LT6214B - Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai - Google Patents

Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai Download PDF

Info

Publication number
LT6214B
LT6214B LT2013109A LT2013109A LT6214B LT 6214 B LT6214 B LT 6214B LT 2013109 A LT2013109 A LT 2013109A LT 2013109 A LT2013109 A LT 2013109A LT 6214 B LT6214 B LT 6214B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
seq
mutans
sequence
sobrinus
antisense
Prior art date
Application number
LT2013109A
Other languages
English (en)
Other versions
LT2013109A (lt
Inventor
Ericson
Kačergius
Original Assignee
Uab "Bioseka"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uab "Bioseka" filed Critical Uab "Bioseka"
Priority to LT2013109A priority Critical patent/LT6214B/lt
Priority to PCT/IB2014/065084 priority patent/WO2015052630A1/en
Publication of LT2013109A publication Critical patent/LT2013109A/lt
Publication of LT6214B publication Critical patent/LT6214B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide

Abstract

Šis išradimas yra iš mikrobiologijos srities. Išradimas siūlo priešprasminius oligonukleotidus (PO), farmacines kompozicijas, apimančias PO, būdą slopinti bakterinių bioplėvelių atsiradimą ir augimą žmogaus kardiovaskuliniuose audiniuose ir žmogaus kraujo terpėje, siekiant aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijos ir gydymo.

Description

Šis išradimas yra mikrobiologijos srities ir yra susijęs su bakterinių bioplėvėlių atsiradimu ir augimu žmogaus kardiovaskuliniuose audiniuose ir kraujo terpėje. Šis išradimas konkrečiai susijęs su bakterinių bioplėvėlių sukeltos aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencija ir gydymu, panaudojant priešprasminius oligonukleotidus ir jų farmacines kompozicijas.
Išradimo pagrindas
Širdies ir kraujagyslių ligos yra vienos iš dažniausių mirties priežasčių pasauliniu mastu (S. Mendis, P. Puška, B. Norrving. Global Atlas on cardiovascular disease prevention and control. VVorld Health Organization, Geneva (2011), p. 8-14). Šių ligų spektras yra labai platus ir apima tokias sunkias, gręsiančias gyvybei būkles kaip išeminę (koronarinę) širdies ligą, miokardo infarktą bei insultą. Fundamentinė to priežastis - aterosklerozė, kada dėl susidariusių aterosklerozinių plokštelių susiaurėja arterinių kraujagyslių spindis. Savo ruožtu, aterogenezės priežastys yra kompleksinės įskaitant hiperlipidemiją, padidėjusį kraujo krešėjimą, oksidacinį stresą, kraujagyslių endotelio disfunkciją, taip pat infekciją ir uždegimą, pažeidžiantį kraujagyslių sieneles.
Remiantis žinomais ir pripažintais moksliniais tyrimais infekcijos veiksnys aterogenezėje yra labai reikšmingas, ypač turint omeny tuos mikroorganizmus, kurie sudaro normaliąją žmogaus mikroflorą (Koren ir kt. Human orai, gut and plaque microbiota in patients with atherosclerosis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 108 [Suppl. 1] (2011), p. 4592-4598).
Vienas iš žmogaus kardiovaskulinės sistemos infekcijų šaltinių yra normaliąją žmogaus mikroflorą sudarantys streptokokai. Tarp jų išskirtinos rūšys yra S. mutans ir
S. sobnnus, įprastai randami žmogaus burnoje. Šių rūšių streptokokai be kita ko geba suformuoti vandenyje netirpią bakterinę bioplėvelę ant burnos audinių paviršiaus. Šių bakterijų formuojamos biologinės plėvelės struktūrinį karkasą sudaro netirpus polimeras - gliukanas, kurį iš sacharozės sintezuoja kelių tipų gliukoziltransferazės (Gtf) izofermentai, t. y. S. mutans GtfB ir GtfC bei S. sobrinus Gtfl (Bowen ir Koo. Biology of Streptococcus mutans-denved glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of canogenic biofilms. Caries Res. 45 (2011), p. 69-86). Gliukoziltransferazės lokalizuojasi ne tik ant bakterijų sienelės, bet ir yra išskiriamos j aplinką laisvoje formoje. Dėl šių fermentų veiklos S. mutans, S. sobrinus ir kitos burnos bakterijos gali tvirtintis praktiškai prie bet kokių paviršių, tarp jų žmogaus audinių, nes susidarantis gliukanas savo fizinėmis savybėmis yra labai lipni medžiaga. Todėl Gtf fermentai tapę svarbiu taikiniu kuriant įvairias farmakologiškai aktyvias medžiagas, slopinančias S. mutans bei S. sobrinus bakterijų adheziją.
Dėl kasdienių burnos audinių pažeidimų, kitų patologinių būsenų, taip pat atliekant medicinines intervencijas burnoje, sukeliančias reikšmingą bakteriemiją, S. mutans bei S. sobrinus patenka j žmogaus kraują ir kardiovaskulinę sistemą (Nakano ir kt. Streptococcus mutans and cardiovascular diseases. J. Dent. Sci. Rev. 44 (2008), p. 29-37).
