NO312516B1 - Peptid-nukleinsyrer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelser som ikke er poly-nukleotider, men som blir bundet til komplementære DNA og RNA tråder i sterkere grad enn tilsvarende DNA. Oppfinnelsen vedrører spesielt forbindelser hvor naturlig forekommende nukleobaser eller andre nukleobase-bindende deler er kovalent bundet til et polyamid-skjelett.

Oligodeoksy-ri/bonukleotider som er så lange som 100 basepar (bp) blir rutinemessig syntetisert ved fast fasemetode ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige, fullstendig automa-tiske syntesemaskiner. Kjemisk syntese av oligoribonukleo-tider er derimot mye mindre rutinemessig. Oligoribonukleoti-der er også mye mindre stabile enn oligodeoksyribonukleotider og dette er et faktum som har bidratt til den mer utstrakte anvendelsen av oligodeoksyribonukleotider innen medisinsk og biologisk forskning rettet mot f.eks. genterapi eller regulering av transkripsjonen eller translasjonen.

Funksjonen til genet begynner ved transkripsjon av dets informasjon til en messenger RNA (mRNA) som ved interaksjon med det ribosomale komplekset fører til syntesen av et protein som blir kodet for av dets sekvens. Synteseprosessen er kjent som translasjon. Translasjon krever tilstedeværelse av forskjellige kofaktorer og byggestener, aminosyrer og deres transfer RNA (tRNA) og alle er tilstede i normale celler.

Transkripsjonsinitiering krever spesifikk gjenkjenning av en promoter DNA sekvens ved det RNA-syntetiserende enzymet, RNA polymerase. I mange tilfeller i prokaryote celler, og sannsynligvis i alle tilfellene i eukaryote celler, blir denne gjenkjenningen forutgått av sekvens-spesifikk binding av en protein transkripsjonsfaktor til promoteren. Andre proteiner som blir bundet til promoteren, men hvor bindingen forhindrer virkningen av RNA polymerase, er kjent som repressorer. Gen-aktivering er derfor vanligvis regulert positivt av transkripsjonsfaktorer og negativt av repressorer.

De mest konvensjonelle medikamentene virker ved interaksjon med og modulering av en eller flere målsøkte endogene proteiner, f.eks. enzymer. Slike medikamenter er derimot vanligvis ikke spesifikke for målsøkte proteiner, men reagerer også med andre proteiner. En relativt stor dose av medikament må derfor anvendes for effektivt å modulere et målsøkt protein. Vanlige daglige doser av medikamentene er fra IO"<1> - IO-<1> millimol pr. kilogram kroppsvekt eller 10-<3->10 millimol for en 100 kg person. Dersom denne moduleringen i stedet for kunne oppnås ved interaksjon med og inaktivering av mRNA, kunne en dramatisk reduksjon i den nødvendige mengden av medikament bli oppnådd sammen med en tilsvarende reduksjon i bivirkninger. Ytterligere reduksjoner kunne oppnås dersom en slik interaksjon kunne bli gjort sete-spesifikt. Dersom et operativt gen kontinuerlig produserer mRNA, vil det være mer fordelaktig dersom gen-transkripsjonen i sin helhet kunne bli stoppet.

01igodeoksynukleotider har slike muligheter. F.eks. kan syntetiske oligodeoksynukleotider bli anvendt som anti-sens prober for å blokkere og eventuelt føre til nedbrytning av mRNA. Syntetisk DNA kunne dermed undertrykke translasjonen in vivo. Det kan også være mulig å modulere genomet til et dyr ved f.eks. trippel heliks dannelse ved anvendelse av oligonukleotider eller andre DNA gjenkjennende midler. Det er derimot et antall ulemper assosiert med trippel heliks dannelse. Den kan f.eks. bare bli anvendt for homopurine sekvenser og den krever ikke-fysiologisk høy ionestyrke og lav pH.

Umodifiserte oligonukleotider er videre upraktiske både i antisens metoden og i trippel heliks metoden på grunn av at de har korte in vivo halveringstider, det er vanskelig å fremstille disse i mer enn milligram mengder og er derfor meget kostbare og de er dårlige cellemembran penetreringsmid-ler .

Disse problemene har resultert i en omfattende forskning når det gjelder forbedringer og alternativer. Problemene som oppstår i sammenheng med dobbelt-trådet DNA (dsDNA) gjenkjenning gjennom trippel heliks dannelse har f.eks. blitt redusert av en fin "switch back" kjemisk binding hvorved en sekvens av polypurin på en tråd blir gjenkjent, og ved "switching back", en homopurin sekvens på den andre tråden kan bli gjenkjent. Se f.eks. McCurdy, Moulds og Froehler, Nucleosides. God heliks-dannelse er også blitt oppnådd ved anvendelse av kunstige baser, som derved forbedrer bindings-tUstandene med hensyn på ionestyrke og pH.

For å forbedre halveringstiden samt membranpenetreringen, er det blitt utført et stort antall variasjoner i skjelettet til polynukleotidet, men frem til nå har dette ikke gitt de ønskede resultatene. Disse variasjonene omfatter anvendelse av metylforsfonater, monotiofosfater, ditiofosfater, fosforamidater, fosfat estere, brodannede fosforamidater, brodannede fosforotioater, brodannede metylenfosfonater, defosfo internukleotid-analoger med siloksanbroer, karbonatbroer, karboksymetyl esterbroer, acetamid-broer, karbamat-broer, tioeter, sulfoksy, sulfono-broer, forskjellige plast DNA, a-anomeriske broer og boranderivater.

Internasjonal patentsøknad WO 86/05518 krever en polymerisk sammensetning som er effektiv når det gjelder å bli bundet til et enkelt-trådet polynukleotid inneholdende en målsekvens av baser. Sammensetningen omfatter ikke-homopolymeriske, vesentlig stereoregulære polymermolekyler med formen:

<R>l <«>2 <*>3 <R>n

B B B B,

hvor:

(a) Rl_Rn er gjenkjenningsdeler valgt fra purin, purin-lignende, pyrimidin og pyrimidinlignende heterocykler som effektivt bindes ved Watson/Crick parring til tilsvarende, i-sekvens baser i målsekvensen, (b) n er slik at det totale antallet Watson/Crick hydrogenbindinger dannet mellom et polymermolekyl og en målsekvens er minst omtrent 15, (c) B ~ B er skjelettdeler koblet hovedsakelig av kjemisk stabile, vesentlig uladede, hovedsakelig achiral-bindinger, (d) skjelett-dellengden varierer fa 5 til 7 atomer dersom skjelettdelene har en syklisk struktur og varierer fra 4 til 6 atomer dersom skjelettdelene har en asyklisk struktur og (e) skjelettdelene understøtter gjenkjenningsdelene ved posisjonen som muliggjør Watson/Crick baseparring mellom gjenkjenningsdelene og tilsvarende, i-sekvens-baser til målsekvensen.

Ifølge WO 86/05518 er gjenkjenningsdelene forskjellige naturlige nukleobaser og nukleobase-analoger, og skjelettdelene er enten sykliske skjelettdeler omfattende furan eller morfol i.n-ringer eller asykliske skjelettdeler med følgende : formler:

hvor E er -CO- eller -SO2-. Beskrivelsen angir generelle beskrivelser for syntese av subenheter, for skjelettkoblings-reaksjoner og strategier for polymer oppstilling. Beskrivelsen gir derimot ikke noe eksempel på hvori en krevd forbindelse eller struktur blir fremstilt. Til tross for at WO 86/05518 angir at de krevde polymersammensetningene kan binde målsekvenser og som et resultat av dette har mulige diagnostiske og terapeutiske anvendelser, så inneholder søknaden ingen data vedrørende bindingsaffiniteten til en krevd polymer.

Internasjonal patentsøknad WO 86/05519 krever diagnostiske reagenser og systemer som omfatter polymerene beskrevet i WO 86/05518, men som er koblet til en fast bærer. WO 86/05519 tilveiebringer heller ingen eksempler vedrørende fremstilling av et krevd diagnostisk reagens, men mindre data som viser den diagnostiske effektiviteten til et slikt reagens.

Internasjonal patentsøknad WO 89/12060 beskriver forskjellige byggeblokker for syntetisering av oligonukleotidanaloger samt oligonukleotidanaloger dannet ved kobling av slike byggeblokker i en definert sekvens. Byggeblokkene kan være enten "rigid" (inneholdende en ring) eller "fleksible" (manglende en ring). I begge tilfellene inneholder blokkene en hydrok-sygruppe og en merkaptogruppe hvorigjennom byggeblokkene blir koblet for å danne oligonukleotidanaloger. Koblingsdelen i oligonukleotidanalogene blir valgt fra gruppen bestående av sulfid (-S-), sulfoksid (-S0-) og sulfon (-S02). W0 89/12060 angir en generell beskrivelse vedrørende syntese av byggeblokker og koblingsreaksjoner for syntese av oligonukleotidanaloger sammen med eksperimentelle eksempler som beskriver fremstilling av byggeblokkene. Søknaden angir derimot ingen eksempler rettet mot fremstilling av en krevd oligonukleotidanalog og ingen data som bekrefter den spesifikke bindingen av en oligonukleotidanalog til et målsøkt oligonukleotid.

01igonukleotider eller derivatene derav er blitt koblet til interkalatorer, for å forbedre bindingen til polylysin eller andre basiske grupper for å forbedre bindingen både til dobbelt- og enkelt-trådet DNA og til peptider for å forbedre membran-penetreringen. Slik binding har derimot ikke resultert i tilfredsstillende binding for verken dobbelt-trådet eller enkelt-trådet DNA. Andre problemer som var et resultat av f.eks. metylfosfonater og monotiofosfater, var oppståelse av chiralitet, utilstrekkelig syntetisk utbytte eller vanskeligheter ved å utføre fast fase-assisterte synteser. I de fleste tilfellene kunne bare noen få av disse modifikasjonene bli anvendt. Selv da var det bare mulig å danne korte sekvenser, ofte bare dimerer eller monomerer. Oligomerene som blir dannet er sjelden blitt vist å bindes til DNA eller RNA eller er ikke blitt undersøkt biologisk.

Størstedelen av disse skjelett-modifikasjonene førte til redusert stabilitet for hybridet dannet mellom det modifiserte oligonukleotidet og dets komplementære native oligonukleotid, vurdert ifølge målte Tm verdier. Det er generelt kjent innenfor fagområdet at skjelett-modifikasjoner de-stabiliserer slike hybrider, dvs. resulterer i lavere Tm verdier og bør bli holdt ved et minimum.

Det er en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe forbindelser som binder ssDNA og RNA tråder for å danne stabile hybrider dermed.

En annen hensikt ifølge oppfinnelsen er å tilveiebringe forbindelser som binder ssDNA og RNA tråder sterkere enn tilsvarende DNA.

En annen hensikt er å tilveiebringe forbindelser hvor naturlig forekommende nukleobaser eller andre nukleobase-bindende deler er kovalent bundet til et peptid-skjelett.

En annen hensikt er å tilveiebringe forbindelser forskjellige fra RNA som kan binde en tråd av et dobbelt-trådet polynukleotid for derved å forflytte den andre tråden.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny klasse forbindelser kjent som peptid-nukleinsyrer (PNA) som binder komplementære ssDNA og RNA tråder sterkere enn et tilsvarende DNA. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen omfatter generelt ligander koblet til et peptidskjelett via en azanitrogen. Representative ligander omfatter enten fire hoved naturlig forekommende DNA baser (dvs. tymin, cytosin, adenin eller guanin) eller andre naturlig forekommende nukleobaser (f.eks. inosin, uracil, 5-metylcytosin eller tiouracil) eller kunstige baser

(f.eks. bromotymin, azaadeniner eller azaguaniner, osv.)

koblet til et peptid-skjelett gjennom en egnet linker.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en forbindelse, kjennetegnet ved at den har formelen:

hvor

n er minst 2,

hver av L<1> - Ln er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, ( C^- C^)alkanoyl, naturlig forekommende nukleobaser, ikke-natur1ig forekommende nukleobaser, aromatiske deler, DNA interkalatorer, nukleobase-bindende grupper, heterocykli ske deler og reporter-1igander, idet minst en av L-<1->Ln er en naturlig forekommende nukleobase, en ikke-naturlig forekommende nukleobase, en DNA interkalator, eller en nukleobase-bindende gruppe,

hver av A^-A<11> er en enkelt-binding, en metylengruppe eller en gruppe med formel (Ila) eller (Ilb):

hvor:

X er 0, S, Se, NE<3>, CH2 eller C(CH3)2<;>

Y er en enkeltbinding, 0, S eller NR<4>,

hver av p og q er 0 eller et tall fra 1 til 5, summen p+q er ikke mer enn 6,

hver av r og s er null eller et tall fra 1 til 5, summen r+s er ikke mer enn 5,

hver R<1> og R<2> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, ( C^- C^)alkyl som kan være hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert,

■hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen, og

hver R<3> og R<4> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, ( C1- Ci)alkyl, hydroksy- eller

alkoksy- eller alkyltio-substituert ( C^- C^)alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltlo og amino;

hver av B^-B<11> er N eller R<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor,

hver av fji-C11 er CR<6>R<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR<6>R7CH2, hvor R<6> er hydrogen og R<7> blir valgt fra gruppen bestående av sidekjeder av naturlig forekommende alfa-aminosyrer, eller R<6> og R<7> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (Cg-C^)alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, ( C^- C^)alkoksy, (C^-C6)alkyltio, NR<3>R<4> og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert ovenfor og R<5> er hydrogen, (C^-C^, )alkyl, hydroksy-, alkoksy- eller alkyltio-substituert (C^-Cfc )alkyl, eller R<6> og R<7> fullfører sammen et alisyk-lisk eller heterosyklisk system,

hver av D-^-D<11> er CR<6>R7, CH2CR<6>R<7> eller CHR<6>CHR<7>, hvor r<6> og R<7> er som definert ovenfor,

hver av G1-Gn_1 er -NR<3>C0-, -NR<3>CS-, -NR<3>S0- eller -NRS02-, Y i en hvilken som helst orientering, hvor R<3> er som definert ovenfor,

Q er -C02H, -CONR'R'', -SO3N eller -SO^<N>R<*>!*" eller et aktivert derivat av -C02H eller -SO3H; og

I er -NHR'''R'''' eller -NR'''C(0 )R ' ' ' ' , hvor R', R", R'<*>' og R''"' uavhengig blir valgt fra gruppen bestående av hydrogen, alkyl, aminobeskyttende grupper, reporterligander, interkalatorer, chelatorer, peptider, proteiner, karbohydrater, lipider, steroider, oligonukleotider og oppløselige og ikke-oppløselige polymerer.

Peptidnukleinsyrene ifølge oppfinnelsen er forskjellig fra de som er beskrevet i WO 86/05518 på grunn av at deres gjenkjenningsdeler er koblet til et azanitrogenatom i skjelettet istedet for til et amid nitrogenatom, en hydrazindel eller et karbonatom i skjelettet.

Foretrukne peptidnukleinsyrer har generell formel (III):

hvor:

hver L blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, fenyl, heterocykliske deler, naturlig forekommende nukleobaser og ikke-naturlig forekommende nukleobaser,

hver R<7>' blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen og sidekjeder av naturlig forekommende a-aminosyrer,

n er et tall fra 1 til 60,

hver av k, 1 og m er uavhengig null eller et tall fra 1 til 5,

R<n> er OH, NH2 eller -NHLysNH2; og

R<1> er H eller C0CH3.

Spesielt foretrukket er forbindelser med formel (III) hvor hver L uavhengig blir valgt fra gruppen bestående av nukleobasene tymin (T), adenin (A), cytosin (C), guanin (G) og uracil (TJ), k og m er null eller 1, og n er et tall fra 1 til 30, spesielt fra 4 til 20. Et eksempel på en slik forbindelse er gitt i Figur 1, som viser den strukturelle likheten mellom slike forbindelser og enkelt-trådet DNA.

Peptidnukleinsyrene ifølge oppfinnelsen blir syntetisert ved tilpasning av utgangspeptid-synteseprosedyren, enten i oppløsning eller på en fast fase. Syntonene som blir anvendt er spesielt konstruerte monomer-aminosyrer eller deres aktiverte derivater, beskyttet ved standard beskyttelsesgrupper. Oligonukleotidanalogene kan også bli syntetisert ved anvendelse av de tilsvarende diacidene og diaminene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en forbindelse, kjennetegnet ved at den har en av førlgende formler:

hvor:

L blir valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, (cl~c4)alkanoyl, naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser, aromatiske deler, DNA interkalatorer, nukleobase-bindende grupper og reporterligander , hvor: aminogruppene eventuelt blir beskyttet av aminobeskyttende grupper,

A er en enkeltbinding eller en gruppe med formel:

hvor

X er 0, S, Se, NR<3>, CH2 eller C(CH3)2<;>

Y er en enkeltbinding, 0, S eller NR<4>;

hver av p og q er null eller et tall fra 1 til 5, summen av p+q er ikke mer enn 10;

hver av r og s er null eller et tall fra 1 til 5, summen r+s er ikke mer enn 10,

hver R<1> og R<2> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C1-C4 )alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert (C1-C4)alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen; og

hver R<3> og R<4> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, ( C^- C^)alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert ( C-^- C^)alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio og amino;

B er N eller R<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor;

hver C er CR<6>R<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR<6>R<7>C<H>2, hvor R<6> er hydrogen og R<7> er valgt fra gruppen bestående av sidekjedene til naturlig forekommende alfa-amino syrer, eller R<6> og R<7> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C2-C^)alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, (C^ - C^)alkoksy, (C1-C6 )alkyltio, NR<3>R4 og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert ovenfor og R<5> er hydrogen eller (C-^ - C^, )alkyl,

hydroksy-, alkoksy- eller alkyl tio-substi tuert (C^-C^, )alkyl, eller R<6> og R<7> fullfører sammen et alicyklisk eller hetéro-cyklisk system,

hver D er CR<6>R<7>, CH2CR<6>R7 eller CHR<6>CHR<7>, hvor R<6> og R<7> er som definert ovenfor,

hver E er COOH, CSOH, SOOH, S02OH eller et aktivert eller beskyttet derivat derav, og

hver F er NHR<3> eller NPgR<3>, hvor R<3> er som definert ovenfor og Pg er en amino-beskyttende gruppe.

Foretrukne monomersyntoner ifølge oppfinnelsen er aminosyrer med formel (VII):

eller amino-beskyttede og/eller aminoterminale aktiverte derivater derav, hvor L blir valgt fra gruppen bestående av hydrogen, fenyl, heterocykliske deler, naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser og beskyttede derivater derav, og R<7>' blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen og sidekjeder fra naturlig forekommende cx-aminosyrer. Spesielt foretrukket er slike syntoner med formel (VII) hvor R<7>, er hydrogen og L blir valgt fra gruppen bestående av nukleobasene tymin (T), adenin (A), cytosin (C), guanin (G) og uracil (U) og beskyttede derivater derav.

Det er uventet at disse forbindelsene også kan gjenkjenne dupleks DNA ved erstatning av en tråd for derved å danne en dobbel heliks med denne andre. En slik gjenkjenning kan foregå til dsDNA sekvenser som er 5 - 60 basepar lange. Sekvensene mellom 10 og 20 baser er av interesse på grunn av at dette er området hvor unike DNA sekvenser fra prokaryoter og eukaryoter finnes. Reagenser som gjenkjenner 17 - 18 baser er av,, spesiell interesse på grunn av at dette er lengden av unike sekvenser i det humane genomet. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen skal også kunne danne trippel helikser med dsDNA.

På grunn av at den forbedrede bindingen av forbindelsen ifølge oppfinnelsen skal gjøre dem effektive som antisens midler, er det ventet at det utvidede området til de relaterte reagenser kan forårsake forflytning idet denne overraskende og uventede adferden til dsDNA er blitt oppdaget .

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for å fremstille en forbindelse som tidligere nevnt, kjennetegnet ved følgende trinn: A) tilveiebringing av et polymersubstrat, idet nevnte polymer blir funksjonalisert med en kjemisk gruppe som kan danne en forankringsbinding med en aminosyre, B) kobling av nevnte polymer med en første aminosyre gjennom nevnte forankringsbinding, idet nevnte første aminosyre har formelen (IV):

nvor:

L blir valgt fra gruppen bestående av naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser, aromatiske deler, DNA interkalatorer, nukleobase-bindende grupper, heterocykliske deler og reporterligander, hvor aminogruppene eventuelt er beskyttet av aminobeskyttende grupper,

A er en enkeltbinding eller en gruppe med formel:

hvor:

X er 0, S, Se, NE<3>, CH2 eller C(CH3)2<;>

Y er en enkeltbinding, 0, S eller NR<4>;

p og q er null eller et tall fra 1 til 5, idet summen av p+q ikke er mer enn 10,

r og s er null eller tall fra 1 til 5, summen av r+s er ikke mer enn 10,

E<1> og E<2> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, ( C±- C% )alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert ( C-^- C^ )alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen, og

E<3> og E<4> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, ( C±- Cq )alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert ( C-^- C^ )alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio og amino;

B er N eller E<3>N<+>, hvor E<3> er som definert ovenfor;

C er CE<6>E<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR<6>E<7>CH2, hvor E<6> er hydrogen og E<7> er valgt fra gruppen bestående av sidekjeder av naturlig forekommende alfa-amino syrer, eller E<6> og E<7> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (Cg-C^, )alkyl, aryl, aralkyl , heteroaryl , hydroksy, (C-^-C^ )alkoksy, ( C-^-C^ )alkyl-tio, NR<3>R<4> og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert ovenfor og R<5> er hydrogen eller (C^-C^ )alkyl, hydroksy-, alkoksy- eller alkyltio- substituert (C-l-C6 )alkyl, eller R<6> og R<7> fullfører sammen et alicyklisk eller heterocyklisk system;

D er CR<6>R7, CH2CR<6>R<7> eller CHR6CHR<7>, hvor R<6> og R<7> er som definert ovenfor,

E er COOH eller et aktivert eller beskyttet derivat derav og F er NPgR3 hvor R<3> er som definert ovenfor og Pg er en amino-beskyttende gruppe; C) fjerning av nevnte amino-beskyttende gruppe fra nevnte koblede første aminosyre for å danne en fri aminogruppe og D) omsette nevnte frie aminogruppe med en andre aminosyre som har formelen (IV) for å danne en peptidkjede.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en anvendelse av forbindelsen som tidligere nevnt for fremstilling av en sammensetning for anvendelse i moduleringen av ekspresjonen av et gen i en organisme ved administrering av sammensetningen til organismen slik at forbindelsen spesifikt binder til DNA eller RNA avledet fra genet.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for å drepe virus eller celler in vitro, kjennetegnet ved at den omfatter å bringe i kontakt cellene eller virus med en forbindelse som tidligere nevnt som spesifikt binder til en del av genomet til cellene eller viruset.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter en forbindelse ifølge en forbindelse som tidligere nevnt og minst én farmasøytisk effektiv bærer, binder, tykner, diluent, buffer, konserveringsmiddel eller overflateaktivt middel.

De mange trekkene og fordelene ved foreliggende oppfinnelse kan bli bedre forstått av fagfolk innenfor området med referanse til de vedlagte figurene hvor: Figur 1 viser et naturlig forekommende deoksyribooligonukleo-tid (A) og en peptid nukleinsyre (PNA) ifølge oppfinnelsen

(B).

Figur 2 angir eksempler på naturlig forekommende og ikke-naturlig forekommende nukleobaser for DNA gjenkjenning og reportergrupper. Figur 3 angir en skjematisk illustrasjon av (a) fotospaltning av Acri-CTaegj-LQ-Lys-NHg (Acr-T10-LysNH2); (b) fotoavtrykk ved diazo-koblet akridin av Acr1-(Taeg )10-Lys-NH2 og foretrukket KMn04-spaltning, og (c) S^-nuklease-forsterket spaltning og (d) mikrococcus nuklease-spaltning av Acr<1->

(Taeg)iQ-Lys-NHg bindingssete.

Figur 4 angir eksempler på PNA monomersyntoner ifølge oppf innelsen. Figur 5 viser Acr^ liganden og en PNA, Acr^-(Taeg)^Q-Lys-NH2. Figur 6 angir et generelt skjema for fremstilling av monomersyntoner . Figur 7 viser et generelt skjema for fremstilling av Acr<* >liganden. Figur 8 viser et generelt skjema for fast-fase PNA syntesen som illustrerer separering av lineære ubeskyttede PNA amider. Figur 9 viser analytiske HPLC kromatogrammer av (A) rå H-[Taeg]15-NH2 etter HF-spaltning (før lyofilisering); (B) rå Acr^-tTaeg]25-NH2 etter HF-spalting (før lyofilisering); og (C) renset Acr<1->[Taeg]15<->NH2. Buffer A, 5$ CH3CH/95# H20/0.0445# TFA; buffer B, 60% CH3CN 40# H20/0.0390# TFA; lineær gradient, 0-100$ B i 30 min; strømningsrate, 1.2 ml/min; kolonne, Vydac C-^s (5 pm, 0.46 x 25 cm). Figur 10 viser analytiske HPLC kromatogrammer av: (A) renset H-[Taeg]10-Lys-NH2°S (B) renset H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2 ved anvendelse av de samme betingelsene som i Figur 9. Figurene lia og 11b viser binding av AcrT10-Lys tilø dA^g. 5 '-32P-merket oligonukleotid (1) (5'-GATCCA10G) ble inkubert i fravær eller nærvær av Acr-T10-LysNH2 og i fravær eller nærvær av oligonukleotid (2) (5'-GATCCT10G) og prøvene ble analysert ved polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) og autoradiografi under "native betingelser" (Figur lia) eller under "denaturerende betingelser" (Figur 11b). Figurene 12 a-c viser kjemisk, fotokjemisk og enzymatisk probing av dsDNA-Acr-T10-LysNH2 komplekset. Kompleksene mellom Acr-T10-LysNH2 og et <32>P-endemerket DNA fragment inneholdende en dA^g/dT^Q målesekvens ble probet ved affini-tetsprobespaltning (Figur 12a, kolonnene 1-3; Figur 12b, kolonnene 1-3), fotoavtrykk (Figur 12a, kolonnene 5-6), kaliumpermanganatprobing (Figur 12b, kolonnene 4-6) eller probing ved stafylococcus nuklease (Figur 12b, kolonnene 8-10) eller ved nuklease S-^ (Figur 12c). Enten A-tråden (Figur 12a) eller T-tråden (Figur 12 b,c) ble probet. Figur 13 viser en fremgangsmåte for syntese av beskyttede PNA syntoner. Figur 14 viser en fremgangsmåte for syntese av en beskyttet adenin monomer synton. Figur 15 viser en fremgangsmåte for fremstilling av en beskyttet guanin monomersynton.

Figur 16 viser eksempler på PNA hovedkjede-endringer.

Figur 17 gir en fremgangsmåte for syntese av tymin monomer syntoner med sidekjeder tilsvarende de normale aminosyrene. Figurene 18a og 18b viser fremgangsmåter for fremstilling av en aminopropylanalog og en propionylanalog av en tymin monomer syntoii. Figur 19 viser en fremgangsmåte for fremstilling av en aminoetyl-e-alanin analog av tymin monomersynton. Figur 20 viser en PAGE autoradiograf som demonstrerer at PNAs-T10, -TgC og -T8C2 blir bundet til dobbelt-trådet DNA med høy sekvens-spesifisitet. Figur 21 viser en graf basert på densitometrisk scanning av PAGE autoradiograf som demonstrerer kinetikken til binding av PNA-TlfJ til et dobbelt-trådet mål. Figur 22 viser en graf basert på densitometrisk scanning av PAGE autoradiografer som demonstrerer de termiske stabilitet-ene til PNA med varierende lengder bundet til et A^q/T^q dobbelt-trådet DNA mål. Figur 23 viser en elektroforetisk gelfarging som demonstrerer at restriksjonsenzym-aktiviteten overfor DNA blir inhibert når PNA er bundet proksimalt til restriksjonsenzym-gjenkjen-ningssetet. Figur 24 viser en PAGE autoradiograf som demonstrerer at <125>I-merket PNA-T^q bindes til et komplementært dA^g oligonukleotid . Figur 25 viser en peptid nukleinsyre ifølge oppfinnelsen. Figur 26 viser synteseretningen for en peptidnukleinsyre ifølge oppfinnelsen. Figur 27 viser en test for tosylgruppen som en nitrogen-beskyttende gruppe ved syntese av peptid nukleinsyrer.

I oligonukleotid analogene og monomer syntonene ifølge oppfinnelsen.er liganden L hovedsakelig en naturlig forekommende nukleobase koblet i samme posisjon som den som finnes i naturen, dvs. posisjon 9 for adenin eller guanin, og posisjon 1 for tymin eller cytosin. Alternativt kan L være en ikke-naturlig forekommende nukleobase (nukleobase analog), en base-bindende del, en aromatisk del ( C^- C^)alkanoyl, hydroksy eller til og med hydrogen. Noen vanlige nukleobase ligander og illustrerende syntetiske ligander er vist i Figur 2. Videre kan L være en DNA interkalator, en reporter ligand som f.eks. en fluorofor, radiomarkør, spinnmarkør, et hapten eller en protein-gjenkjennende ligand såsom biotin.

I monomersyntoner kan L bli blokkert med beskyttelsesgrupper. Dette er illustrert i Figur 4 hvor Pg<1> er en syre, en base eller en hydrogenolytisk eller fotokjemisk spaltbar beskyttelsesgruppe såsom f.eks. t-butoksykarbonyl (Boe), fluorenyl-metyloksykarbonyl (Fmoc) eller 2-nitrobenzyl (2Nb ).

Linkeren A kan være forskjellige grupper såsom -CR<1>R<2>C0-,-CR<1>R<2>CS-, -CR<1>R<2>CSe-, -CR1R<2>CNHR<3->, -CR1R2C=CH2- og-CR1R2Cd=C(CH3)2-, hvor R1, R<2> og R3 er som definert ovenfor. A er fortrinnsvis metylenkarbonyl (-CH2CO-). A kan være en lengre kjededel såsom propanoyl, butanoyl eller pentanoyl, eller et tilsvarende derivat, hvor 0 blir erstattet med en annen X verdi eller kjeden er substituert med R^R<2> eller er heterogen, inneholdende Y. Videre kan A være en (C2-C^,)-alkylenkj ede, en (C2-C^, )alkylenkj ede substituert med R-^R<2 >eller kan være heterogen, inneholdende Y. I visse tilfeller kan A bare være en enkelt binding.

I den foretrukne formen ifølge oppfinnelsen er B et nitrogenatom som derved presenterer muligheten av et achiralt skjelett. B kan også være R<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor.

I den foretrukne formen ifølge oppfinnelsen er C -CR<6>R<7->, men kan også være en to-karbonenhet, dvs. -CHR<6>CHR<7-> eller-CR<6>R<7>CH2- hvor R6 og R<7> er som definert ovenfor. R<6> og R<7 >kan også være en heteroarylgruppe såsom f.eks. pyrrolyl, furyl, tienyl, imidazolyl, pyridyl, pyrimidinyl, indolyl eller kan bli tatt sammen for å fullføre et alicyklisk system såsom f.eks. 1,2-cyklobutandiyl,1,2-cyklobutandiyl,1,2-cyklopentandiyl eller 1,2-cykloheksandiyl.

I den foretrukne formen ifølge oppfinnelsen er E i monomer-syntonen COOH eller et aktivert derivat derav, og G i oligomeren er -CONR<3->. Som definert ovenfor kan E også være CSOH, SOOH, S02OH eller et aktivert derivat derav, hvorved G i oligomeren blir -CSNR<3->, -SONR<3-> og -S02NR<3->. Aktiveringen kan f.eks. bli oppnådd ved anvendelse av et surt anhydrid eller et aktivt esterderivat, hvor hydrogen i gruppene representert ved E er erstattet med en avspaltbar gruppe egnet for dannelse av det voksende skjelettet.

Aminosyrene som danner skjelettet kan være identisk eller forskjellig. Det er oppdaget at de som er basert på 2-aminoetylglycin er spesielt godt egnede ifølge oppfinnelsen.

I noen tilfeller kan det være av interesse å koble ligander ved hvilke som helst terminus (Q, I) for å modulere bindings-karaktertrekkene til PNA. Representative ligander omfatter DNA interkalatorer som vil forbedre dsDNA bindingen eller, basiske grupper, såsom lysin eller polylysin, som vil styrke bindingen av PNA forårsaket av elektrostatisk interaksjon. For å redusere negativt ladede grupper kan karboksy og sulfo-grupper bli anvendt. Konstruksjon av syntoner muliggjør videre at andre deler blir lokalisert på de ikke-terminale posisjonene.

I et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen er PNA oligomerene konjugert til effektorligander med lav molekylvekt såsom ligander med nukleaseaktivitet eller alkylerende aktivitet eller reporterligander (fluoressens, spinnmarkører, radioak-tive, protein-gjenkjenningsligander, f.eks. biotin eller haptener. I et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen er PNA konjugert til peptider eller proteiner, hvor peptidene har signaliserende aktivitet og proteinene er f.eks. enzymer, transkripsjonsfaktorer eller antistoffer. PNA kan bli koblet til vann-oppløselig eller vann-uoppløselige polymerer. I et annet aspekt ifølge oppfinnelsen blir PNA konjugert til oligonukleotider eller karbohydrater. En PNA oligomer kan bli syntetisert på en del (f.eks. en peptidkjede, reporter, interkalator eller annen type av ligand-inneholdende gruppe) koblet til en fast bærer.

Slike konjugater kan bli anvendt for genmodulering (f.eks. genmålsøkte medikamenter), for diagnostiske midler, for bioteknologi og for naturvitenskapelige hensikter.

Som et ytterligere aspekt av oppfinnelsen kan PNA bli anvendt for å målsøke RNA og ssDNA for å produsere både antisens-type gen-regulerende deler og hybridiseringsprober for identifikasjon og rensing av nukleinsyre. PNA kan bli modifisert på en slik måte at de kan danne trippel helikser med dsDNA. Reagenser som blir bundet sekvens-spesifikt til dsDNA kan anvendes som genmålsøkte medikamenter. Disse blir ansett som ekstremt nyttige medikamenter for behandling av sykdommer såsom cancer, AIDS og andre virus-inf eks j oner, og kan også vise seg å være effektive for behandling av noen genetiske sykdommer. Disse reagensene kan videre bli anvendt innen forskning og diagnostikk for deteksjon og isolering av spesifikke nukleinsyrer.

Trippel heliks prinsippet anses å være det eneste kjente prinsippet innenfor fagområdet for sekvens-spesifikk gjenkjenning av dsDNA. Trippel heliks dannelsen er stort sett begrenset til gjenkjenning av homopurin-hemopyrimidin sekvenser. Tråd-forflytninger er bedre enn trippel heliks gjenkjenning på grunn av at det muliggjør for gjenkjenning av en hvilken som helst sekvens ved anvendelse av fire naturlige baser. Ved tråd-erstatning oppstår gjenkjenning ved fysio-logiske tilstander, dvs. naturlig pH, omgivende (20-40°C) temperatur og middels (100 - 150 mM) ionestyrke.

Gen-målsøkte medikamenter er konstruert med en nukleobase-sekvens (inneholdende 10-20 enheter) som er komplementær med en regulatorisk region (promoter) av målgenet. Ved administrering av medikamentet bindes det til promoteren og blokkerer adgangen dertil av RNA polymerase. Ikke noe mRNA og dermed ikke noe genprodukt (protein) blir produsert. Dersom målet er innenfor et vitalt gen for et virus," vil ingen levedyktige viruspartikler bli produsert. Alternativt bør målet være nedstrøms fra promoteren som forårsaker at DNA polymerase blir terminert ved denne posisjonen og dermed danner et forkortet mRNA/protein som er ufunksjonelt.

Sekvens-spesifikk gjenkjenning av ssDNA ved base komplementær hybridisering kan likeledes blir utledet til målspesifikke gener og viruser. I visse tilfeller er målsekvensen innbefattet i mRNA slik at binding av medikamentet til målet hindrer virkningen av riobsomer og dermed translasjon av mRNA til protein. Peptid nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen er overlegne i forhold til tidligere reagenser på grunn av at de har betraktelig høyere affinitet for komplementær ssDNA. De har videre ingen ladning eller vannoppløselighet som ville lette det cellulære opptaket og de inneholder amider av ikke-biologiske aminosyrer som ville gjøre dem biostabile og motstandsdyktige overfor enzymatisk degradering ved f.eks. protease.

Visse biokjemiske/biologiske egenskaper til PNA oligomerer er illustrert ved de følgende eksperimenter. 1. Sekvens-diskriminering på dsDNA nivå (Eksempel 63, Figur 20 ).

Ved anvendelse av S^-nukleaseprobing teknikken ble diskriminering av bindingen av T10, T5CT4(TgC) & T2CT2CT4(<T>8C2) PNA til gjenkjenningssekvensene A^q, A5GA4 (AgG) & A2GA2GA4 (A§G2) klonet inn i BamHI, Sali eller Pstl setet av plasmid pUC19 analysert. Resultatene (Figur 20) viser at de tre PNA blir bundet til deres respektive gjenkjenningssekvenser med følgende relative ef fektiviteter: PNA - T10: A10 > AgG >> A8G2, PNA - TgC: AgG > A10~ AgG2, PNA - T8C2: A8<G>2<>> AgG >> A-Lo- Ved 37° C fører en feilparring av ti til redusert effektivitet (5 - 10 ganger vurdert) mens to feilparringer ikke er akseptert. 2. Kinetikken til PNA-T10-dsDNA tråd erstatningskompleks-dannelse (Eksempel 66, Figur 21).

Kompleksdannelsen ble probet av S-^-nuklease ved forskjellige tidspunkter etter blanding av PNA og <32>P-merket dsDNA fragment (Figur 21). 3. Stabiliteten til PNA-dsDNA komplekset (Eksempel 67, Figur 22 ).

Kompleksene mellom PNA-Tn og 32P-dsDNA (<A>10</T>10) målet ble dannet (60 min., 37°C). Kompleksene ble deretter inkubert ved ønsket temperatur i nærvær av overskudd oligo-dA^Q i 10 min., og avkjølt til RT og probet med KMn04. Resultatene (Figur 22) viser at den termiske stabiliteten til PNA-dsDNA komplekset etterligner det til PNA oligonukleotidkompleksene med hensyn på "Tm". 4. Inhibisjon av restriksjonsenzymets spaltning ved PNA (Eksempel 65, Figur 23).

Plasmidkonstruksjonen pTIO inneholder en dA^g/dT^Q trakt klonet inn i BamHI setet i pUC19. Spaltning av pTIO med BamHI og PvuII resulterer i to små DNA fragmenter på henhv. 211 og 111 hp. I nærvær av PNA-T^q blir et 336 bp fragment oppnådd som tilsvarer bare spaltning med PvuII (Figur 23). Spaltning av BamHI blir inhibert av PNA bundet proksimalt til restriksjonsenzymsetet. Resultatene viser også at PNA-dsDNA komplekset kan bli dannet med 100$ utbytte. Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av pT8C2 plasmidet og PNA-T8C2. 5. Binding av <125>I-merket PNA til oligonukleotider (Eksempel 63, Figur 24).

Et Tyr-PNA-T^Q-Lys-NHg ble merket med <125>l ved anvendelse av Na<125>I og kloramin-T og renset ved HPLC. 125I-PNA-T10 ble vist å bli bundet til oligo-dA^Q ved PAGE og autoradiografi (Figur 24). Bindingen kunne bli konkurrert med et overskudd denaturert kalvetymus DNA.

Den sekvens-spesifikke gjenkjenningen av dsDNA er illustrert ved binding av et PNA bestående av 10 tymin substituerte 2-aminoetylglycylenheter, som C-termineres i et lysinamid og N-terminerer i et kompleks 9-aminoakridinligand (9-Acr^-(Ta<eg>)10-Lys-N<H>2, Figur lia, 11b) til en dA10/dT10<m>ål" sekvens. Målet er innbefattet i et 248 bp <32>P-ende-merket DNA-f ragment.

Tråderstatningen ble bekreftet ved følgende type av eksperimenter : 1) 9-Acr^-ligand (Figur 5) som er utstyrt med en 4-nitro-benzamido gruppe for å forsikre spaltning av DNA ved bestrålning, ventet bare å spalte DNA i nærheten av dets bindingssete. Ved bestråling av PNA med ovennevnte 248 bp DNA fragment, blir selektiv spaltning ved dA^g/dT^Q sekvensen observert (Figur 3a). 2) I en såkalt fotoavtrykksanalyse hvor et syntetisk diazo-koblet akridin under bestrålning spalter DNA (unntatt hvor DNA er beskyttet av nevnte bindingsforbindelse) ved interaksjon med DNA i nærvær av en DNA-bindende forbindelse.

