A1 (en) * 2001-05-25 2003-11-06 Muthiah Manoharan Modified peptide nucleic acids
US7053195B1 (en) 2001-06-12 2006-05-30 Syngenta Participatious Ag Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
EP1925672A1 (de) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Auf abiotischen Stress ansprechende Polynukleotide und Polypeptide
US6921812B1 (en) 2001-07-03 2005-07-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of modulating pharmacokinetics of oligonucleotides
US6852491B2 (en) 2001-09-04 2005-02-08 Abbott Laboratories Amplification and detection reagents for HIV-1
WO2003027328A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to the suppression of detectable probe binding to randomly distributed repeat sequences in genomic nucleic acid
WO2003040395A2 (en) 2001-11-07 2003-05-15 Applera Corporation Universal nucleotides for nucleic acid analysis
EP1448800A4 (de) 2001-11-21 2007-05-16 Applera Corp Digitaler assay
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US20040063109A2 (en) 2002-01-25 2004-04-01 Applera Corporation Single-tube, ready-to-use assay kits, and methods using same
JP2005520554A (ja) * 2002-03-21 2005-07-14 ボストン プローブス，インコーポレイテッド ＢａｃｉｌｌｕｓＡｎｔｈｒａｃｉｓの検出に関するＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法およびキット
US20030211509A1 (en) * 2002-03-26 2003-11-13 Wiley Steven R. TNF-delta ligand and uses thereof
US7052840B2 (en) 2002-04-03 2006-05-30 Capitol Genomix, Inc. Reversible association of nucleic acid with a carboxylated substrate
US7026120B2 (en) 2002-04-15 2006-04-11 Abbott Laboratories Probes for detecting tumor cells
KR20030084444A (ko) 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US7015317B2 (en) 2002-05-02 2006-03-21 Abbott Laboratories Polynucleotides for the detection and quantification of hepatitis B virus nucleic acids
JP2006507798A (ja) * 2002-05-17 2006-03-09 アプレラ　コーポレイション Ｌｉｓｔｅｒｉａの決定に関するＰＮＡプローブ、プローブセット、方法およびキット
US20030220844A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Marnellos Georgios E. Method and system for purchasing genetic data
EP2161276A3 (de) * 2002-09-08 2010-05-26 Applera Corporation PNA enthaltende Verbindungen, Bibliotheken und Methoden und PNA Oligomersynthese
CA2749227A1 (en) * 2002-10-16 2005-01-13 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
WO2004036188A2 (en) * 2002-10-18 2004-04-29 Cylene Pharmaceuticals, Inc. Processes for identifying quadruplex-targeted antiviral molecules
CA2504694C (en) * 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US9150605B2 (en) * 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
US9150606B2 (en) * 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
WO2004044132A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
US7807802B2 (en) 2002-11-12 2010-10-05 Abbott Lab Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
CA2506129C (en) 2002-11-15 2015-02-17 Idenix (Cayman) Limited 2'-branched nucleosides and flaviviridae mutation
EP1567675A4 (de) 2002-11-21 2006-05-10 Epict Technologies Verfahren zur verwendung von primern,die für einen strang eines doppelsträngigen promotors codieren
US20040259132A1 (en) * 2002-11-22 2004-12-23 Henrik Stender Peptide nucleic acid probes for analysis of pseudomonas (sensu stricto)
EP2112229A3 (de) 2002-11-25 2009-12-02 Sequenom, Inc. Verfahren zum Identifizieren des Brustkrebsrisikos und zugehörige Behandlungen
US7736909B2 (en) 2003-01-09 2010-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising capture agents