Žmogaus kraujyje yra gryna forma randami gliukozės monomerai, kurią S. mutans bei S. sobrinus, taip pat jų išskiriamos gliukoziltransferazės gali panaudoti gliukanų sintezei. Bakterijų išskiriamos gliukoziltransferazės iš kraujo gliukozės gali sintezuoti šį lipnų polimerą, prilimpantį prie kraujagyslių sienelių ir tampantį adhezijos židiniais trombocitams ir jų agregacijai kardiovaskuliniuose audiniuose.
Žinomais ir plačiai pripažintais moksliniais tyrimais nustatyta, kad žmogaus širdies vožtuvų audiniuose bei aterosklerozinėse plokštelėse S. mutans aptinkamas labai dideliu dažniu - 65% ir 75% atvejų atitinkamai (Nakano ir kt. Detection of cariogenic Streptococcus mutans in extirpated heart valve and atheromatous plaųue specimens. J. Clin. Microbiol. 44 (2006), p. 3313-3317; Nakano ir kt. Detection oforal bacteria in cardiovascular specimens. Orai Microbiol. Immunol. 24 (2009), p. 64-68). Be to, S. sobrinus taip pat identifikuojamas aterosklerozinėse plokštelėse, tačiau mažesniu dažniu. Tai rodo, kad šie burnos streptokokai yra susiję su aterosklerozės patogeneze.
S. mutans ir S. sobrinus vaidmuo aterosklerozės raidoje susijęs su šių bakterijų išskiriamų gliukoziltransferazių veikla - gliukano sinteze. Tyrimais nustatyta, kad S. mutans padermės, turinčios defektus gtfB ir gtfC genuose, pasižymi ryškiai mažesnėmis savybėmis sukelti trombocitų agregaciją kraujyje palyginus su normaliomis („laukinėmis“) S. mutans bakterijomis (Taniguchi ir kt. Defect of glucosyltransferases reduces platelet aggregation activity of Streptococcus mutans: Analysis of clinical strains isolatedfrom orai cavities. Arch. Orai Biol. 55 (2010), p. 410416). Taigi streptokokų gliukoziltransferazių raiškos slopinimas praktiškai yra svarbus ne tik dantų ėduonies, bet ir širdies bei kraujagyslių ligų prevencijai.
Čia aprašytas patentuojamas išradimas pateikia būdą kaip užslopinti ir/arba sumažinti S. mutans ir S. sobrinus bakterinės plėvelės formavimąsi žmogaus kardiovaskuliniuose audiniuose ir kraujo terpėje, tame tarpe kraujo serume. Šis metodas remiasi priešprasminių oligonukleotidų (PO), selektyviai slopinančių S. mutans gftB ir gtfC bei S. sobrinus gtfl genų raišką, panaudojimu. Taip slopinant gliukoziltransferazių ir tolimesnėje pasėkoje gliukano sintezę. Gliukano sintezės inhibicija užkerta kelią bakterinės bioplėvelės susidarymui, kurie savo ruožtu sąlygoja aterosklerozės bei S. mutans ir S. sobrinus sukeltų kardiovaskulinių infekcijų, tokių kaip bakterinis endokarditas, profilaktiką bei prevenciją, taip pat aterosklerozinių plokštelių formavimosi slopinimą ir mažinimą.
Be to, išradime pateikiamas PO ir bakterinių bioplėvėlių sintezės slopinimo būdas panaudojamas įvairių paviršių besiliečiančių su žmogaus krauju ir audiniais, pvz., vamzdelių, kateterių, dializės membranų, zondų, vožtuvų, protezų, implantų ir pan., apdorojimui, siekiant antibakterinio poveikio nukreipto į S. mutans ir S. sobrinus bakterijas, patekusias ant tokių paviršių. Paminėtina, kad bakterijos patekusios ant šių paviršių, pvz., kateterių, implantų ar protezų, sintezuojamų gliukanų pagalba tvirtai prilimpa ir suformuoja bakterines bioplėveles, kurios apriboja organizmo imuninės sistemos galimybes sunaikinti bakterijas. Bakterijų suformuotos bioplėvelės ant vamzdelių, kateterių, dializės membranų, zondų skatina aterosklerozės židinių formavimąsi kraujotakos sistemoje, tuo tarpu bakterinės bioplėvelės ant širdies vožtuvų arba kaulų ar sąnarių implantų sąlygoja uždegiminius procesus ir implantų atmetimą, taip sukeldamos ypatingai sudėtingas ir gyvybei pavojingas patologines būkles.
Apibendrinant išdėstytą, patentuojami PO ir būdas kompleksiškai sprendžia aterosklerozės, kardiovaskulinių ir susijusių infekcijų profilaktikos, prevencijos ir gydymo problemas.