Et slikt eksperiment ble utført med ovennevnte 248 bp dsDNA fragment som/viste klar beskyttelse overfor fotospaltning av PNA bindingssete (Figur 3b). 3) I et lignende eksperiment viste det DNA-spaltende enzymet mikrococcus nuklease som også er forhindret i dets virkning av de fleste DNA-bindende reagensene øket spaltning ved T-^g-målet (Figur 3c). 4) I en annen eksper iment-type ble den velkjente høye mottageligheten til enkelt-trådete tyminligander (i forhold til dobbelt-trådete tyminligander) overfor kaliumpermanganat oksydering anvendt. Oksydasjon av 248 bp i nærvær av reagenset viste bare oksydasjon av T10-tråden av målet (Figur 3b ). 5) I en lignende demonstrasjonstype viste den enkelt-trådete spesifisiteten til S^ nuklease at bare T^g-tråden av målet ble angrepet (Figur 3d).

Den meget effektive bindingen av (Taeg)^Q, (Taeg^g-Lys-NHg og Acr<1->(Taeg)^Q-Lys-NH2 (Figurene lia, 11b) til tilsvarende dAio ble ytterligere illustrert på to måter: 1. Ligand-oligonukleotidkomplekser vil migrere saktere enn det nakne oligonukleotidet ved elektroforese i polyakrylamid-geler. Slike eksperimenter ble derfor utført med Acr<1->

(Taeg^g-Lys-NHg °&<32>P-ende-merket dA^g. Dette viste redusert migrering under betingelser hvor et normalt dA-^g/- dT^o dupleks er stabilt, samt under betingelser hvor en slik dupleks er ustabil (denaturerende gel). Et kontroll-eksperi-

ment ble utført med en blanding av Acr<1->(Taeg)^o_Lys_NH2°§ <32>P-ende-merket dT^g som ikke viste noen forsinkelse under ovennevnte betingelser. 2. Ved dannelsen av DNA dupleksene (dsDNA) fra enkelt-trådet DNA reduseres ekstinsjonskoeffisienten (hypokromiteten). Denatureringen av DNA kan derfor bli fulgt ved måling av forandingene i absorbans f.eks. som en funksjon av Tm, temperaturen hvor 50$ av dupleksen er borte for å tilveiebringe enkelt-tråder.

Duplekser ble dannet fra enkelt-trådete oligodeoksyribonukleotider og DNA angitt nedenfor. Vanligvis ble 0.3 ODg^rj T-rik tråd hybridisert med 1 ekvivalent av den andre tråden ved oppvarming til 90°C i 5 min., avkjølt til en romtemperatur og oppbevart i 30 min. og til slutt lagret i en fryser ved 5°C i minst 30 min. Bufferene som ble anvendt var alle 10 mM i fosfat og 1 mM i EDTA. Bufferen i lavt saltinnhold inneholdt ikke natriumklorid, mens bufferen med medium salt inneholdt 140 mM NaCl og bufferen med høyt salt 500 mM NaCl. pH til alle bufferene var 7.2. Smeltetemperaturen til hybridene ble bestemt på en Gilford Response apparatur. Følgende ekstink-sjonskoeffisienter ble anvendt A: 15.4 ml/jjmol cm; T: 8.8; G: 11.7 og C: 7.3 for både normale ol igonukleotider og PNA. Smeltekurvene ble registrert i trinn på 0.5 C/min. Tm ble bestemt fra det maksimale av første derivat av plottet til

■^260 vs temperatur.

Liste av oligodeoksyribonukleotider:

<*> = to bestemte smeltetemperaturer fremkommer og dette indikerer lokal smelting før fullstendig denaturering.

Hybridet som blir dannet mellom RNA-A (poly rA) og PNA-T^q-Lys-NHg smelter ved en slik høy temperatur slik at den ikke kan bli målt (>90°C). Spesifikk hybridisering blir derimot demonstrert ved det store fallet i Ag^o vec* blanding med RNA-A, men ikke G, C og U. Eksperimentet blir utført ved blanding av 1 ml av en oppløsning av PNA og 1 ml av en oppløsning av RNA, hver med Ag^rj = O. b °g deretter måling av absorbansen ved 260 nm. Deretter blir prøven oppvarmet til 90°C i 5 min., avkjølt til romtemperatur og holdt ved denne temperaturen i 30 minutter og til slutt lagret ved 5°C i 30 min.

Fra ovennevnte målinger kan følgende konklusjoner bli utført. Det er basestabling på grunn av at en smeltekurve blir observert. PNA-DNA hybridet er mer stabilt enn et normalt DNA-DNA hybrid og PNA-RNA er enda mer stabilt. Feilparringer forårsaker signifikante fall i Tm-verdien uansett om den feilparrede basen er i DNA eller i PNA-tråden. Tm-verdien er bare delvis avhengig av ionestyrken i forhold til normale oligonukleotider.

Syntesen av PNA ifølge oppfinnelsen blir diskutert i detalj i det følgende hvor Figur 1 illustrerer en av de foretrukne PNA eksemplene og sammenligner strukturen derav i forhold til et komplementært DNA.

Syntese av PNA oligomerer og polymerer.

Prinsippet med forankring av molekylet på en fast matriks som er behjelpelig med å stå for mellomprodukter iløpet av kjemiske transformasjoner er kjent som fast fase-syntese eller Merrifield syntese (se f.eks. Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 2149 og Science, 1986, 232, 341). Etablerte metoder for trinnvis eller fragmentvis fast-fase sammenstilling av aminosyrer til peptider anvender normalt en kulefor-met matriks av delvis kryss-bundet styren-divinylbenzen kopolymer idet den kryss-bundne kopolymeren er blitt dannet ved perlepolymerisering av styrenmonomeren hvor det er blitt tilsatt en blanding av divinylbenzener. Et nivå på 1-2$ kryss-binding blir vanligvis anvendt. En slik matriks kan også bli anvendt i fast-fase PNA syntese i henhold til foreliggende oppfinnelse (Figur 8).

Vedrørende den opprinnelige funksjonaliseringen av den faste fasen er mer enn femti metoder blitt beskrevet i sammenheng med trandisjonell fast-fase peptidsyntese (se f.eks. Barany og Merrifield i "The Peptides" bind 2, Academic Press, New York, 1979, s. 1-284, og Stewart og Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. utgave., Pierce Chemical Company, Illinois, 1984). Innføring av klormetyl funksjonalitet (Merrifield harpiks; via en klorometyl metyleter/SnCl4 reaksjon), aminometyl funksjonalitet (via en N-hydroksymetyl-ftalimid reaksjon, se Mitchell et al., Tetrahedron Lett., 19763795), og benzhydrylamino funksjonalitet (Pietta, et al., J.. Chem. Soc., 1970, 650 ) er den mest anvendte. Uansett av dets natur er hensikten med funksjonalitet vanligvis å danne en forankringsbinding mellom kopolymerfase-bæreren og C-terminalenden av den første aminosyren som skal bli koblet til den faste bæreren. Forankringsbindinger, som blir dannet mellom den faste bæreren og aminosyre-terminalenden. Det er generelt hensiktsmessig å uttrykke "konsentrasjonen" av en funksjonell gruppe med hensyn på millimol pr. g (mmol/g). Andre reaktive funksjonaliteter som opprinnelig er blitt innført omfatter 4-metylbenzhydrylamino og 4-metoksybenzhydrylamino. Alle disse etablerte metodene er i prinsippet nyttige innenfor sammenhengen av foreliggende oppfinnelse. Foretrukne metoder for PNA syntese anvender aminometyl som den opprinnelige funksjonaliteten på grunn av at aminometyl er spesielt fordelaktig med hensyn på inkorporering av "spacer" eller "håndtak" grupper, på grunn av reaktiviteten til aminogruppen med aminometyl funksjonalitet med hensyn på den essensielle kvantitative dannelsen av amidbindinger til en karboksylsyre-gruppe ved en ende av det spacer-dannende reagenset. Et stort antall relevante spacer- eller håndtak-dannende bifunksjonelle reagenser er blitt beskrevet (se Barany, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 30, 705), spesielt reagenser som er reaktive overfor aminogrupper som de som finnes i aminometyl funksjonen. Representative bifunksjonelle reagenser omfatter 4-(haloalkyl)aryl-lavere alkanoiske syrer såsom 4-(brommetyl)fenyleddiksyre, Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)aryl-lavere alkanoiske syrer såsom Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)fenyleddiksyre, N-Boc-p-acylbenzhydrylaminer såsom N-Boc-p-glutaroylbenzhydrylamin, N-Boc-4'-lavere-alkyl-p-acylbenzhydrylaminer såsom N-Boc-4'-metyl-p-glutaroylbenzhydrylamin, N-Boc-4'-lavere alkoksy-p-acylbenzhydrylaminer, såsom N-Boc-4'-metoksy-p-glutaroyl-benzhydryl-amin og 4-hydroksymetylfenoksyeddiksyre. En type spacer gruppe som er spesielt relevant innenfor sammenhengen i foreliggende oppfinnelse er fenylacetamidometyl (Pam) håndtaket (Mitchell og Merrifield, J. Org. Chem., 1976, 41, 2015) som er avledet fra den elektro-tiltrekkende virkningen av 4-fenylacetamidometyl gruppen er omtrent 100 ganger mer stabil enn den klassiske benzylesterbindingen overfor Boc-amino avspaltningsreagenset trifluoreddiksyre (TFA).

Visse funksjonaliteter (f.eks. benzhydrylamino, 4-metylbenzhydrylamino og 4-metoksybenzhydrylamino) som kan bli inkorporert for spaltning av en syntetisert PNA kjede fra den faste bæreren slik at C-terminalen av PNA kjeden er i amidform krever ingen introduksjon av en spacer gruppe. En hvilken som helst slik funksjonalitet kan med fordel hli anvendt i foreliggende oppfinnelse.

En alternativ strategi vedrørende innføring av spacer eller håndtaksgrupper er det såkalte "fordannede håndtak" strategien (se Tam, et al., Synthesis, 1979, 955-957) som tilveiebringer fullstendig kontroll over koblingen av den første aminosyren og ekskluderer muligheten for komplikasjoner fra tilstedeværelsen av uønskede funksjonelle grupper som ikke er relatert til peptid eller PNA syntesen. I denne strategien er spacer eller håndtakgrupper av samme type som beskrevet ovenfor, omsatt med den første aminosyren som er ønskelig at blir bundet til den faste bæreren, idet aminosyren er N-beskyttet og eventuelt beskyttet ved de andre side-kjedene som ikke er relevant med hensyn på veksten av den ønskede PNA kjeden. I de tilfellene hvor en spacer eller håndtaksgruppe derfor er ønskelig, kan den første aminosyren som skal bli koblet til den faste bæreren enten bli koblet til den frie reaktive enden av en spacer gruppe som er blitt bundet til den opprinnelige innførte funksjonaliteten (f.eks. en aminometylgruppe) eller kan bli omsatt med det spacer-dannende reagenset. Det spacer-dannende reagenset blir deretter reagert med den opprinnelig innførte funksjonaliteten. Andre nyttige forankringsskjemaer omfatter "multifra-koblingsmulige" harpikser (Tam, et al., Tetrahedron Lett., 1979, 4935 og J. Am. Chem. Soc, 1980, 102, 611; Tam, J. Org. Chem., 1985, 50, 5291) som tilveiebringer mer enn en metode for frigjøring og muliggjør derved mer fleksibilitet i syntetisk konstruksjon.

Egnede valg for N-beskyttelse er tert-butyloksykarbonyl (Boe) gruppen (Carpino, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4427; McKay, et al., J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 6180 ) normalt i kombinasjon med benzyl-baserte grupper for beskyttelse av sidekjeder og 9-fluorenylmetyloksy-karbonyl (Fmoc) gruppen (Carpino, et al., J. Am. Chem. Soc, 1970, 92, 5748 og J. Org. Chem., 1972, 37, 3404) normalt i kombinasjon med tert-butyl (tBu) for beskyttelse av hvilke som helst sidekjeder til tross for at et antall andre muligheter eksisterer og som er velkjente i konvensjonell fast-fase peptid syntese. Mange andre nyttige aminobeskyttende grupper eksisterer og noen er Adoc (Hass, et al., J. Am. Chem. Soc, 1966, 88, 1988), Bpoc (Sieber, Heiv. Chem. Acta., 1968, 51, 614), Mcb (Brady, et al., J. Org., Chem., 1977, 42, 143 ), Bie (Kemp, et al., Tetrahedron, 1975, 4624), o-nitrofenylsulfenyl (Nps) (Zervas, et al., J. Am. Chem., Soc, 1963, 85, 3660) og ditiasuccinoyl (Dts) (Barany, et al., J.Am. Chem. Soc, 1977, 99, 7363). Disse aminobeskyttende gruppene, spesielt de som er basert på den meget anvendte uretan funksjonaliteten, som på en vellykket måte, utelukker racemisering (formidlet ved tautomerisering av de lett dannede oksazolinon (azlacton) mellomproduktene (Goodman, et al., J. Am. Chem. Soc, 1964, 86, 2918) iløpet av koblingen av de fleste a-aminosyrene. I tillegg til slike aminobeskyttende grupper, kan mange a~v de ellers "verdiløse" ikke-uretan-typene av aminobeskyttende grupper anvendes ved oppstilling av PNA molekyler, spesielt de som blir dannet fra achirale enheter. Derfor er ikke bare ovennevnte aminobeskyttende grupper (eller de som er avledet fra noen av disse gruppene) nyttige innenfor sammenhengen av foreliggende oppfinnelse, men omtrent en hvilken som helst aminobeskyttende gruppe som stort sett oppfyller følgende krav: (1) stabilitet overfor svake syrer (ikke i betraktelig grad angrepet av karboksylgrupper), (2) stabilitet overfor svake baser eller nukleosider (ikke betraktelig angrepet av aminogruppen som gjelder), (3) motstand overfor acylering (ikke betraktelig angrepet av aktivert aminosyrer. I tillegg: (4) beskyttelsesgrupper må være når opp til kvantitativt fjernbare uten alvorlige bivirkninger og (5) den optiske integriteten, om noen, av den innkommende aminosyren bør fortrinnsvis være sterkt konservert ved kobling. Og av side-kjede beskyttende grupper avhenger generelt på valget av aminobeskyttende grupper på grunn av at beskyttelsen av side-kjede funksjonalitetene må motstå tilstandene med gjentatte aminoavspaltningscykluser. Dette er tilfellet om den totale strategien for kjemisk oppstilling av PNA molekyler er f.eks. basert på forskjellige syrestabilitet til amino og side-kjede beskyttende grupper (som er tilfellet for ovennevnte "Boc-benzyl" tilnærmelse) eller anvender en ortogonal, dvs. kjemo-selektiv, beskyttelsesskjema (som tilfellet er for ovennevnte "Fmoc-tBu" tilnærmelse).

Etter kobling av første aminosyren, utgjør det neste stadiet av fast-fasesyntesen systematisk utforming av ønsket PNA kjede. Denne utformingen omfatter gjentatte avspaltning-/kobingscykluser. Den temporære beskyttelsesgruppen, såsom Boe eller Fmoc gruppen, på den sistkoblede aminosyren blir kvantitativt fjernet ved en egnet behandling, f.eks. ved acidolyse såsom med trifluoreddiksyre, når det gjelder Boe, eller ved basebehandling, såsom med piperidin, når det gjelder Fmoc, for å frigjøre den N-terminale aminfunksjonen.

Den neste ønskede N-beskyttede aminosyren blir deretter koblet til N-terminalen av den sistkoblede aminosyren. Denne koblingen av den C-terminale aminosyren med N-terminalen av den sist-koblede aminosyren ble oppnådd på flere måter. F.eks. kan karboksylgruppen til den innkommende aminosyren bli omsatt direkte med N-terminalen til den sist-koblede aminosyren med hjelp av et kondensasjonsreagens som f.eks. dicykloheksylkarbodiimid (DCC) (Sheehan & Hess, et al., J. Am. Chem. Soc, 1955, 77, 1067 ) og di isopropylkarbodi imid (DIC) (Sraantakis et al., Biochem. biophys. res. Commun., 1976, 73, 336) eller derivater derav. Alternativt kan det bli bundet ved å tilveiebringe den innkommende aminosyren i en form med karboksylgruppen aktivert ved hjelp av hvilke som helst av flere metoder, inkludert den opprinnelige dannelsen av et aktivt esterderivat såsom et 2,4,5-triklorfenylester (Pless, et al., Heiv. Chim. Acta, 1963, 46, 1609), en ftalimidoester (Nefkens, et al., J. Am. Chem. Soc, 1961, 83, 1263), en pentaklorfenylester (Kupryszewski, Rocz. Chem., 1961, 35, 595), en pentafluorfenylester (Kovacs, et al., J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 183) en o-nitrofenylester (Bodanzsky, Nature, 1955, 175, 685), en imidazolester (Li, et al., J. Am. Chem. Soc, 1970, 92, 7608), og en 3-hydroksy-4-okso-3,4-dihydroquinazolin (Dhht-OH) ester (Konig, et al., Chem. Ber., 1973, 103, 2024 og 2034), eller den opprinnelige dannelsen av et anhydrid såsom et symmetrisk anhydrid (Wieland, et al., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1971, 10, 336). Benzotriazolyl N-oksytrisdimetylaminofosfonium heksafluorfosfat (BOP), "Castro's reagent" (se f.eks. Rivaille, et al., Tetrahedron, 1980, 36, 3413) er anbefalt ved oppstilling av PNA molekyler inneholdende sekundære aminogrupper. Aktiverte PNA monomerer som er analoge med de nylig rapporterte aminosyrer fluoridene (Carpino, J. Am. Chem. Soc, 1990, 112, 9651 ) er lovende for anvendelse også i PNA syntesen.

Etter oppstilling av den ønskede PNA kjeden, inkludert beskyttelsesgrupper, vil det neste trinnet normalt bli avspaltning av aminosyredelene til PNA kjeden og spaltning av det syntetiserte PNA fra den faste bæreren. Disse prosessene kan foregå vesentlig samtidig for derved å tilveiebringe det frie PNA molekylet i ønsket form. I de tilfellene hvor kondensasjon av to separat syntetiserte PNA kjeder skal bli utført, er det mulig ved valg av en egnet spacergruppe ved begynnelsen av syntesen å spalte de ønskede PNA kjedene fra deres respektive faste bærere (begge peptidkjeder har fortsatt inkorporert side-kjede beskyttende grupper) og til slutt fjerning av side-kjede beskyttende grupper etter f.eks. kobling av de to side-kjede beskyttende peptidkjedene for å danne en lengre PNA kjede.

I det ovennevnte "Boc-benzyl" beskyttelsesskjemaet, blir den endelige avspaltningen av side-kjedene og frigjøringen av PNA molekylet fra den faste bæreren som oftest utført ved anvendelse av sterke syrer såsom vannfri HF (Sakakibara, et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1965, 38, 4921), bor tris (trifluoracetat) (Pless, et al., Heiv. Chim. Acta, 1973, 46, 1609), og sulfonsyre såsom trif1normetansulfonsyre og metansulfonsyre (Yajima, et al., J. Chem. Soc, Chem. Comm. , 1974, 107). Denne konvensjonelt sterke syreavspaltnings-metoden (f.eks. vannfri HF), produserer meget reaktive karbokationer som kan føre til alkylering og acylering av sensitive residier i PNA kjeden. Slike side-reaksjoner blir bare delvis unngått ved tilstedeværelse av omfangere (scavengers ) .såsom anisol, fenol, dimetyl sulfid og merkapto-etanol og derfor blir sulf id-assisterte acidolytiske Sjj2 avspal tningsmetoder (Tam, et al., J. Am. Chem. Soc, 1983, 105, 6442 og J. Am. Chem. Soc, 1986, 108, 5242 ) den såkalte "lave", som fjerner forløperne ved skadelig karbokationer for å danne inerte sulfoniumsalter, ofte anvendt i peptid og PNA syntesen, enten alene eller i kombinasjon med "høye" metoder. Mindre ofte blir det i spesielle tilfeller anvendt andre metoder for avspaltning og/eller endelig spaltning av PNA-fast bindingen, f.eks. slike metoder som base-katalysert alkoholyse (Barton, et al., J. Am. Chem. Soc, 1973, 95, 4501) og ammonolyse samt hydrazinolyse (Bodanszky, et al., Chem. Ind., 1964 1423), hydrogenolyse (Jones, Tetrahedron Lett. 1977, 2853 og Schlatter, et al., Tetahedron Lett. 1977, 2861 ) og fotolyse (Rich og Gurwara, J. Am. Chem. Soc, 1975 97, 1575).

I kontrast til kjemisk syntese av "normale" peptider, kan trinnvis kjedeoppbygning av achirale PNA såsom de som er basert på aminoetyl glycylskjelett-enheter begynne enten fra N-terminusen eller C-terminusen på grunn av at koblingsreaksjonene er fri for racemisering. Fagfolk innenfor dette området vil oppdage at synteser forløpende med C-terminalenden anvender vanligvis beskyttede aminogrupper og frie eller aktiverte syregrupper, mens synteser begynnende ved N-terminusen anvender vanligvis beskyttede syregrupper og frie eller aktiverte aminogrupper.

Basert på oppdagelsen av at de fleste operasjonene er identiske i de syntetiske cyklusene til fast-fase peptidsyntesen (som også er tilfellet for fast-fase DNA syntesen), ble en nye matriks, PEPS, nylig introdusert (Berg, et al., J. Am. Chem. Soc, 1989, 111, 8024 og International Patent Application WO 90/02749) for å lette fremstilling av store antall peptider. Denne matriksen består av en polyetylen (PE) film med utragende lang-kjedete polystyren (PS) podninger (molekylvekt i størrelse på IO<6>). Belastnings-kapasiteten til filmen er så høy som den til en kuleformig matriks, men PEPS har den ytterligere fleksibiliteten for å være egnet for samtidig multippel syntese. I en ny konfigurasjon for fast-fase peptidsyntesen, er PEPS filmen utstyrt i form av diskrete, merkede ark, som hver virker som en individuell avdeling. Iløpet av alle identiske trinn til syntesecyklusen, blir arkene holdt sammen i en enkelt reaksjonsbeholder for å muliggjøre samtidig preparering av mange peptider i en rate som er nær opp til et enkelt peptid ved hjelp av konvensjonelle metoder. Det ble antatt at PEPS filmbæreren omfattende linker eller spacergrupper tilpasset til den bestemte kjemien bør være spesielt verdifull ved syntese av multipple PNA molekyler, idet disse er konseptuelt enkelt å syntetisere på grunn av at bare fire forskjellige reaksjons-avdelinger normalt er nødvendig, en av hver av de fire "pseudo-nucleotid" enhetene. PEPS filmbæreren er dermed blitt testet på en vellykket måte i et antall PNA synteser utført på en parallell og vesentlig samtidig måte. Utbyttet og kvaliteten til produktene oppnådd fra PEPS var sammenlign-bare med de som ble oppnådd ved anvendelse av den tradisjon-elle polystyren-kuleformige bæreren. Eksperimenter med andre geometrier av PEPS polymeren såsom f.eks. ikke-vevd filter, strikkede nett, pinner eller mikrobrønn-skåler, har ikke angitt begrensninger på syntetisk effektivitet.

To andre metoder som er foreslått for samtidig syntese av store antall peptider eller også for fremstilling av multip-le, forskjellige PNA molekyler. Den første av disse metodene

(Geysen, et al., Proe Nati. Acad. Sei. USA, 1984, 81, 3998)

anvender akryliske syre-podete polyetylen staver og 96-

mikrotiter brønner for å immobil isere de voksende peptidkjedene og for å utføre den avdelingsinnstilte syntesen. Fremgangsmåten kan bare anvendes på en mikrogram skala på grunn av at den er meget effektiv. Den andre metoden

(Houghten, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1985, 82, 5131)

anvender en "tepose" inneholdende tradisjonelt anvendte polymerkuler. Andre relevante forslag for multippel peptid eller PNA syntese i sammenheng med foreliggende oppfinnelse omfatter den samtidige anvendelse av to forskjellige bærere med forskjellige tettheter (Tregear, i "Chemistry and Biology of Peptides", J. Meienhofer, ed., Ann Arbor Sei. Publ. , Ann Arbor, 1972, s. 175 - 178), kombinering av reaksjonsbeholder-ene via en manifold (Gorman, Anal. Biochem., 1984, 136, 397), multikolonne fast-fase syntese (f.eks. Krchnak, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1989, 33, 209), og Holm og Meldal, i "Proceedings of the 20th European Peptide Symposium", G. Jung og E. Bayer, eds., Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1989 s. 208 - 210) og anvendelse av cellulosepapir (Eichler, et al., Collect. Czech. Chem. Commun., 1989, 54, 1746).

Idet den konvensjonelle kryss-bundede styren/divinylbenzen kopolymer-matriksen og PEPS bæreren for tiden er foretrukket i fast-fase PNA syntese, utgjør en ikke-begrensende liste av eksempler på faste bærere som kan være relevante: (1) Partikler basert på kopolymerer av dimetylakrylamid kryss-bundet med N,N'-bisakryloyletylendiamin, inkludert en kjent mengde N-tertbutoksykarbonyl-beta-alanyl-N'-akryloylheksa-metylendiamin. Flere spacer-molekyler blir vanligvis tilsatt via en beta alanylgruppe etterfulgt av aminosyre rest subenheter. Beta alanyl-inneholdende monomer kan også bli erstattet med en akryloyl sarkosinmonomer iløpet av polymeriseringen for å danne harpikskuler. Polymeriseringen blir etterfulgt av omsetning av kulene med etylendiamin for å danne harpikspartikler som inneholder primære aminer som kovalentlig koblet funksjonalitet. Polyakrylamid-baserte bærere er relativt mer hydrofile enn polystyren-baserte bærere og blir vanligvis anvendt med polare aprotiske oppløsningsmidler inkludert dimetylformamid, dimetylacetamid, N-metylpyrrolidon og lignende (se Atherton, et al., J. Am. Chem. Soc, 1975, 97, 6584, Bioorg. Chem. 1979, 8, 351 ) og J.C.S. Perkin I 538 (1981 )); (2) en andre gruppe av faste bærere er basert på silika-inneholdende partikler såsom porøse glasskuler og silikagel. Et eksempel er reaksjonspro-duktet til triklor-[3-(4klorometyl)fenyl]propylsilan og porøse glasskuler (se Parr og Grohmann, Angew. Chem. Internal. Ed. 1972, 11, 314) solgt under varemerket "PORASIL E" av Waters Associates, Framingham, MA, USA. Likeledes er en monoester av 1,4-dihydroksymetylbenzen og silika (solgt under varemerket "BIOPAK" av Waters Associates) blitt rapportert være nyttig (se Bayer og Jung, Tetrahedron Lett., 1970, 4503 ); (3) en tredje generell type av nyttige faste bærere kan bli betegnet kompositter på grunn av at de inneholder to hovedingredienser; et harpiks og et annet materiale som er også vesentlig inert for organiske syntese-reaksjonsbetingelser som blir anvendt. Et eksempel på en kompositt (se Scott, et al., J. Crom. Seir, 1971, 9, 577 ) anvender glasspartikler belagt med en hydrofob, kryss-bundet styrenpolymer inneholdende reaktive klormetyl-grupper og ble oppnådd fra Northgate Laboratories, Inc., of Hamden, CT, USA. En annen eksempelvis kompositt inneholder en kjerne av fluorinert etylenpolymer hvor det er blitt podet polystyren (se Kent og Merrifield, Israel J. Chem. 1978, 17, 243) og van Rietschoten i "Peptides 1974", Y. Wolman, Ed., Wiley and Sons, New York, 1975, s. 113 - 116); og (4) tilgrensende faste bærere forskjellig fra PEPS, såsom bomullsark (Lebl og Eichler, Peptide Res. 1989, 2, 232) og hydroksypropylakrylat-belagte polypropylenmembraner (Daniels, et al., Tetrahedron Lett. 1989, 4345), er også egnede for PNA syntese.

Enten drevet manuelt eller automatisk, blir fast-fase PNA syntesen i foreliggende oppfinnelse normalt utført i batcher. De fleste syntesene kan derimot likeledes bli utført på kontinuerlig-strømningsmetoder hvor bæreren blir pakket inn i kolonner (Bayer, et al., Tetrahedron Lett., 19780, 4503 og Scott, et al., J. Chromatogr. Sei., 1971, 9, 577). Med hensyn til kontinuerlig-strømnings fast-fase syntese, ser rigid poly(dimetylakrylamid)-Kieselguhr bærer (Atherton, et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1981, 1151) ut til å være spesielt vellykket, men en annen verdi for konfigurasjon vedrører den som er blitt dannet for standard kopolymer(styren-l#-divinylbenzen) bæreren (Krchnak, et al., Tetrahedron Lett. , 1987, ,4469).

Idet fast-fase teknikken for tiden er foretrukket når det gjelder PNA syntese kan andre metodologier eller kombinasjo-ner derav, f.eks. i kombinasjon med fast-fase teknikken også anvendes; (1) den klassiske oppløsnings-fase metoden for peptidsyntese (f.eks. Bodanszky, "Peinciples of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Berlin-New York 1984), enten ved trinnvis sammenstilling eller ved segment/fragment kondensasjon er av spesiell relevanse når produksjon i stor skala blir betraktet (gram, kilogram og til og med tonn) av PNA forbindelsene, (2) den såkalte "væske-fase" strategien, som anvender oppløselige polymeriske bærere såsom lineær polystyren (Shemyakin, et al., Tetrahedron Lett., 1965, 2323) og polyetylen glykol (PEG) (Mutter og Bayer, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1974, 13, 88), er nyttig, (3) tilfeldig polymerisering (se f.eks. Odian, "Peinciples of Polymerization", McGraw-Hill, New York (1970)) gir blandingen av mange molekylvekter ("polydispers") peptid eller PNA molekyler er spesielt relevante for screening av antivirale virkninger, (4) en teknikk basert på anvendelse av polymer-understøttede aminosyre aktive estere (Fridkin, et al., J. Am. Chem. Soc, 1965, 87, 4646), noen ganger referert til som "invers Merrifield syntese" eller "polymerisk reagenssyntese" gir fordelene av isolasjon og rensning av mellomproduktene og kan dermed tilveiebringe en spesielt egnet metode for syntese av PNA molekyler med middels størrelse som eventuelt er beskyttede og som kan deretter bli anvendt for fragment-kondensasjon til større PNA molekyler, (5) det blir betraktet at PNA molekylene kan bli oppstilt enzymatisk av enzymer såsom protease eller derivater derav med nye spesifisiteter (oppnådd f.eks. ved hjelp av kunstige midler såsom protein-omkonstruering). Man kan også betrakte utvikling av "PNA ligase" for kondensasjon av et antall PNA fragmenter inn i meget store PNA molekyler, (6) på grunn av at antistoffer kan bli dannet overfor omtrent et hvilket som helst molekyl av interesse, bør de nylig utviklede katalytiske antistoffene (abzymene), oppdaget samtidig av gruppene til Lerner (Traman-tano, et al., Science, 1986, 234, 1566) og Schultz (Pollack, et al., Science, 1986, 234, 1570) også bli betraktet som potensielle kandidater for oppstilling av PNA molekyler. Det har videre vært svært vellykket for produksjon av enzymer som katalyserer acyl-overføringsreaksjoner (se f.eks. Shokat, et al., Nature 1989, 338, 269) og referanser deri). Fullstendig kunstige enzymer ble nylig utviklet av gruppen til Stewart (Hahn, et al., Science, 1990, 248, 1544), og kan utvikles for å være egnet for PNA syntese. Konstruksjonen av generelt anvendbare enzymer, ligaser og katalytiske antistoffer som kan formidle spesifikke koblingsreaksjoner, bør lettere bli oppnådd for PNA syntese enn for "normal" peptidsyntese på grunn av at PNA molekylene ofte vil bestå av bare fire forskjellige aminosyrer (en av hver av de fire native nukleobasene) sammenlignet med de tyve naturlig forekommende (proteinogene) aminosyrer som utgjør peptider. Ingen enkelt strategi kan være fullstendig egnet for syntese av et spesifikt PNA molekyl og derfor kan noen ganger en kombinasjon av metoder være det beste.

Foreliggende oppfinnelse kan også rettes mot terapeutisk eller profylaktisk anvendelse av peptid nukleinsyrer. Terapeutiske og profylaktiske mål omfatter herpes simplex virus (HSV), human papillomavirus (HPV), human immunsvikt virus (HIV), candidia albicans, influensavirus, cytomegalo-virus (CMV), intracellulære adhesjonsmolekyler (ICAM), 5-1ipoksygenase (5-LO), fosfolipase Ag (PLAg), protein kinase C (PKC) og RAS onkogen. Potensielle anvendelser av en slik målsøking omfatter behandlinger for okkulær, labial, genital og systemisk herpes siplex I og II infeksjoner, kjønnsvorter, cervical cancer, vanlige vorter, Kaposis sarcom; AIDS, hud og systemiske soppinfeksjoner, omgangssyke, lungebetennelse, retinitt og pneumotitt i immunsuppresserte pasienter, mono-nukleose, okkulær, hud og systemisk inflammasjon, kardiovas-kulær sykdom, cancer, astma, psoriasis, cardiovasculær kollaps, hjerteinfarkt, mage-tarmsykdom, nyresykdom, rheumatoid ar.tritt, osteoartritt, akutt pankreatitt, septisk sjokk og Crohns sykdom.

For terapeutisk eller profylaktisk behandling, kan peptidnukleinsyrene ifølge oppfinnelsen bli formulert i en farma-søytisk sammensetning som kan innbefatte bærere, tykningsmid-ler, fortynningsmidler, buffere, konserveringsmidler, overflate-aktive midler og lignende. Farmasøytiske sammensetninger kan også omfatte en eller flere aktive ingredienser såsom anti-mikrobielle midler, anti-inflammatoriske midler, anestesimidler og lignende i tillegg til peptid-nukleinsyren.

Den farmasøytiske sammensetningen kan bli administrert på et antall måter avhengig av om lokal eller systemisk behandling er ønskelig og av området som skal bli behandlet. Adminis-trasjonen kan utføres topisk (inkludert oftalmisk, vaginalt, rektalt, intranasalt), oralt, ved innhalering eller paren-teralt, f.eks. ved intravenøs drypp eller subkutant, intra-peritoneale eller intramuskulære injeksjoner.

Formuleringer for topisk administrasjon kan omfatte salver, vann, kremer, geler, dråper, suppositorer, sprayer, væsker og pulver. Konvensjonelle farmasøytiske bærere, vann, pulver eller oljeholdige baser, fortykningsmidler og lignende kan være nødvendige eller ønskelige. Belagte kondomer kan også være nyttig.

Sammensetninger for oral administrasjon omfatter pulver eller granuler, suspensjoner eller oppløsninger i vann eller ikke-vandig medium, kapsler, puter eller tabletter. Tykningsmid-ler, smakstoffer, fortynningsmidler, emulgeringsmidler, dispergeringshjelpemidler eller bindemidler kan være ønskelig.

Formuleringer for parenteral administrasjon kan omfatte sterile vandige oppløsninger som også kan inneholde buffere, fortynningsmiddel og andre egnede tilsetningsstoffer.

Doseringen er avhengig av alvorligheten og evnen til å reagere i forhold til tilstanden som blir behandlet, men vil normalt være en eller flere doser pr. dag, idet behandlings-forløpet varer fra flere dager til flere måneder eller helt til en helbredelse oppnås eller en redusert sykdomstilstand blir oppnådd. Fagfolk innenfor dette området kan lett bestemme optimale doseringer, doseringsmetodologier og repeti sj onsrater.

Behandling av denne type kan bli utført på forskjellige organismer og variere fra encellede prokaryote og eukaryote organismer til flercellede eukaryote organismer. En hvilken som helst organisme som anvender DNA-RNA transkripsjon og RNA-protein translasjon som en fundamental del av den arvelige, metabolske eller cellulære kontrollen er mottagelig for terapeutisk og/eller profylaktisk behandling. Forskjellige organismer såsom bakterier, gjær, protozoer, alger, alle planter og alle høyere dyreformer, inkludert varmblodige dyr kan bli behandlet. På grunn av at hver celle fra flercellede eukaryoter kan bli behandlet på grunn av at de omfatter både DNA-RNA transkripsjon og RNA-protein translasjon som integrerte deler av deres cellulære aktivitet. Mange av organellene (f.eks. mitochondrier og kloroplast) fra eukaryote celler omfatter også transkripsjon og trans-lasjonsmekanismer. Enkeltceller, cellulære populasjoner eller organeller kan derfor også bli inkludert innenfor definisjonen av organismer som kan bli behandlet med terapeutiske eller diagnostiske fosforotioat oligonukleotider. Heri skal terapeutiske midler innbefatte utrydning av 11

en sykdomstilstand ved dreping av en organisme eller ved kontroll av skadelig cellulær vekst eller ekspressjon.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også den fordelaktige anvendelsen av PNA molekyler i fast-fase biokjemi (se f.eks. "Solid-Phase Biochemistry - Analytical and Synthetic Aspects", W. H. Scouten, ed., John Wiley & Sons, New York, 1983), fast-fase biosystemer, spesielt bioanalyser eller fast-fase teknikker som vedrører diagnostisk deteksjon/kvantifisering eller affinitetsrensing av komplementære nukleinsyrer (se f.eks. "Affinity Chromatography - A Practical Approach", P.D.G. Dean, W.S. Johnson and F.A. Middle, eds., IRL Press Ltd., Oxford 1986; "Nucleic Acid Hybridization - A Practical Approach", B. D. Harnes and S. J. Higgins, IRL Press Ltd., Oxford 1987). Gjeldende fremgangsmåte for utføring av slike bioanalyser eller rensningsteknikker omfatter omtrent bare anvendelse av "normale" eller noen modifiserte oligonukleotider enten fysisk adsorbert eller bundet gjennom en vesentlig permanent kovalent forankringsbinding til kuleformige faste bærere såsom cellulose, glasskuler, inkludert de med kontrollert porøsitet (Mizutani, et al., J. Chromatogr., 1986, 356, 202 ), "Sephadex.., "Sepharose", agarose, polyacrylamid, porøs partikkelform i aluminiumoksid, hydroksyalkyl metakrylatgeler, diol-bundet silika, porøs keramikk eller nærliggende materialer såsom filterskiver av nylon og nitrocellulose. Et eksempel anvendte den kjemiske syntesen av oligo-dT på cellulosekuler for affinitetisolering av poly A halen inneholdende mRNA (Gilham i "Methods in Enzymolkogy", L. Grossmann og K. IMoldave, eds., bind. 21, del D, s. 191, Academic Press, New York og London, 1971). Alle ovennevnte metodene er tilgjengelige innenfor foreliggende oppfinnelse. Når mulig er derimot kovalent binding foretrukket i forhold til fysisk adsorpsjon av molekylene, på grunn av at den sistnevnte metoden har den ulempen at noen de immobil iserte molekylene kan bli vasket ut (desorbert) iløpet av hybridiseringen eller affinitetsprosessen. Det er derfor liten kontroll med i hvilken grad en art adsorbert på overflaten av bærermateria-let blir borte iløpet av de forskjellige behandlingene som bæreren er utsatt for iløpet av bioanalyse/rensningsprose-dyren. Alvorligheten av dette problemet vil selvfølgelig avhenge i stor grad av raten og ved likevekt mellom adsorberte og "frie" arter blir oppnådd. I visse tilfeller kan det være omtrent umulig å utføre en kvantitativ analyse med akseptabel nøyaktighet og/eller reproduserbarhet. Tap av adsorberte arter iløpet av behandling av bæreren med kropps-fluider, vandige reagenser eller vaskemedium vil generelt være ventet å være mest utsatt for arter med relativt lav molekylvekt. Med oligonukleotider er PNA molekyler lettere å få koblet på faste bærere på grunn av at de inneholder sterke nukleofile og/eller elektrofile sentre. Den direkte sammen-stillingen av oligonukleotider på faste bærere lider i tillegg fra en ekstrem lav belastning av det immobiliserte molekylet hovedsakelig forårsaket av den lave overflate-kapasiteten til materialene som muliggjør en vellykket anvendelse av eksisterende fosforamidin-kjemi for konstruksjon av oligonukleotider. (Beaucage og Caruthers, Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859; Caruthers, Science, 1985, 232, 281). De lider også av det faktumet at ved anvendelse av den alternative fosfit triester metoden (Letsinger og Mahadevan, J. Am. Chem. Soc. 1976, 98, 3655 ), som er egnet for faste bærere med en høy overflate/belastningskapasitet, kan bare relativt korte oligonukleotider bli oppnådd. Når det gjelder konvensjonell fast-fase peptid syntese, er derimot sistnevnte bærere meget gode materialer for bygging av immobiliserte PNA molekyler (side-kjede beskyttende grupper blir fjernet fra den syntetiserte DNA kjeden uten spaltning av forankringsbindingen som holder kjeden til den faste bæreren). PNA artene drar fordel av ovennevnte fast-fase teknikk med hensyn på den mye høyere (og fortsatt sekvens-spesifikke) bindingsaffiniteten for komplementære nukleinsyrer og fra den ytterligere unike sekvens-spesifikke gjenkjenningen av (og sterke bindingen til) nukleinsyre som er tilstede i dobbelt-trådete strukturer. De kan også bli applisert på faste bærere i store mengder og dette øker ytterligere sensitiviteten/kapasiteten ved fast-fase teknikken. Visse typer av studier vedrørende anvendelse av DNA i fast-fase kjemi kan bli utført, lettere eller hurtigere ved anvendelse av den nylig rapporterte "light-directed, spatially addressable, parallel chemical synthesis" teknolo-gien (Fodor, et al., Science, 1991, 251, 767). Denne teknikken kombinerer fast-fase kjemi og fotolitografi for å produsere tusenvis av meget forskjellige, men identifiser-bare, permanent immobiliserte forbindelser (såsom peptider) på en vesentlig simultan måte.