US7195751B2 (en) * 2003-01-30 2007-03-27 Applera Corporation Compositions and kits pertaining to analyte determination
WO2004072284A1 (en) * 2003-02-11 2004-08-26 Antisense Therapeutics Ltd Modulation of insulin like growth factor i receptor expression
US20040171149A1 (en) * 2003-02-11 2004-09-02 Wraight Christopher J. Modulation of insulin like growth factor I receptor expression
EP1595953B1 (de) 2003-02-21 2012-04-04 Eisai R&D Management Co., Ltd. Signalverstärkungsverfahren zum nachweis eines mutanten gens
EP1631677B1 (de) * 2003-05-20 2010-11-17 Investigen, Inc. System zum nachweis von polynukleotiden
JPWO2005010181A1 (ja) * 2003-07-25 2007-09-27 株式会社クレディアジャパン 核酸検出方法
WO2005012546A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 Andreas Braun Methods for isolating and identifying novel target-specific structuremers for use in the biological sciences
US20050063932A1 (en) * 2003-08-14 2005-03-24 Natalie Dilallo Skin care compositions including hexapeptide complexes and methods of their manufacture
US20060198800A1 (en) * 2003-08-14 2006-09-07 Natalie Dilallo Skin care compositions including hexapeptide complexes and methods of their manufacture
US20050095627A1 (en) * 2003-09-03 2005-05-05 The Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
US20050148087A1 (en) 2004-01-05 2005-07-07 Applera Corporation Isobarically labeled analytes and fragment ions derived therefrom
CN1910289B (zh) 2004-01-07 2012-05-23 日立化成研究中心公司 用于检测hiv的引物和探针
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
EP1727913B8 (de) 2004-03-24 2009-08-19 Applied Biosystems, LLC Ligation und amplifikationsreaktionen zur bestimmung von zielmolekülen
JP4482557B2 (ja) 2004-04-28 2010-06-16 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 ハイブリダイゼーション方法
EP1745156A2 (de) * 2004-05-04 2007-01-24 Dako Denmark A/S Verfahren für den nachweis von chromosomenaberrationen
JP2008501693A (ja) * 2004-06-03 2008-01-24 アイシス ファーマシューティカルズ、インク． 遺伝子調節で使用するための個別に調節された鎖を有する二本鎖組成物
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
EP1776482A2 (de) 2004-06-30 2007-04-25 Applera Corporation Loglineare verstärkung
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US7306785B2 (en) * 2004-09-23 2007-12-11 General Electric Company Multifunctional cross-bridged tetraaza macrocyclic compounds and methods of making and using
WO2007044031A2 (en) * 2004-12-06 2007-04-19 Bioveris Corporation Methods and compositions for detecting bacillus anthracis
US20080305142A1 (en) * 2004-12-11 2008-12-11 Cytogenix, Inc. Cell Free Biosynthesis of High-Quality Nucleic Acid and Uses Thereof
EP2813581B1 (de) 2005-01-06 2018-06-27 Applied Biosystems, LLC Verwendung von Polypeptiden mit Nukleinsäurebindungsaktivität in Verfahren schneller Nukleinsäurenamplifikation
US20090264635A1 (en) 2005-03-25 2009-10-22 Applera Corporation Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
US7229769B2 (en) * 2005-03-25 2007-06-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity
AU2006252346B2 (en) 2005-06-02 2012-06-28 Advandx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of microorganisms
EP2489746B1 (de) 2005-06-07 2016-02-03 Luminex Corporation Verfahren zur Detektion und Typisierung von Nucleinsäuren
WO2007045998A2 (en) 2005-07-01 2007-04-26 Dako Denmark A/S New nucleic acid base pairs
US20070059713A1 (en) 2005-09-09 2007-03-15 Lee Jun E SSB-DNA polymerase fusion proteins
US20090291437A1 (en) * 2005-11-02 2009-11-26 O'brien Sean Methods for targeting quadruplex sequences