Išradimo esmė
Kaip aptarta aukščiau, yra aktualus poreikis spręsti aterosklerozės, kardiovaskulinių ir susijusių infekcijų profilaktikos, prevencijos ir gydymo problemas, kurias sukelia bakterijos patekusios į kraujotakos sistemą, į kardiovaskulinius audinius ir kitus objektus kurie kontaktuoja su krauju ir kardiovaskulinės sistemos audiniais. Šis išradimas apima medžiagas ir būdą, kurie sprendžia šias problemas, ypač bakterinių bioplėvelių ir bakterinių gliukanų sąlygojamą aterosklerozės vystymąsi bei kardiovaskulinės sistemos infekcijas.
Pagrindinis patentuojamas išradimo objektas yra medžiaga - izoliuoti priešprasminiai oligonukleotidai (PO), atitinkantis šiuos požymius:
a) PO sudaryti iš nukleotidų sekų pagal SEQ ID nr. 1,13,19;
b) PO sudaryti iš nukleotidų sekų, kurie yra SEQ ID nr. 1, 13, 19 fragmentai;
arba
c) PO, kurių nukleotidų sekos ne mažiau kaip 85% sutampa su sekomis nurodyta SEQ ID nr. 1, 13,19.
Taip pat išradimo objektas yra PO, kurių nukleotidų sekos skiriasi nuo SEQ ID nurodytos SEQ ID nr. 1, 13, 19, vienu, dviem, trim arba keturiais nukleotidais, tarp jų PO fragmentai, kurių nukleotidų sekos parinktos iš šių sekų grupės: SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24.
PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, gali būti konjuguoti su peptidu palengvinančiu prasiskverbimą per bakterijos ląstelės sienelę.
Taip pat išradimo objektas yra PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, panaudojami aterosklerozinių plokštelių ir/ar židinių susiformavimo profilaktikai, prevencijai, slopinimui ir mažinimui žmogaus kardiovaskuliniuose audiniuose ir/ar kraujo terpėje, kurios komponentas yra kraujo serumas.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, skirta biofarmaciniam ir medicininiam panaudojimui.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, tarp jų biofarmacijoje naudojami adjuvantai ir/ar nešėjai.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, kurioje naudojamas nešėjas yra katijoninis polimeras.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, skirta aterosklerazės gydymui ar prevencijai.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, skirta bakterinio endokardito gydymui ar prevencijai.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, skirta paviršių besiliečiančių su žmogaus krauju ir audiniais, pvz., vamzdelių, kateterių, dializės membranų, zondų, vožtuvų, protezų, implantų ir pan., apdorojimui, siekiant antibakterinio poveikio nukreipto į S. mutans ir S. sobrinus ant tokių paviršių.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, skirta paviršių besiliečiančių su žmogaus krauju ir audiniais, pvz., vamzdelių, kateterių, dializės membranų, zondų, vožtuvų, protezų, implantų ir pan., apdorojimui, aterosklerozinių plokštelių ir/ar židinių susiformavimo profilaktikos, prevencijos, slopinimo ir mažinimo ant tokių paviršių.
Taip pat išradimo objektas yra biofarmacinė kompozicija, kurią sudaro PO, bet kuria iš aukščiau nurodytų formų, ir kitos dalys, skirtas paviršių besiliečiančių su žmogaus krauju ir audiniais, pvz., vamzdelių, kateterių, dializės membranų, zondų, vožtuvų, protezų, implantų ir pan., apdorojimui, siekiant sumažinti bakterinių bioplėvelų atsiradimą ir augimą.
Galiausiai išradimas apima S. mutans ir S. sobrinus bakterijų kolonijų kontrolės būdą, kuris apima šių bakterijų gebėjimo sintetinti bioplėvelių karkasą sudarančių egzopolisacharidų slopinimą, panaudojant PO, specifiškai ir vienu metu slopinančio gtfB ir gtfC iRNR raišką S. mutans bakterijoje ir gtfl iRNR raišką S. sobrinus bakterijoje, administravimą, taip vienu metu slopinant šių bakterijų gebėjimą sintezuoti vandenyje netirpių gliukanų ir dalinai vandenyje tirpių gliukanų polimerus.
Iliustracijų aprašymas
Fig. 1 rodo nukleotidų SEQ ID nr. 14 fragmentą:
5'UCUGUUAAGAUUAAGCAAUGGUCUGCCAAGUACUUUAAUGGGACAAAUAU
UUUAGGGCGCGGAGCAGGCUAUGUCUUAAAAGA-3', pateiktą originaliame Mfold programos formato rezultatuose, prognozuojančiuose S. mutans gtfB iRNR antrinės struktūros modelį su apibrėžta priešprasminio oligonukleotido prisijungimo sritimi. Kaip matoma šiame modelyje, apibrėžta sritis turi rutulinę kilpą, kuri yra sudaryta iš nesuporuotų nukleotidų (5'-UAAGCA-3'), lemiančių tai, kad pasirinkti PO gali būti stiprūs konkurentai beteroduplekso formavimesi. Simboliai „—
----“ ir „\” reiškia sąryšį tarp atitinkamų nukleotidų ir jie yra panaudoti geresniam rutulinių ir smeigtukinių kilpų atvaizdavimui. Kaip parodyta Fig. 1, gtfB iRNR sritis prasideda nuo 3049 nt, o apibrėžta PO prisijungimo vieta prasideda nuo 3056 nt - tai yra taip pat kaip ir S. mutans gtfB gene (žr. 1 pavyzdį).