Ytterligere hensikter, fordeler og nye trekk ifølge denne oppfinnelsen vil fremkomme for fagfolk innenfor dette området ved granskning av følgende eksempler.

Syntese av monomere byggeblokker

Monomerene blir fortrinnsvis syntetisert ved den generelle metoden beskrevet i Fig. 13. Dette involverer fremstilling av enten metyl eller etylester av (Bocaminoetyl)glycin ved en beskyttelses/avspaltningsprosedyre som beskrevet i Eksemplene 24 - 26. Syntesen av tymin-monomer er beskrevet i Eksemplene 27 - 28 og den til beskyttet cytosin monomer er beskrevet i Eksempel 29.

Syntese av beskyttet adenin monomer (Fig. 14) involverer alkylering med etylbromacetat (Eksempel 30) og verifisering av posisjonen til substitusjonen ved røntgenkrystallografi som er den ønskede 9-posisjon. N<6->aminogruppen ble deretter beskyttet med benzyloksykarbonylgruppen ved anvendelse av reagenset N-etyl-benzyloksykarbonylimidazol tetrafluorborat (Eksempel 31). Enkel hydrolyse av produktesteren (Eksempel 32) ga N<6->benzyloksykarbonyl-9-karboksymetyl adenin som deretter ble anvendt i standard prosedyren (Eksemplene 33-34, Fig. 13). Adeninmonomeren var blitt dannet til to forskjellige PNA-oligomerer (Eksemplene 56, 57, 71 og 73). Syntesen av den beskyttede G-monomeren er beskrevet i Fig. 15. Utgangsmaterialet, 2-amino-6-kloropurin, ble alkylert med bromeddiksyre (Eksempel 35) og kloratomet ble deretter substituert med en benzyloksy gruppe (Eksempel 36). Den resulterende syren ble koblet til (bocaminoetyl) glycin metylester (fra Eksempel 26) med middelet PyBrop™, og den resulterende esteren ble hydrolysert (Eksempel 37). 0<6->benzyl gruppen ble fjernet i det endelige HF-spaltningstrin-net i syntesen av PNA-oligomeren. Spaltningen ble verifisert ved funnet av den ventede massen av den endelige PNA-oligo-merén ved inkorporering inn i en PNA-oligomer ved anvendelse av diisopropyl karbodiimid som kondensasjonsmiddel (Eksemplene 55 og 71).

Utvidete skjeletter

Endringer av gruppene A, C og D (Figur 16) blir demonstrert ved syntese av monomere byggeblokker og inkorporert inn i PNA-oligomerene.

I et eksempel var C gruppen en CH(CH3) gruppe. Syntesen av den tilsvarende monomeren er beskrevet i Figur 17. Den omfatter fremstilling av Boc-beskyttet l-amino-2,3-propandiol (Eksempel 38) som blir spaltet av periodat til bocaminoacet-aldehyd som blir anvendt direkte i neste reaksjon. Bocamin-acetyl kan bli kondensert med forskjellige aminer og i Eksempel 39 ble alanin etylester anvendt. I Eksemplene 40-42, ble de tilsvarende tymin-monomerene dannet. Monomeren er blitt inkorporert inn i en 8-mer (Eksempel 60) ved DCC-koblingsprotokollen (Eksemplene 56 og 57).

I et annet eksempel er D gruppen en (CHg^ gruppe. Syntesen av den tilsvarende monomeren er beskrevet i Figur 18. A og er beskrevet i Eksemplene 43 - 44.

I et annet eksempel er A gruppen en (CHg^CO gruppe. Syntesen av den tilsvarende tymin monomeren er beskrevet i

Figur 18.B og Eksemplene 46 til og med 48.

I et annet eksempel er C gruppen en (CHgjg gruppe. Syntese av tymin og beskyttet cytosin monomer er beskrevet i Figur 19 og Eksemplene 49 og 54. Hybridiseringseksperimentene med en PNA-oligomer inneholdende en enhet er beskrevet i Eksemplene 61 og 81 og viser en betraktelig lavere affinitet, men en retensjon av spesifisiteten.

Følgende forkortelser blir anvendt i de eksperimentelle eksemplene: DMF , N,N-dimetylformamid; DCC , N,N-dicykloheksyl karbodiimid; DCU, N,N-dicykloheksyl urea; THF, tetrahydro-furan; aeg, N-acetyl (2'-aminoetyl)glycin; pfp , pentafluorfenyl; Boe, tert-butoksykarbonyl; Z, benzyloksykarbonyl; NMR, nukleær magnetisk resonans, s, singlett; d, dublett, dd, dublett av dobletter, t, triplett, q, kvartett; m, multi-plett; b, bred; S, kjemisk skift.

NMR spekteret ble registrert på enten et JEOL FX 90Q spektro-meter eller en bruker 250 MHz med tetrametylsilan som indre standard. Masse-spektrometri ble utført på et MassLab VG 12-250 quadropole instrument utstyrt med en VG FAB kilde og probe. Smeltepunktene ble registrert på Buchi smeltepunkt-apparaturen og er ukorrugerte. N,N-dimetylformamid ble tørket over en 4 Å molekylær sikt, destillert og lagret over 4 Å molekylærsikt. Pyridin (HPLC kvalitet) ble tørket og lagret over 4 Å molekylære sikter. Andre oppløsningsmidler som ble anvendt var enten høyeste oppnåelige kvalitet eller ble destillert før bruk. Dioksan ble sendt igjennom basisk aluminiumoksid før anvendelse. Bocanhydrid, 4-nitrofenol, metyl bromacetat, benzyloksykarbonyl klorid, pentafluorfenol ble alle oppnådd fra Aldrich Chemical Company. Tymin, cytosin, adenin ble alle oppnådd fra Sigma.

Tynnsiktskromatografi (Tic) ble utført ved anvendelse av følgende oppløsningsmiddelsystemer: (1) kloroform:trietylamin:metanol , 7:1:2; (2) metylen klorid:metanol, 9:1; (3) kloroform:metanol:eddiksyre 85:10:5. Flekkene ble visualisert ved UV (254 nm) eller/og spraying med en ninhydrinopp-løsning (3 g ninhydrin i 1000 ml 1-butanol og 30 ml eddiksyre), etter oppvarming ved 120°C i 5 min. og etter spraying, ny oppvarming.

EKSEMPEL 1

tert-Butyl 4-nitrofenyl karbonat

Natriumkarbonat (29.14 g; 0.275 mol) og 4-nitrofenol (12.75 g; 91.6 mmol) ble blandet med dioksan (250 ml). Boc-anhydrid (20.0 g; 91.6 mmol) ble overført til blandingen med dioksan (50 ml). Blandingen ble tilbakestrømmet ilt, avkjølt til 0°C, filtrert og konsentrert til 1/3, og deretter heilt inn i vann (350 ml) ved 0°C. Etter omrøring i 1/2 t, ble produktet samlet ved filtrering, vasket med vann og deretter tørket over sicapent i vakuum. Utbytte 21.3 g (97$). Smp. 73.0-74.5°C (litt. 78.5 - 79.5°C).

Analyse for C11<H>13N05:

Funnet (beregnet):

C: 55.20 (55.23) H: 5.61 (5.48) N: 5.82 (5.85).

EKSEMPEL 2

(N'-Boc-2'-aminoetyl)glycin (2)

Tittelforbindelsen ble fremstilt ved en modifikasjon av fremgangsmåten til Heimer, et al., Int. J. Pept., 1984, 23, 203 - 211 N-(2-aminoetyl )glycin (1, 3.00 g; 25.4 mmol) ble løst opp i vann (50 ml), dioksan (50 ml) ble tilsatt og pH ble justert til 11.2 med 2 N natriumhydroksid. tert-butyl-4-nltrofenyl karbonat (7.29 g; 30.5 mmol) ble løst opp i dioksan (40 ml) og dråpevis tilsatt over en periode på 2 t, hvorpå pH ble opprettholdt ved 11.2 med 2 N natriumhydroksid. pH ble justert periodisk til 11.2 i 3 ytterligere timer og deretter ble oppløsningen latt stå over natt. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C og pH ble forsiktig justert til 3.5 med 0.5 M saltsyre. Den vandige oppløsningen ble vasket med kloroform (3 x 200 ml) og pH justert til 9.5 med 2 N natriumhydroksid og oppløsningen ble avdampet til tørrhet i vakuum (14 mmHg). Resten ble ekstrahert med DMF (25 + 2 x 10 ml) og ekstraktene ble filtrert for å fjerne salt i overskudd. Dette resulterer i en oppløsning av tittelforbindelsen i omtrent 60$ utbytte og høyere enn 95$ renhet ved tic (system 1 og visualisert med ninhydrin, Rf = 0.3). Oppløsningen ble anvendt i følgende prepareringer av Boc-aeg derivater uten ytterligere rensning.

EKSEMPEL 3

N-l-karboksymetyltymin (4)

Denne fremgangsmåten er forskjellig fra 1 itteratursyntesen, men er lettere og gir høyere utbytter og etterlater ikke noe ureagert tymin i produktet. Til en suspensjon av tymin (3, 40.0 g; 0.317 mol) og kaliumkarbonat (87.7 g; 0.634 mmol) i DMF (900 ml) ble det tilsatt metyl bromacetat (30.00 ml; 0.317 mmol). Blandingen ble omfattende omrørt over natt under nitrogen. Blandingen ble filtrert .og avdampet til tørrhet i vakuum. Den faste resten ble behandlet med vann (300 ml) og 4 N saltsyre (12 ml), omrørt i 15 min. ved 0°C, filtrert og vasket med vann (2 x 75 ml). Presipitatet ble behandlet med vann (120 ml) og 2 N natriumhydroksyd (60 ml) og ble kokt i 10 minutter. Blandingen ble avkjølt til 0°C, filtrert og den rene tittelforbindelsen ble presipitert ved tilsetning av 4 N saltsyre (70 ml). Utbytte etter tørking i vakuum over sicapent: 37.1 g (64$). ^H-NMR: (90 MHz; DMSO-d6): 11.33 ppm (s, 1H, NH); 7.49 (d, J = 0.92 Hz, 1H, Arg); 4.38 (s, 2H, CH2); 1.76 (d, J = 0.92 Hz, T-CH3)

EKSEMPEL 4

N-l-karboksymetyltymin pentafluorfenyl ester (5)

N-l-karboksymetyltymin (4, 10.0 g; 54.3 mmol) og pentafluorfenol (10.0 g; 54.3 mmol) ble oppløst i DMF (100 ml) og avkjølt til 5°C i isvann. DCC (13.45 g; 65.2 mmol) ble deretter tilsatt. Når temperaturen gikk under 5°C, ble isbadet fjernet og blandingen ble omrørt i 3 t ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering og vasket to ganger med DMF (2 x 10 ml). Det kombinerte filtratet ble heilt inn i eter (1400 ml) og avkjølt til 0°C. Petroleumeter (1400 ml) ble tilsatt og blandingen ble latt stå over natt. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering og ble grundig vasket med petroleumeter. Utbytte: 14.8 g (78$). Produktet var rent nok for å utføre den neste reaksjonen, men en analytisk prøve ble oppnådd ved omkrystallisering fra 2-propanol. Smp. 200.5 - 206°C.

Analyse for C13H7F5N2<0>4<:>

Funnet (beregnet:

C: 44.79 (44.59); H: 2.14 (2.01) N: 8.13 (8.00). FAB-MS: 443 (M+l+glycerol), 351 (M+l). <1>H-NME (90 MHz; DMSO-d6): 11.52 ppm (s, 1H, NH); 7.64 (s, 1H, ArH); 4.99 (s, 2H, CH2); 1.76 (s, 3H, CH3).

EKSEMPEL 5

1-(Boe-aeg)tymin (6)

Til DMF-oppløsningen fra ovenfor ble det tilsatt trietylamin (7.08 ml; 50.8 mmol) etterfulgt av N-l-karboksymetyltymin pentafluorfenylester (5, 4.45 g; 12.7 mmol). Den resulterende oppløsningen ble omrørt ilt. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C og behandlet med kation-bytte materiale ("Dowex 50W X-8", 40 g) i 20 minutter. Kationutvekslingsmaterialet ble fjernet ved filtrering, vasket med diklormetan (2 x 15 ml) og diklormetan (150 ml) ble tilsatt. Den resulterende oppløs-ningen ble vasket med mettet natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum, først med en vann-utsuger og deretter ved hjelp av en oljepumpe. Resten ble ristet med vann (50 ml) og avdampet til tørrhet. Denne prosedyren ble gjentatt en gang. Resten ble deretter løst opp i metanol (75 ml) og heilt inn i eter (600 ml) og petroleumeter (1.4 L). Etter omrøring over natt ble det faste stoffet isolert ved filtrering og vasket med petroleumeter. Tørking over sicapent i vakuum ga 3.50 g (71.7$). Smp. 142 - 147°C.

Analyse for C-^H^^Oy:

Funnet (beregnet):

C: 49.59 (50.00); H: 6.34 (6.29); N: 14.58 (14.58). ^H-NMR (250 MHz, DMSO-d^): På grunn av begrenset rotasjon rundt den sekundære amidbindingen, ble flere av signalene fordoblet i forholdet 2:1, (angitt i listen med mj. for major og mi. for minor). 12.73 ppm (b, 1H, -C02H); 11.27 ppm (s, mj . , imide); 11.25 ppm (s, mi., imide); 7.30 ppm (s, mj . , ArH); 7.26 ppm (s, mi., ArH); 6.92 ppm (unres. t, mj . , BocNH); 6.73 ppm (unres. t; mi., BocNH); 4.64 ppm (s, mj., T-CH2-C0-); 4.47 ppm (s, mi., T-CH2-C0-); 4.19 ppm (s, mi., C0NRCH2C02H); 3.97 ppm (s, mj., C0NRCH2C02H); 3.41 - 2.89 ppm (unres. m, -CH2CH2- og vann); 1.75 ppm (s, 3H, T-CH3); 1.38 ppm (s, 9H, t-bu). <13>C-NMR: 170.68 ppm (CO); 170.34 (CO); 167.47 (CO); 167.08 (CO); 164.29 (CO); 150.9 (C5''); 141.92 (C6''); 108.04 (C2'); 77.95 og 77.68 (Thy-CH2C0); 48.96, 47.45 og 46.70 (-CH2CH2- og NCH2C02H); 37.98 (Thy-CH.3); 28.07 (t-Bu). FAB-MS: 407 (M+Na<+>); 385 (M+H<+>).

EKSEMPEL 6

l-(Boc-aeg)tymin pentafluorfenylester (7, Boc-Taeg.Opfp) l-(Boc-aeg)tymin (6) (2.00 g; 5.20 mmol) ble oppløst i DMF (5 ml) og metylenklorid (15 ml) ble tilsatt. Pentafluorfenol (1.05 g; 5.72 mmol) ble tilsatt og oppløsningen ble avkjølt til 0°C i et isbad. DDC ble deretter tilsatt (1.29 g; 6.24 mmol) og isbadet ble fjernet etter 2 min. Etter 3 t med omrøring ved romtemperatur ble presipitert DCU fjernet ved filtrering og vasket med metylenklorid. Det kombinerte filtratet ble vasket to ganger med vandig natriumhydrogenkarbonat og en gang med mettet natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum. Den faste resten ble løst opp i dioksan (150 ml) og heilt inn i vann (200 ml) ved 0°C. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering, vasket med vann og tørket over sicapent i vakuum.

Utbytte: 2.20 g (77%). En analytisk prøve ble oppnådd ved omkrystallisering fra 2-propanol. Smp. 174 - 175.5"C.

Analyse for C22<H>23<N>4°7<F>5

Funnet (beregnet)

C: 48.22 (48.01); H: 4.64 (4.21); N: 9.67 (10.18). <1>H-NMR (250 MHz, CDC13): På grunn av den begrensete situa-sjonen rundt den sekundære amidbindingen, ble flere av signalene doblet i forholdet 6:1 (indikert i listen med mj . for major og mi. for minor). 7.01 ppm (s, mi., ArH); 6.99 ppm (s, mj., ArH); 5.27 ppm (unres. t, BocNH); 4.67 ppm (s, mj., T-CH2-C0-); 4.60 ppm (s, mi., T-CH2-C0-); 4.45 ppm (s, mj . , C0NRCH2C02Pfp); 4.42 ppm (s, mi., CONRCH2C02P<fp>); 3.64 ppm (t, 2H, BocNHCH2CH2-); 3.87 ppm ("q", 2H, BocNHCH2CH2-); 1.44 (s, 9H, t-Bu). FAB-MS: 551 (10; M+l ); 495 (10; M+l-tBu); 451 (80; -Boe).

EKSEMPEL 7

N<4->benzyloksykarbonyl cytosin (9)

Over en periode på 1 t ble benzyloksykarbonyl klorid (52 ml; 0.36 mol) dråpevis tilsatt til en suspensjon av cytosin (8, 20.0 g; 0.18 mol) i tørr pyridin (1000 ml) ved 0°C under nitrogen i ovnstørket utstyr. Oppløsningen ble deretter omrørt over natt og deretter ble pyridinsuspensjonen avdampet til tørrhet i vakuum. Vann (200 ml) og 4 N saltsyre ble tilsatt til pH ca. 1. Det resulterende hvite presipitatet ble filtrert av, vasket med vann og delvis tørket ved luft-utsuging. Det fortsatt våte presipitatet ble kokt med absolutt etanol (500 ml) i 10 min., avkjølt til 0°C, filtrert, vasket grundig med eter og tørket i vakuum. Utbytte 24.7 g (54$). Smp. >250°C.

Analyse for C^2HllN3°3:

Funnet (beregnet):

C: 58.59 (58.77); H: 4.55 (4.52); N: 17.17 (17.13). Ikke noe NMR spektra ble registrert på grunn av at det ikke var mulig å få oppløst produktet.

EKSEMPEL 8

-benzyloksykarbonyl-N1-karboksymetyl cytosin (10)

I en trehalset rundbunnet flaske utstyrt med mekanisk rører og nitrogentilførsel, ble det plassert metyl bromacetat (7.82 ml; 82.6 mmol) og en suspensjon av N<4->benzyloksykarbonyl-cytosin (9, 21.0 g; 82.6 mmol) og kaliumkarbonat (11.4 g; 82.6 mmol) i, tørr DMF (900 ml). Blandingen ble omfattende omrørt over natt, filtrert og avdampet til tørrhet i vakuum. Vann (300 ml) og 4 N saltsyre (10 ml) ble tilsatt, blandingen ble omrørt i 15 minutter ved 0°C, filtrert og vasket med vann (2 x 75 ml). Det isolerte presipitatet ble tørket med vann (120 ml), 2 N natriumhydroksid (60 ml), omrørt i 30 min., filtrert, avkjølt til 0°C og 4 N saltsyre (35 ml) ble tilsatt. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering, vasket grundig med vann, omkrystal1 i sert fra metanol (1000 ml) og vasket grundig med eter. Dette ga 7.70 g (31$) av den rene forbindelsen. Morvæsken fra omkrystalliseringen• ble redusert til et volum på 200 ml og avkjølt til 0°C. Dette ga ytterligere 2.30 g av et materiale som var rent ifølge tic, men som hadde en rødaktig farge. Smp. 266 - 274<0>C.

Analyse for C14<H>13<N>3<O>5:

Funnet (beregnet):

C: 55.41 (55.45); H: 4.23 (4.32); N: 14.04 (13.86). <i>H-NMR (90 MHz; DMS0-d6): 8.02 ppm (d, J=7.32 Hz, 1H, H-6); 7.39 (s, 5H, Ph); 7.01 (d, J=7.32 Hz, 1H, H-5); 5.19 (s, 2H, PhCH2-); 4.52 (s, 2H).

EKSEMPEL 9

-benzyloksykarbonyl-N^-karboksymetyl-cytosin pentafluorfenylester (11)

N<4->benzyloksykarbonyl-N<1->karboksymetyl-cytosin (10, 4.00 g; 13.2 mmol) og pentafluorfenol (2.67 g; 14.5 mmol) ble blandet med DMF (70 ml), avkjølt til 0°C med isvann og DCC (3.27 g; 15.8 mmol) ble tilsatt. Isvannet ble fjernet etter 3 min. og blandingen ble omrørt i 3 t ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering, vasket med DMF og filtratet ble avdampet til tørrhet i vakuum (0.2 mmHg). Den faste resten ble behandlet med metylenklorid (250 ml), omfattende omrørt i 15 min., filtrert, vasket to ganger med fortynnet natriumhydrogen karbonat og en gang med mettet natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum. Den faste resten ble omkrystallisert fra 2-propanol (150 ml) og krystallene ble grundig vasket med eter. Utbytte 3.40 g (55$). Smp. 241 - 245°C.

Analyse for C2oH^2N3F505:

Funnet (beregnet):

C: 51.56 (51.18); H, 2.77 (2.58); N, 9.24 (8.95). <1->H-NMR (90 MHz; CDCI3): 7.66 ppm (d, J = 7.63 Hz, 1H, H-6); 7.37 (s, 5H, Ph); 7.31 (d, J=7.63 Hz, 1H, H-5 ); 5.21 (s, 2H, PhCH2-); 4.97 (s, 2H, NCH2-). FAB-MS: 470 (M+l ) .

EKSEMPEL 10

N<4->benzyloksykarbonyl-l-Boc-aeg-cytosin (12)

Til en oppløsning av (N-Boc-2-aminoetyl)glycin (2) i DMF, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble det tilsatt trietylamin (7.00 ml; 50.8 mmol) og N<4->benzyloksykarbonyl-N<1->karboksymetyl-cytosin pentafluorfenylester (11, 2.70 g; 5.75 mmol). Etter omrøring av oppløsningen ilt ved romtemperatur, ble metylenklorid (150 ml), mettet natriumklorid (250 ml ) og 4 N saltsyre til pH %1 tilsatt. Det organiske laget ble separert og vasket to ganger med mettet natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum, først med en vannutsuger og deretter med en oljepumpe. Den oljeholdige resten ble behandlet med vann (25 ml) og på ny avdampet til tørrhet i vakuum. Denne prosedyren ble deretter gjentatt. Den oljeholdige resten (2.80 g) ble deretter løst opp i metylenklorid (100 ml), petroleumeter (250 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt over natt. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering og vasket med petroleumeter. Tic (system 1) indikerte vesentlige mengder pentafluorfenol, men det ble ikke gjort noen forsøk på å fjerne dette. Utbytte: 1.72 g (59$). Smp. 156°C (dekomp.). 1-H-NMR (250 MHz, CDCI3): På grunn av begrenset rotering rundt den sekundære amidbindingen, ble flere av signalene koblet i forholdet 2:1, (indikert i listen med mj . for major og mi. for minor). 7.88 ppm (dd, 1H, H-6); 7.39 (m, 5H, Ph); 7.00 (dd, 1H, H-5); 6.92 (b, 1H, BocNH); 6.74 (b, 1H, ZNH) -?; 5.19 (, 2H, PI1-CH3); 4.81 ppm (s, mj . , Cyt-CH2-C0-) ; 4.62 ppm (s, mi., Cyt-CH2-C0-); 4.23 (s, mi., C0NRCH2C02H); 3.98 ppm (s, mj., C0NRC<H>2C02H); 3.42 - 3.02 (unres. m, -CH2CH2- og vann); 1.37 (s, 9H, tBu). FAB-MS: 504 (M+l); 448 (M+l-tBu).

EKSEMPEL 11

-benzyloksykarbonyl-1-Boc-aeg-cytosin pentafluorfenylester

(13)

N4 -benzyloksykarbonyl-l-Boc-aeg-cytosin (12, 1.50 g; 2.98 mmol) og pentafluorfenol (548 mg; 2.98 mmol) ble løst opp i DMF (10 ml) metylenklorid (10 ml) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0°C i isbad og DCC (676 mg, 3.28 mmol) ble tilsatt. Isbadet ble fjernet etter 3 min. og blandingen ble omrørt i 3 t ved romtemperatur. Presipitatet ble isolert ved filtrering og vasket en gang med metylenklorid. Presipitatet ble løst opp i kokende dioksan (150 ml) og oppløsningen ble avkjølt til 15° C hvorved DCU ble presipitert. DCU ble fjernet ved filtrering og det resulterende filtratet ble heilt inn i vann (250 ml) ved 0°C. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering, vasket med vann og tørket over sicapent, i vakuum. Utbytte 1.30 g (65$).

Analyse for C2g<H>2gN5<0>gFg

Funnet (beregnet):

C: 52.63 (52.02); H, 4.41 (4.22); N, 10.55 (10.46) 1-H-NMR (250 MHz; DMS0-d6 ): viste vesentlige spektre av ovennevnte syre, sannsynligvis på grunn av hydrolyse av esteren. FAB-MS: 670 (M+l); 614 (M+l-tBu).

EKSEMPEL 12

4-klorkarboksy-9-kloracridin

4-karboksyacridon (6.25 g; 26.1 mmol), tionylklorld (25 ml) og 4 dråper DMF ble forsiktig oppvarmet under en nitrogen-strøm helt til alt fast materiale vara oppløst. Oppløsningen ble deretter tilbakestrømmet i 40 min. Oppløsningen ble avkjølt og tienylklorid i overskudd ble fjernet i vakuum. De siste sporene av tionylklorid ble fjernet ved samtidig avdampning med tørr benzen (tørket over Na-Pb) to ganger. Det gjenværende gule pulveret ble anvendt direkte i den neste reaksj onen.

EKSEMPEL 13

4-(4-metoksykarbonylpentylamidokarbonyl)-9-kloracridin Metyl 6-aminoheksanoat hydroklorid (4.70 g; 25.9 mmol) ble løst opp i metylenklorid (90 ml), avkjølt til 0°C, trietylamin (15 ml) ble tilsatt og den resulterende oppløsningen ble deretter øyeblikkelig tilsatt til syrekloridet fra det ovennevnte. En rundbunnet flaske inneholdende syreklorid ble avkjølt til 0°C i et isbad. Blandingen ble omfattende omrørt i 30 min. ved 0°C og 3 t ved romtemperatur. Den resulterende blandingen ble filtrert for å fjerne gjenværende faste stoffer som ble vasket med metylenklorid (20 ml). Det rød-brune metylenklorid filtratet ble deretter vasket to ganger med mettet natriumhydrogenkarbonat, en gang med mettet natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum. Til den resulterende oljeaktige fase-forbindelsen ble det tilsatt tørr benzen (35 ml) og ligroin (60 - 80°C, tørket over Na-Pb). Blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp. Aktivert karbon og celit ble tilsatt og blandingen ble tilbakestrømmet i 3 min. Etter filtrering ble tittelforbindelsen krystallisert ved avkjøling med magnetisk omrøring. Den ble isolert ved filtrering og vasket med petroleumeter. Produktet ble lagret over fast kaliumhydroksid. Utbytte 5.0 g (50$).

EKSEMPEL 14

4-( 5-metoksykarbonylpentyl )amidokarbonyl-9-[6'-(4' '-nitro-benzamido)heksylaminb]-aminoacridin

4-(5-metoksykarbonylpentylamidokarbonyl)-9-kloracridin (1.30 g; 3.38 mmol) og f enol (5 g) ble oppvarmet til 80 °C i 30 min. under en,nitrogenstrøm og deretter ble 6-(4'-nitrobenz-amido)-l-heksylamin (897 mg; 3.38 mmol) tilsatt. Temperaturen ble øket til 120° C i 2 t. Reaksjonsblandingen ble avkjølt og metylenklorid (80 ml) ble tilsatt. Den resulterende oppløsningen ble vasket tre ganger med 2 N natriumhydroksid (60 ml porsjoner) og en gang med vann, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum. Den resulterende røde oljen (1.8 g) ble løst opp i metylenklorid (40 ml), avkjølt til 0°C. Eter (120 ml) ble tilsatt og den resulterende oppløsningen ble omrørt over natt. Dette resulterer i en blanding av fast materiale og en olje. Det faste stoffet ble isolert ved filtrering. Det faste stoffet og oljen ble på ny løst opp i metylenklorid (80 ml) og dråpevis tilsatt til kald eter (150 ml). Etter 20 min. med omrøring ble tittelforbindelsen isolert ved filtrering i form av orange krystaller. Produktet ble vasket med eter og tørket i vakuum over kaliumhydroksid. Utbytte 1.60 g (77$). Smp. 145 - 147°C.

EKSEMPEL 15

4-(5-karboksypentyl )amidokarbonyl-9-[6'-(4*'-nitrobenzamido)-heksylamino]-aminoacridin

4 - ( 5-metoksykarbonylpentyl )amidokarbonyl-9 - [6 ' - ( 4 ' ' -nitro-benzamido)heksylamino]aminoacridin (503 mg; 0.82 mmol) ble løst opp i DMF (30 ml), og 2 N natriumhydroksid (30 ml) ble tilsatt. Etter omrøring i 15 min. ble 2 N saltsyre (35 ml) og vann (50 ml) tilsatt ved 0°C. Etter omrøring i 30 min. ble oppløsningen dekantert og ga en oljeaktig forbindelse som ble løst opp i kokende metanol (150 ml), filtrert og konsentrert til 1/3 volum. Til metanoloppløsningen ble det tilsatt eter (125 ml ) og 5 - 6 dråper HC1 i etanol. Oppløsningen ble dekantert etter 1 t ved omrøring ved 0°C. Den oljeholdige forbindelsen ble på ny løst opp i metanol (25 ml) og presipitert med eter (150 ml). Tittelforbindelsen ble isolert som gule krystaller etter omrøring over natt. Utbytte 417 mg (80$). Smp. 173°C (dekomp.).

EKSEMPEL 16

(a) 4-(5-pentafluorfenyloksykarbonylpentyl)-amidokarbonyl-9-[6 *-(4 * *-nitrobenzamido )-heksylamino] -

aminocridin (Åcr^Opfp)

Syren fra ovenfor (300 mg; 0.480 mmol) ble løst opp i DMF (2 ml) og metylenklorid (8 ml) ble tilsatt. Pentafluorfenol (97 mg; 0.53 mmol) ble overført med 2 x 2 ml metylenklorid. Den resulterende oppløsningen ble avkjølt til 0°C hvorpå DCC (124 mg, 0.60 mmol) deretter ble tilsatt. Isbadet ble fjernet etter 5 min. og blandingen ble latt stå med omrøring over natt. Presipitert DCU ble fjernet ved sentrifugering og sentrifugatet ble avdampet til tørrhet i vakuum, først med en vannutsuger og deretter med en oljepumpe. Resten ble løst opp i metylenklorid (20 ml), filtrert og avdampet til tørrhet i vakuum. Resten ble på ny løst opp i metylenklorid og petroleumeter (150 ml). En 1 ml del 5 M HC1 i eter ble tilsatt. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved dekantering etter 30 min. omrøring ved 0°C. Den gjenværende oljeholdige forbindelsen ble løst opp i metylenklorid (100 ml). Petroleumeter (100 ml) ble tilsatt og blandingen ble latt stå med omrøring over natt. Neste dag ble det gule presipiterte krystallinske materialet isolert ved filtrering og ble vasket med like mengder petroleumeter. Utbyttet etter tørking 300 mg (78$). Smp. 97.5"C (dekomp.). Alle prøvene viste tilfredsstillende elementanalyse, ^H- og -'-^C-NMR og masse-spektra.

(b) Det eksperimentelle for syntese av PNA forbindelser

ifølge Figur 8

Materialer: Boc-Lys (C1Z), benzhydrylamin-copoly(styren-l$-divinylbenzen) harpiks (BHA harpiks) og p-metylbenzhydryl-amin-kopoly(styren-l$-divinylbenzen)harpiks (MBHA harpiks) var fra Peninsula Laboratories. Andre reagenser og oppløs-ningsmidler var: Biograde trifluoreddiksyre fra Halocarbon Products; di isopropyletylamin (99$; ble ikke ytterligere destillert) og N-acetylimidazol (98$) fra Aldrich; HgO ble destillert to ganger, vannfri HF fra Union Carbide; N,N-dimetylformamid med syntesekvalitet og metylenklorid med analytisk kvalitet (ble ikke ytterligere destillert) fra Merck; acetonitril med HPLC kvalitet fra Lab-Scan; purum kvalitet og anisol, N,N'-dicykloheksylkarbodiimid, diisopro-pylkarbodiimid, puriss, kvalitet 2,2,2-trifluoretanol fra Fluka og trifluormetansulfonsyre fra fluorad.

(b) Generelle metoder og anmerkninger

Dersom ikke annet er angitt, gjelder det følgende. PNA forbindelsene ble syntetisert ved den trinnvise fast-fase metoden (Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 2149 ) ved anvendelse av konvensjonell peptidkjemi ved anvendelse av TFA-labil tert-butyloksykarbonyl (Boe) gruppe for "temporær" N-beskyttelse (Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 1964, 86, 304 ) og de mer syre-stabile benzyloksykarbonyl (Z) og 2-klor-benzyloksykarbonyl (C1Z) gruppene for "permanent" sidekjede beskyttelse. For å oppnå C-terminale amider ble PNA oppstilt på HF-labile BHA eller MBHA harpikser (MBHA harpiksen har øket mottagelighet for den endelige HF spaltningen relativt til usubstituert BHA harpiks (Matsueda, et al., Peptides, 1981, 2, 45). Alle reaksjonene (unntatt HF reaksjonene) ble utført i manuelt drevet standard fast-fase reaksjonsbeholdere utstyrt med en grov glassfritte (Merrifield, et al., Biochemistry, 1982, 21, 5020). Den kvantitative ninhydrin reaksjonen (Kaiser test) som opprinnelig er utviklet av Merrifield og medarbeidere (Sarin, et al., Anal. Biochem., 1981, 117, 147) for peptider inneholdende "normal" aminosyrer ble med hell anvendt (se Tabell I - III) ved anvendelse av den "normalt" anvendte effektive ekstinsjonskoeffisienten c = 15 000 M_<1>cm-<1> for alle residier for å bestemme fullstendig-heten til de individuelle koblingene samt måling av antallet voksende peptidkjeder. Den teoretiske substitusjon Sn_^ ved kobling av residienummer n (ved antagelse av både fullstendig avspaltning og kobling samt verken kjedeterminering eller tap av PNA kjeder iløpet av syntesecyklusen) ble vurdert fra 1igningen:

hvor aMW er økningen i molekylvekt ([aMW] = g/mol) og Sn_^ er den teoretiske substitusjon ved kobling av det foregående residiet n-1 ([S] = mmol/g). Den vurderte verdien ($) på grad av individuell kobling blir beregnet relativt til den målte substitusjonen (ellers ble S ikke bestemt) og omfatter korreksjon for antall gjenværende frie aminogrupper etter den foregående cyklusen. HF reaksjonene ble utført i en Diaflon HF apparatur fra Toho Kasei (Osaka, Japan). Vydac C-^g (5 pm, 0.46 x 25 cm og 5 pm, 1.0 x 25 cm) revers-fase kolonner blir henholdsvis anvendt for analytisk og semi-preparativ HPLC på et SP8000 instrument. Buffer A utgjorde 5 volumprosent acetonitril i vann inneholdende 445 pl trifluoreddiksyre pr. liter og buffer B utgjorde 60 volumprosent acetonitril i vann inneholdende 390 pl trifluoreddiksyre pr. liter. Den lineære gradienten var 0 - 100$ av buffer B i 30 min., strømningsrat-ene 1.2 ml/min. (analytisk) og 5 ml/min. (semi-preparative). Elueringene ble registrert ved 215 nm (analytisk) og 230 nm (semi-preparativ)- Molekylvektene til PNA ble bestemt ved <252>Cf plasma desorpsjon "time-of-flight" massespektrometri fra gjennomsnittet av de mest hyppige isotopene.

EKSEMPEL 17

Fast-fase syntese av Acr^-[Taeg]15-NH2 og kortere derivater

(a) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg]15-BHA harpiks Syntesen ble initiert på 100 mg forsvellet og nøytralisert BHA harpiks (bestemt ved kvantitativ ninhydrin-reaksjon å inneholde 0.57 mmol NH2/g) ved anvendelse av enkelt-koblinger ("Synthetic Protocol 1") ved anvendelse av 3.2 ekvivalenter BocTaeg-OPfp i omtrent 33$ DMF/CH2C12• De individuelle koblingsreaksjonene ble utført ved risting i minst 12 timer i en manuelt drevet 6 ml standard fast-fase reaksjonsbeholder og ureagerte aminogrupper ble blokkert ved acetylering ved valgte trinn av syntesen. Progresjonen av kjedeforlengningen ble registrert ved flere stadier ved kvantitativ ninhydrin-reaksjon (se Tabell I). Deler av beskyttet Boe-[Taeg]5-BHA, Boe-[Taeg]^q-BHA og Boe-[Ta<eg>]15-BHA harpikser ble tatt ut etter oppstilling av henhv. 5, 10 og 15 residier.

(b) Syntese av Aci-i-ETaeg] 15-BHA harpiks

Etter avspaltning av gjenværende Boe-[Taeg]15-BHA harpiks (den estimerte tørrvekten er på omtrent 30 mg, 5:0.002 mmol voksende kjeder), ble H-[Taeg]5-BHA harpiks omsatt med omtrent 50 ekvivalenter (80 mg; 0.11 mmol) av Acr^-OPfp i 1 ml av omtrent 66$ DMF/CH2C12 (dvs. en 0.11 M oppløsning av pentafluorfenylester) i en 3 ml fast-fase reaksjonsbeholder. Ved en kvalitativ ninhydrin reaksjon ble det oppdaget at kobling av acridindelen var nesten kvantitativt.

(c) Spaltning, rensning og identifikasjon av H-[Taeg]5-NH2

En del av den beskyttede Boe-[Taeg]5-BHA harpiksen ble behandlet med 50$ trifluoreddiksyre i metylenklorid for å fjerne den N-terminale Boc-gruppen (som er en forløper til det potensielt skadelige tert-butyl kationet) før HF spaltning. Etter nøytralisering og vasking (utført på en måte som ligner den ifølge trinnene 2-4 i "Synteseprotokoll 1" og tørking i 2 t i vakuum, blir den resulterende 67.1 mg (tørrvekt) H-[Taeg]5-BHA harpiksen spaltet med 5 ml HF:anisol (,9:1, v/v) omrøring ved 0°C i 60 min. Etter fjerning av HF ble resten omrørt med tørr dietyleter (4 x 15 ml, 15 min. hver) for å fjerne anisol, filtrert under tyngdekraften gjennom en frittet glasstrakt og tørket. PNA ble deretter ekstrahert inn i en 60 ml (4 x 15 ml), omrøring av hver i 15 min. (10$ vandig eddiksyre-oppløsning). Alikotene av denne oppløsningen ble analysert ved analytisk revers-fase HPLC for å etablere enheten til rå PNA. Hovedtoppen ved 13.0 min. utgjorde omtrent 93$ av den totale absorbansen. Den gjenværende oppløsningen ble frosset og liofilisert for å tilveiebringe omtrent 22.9 mg råmateriale. Til slutt ble 19.0 mg av råproduktet renset fra fem båtener, som hver inneholder 3.8 mg i 1 ml H20. Hovedtoppen ble samlet ved anvendelse av en semi-preparativ revers-fase kolonne. Acetonitril ble fjernet på en speed vac og den gjenværende oppløsningen ble frosset (tørr is) og ..deretter lyofilisert til 13.1 mg >99$ ren H-[Taegjg-NHg. PNA molekylet ble lett oppløst i vann og hadde viktig molekylvekt basert på masse-spektral bestemmelse. For (M+H)<+> var den beregnede m/z verdien 1349.3 og den målte m/z verdien var 1347.8.

(d) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]^Q-NH2

En del av beskyttet Boc-[Taeg]^q-BHA harpiks bles behandlet som beskrevet i seksjon (c) for å tilveiebringe 11.0 mg råmateriale ved HF spaltning av 18.9 mg tørr H-[Taeg]-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 15.5 min. utgjorde omtrent 53$ av den totale absorbansen. Omtrent 1 mg av råproduktet ble gjentatte ganger renset (av grunner beskrevet nedenfor) for å oppnå omtrent 0.1 mg av minst 80$, men antageligvis >99$ rent H-[Taeg] irj-NH2 • En heller bred hale som ble eluert etter måltoppen og som utgjør omtrent 20$ av den totale absorbansen, kunne ikke bli fjernet (bare delvis redusert) med gjentatt rensing. Ifølge vurdering med massespektre som bare bekrefter tilstedeværelsen av den riktige molekylvekten H-[Taeg] ifj-NHg tilskrives halefenomenet til mer eller mindre veldefinerte aggregasjons-/konformasjonstilstander til målemolekylet. Det er derfor sannsynlig at råproduktet inneholder mer enn ovennevnte 53$ av målemolekylet. H-[Taeg]ig-NH2 vil bli lett løst opp i vann. For (M+H)<+> var den beregnede m/z verdien 2679.6 og den målte m/z verdien var 2681.5.