WO2007073149A1 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Keygene N.V. Alternative nucleotides for improved targeted nucleotide exchange
EP2010677A4 (de) * 2006-02-24 2010-04-14 Investigen Inc Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis von polynukleotiden
EP1997908A4 (de) 2006-03-15 2010-09-29 Eisai R&D Man Co Ltd Verfahren zum bilden eines signalsondenpolymers
CA2651815A1 (en) 2006-05-10 2007-11-22 Dxterity Diagnostics Detection of nucleic acid targets using chemically reactive oligonucleotide probes
US20100196336A1 (en) 2006-05-23 2010-08-05 Dongsu Park Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods
RU2009102155A (ru) 2006-06-30 2010-08-10 Апплера Корпорейшн (Us) Способы анализирования связывающих взаимодействий
EP2484781B1 (de) 2006-08-01 2017-08-23 Applied Biosystems, LLC Nachweis von Analyten und Nukleinsäuren
US20080096193A1 (en) * 2006-10-24 2008-04-24 Charles Robert Bupp Methods and compositions for detecting polynucleotides
US20080131880A1 (en) * 2006-11-22 2008-06-05 Bortolin Laura T PNA-DNA oligomers and methods of use thereof
WO2008070525A1 (en) 2006-12-04 2008-06-12 Luminex Corporation Oxocarbonamide peptide nucleic acids and methods of using same
AU2007333040B2 (en) 2006-12-13 2013-02-07 Luminex Corporation Systems and methods for multiplex analysis of PCR in real time
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
EP2118310B1 (de) * 2006-12-29 2013-03-06 Applied Biosystems, LLC Systeme und verfahren zum nachweis von nukleinsäuren
WO2008083259A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Applera Corporation Systems and methods for detecting nucleic acids
US7803543B2 (en) 2007-01-19 2010-09-28 Chang Gung University Methods and kits for the detection of nucleotide mutations using peptide nucleic acid as both PCR clamp and sensor probe
WO2008103702A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Investigen, Inc. Methods and compositions for rapid light-activated isolation and detection of analytes
AU2008218939B2 (en) * 2007-02-23 2014-05-08 The Research Foundation Of State University Of New York RNA targeting compounds and methods for making and using same
US9260476B2 (en) 2007-02-23 2016-02-16 The Research Foundation For The State University Of New York RNA targeting compounds and methods for making and using same
ES2659145T3 (es) 2007-04-13 2018-03-14 Abbott Molecular Inc. Secuencia de cebador y sonda para detectar Chlamydia trachomatis
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
IL184627A0 (en) 2007-07-15 2008-12-29 Technion Res & Dev Foundation Agents for diagnosing and modulating metastasis and fibrosis as well as inflammation in a mammalian tissue
SI2185198T1 (sl) 2007-08-02 2015-04-30 Gilead Biologics, Inc. Inhibitorji LOX in LOXL2 ter njihova uporaba
US20100256007A1 (en) 2007-10-24 2010-10-07 Mitsugu Usui Nucleic acid probe, and method of forming probe-polymer
JPWO2009057702A1 (ja) 2007-10-31 2011-03-10 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 標的物質検出用ポリマー及び標的物質の検出方法
EP2222851B1 (de) 2007-11-20 2017-06-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation der cd40-expression
WO2009067628A1 (en) 2007-11-20 2009-05-28 Applied Biosystems Inc. Reversible di-nucleotide terminator sequencing
KR101588736B1 (ko) 2008-01-10 2016-01-26 리서치 디벨롭먼트 파운데이션 얼리키아 샤피엔시스에 대한 백신 및 진단제
WO2009091934A1 (en) 2008-01-17 2009-07-23 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions
KR101072899B1 (ko) * 2008-01-21 2011-10-17 주식회사 파나진 아미노산 스페이서가 결합된 펩티드 핵산의 합성 및 그의응용
AU2009223671B2 (en) 2008-03-11 2014-11-27 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
KR20090098710A (ko) 2008-03-14 2009-09-17 주식회사 씨티아이바이오 세포투과성과 핵산 결합력이 좋은 펩타이드 핵산 유도체
EP2285979B2 (de) 2008-05-27 2020-02-19 Dako Denmark A/S Hybridisierungszusammensetzungen und -verfahren
US20090312196A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
WO2009152336A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
US8859490B2 (en) 2008-09-03 2014-10-14 Nanyang Technological University Peptide nucleic acid monomers and oligomers
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
JP6209309B2 (ja) 2008-09-22 2017-10-04 アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション サイズが減少した自己送達用ＲＮＡｉ化合物
EP2342334A4 (de) 2008-09-29 2012-03-14 Univ Pennsylvania Auf tumorgefässmarker gerichtete impfstoffe
CN102186993A (zh) 2008-10-15 2011-09-14 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 寡核苷酸检测方法
CN102272157B (zh) 2008-11-07 2015-11-25 研究发展基金会 用于抑制cripto/grp78复合物形成和信号的组合物和方法
US8715732B2 (en) * 2009-01-05 2014-05-06 Cornell University Nucleic acid hydrogel via rolling circle amplification
WO2010080769A2 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Arresto Biosciences, Inc. Chemotherapeutic methods and compositions
EP2391714B2 (de) 2009-01-30 2019-07-24 Whitehead Institute for Biomedical Research Ligaturverfahren und ihre verwendung
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
US7964355B2 (en) 2009-02-17 2011-06-21 Investigen, Inc. Assays based on detection of photobleaching reaction products from dye catalytic complex
US9303287B2 (en) 2009-02-26 2016-04-05 Dako Denmark A/S Compositions and methods for RNA hybridization applications
US8063193B2 (en) 2009-03-27 2011-11-22 Abbott Laboratories Nucleotide and amino acid sequences encoding an exported protein 1 derived from Plasmodium vivax and uses thereof
CN102449169B (zh) 2009-04-01 2016-03-16 德克斯特里蒂诊断公司 化学连接依赖性的探针扩增(clpa)
US20100297127A1 (en) 2009-04-08 2010-11-25 Ghilardi Nico P Use of il-27 antagonists to treat lupus
AU2010256880B2 (en) 2009-06-02 2015-01-22 Opko Health, Inc. Identification of small molecules recognized by antibodies in subjects with neurodegenerative diseases
CA2766351C (en) 2009-06-29 2018-02-27 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
WO2011011630A2 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Codexis, Inc. Nitrilase biocatalysts
EP2462230B1 (de) * 2009-08-03 2015-07-15 Recombinetics, Inc. Verfahren und zusammensetzungen für gezielte genmodifikation
SG2014004816A (en) 2009-08-21 2014-03-28 Gilead Biologics Inc Catalytic domains from lysyl oxidase and loxl2
TW201124726A (en) 2009-10-16 2011-07-16 Univ Texas Compositions and methods for producing coded peptoid libraries
CA2781907C (en) 2009-12-02 2019-07-16 Dako Denmark A/S Compositions and methods for performing hybridizations with no denaturation
US9404160B2 (en) 2009-12-22 2016-08-02 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
WO2011087760A2 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
RU2615143C2 (ru) 2010-03-24 2017-04-04 Адвирна Самодоставляющие PHKi соединения уменьшенного размера
WO2011133931A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Genentech, Inc. Use of il-27 antagonists for treating inflammatory bowel disease
MX2017015093A (es) 2011-01-11 2023-03-10 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto.