Fig. 2 (fig. 2a, 2b ir 2c) rodo stikliuko su S. mutans kultūros bioplėvele optinį paviršiaus profilį po 24 vai. inkubacijos su skirtingais poveikiais Todd Hewitt buljone, turinčiame 1% sacharozės:
fig. 2a - bioplėvelės paviršiaus optinis profilis esant PO1 + TurboFect™ poveikiui;
fig. 2b - bioplėvelės paviršiaus optinis profilis esant PO2 + TurboFect™ poveikiui;
fig. 2c - bioplėvelės paviršiaus optinis profilis esant PO3 + TurboFect™ poveikiui. Padidinimas *50. 1 lentelėje taip pat pateikti duomenys, susiję su Fig. 2
Fig. 3 rodo S. mutans kultūrų, augančių Todd Hewitt buljone be sacharozės (fig. 3a ) ir su 1% sacharozės (fig. 3b, 3c, 3d), optinius tankius 24 vai. poveikiuose su nukleazių neturinčiu vandeniu (fig. 3a, 3b, 3c), TurboFect™ reagentu (fig. 3a, 3b) arba abiejų kartu (fig. 3b, 3d), tik su PO (fig. 3c ) arba jų kombinacija su TurboFect™ (fig. 3d).
Simboliai: ♦, terpė be bakterijų ir poveikių; , nepaveiktos bakterijos; ▲, nukleazių neturintis vanduo; O, TurboFect™; ·, nukleazių neturintis vanduo + TurboFect™; O, PO1 arba PO1 + TurboFect™; χ, PO2 arba PO2 + TurboFect™; *, PO3 arba PO3 + TurboFect™.
Fig. 4 rodo Gramo būdu dažytų S. mutans bakterijų morfologiją po 24 vai.
inkubacijos Todd Hewitt buljone esant skirtingiems poveikiams: fig. 4a - bakterijos, augančios terpėje be sacharozės; fig. 4b - bakterijos, augančios terpėje su 1% sacharozė;
fig. 4c - bakterijos esant PO1 + TurboFect™ poveikiui Todd Hevvitt buljone su
1% sacharozė;
fig. 4d - bakterijos esant PO2 + TurboFect™ poveikiui Todd Hevvitt buljone su
1% sacharozė;
fig. 4e - bakterijos esant PO3 + TurboFect™ poveikiui Todd Hevvitt buljone su
1% sacharozė. Padidinimas *100 (imersinė sistema).
Fig. 5 rodo S. mutans kultūrų, augančių Todd Hevvitt buljone be sacharozės, optinius tankius 24 vai. poveikiuose su nukleazių neturinčiu vandeniu (fig. 5a, 5b), TurboFect™ reagentu (fig. 5a) arba abiejų kartu (fig. 5a, 5c), tik su PO (fig. 5b) arba jų kombinacija su TurboFect™ (fig. 5c).
Simboliai: ♦, terpė be bakterijų ir poveikių; , nepaveiktos bakterijos; ▲, nukleazių neturintis vanduo; O, TurboFect™; ·, nukleazių neturintis vanduo + TurboFect™; O, PO1 arba PO1 + TurboFect™; x, PO2 arba PO2 + TurboFect™; *, PO3 arba PO3 + TurboFect™.