(e) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]^5~

NH2

En del av den beskyttede Boe-[Taeg]15-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i seksjon (c) for å tilveiebringe 3.2 mg råmateriale av HF spaltning av 13.9 mg tørr H-[Taeg]15-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 22.6 min. var beliggende i en bred utbulking som står for omtrent 60$ av den totale absorbansen (Fig. 12a). Som den foregående delen angir, er utbulkingen et resultat av aggregat-konformasjonstilstander til målemolekylet H-[Taeg]15-NH2 på grunn av at massespektralanalyse av den samlede "utbulkingen" ikke viser tilstedeværelse av andre molekyler. Hele råproduktet ble renset ved samling av "utbulking", for å oppnå omtrent 2.8 mg materiale. For (M+Na)<+> var den beregnede m/z verdien 4033.9 og den målte m/z verdien var 4032.9.

(f) Spaltning, rensing og identifisering av

Are1-[Tae<g>]15<->N<H>2.

En del beskyttet Are<1->[Taeg]15-BHA harpiks ble behandlet som beskrevet i seksjon (b) for å gi 14.3 mg råmateriale ved HF spaltning av 29.7 mg tørr Arc<1->[Taeg]15-BHA harpiks. Samlet utgjør hovedtoppen ved 37.7 min. og en "dimer" (se nedenfor) ved 29.2 min. omtrent 40$ av den totale absorbansen (Fig. 12

b). Råproduktet ble gjentatte ganger renset for å gi omtrent 1 mg av antatt >99$ ren Acr<1->[Taeg]i5-NH2 "kontaminert" med

selv-aggregerte molekyler som eluerer ved 27.4 min., 29.2 min. og til slutt som en stor, bred utbuling som eluerer med 100$ buffer B (Fig. 12 c). Denne tolkningen er i samsvar med observasjonen om at disse toppene vokser ved henstand (i timer) i vandig eddiksyreoppløsning og til slutt presipiteres ut kvantitativt. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 4593.6 og den målte m/z verdien var 4588.7.

(g) Synteseprotokoll 1

(1) Boc-avspaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 3 ml , 3x1 min. og 1 x 30 min; (2) vasking med CH2C12, 3 ml, 6x1 min; (3) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 3 ml, 3x2 min; (4) vasking med CHgClg, 3 ml, 6x1 min, og la dette avdryppe i 1 min., (5) 2-5 mg prøve av PNA-harpiksen kan bli tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme substitusjonen, (6) tilsetning av 3.2 ekv.

(0.18 mmol; 100 mg) BocTaeg-OPfp oppløst i 1 ml CH2C12 etterfulgt av tilsetning av 0.5 ml DMF (sluttkonsentrasjon av pentaf luorf enylester =s0.12 M), og koblingsreaksjonen ble latt gå i totalt.. 12 til 24 t risting ved romtemperatur, (7) vasking med DMF, 3 ml, 1x2 min., (8) vasking med CH2C12, 3 ml, 4 x 1 min; (9) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 3 ml, 2x2 min., (10) vasking med CH2C12, 3 ml, 6x1 min., (11) 2 - 5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut for en hurtig kvalitativ ninhydrintest og ytterligere 2-5 mg blir grundig tørket for en kvantitativ ninhydrin analyse for å bestemme koblingsgraden (etter cyklusene 7, 10 og 15 ble ureagerte aminogrupper blokkert ved acetylering med N-acetylimidazol i metylenklorid).

EKSEMPEL 18

Fast-fase syntese av Acr1-[Taeg] ^-Lys-NEtø og kortere derivater

(a) Trinnvis sammenstilling av Boe-[Taeg]i5~Lys(ClZ)-BHA

harpiks.

Syntesen ble initiert ved en kvantitativ belastning (standard DCC in situ kobling i kun CH2C12) av Boc-Lys(ClZ) på 100 mg forsvellet og nøytralisert BHA harpiks (0.57 mmol NH2/g). Ytterligere utvidelse av den beskyttede PNA kjeden anvendte enkeltkoblinger ("Syntetisk protokoll 2") for cyklusene 1 til 5 og cyklusene 10 til 15 ved anvendelse av 3.2 ekvivalenter av BocTaeg-OPfp i omtrent 33$ DMF/CH2C12. Cyklusene 5 til 10 anvendte en ekstra rett DCC (dvs. in situ) kobling av den frie syren BocTaeg-OH i omtrent 33$ DMF/CH2C12. Alle koblingsreaksjonene ble utført ved risting i minst 12 t i en manuelt drevet 6 ml standard fast-fase reaksjonsbeholder. Ureagerte aminogrupper ble blokkert ved acetylering ved de samme syntesetrinnene som i Eksempel 17. Deler av beskyttet Boc-[Taeg]5-Lys(ClZ)-BHA og Boc-[Taeg]10-Lys(C1Z)-BHA harpikser ble tatt ut etter oppstilling av henhv. 5 og 10 PNA residier. Etter vurdering av det analytiske HPLC kromato-grammet av det råe spaltningsproduktet fra Boe-[Taeg] iq-Lys(C1Z)-BHA harpiksen (se seksjon (e)), ga en ytterligere "fri syre" kobling av PNA residiene 5 til 10 ingen signifi-kant forbedring av det syntetiske utbyttet sammenlignet med det fullstendige enkelt-koblete residiene i Eksempel 17.

(b) Syntese av Acr<1->[Taeg]iQ-Lys(ClZ)-BHA harpiks.

Etter avspaltning av en del av Boe-[Taeg]^Q-Lys(C1Z)-BHA harpiksen (vurdert tørrvekt er på omtrent 90 mg, % 0.01 mmol voksende kjeder), H-[Taeg]^5-BHA harpiks ble omsatt med omtrent 20 ekvivalenter (141 mg; 0.19 mmol) Acr^-OPfp i 1 ml av omtrent 66$ DMF/CH2C12 i en 3 ml fast-fase reaksjonsbeholder. Som vurdert ved en kvalitativ ninhydrin-reaksjon, var koblingen av acridindelen nærmest kvantitativ. (c) Syntese av Acr<1->[Taeg]15-Lys(ClZ)-BHA harpiks Etter avspaltning av gjenværende Boe-[Taeg]15-Lys(C1Z)-BHA harpiks (vurdert tørrvekt er på omtrent 70 mg, x 0.005 mmol voksende kjeder), ble H-[Taeg]ig-Lys(ClZ)-BHA harpiksen omsatt med omtrent 25 ekvivalenter (91 mg, 0.12 mmol) Acr<1->OPfp i 1 ml av omtrent 66$ DMF/CH2C12 i en 3 ml fast-fase reaksjonsbeholder. Som vurdert ved kvalitativ ninhydrin-reaksjon, var koblingen av acridindelen nærmest kvantitativ. (d) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]5-Lys-NHg

En del av den beskyttede Boe-[Taeg]5-Lys(C1Z)-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17c for å tilveiebringe 8.9 mg råmateriale ved HF spaltning av 19.0 mg tørr H-[Taeg]5~Lys(C1Z)-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 12.2 min.

(eluert ved 14.2 min. dersom den ble injisert fra en vandig oppløsning istedet for 10$ vandig eddiksyreoppløsning) sto for omtrent 90$ av den totale absorbansen. Omtrent 2.2 mg av

råproduktet ble renset til omtrent 1.5 mg 99$ ren H-[Taeg]5~ Lys-NHg•

(e) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]^o~

Lys-NH2

En del av den beskyttende Boe-[Taeg]10-Lys(C1Z)-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å gi 1.7 mg av råmaterialet ved HF spaltning av 7.0 mg tørr H-[Taeg]1Q-Lys(ClZ)-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 15.1 min. (eluert ved 17.0 min. ved injeksjon fra en vandig oppløsning istedet for 10$ vandig eddiksyreoppløsning) utgjorde omtrent 50$ av den totale absorbansen. Omtrent 1.2 mg av råproduktet ble renset til omtrent 0.2 mg >95$ ren H-[Taeg]10-Lys-NH2. Figur 13 a. For (M+H)<+> var den beregnede m/z verdien 2807.8 og den målte m/z verdien var 2808.2.

(f) Spaltning, rensing og identifikasjon av Acr<1->

[Tae<g>]10<->Lys-NH2

99.1 mg beskyttet Acr<1->[Taeg]10-Lys(C1Z)-BHA harpiks (tørr-vekt) ble spaltet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe 42.2 mg råmaterialet. Hovedtoppen ved 25.3 min. (eluert ved 23.5 min. dersom den ble injisert fra en vandig oppløsning istedet for 10$ vandig eddiksyreoppløsning) utgjorde omtrent 45$ av den totale absorbansen. En 8.87 mg del av råproduktet ble renset til omtrent 5.3 mg >97$ ren H-[Taeg]21g-Lys-NH2. For (M+H)<+> var den beregnede m/z verdien 2850.8 og den målte m/z verdien var 2849.8.

(g) Spaltning og rensing av Acr1-[Taeg] -^-Lys-NHj»

En 78.7 mg del av beskyttet Acr<1->[Taeg]15-Lys-NH2-BHA harpiks (tørr vekt) ble spaltet som beskrevet i Eksempel I del (c) for å tilveiebringe 34.8 mg av råmaterialet. Hovedtoppen ved 23.5 min. (omtrent samme elueringstid dersom det ble injisert fra en vandig oppløsning istedet for 10$ vandig eddiksyre-oppløsning) og en "dimer" ved 28.2 min. utgjorde omtrent 35$ av den totale absorbansen. Omtrent 4.5 mg av råproduktet ble renset til omtrent 1.6 mg av sannsynligvis >95$ ren H-

[Taeg]iQ-Lys-NHg• Denne forbindelsen kunne ikke være fri for "dimer" toppen, som vokste ved henstand i vandig eddiksyre-oppløsning .

(h) Syntetisk protokoll 2

(1) Boc-avspaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v, 3 ml , 3x1 min. og 1 x 30 min., (2) vasking med CH2C12, 3 ml , 6x1 min., (3) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 3 ml 3 x 2 min., (4) vasking med CH2C12, 3 ml , 6 x 1 min. og avrenning i 1 min., (5) 2-5 mg prøve av PNA-harpiksen kan bli tatt ut og grundig tørket for en kvalitativ ninhydrinanalyse, (6) for cyklusene 1 til 5 og cyklusene 10 til 15 ble koblingsreaksjonen utført ved tilsetning av 3.2 ekv. (0.18 mmol; 100 mg) BocTaeg-OPfp løst opp i 1 ml CE2C12 etterfulgt av tilsetning av 0.5 ml DMF (sluttkonsentrasjonen av pentafluorfenylester x0.12 M), koblingsreaksjonen ble utført i totalt 12 - 24 t med risting og cyklusene 5 til 10 anvendte en ytterligere 0.12 M DCC kobling av 0.12 M BocTaeg-OH i 1 .-5 ml DMF/CH2C12 (1:2, v/v), (7) vasking med DMF, 3 ml, 1x2 min., (8) vasking med CH2C12, 3 ml, 4x1 min., (9) nøytrali-sering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 3 ml, 2x2 min., (10) vasking med CH2C12, 3 ml, 6x1 min, (11) 2-5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks blir tatt ut for en kvalitativ ninhydrintest (etter cyklusene 7, 10 og 15 ble ureagerte aminogrupper blokkert ved acetylering med N-acetylimidazol i metylenklorid ).

EKSEMPEL 19

Forbedret fast-fase syntese av H-[Taeg]^Q-Lys-NH2

Beskyttet PNA ble oppstilt på en MBHA harpiks ved anvendelse av omtrent halve belastningen av BHA harpiksen anvendt i de foregående eksemplene. Alle cyklusene unntatt en ble etterfulgt av acetylering av ukoblede aminogrupper. Nedenfor beskrives syntesen fullstendig: (a) Preparering av Boc-Lys(C1Z)-NH-CH(p-CH3-C6H4)-C6H4

harpiks (MBHA harpiks) med en innledende substitusjon

av 0.3 mmol/g

Den ønskede substitusjonen av Boc-Lys(C1Z)-MBHA harpiks var 0.25 - 0.30 mmol/g. For å oppnå denne verdien ble 1.5 mmol Boc-Lys(ClZ) koblet til 5.0 g nøytralisert og forsvellet MBHA harpiks (bestemt ved kvantitativ ninhydrinreaksjon å inneholde 0.64 mmol NH2/g) ved anvendelse av en enkelt "in situ" kobling (1.5 mmol DCC) i 60 ml CH2C12. Reaksjonen ble utført ved risting i 3 timer i en manuelt drevet 225 ml, standard, fast-fase reaksjonsbeholder. Ureagerte aminogrupper ble deretter blokkert ved acetylering med en blanding av eddiksyre-anhydrid/pyridin/CH2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 18 t. En kvantitativ ninhydrin-reaksjon på den nøytraliserte harpiksen viste at bare 0.00093 mmol/g fri amin var igjen (se Tabell I), dvs. 0.15$ av de opprinnelige aminogruppene. Substitu-sjonsgraden ble bestemt ved avspaltning og ninhydrinanalyse og ble funnet å være 0.32 mmol/g for den nøytraliserte H-Lys(C1Z)-MBHA harpiksen. Dette er i samsvar med den maksimale verdien til 0.28 mmol/g for en kvantitativ kobling av 0.30 mmol Boc-Lys(C1Z)/g harpiks (se Tabell II).

(b) Trinnsvis oppstilling av Boe-[Taeg]3-Lys(ClZ)-MBHA

harpiks

Den fullstendige batchen av H-Lys(C1Z)-MBHA harpiksen dannet i seksjon (a) ble anvendt direkte (i den samme reaksjonsbeholderen) for å oppstille Boe-[Taeg]3-Lys(C1Z)-MBHA harpiksen ved enkeltkobling ("Synteseprotokoll 3") ved anvendelse av 2.5 ekvivalenter BocTaeg-OPfp i kun CH2C12. Den kvantitative nunhydrinreaksjon ble anvendt i syntesen (se Tabell II).

(c) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg]3-Lys(ClZ)-MBHA

harpiks

Omtrent 4.5 g av våt Boe-[Taeg] 3-Lys (C1Z )-MBHA harpiks (5:0.36 mmol voksende kjeder, tatt ut av totalt * 19 g våt harpiks preparert i seksjon (b)) ble plassert i 55 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boe-[Taeg]g-Lys(C1Z )-MBHA harpiks ble oppstilt ved enkeltkoblinger ("Synteseprotokoll 4") ved anvendelse av 2.5 ekvivalenter BocTaeg-OPfp i omtrent 30$ DMF/CH2C12. Forløpet av syntesen ble registrert ved alle trinn ved kvantitativ ninhydrinreaksjon (se Tabell II).

(d) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA

harpiks

Omtrent 1 g,. våt Boc-[Taeg]8-Lys(ClZ )-MBHA harpiks (~ 0.09 mmol voksende kjeder, tatt ut av totalt z 4 g våt harpiks preparert i seksjon (c) ble plassert i en 2 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]10-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved enkelt-koblingsprotokollen anvendt i den foregående delen ved anvendelse av 2.5 ekvivalenter BocTaeg-OPfp i omtrent 30$ DMF/CH2C12. Reaksjonsvolumet var 3 ml (vigorøs risting). Syntesen ble registrert ved kvantitativ ninhydrinreaksjon (se Tabell II).

(e) Syntese av Ac-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA harpiks Etter avspaltning av en del av Boc-[Taeg] ifj-Lys( C1Z )-MBHA harpiksen (vurdert tørrvekt er omtrent 45 mg), ble harpiksen deretter acetylert kvantitativt med en 2 ml blanding av eddiksyreanhydrid/pyridin/CHgClg (1:1:2, v/v/v) i 2 timer i en 3 ml fast-fase reaksjonsbeholder. (f) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]^Q-Lys-NH2

En del av den beskyttede Boe-[Taeg]10-Lys(C1Z)-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 24 mg råmateriale ved HF spaltning av 76 mg tørr H-[Taeg]5~Lys(ClZ)-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 15.2 min. (som innbefatter enheter såsom delesjonspeptider og forskjellige biprodukter) utgjør omtrent 78$ av den totale absorbansen. Hovedtoppen sto også for omtrent 88$ av "hovedtoppen pluss delesjonstopper". Absorbansen som er i samsvar med det vurderte koblingsutbyttet på 90.1$ oppnådd ved oppsummering av de individuelle koblingsutbyttene i Tabell II. En 7.2 mg del av råproduktet ble renset fra to batcher ved anvendelse av en semi-preparativ revers-fase kolonne (oppsamling av hovedtoppen i en beholder avkjølt med tørr is/2-propanol). Hver inneholdt 3.6 mg i 1 ml HgO. Den frosne oppløsningen ble direkte lyofilisert (uten på forhånd fjerning av acetonitril på en speed vac) for å tilveiebringe 4.2 mg 82$ ren H-[Taeg]10-Lys-NH2.

(g) Spaltning, rensing og identifikasjon av Ac-[Taeg]^q-Lys-NHg

En 400.0 mg del av beskyttet Ac-[Taeg]10-Lys(C1Z)-BHA harpiks (tørrvekt) ble spaltet som beskrevet i Eksempel 17 c, med unntagelse av TFA behandling for å tilveiebringe 11.9 mg råmateriale. Hovedtoppen ved 15.8 min. sto for omtrent 75$ av den totale absorbansen. En 4.8 mg del av råproduktet ble renset til omtrent 3.5 mg >95$ ren Ac-[Taeg]^Q-Lys-NHg• For (M+H)<+> er den beregnede m/z verdien = 2849.8 og den målte m/z verdien = 2848.8.

(h) Synteseprotokoll 3.

(1) Boc-avspaltning med TFA/ICH2C12 (1:1, v/v), 100 ml, 3 x 1 min. og 1 x 30 min. (2) vasking med CH2C12, 100 ml, 6x1 min.; (3) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 100 ml, 3x2 min; (4) vasking med CH2C12, 100 ml, 6 x 1 min. og drenering i 1 min., (5) 2-5 mg prøve PNA-harpiks blir tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme substitusjon, (6) addisjon av 2.5 ekv. (3.75 mmol; 2.064 g) BocTaeg-OPfp løst opp i 35 ml CH2C12 (sluttkonsentrasjonen til pentaf luorf enylester s;0.1 M), og kobl ingsreak-sjonen ble latt gå i totalt 20-24 t med risting, (7) vasking med DMF, 100 ml, 1x2 min. (for å fjerne presipitatet av BocTaeg-0H), (8) vasking med CH2C12 100 ml, 4x1 min., (9) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 100 ml, 2x2 min., (10) vasking med CH2C12, 100 ml, 6x1 min., (11) 2-5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks blir tatt ut for en hurtig kvalitativ ninhidrintest og ytterligere 2-5 mg blir grundig tørket, for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme koblingsgraden, (12) blokkering av ureagerte aminogrupper ved acetylering med en 100 ml blanding av eddiksyreanhydrid/- pyridin/CH2Cl2, (1:1:2, v/v/v) i 2 t, (13) vasking med CH2C12, 100 ml, 6x1 min., (14) 2 x 2-5 mg prøver av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut, nøytralisert med DIEA/- CH2C12 (1:19, v/v) og vasket med CH2C12 for kvalitativ og kvantitativ ninhydrin analyser.

(i) Synteseprotokoll 4.

(1) Boc-avspaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 25 ml , 3x1 min. og 1 x 30 min; (2) vasking med CH2C12, 25 ml , 6x1 min., (3) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 25 ml, 3x2 min., (4) vasking med CH2C12, 25 ml, 6 x 1 min., og drenering i 1 min., (5) 2-5 mg prøve PNA-harpiks blir tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme substitusjon, (6) addisjon av 2.5 ekv. (0.92 mmol; 0.506 g) BocTaeg-OPfp løst opp i 6 ml CH2C12 etterfulgt av tilsetning av 3 ml DMF (sluttkonsentrasjon av pentafluorfenylester ~ 0.1 M), koblingsreaksjonen ble utført i totalt 20 - 24 timer med risting, (7) vasking med DMF, 25 ml, 1x2 min, (8) vasking med CH2C12, 25 ml, 4x1 min, (9) nøytrali-sering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 25 ml, 2x2 min; (10) vasking med CH2C12, 25 ml , 6x1 min; (11) 2-5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut for en hurtig kvalitativ ninhydrintest og ytterligere 2-5 mg ble grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme koblingsgraden, (12) blokkering av ureagerte aminogrupper ved acylering med en 25 ml blanding av eddiksyreanhydrid/pyridin/CH2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 2 t (unntatt etter den første cyklus); (13) vasking med CH2C12, 25 ml , 6x1 min., (14) 2 x 2.5 mg prøver av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut, nøytralisert med DIEA/- CH2C12 (1:19, v/v) og vasket med CH2C12 for kvalitativ og kvantitativ ninhydrinanalyser.

EKSEMPEL 20

Fast-fase syntese av H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4~Lys-NH2

(a) Trinnvis oppstilling av Boc-[Taeg]5-C(z)aeg-[Taeg]4-Lys(ClZ)-MBHA harpiks

Omtrent 2.5 g våt Boe-[Taeg]3-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ( x 1/6 av totalt gjenværende omtrent 16 g våt harpiks, 5:0.75 g tørr harpiks 5:0.15 mmol voksende kjeder) ble plassert i en 6 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boe-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved dobbeltkobling av alle Taeg-residiene ved anvendelse av de vanlige 2.5 ekvivalentene av BocTaeg-OPfp i 2.5 ml omtrent 30$ DMF/CH2C12 med unntagelse av at det første residiet var enkelt-koblet. Inkorporering av C(Z)aeg-residiet ble oppnådd ved kobling med 2.0 ekvivalenter BocC(Z)aeg-0Pfp i TFE/CH2C12 (1:2, v/v). Progresjonen av syntesen ble registrert ved alle trinnene ved kvantitativ ninhydrinreaksjon (se Tabell III).

(b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2

En del av den beskyttede Boc-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys(ClZ )-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i Eksempel I seksjon (c) for å gi omtrent 14.4 mg råmateriale ved HF spaltning av 66.9 mg tørr H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]4-Lys(C1Z)-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 14.5 min. utgjorde >50$ av desn totale absorbansen. En 100.0 mg del av råproduktet ble renset (8 batcher som hver er løst opp i 1 ml HgO) for å oppnå omtrent 9.1 mg 96$ ren H-[Taeg]g-Caeg-[Taeg]4~Lys-NH2 (Figur 13 b). For (M+H)<+> var den beregnede m/z verdien = 2793.8 og den målte m/z verdien = 2790.6.

EKSEMPEL 21

Binding av Acr<1->(Taeg)i0-Lys-NH2 til dA10 (Figur lia). Acr<1->(Taeg)iQ-Lys (100 ng) ble inkubert i 15 min. ved romtemperatur med 50 eps 5'-[<32>P]-ende-merket oligonukleotid [d(GATCCA10G)] i 20 pl TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4). Prøven ble avkjølt på is (15 min.) og analysert ved gelelektroforese i polyakrylamid (PAGE). Til 10 pl av prøven ble det tilsatt 2 pl 50$ glycerol , 5 TBE (TBE = 90 mM Tris-borat, 1 mM EDTA, pH 8.3) og prøvene ble analysert ved PAGE (15$ acrylamid, 0.5$ bisacrylamid) i TBE buffer ved 4°C. En 10 pl del av prøven ble lyofilisert og på ny løst opp i 10 pl 80$ formamid, 1 TBE, oppvarmet til 90°C (5 min.) og analysert ved urea/PAGE,. (15$ acrylamid, 0.5$ bisacrylamid, 7 M urea) i TBE. [<32>P]-inneholdende DNA bånd ble visualisert ved autoradiografi ved anvendelse av intensiverende skjermer og Agfa Curix RPI røntgenfilmer eksponert ved -80"C i 2 t.

01igonukleotidene ble syntetisert på en Biosearch 7500 DNA syntesemaskin merket med 7[<32>P]-ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol) og polynukleotid kinase og renset ved PAGE ved anvendelse av standard teknikker (Maniatis et al. (1986): A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories).

EKSEMPEL 22

Dannelse av trådforflytningskompleks.

En dA^Q-dT^Q målsekvens innbefattet innenfor en plasmid DNA sekvens ble konstruert ved kloning av to oligonukleotider (d(GATCCA10G) + d( GATCCTlfJG)) inn i BamHI restriksjonsenzymsetet til pUC19 ved anvendelse av Eschericia coli JM101 stammen ved hjelp av standard teknikker (Maniatis et al., 1986). Det ønskede plasmidet (betegnet pT10) ble isolert fra en av de resulterende klonene og renset ved alkalisk instruk-sjonsprosedyre og CsCl sentrifugering (Maniatis et al., 1986). En 3'-[<32>P]-ende-merket DNA fragment på 248 bp inneholdende dA^Q/dT^Q målsekvensen ble oppnådd ved spalting av pT10 DNA med restriksjonsenzymene EcoRI og PvuII, merking av spaltet DNA med a[<32>P]-dATP (4000 Ci/mmol, Amersham) ved anvendelse av Klenow fragmentet til E.coli DNA polymerase (Boehringer Mannheim) og rensing av 248 pb DNA fragmentet ved PAGE (5$ acrylamid, 0.06$ bisacrylamid, TBE buffer). Dette DNA fragmentet ble oppnådd med [<32>P]-ende-merket ved 5'-enden ved behandling av EcoRI-spaltet pTIO plasmid med bakteriell alkalisk fosfatase (Boehringer Mannheim), rensing av plasmid DNA ved gelelektroforese i lavtsmeltende agarose og merking med -y[<32>P] ATP og polynukleotidkinase. Etter behandling med PvuII, ble 248 bp DNA fragmentet renset som ovenfor.

Komplekset mellom Acr^Taeg )10-Lys-NH2 og 248 bp DNA fragmentet ble dannet ved inkubering av 50 ng Acr<1->(Taeg)io-Lys-NH2 med 500 eps <32>P-merket 248 bp fragment og 0.5 pg kalvetymus DNA i 100 pl buffer i 60 min. ved 37°C.

EKSEMPEL 23

Probing av trådforflytningskomplekset med:

(a) Staphylococcus nuklease (Figur 12 b)

Trådforflytningskomplekset ble dannet i 25 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, pH 7.4 som beskrevet ovenfor. Kompleksene ble behandlet med Staphylococcus nuklease (Boehringer Mannheim) ved 750 U/ml i 5 min. ved 20° C og reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av EDTA til 25 mM. DNA ble presipitert med 2 vol. etanol, 2$ kaliumacetat på ny løst opp i 80$ formamid, TBE, varmet til 90°C (5 min.) og analysert ved PAGE med høy oppløsning (10$ akrylamid, 0.3$ bisacrylamid, 7 M urea) og autoradiografi.

(b) Affinitetsfotospaltning (Figur 12a + 12b)

Komplekset ble dannet i TE buffer. En prøve innbefattet i et Eppendorf rør ble bestrålt ovenfor ved 300 nm (Philips TL 20 W/12 fluoressens lysrør, 24 Jm~ 2s~^) i 30 min. DNA ble presipitert som ovenfor, tatt opp i 1 M piperidin og varmet til 90°C i 20 min. Etter lyofilisering ble DNA analysert ved PAGE som ovenfor.

(c) Kaliumpermanganat (Figur 12 b)

Komplekset ble dannet i 100 pl TE og 5 pl 20 mM KMn04 ble tilsatt. Etter 15 s ved 20° C ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 50 pl 1.5 M natr iumacetat, pH 7.0, 1 M 2-merkaptoetanol. DNA ble presipitert, behandlet med piperidin og analysert som ovenfor.

(d) Fotoavtrykk (Figur 12 b)

Komplekset ble dannet i 100 pl TE og diazo-koblet acridin (0.1 pg/pl) (DHA, Nielsen et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 3877-88) ble, tilsatt. Prøven ble bestrålt ved 365 nm (Philips TL 20 W/09N, 22 Jm~<2>s_<1>) i 30 min. og behandlet som beskrevet for "affinitetsfotospaltning".

(e) S^-nuklease (Figur 12 c)

Komplekset ble dannet i 50 mM sodiumacetat, 200 mM NaCl, 0.5$ glycerol , 1 mM ZnClg, pH 4.5 og behandlet med nuklease S^

(Boehringer Mannheim) ved 0.5 U/ml i 5 min. ved 20"C. Reaksjonen ble stoppet og behandlet videre som beskrevet under "Staphylococcus nuclease".

EKSEMPEL 24

N-Benzyloksykarbonyl-N-'(bocaminoetyl)glycin.

Aminoetylglycin (52.86 g; 0.447 mol) ble løst opp i vann (900 ml) og dioksan (900 ml) ble tilsatt. pH ble justert til 11.2 med 2N NaOH. Mens pH ble holdt ved 11.2, ble tert-butyl-p-nitrofenyl karbonat (128.4 g; 0.537 mol) løst opp i dioksan (720 ml) og tilsatt dråpevis iløpet av 2 timer. pH ble holdt ved 11.2 i minst tre ytterligere timer og deretter latt stå med omrøring over natt. Den gule oppløsningen ble avkjølt til 0°C og pH ble justert til 3.5 med 2N HC1. Blandingen ble vasket med kloroform (4 x 100 ml), og pH til den vandige fasen ble på ny justert til 9.5 med 2N NaOH ved 0°C. Benzyloksykarbonylklorid (73.5 ml; 0.515 mol) ble tilsatt over en halv time, mens pH ble holdt ved 9.5 med 2N NaOH. pH ble ofte justert iløpet av de nevnte 4 timene og oppløsningen ble latt stå med omrøring over natt. På den følgende dagen ble oppløsningen vasket med eter (3 x 600 ml) og pH til oppløsningen ble deretter justert til 1.5 med 2N HC1 ved 0°C. Tittelforbindelsen ble isolert ved ekstrahering med etylacetat (5 x 1000 ml). Etylacetatoppløsningen ble tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum. Dette ga 138 g som ble løst opp i eter (300 ml) og presipitert ved tilsetning av petroleumeter (1800 ml). Utbytte 124.7 g (79$). Smp. 64.5 - 85°C.

Analyse for C17H24<N>2O6:

Funnet (beregnet):

C: 58.40 (57.94); H: 7.02 (6.86); N: 7.94 (7.95). <1->H-HMR (250 MHz, CDCI3) 7.33 & 7.32 (5H, Ph); 5.15 & 5.12 (2H, PhCH2); 4.03 & 4.01 (2H, NCH2C02H); 3.46 (b, 2H, BocNHCH2CH2); 3.28 (b, 2H, BocNHCH2, CH2); 1.43 6 1.40 (9H, 'Bu). HPLC (260 nm) 20.71 min. (80.2$) og 21.57 min. (19.8$). UV-spektret (200 nm - 300 nm) er identisk og indikerer at de mindre toppene består av Bis-Z-AEG.

EKSEMPEL 25

N'-Boc-aminoetyl glycin etylester.

N-benzyloksykarbonyl-N'-(bocaminoetyl)glycin (60.0 g; 0.170 mol) og N,N-dimetyl-4-aminopyridin (6.00 g) ble løst opp i absolutt etanol (500 ml), og avkjølt til 0°C før tilsetning av DCC (42.2 g; 0.204 mol) Isbadet ble fjernet etter 5 min. og omrøringen ble fortsatt i ytterligere 2 timer. Presipitert DCU (32.5 g tørket) ble fjernet ved filtrering og vasket med eter (3 x 100 ml). Det kombinerte filtratet ble deretter vasket med fortynnet kalium hydrogensulfat (2 x 400 ml), fortynnet natriumhydrogenkarbonat (2 x 400 ml) og mettet natriumklorid (1 x 400 ml). Den organiske fasen ble filtrert og deretter tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum som ga et utbytte på 6.1 g av en oljeholdig forbindelse som inneholdt noe DCU.

Oljen ble løst opp i absolutt etanol (600 ml) og det ble tilsatt 10$ palladium på karbon (6.6 g). Oppløsningen ble hydrert ved atmosfærisk trykk hvor reservoaret ble fylt med 2N natriumhydroksid. Etter 4 timer ble 3.3 L konsumert fra teoretisk 4.2 L. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celit og avdampet til tørrhet i vakuum og ga 39.5 g (94$) av en oljeholdig forbindelse. En 13 g del av den oljeholdige forbindelsen ble renset ved silikagel (600 g Si02 ) kromatografi. Etter eluering med 300 ml 20$ petroleumeter i metylenklorid, ble tittelforbindelsen eluert med 1700 ml 5$ metanol i metylenklorid. Oppløsningsmidlet ble fjernet fra fraksjonene med tilfredsstillende renhet i vakuum og utbyttet var 8.49 g. Alternativt ble 10 g av råmaterialet renset ved Kugel Rohr destillasjon. ■'-H-NMR (250 MHz, CD30D); 4.77 (b.s, NH); 4.18 (q, 2H, MeCH2-); 3.38 (s, 2H, NCH2-C02Et); 3.16 (t, 2H, BoxNHCH2CH2 ) ; 2.68 (t, 2H, BocNHCH2CH2); 1.43 (s, 9H,

'Bu) og 1.26 (t, 3H, CH3) <13>C-NMR 171.4 (COEt); 156.6 (CO); 78.3 ((CH3)3C); 59.9 (CH2); 49.0 (CH2); 48.1 (CH2); 39.0 (CH2); 26.9 (CH2) og 12.6 (CH3 ) .

EKSEMPEL 26

N'-Boc-aminoetyl glycin metylester.

Ovennevnte fremgangsmåte ble anvendt, men metanol ble anvendt istedet for etanol. Sluttproduktet ble renset på kolonner.

EKSEMPEL 27

l-(Boc-aeg)tymin etylester.

N-Boc-aminoetyl glycin etylester (13.5 g; 54.8 mmol), DhbtOH (9.84 g; 60.3 mmol) og 1-karboksymetyl tymin (11.1 g; 60.3 mmol) ble løst opp i DMF (210 ml). Metylenklorid (210 ml) ble deretter tilsatt. Oppløsningen ble avkjølt ved 0°C i et etanol/isbad og DCC (13.6 g; 65.8 mmol) ble tilsatt. Isbadet ble fjernet etter 1 time og omrøringen ble fortsatt i ytterligere 2 timer ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering og vasket to ganger med metylenklorid (2 x 75 ml). Til det kombinerte filtratet ble det tilsatt ytterligere metylenklorid (650 ml). Oppløsningen ble deretter vasket med fortynnet natriumhydrogenkarbonat (3 x 500 ml), fortynnet kal iumhydrogensulf at (2 x 500 ml) og mettet natriumklorid (1 x 500 ml). Noe presipitat ble fjernet fra den organiske fasen ved filtrering. Den organiske fasen ble tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum. Den oljeholdige resten ble løst opp i metylklorid (150 ml), filtrert og tittelforbindelsen ble presipitert ved tilsetning av petroleumeter (350 ml) ved 0°C. Metylenklorid/petroleumeter prosedyren ble gjentatt en gang. Dette ga 16.0 g (71$) av et materiale som hadde en renhet på mer enn 99$ ifølge HPLC.

EKSEMPEL 28

l-(Boc-aeg)tymin.

Det ovennevnte materialet ble suspendert i THF (194 ml, gir en 0.2 M oppløsning) og 1 M vandig litium hydroksid (116 ml) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 45 min. ved romtemperatur og deretter filtrert for å fjerne gjenværende DCU. Vann (40 ml) ble tilsatt til oppløsningen som deretter ble vasket med metylenklorid (300 ml). Ytterligere vann (30 ml) ble tilsatt og den alkaliske oppløsningen ble vasket en gang til med metylenklorid (150 ml). Den vandige oppløsningen ble avkjølt til 0°C og pH ble justert til 2 ved dråpevis tilsetning av 1 N HC1 (omtrent 110 ml). Tittelforbindelsen ble ekstrahert med etylacetat (9 x 200 ml) og de kombinerte ekstraktene ble tørket over magnesiumsulfat og ble avdampet til tørrhet i vakuum. Resten ble avdampet en gang fra metanol som etter tørking over natt ga et fargeløst, glass-aktig faststoff. Utbytte 9.57 g (64$). HPLC > 98$ RT = 14.8 min.

Analyse for C16H24N407 °0.25 H20:

Funnet (beregnet):

C: 49.29 (49.42); H: 6.52 (6.35); N: 14.11 (14.41).

På grunn av den begrensede rotasjonen rundt det sekundære amidet ble flere av signalene koblet i forholdet 2:1 (indikert i listen med mj . for hoved og mi. for mindre). ^H-NMR

(250 MHz, DMS0-d6): 12.75 (b.s., 1H, C02H); 11.28 (s, "1H", mj . imid NH); 11.26 (s, "1H" , mi., imid NH); 7.30 (s, "1H", mj . , T H-6); 7.26 (s, "1H", mi., T H-6); 6.92 (b.t., "1H", mj., BocNH); 6.73 (b.t., "1H", mi., BocNH); 4.64 (s, "2H", mj . , CH2C0N); 4.46 (s, "2H" , mj . , CH2C0N); 4.19 (s, "2H" , mi., CH2C02H); 3.97 (s, "2H" , mj., CHc02H); 3.63-3.01 (uoppløst m, innbefatter vann, CH2CH2); 1.75 (s, 3H, CH3) og 1.38 (s , 9H, } 3u).

EKSEMPEL 29

N4-benzyloksykarbony1-1-(Boe-aeg)cytos in.

N'-Boc-aminoetyl glycin etylester (5.00 g; 20.3 mmol), DhbtOH (3.64 g; 22.3 mmol) og N<4->benzyloksykarbonyl-l-karboksymetyl cytosin (6.77 g; 22.3 mmol) ble suspendert i DMF (100 ml). Metylenklorid (100 ml) ble deretter tilsatt. Oppløsningen ble avkjølt til 0"C og DCC (5.03 g; 24.4 mmol) ble tilsatt. Isbadet ble fjernet etter 2 t og omrøringen ble fortsatt i ytterligere 1 t ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter avdampet til tørrhet i vakuum. Resten ble suspendert i eter (100 ml) og omrørt i 30 min. Det faste materialet ble isolert ved filtrering og eter-vaskeprosedyren ble gjentatt to ganger. Materialet ble deretter omrørt i 15 min. med fortynnet natriumhydrogenkarbonat (omtrent 4$ oppløsning, 100 ml), filtrert og vasket med vann. Denne prosedyren ble gjentatt en gang og ga etter tørking 17.0 g gult, fast materiale. Det faste stoffet ble deretter kokt med dioksan (200 ml) og filtrert mens det var varmt. Etter avkjøling ble vann (200 ml) tilsatt. Det presipiterte materialet ble isolert ved filtrering, vasket med vann og tørket. Ifølge HPLC (observert ved 260 nm) hadde dette materialet en renhet som var høyere enn 99$ bortsett fra DCU. Estere ble deretter suspendert i THF (100 ml), avkjølt til 0°C og 1 N LiOH (61 ml) ble tilsatt. Etter røring i 15 minutter ble blandingen filtrert og filtratet ble vasket med metylenklorid (2 x 150 ml). Den alkaliske oppløsningen ble deretter avkjølt til 0°C og pH ble justert til 2.0 med IN HC1. Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering og vasket en gang med vann og dette ga 11.3 g av et hvitt pulver etter tørking. Materialet ble suspendert i metylenklorid (300 ml) og petroleumeter (300 ml) ble tilsatt. Filtrering og vasking ga 7.1 g (69$) etter tørking. HPLC viser en renhet på 99$ R^ = 19.5 min. og en mindre urenhet ved 12.6 min. (omtrent 1$) som mest sannsynlig er Z-de beskyttet monomer.

Anal. for Cgs<H>^g<N>gOg:

Funnet (beregnet):

C: 54.16 (54.87); H: 5.76 (5.81); N: 13.65 (13.91).

^H-NMR (250 MHz, DMS0-d6). 10.78 (b.s, 1H, C02H); 7.88 (2 overlappende dupletter, 1H, Cyt H-5); 7.41 - 7.32 (m, 5H, Ph); 7.01 (2 overlappende dubletter, 1H, Cyt H-6); 6.94 & 6.78 (ures. tripletter, 1H, BocNH); 5.19 (s, 2H, PhCH2 ); 4.81 & 4.62 (s, 2H, CH2C0N); 4.17 & 3.98 (s, 2H, CH2C02H); 3.42-3.03 (m, innbefatter vann, CH2CH2) og 1.38 & 1.37 (s, 9H, 'Bu). <13>C-NMR. 150.88; 128.52; 128.18; 127.96; 93.90; 66.53; 49.58 og 28.22. IR: Frekvens i cm-<1> (intensitet). 3423 (26.4), 3035 (53.2), 2978 (41.4), 1736(17.3), 1658 (3.8), 1563 (23.0), 1501 (6.8) og 1456 (26.4).