JP5852222B2 (ja) 2011-03-29 2016-02-03 シージーン アイエヌシー Ｐｔｏ切断及び延長−依存的切断によるターゲット核酸配列の検出
WO2012138955A2 (en) 2011-04-08 2012-10-11 Ly Danith H CONFORMATIONALLY-PREORGANIZED, MiniPEG-CONTAINING GAMMA-PEPTIDE NUCLEIC ACIDS
CA2834218C (en) 2011-04-29 2021-02-16 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species using inhibitory oligonucleotides
WO2012150749A1 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by po cleavage and hybridization
JP2014513557A (ja) 2011-05-17 2014-06-05 ディクステリティー ダイアグノスティクス インコーポレイテッド 標的核酸を検出する方法及び組成物
EP2761028A1 (de) 2011-09-30 2014-08-06 Dako Denmark A/S Hybridisierungszusammensetzungen und -verfahren mit formamid
GB201117482D0 (en) 2011-10-11 2011-11-23 Univ Dundee Targetiing of miRNA precursors
EP2768974B1 (de) 2011-10-21 2017-07-19 Dako Denmark A/S Hybridisierungszusammensetzungen und -verfahren
EP2594942A1 (de) * 2011-11-16 2013-05-22 Koninklijke Philips Electronics N.V. Lange starre Abstandshalter zur Verbesserung der Bindekinetik in Immuntests
WO2013085026A1 (ja) 2011-12-09 2013-06-13 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 塩基変異の検出方法及び検出用キット
ES2930180T3 (es) 2012-03-02 2022-12-07 Sequenom Inc Métodos para enriquecer ácido nucleico canceroso a partir de una muestra biológica
CN104245959B (zh) 2012-03-05 2017-10-13 Seegene株式会社 基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验的从靶核酸序列的核苷酸变异检测
WO2013172305A1 (ja) 2012-05-15 2013-11-21 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 Ｒｎａの検出方法及び検出用キット
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
KR20150016336A (ko) 2012-05-21 2015-02-11 더 스크립스 리서치 인스티튜트 리보솜 폴리뉴클레오티드 및 관련 발현 시스템
US10077474B2 (en) 2012-05-29 2018-09-18 Abbott Molecular, Inc. Method of designing primers, method of detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs), method of distinguishing SNPs, and related primers, detectable oligonucleotides, and kits
CA2878979C (en) 2012-07-13 2021-09-14 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
WO2014033314A1 (en) 2012-09-03 2014-03-06 Uab Bioseka Antisense oligonucleotide targeting bacterial glucosyltransferases
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
WO2014093291A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 Advandx, Inc. Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest
AU2014200958B2 (en) 2013-02-25 2016-01-14 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence
US9289502B2 (en) 2013-03-08 2016-03-22 Emerald Therapeutics, Inc. Preparation of oligo conjugates
WO2014168711A1 (en) 2013-03-13 2014-10-16 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
WO2014142575A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Seegene, Inc. Quantification of target nucleic acid using melting peak analysis
US9365902B2 (en) 2013-03-15 2016-06-14 Abbott Molecular Inc. Detection of bisulfite converted nucleotide sequences
WO2014152054A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays for mutation detection
US10221216B2 (en) 2013-04-11 2019-03-05 Carnegie Mellon University Template-directed γPNA synthesis process and γPNA targeting compounds
US10370415B2 (en) 2013-04-11 2019-08-06 Carnegie Mellon University Divalent nucleobase compounds and uses therefor
WO2015005961A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Emd Millipore Corporation A method of determining virus removal from a sample containing a target protein using activated carbon
KR101863943B1 (ko) 2013-07-15 2018-06-01 주식회사 씨젠 Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 고정화 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