Fig. 6 rodo gliukoziltransferazės genų daugybinę sekų palyginamąją atranką tarp įvairių Streptococcus rūšių ir padermių atliktą panaudojant MAFFT programos internetinj serverį, esantį Max Planck Institute for Development Biology. Konservatyvi tikslinė sritis (sudaryta iš 26 nukleotidų: 5'-GTTAAGATTAAGCAATGGTCTGCCAA-3', turinti SEQ ID nr. 16) yra apibrėžta dideliame stačiakampyje, o nesutapimai yra apibrėžti mažuose stačiakampiuose. Paveiksle nurodytos Streptococcus rūšys ir padermės yra šios:
ENA|AAN58705|AAN5870_0/1-4431 - Streptococcus mutans UA159 gliukoziltransferazė-l;
ENA|AAN58706|AAN5870_1/1-4368 - Streptococcus mutans UA159 gliukoziltransferazė-SI;
ENA|D88654|D88654.1_2/1-5684 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka, klonas:PYT216;
ENA|D88660|D88660.1_3/1-5684 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka, klonas: PYT223;
ENA|D89977|D89977.1_4/1-5684 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka, klonas:PTH1;
ENA|D88657|D88657.1_5/1-5686 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka, klonas: PYT239;
ENA|M17361|M17361.1_6/1-10029 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazių (gtfB ir gtfC) genai, pilnos koduojančios sekos;
ENA|D88651|D88651.1_7/1-5684 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka, klonas:PSK6;
ENA|AB299801 |AB29980_8/1 -4410 - Streptococcus criceti gtfl gliukoziltransferazėsI genas, pilna koduojanti seka;
ENA|AB273728|AB27372_9/1-4930 - Streptococcus criceti gtfl gliukoziltransferazėsI genas, pilna koduojanti seka, padermė: GTC242;
ENA|AB355819|AB35581_10/1-4602 gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka;
ENA|AB275384|AB27538_11/1-5423 gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka;
Streptococcus dentirousetti gtfl gtfl
Streptococcus dentisuis
Streptococcus orisuis gtf
ENA|AB272987|AB27298_12/1-4984 gliukoziltransferazės genas, pilna koduojanti seka;
ENA|D63570|D63570.1_13/1-6838 - Streptococcus sodrinus gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka;
ENA|M17391|M17391.1_14/1-4995 - Streptococcus downei gliukoziltransferazės geno pirmtakas, pilna koduojanti seka.
Fig. 7 rodo gliukoziltransferazės genų daugybinę sekų palyginamąją atranką tarp įvairių Streptococcus rūšių ir padermių, aptinkamų žmogaus organizme, atliktą panaudojant MAFFT programos internetinj serverį, esantį Max Planck Institute for Development Biology. Konservatyvi tikslinė sritis (sudaryta iš 26 nukleotidų: 5'9
CGCGTCATGTTTGAAGGTTTCTCTAA-3', turinti SEQ ID nr. 18) yra apibrėžta stačiakampyje. Fig. 7 nurodytos Streptococcus rūšys ir padermės yra šios:
ENA|AAN58705|AAN5870_0/1-4431 - Streptococcus mutans UA159 gliukoziltransferazė-l;
ENA|AAN58706|AAN5870_1 /1-4368 - Streptococcus mutans UA159 gliukoziltransferazė-SI;
ENA|D88654|D88654.1_2/1-5684 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka,klonas:PYT216;
ENA|D88660|D88660.1_3/1-5684 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka, klonas:PYT223;
ENA|D89977|D89977.1_4/1-5684 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka, klonas:PTH1;
ENA|D88657|D88657.1_5/1-5686 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka, klonas:PYT239;
ENA|M17361|M17361.1_6/1-10029 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazių (gtfB ir gtfC) genai, pilnos koduojančios sekos;
ENA|D88651|D88651.1_7/1-5684 - Streptococcus mutans gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka, klonas:PSK6;
ENA|D63570|D63570.1_13/1-6838 - Streptococcus sobrinus gliukoziltransferazės-l genas, pilna koduojanti seka.
Fig. 8 rodo stikliuko su maišytos S. mutans ir S. sobrinus kultūros bioplėvelės optinį paviršiaus profilį po 24 vai. inkubacijos su skirtingais poveikiais Todd Hewitt buljone, turinčiame 10% kraujo serumo ir 1% sacharozės:
fig. 8a - bioplėvelės paviršiaus optinis profilis nesant poveikiams;
fig. 8b - bioplėvelės paviršiaus optinis profilis esant PO1 + TF (TurboFect™) poveikiui;
fig.8c - bioplėvelės paviršiaus optinis profilis esant PO3 + TF (TurboFect™) poveikiui. Padidinimas χ50.
Fig. 9 rodo maišytos S. mutans ir S. sobrinus kultūros bioplėvelės kiekius susidariusios ant stikliuko paviršiaus, po 24 vai. inkubacijos su skirtingais poveikiais
Todd Hewitt buljone, turinčiame 10% serumo ir 1% sacharozės:
fig. 9a - bioplėvelės paviršiaus šiurkštumo parametras Rq; fig. 9b - bioplėvelės storis.
Kontrolė - stikliuko paviršius po 24 vai. inkubacijos Todd Hewitt buljone, turinčiame 10% kraujo serumo ir 1% sacharozės, tačiau be bakterijų; nepaveiktos bakterijos (fig. 9a, 9b juodas stulpelis) - tai yra bakterijos, inkubuotos 24 vai. Todd Hewitt buljone su 10% serumo, tačiau be sacharozės ir poveikių; nepaveiktos bakterijos (fig. 9a, 9b baltas stulpelis) - tai yra bakterijos, inkubuotos 24 vai. Todd Hewitt buljone su 10% serumo ir 1% sacharozės, tačiau be poveikių; PO + TF - tai yra priešprasminis oligonukleotidas + TurboFect™ reagentas. Reikšmės (n = 6 [šiurkštumas Rqj; n = 5 [storis]) yra nurodytos kaip vidurkiai ± standartinė vidurkio paklaida. *p < 0,05 palyginus su nepaveiktomis bakterijomis (baltas stulpelis), **p < 0,05 palyginus su PO3 + TF.