EKSEMPEL 30

9-karboksymetyl adenin etylester.

Adenin (10.0 g, 74 mmol) og kaliumkarbonat (10.29 g, 74.0 mmol) ble suspendert i DMF og etylbromacetat (8.24 ml, 74 mmol) ble tilsatt. Suspensjonen ble omrørt i 2.5 t under nitrogen ved romtemperatur og deretter filtrert. Den faste resten ble vasket tre ganger med DMF (10 ml). Det kombinerte filtratet ble avdampet til tørrhet i vakuum. Det gul-organge fastmaterialet ble heilt inn i vann (200 ml )og 4N HC1 ble tilsatt til pH £ 6. Etter omrøring ved 0°C i 10 min. ble det faste stoffet filtrert ut, vasket med vann og omkrystallisert fra 96$ etanol (150 ml). Tittelforbindelsen ble isolert ved filtrering og grundig vasket med eter. Utbytte 3.4 g (20$). Smp. 215.5 - 220°C.

Anal. for CqH11<N>5<0>2<:>

Funnet (beregnet):

C: 48.86 (48.65); H: 5.01 (4.91); N: 31.66 (31.42).

1-H-NMR (250 MHz; DMS0-d6) : (s, 2H, H-2 & H-8) , 7.25 (b.s., 2H, NH2), 5.06 (s, 2H, NCH2), 4.17 (q, 2H, J-7.11 Hz, 0CH2) og 1.21 (t, 3H, J=7.13 Hz, NCH2). <13>C-NMR. 152.70, 141.30, 61.41, 43.97 og 14.07. FAB-MS. 222 (MH+). IR: Frekvens 1 cm"<1> (intensitet). 3855 (54.3), 3274 (10.4), 3246 (14.0), 3117 (5.3), .2989 (22.3), 2940 (33.9), 2876 (43.4), 2753 (49.0), 2346 (56.1), 2106 (57.1), 1899 (55.7), 1762 (14.2), 1742 (14.2), 1742 (1.0), 1671 (1.8), 1644 (10.9), 1606 (0.6), 1582 (7.1 ), 1522 (43.8), 1477 (7.2 ), 1445 (35.8) og 1422 (8.6). Posisjonen til alkyleringen ble verifisert ved røntgen-krystallografi på krystaller som ble oppnådd ved omkrystallisering fra 96$ etanol.

Alternativt kan 9-karboksymetyladenin etylester bli dannet ved hjelp av følgende prosedyre. Til en suspensjon av adenin (50.0 g, 0.37 mol) i DMF (1100 ml) i 2 L trehalset flaske utstyrt med et nitrogeninnløp, en mekanisk rører og en skilletrakt blir det tilsatt 16.4 g (0.407 mol) vasket natrium-hydrid- mineralolje dispersjon. Blandingen ble deretter omfattende omrørt i 2 timer og etyl bromacetat 75 ml, 0.67 mol) ble dråpevis tilsatt iløpet av 3 timer. Blandingen ble omrørt i en ytteligere time og tic indikerte fullstendig omdanning av adenin. Blandingen ble avdampet til tørrhet ved 1 mmHg og vann (500 ml) ble tilsatt til den oljeholdige resten som forårsakte krystallisasjon av tittelforbindelsen. Det faste stoffet ble omkrystallisert fra 06$ etanol (600 ml). Utbytte etter tørking var 53.7 (65.6$). HPLC (215 nm) renhet > 99.5$.

EKSEMPEL 31

N<6>Benzyloksykarbonyl-9-karboksymetyl adenin etylester.

9-karboksymetyladenin etylester (3.40 g, 15.4 mmol) ble løst opp i tørr DMF (50 ml) forsiktig oppvarming, avkjølt til 20°C og tilsatt til en oppløsning bestående av N-etyl-benzyloksy-

karbonyl imidazol tetrafluorborat (62 mmol) i metylenklorid (50 ml) over en periode på 15 min. med isavkjøling. En viss grad av presipitasjon ble observert. Isbadet ble fjernet og oppløsningen ble omrørt over natt. Reaksjonsblandingen ble behandlet med et natriumhydrogenkarbonat (100 ml). Etter tørking i 10 min. ble fasene separert og den organiske fasen ble fortløpende vasket med et volum vann, fortynnet kalium hydrogensulfat (to ganger) og mettet natriumklorid. Oppløs-ningen ble tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum som ga 11 g av et oljeholdig materiale. Materialet ble løst opp i metylenklorid (25 ml), avkjølt til 0°C og presipitert med petroleumeter (50 ml). Denne prosedyren ble gjentatt en gang for å oppnå 3.45 g (63$) av tittelforbindelsen. Smp. 132 - 35°C.

Anal. for C-L7H17N5O4:

Funnet (beregnet):

C: 56.95 (57.46); H: 4.71 (4.82); N: 19.35 (19.71). <i>H-NMR (250 MHz; CDCI3): 8.77 (s, 1H, H-2 eller H-8); 7.99 (s, 1H, H-2 eller H-8); 7.45 - 7.26 (m, 5H, Ph); 5.31 (s, 2H, N-CH2); 4.96 (s, 2H, Ph-CH2); 4.27 (q, 2H, J=7.15 Hz, CH2CH3) og 1.30 (t, 3H, J=7.15 Hz, CH2-CH3). <13>C-NMR: 153.09; 143.11; 128.66; 67.84; 62.51; 44.24 og 14.09. FAB-MS: 356 (MH+) og 312 (MH+-C02). IR: frekvens i cm-<1> (intensitet). 3423 (52.1 ); 3182 (52.8); 3115 (52.1); 3031 (47.9 ); 2981 (38.6); 1747 (1.1); 1617 (4.8); 15.87 (8.4); 1552 (25.2); 1511 (45.2); 1492 (37.9); 1465 (14.0) og 1413 (37.3).

EKSEMPEL 32

N<6>Benzyloksykarbonyl-9-karboksymetyl adenin.

N<6->benzyloksykarbonyl-9-karboksymetyladenin etylester (3.20 g; 9.01 mmol) ble blandet med metanol (50 ml) avkjølt til 0°C. Natrium hydroksidoppløsningen (50 ml; 2N) ble vasket og materialet ble deretter hurtig oppløst. Etter 30 min. ved 0°C ble den alkaliske oppløsningen vasket med metylenklorid (2 x 50 ml). Den vandige oppløsningen ble bragt til pH 1.0 med 4N HC1 ved 0°C og deretter ble tittelforbindelsen presipitert. Utbyttet etter filtrering, vasking med vann og tørking var 3.08 g (104$). Produktet inneholdt salt og elementanalysen reflekterte dette.

Anal. for C15H-L3N5O4:

Funnet (beregnet):

C: 46.32 (55.05); H: 4.24 (4.00); N, 18.10 (21.40) og C/N: 2.57 (2.56). ^H-NMR (250 MHz; DMS0-d6): 8.70 (s, 2H, H-2 og H-8); 7.50 - 7.35 (m, 5H, Ph); 5.27 (s, 2H, N-CH2); og 5.15 (s, 2H, Ph-CH2). <13>C-NMR. 168.77, 152.54, 151.36, 148.75, 145.13, 128.51, 128.17, 127.98, 66.76 og 44.67. IR(KBr) 3484 (18.3); 3109 (15.9); 3087 (15.0); 2966 (17.1); 2927 (19.9); 2383 (53.8); 1960 (62.7); 1739 (2.5); 1688 (5.2); 1655 (0.9); 1594 (11.7); 1560 (12.3); 1530 (26.3); 1499 (30.5 ); 1475 (10.4 ); 1455 (14.0); 1429 (24.5 ) og 1411 (23.6). FAB-MS: 328 (MH+) og 284 (MH+-C02). HPLC (215 nm, 260 nm) i system 1: 15.18 min., mindre urenheter var alle mindre enn 2$.

EKSEMPEL 33

N<4->Benzyloksykarbonyl-l-(Boc-aeg)adenin etylester. N-Boc-aminoetyl glycin etylester (2.00 g; 8.12 mmol), DhbtOH (1.46 g; 8.93 mmol) og N<6->benzyloksykarbonyl-9-karboksymetyl adenin (2.92 g; 8.93 mmol) ble løst opp i DMF (15 ml). Metylenklorid (15 ml) ble deretter tilsatt. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C i et etanol/isbad. DCC (2.01 g; 9.74 mmol) ble tilsatt. Isbadet ble fjernet etter 2.5 t og omrøringen ble fortsatt i ytterligere 1.5 time ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering og vasket en gang me-d DMF (15 ml) og to ganger med metylenklorid (2 x 15 ml). Til det kombinerte filtratet ble det tilsatt ytterligere metylenklorid (100 ml). Oppløsningen ble vasket med fortynnet natriumhydrogen karbonat (2 x 100 ml), fortynnet kalium-hydrogensulfat (2 x 100 ml) og mettet natriumklorid (1 x 100 ml). Den organiske fasen ble avdampet til tørrhet i vakuum og ga 3.28 g (73$) av en gul oljeholdig forbindelse. HPLC av råproduktet viser en renhet på bare 66$ med flere urenheter og som begge var mer eller mindre polare enn hovedtoppen. Oljen ble løst opp i absolutt etanol (50 ml) og aktivert karbon ble tilsatt. Etter omrøring i 5 min. ble oppløsningen filtrert. Filtratet ble blandet med vann (30 ml) og ble latt stå med omrøring over natt. Neste dag ble det hvite presipitatet fjernet ved filtrering, vasket med vann og tørket og ga 1.16 g (26$) av et materiale med en renhet som er høyere enn 98$ ifølge -HPLC. Tilsetning av vann til morvæsken ga ytterligere 0.53 g med en renhet på omtrent 95$.

Anal. for C26<H>33<N>707<o>H20:

Funnet (beregnet):

C: 55.01 (54.44); H: 6.85 (6.15); N: 16.47 (17.09).

1-H-NMR (250 MHz, CDC13) 8.74 (s, 1H, Ade H-2); 8.18 (b. s, 1H, ZNH); 8.10 & 8.04 (s, 1H, H-8); 7.46 - 7.34 (m, 5H, Ph); 5.63 (ures. t, 1H, BocNH); 5.30 (s, 2H, PhCH2); 5.16 & 5.00 (s, 2H, CHgCON); 4.29 & 4.06 (s, 2H, CH2C02H); 4.20 (q, 2H, 0C<H>2C<H>3)<;> 3.67 - 3.29 (m, 4H, CH2CH2); 1.42 (s, 9H, 'Bu) og 1.27 (t, 3H, 0CH2CH_3). Spekteret viser spor av etanol og

DCU.

EKSEMPEL 34

N<4->benzyloksykarbonyl-l-(Boc-aeg)adenin.

N<6->benzyloksykarbonyl-l-(Boc-aeg)adenin etylester (1.48 g; 2.66 mmol) ble suspendert i THF (13 ml) og blandingen ble avkjølt til 0°C. Litiumhydroksid (8 ml, IN) ble tilsatt. Etter 15 min. med omrøring ble reaksjonsblandingen filtrert, ekstra vann (25 ml) ble tilsatt og oppløsningen ble vasket med metylenklorid (2 x 25 ml). pH til den vandige oppløs-ningen ble justert til pH 2.0 med IN HC1. Presipitatet ble isolert ved filtrering, vasket med vann og tørket og dette ga 0.82 g (58$). Produktet ble på ny presipitert to ganger med metylenklorid/petroleumeter, 0.77 g (55$) etter tørking. Smp. 119°C (dekomp.).

Anal. for C24<H>2gN707°H20:

Funnet (beregnet):

C: 53.32 (52.84); H: 5.71 (5.73); N: 17.68 (19.97).

FAB-MS. 528.5 (MH+). ^H-NMR (250 MHz, DMSO-d4). 12.75 (meget b, 1H, C02H); 10.65 (b. s, 1H, ZNH); 8.59 (d, 1H, J = 2.14 Hz, Ade H-2); 8.31 (s, 1H, Ade H-8); 7.49 - 7.31 (m, 5H, Ph); 7.03 & 6.75 (uresol. t, 1H, BocNH); 5.33 & 5.16 (s, 2H, CH2C0N); 5.22 (s, 2H, PhCH2) ; 4.34 - 3.99 (s, 2H, CH2C02<H>); 3.54 - 3.03 (m's, innbefatter vann, CH2CH2) og 1.39 & 1.37 (s, 9H, 'Bu). <13>C-NMR. 170.4; 166.6; 152.3; 151.5; 149.5; 145.2; 128.5; 128.0; 127.9; 66.32; 47.63; 47.03; 43.87 og 28.24.

EKSEMPEL 35

2-amino-6-klor-9-karboksymetylpurin.

Til en suspensjon av 2-amino-6-klorpurin (5.02 g; 29.6 mmol) og kaliumkarbonat (12.91 g; 93.5 mmol) i DMF (50 ml) ble det tilsatt bromeddiksyre (4.70 g; 22.8 mmol). Blandingen ble omfattende omrørt i 20 t under nitrogen. Vann (150 ml) ble tilsatt og oppløsningen ble filtrert gjennom celit for å tilveiebringe en klar gul oppløsning. Oppløsningen ble surgjort til en pH på 3 med 4 N saltsyre. Presipitatet ble filtrert og tørket i vakuum over sicapent. Utbytte (3.02 g; 44.8$). 1-H-NMR (DMS0-d6): d= 4.88 ppm (s, 2H); 6.95 (s, 2H); 8.10 (s, 1H).

EKSEMPEL 36

2-amino-6-benzyloksy-9-karboksymetylpurin.

Natrium (2.0 g; 87.0 mmol) ble løst opp i benzylalkohol (20 ml) og oppvarmet til 130°C i 2 t. Etter avkjøling til 0°C ble en oppløsning av 2-amino-6-klor-9-karboksymetylpurin (4.05 g; 18.0 mmol) i DMF (85 ml) sakte tilsatt og den resulterende suspensjonen ble omrørt over natt ved 20°C. Natriumhydroksid-oppløsningen (IN, 100 ml) ble tilsatt og den klare oppløsningen ble vasket med etylacetat (3 x 100 ml). Vannfasen ble deretter surgjort til en pH på 3 med 4K saltsyre. Presipitatet ble tatt opp i etylacetat (200 ml) og vannfasen ble ekstrahert med etylacetat (2 x 100 ml). De kombinerte organiske fasene ble vasket med mettet natriumklorid-oppløsning (2 x 75 ml), tørket med vannfri natriumsulfat og tørket ved avdampning i vakuum. Resten ble omkrystallisert fra etanol (300 ml). Utbytte etter tørking i vakuum over sicapent var: 2.76 g (52$). Smp. 159 - 65°C.

Anal .

Beregnet (funnet):

C(56.18; 55.97), H(4.38; 4.32), N(23.4; 23.10).

1- H-NMR (DMS0-d6): 4.82 ppm. (s, 2H); 5.51 (s, 2H); 6.45 (s, 2H); 7.45 (m, 5H); 7.82 (s, 1H).

EKSEMPEL 37

N-( [ 2-amino-6-benzyloksy-purin-9-yl]-acetyl ) -N- ( 2-Boc-aminoetyl)-glycin [BocGaeg-OH monomer].

2- amino-6-benzyloksy-9-karboksymetyl-purin (0.50 g; 1.67 mmol ), metyl-N(2-[tert-butoksykarbonylamino]etyl)glycinat (0.65 g; 2.80 mmol), diisopropyletyl amin (0.54 g; 4.19 mmol) og brom-tris-pyrrolidino-fosfornium-heksafluor-fosfat (PyBroP®) (0.798 g; 1.71 mmol) ble omrørt i DMF (2 ml) i 4 t. Den klare oppløsningen ble heilt inn i is-avkjølet oppløsning av natriumhydrogen karbonat (IN; 40 ml) og ekstrahert med etylacetat (3 x 40 ml). Det organiske laget ble vasket med kaliumhydrogensulfat-oppløsning (IN, 2 x 40 ml), natriumhydrogen karbonat (IN, 1 x 40 ml) og mettet natriumklorid-oppløsning (60 ml). Etter tørking med vannfri natriumsulfat og avdampning i vakuum ble den faste resten omkrystallisert fra etyl acetat/heksan (20 ml (2:1)) for å tilveiebringe metylester i et utbytte på 63$ (MS-FAB 514 (M+l). Hydrolysen ble oppnådd ved oppløsning i eter i etanol/vann (30 ml (1:2)) inneholdende kons. natriumhydroksid (1 ml). Etter omrøring i 2 t ble oppløsningen filtrert og surgjort til en pH på 3 ved tilsetning av 4N saltsyre. Tittelforbindelsen ble oppnådd ved filtrering. Utbytte: 370 mg (72$ for hydrolysen). Enheten ifølge HPLC var høyere enn 99$. På grunn av den begrensede rotasjonen rundt det sekundære amidet, ble flere av signalene fordoblet i forholdet 2:1 (indikert i listen ved

mj . for major og mi. for minor). <1>H-N1VIE (250, MHz, DMS0-d6): d = 1.4 ppm. (s, 9H); 3.2 (m, 2H); 3.6 (m, 2H); 4.1 (s, mj., C0NRCH2C00H); 4.4 (s, mi., C0NRCH2C00H); 5.0 (s, mi., Gua-CH2C0-); 5.2 (s, mj., Gua-CH2C0); 5.6 (s, 2H); 6.5 (s, 2H); 6.9 (m, mi., BocNH); 7.1 (m, mj., BocNH); 7.5 (m., 3H); 7.8 (s, 1H); 12.8 (s; 1H). <13>C-NMR. 170.95; 170.52; 167.29; 166.85; 160.03; 159.78; 155.84; 154.87; 140.63; 136.76; 128.49; 128.10; 113.04; 78.19; 77.86; 66.95; 49.22; 47.70; 46.94; 45.96; 43.62; 43.31 og 28.25.

EKSEMPEL 38

3-Boc-amino-l,2-propandiol.

3-amino-l,2-propandiol (40.00 g, 0.440 mol, 1.0 ekv.) ble løst opp i vann (1000 ml) og avkjølt til 0°C. Di-tert-butyl dikarbonat (115.0 g, 0.526 mol, 1.2 ekv.) ble tilsatt i en porsjon. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet ved romtemperatur på et vannbad med omrøring. pH ble opprettholdt ved 10.5 med en oppløsning av natriumhydroksid (17i.56 g., 0.440 mol, 1.0 ekv.) i vann (120 ml). Når tilsetning av vandig natriumhydroksid var tilført, ble reaksjonsblandingen omrørt over natt ved romtemperatur. Deretter ble etylacetat (7i50 ml) tilsatt til reaksjonsblandingen etterfulgt av avkjøling til 0°C. pH ble justert til 2.5 med 4 N svovelsyre med omfattende omrøring. Fasene ble separert og vannfasen ble vasket med ytterligere etylacetat (6 x 350 ml). Volumet til den organiske fase ble redusert til 900 ml ved avdampning under redusert trykk. Den organiske fasen ble deretter vasket med en mettet vandig oppløsning av kaliumhydrogen sulfat fortynnet til to ganger av volumet (1 x 1000 ml) og med mettet vandig natriumklorid (1 x 500 ml). Den organiske fasen ble tørket (MgS04) og avdampet under redusert trykk for å tilveiebringe 50.12 g (60$) av tittelforbindelsen. Produktet kunne stivne ved avdampning fra metylenklorid og påfølgende frysing. <1>H-NMR (CDCI3/TMS): d = 1.43 (s, 9H, Me3C), 3.25 (m, 2H, CH2), 3.57 (m, 2H, CH2), 3.73 (m, 1H, CH). 13C-NMR

(CDCI3/TMS): d = 28.2 (Me3C), 42.6 (CH2), 63.5, 71.1 (CH20H, CHOH), 79.5 (Me3C), 157.0 (C=0).

EKSEMPEL 39

2- (Boe-amino)etyl-L-alanin metylester.

3- Boc-amino-l,2-propandiol (20.76 g, 0.109 mol, 1 ekv.) ble suspendert i/ vann (150 ml). Kalium m-periodate (24.97 g, 0.109 mol, 1 ekv.) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 t vesd romtemperatur under nitrogen. Reaksjonsblandingen ble filtrert og vannfasen ekstrahert med kloroform (6 x 250 ml). Den organiske fasen ble tørket (MgSC^) og avdampet for å tilveiebringe et nesten kvantitativt utbytte av Boc-aminoacetaldehyd som en fargeløs olje, som ble anvendt uten ytterligere rensing i følgende prosedyre.

Palladium-på-karbon (10$, 0.8 g) ble tilsatt til MeOH (250 ml) under nitrogen med avkjøling (0°C) og omfattende omrør-ing. Vannfri natriumacetat (4.49 g, 54.7 mmol, 2 ekv.) og L-alanin metylester, hydroklorid (3-82 g, 27.4 mmol, 1 ekv.) ble tilsatt. Boc-aminoacetaldehyd (4.79 g, 30.1 mmol, 1.1 ekv.) ble løst opp i MeOH (150 ml) og tilsatt til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen ble hydrert ved atmosfærisk trykk og ved romtemperatur helt til hydrogenopptaket var opphørt. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celit som ble vasket med ytterligere MeOH. MeOH ble fjernet under redusert trykk. Resten ble suspendert i vann (150 ml) og pH justert til 8.0 ved dråpevis tilsetning av 0.5 N NaOH med omfattende omrøring. Vannfasen ble ekstrahert med metylenklorid (4 x 250 ml). Den organiske fasen ble tørket (MgSOjj), filtrert gjennom celit og avdampet under redusert trykk for å tilveiebringe 6.36 g (94$) av tittelforbindelsen som en klar, noe gul olje. MS (FAB-MS): m/z ($) = 247 (100, M+l, 191 (90 ), 147 (18). <*>H-NMR (1250 MHz, CDC13). 1.18 (d, J=7.0 Hz, 3H, Me), 1.36 (s, 9H, Me3C), 1.89 (b, 1H, NH), 2.51 (m, 1H, CH2), 2.66 (m, 1H, CH2) , 3.10 (m, 2H, CH2) , 3.27 (q, J=7.0 Hz, 1H, CH), 3.64 (s, 3H, OMe), 5.06 (b, 1H, karbamat NH). <13>C-NMR. d-18.8 (Me), 28.2 (Me3C), 40.1, 47.0 (CH2), 51.6 (OMe), 56.0 (CH), 155.8 (karbamat C=0) , 175.8 (ester C=0).

EKSEMPEL 40

N-(Boc-aminoetyl)-N-(1-tyminylacetyl)-L-alanin metylester. Til en oppløsning av Boc-aminoetyl-(L )-alanin metylester (1.23 g, 5.0 mmol) i DMF (10 ml) ble det tilsatt Dhbt-OH (0.90 g, 5.52 mmol) og 1-tyminyleddiksyre (1.01 g. 5.48 mmol). Når 1-tyminyleddiksyre ble oppløst, ble diklormetan (10 ml) tilsatt og oppløsningen ble avkjølt på et isbad. Etter at reaksjonsblandingen hadde nådd 0°C ble DCC (1.24 g, 6.01 mmol) tilsatt. Iløpet av 5 min. etter tilsetningen fremkom et presipitat av DCU. Etter ytterligere 5 min. ble isbadet fjernet. To timer senere viste TLC analyse at reaksjonen var avsluttet. Blandingen ble filtrert og presipitatet ble vasket med diklormetan (100 ml). Den resulterende oppløsningen ble ekstrahert to ganger med 5$ natriumhydrogen karbonat (150 ml) og to ganger med mettet kal iumhydrogen sulfat (25 ml) i vann (100 ml). Etter en endelig ekstrahering med mettet natriumklorid (150 ml), ble oppløsningen tørket med magnesiumsulfat og avdampet til et hvitt skum. Skummet ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel ved anvendelse av diklormetan med en metanolgradient som elueringsmiddel. Dette ga en ren forbindelse (>99$ ifølge HPLC) (1.08 g, 52.4$). FAB-MS: 413 (M+l) og 431 (M+l + vann). <1>H-NMR (CDC13): 4.52 (s, 2H, CH2); 3.73 (s, 3H, OMe); 3.2 - 3.6 (m, 4H, etyl CH2_s), 1.90 (s, 3H, Me i T); 1.49 (d, 3 H, Me i Ala, J = 7.3 Hz); 1.44 (s, 9H, Boe).

EKSEMPEL 41

N-(Boc-aminoetyl)-N-(1-tyminylacetyl)-L-alanin.

Metylester av tittelforbindelsen (2.07 g, 5.02 mmol) ble løst opp i metanol (100 ml) og avkjølt på et isbad. 2 M natriumhydroksid (100 ml) ble tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble pH i blandingen justert til 3 med 4 M hydrogenklor id. Oppløsningen ble deretter ekstrahert med etylacetat (3 x 100 ml). De kombinerte organiske ekstraktene ble tørket over magnesiumsulfat. Etter avdampning ble det resulterende skummet løst opp i etylacetat (400 ml) og få ml metanol for å oppløse det faste materialet. Petroleumeter ble deretter tilsatt helt til presipiteringen begynte. Etter henstand over natten ved -20°C ble presipitatet fjernet ved filtrering. Dette ga 1.01 g (50.5$) ren forbindelse ( >99$ ifølge HPLC). Forbindelsen kan bli omkrystallisert fra 2-propanol. FAB-MS: 399 (M+l). ^H-NMR (DMS0-d6): 11.35 (s, 1H, C00); 7.42 (s, 1H, H~6); 4.69 (s, 2H, CH_2); 1.83 (s, 3H, Me i T);

I. 50 - 1.40 (m, 12 H, Me i Ala + Boe).

EKSEMPEL 42

(a) N-(Boc-aminoetyl)--N-( 1-tyminylacetyl )-p-alanin

metylester.

Til en oppløsning av Boc-aminoetyl alanin metylester (2.48 g, 10.1 mmol) i DMF (20 ml) ble det tilsatt Dhbt-OH (1.80 g, II. 0 mmol) og tyminyleddiksyre (2.14 g, 11.6 mmol). Etter oppløsning av 1-tyminyleddiksyre, ble metylenklorid (20 ml) tilsatt og oppløsningen avkjølt på et isbad. Når reaksjonsblandingen hadde nådd 0°C, ble DCC (2.88 g, 14.0 mmol) tilsatt. Iløpet av 5 min. etter tilsetningen fremkom et presipitat av DCU. Etter 35 min. ble isbadet fjernet. Reaksjonsblandingen ble filtrert 3.5 t senere og presipitatet ble vasket med metylenklorid (200 ml). Den resulterende oppløsningen ble ekstrahert to ganger med 5$ natriumhydrogenkarbonat (200 ml) og to ganger med mettet kalium hydrogensulfat i vann (100 ml). Etter en sluttlig ekstrahering med mettet natriumklorid (250 ml), ble oppløsningen tørket med magnesiumsulfat og avdampet til en olje. Oljen ble renset ved kromatografi på en kort silikagel-kolonne ved anvendelse av metylenklorid med en metanolgradient som elueringsmiddel. Dette ga en forbindelse som hadde en renhet på 96$ ifølge HPLC (1.05 g, 25.3$) etter presipitering med petroleumeter. FAB-MS: 413 (M+l). ^H-NMR (CDC13): 5.64 (t, 1 H, BocNH, J=5.89 Hz); 4.56 (d, 2H, CH"2); 4.35 (q, 1 H, CH i Ala, J=7.25 Hz); 3.74 (s, 3H, OMe); 3.64 - 3.27 (m, 4 H, etyl H-s); 1.90 (s, 3 H, Me i T); 1.52 - 1.44 (t, 12 H, Boc+Me i Ala).

(b) N-Boc-aminoetyl)-N-(1-tyminylacetyl )-D-alanin

Metylesteren av tittelforbindelsen (1.57 g, 3.81 mmol) ble løst opp i metanol (100 ml) og avkjølt på et isbad. Natriumhydroksid (100 ml, 2 M) ble tilsatt. Etter omrøring i 10 min. ble pH til blandingen justert til 3 med 4 M hydrogenklo-rid. Oppløsningen ble deretter ekstrahert med etylacetat (3 x 100 ml). Kombinerte organiske ekstrakter ble tørket over magnesiumsulfat. Etter avdamping ble oljen løst opp i etylacetat (200 ml). Petroleumeter ble tilsatt (til et totalt volum på 600 ml) helt til presipiteringen begynte. Etter henstand over natt ved -20°C, ble presipitatet fjernet ved filtrering. Dette ga 1.02 g (67.3$) av tittelforbindelsen som var 94$ renhet ifølge HPLC. FAB-MS: 399 (M+l). <1>H-NMR: 22.34 (s, 1H, COOH); 7.42 (s, 1 H, H"6); 4.69 (s, 2 H, CH"2); 4.40 (q, 1 H, CH i Ala, J=7.20 Hz); 1.83 (s, 3 H, Me i T); 1.52 - 1.40 (m, 12 H, Boe + Me i Ala).

EKSEMPEL 43

N-(N'-Boc-3'-aminopropyl)-N-[(1-tyminyl)acetyl]glycin metylester

N-(N'-Boc-3'-aminopropyl)glycin metylester (2.84 g, 0.0115 mol) ble løst opp i DMF (35 ml), og etterfulgt av tilsetning av DhbtOH (2.07 g, 0.0127i mol) og 1-tyminyleddiksyre (2.34 g, 0.0127 mol). Metylenklorid (35 ml) ble tilsatt og blandingen ble avkjølt til 0°C på isbad. Etter tilsetning av DCC (2.85 g, 0.0138 mol), ble blandingen omrørt ved 0°C i 2 etterfulgt av 1 t ved romtemperatur. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering, vasket med metylenklorid (25 ml) og en ytterligere mengde metylenklorid (150 ml) ble tilsatt til filtratet. Den organiske fasen ble ekstrahert med natriumhydrogenkarbonat (1 volum mettet, fortynnet med 1 volum vann, 6 x 250 ml), kaliumsulfat (1 volum mettet fortynnet med 1 volum vann, 3 x 250 ml) og mettet vandig natriumklorid (1 x 250 ml), tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet 1 vakuum. Den faste resten ble suspendert i metylenklorid (35 ml) og omrørt ilt. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering og vasket med metylenklorid (25 ml). Filtratet ble avdampet /til tørrhet i vakuum og resten ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel, eluerende med en blanding av metanol og metylenklorid (gradient fra 3-7$ metanol i metylenklorid). Dette ga tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff (3.05 g, 64$). Smp. 76 - 79°C (dekomp.).

Anal. for C-LgH2gN407:

Funnet (beregnet):

C: 52.03 (52.42); H: 6.90 (6.84); N: 13.21 (13.58). Forbindelsen viste tilfredsstillende ^H og <13>C-NMR spektre.

EKSEMPEL 44

N-(N'-Boc-3'-aminopropyl)-N-[(1-tyminyl)acetyl]glycin. N-(N'-Boc-3 '-aminopropyl )-N-[(1-tyminyl)acetyl]glycin metylester (3.02 g, 0.00732 mol) ble løst opp i metanol (25 ml) og omrørt i 1.5 t med 2 M natriumhydroksid (25 ml). Metanol ble fjernet ved avdampning i vakuum og pH justert til 2 med 4 M saltsyre ved 0°C. Produktet ble isolert som hvite krystaller ved filtrering, vasket med vann (3 x 10 ml) og tørket over sicapent i vakuum. Utbytte 2.19 g (75$).

Anal. for C17<H>26<N>407, H20,

Funnet (beregnet)

C-: 49.95 (49.03); H: 6.47 (6.29 ); N: 13.43 (13.45 ). Forbindelsen viste tilfredsstillende og <13>C-NMR spektre.

EKSEMPEL 45

3-(1-tyminyl )-propansyre metylester.

Tymin (14.0 g, 0.11 mol) ble suspendert i metanol. Metyl-acrylat (39.6 ml, 0.44 mol) ble tilsatt sammen med katalytiske mengder natriumhydroksid. Oppløsningen ble tilbake-strømmet for å tørke i 45 t, avdampet til tørrhet i vakuum og resten ble løst opp i metanol (8 ml) med oppvarming. Etter avkjøling på et isbad, ble produktet presipitert ved tilsetning av eter (20 ml), isolert ved filtrering, vasket med eter (3 x 15 ml) og tørket over sicapent i vakuum. Utbytte 11.23 g (48$). Smp. 112 - 119°C.

Anal. for CgjBi2<N>2°4:

Funnet (beregnet):

C: 51.14 (50.94); H: 5.78 (5.70); N: 11.52 (13.20). Forbindelsen viste tilfredsstillende og <13>C-NMR spektre.

EKSEMPEL 46

3-(1-tyminyl )-propansyre.

3-(1-tyminyl)-propansyre metylester (1.0 g, 0.0047 mol) ble suspendert i 2 M natriumhydroksid (15 ml), kokt i 10 min. pH ble justert til 0.3 med kons. saltsyre. Oppløsningen ble ekstrahert med etylacetat (10 x 25 ml). Den organiske fasen ble ekstrahert med mettet vandig natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff (0.66 g, 71$). Smp. 118 - 121°C.

Anal. for CgH-LgNgO/j:

Funnet (beregnet):

C: 48.38 (48.49); H: 5.09 (5.09); N: 13.93 (14.14). Forbindelsen viste tilfredsstillende ^H og <13>C-NMR spektre.

EKSEMPEL 47

N-(N'-Boc-aminoetyl )-N-[( 1-tyminyl )propanoyl] glycin etylester.

N-(N'-Boc-aminoetyl)-glycin etylester (1.0 g, 0.0041 mol) ble løst opp i DMF (12 ml). DhbtOH (0.73 g, 0.0045 mol) og 3-(l-tyminyl)-propansyre (0.89 g, 0.0045 mol) ble tilsatt. Metylenklorid (12 ml) ble deretter tilsatt og blandingen ble avkjølt til 0°C på et isbad. Etter tilsetning av DCC (1.01 g, 0.0049 mol), ble blandingen omrørt ved 0°C i 2 t etterfulgt av 1 t ved romtemperatur. Presipitert ester ble fjernet ved filtrering, vasket med metylenklorid (25 ml) og en ytterligere mengde metylenklorid (50 ml) ble tilsatt til filtratet. Den organiske fasen ble ekstrahert med natriumhydrogen karbonat (1 volum mettet fortynnet med 1 volum vann, 6 x 100 ml), kaliumsulfat (1 volum mettet fortynnet med 4 volum vann, 3 x 100 ml) og mettet vandig natriumklorid (1 x 100 ml), tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum. Den faste resten ble suspendert i metylenklorid (15 ml) og omrørt ilt. Presipitert DCU ble fjernet ved filtrering og vasket med metylenklorid. Filtratet ble avdampet til tørrhet i vakuum og resten ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel, eluerende med en blanding av metanol og metylenklorid (gradient fra 1 tilø 6$ metanol og metylenklorid). Dette ga tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff (1.02 g, 59$).

Anal. for C^ G^ q^^- j:

Funnet (beregnet):

C: 53.15 (53.51); H: 6.90 (7.09); N: 12.76 (13.13). Forbindelsen viste tilfredsstillende og <13>C-NMR spektre.

EKSEMPEL 48

N-(N' -Boc-aminoetyl )-N- [ (1-tyminyl )propanoyl] glycin. N-(N'-Boc-aminoetyl)-N-[(1-tyminyl)poropanoyl]glycin etylester (0.83 g, 0.00195 mol) ble løst opp i metanol (25 ml). Natriumhydroksid (25 ml; 2 M) ble tilsatt. Oppløsningen ble omrørt ilt. Metanol ble fjernet ved avdamping i vakuum og pH justert til 2 med 4 M saltsyre ved 0°C. Produktet ble isolert ved filtrering, vasket med eter (3 x 15 ml) og tørket over sicapent i vakuum. Utbytte 0.769 g, 99$). Smp. 213°C (dekomp.).

EKSEMPEL 49

Mono-Boc-etylendiamin (2).

tert-Butyl-4-nitrofenyl karbonat (1) (10.0 g; 0.0418 mol) løst opp i DMF (50 ml) ble dråpevis tilsatt over en periode på 30 min. til en oppløsning av etylendiamin (27.9 ml; 0.418 mol) og DMF (50 ml) og omrørt over natt. Blandingen ble avdampet til/ tørrhet i vakuum og den resulterende oljen ble løst opp i vann (250 ml). Etter avkjøling til 0°C ble pH justert til 3.5 med 4 M saltsyre. Oppløsningen ble deretter filtrert og ekstrahert med kloroform (3 x 250 ml). pH ble justert til 12 ved 0°C med 2 M natriumhydroksid og den vandige oppløsning ble ekstrahert med metylenklorid (3 x 300 ml). Etter behandling med mettet vandig natriumklorid (250 ml), ble metylenklorid oppløsningen tørket over magnesiumsulfat. Etter filtrering ble oppløsningen avdampet til tørrhet i vakuum og ga 4.22 g (63$) av produktet (olje). -'-H-NMR (90 MHz; CDC13): § 1.44 (s, 9H); 2.87 (t, 2H); 3.1 (q, 2H); 5.62 (s , bred ).

EKSEMPEL 50

(N-Boc-aminoetyl)-p-alanin metylester, HC1.

Mono-Boc-etylendiamin (2) (16.28 g; 0.102 mol) ble løst opp i acetonitril (400 ml) og metylakrylat (91.50 ml; 1.02 mol) overført til blandingen med acetonitril (200 ml). Oppløs-ningen ble tilbakestrømmet over natt under nitrogen i mørket for å unngå polymerisering av metylakrylat. Etter avdampning til tørrhet i vakuum, ble en blanding av vann og eter (200 + 200 ml) tilsatt og oppløsningen ble filtrert og omfattende omrørt. Den vandige fasen ble ekstrahert en gang til med eter og deretter frysetørret for å tilveiebringe et gult fast stoff. Omkrystallisering fra etylacetat ga 13.09 g (46$) av tittelforbindelsen. Smp. 138 - 140°C.

Anal. for C11H23<N>204C1:

Funnet (beregnet):

C: 46.49 (46.72); H: 8.38 (8.20); N: 9.83 (9.91);

Cl: 12.45 (12.54). ^H-NMR (90 MHz; DMSO-d6): 5 1.39 (s, 9H); 2.9 (m, 8H); 3.64 (s, 3H).

EKSEMPEL 51

N-[(1-tyminyl)acetyl]-N'-Boc-aminoetyl-p<->alanin metylester.

(N-Boc-amino-etyl)-P-alanin metylester, HC1 (3) (2.0 g; 0.0071 mol) og 1-tyminyl eddiksyre pentafluorfenylester (5)

(2.828 g; 0.00812 mol) ble løst opp i DMF (50 ml). Trietylamin (1.12 ml; 0.00812 mol) ble tilsatt og blandingen omrørt over natt. Etter tilsetning av metylenklorid (200 ml) ble den organiske fasen ekstrahert med vandig natriumhydrogenkarbonat (3 x 250 ml), halvmettet. Vandig kaliumhydrogensul-fat (3 x 250 ml) og mettet vandig natriumklorid (250 ml) og tørket over magnesiumsulfat. Filtrering og avdamping til tørrhet i vakuum resulterte i 2.9 g (99$) utbytte (olje). ^H-NMR (250 MHz; CDCI3): på grunn av begrenset rotering rundt det sekundære amidet ble flere av signalene doblet, S 1.43 (s, 9H); 1.88 (s, 3H); 2.63 (t, 1H); 2.74 (t, 1H); 3.25-3.55 (4xt, 8H); 3.65 (2xt, 2H); 3.66 (s, 1.5); 3.72 (s, 1.5); 4.61 (s, 1H); 4.72 (s, 2H); 5.59 (s, 0.5H); 5.96 (s, 0.5H); 7.11 (s, 1H); 10.33 (s, 1H).

EKSEMPEL 52

N-[(1-tyminyl)acetyl]-N'-Boc-aminoetyl-p<->alanin. N-[(1-tyminyl)acetyl]-N'-Boc-aminoetyl-p<->alanin metylester (3.0 g; 0.0073 mol) ble løst opp i 2 M natriumhydroksid (30 ml) og pH justert til 2 ved 0°C med 4 M saltsyre og oppløs-ningen ble omrørt i 2 t. Presipitatet ble isolert ved filtrering, vasket tre ganger med kaldt vann og tørket over sicapent i vakuum. Utbytte: 2.23 g (77$). Smp. 170 - 176°C. Anal. for C17E2()^ 407, H20,

Funnet (beregnet):

C: 49.49 (49.03); H: 6.31 (6.78); N: 13.84 (13.45).

<1>H-NMR (90 MHz; DMSO-d6): S 1.38 (s, 9H); 1.76 (s, 3H); 2.44 og 3.29 (m, 8H); 4.55 (s, 2H); 7.3 (s, 1H); 11.23 (s, 1H). FAB-MS: 399' (M+l).