LT6214B (lt) 2013-10-07 2015-08-25 Uab "Bioseka" Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai
CN105814078A (zh) 2013-10-11 2016-07-27 豪夫迈·罗氏有限公司 Nsp4抑制剂及其使用方法
JP6640079B2 (ja) 2013-10-16 2020-02-05 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 小容積の粒子を調製するためのデバイス及び方法
CN105705657B (zh) 2013-10-18 2020-07-28 Seegene株式会社 基于利用杂交-捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸分析的在固相中的靶核酸序列检测
WO2015070050A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Baylor Research Institute Nuclear loclization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure
EP3099799B1 (de) 2014-01-28 2019-05-15 Dice Molecules SV. LLC Arrays von monolithen mit angehängten erkennungsverbindungen
EP3736344A1 (de) 2014-03-13 2020-11-11 Sequenom, Inc. Verfahren und prozesse zur nichtinvasiven beurteilung genetischer variationen
US10851407B2 (en) 2014-05-08 2020-12-01 Carnegie Mellon University Left-handed gamma-peptide nucleic acids, methods of synthesis and uses therefor
WO2015191777A2 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Dxterity Diagnostics Incorporated Devices and methods for collecting and stabilizing biological samples
US9909187B2 (en) 2014-06-24 2018-03-06 Abbott Molecular Inc. Detection of single nucleotide polymorphisms in human KRAS
ES2962636T3 (es) 2014-07-24 2024-03-20 Abbott Molecular Inc Métodos para la detección y análisis de mycobacterium tuberculosis
EP3633047B1 (de) 2014-08-19 2022-12-28 Pacific Biosciences of California, Inc. Verfahren zur sequenzierung von nukleinsäuren basierend auf einer anreicherung von nukleinsäuren
WO2016134293A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Baylor College Of Medicine p63 INACTIVATION FOR THE TREATMENT OF HEART FAILURE
US11136390B2 (en) 2015-06-12 2021-10-05 Alector Llc Anti-CD33 antibodies and methods of use thereof
JP7497953B2 (ja) 2015-06-12 2024-06-11 アレクトル エルエルシー 抗ｃｄ３３抗体及びその使用方法
EP3322483A4 (de) 2015-07-14 2019-01-02 Abbott Molecular Inc. Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von wirkstoffresistenter tuberkulose
JP7525980B2 (ja) 2015-08-28 2024-07-31 アレクトル エルエルシー 抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体及びその使用方法
AU2016324165B2 (en) 2015-09-16 2020-07-02 PetaOmics, Inc. Methods and compositions for genomic target enrichment and selective DNA sequencing
ES2941968T3 (es) 2015-10-01 2023-05-29 The Whitehead Institute For Biomedical Res Marcaje de anticuerpos
EP3370518B1 (de) 2015-10-14 2023-08-23 X-Therma, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur verringerung der eiskristallbildung
WO2017066643A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Bio-Path Holding, Inc. P-ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
WO2017075432A2 (en) 2015-10-29 2017-05-04 Alector Llc Anti-siglec-9 antibodies and methods of use thereof
EP3400097B1 (de) 2016-01-06 2021-01-27 The University Of British Columbia Verzweigte mischer sowie verfahren zu deren verwendung und herstellung
CA3019635A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 Baylor Research Institute Angiopoietin-like protein 8 (angptl8)
US10400274B2 (en) 2016-06-18 2019-09-03 Jan Biotech, Inc. Fluorogenic probes and their use in quantitative detection of target RNA sequences
WO2018013924A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic nanoparticles for delivery of immunomodulatory compounds
MX2019003070A (es) 2016-09-16 2019-10-14 Bio Path Holdings Inc Terapia de combinacion con oligonucleotidos antisentido liposomales.