Sąvokų apibrėžimai
Šiame dokumente naudojama sąvoka “priešprasminis poveikis” reiškia oligonukleotido poveikį, kuris susidaro po to kai sudaromas junginys su papildoma seka, esančia iRNR, lemiantis specifinį geno raiškos ir baltymo transliacijos slopinimą.
Šiame dokumente naudojama sąvoka priešprasminiai oligonukleotidai (PO) apibūdina preparatus, kurie yra chemiškai modifikuotos arba nemodifikuotos viengubos nukleorūgšties molekulės (paprastai 15-30 nt ilgio), galinčios selektyviai jungtis su savo taikiniu iRNR sekoje pagal VVatson-Crick susiporavimo principą. POiRNR heterodupleksų formavimasis sąlygoja šiuos efektus:
1) aktyvuojama RNazė H endonukleazė arba bakterijų endoribonukleazės RNazė III ir RNazė E - lemiančios iRNR degradaciją, tačiau paliekant PO nepažeistą;
2) sąlygojama transliacijos inhibiciją per ribosomų veiklos sferinį blokavimą;
3) slopinamas iRNR susijungimas;
4) destabilizuojamas iRNR pirmtakas.
Kuris efektas pasireikš, priklauso nuo PO cheminės struktūros ir hibridizacijos vietos, tačiau vėlesni rezultatai yra konkretaus geno-taikinio raiškos ir baltymų transliacijos derereguliacija.
“Nukleotidų seka”, “nukleorūgštis“, „nukleorūgšties grandinė“ ir „nukleorūgšties seka“ reiškia, kad bet kas, kas jungiasi arba hibridizuojasi per bazių susijungimą įskaitant oligomerus arba polimerus, turinčius pagrindą, suformuotą iš natūraliai atsirandančių nukleotidų, tokių kaip DNR (dezoksiribonukleino rūgštis) arba RNR (ribonukleorūgštis) ir/arba nukleorūgšties analogai, susidedantys iš nestandartinių nukleobazių ir/arba nestandartinių karkasų, pavyzdžiui, peptidinė nukleorūgštis (PNR) arba užrakinta nukleorūgštis (UNR), arba be kokia išvestinė arba modifikuota nukleorūgšties forma, tame tarpe ir pakeitimai siekiant padidinti stabilumą ir atsparumą nukleazėms.
Šiame dokumente naudojama sąvoka “peptidinė nukleorūgštis“ arba „PNR“ reiškia sintetinį oligomerą arba polimerą, turintį poliamido pagrindą su prisijungusiomis nukleobazėmis (atsirandančiomis natūraliai arba modifikuojamomis), įskaitant, bet neapsiribojant, bet kokie oligomerų ar polimerų segmentai nurodyti ar įvardinti kaip peptidinės nukleorūgštys JAV Pat. Nr. 5539082, 5527675, 5623049, 5714331, 5718262, 5736336, 5773571, 5766855, 5786461, 5837459, 5891625, 5972610, 5986053, 6107470 6201103, 6228982 ir 6357163, VV096/04000, kurie visi yra įtraukti kaip nuorodos arba yra naudojami kaip nuorodos kituose cituotuose dokumentuose. Prisijungusi nukleobazė, pavyzdžiui, purino ar pirimidino bazė PNR gali būti prijungta prie karkaso naudojantis viena iš jungčių apibūdintų PCT/US02/30573 ar bet kurioje kitoje nuorodoje, esančioje šiame dokumente. Jame PNR turi N-(2-aminoetilo)-glicino) pagrindą. PNR gali būti susintetinta (ir vizualiai paženklinta) kaip minima PCT/US02/30573 arba jame cituotose nuorodose. PNR stipriai jungiasi ir tai atlieka specifinio eiliškumo tvarka, su DNR ir RNR, nes PNR karkasas neturi krūvio. Taigi, trumpi PNR zondai gali demonstruoti panašią specifiką su ilgesniais DNR ir RNR zondais. PNR zondai taip pat gali rodyti didesnį detalumą prisijungiant prie papildomos DNR ar RNR.
Šiame dokumente naudojama sąvoka „užrakinta nukleorūgštis“ arba „UNR“ reiškia oligomerą arba polimerą, sudarytą bent iš vieno ar kelių UNR subvienetų.
Šiame dokumente naudojama sąvoka „UNR subvienetas“ reiškia ribonukleotidą, kuriame yra metileno tiltas, jungiantis 2’-deguonies ribozę su 4’-anglimi (žr. Kurreck Antisense technologies. Improvement through novel Chemical modifications. (Eur J Biochem 270 (2003). 1628-1644 p.)).