EKSEMPEL 53

N-[(l-(N4-Z)-cytosyl)acetyl]-N' -Boc-aminoetyl -p-al anin metylester..

(N-Boc-amino-etyl)-g<->alanin metylester, HC1 (3) (2.0 g; 0.0071 mol) og 1-(N-4-Z)-cytosyleddiksyre pentafluorfenylester (5) (3.319 g; 0.0071 mol) ble løst opp i DMF (50 ml). Trietylamin (0.99 ml; 0.0071 mol) ble tilsatt og blandingen omrørt over natt. Etter tilsetning av metylenklorid (200 ml) ble den organiske fasen ekstraktert med vandig natriumhydrogen karbonat (3 x 250 ml), halv-mettet vandig kaliumhydrogen sulfat (3 x 250 ml) og mettet vandig natriumklorid (250 ml) og tørket over magnesiumsulfat. Filtrering og avdampning til tørrhet i vakuum resulterte i 3.36 g fast forbindelse som ble omkrystallisert fra metanol. Utbytte: 2.42 g (64$). Smp. 158 - 161"C.

Anal. for C^HggNgOg:

Funnet (beregnet):

C: 55.19 (56.49); H: 6.19 (6.26); N: 12.86 (13.18).

1-H-NMR (250 MHz; CDCI3): på grunn av begrenset rotering rundt det sekundære amidet ble flere av signalene doblet; S 1.43 (s, 9H); 2.57 (t, 1H); 3.60 - 3.23 (m's, 6H); 3.60 (s, 1, 5H); 3.66 (s, 1. 5H); 4.80 (s, 1H); 4.88 (s, 1H); 5.20 (s, 2H); 7.80 - 7.25 (m's, 7H). FAB-MS: 532 (M+l).

EKSEMPEL 54

N-[(1-(N<4->Z)-cytosyl)acetyl]-N'-Boc-aminoetyl-p-alanin.

N-[(l--(N-4-Z)-cytosyl)acetyl]-N'-Boc-aminoetyl-p-alanin metylester (0.621 g; 0.0012 mol) ble løst opp i 2 M natriumhydroksid (8.5 ml) og omrørt i 2 t. Deretter ble pH justert til 2 ved 0°C med 4 M saltsyre og oppløsningen ble omrørt i 2 t. Pesipitatet ble isolert ved filtrering, vasket tre ganger med kaldt vann og tørket over sicapent i vakuum. Utbytte 0.326 g (54$). Det hvite faste stoffet ble omkrystal1isert fra 2-propanol og vasket med petroleumeter. Smp. 163° C

(dekomp.)

Anal. for C24H3iN50g,

Funnet (beregnet):

C: 49.49 (49.03); H: 6.31 (6.78); N: 13.84 (13.45).

<1>H-NMR (250 MHz; CDC13) på grunn av den begrensede roteringen rundt det sekundære amidet, ble flere av signalene dobbelt, S 1.40 (s, 9H); 2.57 (t, 1H); 2.65 (t, 1H); 3.60 - 3.32 (m's, 6H); 4.85 (s, 1H); 4.98 (s, 1H); 5.21 (s, 2H); 5.71 (s, 1H, bred); 7.99 - 7.25 (m's, 7H). FAB-MS: 518 (M+l).

EKSEMPEL 55

Eksempel på en PNA-oligomer med et guaninresidie

(a) Fast-fase syntese av H-[Taeg]5-[Gaeg]-[Taeg]4-Lys-NH2 Beskyttet PNA ble oppstilt på en Boc-Lys(ClZ) modifisert MBHA harpiks med en substitusjon på omtrent 0.15 mmol/g (bestemt ved kvantitativ ninhydrinreaksjon). Kobling av ukoblede aminogrupper ble bare utført før inkorporering av BocGaeg-OH monomeren. (b) Trinnvis oppstilling av H-[Taeg]5~[Gaeg]-[Taeg]4-Lys-NH2 (synteseprotokoll).

Syntesen ble initiert på 102 mg (tørrvekt) forsvellet (overnatt i DCM) og nøytralisert Boc-Lys(C1Z)-MBHA harpiks. De utførte trinnene var som følger: (1) Boc-avspaltning med TFA/DCM (1:1, v/v), 1x2 min. og 1 x 1/2 t, 3 ml; (2) vasking med DCM, 2 x 20 sek., 3 ml, og drenering i 30 sek., (3) nøytralisering med DIEA/DCM (1:19 v/v), 2x3 min., 3 ml; (4) vasking med DCM, 4 x 20 sek., 3 ml og drenering i 1 min., (5) tilsetning av 4 ekv. diisopropyl karbodiimid (0.06 mmol); 9.7 pl) og 4 ekv. (0.06 mmol; 24 mg) BocTaeg-OH eller (0.06 mmol; 30 mg) BocGaeg-OH løst opp i 0.6 ml DCM/DMF (1:1, v/v) (sluttkonsentrasjon av monomer 0.1 M), og koblingsreak-

J. VJ c

sjonen ble utført i en 1/2 t risting ved romtemperatur, (6) drenering i 20 sek., (7) vasking med DMF, 2 x 20 sek. og 1 x 2 min., 3 ml, vasking med DCM 4 x 20 sek., 3 ml; (8) nøytral-isering med DIEA/DCM (1:19 v/v), 2x3 min., 3 ml; (9) vasking med DCM 4 x 20 sek., 3 ml og drenering i 1 min.; (10) kvalitativ Kaiser test; (11) blokkering av ureagerte aminogrupper ved acetylering med Ac20/pyridin/DCM (1:1:2, v/v), 1 x 1/2 t, 3 ml; og (12) vasking med DCM, 4 x 20 sek., 2x2 min. og 2 x 20 sek., 3 ml. Trinnene 1-12 ble gjentatt helt til den ønskede sekvensen ble oppnådd. Alle kvalitative Kaiser testene var negative (strå-gul farge uten farging av kulene) indikerte et utbytte på nærmest 100$ kobling. PNA-oligomeren ble spaltet og renset ved den normale prosedyren. FAB-MS: 2832.11 (M<*>+l] (beregnet 2832.15 ).

EKSEMPEL 56

Fast-fase syntese av H-Taeg-Aaeg-[Taeg]8-Lys-NH2-

(a) Trinnvis oppstilling av Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]8-Lys-(CIZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 0.3 g våt Boe-[Taeg]8-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble plassert i en 3 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved in situ DCC kobling (enkelt) av A(Z)aeg residiet ved anvendelse av 0.19 M BocA(Z )aeg-0H sammen med 0.15 M DCC i 2.5 ml 50$ DMF/CH2C12 og en enkelt kobling med 0.15 M BocTaeg-OPfp i CH2C12 ("Synteseprotokoll 5"). Syntesen ble registrert ved kvantitativ ninhydrinreaksjon som viste omtrent 50$ inkorporering av A(Z)aeg og omtrent 96$ inkorporering av Taeg.

(to) Spalting, rensing og identifikasjon av H-Taeg-Aaeg-[Taeg]8-Lys-NH2

Beskyttet Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(C1Z )-BAH harpiks ble behandlet i Eksempel 40 c for å tilveiebringe omtrent 15.6 mg råmateriale ved HF spaltning av 53.1 mg tørr H-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(ClZ)-BHA harpiks. Hovedtoppen ved 14.4 min. utgjorde mindre enn 50$ av den totale absorbansen. En 0.5 mg del av råproduktet ble renset for å tilveiebringe omtrent 0.1 mg H-Taeg-Aaeg-[Taeg]g-Lys-NHg. For (MH+)<+> var den beregnede m/z verdien 2816.16 og den målte m/z verdien var 2816.28.

(c) Synteseprotokoll 5

(1) Boc-avspaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 2.5 ml, 3x1 min. og 1 x 30 min.; (2) vasking med CH2C12, 2.5 ml, 6 x 1 min.; (3) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 2.5 ml, 3x2 min; (4) vasking med CH2C12, 2.5 ml, 6 x 1 min. og drenering i 1 min., (5) 2 - 5 mg prøve av PNA-harpiksen ble tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhidrinanalyse for å bestemme substitusjonen, (6) tilsetning av 0.47 mmol (0.25 g) BocA(Z )aeg-0H løst opp i 1.25 ml DMF etterfulgt av tilsetning av 0.47 mmol (0.1 g) DCC i 1.25 ml CH2C12 eller 0.36 mmol (0.20 g) BocTaeg-OPfp i 2.5 ml CH2C12; koblingsreaksjonen ble utført i totalt 20 - 24 timer risting, (7) vasking med DMF, 2.5 ml, 1 x 2 min., (8) vasking med CH2C12, 2.5 ml, 4x1 min.; (9) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 2.5 ml, 2x2 min.; (10) vasking med CH2C12, 2.5 ml, 6 x 1 min.; (11) 2- 5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhidrinanalyse for å bestemme koblingsgraden, (12) blokkering av ureagerte aminogrupper ved acetylering med en 25 ml blanding av eddiksyreanhydrid/pyridin/CH2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 2 t (unntatt etter den siste cyklusen), og (13) vasking med CH2C12, 2.5 ml, 6x1 min., (14) 2 x 2 - 5 mg prøver av beskyttet PNA-harpiks blir tatt ut og nøytralisert med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v) og vasket med CH2C12 for ninhidrin-analyser.

EKSEMPEL 57

Fast-fase syntese av H-[Taeg]2~Aaeg-[Taeg]s-Lys-NKtø.

(b) Trinnvis oppstilling av Boc-[Taeg]5-A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

1U1

Omtrent 0.5 g våt Boe-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks hie plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks hie oppstilt ved in situ DCC kobling av både A(Z)aeg og Taeg residiene ved anvendelse av 0.15 M til 0.2 M beskyttet PNA monomer (fri syre) sammen med en ekvivalent mengde DCC i 2 ml CH2C12 ("Synteseprotokoll 6"). Syntesen ble registrert ved kvantitativ ninhidrinreaksjon som viste totalt omtrent 82$ inkorporering av A(Z)aeg etter kobling tre ganger (den første koblingen ga omtrent 50$ inkorporering og en fjerde HOBt-formldlet kobling i 50$ DMF/CH2C12 økte ikke det totale koblingsutbyttet) og kvantitativ inkorporering (enkle koblinger) av Taeg residiene. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]2-Aaeg-[Taeg]5-Lys-NH2.

Den beskyttede Boe-[Taeg]2-A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-BHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i Eksempel 40 c for å tilveiebringe omtrent 16.2 mg råmateriale ved HF spaltning av 102.5 mg tørr H-[Taeg]2-A(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-BHA harpiks. En liten del av råproduktet ble renset. For (MH+)<+> var den beregnede m/z verdien 2050.85 og den målte m/z verdien var 2050.90.

(c) Synteseprotokoll 6

(1) Boc-avspaltning med TFA=CH2C12 (1:1, v/v), 2 ml, 3x1 min. og 1 x 30 min; (2) vasking med CH2C12, 2 ml, 6x1 min., (3) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 2 ml, 3x2 min.; (4) vasking med CH2C12, 2 ml, 6 x 1 min. og drenering i 1- min., (5 ) 2 - 5 mg prøve av PNA-harpiksen ble tatt ut og grundig tørket for en kvantitativ ninhydrinanalyse for å bestemme substitusjon, (6) tilsetning av 0.44 mmol (0.23 g) BocA( Z )aeg-0H løst opp i 1.5 ml CH2C12 og etterfulgt av tilsetning av 0.44 mmol (0.09 g) DCC i 0.5 ml CH2C12 eller 0.33 mmol (0.13 g) BocTaeg-OH i 1.5 ml CH2C12 etterfulgt av tilsetning av 0.33 mmol (0.07 g) DCC i 0.5 ml CH2C12, kobl ingsreaksj onen ble fortsatt i totalt 20 - 24 t med risting, (7) vasking med DMF, 2 ml, 1x2 min., (8) vasking med CH2C12, 2 ml , 4 x 1 min., (9) nøytralisering med DIEA/- CH2C12 (1:19, v/v), 2 ml, 2x2 min., (10) vasking med CH2C12, 2 ml , 6x1 min., (11) 2 - 5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut og grundig tørket for kvantitativ ninhidrinanalyse for å bestemme koblingsgraden, (12) blokkering av ureagerte aminogrupper ved acetylering med en 25 ml blanding av eddiksyreanhydrid/pyridin/CH2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 2 t (unntatt etter den siste cyklusen), (13) vasking med CH2C12, 2 ml, 6x1 min., og (14) 2 x 2 - 5 mg prøver av beskyttet PNA-harpiks ble tatt ut, nøytralisert med DIEA/- CH2C12 (1:19, v/v) og vasket med CH2C12 for ninhydrinanalyser.

EKSEMPEL 58

PNA-oligomer H-T4C2TCT-LysNH2 ble dannet som beskrevet i Eksempel 93. Hybridi seringseksperimentene med denne sekvensen burde bevise orienteringen på grunn av at den er asym-metrisk. Slike eksperimenter skal også beskrive pH-avhengig-heten til Tm og støkiometrien av de dannede kompleksene.

Hybridiseringseksperimentene med PNA-oligomeren H-T4C2TCTC-LysNH2 som følger:

Disse resultatene viser at en sann blandet sekvens ga opphav til veldefinerte smeltekurver. PNA-oligomerene kan bli bundet i begge orienteringene (sammenlign rad 1 og 4), til tross for at det er foretrukket for den N-terminale/5' - orienteringen. Innføring av en enkelt feilparring motsatt enten T eller C forårsaket en senkning av T^ med mer enn 16°C ved pH 7.2 og ved pH 5.0 var Tm-verdien redusert mer enn 27° C. Dette viser at det er en meget høy grad av sekvens-selektivitet som bør være et generelt trekk for alle PNA C/T sekvensene.

Som angitt ovenfor er det en meget sterk pH-avhengighet for Tm-verdien som indikerer at Hoogsteen baseparring er viktig for dannelsen av hybrider. Det er derfor ikke overraskende at støkiometrien ble funnet å være 2:1.

Den manglende symmetrien i sekvensen og den meget store senkningen av Tm når feilparringer er tilstede viser at Watson-Crick tråden og Hoogsteen tråden er parallelle når de er bundet til komplementært DNA. Dette er tilfellet for begge orienteringene, dvs. 5'/N-terminal og 3'/N-terminal.

EKSEMPEL 59

Resultater av hybridiseringseksperimentene med H-TgGT^LysNHg ble utført som følger:

Som vist ved sammenligning av radene 1, 3 og 6 med radene 2, 4, 5 og 7, kan G på denne måten diskriminere mellom C/A og G/T i DNA-tråden, dvs. sekvens-diskriminering er observert. Komplekset i rad 3 ble ytterligere bestemt å være 2 PNA : 1 DNA kompleks ut i fra UV-blandingskurvene.

EKSEMPEL 60

Massene til noen syntetiserte PNA-oligomerer bestemt ifølge FAB massespektrometri er som følger:

EKSEMPEL 61

Hybridiseringsdata for en PNA-oligomer med en enkelt enhet med et utvidet sett (p<->alanin modifikasjon) er som følger:

Til tross for at smeltetemperaturen reduseres så domonstrerer dataene at den basespesifiserte gjenkjenningen blir beholdt.

EKSEMPEL 62

Et eksempel med "ingen base" substitusjon.

EKSEMPEL 63

Jodineringsprosedyre

En 5 pg del av Tyr-PNA-T10-Lys-NH2 blir løst opp i 40 pl 100 mM Na-fosfat, pH 7.0 og 1 mCi Na125I og 2 pl kloramin-T (50 mM i CH3CN) blir tilsatt. Oppløsningen blir latt være ved 20° C i 10 min. og deretter sendt gjennom en 0.5 + 5 cm Sephadex G10-kolonne. De første to fraksjonene (100 pl hver) inneholdende radioaktivitet blir samlet og renset ved HPLC: revers fase C-18 ved anvendelse av 0 - 60$ CHgCn gradient i 0.1$ CF3COOH i H20. <125>I-PNA blir eluert rett etter PNA toppen. Oppløsningsmidlet blir fjernet under redusert trykk.

EKSEMPEL 64

Binding av PNAs-T10/Tg-C/T8C2 til dobbelt-trådete DNA mål A10/AqG/<A>8G2 (Figur 20).

En blanding av 200 eps <32>P-merket EcoRI-PvuII fragment (det større fragmentet er merket ved 3'-enden av EcoRI setet) av indikert plasmid, 0.5 pg av bærer kalvetymus DNA og 300 ng PNA i 100 pl buffer (200 mM NaCl, 50 mM Na-acetat, pH 4.5, 1 mM ZnS04) ble inkubert ved 37°C i 120 min.. En 50 enhet del av nuklease S^ ble tilsatt og inkubert ved 20° C i 5 min. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 3 pl 0.5 M EDTA og DNA ble presipitert ved tilsetning av 250 pl 2$ kaliumacetat i etanol. DNA ble analysert ved elektroforese i 10$ polyakrylamid sekvenseringsgeler og radioaktivt merket DNA bånd ble visualisert ved autoradiografi.

Målplasmidene ble dannet ved kloning av de hensiktsmessige oligonukleotidene inn i pUC19. Mål A^q: oligonukleotidene GATCCA10G & GATCCT10G ble klonet inn i BamHI setet (plasmid betegnet pTIO). Mål AgGA4: oligonukleotidene TCGACT4CT5G & TCGACA5GA4G ble klonet inn i Sali setet (plasmid pT9C). Mål A2GA2GA4: oligonukleotidene GA2GA2<G>A4TGCA & GT4CT2CT2CTGCA inn i Pstl setet (plasmid pT8C2). Posisjonene til målfor-bindelsene i gelen er angitt i kolonner til venstre. A/G er en A+G sekvens-stige av mål P10.

EKSEMPEL 65

Inhibisjon av restriksjonsenzymspalting ved PNA (Figur 23).

En 2 pg av plasmid pTIO ble blandet med den angitte mengden PNA-T-lo i 20 pl TE buffer (10 mM Tris-HCl , 1 mM EDTA, pH 7.4) og inkubert ved 37°C i 120 min. 2 pl 10 x buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM, MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT). PvuII (2 enheter) og BamHI (2 enheter) ble tilsatt og inkubasjonen ble fortsatt i 60 min. DNA ble analysert ved gel-elektroforese i 5$ polyakrylamid og DNA ble visualisert ved etidium bromid farging.

EKSEMPEL 66

Kinetikken til PNA-T10 - dsDNA tråd forflytningskompleks-dannelse (Figur 21).

En blanding av 200 eps <32>P-merket EcoRI-PvuII fragmentet til pTIO (det store fragmentet merket ved 3'-enden av EcoRI setet), 0.5 pg bærer kalvetymus DNA, og 300 ng PNA-Tiø-LysNHg i 100 pl buffer (200 mM NaCl, 50 mM Na-acetat, pH 4.5, 1 mM ZnS04 ) ble inkubert ved 37°C. Ved de indikerte tidspunktene ble 50 U S^ nuklease tilsatt til hver av de 7 prøvene og inkubasjonen ble fortsatt i 5 min. ved 20° C. DNA ble deretter presipitert ved tilsetning av 250 pl 2$ K-acetat i etanol og analysert ved elektroforese i en 10$ polyakrylamid-sekvenseringsgel. Mengden av trådforflytningskompleks ble beregnet fra intensiteten til S^-spaltningen ved målsekvensen målt ved densitometrisk scanning av autoradiografer.

EKSEMPEL 67

Stabiliteten til PNA-dsDNA kompleksene (Figur 22).

En blanding av 200 eps <32>P-pT10 fragmentet, 0.5 pg kalvetymus DNA og 300 ng av ønsket PNA (enten T10-LysNH2, T8-LysNH2 eller T6-LysNH2) ble inkubert i 100 pl 200 mM NaCl, 50 mM Na-acetat, pH 4.5, 1 mM ZnS04 i 60 min. ved 37° C. En 2 pg del av oligonukleotidet GATCCA^qG ble tilsatt og hver prøve ble oppvarmet i 10 min. ved temperaturen som er angitt, avkjølt i is i 10 min. og varmet til 20°C. En 50 U del av S^ nuklease ble tilsatt og prøvene ble behandlet og analysert og resultatene kvantifisert.

EKSEMPEL 68

Inhibisjon av transkripsjonen ved PNA.

En blanding av 100 ng plasmid DNA (spaltet med restriksjonsenzym PvuII (se nedenfor) og 100 ng PNA i 15 pl 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4 ble inkubert ved 37 °C i 60 min. Deretter ble 4 pl 5 x konsentrert buffer (0.2 M Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM MgCl2m 10 mM spermidin, 125 mM NaCl) blandet med 1 pl NTP-mix (10 mM ATP, 10 mM CTP, 10 mM GTP, 1 mM UTP, 0.1 pCi/pl <32>P-UTP, 5 mM DTT, 2 pg/ml tRNA, 1 pg/ml heparin) og 3 enheter PNA polymerase. Inkubasjonen ble fortsatt i 10 min. ved 37°C. RNA ble deretter presipitert ved tilsetning av 60 pl 2$ kaliumacetat i 96$ etanol ved -20°C og analysert ved elektroforese i 8$ polyakrylamid sekvenseringsgeler. RNA transkriptet ble visualisert ved autoradiografi. Følgende plasmider ble anvendt: pT8C2-KS/pa8G2-KS: oligonukleotider GA2GAGA4GTGAC & GT4CT2CT2CTGCA klonet inn i Pstl setet til pBluescript-KS<+>; pT10-KS/pA10-KS (begge orienteringene av innskuddet ble oppnådd). pT10UV5:oligonuleotidene GATCCA^qG ble klonet inn i BamHI setet til et pUC18 derivat hvor lac UV5 E. coli promoteren er blitt klonet inn i EcoRI setet (Jeppesen, et al., Nucleic Acids Res., 1988, 16, 9545).

Ved anvendelse av T3-RNA polymerase, ble hemning av tran-skripsjons-elongeringen oppnådd med PNA-TgC2-LysNH2 og pA8G2-KS plasmidet med PNA gjenkjenningssekvensen på templat-tråden, men ikke med pT8C2-KS som har PNA gj enkj enningsse-

-L _L Ci

kvensen på ikke-templat-tråden. Lignende resultater ble oppnådd med PNA-T10-LysNH2 og plasmidene pA10-KS og pT10-KS (se Figur 25). Ved anvendelse av E. coli RNA polymerase og pT10UV5 plasmidet (A^Q-sekvensen på templat-tråden) ble hemming av transkrips j onselonger ingen oppnådd med PNA-T-lO-LysNHg•

EKSEMPEL 69

Biologisk stabilitet til PNA.

En blanding av PNA-T5 (10 pg) og et kontroll, "normalt" peptid (10 pg) i 40 pl 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 ble behandlet med forskjellige mengder peptidase fra grisetarm-slim eller protease fra Streptomyces caespitosus i 10 min. ved 37° C. Mengden av PNA og peptid ble bestemt ved HPLC analyse (revers fase C-18 kolonne: 0 - 60$ acetonitril, 0.1$ trifluoreddiksyre ).

Ved peptidase/protease konsentrasjonene ble fullstendig degradering av peptid observert (ingen HPLC topp) og PNA var fortsatt intakt.

EKSEMPEL 70

Inhibisjon av genekspressjonen.

En foretrukket analyse for å undersøke evnen som peptid nukleinsyre har til å inhibere ekspressjonen av E2 mRNA til papillomavirus er basert på de godt dokumenterte transak-tiverings-egenskapene til E2. Spalholtz, et al., J. Virol.,

•1987, 61, 2128-2137. Et reporterplasmid (E2RECAT) ble konstruert slik at det inneholder det E2 reagerende elementet som virker som en E2 avhengig enhancer. E2RECAT inneholder også SV40 early promoter, et early polyadenyleringssignal og klorofenicol acetyltransferasegen (CAT). Innenfor dette plasmidet er CAT ekspressjonen avhengig av ekspressjon av E2. Avhengighet av CAT ekspressjon på tilstedeværelse av E2 er blitt testet ved transfeksjon av dette plasmid inne i C127

celler transformert med BPV-1, uinfisert C127 celler og C127 celler co-transfektert med E2RECAT og en E2 ekspressjon vektor.

A. Inhibisjon av BPV-1 E2 ekspressjon.

BPV-1 transformerte C127 celler blir sådd ut på 12 brønn skåler. 24 timer før transfeksjonen med E2RE1, blir cellene forbehandlet ved tilsetning av antisens PNA til vekstmediet ved sluttkonsentrasjoner på 5, 15 og 30 mM. Neste dag blir cellene transfektert med 10 pg E2RE1CAT ved kalciumfosfat presipitering. 10 pg E2RE1CAT og 10 pg bærer DNA (PUC 19) ble blandet med 62 pl 2 M CaCl2 i et sluttvolum på 250 pl H20, etterfulgt av tilsetning av 250 pl 2X HBSP (1.5 mM Na2P02. 10 mM KC1 , 280 mM NaCl, 12 mM glukose og 50 mM HEPES, pH 7.0) og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. 100 mikroliter av denne oppløsningen ble tilsatt til hver testbrønn og inkubert i 4 timer ved 37°C. Etter inkubasjonen blir cellene glycerolsjokk-behandlet i 1 min. ved romtemperatur med 15$ glycerol i 0.75 mM Na2P02, 5 mM KC1, 140 mM NaCl, 6 mM glukose og 25 mM HEPES, pH 7.0. Etter sjokkbehandling blir cellene vasket to ganger med serumfritt DMEM og på ny tilført DMEM inneholdende 10$ fetalt bovinserum og antisens oligonukleotid ved opprinnelig konsentrasjon. 48 timer etter transfeksjon blir cellene høstet og analysert for CAT aktivitet.

For bestemmelse av CAT aktivitet ble cellene vasket to ganger med fosfatbufret saltvann og samlet ved skraping. Cellene blir suspendert i 100 pl 250 mM Tris-HCl, pH 8.0 og ødelagt ved frysing-tining 3 ganger. 24 mikroliter av celleekstrak-tet blir anvendt i hver analyse. I hver analyse blir følgende blandet sammen i et 1.5 ml Eppendorf-rør og inkubert ved 37° C i 1 time: 25 pl celle-ekstrakt, 5 pl 4 mM acetyl coenzym A, 18 pl H20 og 1 pl <14>C-kloramfenicol, 40 - 60 mCi/mM. Etter inkubasjonen blir kloramfenicol (acetylerte og ikke-acetylerte former) ekstrahert med etylacetat og avdampet til tørrhet. Prøver blir resuspendert i 25 pl etylacetat, applisert på en TLC plate og kromatografert i kloroform:metanol (19:1). Kromatografene blir analysert ved autoradiografi. Flekker tilsvarer acetylert og ikke-acetylert <14>C-kloramfenicol blir spaltet ut fra TLC skålen og opptelt vec væske scintillasjon for kvantifisering av CAT aktiviteten. Peptid nukleinsyrer som undertrykker CAT aktiviteten på er doseavhengig måte, er betraktet som positive.

B. Inhibisjon av HPV E2 ekspressjonen.

Analysen for inhibisjon av humant papillomavirus (HPV) E2 vec peptid nukleinsyrer er vesentlig den samme som den for BPV-] E2. For HPV analyser blir hensiktsmessige HPV kotransfekterl inn i enten CV-1 eller A431 celler med PSV2NE0 ved anvendelse av kalsiumfosfat metoden beskrevet ovenfor. Celler som tai opp DNA blir valgt ved dyrkning i medium inneholdende anti-biotika G418. G418-resistente celler blir deretter analyserl for HPV DNA og RNA. Celler som uttrykker E2 blir anvendt son

målceller for antisens studier. For hver PNA, blir cellent for-behandlet som ovenfor, transfektert med E2RE1CAT of analysert for CAT aktivitet som ovenfor. Peptid nukleinsyrene blir betraktet å ha en positiv virkning dersom de kai undertrykke CAT aktiviteten på en doseavhengig måte.

EKSEMPEL 71

Syntese av PNA 15-mer inneholdende fire naturlig forekommende nukleobaser; H-[Taeg]-[Aaeg]-[Gaeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Aaeg] ■

[ Taeg] - [ Caeg] - [ Taeg] -Caeg] - [Taeg] - [Aaeg] - [Taeg] - [Caeg] -

[Taeg]-LYS-NH2.

Beskyttet PNA ble oppstilt på et Boc-Lys(ClZ) modifisert MBHj harpiks med en substitusjon på omtrent 0.145 mmol/g. Kobling av "capping" av ukoblede aminogrupper ble bare utført fø] inkorporering av BocGaeg-OH monomeren.

Syntese ble initiert på 100 mg (tørrvekt) nøytralisert Boc-Lys ( CIA ) -MBHA harpiks som var blitt for-svellet over natt DCM. Inkorporering av monomerene fulgte protokollen i Eksempel 32, med unntagelse av at trinn 5 for inkorporering av BocAaeg-OH monomeren. Trinn 5 for denne syntesen involverte addisjon av 4 ekv. diisopropyl karbodiimid (0.06 ml; 9.7 pl) og 4 ekv. BocAaeg-OH (0.06 mmol; 32 mg) løst opp i 0.6 ml DCM/DMF (1:1, v/v) (sluttkonsentrasjonen av monomer er 0.1 M). Koblingsreaksjonen ble utført i 1 x 15 min. og 1 x 60 min. (omkobling).

Alle kvantitative Kaiser testene var negative (strå-gul farge uten farging av kulene). PNA-oligomeren ble spaltet og renset ved standard prosedyre. FAB-MS gjennomsnittlig masse funnet.(beregnet) (M+H) 4145.1 (41.46.1).

EKSEMPEL 72

Det faktum at det er nesten ikke noe tap i Tm ved å gå fra pH

■7.2 til 9.0 indikerer at Hoogsteen baseparring ikke er involvert. Økning i Tm ved å gå fra 7.2 til 5 er stor for den parallelle orientering og sannsynligvis forårsaket av dannelsen av et 2:1 kompleks. Det gjentas at den mest gunstige orienteringen i Watson-Crick bindingsmotivet er 3'/N-orienteringen og at i Hoogsteen motivet er 5'/N-orienteringen den mest stabile. Det kan derfor være tilfelle at

det mest stabile komplekset er med de to PNA trådene anti-parallelle.

Det er sannsynligvis en sterk preferanse for en parallell orientering av Hoogsteen tråden. Dette forklarer hvorfor det selv ved en pH på 9 sees et 2:1 kompleks med 5'/N-orientering. Det forklarer videre at det lille tapet ved å gå fra 7.2 til 9 i 3.'/N på grunn av at dette sannsynligvis er et 1:1 kompleks.

EKSEMPEL 73

Fast-fase syntese av H-[Taeg]g-Aaeg-Taeg-Caeg-Aaeg-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH2. (a) Trinnvis oppstilling av Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-Taeg-C(Z )aeg-A(Z )aeg-Taeg-C( Z )aeg-Taeg-C(Z )aeg-Lys(C1Z )-MBHA harpiks.

Omtrent 1 g våt Boc-Lys(C1Z)-MBHA (0.28 mmol Lys/g) harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-Taeg-C(z)aeg-A(Z )aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble oppstilt ved in situ DCC kobling av 5 første residier ved anvendelse av 0.16 M BocC[Z]-0H, BocTaeg-OH eller BocA(Z)aeg-0H sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9") og ved analog in situ DIC kobling av de fem siste residiene ("Synteseprotokoll 10"). Hver koblingsreaksjon ble utført i totalt 20 - 24 t med risting. Syntesen ble registrert ved ninhydrin reaksjon som viste nærmest kvantitativ inkorporering av alle residiene med unntagelse av det første A(Z) aeg residiet som måtte bli koblet to ganger. Det totale koblingsutbyttet var omtrent 96$ (første kobling hadde en effektivitet på omtrent 89$). (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]2-Aaeg-Taeg-Caeg-AAeg-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH2.

Den beskyttede Boe-[Taeg]2-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(C1Z)-MBHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 53.4 mg råmateriale ved HF spaltning av 166.1 mg tørr Boc-[Taeg]2-A(Z)aeg-Taeg-C(Z )aeg-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(C1Z)-MBHA harpiksen. Råproduktet (53.4 mg) ble renset for å tilveiebringe 18.3 mg H-[Taeg]2-Aaeg-Taeg-Caeg-Aaeg-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH2. For (M+H)+, var beregnet m/z verdi = 2780.17 og den målte m/z verdien = 2780.07.

EKSEMPEL 74

Hybridiseringsegenskapene til H-TTA TCA TCT C-Lys-NH2. Tittelforbindelsen hybridiserte med følgende oligonukleotider :

EKSEMPEL 75

Syntese av en PNA med to parallelle tråder koblet sammen.

En 375 mg del MBHA harpiks (belastning 0.6 mmol/g) ble svellet over natt i diklormetan (DCM). Etter en time i DMF/DCM ble harpiksen nøytralisert ved to ganger vask med 5% diisopropyletylamin i DCM (2 min.) etterfulgt av vasking med DCM (2 ml; 6x1 min.). N ,N' - di-Boc-aminoetyl glycin (49.1 mg; 0.132 mmol) løst opp i 2 ml DMF ble tilsatt til harpiksen etterfulgt av DCC (64.9 mg; 0.315 mmol) løst opp i 1 ml DCM. Etter 2.5 timer ble harpiksen vasket med DMF tre ganger (1 min.) og en gang med DCM (1 min.). Ureagerte aminogrupper ble deretter koblet ved behandling med eddiksyreanhydrid/- DCM/pyridin (1 ml/2 ml/2ml) i 72 timer. Etter vasking med DCM (2 ml; 4 x 1 min.), viste en Kaiser test at ingen aminogrupper var tilstede. Harpiksen ble avspaltet og vasket som beskrevet ovenfor. Dette ble etterfulgt av omsetning med 6-(Bocamino)heksansyre DHBT ester (255.8 mg; 67 mmol) løst opp i DMF/DCM 1:1 (4 ml) over natt. Etter vasking og nøytralisering ble en Kaiser test og en isatintest utført. Begge var negative. Etter kobling ble elongering av PNA-kjedene utført ifølge standard prosedyren for DCC koblinger. Alle Kaiser testene som ble utført etter koblingsreaksjonene var negative (gul). Kvalitative Kaiser tester ble utført etter avspaltning av PNA enheter med nr. 1, 2, 4 og 6. Hver test var blå. PNA oligomerene ble spaltet og renset ved standard prosedyrer. Mengden av monomer og DCC anvendt for hver kobling var som følger (totalt volum 4.5 ml):

For PNA med strukturen (70) hvor R7g = , var det 24.5 mg råprodukt som resulterte i 6.9 mg etter rensing. For PNA hvor Ri = Tg var det 28.8 mg råprodukt som resulterte i 2.8 mg etter rensing. Produktene hadde en høy tendens til aggregasjon og dette kom frem ved et omfattende HPLC kromatogram etter få timer ved romtemperatur i konsentrasjon over 1 mg/ml. PNA-XT6)2 og PNA-(T8)2 hie hybridisert til henhv.

(dA)fc og (dA)g ved registrerte Tm på henhv. 42"C og 59°C.

EKSEMPEL 76

Fast-fase syntese av H-[Taeg]5~Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

PNA oligomeren ble koblet til 500 mg (tørrvekt) MBHA harpiks som har blitt for-svellet over natt i DCM. Harpiksen ble innledningsvis substituert med omtrent 0.15 mmol/g Boc-Lys(ClZ) bestemt ved kvantitativ ninhydrin reaksjon. Den trinnvise syntesen av oligomeren ble utført ifølge syntese-protokollen beskrevet i Eksempel 32 som anvender 0.977 g (0.2 mmol) BocTaeg-OH og 31.3 pl (0.2 mmol) diisopropyl karbodiimid i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 i hver kobling. "Capping" av ukoblede aminogrupper ble utført før avspaltningen i hvert trinn. Alle kvalitative Kaiser testene var negative og indikerer nærmest 100$ koblingsutbytte.

EKSEMPEL 77

Fast-fase syntese av H-[Taeg]4-[apgT]-[Taeg]5Lys-NH2 Syntesen ble initiert på omtrent 1/4 av våt H-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks fra Eksempel 76. In situ diisopropyl karbodiimid (DIC) koblinger av både Boc-(apgT)-0H og BocTaeg-OH ble utført i 1.2 ml 50$ DMF/CH2C12 ved anvendelse av 0.048 g (0.12 mmol) og 0.046 g (0.12 mmol) monomer og 18.7 pl (0.12 mmol) diisopropyl karbodiimid i hver kobling. Alle kvalitative Kaiser testene var negative og indikerer nærmest 100$ koblingsutbytte. PNA oligomeren ble spaltet og renset ved standard prosedyrer. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2820.15 og den målte m/z verdien var 2820.92.

EKSEMPEL 78

Fast-fase syntese av H-[Taeg]4-[proT]-[Taeg]5-Lys-NH2. Syntesen ble initiert på omtrent 1/4 av våt H-[Taeg]5~ Lys(C1Z)-MBHA harpiksen fra Eksempel 76. In situ diisopropyl karbodiimid koblingene til BocTaeg-OH ble utført i 1.2 ml 50$ DMF/CHgClg ved anvendelse av 0.046 g (0.12 mmol) monomer og 18.7 pl (0.12 mmol) diisopropyl karbodiimid i hver kobling. På grunn av problemer med Boc-(proT)-0H 0.048 g (0.12 mmol) suspendert i 2.5 ml 50$ DMF/DMSO før koblingen, suspensjonen ble filtrert og omtrent 2 ml av filtratet ble anvendt i overnattskoblingen. Alle kvalitative Kaisertestene var negative og dette indikerer nærmest 100$ koblingsutbytte. PNA oligomeren ble spaltet og renset ved hjelp av standard prosedyrer.

EKSEMPEL 79

Hybridiseringsegenskaper til H-[Taeg]4-l[proT]-[proT]-[Taeg]5Lys-NH2

EKSEMPEL 80

Fast-fase syntese av H-[Taeg]4-[bC]-[Taeg]5-Lys-NHg.

PNA oligomeren ble tilført på 100 mg (tørrvekt) MBHA harpiks som var blitt forsvellet over natt i DCM. Harpiksen ble innledningsvis substituert med omtrent 0.25 mmol/g Boc-Lys (C1Z) bestemt ved kvantitativ ninhydrin reaksjon. Den trinnvise syntesen av oligomeren var ifølge synteseprotokoll 9 ved anvendelse av 0.023 g (0.06 mmol) BocTaeg-OH, 0.062 g (0.12 mmol) BocbC(Z)-0H og 0.012 g (0.06 mmol) DCC i 1.2 ml 50$ DMF/CH2C12 i hver kobling. "Capping" av ukoblede aminogrupper ble utført før avspaltningen i hvert trinn. Alle kvalitative Kaiser testene var negative og indikerte nær 100$ koblingsutbytte. PNA-oligomeren ble spaltet og renset ved hjelp av standard prosedyrer.

EKSEMPEL 81

Hybridiseringsegenskapene til H-T^bCTs-Lys-NItø.

EKSEMPEL 82

Trinnvis oppstilling av H-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Aaeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-LYS-NH2.

Syntesen ble initiert på en Boc-[Taeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks (fra Eksempel 76) som var blitt for-svellet over natt i DCM. Harpiksen lignet omtrent 100 mg (tørrvekt) Boc-Lys(C1Z)-MBHA harpiks (belastning 0.15 mmol/g). Inkorporering av monomerene var ifølge protokollen i Eksempel 55 med unntagelse av trinn 5 (inkorporering av BocA(Z)aeg-0H monomer). Det nye trinn 5 (inkorporering av A(Z)aeg) involverte tilførsel av 4 ekv. diisopropyl karbodiimid (0.06 mmol; 9.7 pl) og 4 ekv. BocA(Z )aeg-0H (0.06 mmol; 32 mg) løst opp i 0.6 ml DCM/DMF (1:1, v/v) (sluttkonsentrasjon av monomer 0.1 M). Koblingsreaksjonen ble utført i 1 x 15 min. og 1 x 60 min. (ny kobl ing).

"Capping" av ukoblede aminogrupper ble bare utført før inkorporering av BocA(Z)aeg-0H monomeren. Koblingsreaksjonen ble registrert ved kvalitativ ninhydrinreaksjon (Kaiser test). Alle kvalitative Kaisertestene var negative (strå-gul farge uten farging av kulene). PNA oligomeren ble spaltet og renset ved hjelp av standard prosedyrer.

EKSEMPEL 84

Hybridiseringsegenskapene til H-T^ATs-LysNHg•

EKSEMPEL 85

Trinnvis oppstilling av H-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Gaeg]-[Gaeg]-[Taeg]-[Gaeg]-LYS-NH2.