JP2019531726A (ja) 2016-09-26 2019-11-07 カーネギー メロン ユニバーシティ 二価核酸塩基化合物およびそれらの使用
US11147249B2 (en) 2016-12-08 2021-10-19 Alector Llc Siglec transgenic mice and methods of use thereof
US11359014B2 (en) 2017-05-16 2022-06-14 Alector Llc Anti-siglec-5 antibodies and methods of use thereof
WO2018218250A2 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
CN117700548A (zh) 2017-08-03 2024-03-15 艾利妥 抗cd33抗体及其使用方法
KR102380264B1 (ko) 2017-08-31 2022-03-29 주식회사 씨젠 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 구성요소의 성능 평가
US11401546B2 (en) 2017-09-29 2022-08-02 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by PTO cleavage and extension-dependent extension assay
US11470827B2 (en) 2017-12-12 2022-10-18 Alector Llc Transgenic mice expressing human TREM proteins and methods of use thereof
JP7373205B2 (ja) 2017-12-21 2023-11-02 カーネギー メロン ユニバーシティ 鋳型指向性の核酸標的化合物
EA202190183A1 (ru) 2018-07-27 2021-05-18 Алектор Ллс Антитела к siglec-5 и способы их применения
WO2020061591A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating diabetes, and methods for enriching mrna coding for secreted proteins
WO2021005223A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
WO2021099394A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
US20210381039A1 (en) 2020-05-29 2021-12-09 Front Range Biosciences, Inc. Methods and compositions for pathogen detection in plants
US20230002779A1 (en) 2020-06-29 2023-01-05 Front Range Biosciences, Inc. Characterization of plant cultivars based on terpene synthase gene profiles
KR20230050336A (ko) 2020-07-10 2023-04-14 인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸) 뇌전증을 치료하기 위한 방법과 조성물
CA3218220A1 (en) * 2021-05-11 2022-11-17 Russell Lewis Mccurdy Replaceable floating attractant accessories for fishing line
WO2023043280A1 (ko) 2021-09-17 2023-03-23 주식회사 씨젠 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
CN114409890A (zh) * 2022-02-28 2022-04-29 中国科学院长春应用化学研究所 一种氨基功能化的聚乙二醇衍生物及其制备方法
WO2024017990A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders
WO2024146935A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Intravenous administration of antisense oligonucleotides for the treatment of pain

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2910130A1 (de) 1979-03-15 1980-09-25 Franz Rossmoeller Verbesserte befestigungsvorrichtung zum aufhaengen von paneelen und moebelelementen
DE2910129C2 (de) 1979-03-15 1986-01-23 Oskar 4354 Datteln Fleck Leiste zum Abdichten des Zwischenraums zwischen der Trauflatte eines Daches und den darüberliegenden traufseitigen Dacheindeckungsplatten
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) * 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
ATE171185T1 (de) * 1985-03-15 1998-10-15 Antivirals Inc Immunotestmittel für polynukleotid und verfahren
ATE192465T1 (de) 1987-10-28 2000-05-15 Florey Howard Inst Oligonucleotid-polyamid konjugate
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
AU4225889A (en) 1988-09-01 1990-04-02 Forskningscenter Riso Peptide synthesis method and solid support for use in the method
JPH02156895A (ja) * 1988-12-08 1990-06-15 Sumitomo Heavy Ind Ltd 好塩菌による５’‐ヌクレオチド類の製造法
JPH0635469B2 (ja) * 1989-09-13 1994-05-11 信 高橋 ジエチレントリアミン三酢酸化合物及びその製造中間体並びにそれらの製造法
US5340716A (en) * 1991-06-20 1994-08-23 Snytex (U.S.A.) Inc. Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label
DK51092D0 (da) * 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US6414112B1 (en) * 1991-05-24 2002-07-02 Ole Buchardt Peptide nucleic acids having 2,6-diaminopurine nucleobases
US6451968B1 (en) * 1991-05-24 2002-09-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US6228982B1 (en) * 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
US5539082A (en) * 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
MX9207334A (es) 1991-12-18 1993-08-01 Glaxo Inc Acidos nucleicos peptidicos y formulacion farma- ceutica que los contiene
US6770738B1 (en) * 1992-05-22 2004-08-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Higher order structure and binding of peptide nucleic acids
AU4525093A (en) * 1992-05-28 1993-12-30 Gilead Sciences, Inc. Conformationally restrained oligomers containing amide or carbamate linkages for sequence-specific binding
US5705333A (en) * 1994-08-05 1998-01-06 The Regents Of The University Of California Peptide-based nucleic acid mimics(PENAMS)
US6472209B1 (en) * 1997-10-17 2002-10-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response

Also Published As

Publication number Publication date
EP1411063B1 (de) 2006-07-19
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EP0586618B1 (de) 1997-07-16
US6710163B1 (en) 2004-03-23
FI935208A0 (fi) 1993-11-23
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JP2003235590A (ja) 2003-08-26
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