Nukleino rūgščių ir nukleino rūgščių analogų pavyzdžiai, naudojam kaip izoliuotas PO, taip pat apima oligomerų ir nukleotidų monomerų polimerus, tarp jų dvigubi ir viengubi deoksiribonukleotidai (DNR), ribonukleotidai (RNR) tarp jų natūraliai susiformuojančios priešprasminės RNR molekulės, tokios kaip mikroRNR (miRNR) ir mažos trukdančios (interferuojančios) RNR (siRNR), randamos eukariotinėse ląstelėse, taip pat mažos priešprasminės RNR, randamos prokariotinėse ląstelėse (bakterijose), anomerinės jų formos, natūralūs ir sintetiniai analogai ir kita. Nukleorūgšties grandinė gali būti sudaryta vien tik iš deoksiribonukleotidų, ribonukleotidų, peptidinių nukleorūgščių (PNR), užrakintų nukleorūgščių (UNR), natūralių ar sintetinių analogų, tokių kaip fosforodiamidato morfolino ir tiofosforoamidato oligonukleotidai, ar jų mišiniai. DNR, RNR ir kitos natūralios ar šiame dokumente apibūdintos sintetinės nukleo rūgštys gali būti naudojamos metoduose ir išradimo kompozicijose.
Naudojant terminą „farmaciškai tinkamas“, pavyzdžiui, percituojant „farmaciškai tinkamas nešėjas“ arba „farmaciškai tinkamas priedas“ šiame dokumente norima pasakyti, kad medžiaga, kuri nėra biologiškai ar kaip nors kitaip nepageidaujama, t.y. medžiaga gali būti inkorporuota į farmacines kompozicijas, skiriamas pacientui, nesukeliant nepageidaujamų biologinių poveikių ar reaguojant į kitus komponentus, esančius kartu sudėtyje nesielgia žalingai. Be to, priedai ir nešėjai, esantys minimose sudėtyse, yra tinkami taikyti kardiovaskulinių audinių aplinkoje ir/ar kraujo terpėje nesukeliant jokio nepageidaujamo biologinio poveikio bei niekaip žalingai nereaguojant. Šiame dokumente yra pateikti tinkamų nešėjų ir priedų pavyzdžiai, kurių tarpe yra vanduo be nukleazių ar bet koks kitas reagentas, kurio pagalba yra suformuojamas kompaktiškas, stabilus, teigiamai įkrautas kompleksas su oligonukleotidu, skirtas saugoti nuo degradacijos ir padėti oligonukleotidui lengviau isiskverbti į bakterijų ląsteles, pavyzdžiui, komerciškai prieinamas TurboFect™ transfekcijos reagentas ir katijoninis polimeras (Thermo Fisher Scientific, Fermentas).
Šiame dokumente vartojama sąvoka „nukleazių neturintis vanduo“ reiškia sterilų dejonizuotą vandenį, kuriame nėra jokio tipo nukleazių, galinčių skaidyti oligonukleotidus.
Šiame dokumente vartojamas terminas „bioplėvelė“ reiškia bioplėvelę, sudarytą iš polisacharidų matricos, kurią sudaro daugiausia vandenyje netirpūs ir dalinai tirpūs gliukanai ir bakterijos, galinčios iš gliukozės monomerų sintezuoti polisacharidinius polimerus, sudarančius egzopolisacharidinę matricą.
Išsamus išradimo aprašymas
Kaip minima šiame dokumente, bakterijų kultūros gali būti tiek in vivo, tiek in vitro kultūros, jei nėra atskirai nurodoma, kokia būtent kultūra turima omeny. Minėtos kultūros gali būti suspenduotos ant kietų paviršių, tokių kaip stiklas (in vitro pavyzdys kietoje būsenoje) arba kraujagyslės sienelės audiniai (in vivo pavyzdys kietoje būsenoje) ar bet koks kitas kietas paviršius kardiovaskulinėje sistemoje, arba implantas ar kitoks paviršius kontaktuojantis su žmogaus audiniais ir krauju.
Kaip minėta anksčiau, išradimas parodo naują būdą, skirtą bioplėvelių, tokių kaip bioplėvelė, besiformuojanti iš burnos streptokokų, ypač S. mutans ir S. sobrinus, ir bioplėvelių junginių ant kietų paviršių, pavyzdžiui, stiklo ir kraujagyslių sienelių paviršių, formavimosi mažinimui, slopinimui ar kelio tam užkirtimui.
Šiam naujam būdui taikomas efektyvus priešprasminių oligonukleotidų (PO) poveikis, siekiant vienu metu nusitaikyti ir slopinti gliukozilransferazės iRNR išraišką kelių rūšių streptokokuose, ypač S. mutans ir S. sobrinus, tokių kaip gtfB ir gtfC glukoziltransferazės iRNR, esančias S. mutans ir gtfl iRNR S. sobrinus, lemiančių vandenyje netirpių ir iš dalies vandenyje tirpių gliukano polimerų gamybos ir bakterijų ląstelių sukibimo slopinimą S. mutans ir S. sobrinus kultūrose taip lemiant bioplėvelių mažinimą, slopinimą arba kelio užkirtimą jų formavimuisi. Minėtos kultūros gali būti in vitro kultūros arba in vivo kultūros, pvz., kardiovaskulinėje sistemoje arba ant kitų kietų paviršių kontaktuojančių su žmogaus audiniais ir krauju.