Beskyttet PNA ble oppstilt på en Boc-Lys(ClZ) modifisert MBHA harpiks med en substitusjon på 0.15 mmol/g. Inkorporering av monomerene fulgte protokollen ifølge Eksempel 32 med unntagelse av at "capping" trinnet 11 og vasketrinnet 12 ble utelatt. Etter inkorporering og avspaltning av den første, andre og fjerde G(Bzl )aeg-monomeren var det visse vanskeligheter med å oppnå at harpiksen svellet. 3 timers risting i DCM ga akseptabel svelling. For inkorporering av residiene Taeg-4, G(Bzl)aeg-6 og Taeg-7 til Taeg-10 var ny kobling nødvendig for å oppnå nærmest kvantitative koblingsutbytter. Taeg4 (2 x i 50$ DMF/DCM), Gaeg6 (2 x i 50$ DMF/IDMC), Taeg7 (2 x i 50$ DMF/DCM, 1 x i 50$ NMP/DCM og 1 x i kun DCM), Taegg (1 x i 50$ DMF/DCM og 2 x i kun DCM), Taegq (2 x i 50$ DMF/DCM), Taeg10 (2 x i 50$ DMF/DCM). Alle kvalitative Kaiser testene var negative (strå-gul farge uten farging av kulene). PNA oligomeren ble spaltet og renset ved hjelp av standard prosedyrer.

EKSEMPEL 86

Hybridiseringsegenskapene til rå (omtrent 50$) H-T4-G2TGTG-LysNH2

EKSEMPEL 87

Fast-fase syntese i stor skala av H-[Taeg]£,-Lys-NH2» H_

[Taeg]7-Lys-NH2, H-[Taeg]8-Lys-NH2, H-[Taeg]9-Lys-NH2 og H-[Tae<g>]10<->Lys-NH2.

(a) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg] j[0-Lys-( C1Z )-MBHA

harpiks og kortere fragmenter.

ILI

Omtrent 9 g våt Boe-[Taeg]3-Lys(C1Z)-MBHA (se Eksempel 19 b) harpiks ble plassert i en 60 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]5~Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved enkelt kobling av begge residiene med 0.15 M BocTaeg-OPfp i 10 ml kun CHgClg

. ("Synteseprotokoll 8"). Begge koblingsreaksjonene ble latt gå over natt. Syntesen ble registrert ved ninhydrin reaksjonen som viste nærmest kvantitativ inkorporering av begge residiene. Etter avspaltning av den N-terminale Boc-gruppen ble omtrent 4.5 g H-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA plassert i en 20 ml SPPS reaksjonsbeholder og forlenget til Boc-[Taeg]g-Lys(ClZ)-MBHA ved enkelt in situ DCC kobling av alle residiene

(nærmest kvantitativt med unntagelse av residie nr. åtte)

over natt med 0.2 M BocTaeg-OH sammen med 0.2 M DCC i 7.5 ml CHgClg ("Synteseprotokoll 9"). Før kobling av Taeg residiene nr. 7 og 8, ble små porsjoner av H-[Taeg] ^,-Lys (C1Z )-MBHA og H-[Taeg]7-Lys(C1Z)-MBHA tatt ut for HF spaltning.

Taeg residiet nr. 8 ble koblet to ganger (over natt) for å oppnå nær opp til kvantitativ inkorporering. Etter avspaltning av den N-terminale Boe gruppen ble en stor porsjon H-[Taeg]8-Lys(ClZ)-MBHA tatt ut for HF spaltning. Boe—

[Taeg]10-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved dobbel in situ DCC kobling av 0.16 M BocTaeg-OH, sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9"). Før kobling av det endelige residiet ble en liten del av H-[Taeg]g-Lys(C1Z)-MBHA tatt ut for HF spaltning. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]fc-Lys-NHg.

Beskyttet Boe-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å oppnå omtrent 14.0 mg råmateriale ved HF spaltning av 52.4 mg tørr H-Taeg](j-Lys(ClZ)-MBHA harpiks. Råproduktet ble ikke renset (omtrent 99$ renhet). (c) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]7-Lys-NHg•

Beskyttet Boc-[Taeg]7-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 5.2 mg råmateriale ved HF spaltning av 58.4 mg tørr H-Taeg]y-Lys(C1Z )-MBHA harpiks. (d) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]g-Lys-NHg.

Beskyttet Boc-[Taeg]g-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 114 mg råmateriale ved HF spaltning av omtrent 604 mg tørr H-Taeg]g-Lys(ClZ)-MBHA harpiks. (e) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]g-Lys-NH2•

Beskyttet Boc-[Taeg]g-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 19.3 mg av råmaterialet ved HF spaltning av 81.0 mg tørr H-Taeg]g-Lys(C1Z )-MBHA harpiks. (f) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]ig-Lys-NHg•

Beskyttet Boe-[Taeg]-^Q-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 141 mg råmateriale ved HF spaltning av omtrent 417 mg tørr H-Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

(g) Synteseprotokoll 8 (Generell protokoll)

(1) Boc-avspaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 3x1 min. og 1 x 30 min; (2) vasking med CH2C12, 6x1 min; (3) nøytrali-sering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 3x2 min; (4) vasking med CH2C12, 6x1 min. og avrenning i 1 min., (5) ved noen stadier av syntesen blir 2 - 5 mg prøve av PNA-harpiksen tatt ut og grundig tørket for en ninhydrin-analyse for å bestemme substitusjonen, (6) addisjon av Boc-beskyttet PNA monomer (Pfp ester), kobl ingsreaksj onen ble latt gå i totalt X t risting, (7) vasking med DMF, 1x2 min., (8) vasking med CH2C12, 4x1 min., (9) nøytralisering med DIEA/CH2C12, (1:19, v/v), 2x2 min., (10) vasking med CH2C12, 6x1 min., (11) av og til ved 2 - 5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks tatt ut og grundig tørket for en ninhydrin-analyse for å bestemme koblingsgraden, (12) ved noen stadier av syntesen ble ureagerte aminogrupper blokkert ved acetylering med en blanding av eddiksyreanhydrid/pyridin/CH2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 2 t etterfulgt av vasking med CH2C12, 6x1 min. og ninhydrin-analyse

EKSEMPEL 88

Fast-fase syntese av H-[Taeg]4-Caeg-[Taeg]5-Lys-NH2• (a) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg]4-C[Z]aeg-[Taeg]-5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 1 g våt Boe-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]4-C[Z]aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble oppstilt ved in situ DCC kobling av alle residiene ved anvendelse av 0.16 M BocC[Z]aeg-OH sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 eller 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9"). Hver koblingsreaksjon ble latt gå i totalt 20 - 24 t med risting. Syntesen ble registrert ved ninhidrin reaksjon som viser omtrent 98$ inkorporering av C[Z]aeg og nærmest kvantitativ inkorporering av alle Taeg residiene. (b) Spalting, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]4-C[Z]aeg-[Taeg]5-Lys-NH2.

Beskyttet Boe-[Taeg]4-C[Z]aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe 22.5 mg av råmateriale ved HF spaltning av 128.2 mg tørr H-[Taeg]4-C[Z]aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks. Råproduktet (5.8 mg) ble renset for å oppnå 3.1 mg H-[Taeg]4-Caeg-[Taeg]5-Lys-NH2.

(c) Synteseprotokoll 9 (Generell protokoll).

(1) Boc-spaltning med TFA/CH2C12 (1:1, v/v), 3x1 min. og 1 x 30 min., (2) vasking med CH2C12, 6x1 min.; (3) nøytrali-sering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 3x2 min.; (4) vasking med CH2C12, 6x1 min., og avrenning i 1 min., (5) ved visse stadier av syntesen blir 2 - 5 mg prøve av PNA-harpiksen tatt ut og grundig tørket for en ninhydrinanalyse for å bestemme substitusjonea, (6) addisjon av Boc-beskyttet PNA monomer (fri syre) i X ml DMF etterfulgt av tilsetning av DCC i X ml CH2C12, koblingsreaksjonen ble utført i totalt Y t risting, (7) vasking med DMF, 1x2 min., (8) vasking med CH2C12, 4 x 1 min., (9) nøytralisering med DIEA/CH2C12 (1:19, v/v), 2x2 min., (10) vasking med CH2C12, 6x1 min., (11) av og til blir 2 - 5 mg prøve av beskyttet PNA-harpiks tatt ut og grundig tørket for en ninhydrinanalyse for å bestemme koblingsgraden, (12) ved noen trinn av syntesen blir ureagerte aminogrupper blokkert ved acetylering med en blanding av eddiksyreanhydrid/pyridin/CH2Cl2 (1:1:2, v/v/v) i 2 t etterfulgt av vasking med CH2C12, 6x1 min., og av og til ninhydrinanalyse.

EKSEMPEL 89

Fast-fase syntese av H-[Taeg]4-(NBaeg)-[Taeg]5-Lys-NH2.

(NB = C0CH3).

(a) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg]4-(NBaeg)-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 1 g våt Boe-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]4-(NBaeg)-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved in situ DCC kobling ved anvendelse av 0.16 M Boc(NBaeg)-0H sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml CH2C12 eller 0.16 M BocTaeg-OH sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9"). Hver koblingsreaksjon ble utført i totalt 20 - 24 t med risting. NBaeg residiet ble koblet tre ganger og Taeg residiene ble alle koblet en gang. Syntesen ble registrert ved ninhydrinreaksjonen som viste >99$ total inkorporering av NBaeg (omtrent 88$ etter den første kobling og omtrent 93$ etter den andre kobling) og nærmest kvantitativ inkorporering av alle Taeg residiene. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]4-(NBaeg)-[Taeg]5-Lys-NH2.

Beskyttet Boe-[Taeg]4-(NBaeg)-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å gi omtrent 33.6 mg råmateriale ved HF spaltning av 108.9 mg tørr H-[Taeg]4-(NBaeg)-Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks. Råproduktet (20.6 mg) ble renset for å oppnå 4.6 mg H-[Taeg]4-(NBaeg)-[Taeg]5-Lys-NH2. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2683.12 og den målte m/z verdien var 2683.09.

EKSEMPEL 90

Fast-fase syntese av H-[Taeg]4-aeg-[Taeg]5-Lys-NH2.

(a) Trinnvis oppstilling av Boc-[Taeg]4-aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 1 g våt Boe-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boe-[Taeg]4-aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z )-MBHA harpiks ble oppstilt ved in situ DCC enkeltkobling av alle residiene ved anvendelse av: (1) 0.16 M Bocaeg-0H sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2Cleller (2) 0.16 M BocTaeg-OH sammen med (2) 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9"). Hver koblingsreaksjon ble utført i totalt 20 - 24 t med risting. Syntesen ble registrert ved ninhydrinreaksjon, som viste nærmest kvantitativ inkorporering av alle residiene. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]4-aeg-[Taeg]5-Lys-NH2.

Beskyttet Boe-[Taeg]4-aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 22.2 mg råmateriale ved HF spaltning av 126.0 mg tørr H-[Taeg]4-aeg-[Taeg]5-Lys(CIZ)-MBHA harpiks. Råproduktet (22.2 mg) ble renset til 7.6 mg H-[Taeg] 4-aeg-[Taeg] 5-Lys-NH2. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2641.11 og målt m/z verdi var 2641.16.

EKSEMPEL 91

Fast-fase syntese av H-[Taeg]4-Gly-[Taeg]5-Lys-NH2.

(a) Trinnvis dannelse av Boc-[Taeg]4-Gly-[Taeg]5—

Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 1 g våt Boe-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]4-Gly[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble sammenstilt ved in situ DCC enkeltkobling av alle residiene ved anvendelse av: (1) 0.16 M BocGly-OH sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF /-CH2C12 eller (2) 0.16 M BocTaeg-OH sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9"). Hver koblingsreaksjon ble latt gå i totalt 20 - 24 t med risting. Syntesen ble registrert ved ninhydrinreaksjonen som viste nær opp til kvantitativ inkorporering av alle residiene. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]4-Gly-[Taeg]5-Lys-NH2.

Beskyttet Boe-[Taeg]4-Gly-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 18 c for å tilveiebringe omtrent 45.0 mg råmateriale med HF spaltning av 124.1 mg tørr H-[Taeg]4-Gly-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks. Råproduktet (40.4 mg) ble renset til 8.2 mg H-[Taeg] 4-Gly-[Taeg] 5-Lys-NH2.

EKSEMPEL 92

Fast-fase syntese av H-[Taeg]4-Gly2-[Taeg]5-Lys-NH2.

(a) Trinnvis dannelse av Boe-[Taeg]4-Gly2-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 1 g våt Boe-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]4-[C[Z]aeg]2-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Lys(ClZ)-MBHA harpiksen ble oppstilt ved in situ DCC enkelt kobling av alle residiene ved anvendelse av: (1) 0.16 M BocGly-OH sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 eller (2) 0.16 M BocTaeg-OH sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9"). Hver koblingsreaksjon ble latt gå i totalt 20 - 24 t med risting. Syntesen ble registrert ved ninhydrinreaksjonen som viste nær opp til kvantitativ inkorporering av alle residiene. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]4-Gly2-[Taeg]5-Lys-NH2.

Beskyttet Boe-[Taeg]4-Gly2-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 32.6 mg råmateriale ved HF spaltning av 156.6 mg tørr H-[Taeg]4-Gly2-[Taeg]5-Lys(CIZ)-MBHA harpiks. Råproduktet (30 mg) ble renset til 7.8 mg H-[Taeg]4-Gly2-[Taeg]5-Lys-NH2. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2655.09 og den målte m/z verdien var 2655.37.

EKSEMPEL 93

Fast-fase syntese av H-[Taeg]4-[Caeg]2-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH2. (a) Trinnvis oppstilling av Boc-[Taeg]4-[C[Z]aeg]2-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Lys(C1Z)-MBHA harpiks.

Omtrent 1.5 g våt Boc-Lys(C1Z)-MBHA (0.28 mmol Lys/g) harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]4-[C[Z]aeg]2-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Lys(C1Z)-MBHA harpiksen ble dannet ved in situ DCC enkeltkobling av alle residiene ved anvendelse av: (1) 0.16 M BocC[Z]-0H sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 eller (2) 0.16 M BocTaeg-OH sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9"). Hver koblingsreaksjon ble utført i totalt 20 - 24 t med risting. Syntesen ble registrert ved ninhydrinreaksjonen som viste nær opp til kvantitativ inkorporering av alle residiene.

(b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]4~

[Caeg]2~Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH2•

Beskyttet Boe-[Taeg]4-[C[Z]aeg]2-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Lys (C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 52.1 mg råmateriale ved HF spaltning av 216.7 mg tørr H-[Taeg]4-[C[Z]aeg]2-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Lys (CIZ)-MBHA harpiks. Råproduktet (30.6 mg) ble renset for å tilveiebringe 6.2 mg H-[Taeg]4-[Caeg]2-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH2. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2747i.l5 og den målte m/z verdien var 2746.78.

EKSEMPEL 94

Fast-fase syntese av H-Caeg-Taeg-Caeg-Taeg-[Caeg]3-Taeg-Caeg-Taeg-Lys-NH2.

(a) Trinnvis oppstilling av Boc-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Taeg- [C[Z] aeg] 3-Taeg-C[Z] aeg-Taeg-Lys( C1Z )-MBHA

harpiks.

Omtrent 1.5 g våt Boc-Lys(C1Z)-MBHA (0.28 mmol Lys/g) harpiks ble plassert i 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-C[Z]aeg-Taeg-C [Z] aeg-Taeg-[C[Z]aeg]3-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved in situ DCC enkelt-kobling av alle residiene ved anvendelse av: (1) 0.16 M BocC[Z]-0H sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 eller (2) 0.16 M BocTaeg-OH sammen med 0.16 M DCC i 2.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9"). Hver koblingsreaksjon ble utført i totalt 20

- 24 t med risting. Syntesen ble registrert ved ninhidrin-reaksjonen som viste nær opp til kvantitativ inkorporering av alle residiene. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-Caeg-Taeg-Caeg-Taeg-[Caeg]3-Taeg-Caeg-Taeg-Lys-NH 2.

Den beskyttede Boc-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-[C[Z]aeg]3-Taeg-C[Z]aeg-TaegLys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å gi omtrent 56.1 mg råmateriale ved HF spaltning av 255.0 mg tørr H-C[Z]aeg-Taeg-C[Z]aeg-Taeg-[C[Z]aeg3-Taeg-C[Z]aeg-TaegLys(C1Z)-MBHA harpiks. Råproduktet (85.8 mg) ble renset for å gi 46.2 mg H-Caeg-Taeg-Caeg-Taeg-[Caeg]3-Taeg-Caeg-Taeg-LysNH2• For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2717.15 og den målte m/z verdien var 2716.93.

EKSEMPEL 95

Fast-fase syntese av H-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-Lys-NH2, H-Caeg-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-Lys-NH2, og H-Tyr-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-Lys-NH2. (a) Trinnvis oppstilling av Boc-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA harpiks, Boc-Caeg-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA harpiks, og Boc-Tyr(BrZ )-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 3 g våt Boc-Lys(ClZ)-MBHA (0.28 mmol Lys/g) harpiks ble plassert i en 20 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA harpiksen ble oppstilt ved in situ DCC enkeltkobling av alle residiene ved anvendelse av: (1) 0.16 M BocC[Z]-0H sammen med 0.16 M DCC i 3.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9"). Hver koblingsreaksjon ble latt gå i totalt 20 - 24 t med risting. Syntesen ble registrert ved ninhydrinreaksjonen som viste nær opp til kvantitativ inkorporering av alle residiene. Etter avspaltning av den N-terminale Boe gruppen ble halvparten av PNA-harpiksen koblet kvantitativt på Tyr(BrZ)-0H og en liten del ble koblet kvantitativt på et ytterligere Caeg residie. Begge koblingene anvendte ovennevnte synteseprotokoll. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-Lys-NH2.

Den beskyttede Boe-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z )aeg]2-Lys(C1Z)-MBHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 50.9 mg råmateriale ved HF spaltning av 182.5 mg tørr H-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA harpiks. Råproduktet (50.9 mg) ble renset for å oppnå 13.7 mg H-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-LysNH2. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2466.04 og m/z verdien ble ikke målt. (c) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-Tyr-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-Lys-NH2.

Beskyttet Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å gi omtrent 60.8 mg råmateriale ved HF spaltning av 188.8 mg tørr H-Tyr(BrZ)-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-LysNH2. Råproduktet (60.8 mg) ble renset til 20.7 mg H-Tyr-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-LysNH2. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2629.11 og den målte m/z verdien var 2629.11. (d) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-Caeg-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-Lys-NH2•

Beskyttet Boc-C(Z)aeg-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 11.7 mg råmateriale ved HF spaltning av 42.0 mg tørr H-C(Z )aeg-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA harpiks. Råproduktet (11.6 mg) ble renset til 3.1 mg H-Caeg-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-[Caeg]2-LysNH2. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 27117.15; m/z verdien ble ikke målt.

EKSEMPEL 96

Fast-fase syntese av H-[Caeg]2-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-Lys-NH2,

H-Taeg-[Caeg]2-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-Lys-NH2, og H-Tyr-[Caeg]2-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-Lys-NH2. (a) En trinnvis oppstilling av Boc-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-Lys(ClZ)-MBHA harpiks, Boc-Taeg-[ C ( Z )aeg] 2- [Taeg] 2- [ C ( Z )aeg] 3- [Taeg] 2-Lys(C1Z )-MBHA harpiks, og Boc-Tyr(BrZ)-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)-aeg]3-[Taeg]2-Lys(C1Z)-MBHA harpiks.

Omtrent 3 g våt Boc-Lys(C1Z)-MBHA (0.28 mmol Lys/g) harpiks hie plassert 1 20 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-[C(Z)aeg]2-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble oppstilt ved in situ DCC enkeltkobling av alle residiene ved anvendelse av: (1) 0.16 M BocC[Z]-0H sammen med 0.16 M DCC i 3.0 ml 50$ DMF/CH2C12 eller (2) 0.16 M BocTaeg-OH sammen med 0.16 M DCC i 3.0 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9"). Hver koblingsreaksjon ble utført i totalt 20 - 24 t med risting. Syntesen ble registrert ved ninhidrin reaksjon som viste nær opp til kvantitativ inkorporering av alle residiene. Etter avspaltning av den N-terminale Boc-gruppen, ble halvparten av PNA-residiene koblet kvantitativt på Tyr(BrZ)-0H og en liten del ble koblet kvantitativt på et ytterligere Taeg residie. Begge koblingene anvendt ovennevnte synteseprotokoll. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-Lys-NH2.

Beskyttet Boe-[C(Z )aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-8Taeg]2-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 57.6 mg råmateriale ved HF spaltning av 172.7 mg tørr H-[C(Z )aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg] 2-Lys(C1Z)-MBHA harpiks. Råproduktet (57.6 mg) ble renset til 26.3 mg H-[Daeg]2-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-Lys-NH2. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2466.04; m/z verdien ble ikke målt. (c) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-Tyr-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg93-[Taeg]2-Lys-NH2.

Den beskyttede Boc-Tyr(BrZ)-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-Lys(C1Z)-MBHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i

Eksempel 17 c for å gi omtrent 57.6 mg råmateriale ved HF spaltning av 172.7 mg tørr H-Tyr(BrZ)-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-Lys(CIZ)-MBHA harpiks. Råproduktet (47.1 mg) hie renset til 13.4 mg H-Tyr-[Caeg]2-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-Lys-NH2• For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2629.11 og den målte m/z verdien var 2629.11. (d) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-Taeg-[C(Z )aeg] 2- [Taeg] 2- [C(z )aeg] 3- [Taeg] 2-Lys-NH2.

Den beskyttede Boc-Taeg-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-Lys(C1Z)-MBHA harpiksen ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 53.4 mg råmateriale ved HF spaltning av 42.4 mg tørr H-Taeg-[C(Z)aeg]2-[Taeg]2-[C(Z)aeg]3-[Taeg]2-Lys(ClZ)-MBHA harpiks. Råproduktet (11.9 mg) ble renset til 4.3 mg H-Taeg-[Caeg]2-[Taeg]2-[Caeg]3-[Taeg]2-Lys-NH2. For (M+H)+ var den beregnede m/z verdien 2732.15 og m/z verdien ble ikke målt.

(c) Synteseprotokoll 10 (Generell protokoll).

Samme protokoll som "Synteseprotokoll 9" med unntagelse av at DCC er blitt erstattet med DIC.

EKSEMPEL 97

SYNTESE AV SKJELETTDELEN FOR OPPSKALERING VED REDUKTIV AMINERING.

(a) Preparering av (bocamino)acetaldehyd. 3-amino-l,2-propandiol (80.0 g; 0.88 mol) ble løst opp i vann (,1500 ml) og oppløsningen ble avkjølt til 4°C, hvoretter Boe anhydridet (230 g, 1.05 mol) ble tilsatt på en gang. Oppløsningen ble forsiktig oppvarmet til romtemperatur med et vannbad. pH ble holdt ved 10.5 ved dråpevis tilsetning av natriumhydroksid. I løpet av reaksjonen ble totalt 70.2 g NaOH, oppløst i 480 ml vann tilsatt. Etter omrøring over natt ble etylacetat (1000 ml) tilsatt og blandingen ble avkjølt til 0"C og pH ble justert til 2.5 ved tilsetning av 4

M saltsyre. Etylacetatlaget ble fjernet og den sure vandige oppløsningen ble ekstrahert med ytterligere etylacetat (8 x 500 ml). Den kombinerte etylacetatoppløsningen ble redusert til et volum på 1500 ml ved anvendelse av en roterende avdamper. Den resulterende oppløsningen ble vasket med halvmettet kalium hydrogensulfat (1500 ml) og deretter med mettet natriumklorid. Den ble deretter tørket over magnesiumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum. Utbytte 145.3 g (86$).

3-bocamino-l,2-propandiol (144.7 g; 0.757 mol) ble suspendert i vann (750 ml) og kaliumperjodat (191.5 g; 0.833 mol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt under nitrogen i 2.5 t og presipitert kaliumjodat ble fjernet under filtrering og vasket en gang med vann. (100 ml). Den vandige fasen ble ekstrahert med kloroform (6 x 400 ml). Kloroformekstraktene ble tørket og avdampet til tørrhet i vakuum. Utbytte 102 g (93$) av en olje. (Bocamino)acetaldehydet ble renset ved en kulerør-destillas j on ved 84°C og 0.3 mmHg i to porsjoner. Utbytte 79 g (77$) av en fargeløs olje. (b) Fremstilling av (N'-bocaminoetyl)glycin metylester. Palladium på karbon (10$, 2.00 g) ble tilsatt til en oppløs-ning av (bocamino)acetaldehyd (10.0 g; 68.9 mmol) i metanol (150 ml) ved 0°C. Natriumacetat (11.3 g; 138 mmol) i metanol (150 ml), og glycin metylester hydroklorid (8.65 g; 68.9 mmol) i metnol (75 ml) ble deretter tilsatt. Blandingen ble hydrert ved atmosfærisk trykk i 2.5 t, deretter filtrert gjennom celit og avdampet til tørrhet i vakuum. Materialet ble på ny løst opp i vann (150 ml) og pH ble justert til 8.0 med 0.5 N NaOH. Den vandige oppløsningen ble ekstrahert med metylenklorid (5 x 150 ml). De kombinerte ekstraktene ble tørket over natriumsulfat og avdampet til tørrhet i vakuum. Dette resulterte i 14.1 g (88$) (N'-bocaminoetyl)glycin metylester. Råmaterialet ble renset ved kulerør destinasjon ved 120°C og 0.5 mmHg til 11.3 g (70$) av en fargeløs olje. Produktet hadde en renhet som var høyere enn materialet

produsert i Eksempel 26 ifølge tlc-analysen (10% metanol i metylenklorid).

Alternativt kan natriumcyanoborhydrid bli anvendt som reduksjonsmiddel istedet for hydrogen (med Pd(C) som kataly-sator), til tross for at utbyttet (42$) var lavere. (c) Fremstilling av (N<*->bocaminoetyl)glycin etylester. Tittelforbindelsen ble fremstilt ved ovennevnte fremgangsmåte med glycin etylester hydroklorin substituert med glycin metylester hydroklorid. Oppløsningsmidlet som ble anvendt var etanol. Utbyttet var 87$.

EKSEMPEL 98

Fast-fase syntese av H-Tyr-[Taeg]ig-Lys-røfø • (a) Trinnvis oppstilling av Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]^g-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 0.2 g våt Boe-[Taeg]10-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]io_Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved standard in situ DCC kobling ved anvendelse av 0.32 M BocCTyr(BrZ)-0H sammen med 0.32 M DCC i 3.0 ml CHgClg over natt. Ninhydrinreaksjonen viste omtrent 97$ inkorporering av BocTyr(BrZ). (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-Tyr-[Tae<g>]10<->Lys-NH2.

Beskyttet Boc-Tyr(BrZ)-[Taeg]10-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 5.5 mg råmateriale ved HF spaltning av 20.7 mg tørr H-Tyr(BrZ)-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA harpiks. Råproduktet ble renset til 2.5 mg H-Tyr-[Taeg]^Q-Lys-NHg•

EKSEMPEL 99

Fast-fase syntese av Dansyl-[Taeg]iQ-Lys-N^

(a) Trinnvis oppstilling av Dansyl-[Taeg]10_Lys(C1Z)-MBHA

harpiks.

Omtrent 0.3 g våt Boe-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA harpiks hie plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Dansyl-[Taeg]^g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble oppstilt ved kobling av 0.5 M dansyl-Cl i 2.0 ml pyridin over natt. Ninhydrin-reakskjonen viste omtrent 95$ inkorporering av dansyl. (b) Spalting, rensing og identifikasjon av Dansyl-[Tae<g>]10<->Lys-NH2.

Beskyttet dansyl-[Taeg]10-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 12 mg råmateriale ved HF spalting av 71.3 mg tørr dansyl-[Taeg] -LQ-Lys( C1Z )-MBHA harpiks. Råproduktet ble renset til 5.4 mg dansyl-[Taeg]iQ-Lys-NHg.

EKSEMPEL 100

Fast-fase syntese av Gly-Gly-His-[Taeg]^g-Lys-NHg.

(a) Trinnvis oppstilling av Boc-Gly-Gly-His(Tos )-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 0.05 g Boc-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg]10-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble oppstilt ved standard dobbel in situ DCC kobling av Boc-beskyttet aminosyre (0.1 M) i 2.5 ml 25$ DMF/CH2C12, med unntagelse av den første koblingen av BocHis(Tos), som ble utført ved anvendelse av et fordannet symmetrisk anhydrid (0.1 M) i 25$ DMF/CHgClg- Alle koblingene ble utført over natt og ninhydrin-reaksjonene ble ikke utført.

(b) Spaltning, rensing og identifikasjon av Gly-Gly-His-[Taeg]10-Lys-NH2-

Beskyttet Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg]10-Lys(C1Z)-MBHA harpiks hie behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 10.3 mg råmateriale (omtrent 40$ renhet) ved HF spaltning av 34.5 mg tørr Boc-Gly-Gly-His(Tos)-[Taeg]10-Lys(C1Z)-MBHA harpiks. En liten del av råproduktet (tatt ut før lyofilisering) ble renset til 0.1 mg Gly-Gly-His-[Taeg]10-Lys-NH2.

EKSEMPEL 101

Fast-fase syntese av H-[Taeg]]5~[Caeg]2-NH2.

(a) Trinnvis dannelse av Boe-[Taeg]5~[C(Z)aeg]2~MBHA

harpiks.

Omtrent 0.2 g MBHA harpiks ble plassert i en 3 ml SPPS reaksjonsbeholder og nøytralisert. Belastningen ble bestemt til å være omtrent 0.64 mmol/g. BocC(Z)aeg-0Pfp ble koblet på harpiksen ved anvendelse av en konsentrasjon på 0.13 M i 2.5 ml 25$ fenol/CHgClg• Ninhydrinanalysen viste et koblingsutbytte på omtrent 40$. De gjenværende frie aminogruppene ble acetylert som vanlig. Boc-[Taeg]g-[C(Z)aeg]2~MBHA harpiksen ble dannet ved enkel in situ DCC kobling av det neste residie ved anvendelse av 0.11 M BocC(Z)aeg-0H sammen med 0.11 M DCC i 2.5 ml 50$ DMF/CHgClg og ved kobling med 0.13 M BocTaeg-OPfp i CH2CI2 for de gjenværende residiene ("Synteseprotokoll 8"). Hver koblingsreaksjon ble latt gå med risting over natt. Syntesen ble registrert ved ninhydrinreaksjon som viste nær opp til kvantitativ inkorporering av alle residiene. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]5-[Caeg]2-NH2.

Beskyttet Boc-[Taeg]5-[C(Z)aeg]2-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 21.7 mg av råmaterialet ( >80$ renhet) ved HF spaltning av 94.8 mg tørr H-[Taeg]5-[C(Z)aeg]2-MBHA harpiks. Råproduktet (7.4 mg) hie renset til 2.0 mg H-[Taeg] 5-[Caeg] 2-NH2 ( >99$ renhet).

EKSEMPEL 102

Fast-fase syntese av H-[Taeg]3-Caeg-[Taeg]4-NH2.

(a) Trinnvis dannelse av Boe-[Taeg]3~C(Z)aeg-[Taeg]4-MBHA

harpiks.

Omtrent 0.2 g ovennevnte MBHA harpiks hie plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder og nøytralisert. Boc-[Taeg]3~C(Z)aeg-[Taeg]4-MBHA harpiksen ble dannet ved enkelt in situ DCC kobling av C(Z)aeg residiet ved anvendelse av 0.13 M Boc[Z]-aeg-OH sammen med 0.13 M DCC i 2.5 ml 50$ DMF/CH2C12 og ved kobling av Taeg residiene med 0.13 M BocTaeg-OPfp i 2.5 ml CH2C12. Hver koblingsreaksjon ble latt gå med risting over natt. Syntesen ble registrert ved ninhydrinreaksjonen og viste nær opp til kvantitativ inkorporering av alle residiene . (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]3-Caeg-[Taeg]4-NH2.

Beskyttet Boe-[Taeg]3-C(Z)Laeg-[Taeg]4-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 44.4 mg råmateriale ved HF spaltning av omtrent 123 mg tørr H-[Taeg]3-C(Z)aeg-[Taeg]4-MBHA harpiks. Råproduktet (11.0 mg) ble renset til 3.6 mg H-[Taeg]3-Caeg-[Taeg]4-NH2.

EKSEMPEL 103

Fast-fase syntese av H-Taeg-Caeg-[Taeg]g-LysNH2.

(a) Trinnvis oppstilling av Boc-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 0.3 g våt Boe-[Taeg]8-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble plassert i en 3 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-Taeg-C(Z)aeg-

[Taeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks hie dannet ved enkelt in situ DCC kobling over natt av C(Z)aeg residiet ("Synteseprotokoll 9") ved anvendelse av 0.2 M BocC(Z )aeg-0H sammen med 0.2 M DCC i 2.5 ml 50$ DMF/CH2C12 (inkorporeringen var omtrent 80$ vurdert ifølge ninhydrinanalyser og gjenværende frie aminogrupper ble acetylert) og ved over-natt kobling av Taeg residiet med 0.15 M BocTaeg-OPfp i 2.5 ml CH2C12 (nesten kvantitativt )..-(b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-Taeg-Caeg-[Taeg]8-LysNH2.

Beskyttet Boc-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(C1Z )-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c til omtrent 22.3 mg råmateriale ved HF spalting av omtrent 76.5 mg tørr H-Taeg-C(Z)aeg-[Taeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks. Råproduktet (6.7 mg) ble renset til 2.6 mg H-Taeg-Caeg-[Taeg]g-LysNH2. For (M+H)<+ >var den beregnede m/z verdien 2792.15 og den målte m/z verdien var 2792.21.

EKSEMPEL 104

Fast-fase syntese av H-Caeg-[Taeg]5-Lys-NHg og H-[Taeg]2~ Caeg-[Taeg]5-Lys-NH2. (a) Trinnvis dannelse av Boc-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

Omtrent 0.5 g våt Boe-[Taeg]5-Lys(C1Z )-MBHA harpiks ble plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiksen ble dannet ved enkelt in situ DCC kobling av alle residiene ved anvendelse av: (1) 0.12 M BocC[Z]aeg-OH sammen med 0.12 M DCC i 3.0 ml 50$ DMF/CH2C12 eller (2) 0.12 M BocTaeg-OH sammen med 0.12 M DCC i 3.0 ml 50$ DMF/CH2C12. ("Synteseprotokoll 9"). Hver koblingsreaksjon ble latt gå over natt med risting. Syntesen ble registrert ved ninhydrinreaksjon som viste nær opp til kvantitativ inkorporering av alle residiene. I løpet av syntesen ble en liten del H-C(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z )-MBHA harpiksen tatt ut for HF spaltning.

(b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-Caeg-[Taeg]5-Lys-NH>

Beskyttet Boc-C(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å oppnå omtrent 3.0 mg råmateriale ved HF spaltning av 37.5 mg tørr H-C(Z)aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks. Omtrent 0.7 mg råprodukt ble renset til omtrent 0.5 mg H-Caeg-[Taeg]5-Lys-NH2. (c) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]g-Caeg-[Taeg]g-Lys-NHg.

Beskyttet Boe-[Taeg]2-C[Z]aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å oppnå omtrent 37.7 mg råmateriale ved HF spalting av 118.6 mg tørr H-[Taeg]2-C[Z]aeg-[Taeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks.

EKSEMPEL 105

Fast-fase syntese av H-[Caeg]5-Lys-NHg, H-[Caeg]^-Lys-NH2, H-[Caeg]8-Lys-NH2, og H-[Caeg]10-Lys-NH2

(a) Trinnvis dannelse av Boc-[C(Z)aeg]10-Lyz(ClZ )-MBHA

harpiks og kortere fragmenter.

Omtrent 5 g våt Boc-Lys(ClZ)-MBHA harpiks (substitusjon = 0.3 mmol Lys/g) ble plassert i en 30 ml SPPS reaksjonsbeholder. Boc-[C(Z)aeg]10-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble dannet ved enkelt in situ DCC kobling av de første tre residiene med 0.1 M BocC(Z )aeg-0H sammen med 0.1 M DCC i 10 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 9") og ved enkel in situ DIC kobling av de gjenværende syv residiene med 0.1 M BocC(Z)aeg-0H sammen med 0.1 M DIC i 10 ml 50$ DMF/CH2C12 ("Synteseprotokoll 10"). Alle koblingsreaksjonene ble utført over natt. Syntesen ble registrert ved ninhydrinreaksjon som viste nær opp til kvantitativ inkorporering av alle residiene. I løpet av syntesen ble deler av de kortere fragmentene H-[C(Z) aeg] §-Lys(C1Z)-MBHA harpiks, H-[C(Z)aeg]6-Lys(C1Z)-MBHA harpiks, H-[C(Z)aeg]7-Lys(ClZ)-MBHA harpiks, H-[C(Z)aeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks og H-[C(Z)aeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks tatt ut for HF spaltning. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Caeg]5-Lys-NHg•

Beskyttet Boc-[C(Z)aeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 10.8 mg råmateriale ved HF spalting av 60.1 mg tørr H-[C(Z)aeg]5-Lys(C1Z)-MBHA harpiks. (c) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Caeg]5-Lys-NHg.

Beskyttet Boc-[C(Z)aeg]6-Lys(ClZ)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c til omtrent 13.4 mg råmateriale ved HF spaltning av 56.2 mg tørr H-[C(Z)aeg]6-Lys(ClZ)-MBHA harpiks. (d) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Caeg]g-Lys-NH2.

Beskyttet Boc-[C(Z)aeg]g-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c til omtrent 16.8 mg råmateriale ved HF spaltning av 65.6 mg tørr H-[C(Z)aeg)g-Lys(ClZ)-MBHA harpiks. (e) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Caeg]^Q-Lys-NHg.

Beskyttet Boe-[C(Z)aeg]10-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 142.4 mg råmateriale ved HF spaltning av 441 mg tørr H-[C(Z)aeg]10-Lys(ClZ)-MBHA harpiks.

XII

EKSEMPEL 106

Fast-fase syntese av H-[Taeg]2-Caeg-[Taeg]2-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2. (a) Trinnvis oppstilling av Boe-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]2-C(Z )aeg-[Taeg]4-Lys(C1Z)-MBHA harpiks.

Omtrent 0.3 ,.g våt H-[Taeg] 2-C (Z )aeg-[Taeg] 4-Lys(ClZ )-MBHA harpiks fra den tidligere syntesen av Boe-[Taeg]5-C(Z)aeg-[Taeg]4-Lys(ClZ)-MBHA harpiks hie plassert i en 5 ml SPPS reaksjonsbeholder. Etter kobling av det neste residiet fem ganger, ble en total inkorporering av BocC(Z)aeg på 87$ oppnådd. De fem gjentatte koblingene ble utført med 0.18 M BocC(Z)aeg-0Pfp i 2 ml TFE/CH2C12 (1:2, v/v), 2 ml TFE/CH2C12 (1:2, v/v), 2 ml TFE/CH2C12 (1:2, v/v) med to dråper dioksan og to dråper DIEA (denne tilstanden ga bare et koblingsutbytte på noen få prosent), 2 ml TFE/CH2CL2 (1:2, v/v) pluss 0. 5 g fenol og 1 ml CH2C12 pluss 0.4 g fenol. De to siste Taeg residiene ble inkorporert nærmest kvantitativt ved dobbeltkoblinger med 0.25 M BocTaeg-OPfp i 25$ fenol/CH2Cl2. Alle koblingene ble latt gå over natt. (b) Spaltning, rensing og identifikasjon av H-[Taeg]2-Caeg-[Taeg]2-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2.

Beskyttet Boe-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]4-Lys(C1Z)-MBHA harpiks ble behandlet som beskrevet i Eksempel 17 c for å tilveiebringe omtrent 7 mg råmateriale ved HF spaltning av 80.7 mg tørr H-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]2-C(Z)aeg-[Taeg]4-Lys(Clz)-MBHA harpiks. Råproduktet ble renset til 1. -2 mg H-[Taeg] 2-Caeg-[Taeg] 2-Caeg-[Taeg]4-Lys-NH2 (>99.9$ renhet) .

EKSEMPEL 107

SYNTESE AV EN PNA MED TO ANTI-PARALLELLE TRÅDER KOBLET SAMMEN.

Syntese av H-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Gaeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-]6-AHA]-[aeg]-[6-AHA]-[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Aaeg] -

[Taeg]-[Taeg]-[Taeg]-LYS-NH2. (6-AHA = 6 aminoheksansyre )

(Figur 26).

Beskyttet PNA ble oppstilt på en Boc-Lys(ClZ) modifisert MBHA harpiks med en substitusjon på omtrent 0.30 mmol/g. "Capping" av ukoblede aminogrupper ble bare utført før inkorporering av BocGaeg-OH monomeren. Syntesen ble initiert på 1.00 g (tørrvekt) for-svellet (over natten i DCM) og nøytralisert Boc-Lys(C1Z)-MBHA harpiks. Inkorporering av monomerene var ifølge protokollen i Eksempel 32 og Eksempel 71. Koblingsreaksjonen ble registrert ved kvalitativ ninhydrin-reaksjon (Kaisertest). Når det gjelder en positiv Kaiser-test, ble koblingsreaksjonen gjentatt helt til testen ikke viste noen farging av kulene. Endelig avspaltning, spaltning fra bæreren og rensing ble utført ifølge standard prosedyrer.

EKSEMPEL 108

Alternativ beskyttelsesgruppe-strategi for PNA-syntese (Figur 27).

(a) Syntese av testforbindelsene.

2-amino-6-0-benzyl purin. Til en oppløsning av 2.5 g (0.109 mol) natrium i 100 ml benzylalkohol ble det tilsatt 10.75 g (0.063 mol) 2-amino-6-klorpurin. Blandingen ble omrørt i 12 t ved 120°C. Oppløsningen ble avkjølt til romtemperatur og nøytralisert med eddiksyre og ekstrahert med 10 deler 50 ml 0.2 N natriumhydroksid. De samlede natriumhydroksidfåsene ble vasket med 100 ml dietyleter og nøytralisert med eddiksyre hvorved presipitasjonen begynner. Oppløsningen ble

avkjølt til 0°C og det gule presipitatet ble samlet ved filtrering. Omkrystallisering fra etanol ga 14.2 g 92$ rene hvite krystaller av målforbindelsen. 1H-NMR (250 MHz--DMS0-d6) d ppm: 8-H, 7.92; benzylaromatisk, 7.60 - 7.40; 2NH2, 6.36; benzyl CH2, 5.57.

(2-amino-6-0-benzyl purinyl)metyletanoat. En blanding av 5 g (0.0207 mol) 2-amino-6-0-benzyl-purin, 30 ml DMF og 2.9 g (0.021 mol)/ kaliumkarbonat ble omrørt ved romtemperatur. Metyl bromacetat (3.2 g; 1.9 ml; 0.0209 mol) ble dråpevis tilsatt. Oppløsningen ble filtrert etter 4 t og oppløsnings-midlét ble fjernet under redusert trykk (4 mmHg, 40°C). Resten ble omkrystallisert to ganger fra etylacetat for å oppnå 3.7 g (57$) av målforbindelsen. 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) d ppm: 8-H, 7.93; benzyl aromatisk 7.4 - 7.6; 2-NH2, 6.61; benzyl CH2, 5.03; CH2, 5.59; 0CH3, 3.78.

(2N-p-toluen sulfonamido-6-0-benzyl purinyl) metyl etanoat. Til en oppløsning av 0.5 g (1.6 mmol) (2-amino-6-0-benzyl purinyl) metyl etanoat i 25 ml metylenklorid ble det tilsatt 0.53 g (1.62 mmol) p-toluensulfonsyre anhydrid og 0.22 g (1.62 mmol) kaliumkarbonat. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur. Blandingen ble filtrert og oppløsningsmidlet ble fjernet ved redusert trykk (15 mmHg, 40°C). Dietyleter ble tilsatt til den oljeholdige resten. Den resulterende oppløsningen ble omrørt over natt og målforbindelsen (0.415 mg; 55$) presipiterte og ble samlet ved filtrering. 1H-NMR (250 MHz, DMS0-d6) d ppm: 8-H, 8.97, aromatisk 7.2 - 7.8; benzyl CH2, 5.01; CH2, 4.24; 0CH3, 3.73; CH3, 2.43.

(b) Stabiliteten til det tosyl-beskyttede base-residiet i

TFA og HF.

Materialet ble utsatt for standard avspaltningsbetingelser (TFA-avspaltning) og endelig spaltninger med HF. Produktene ble deretter utsatt for HPLC-analyse ved anvendelse av en 4 jj RCM 8 x 10 Nova pack kolonne og oppløsningsmidlene A (0.1$ TFA i vann) og B (0.1$ TFA i acetonitril) ifølge følgende tidsgradient med en strømning på 2 ml/min.

Følgende retensjonstider ble funnet: (a) Forbindelse 1: 30.77 min.; (b) forbindelse 2: 24.22 min., og (c) forbind-elsé 3: 11.75 min. Analysen viste at 06-benzyl gruppen ble fjernet både med TFA og HF, mens det ikke var noen spaltning av tosylgruppen i TFA, men kvantitativ fjerning i HF under standard spaltningsbetingelser.

EKSEMPEL 109

5-bromuracil_N<1->metylacetat.

5-bromuracl (5.00 g; 26.2 mmol) og kaliumkarbonat (7.23 g; 52.3 mmol) ble suspendert i DMF (75 ml). Metylbromacetat (2.48 ml; 26.1 mmol) ble tilsatt over en periode på 5 min. Suspensjonen ble omrørt i 2 t ved romtemperatur og deretter filtrert. Den faste resten ble vasket to ganger med DMF og de kombinerte filtratene ble avdampet til tørrhet i vakuum. Resten var en olje inneholdende tittelforbindelsen, DMF og noen uidentifiserte urenheter. Det var ikke nødvendig å rense tittelforbindelsen før hydrolysen. ^H-NMR (DMSO-d^,, 250 MHz); 8.55 (urenhet); 8.27 (CBr=CHN); 8.02 (urenhet); 4.76 (urenhet); 4.70 (urenhet); 4.62 (NCH2C00CH3); 3.78 (C00CH3); 2.96 (DMF); 2.80 (DMF). 13C-NMR (DMS0-d6), 250 MHz); 168.8 (COOCH3); 172.5 (CH=CBrC0N); 161.6 (DMF); 151.9 (NCON); 145.0 (C0-CBr=CHN); 95.6 (C0CBr=CHN); 52.6 (urenhet); 52.5 (OCH3); 49.7 (urenhet); 48.8 (NCHgCOOMe); 43.0 (urenhet); 36.0 (DMF). UV(metanol; maxnm); 226; 278. IR(KBr; cm" 1_ ; 3158s (_NH); 1743 vs (_C=0, COOMe); 1701 vs (_C=0, CONH); 1438 vs (5 CH, CH3O); 1223 vs (_ C-0, COOMe); 864 m (5 CH, Br=C-H). FAB-MS m/z (anvisning): 265/263 (M+H).

EKSEMPEL 110

(5-bromuracil)eddiksyre.

Vann (30 ml) ble tilsatt til oljen av råproduktet fra Eksempel 109 og blandingen ble løst opp ved tilsetning av natriumhydroksid (2M, 60 ml). Etter omrøring ved 0°C i 10 min., ble saltsyre (4M, 45 ml) tilsattt til pH=2 og tittelforbindelsen ble presipitert. Etter 50 min. ble den faste resten isolert ved filtrering, vasket en gang med kaldt vann og deretter tørket i vakuum over sicapent. Utbytte: 2.46 g (38$). Smp. 250 - 251°C.

Anal. for C6H5BrN204.

Funnet (beregnet):

C: 28.78 (28.94); H: 2.00 (2.02); Br: 32.18 (32.09) N: 11.29 (11.25). 1-H-NMR (DMS0-d6, 250 MHz): 12.55 (lH.s, COOH); 11.97 (lH.s.NH); 8.30 (1H, s, C=C-H); 4.49 (2H,s, HCH2C00H). <13>C-NMR (DMS0-d6, 250 MHz); 169.4 (COOH); 159.8 (NHCOCBr=CH); 150.04 (NCON); 145.8 (C0CBr=CHN); 94.6 (C0CBr=CHN); 48.8 (NCH2C00H). UV (Metanol; maxnm); 226; 278. IR (KBr; cm"<1>); 3187s (_NH); 1708 vs (_C=0, COOH); 1687 vs; 1654VS (_C=0, CONH); 1192s (_C-0, COOH); 842 m (S CH, Br-C=C-H). FAB-MS m/z (anvisning, relativ intensitet); 251/249 (M + H,5).

EKSEMPEL 111

N- ( Boc-aminoetyl )-N-(5-bromuracil)metylenkarbonoylglycin etylester.

Boc-aminoetylglycin etylester (1.80 g; 7.30 mmol) ble løst opp i DMF (10 ml). Dhbt-OH (1.31 g; 8.03 mmol) ble tilsatt, og et presipitat ble dannet. DMF (2 x 10 ml) ble tilsatt helt til presipitatet ble oppløst. Produktet fra Eksempel 110 (2.00 g; 8.03 mmol) ble sakte tilsatt for å unngå presipitering. Metylenklorid (30 ml) ble tilsatt og blandingen ble avkjølt til 0°C og deretter filtrert. Presipitatet, DCU, ble vasket to ganger med metylenklorid. Til det kombinerte filtratet ble det tilsatt metylenklorid (100 ml). Blandingen ble vasket med halv-mettet NaHC03-oppløsning (3 x 100 ml, H20:mettet NaHC03-oppløsning (1:1 v/v), og deretter med fortynnet KHSC^-oppløsning (2 x 100 ml, H20:mettet KHSO4-oppløsning 4:1 v/v), og til slutt med mettet NaCl-oppløsning (1 x 100 ml). Den organiske fasen ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og avdampet til tørrhet i vakuum (omtrent 15 mmHg og deretter omtrent 1 mmHg). Resten ble suspendert i metylenklorid, (35 ml), omrørt i 45 min. ved romtemperatur og filtrert (presipitatet var DCU). Petroleumeter (2 volum) ble dråpevis tilsatt til filtratet ved 0°C hvorved en olje presipiterte. Væsken ble dekantert og den gjenværende oljen ble løst opp i metylenklorid (20 - 50 ml). Presipitatet ble dannet ved tilsetning av petroleumeter (2 volum). Denne prosedyren ble gjentatt 5 ganger helt til en urenhet ble fjernet. Urenheten kan sees på TLC med 10$ MeOH/CH2Cl2 som utviklende oppløsningsmiddel. Den resulterende oljen ble løst opp i metylenklorid (25 ml) og avdampet til tørrhet i vakuum og forårsaket stivning av tittelforbindelsen. Utbytte: 2.03 g (58$). Smp. 87-90<0>C.

Anal. for 0^7^56^407 .

Funnet (beregnet):

C: 42.33 (42.78); H: 5.15 (5.28); Br: 17.20 (16.74); N: I. 69 (11.74 ). 1-H-NMR (DMS0-d6, 250 MHz, J i Hz): 1.93 & II. 92 (lH,s,C=0NHC=0); 8.09 & 8.07 (1H, s , C=C-H); 7.00 & 6.80 (lH,t,b,BocNH); 4.80 & 4.62 (2H,s,NCH2C0N); 4.35 & 4.24 (2H,s,NCH2C00Et); 4.27 - 4.15 (2H,m's, C00CH2CH30); 3.47-3.43 (2H,m's, BocNHCH2CH2N); 3.28 - 3.25 & 3.12 - 3.09 (2H, m's, BocNHCH2CH-2N) : 1.46 & 1.45 (gH.s^Bu); 1.26 & 1.32 (3H, t,J=7.1, C00CH2CH3). <13>C-NMR (DMS0-d6, 250 MHz), 169.3 & 169.0 (<t>BuOC^O); 167.4 & 167.1 (COOEt); 159.8 (C=C-C0N); 155.9 (NCH2C0N); 150.4 (NCON); 145.9 (COCBrCHN); 94.5 (C0CBr=CHN); 78.2 (Me3C); 61.3 & 60.7 (C0CH2CH3); 49.1 & 48.0 (NCH2C00H); 48.0 & 47.0 (NCH2C0N); 38.6 (BocNHCH2CH2N) ; 38.2 (BocNHCH2CH2N); 26.3 (C(CH3)3)<;> 14.1 (C0CH2CH3). UV (Metan-0<1>5 max™): 226 280 • IR (KBr, CM-1 ): 3200 ms (bred (_NH); 168 vs, bred (_C=0, COOH, CONH); 1250s (_C-0, COOEt); 1170s (_C-0, COOtBu); 859 m (S CH, Br-C=C-H). FAB-MS m/z (anvisning, relativ intensitet): 479/477 (M+H, 5); 423/421 (M + 2H - tBu, 8); 379/377 (M + 2H - Boe, 100); 233/231 (M-skjelett, 20 ).

EKSEMPEL 112

N-( Boc-aminoetyl )-N-( 5-bromuracyl-N^-metylenkarbonoyl )glycin. Produktet fra Eksempel 111 (1.96 g; 4.11 mmol) ble løst opp i metanol (30 ml) ved oppvarming og deretter avkjølt til 0°C. Natriumhydroksid (2M, 30 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 30 min. HCL (IM, 70 ml) ble tilsatt til pH = 2.0. Vannfasen ble ekstrahert med etylacetat (3 x 65 ml + 7 x 40 ml). De kombinerte etylacetat-ekstraktene ble vasket med mettet NaCl-oppløsning (500 ml). Etylacetatfasen ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og avdampet til tørrhet i vakuum. Utbytte: 1.77 g (96%). Smp. 92 - 97°C.

Anal. for C15H21BrM407.

Funnet (beregnet):

C: 40.79 (40.10); H: 5.15 (4.71); Br; 14.64 (17.70);

N: 11.35 (12.47 ). 1H-NMR (DMS0-d6, 250 MHz, J i Hz): 12.83 (lH.s, COOH); 11.93 & 11.91 (1H,s,C=0NHC=0) ; 8.10 & 8.07 (lH,s,C=C-H); 7.00 & 6.81 (1H, t,b,BocNH); 4.79 & 4.61 (2H,s ,NCH2C0N) ; 4.37 & 4.25 (2H, s ,NCH2C00H) ; 3.46 - 3.39 (2H,m's, BocNHCH2CH2N) ; 3.26 - 3.23 & 3.12 - 3.09 (2H, m's, BocNHCH2CH2N); 1.46 (gH.s^Bu). 13C-NMR (DMS0-d6, 250 MHz); 17i0.4 ("<t>BuOC^O); 166.9 (COOH); 159.7 (C=C-C0N); 155.8 (NCH2C0N); 150.4 (NCON); 145.9 (C0CBr=CHN); 94.4 (C0CBr=CHN); 78.1 (Me3C); 49.1 & 48.0 (NCH2C00H); 47.7 & 47.8(NCH2C0N) ; 38.6 (BocNHC2CH2N); 38.1 (Boe NHCH2<C>H2<N>); 28.2 (C(CH3)3. UV (Metanol; maxnm); 226; 278. IR (KBr, cm-<1>): 3194 ms, bred (_NH); 1686vs, vbred (_C=0 COOH, CONH); 1250s (_C-0, COOH); 1170s (_C-0, COO<t>Bu); 863m (S CH, Br-C = C-H). FAB-MS m/z (anvisning, relativ intensitet): 449/451 (M + H, 70); 349/351 (M + 2H -Boe, 100); 231/233 (M - skjelett, 20).

EKSEMPEL 113

Uracil -metyl acetat.

Uracil (10.0 g; 89.2 mmol) og kaliumkarbonat (24.7 g; 178 mmol) ble suspendert i DMF (250 ml). Metylbromacetat (8.45 ml; 89.2 mmol) ble tilsatt over en periode på 5 min. Suspensjonen ble omrørt over natt under nitrogen ved romtemperatur og deretter filtrert. TLC (10% metanol i etylen-klorid) indikerte fullstendig omdanning av uracil. Den faste resten ble vasket to ganger med DMF og de kombinerte filtratene ble avdampet til tørrhet i vakuum. Presipitatet ble suspendert i vann (60 ml) og HC1 (2.5 ml, 4M) ble tilsatt til pH = 2. Suspensjonen ble omrørt i 30 min. ved 0°C og deretter filtrert. Den presipiterte tittelforbindelsen ble vasket med vann og tørket i vakuum over sicapent. Utbytte: 9.91 g (60%). Smp. 182 - 183°C.

Anal. for CfcHgN204 .

Funnet (beregnet):

C: 45.38 (45.66); H: 4.29 (4.38; N: 15.00 (15.21); ^H-NMR (DMS0-d6, 250 MHz, J i Hz): 1.47 (1H,s, NH); 7.68 (1H, d, JH_C=C_H=7.9), CH=CHN); 5.69 (1H,d,JH_C=C_H=7.9), CH=CHN); 4.59 (2H,s,NCH2C00Me); 3.76 (3H,s,COOCH3 ). <13>C-NMR (DMS0-d6, 250 MHz); 168.8 (COOMe); 164.0 (C=C-C0N); 151.1 (NCON); 146.1 (C0CH=CHN); 101.3 (C0CH=CHN); 52.5 (COOCH3); 48.7 (NCH2-COOMe). UV (Metanol; maxnm): 226; 261. IR(KBr; cm-<1>); 3164s (_NH); 1748vs (_C=0, COOMe); 1733vs (_C=0, CONH); 1450vs (SCH, CH3O); 1243VS (_C-0, COOMe); 701 m (S CH, H-C=C-H). FAB-MS m/z (anvisning); 185 (M+H).

EKSEMPEL 114

Uracileddiksyre.

Vann (90 ml) ble tilsatt til produktet i Eksempel 113 (8.76 g; 47.5 mmol), etterfulgt av natriumhydroksid (2M, 40 ml). Blandingen ble oppvarmet i 40 min. helt til total metylester hadde reagert. Etter omrøring ved 0°C i 15 min. ble saltsyre (4M, 25 ml) tilsatt til pH=2. Tittelforbindelsen presipiterte og blandingen ble filtrert etter 2 - 3 t. Presipitatet ble vasket en gang med morvæsken og to ganger med kaldt vann og tørket i vakuum over sicapent. Utbytte: 6.66, (82$). Smp. 288 - 289°C.

Anal. for C6H6<N>2<0>4.

Funnet (beregnet):

C: 42.10 (42.36), H: 3.43 (3.55); N: 16.25 (16.47)/- <1->H-NMR (DMS0-d6), 250 MHz, J i Hz): 13.19 (lH.s.COOH); 11.41 (lH.s.NH); 7.69 (1H,d,JH_=C_H=<7.>8, Jh-C-C-H-H<=>2•0» coch=chn); 4.49 (2H,s,NCH2C00H). <13>C-NMR (DMS0-d6, 2509 MHz); 169.9 (COOH); 163.9 (CH=CHC0N); 151.1 (NCON); 146.1 (C0CH=CHN) ; 100.9 (C0CH=CHN); 48.7 NCH2C00H. UV (Metanol; maxnm): 246; 263. IR (KBr; cm-<1>): 3122s (_NH); 1703vs (_C=0, COOH); 1698vs, 1692vs (_C=0, C0NH); 1205s (_C-0, COOH); 676 (S CH, H-C=C-H). FAB-MS m/z (anvisning): 171 (M + H).

EKSEMPEL 115

N-(Boeaminoetyl)-N-(uracil-N<1->metylenkarbonoyl)glycin etylester.

(Bocaminoetyl )glycin etylester (2.00 g; 8.12 mmol) ble løst opp i DMF (10 ml). Dhbt-OH (1.46 g; 8.93 mmol) ble tilsatt og et presipitat ble dannet. DMF (2 x 10 ml) ble tilsatt helt til det hele var oppløst. Produktet ifølge Eksempel 114 (1.52 g; 8.93 mmol) ble sakte tilsatt for å unngå presipitasjon. Metylenklorid (30 ml) ble tilsatt og blandingen ble avkjølt til 0°C og deretter ble DDC (2.01 g; 9.74 mmol) tilsatt. Blandingen ble omrørt ilt ved 0°C, ved 2 t ved romtemperatur og deretter filtrert. Presipitert DCU ble vasket to ganger med metylenklorid. For å kombinere filtratet ble det tilsatt metylenklorid (100 ml), og oppløs-ningen ble vasket med halv-mettet NaHC03-oppløsning (3 x 100 ml, H20:mettet NaHCOg-oppløsning i 1:1 v/v), og deretter med fortynnet KHS04-oppløsning (2 x 100 ml, H20:mettet KHS04-oppløsning 4:1 v/v) og til slutt med mettet NaCl-oppløsning (1 x 100 ml). Den organiske fasen ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og avdampet til tørrhet i vakuum (omtrent 15

mmHg og deretter omtrent ImmHg). Resten ble suspendert i metylenklorid (32 ml) og omrørt i 35 min. ved romtemperatur og 30 min. ved 0°C og deretter filtrert. Presipitatet (DCU) ble vasket med metylenklorid. Petroleumeter (2 volum) ble dråpevis tilsatt til det kombinerte filtrat ved 0°C som forårsaket separasjon av en olje. Blandingen ble dekantert og den gjenværende oljen ble deretter løst opp i metylenklorid (20 ml) og deretter på ny presipitert ved tilsetning av petroleumeter (2 volum). Denne prosedyren ble gjentatt fem ganger helt til en urenhet ble fjernet. Urenheten kan sees på TLC med 10$ MeOH/CH2Cl2 som utviklingsoppløsningsmiddel. Den resulterende oljen ble løst opp i metylenklorid (20 ml) og avdampet til tørrhet i vakuum og forårsaket stivning av tittelforbindelsen. Utbytte: 1.71 g (53$). Smp. 68.5-75.7°C.

Anal. for C17<H>26<N>4O7.

Funnet (beregnet):

C: 50.61 (51.25); H: 6.48 (6.58); N: 13.33 (14.06).

1H-NMR (DMS0-d6, 250 MHz, J i Hz): 11.36 (1H,s,C=0nHC=0); 7.51 & 7.47 (lH.<d,><J>h-C=C-H+ 6- 1' C0CH=X-H); 7.00 & 6.80 (1H, t,b, BocNH); 5.83 & 5.66 (1H, d, Jh-C=C-H=5•7• C0CH=CH); 4.78 & 4.60 (2H,s,NCH2C0N) ; 4.37 & 4.12 (2H,s,HCh2C00Et); 4.30-4.15 (2H, m's, C00CH2CH3); 3.49 - 3.46 (2H,m<*>s, BocNHCH2-CH2n); 3.27 3.23 & 3.11 - 3.09 (2H, m's, BocNHCH2CH2N; 1.46 (9H, s, <t>Bu); 1.39 - 1.23 (3H, m's, C00CH2CH3). <13>C-NMR (CMS0-d6, 250 MHz): 169.4 & 169.0 (<t>BuOC=0); 167.6 & 167.3 (COOEt); 163.8 (CH=CHC0N); 155.8 (NCH2C0N); 151.0 (NC0N); 146.3 (C0CH=CHN); 100.8 (C0CH=CHN); 78.1 (Me3C); 61.2 & 60.6 (C00CH2CH3); 49.1 (NCH2C00Et); 47.8 & 47.0 (NCH2C0N); 38.6 (BocNHCH2CH2N); 38.1 & 37.7 (BocNHCH2N); 28.2 (C(CH3)3); 14.1 (C0-0C<H>2<C>H3. UV (Metanol: raaxnm); 226, 264. IR(KBr; cm-<1>): 3053m (_NH); 1685vs, vbred (_C=0, COOH, C0NH); 1253s (_C-0, COOEt); 1172s (_C-0, COO<t>Bu): 718w (S CH, C-C-C-H), FAB-MS m/z (anvisning, relativ intensitet); 399 (M + H, 35); 343 (M + 2H - <t>Bu, 100); 299 (M + 2H - Boe, 100); 153 (M - skjelett, 30 ).

J. KJ 1

EKSEMPEL 116

N-(Bocaminoetyl)-N-(uracilmetylenkarbonoyl)glycin

Produktet Ifølge Eksempel 115 (1.56 g; 3.91 mmol) ble løst opp i metanol (20 ml) og deretter avkjølt til 0°C. Natriumhydroksid (2M, 20 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 75 min. ved 0°C. Saltsyren (IM, 46 ml) ble tilsatt til pH = 2.0. Vannfasen som ble ekstrahert var etylacetat (3 x 50 ml + 7 x 30 ml). De kombinerte etylacetat-ekstraksjonene ble vasket med mettet NaCl oppløsning (360 ml). Etylacetatfasen ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og avdampet til tørrhet i vakuum. Resten ble løst opp i metanol og avdampet til tørrhet i vakuum. Utbytte: 0.55 g (38$). Smp. 164-170° C.

Anal. for C15<H>22<N>4O7.

Funnet (beregnet):

C: 46.68 (48.65); H: 6.03 (5.99); N: 14.61 (15.13). ^H-NMR (DMS0-d6, 250 MHz, J i Hz); 12.83 (1H, s, COOH); 11.36 (1H, s, C=0NHC=0); 7.52 - 7.45 (1H, m's, C0CH=CHN); 7.00 & 6.82 (1H, t, b, BocNH); 5.67 - 5.62 (1H, m's, C0CH=CHN); 4.76 & 4.58 (2H, s, NCH2C0N); 4.26 & 4.05 (2H, s, NCH2C00H): 3.46 - 3.39 (2H, m<*>s, BocNHCH2CH2N); 3.25 - 3.23 & 3.15 - 3.09 (2H, m's, BocNHCH2CH2N) ; 1.46 (9H, s, <t>Bu). 13C-NMR (DMS0-d6, 250 MHz); 170.5 (^00=0); 167.2 (COOH); 163.9 (C=C-C0N); 155.8 (NCH2C0N); 151.1 (NCON); 146.4 (C0CH=CHN); 100.8 (COCH-CHN); 78.1 (Me3C); 49.1 & 47.8 (NCH2 COOH); 47.6 & 46.9 (NCH2C0N); 38.6 (BocNHCH2CH2N); 38.1 & 37.6 (BocNHCH2CH2N); 28.2 (C(<C>H3)3). UV (Metanol; maxnm): 226; 264. IR (KBr; cm" <!>); 3190 (_NH); 1685vs, vbred (_C=0, COOH, CONH); 1253s (-C-0-, COOH); 1171s (_C-0, COO<t>Bu); 682w (§ CH, H-C=C-H). FAB-MS m/z (anvisning, relativ intensitet): 371 (M + H, 25); 271 (M + H - Boe, 100).

EKSEMPEL 117

H-U10-LysNH2

Syntese av tittelforbindelsen ble oppnådd ved anvendelse av "Synteseprotokoll 10". Syntesen ble initiert på omtrent 100 mg Lys (C1Z )-MBHA-harpiks. Råproduktet (12 mg) var rent nok for hybridiseringsstudier. Hybridet mellom 5'-(dA)10 og H-U10 hadde Tm på 67.5°C.

EKSEMPEL 118

Avspaltning og spaltning av H-[Caeg]ig-Lys-NH2 ved trifluormetansulfonsyre (TFMSA). En alternativ metode for avspaltning og spaltning av hydrogenfluorid (HF).

(a) Avspaltning av side-kjede beskyttende grupper ved

hjelp av en "lav-aciditet" TFMSA-TFA-DMS prosedyre. En del av ca. 0.4 g våt Boc-[Caeg] 10-Lys(clz )-MBHA harpiks (preparert i en av de tidligere eksemplene) ble plassert i en 5 ml fast-fase reaksjonsbeholder. Den n-Terminale Boc-gruppen ble fjernet med følgende protokoll: (1) 50$ TFA/- CH2CL2, 2x1 min. og 1 x 30 min.; (2) 100$ TFA, 2x1 min. og avrenning. For å avspalte benzyl-baserte side-kjede beskyttende grupper, ble en såkalt "lav-aciditet" TFMSA prosedyre utført som følger: En stamoppløsning (a) inneholdende 5 ml TFA-DMS-m-cresol (2:6:2, v/v/v) og en stamoppløs-ning (B) inneholdende TFA-TFMSA (8:2, v/v) ble dannet. Deretter ble følgende trinn utført: (3) 1 ml stamoppløsning

(A) blir tilsatt til PNA-harpiksen i reaksjonsbeholderen med risting i 2 min. Ingen avrenning, (4) 1 ml stamoppløsning (B) (avkjølt med is/vann) ble tilsatt i porsjoner på 200 pl hvert tiende minutt over en periode på 40 min. og ristingen blir fortsatt i ytterligere 50 min., (5) avrenning og vasking med 100$ TFA, 5x1 min. og avrenning. (b) Spaltning fra harpiksen ved hjelp av en "høy—

aciditet" TFMSA-TFA prosedyre.

x u u

For å spalte ovennevnte av de beskyttede PNA fra harpiksen ble en såkalt "høy aciditet" TFMSA prosedyre utført som følger: En stam-oppløsning (C) innneholdende m-cresol-TFA (2:8, v/v) ble dannet. Deretter ble følgende trinn utført: (6) 1 ml stam-oppløsning (C) ble tilsatt til den avspaltede PNA-harpiksen i SPPS beholderen med risting i 2 min., (7) 1 ml stam-oppløsning (B) (avkjølt med is/vann) blir tilsatt i porsjoner på 200pl over en periode på 30 min. og ristingen blir fortsatt i ytterligere 150 min., (5) 2 ml oppløsningen i reaksjonsbeholderen blir "blåst ut" gjennom filteret inn i en 20 ml oppløsning av dietyleter avkjølt med tørris/isopro-panol. For å fullføre pesipiteringsprosessen blir 200 pl vannfri pyridin tilsatt dråpevis til syre-eter blandingen, (8) sentrifugering ved 3000 rpm i 5 min., (9) supernatanten blir dekantert og presipitatet blir vasket tre ganger med kald dietyleter, tørket, løst opp i vann og lyofilisert.

(c) Rensing og identifikasjon av H-[Caeg]iQ-Lys-NItø.

Et analytisk HPLC kromatogram viste et fint råprodukt med god renhet og en profil som nesten er identisk med den som blir oppnådd fra HF spaltningen av H-[Caeg]^Q-Lys-NHg, med unntagelse av en ytterligere topp blir dannet fra pyridin TFMSA salt eluater tidlig i kromatogrammene. Rensingen og identifikasjonen ble utført ved hjelp av vanlige prosedyrer.

Claims (22)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formelen: hvor: n er minst 2, hver av L<1> - Ln blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, (C^ - C^alkanoyl, naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser, aromatiske deler, DNA interkalatorer, nukleobase-bindende grupper, heterocykliske deler og reporterligander, idet minst en av L.<1> - Ln er en naturlig forekommende nukleobase, en ikke-naturlig forekommende nukleobase, en DNA interkalator eller en nukleobase-bindende gruppe, hver av A<1> - An er en enkeltbinding, en metylengruppe eller en gruppe med formel: hvor: X er 0, S, Se, NE<3>, CH2 eller C(CH3)2<;>Y er en enkeltbinding, 0, S eller NR<4>; hver av p og q er null eller et tall fra 1 til 5, summen av p+q er ikke mer enn 6; hver av r og, s er null eller et tall fra 1 til 5, summen av r+s er ikke mer enn 5; hver R<1> og R<2> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C^ -C4 )alkyl, som kan være hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert, hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen; og hver R<3> og R<4> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, ( C^- C^)alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert ( C^- C^)alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio og amino; hver av B-^-B11 er N eller R<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor, hver av C<1->^ er CR<6>R<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR<6>R<7>CH2, hvor R6 er hydrogen og R<7> er valgt fra gruppen bestående av side-kjedene til de naturlig forekommende alfa aminosyrene eller R<6> og R<7 >blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C2-C^)alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, (C-L-C^alkoksy, (Ci-Cfcjalkyltio, NR<3>R4 og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert ovenfor og R<5> er hydrogen, (C^-C^ )alkyl, hydroksy-, alkoksy-, eller alkyltio-substituert (C^-C^ )alkyl, eller R<6 >og R<7> fullfører sammen et alicyklisk eller heterocyklisk system, hver av D<1> - Dn er CR<6>R7, CH2CR<6>R<7> eller CHR<6>CHR<7>, hvor R<6> og R<7> er som definert ovenfor, hver av G1 -Gn_1 er -NR<3>C0-, -NR<3>CS-, -NR<3>S0- eller -NR<3>S02-i en orientering, hvor R<3> er som definert ovenfor, Q er -C02H, -CONR'R", -S03H eller -S02NR'R'' eller et aktivert derivat av -C02H eller -S03H; og 1 er -NHR'"R''" eller -NR ' ' ' C ( 0 )R ' ' ' ' , hvor R', R", R'" og R'''' er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, alkyl, amino-beskyttede grupper, reporterligander, interkalatorer, chelatorer, peptider, proteiner, karbohydrater, lipider, steroider, oligonukleotider og oppløselige og ikke-oppløselige polymerer.

2 . Forbindelsen ifølge krav 1, karakterisert ved at den har formelen: hver L blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av nukleobasene tymin, adenin, cytosin, guanin og uracil; hver R<7>' er hydrogen, og n er et tall fra 1 til 30, Rh er OH, NH2 eller -NHLysNH2; og R<1> er H eller COCH3.

3. Forbindelse, karakterisert ved at den har en av følgende formler: hvor : L blir valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, (cl_c4)alkanoyl, naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser, aromatiske deler, DNA interkalatorer , nukleobase-bindende grupper og reporter1igan-der , hvor: aminogruppene eventuelt blir beskyttet av aminobeskyttende grupper, A er en enkeltbinding eller en gruppe med formel: hvor X er 0, S, Se, NR<3>, CH2 eller C(CH3)2<; >Y er en enkeltbinding, 0, S eller NR<4>; hver av p og q er null eller et tall fra 1 til 5, summen av p+q er ikke mer enn 10; hver av r og s er null eller et tall fra 1 til 5, summen r+s er ikke mer enn 10, hver R<1> og R<2> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C1-C4 )alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert (Ci~C4 )alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen; og hver R<3> og R<4> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C1-C4 )alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert ( C^- C^)alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio og amino; B er N eller R<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor; hver C er CR<6>R<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR<6>R7CH2, hvor R6 er hydrogen og R<7> er valgt fra gruppen bestående av sidekjedene til naturlig forekommende alfa-amino syrer, eller R<6> og R<7> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C2-C^)alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, (C^ - C^)alkoksy, ( C1- Cb )alkyltio, NR<3>R4 og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert ovenfor og R<5> er hydrogen eller (C^ - C^)alkyl, hydroksy-, alkoksy- eller alkyltio-substituert (C-^-Cf, )alkyl, eller R<6> og R<7> fullfører sammen et alicyklisk eller heterocyklisk system, hver D er CR<6>R<7>, CH2CR<6>R7 eller CHR<6>CHR<7>, hvor R<6> og R<7> er som definert ovenfor, hver E er COOH, CSOH, SOOH, S020H eller et aktivert eller beskyttet derivat derav, og hver F er NHR<3> eller NPgR<3>, hvor R<3> er som definert ovenfor og Pg er en amino-beskyttende gruppe.

4 . Forbindelse ifølge krav 3, karakterisert ved at den har formelen: hvor : L blir valgt fra gruppen bestående av nukleobasene tymin adenin, cytosin, guanin, uracil, 5-metylcytosin, 6-tioguani: og 5-bromuracil og beskyttede derivater derav,R<7>' er hydrogen, E er COOH eller et aktivert eller beskyttet derivat derav, o, F er NHg eller NHPg, hvor Pg er en amino-beskyttende gruppe.

5 . Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge kra 1, karakterisert ved følgende trinn: A) tilveiebringing av et polymersubstrat, idet nevnte polymer blir funksjonalisert med en kjemisk gruppe som ka: danne en forankringsbinding med en aminosyre, B) kobling av nevnte polymer med en første aminosyre gjennoi nevnte forankringsbinding, idet nevnte første aminosyre ha formelen (IV): hvor : L blir valgt fra gruppen bestående av naturlig forekommend nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser, aroma tiske deler, DNA interkalatorer, nukleobase-bindende grupper, heterocykliske deler og reporterligander, hvor aminogruppene eventuelt er beskyttet av aminobeskyttende grupper, A er en enkeltbinding eller en gruppe med formel: hvor: X er 0, S, Se, NR3, CH2 eller C(CH3)2<; > Y er en enkeltbinding, 0, S eller NR<4>; p og q er null eller et tall fra 1 til 5, idet summen av p+q ikke er mer enn 10, r og s er null eller tall fra 1 til 5, summen av r+s er ikke mer enn 10, R<1> og R<2> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, ( C^- C^)alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert (C1-C4 )alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio, amino og halogen, og R<3> og R<4> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (C-L-C4 )alkyl, hydroksy- eller alkoksy- eller alkyltio-substituert (C-L-C4 )alkyl, hydroksy, alkoksy, alkyltio og amino; B er N eller R<3>N<+>, hvor R<3> er som definert ovenfor; C er CR6R<7>, CHR<6>CHR<7> eller CR<6>R<7>C<H>2, hvor R<6> er hydrogen og R<7> er valgt fra gruppen bestående av sidekjeder av naturlig forekommende alfa-amino syrer, eller R<6> og R<7> blir uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, (Cg-C^, )alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl, hydroksy, (C-^-C^,)alkoksy, (C^-C^)alkyl-tlo, NR<3>R<4> og SR<5>, hvor R<3> og R<4> er som definert ovenfor og R<5> er hydrogen eller (C^-C^)alkyl, hydroksy-, alkoksy- eller alkyltio- substituert ( C^ Cf^ )alkyl, eller R<6> og R<7> fullfører sammen et alicyklisk eller heterocyklisk system; D er CR6R<7>, CH2CR<6>R<7> eller CHR6CHR<7>, hvor R<6> og R<7> er som definert ovenfor, E er COOH eller et aktivert eller beskyttet derivat derav og F er NPgR<3> hvor R<3> er som definert ovenfor og Pg er en amino-beskyttende gruppe; C) fjerning av nevnte amino-beskyttende gruppe fra nevnte koblede første aminosyre for å danne en fri aminogruppe og D) omsette nevnte frie aminogruppe med en andre aminosyre som har formelen (IV) for å danne en peptidkjede.

6 . Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den videre omfatter følgende trinn: E) fjerning av nevnte aminobeskyttende gruppe fra nevnte andre aminosyre for å danne en terminal fri aminogruppe på nevnte peptidkjede, og F) omsette nevnte frie aminogruppe på nevnte peptidkjede med en ytterligere aminosyre som har formelen (IV) for å forlenge nevnte peptidkjede.

7 . Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at trinnene E og F blir utført flere ganger.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den videre omfatter fjerning av minst en beskyttende gruppe på aminosyredelene til peptidkjeden.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den videre omfatter spaltning av nevnte forankringsbinding uten vesentlig degradering av nevnte peptidkjede .

10. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at polymersubstratet inneholder polystyren, polyakrylamid, silika, et kompositt materiale, bomull eller et derivat derav.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den kjemiske gruppen som kan danne nevnte forankringsbinding er klor-, brom- og jod-substituert alkyl, amino-substituert alkyl, amino og aryl-substituert alkyl, amino- og alkylaryl-substituert alkyl, hydroksy-substituert alkyl eller et derivat derav som har en spacergruppe som kan bli spaltet vesentlig uten degradering av nevnte polypeptid.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at klor-substituert alkyl er klormetyl, amino-substituert alkyl er aminometyl, amino- og alkyl-substituert aryl er a-aminobenzyl, amino- og alkylaryl-substi tuert alkyl blir valgt fra gruppen bestående av a-amino-3- og cx-amino-4-metylbenzyl, og hydroksy-substituert alkyl er hydroksymetyl.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at den kjemiske gruppen er avledet fra en amino- inneholdende del valgt fra amino-substituert alkyl, amino- og aryl-suhstituert alkyl og amino- og alkylaryl-substituert alkyl, og den kjemiske gruppen innbefatter en spacergruppe avledet fra gruppen bestående av 4-(haloalkyl)aryl-lavere alkanoiske syrer, Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)aryl-lavere alkanoiske syrer, N-Boc-p-acylbenzhydrylaminer, N-Boc-4'-(lavere alkyl)-p-acylbenzhydrylaminer, N-Boc-4'-(lavere alkoksy)-p-acylbenzhydrylaminer og 4-hydroksymetylfenoksy-laverealkanoinsyrer.

14 . Fremgangsmåte for sekvens-spesifikk gjenkjenning av et dobbelt-trådet polynukleotid, karakterisert ved å kontakte nevnte polynukleotid med en forbindelse ifølge krav 1 eller 2, og som blir bundet til en tråd av polynukleotidet og som derved forflytter den andre tråden.

15 . Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte forbindelse er en oligomer som omfatter et homogent eller heterogent skjelett hvor det er koblet naturlig forekommende nukleobaser, ikke-naturlig forekommende nukleobaser eller andre ligander som individuelt blir bundet av hydrogen til minst en naturlig nukleobase i nevnte bundede polynukleotid-tråd.

16 . Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den er for anvendelse i terapi.

17 . Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 eller 2, for fremstilling av en sammensetning for anvendelse i moduleringen av ekspresjonen av et gen i en organisme ved administrering av sammensetningen til organismen slik at forbindelsen spesifikt binder til DNA eller ENA avledet fra genet.

18. Anvendelse iføge krav 17, hvori moduleringen omfatter å inhibere transkripsjonen av genet eller replikasjonen av genet.

19. Anvendelse ifølge krav 17 eller 18, i behandlingen av tilstander assosiert med uønsket produksjon av et protein eller for induksjonen av degraderingen av RNA eller DNA i cellene til en organisme.

20. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 17 til 19 for å drepe celler eller virus.

21. Fremgangsmåte for å drepe virus eller celler in vitro, karakterisert ved at den omfatter å bringe i kontakt cellene eller virus med en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4 som spesifikt binder til en del av genomet til cellene eller viruset.

22 . Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4 og minst én farmasøytisk effektiv bærer, binder, tykner, diluent, buffer, konserveringsmiddel eller overflateaktivt middel.