Išradime patentuojamų naujų PO sekų sąrašas ir aprašymas pateiktas 1 priede.
Minėti PO gali būti chemiškai sintetinami fosforotioatų formos oligodeoksiribonukleotidai, savo sekomis atitinkantys nukleotidų SEQ ID nr. 1, 13, 19 sekas, priešprasminio efekto eksponavimui, kaip parodyta pavyzdyje, arba bet kurios kitos PO formos, apibūdintos šiame dokumente, t.y., SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11, 12, 20, 21,22, 23, 24, arba išradimo specifikacijoje nurodytas sąlygas atitinkantys PO fragmentai ar modifikacijos.
Gliukanų, sudarančių bioplėvelės egzopolisacharidinę matricą, matavimas gali būti atliktas kaip aprašyta antrame ir penktame pavyzdžiuose, kur profilometrijos rezultatai aiškiai parodo, kad bakterijų adhezija prie stiklo paviršiaus yra stipriai sumažinama su PO molekulėmis, kurių nukleotidų seka atitinka SEQ ID nr. 1,13 arba
19.
Bioplėvelės formavimosi mažėjimas rodo gliukano polimerų sintezės mažėjimą nes gliukanai yra būtini bioplėvelių formavimuisi, o gliukanų nebuvimas lemia bioplėvelės nesiformavimą.
Gliukanų koncentraciją bakterinių ląstelių kultūrose taip pat galima išmatuoti naudojant kitus metodus, apibūdintus Guo ir kt. „Treatment of Streptococcus mutans with antisense oligodeoxyribonucleotides to gtfB mRNA inhibits GtfB expression and function“ (FEMS Microbial Lett 264 (2006), 8-14 p.) ir Masuko ir kt. „Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format“ (Anai Biochem 339 (2005) 69-72 p.).
Kitas šio išradimo naujumo ir išradimo lygio aspektas suteikia priemones naudoti tik vieno tipo (vienos nukleotidų sekos) PO, kurie efektyviai slopina tiek vandenyje tirpius, tiek iš dalies vandenyje tirpius gliukanus S. mutans užkoduotus gtfB ir gtfC genais ir taip pat S. sobrinus gtfl.
Šis naujas būdas leidžia naudoti vienus PO bakterinėse kultūrose tam, kad paveikti du taikinius - gtfB ir gtfC iRNR S. mutans ir tuo pačiu metu gliukoziltransferazės-l iRNR S. sobrinus.
Taikiniai minėtuose S. mutans ir S. sobrinus genuose bei atitinkamai iRNR yra konservatyvūs - koduojančios nukleotidų sekos šių bakterijų genuose yra nekintančios. Todėl PO panaudojimas sumažina bakterijų gebėjimą kitais būdais sintetinti vandenyje netirpius ir dalinai tirpius gliukanus, kad būtų galima sukurti bioplėvelės polimerinę matricą. Taikinių konservatyvumas parodytas ir pagrįstas Fig. 6 ir Fig. 7
Pagal šj išradimą nauji PO, kurie pasiekia priešprasminj efektą, gali būti chemiškai sintetinamos fosforotioatų oligodeoksiribonukleotidų sekos, atitinkančios nukleotidų sekas pagal SEQ ID nr. 1, 13, 19, arba gali būti bet kokia kita šiame dokumente apibūdinta PO forma, t.y., SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12, 20, 21,22, 23, 24, ar jų fragmentai ar modifikacijos.
Trumpesnės sekos (SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24) turi tokį patį nukleotidų (nt) išsidėstymą kaip ir PO su SEQ ID nr. 1, 13, 19, todėl jos gali būti savarankiškai naudojamos nustatytiems bakterijų genomo taikiniams tarp gtfB ir gtfC S. mutans, taip pat S. sodrinus gtfl genų ir iRNR. Dėl termodinaminių savybių (tokių pačių kaip ir su PO SEQ ID nr. 1, 13,19), šie trumpesni fragmentai atitinkamoje bakterijų genomo srityje gali formuoti heterodupleksus.
Pažymėtina, kad PO, turintis SEQ ID nr. 1, jungiasi su nesuporuotais nukleotidais esančiais rutulinėje kilpoje S. mutans iRNR gtfB kaip tai yra nurodyta Fig. 1 Analogiškai ilgesnės sekos PO (SEQ ID nr. 13) gali formuoti heterodupleksus numatytoje srityje ir papildo bei jungiasi rutulinėje kilpoje su nesuporuotais nukleotidais
S. mutans iRNR gtfB kaip yra apibrėžta fig. 1
Gausus literatūroje pristatytų tyrimų, atliktų in vitro ir in vivo sąlygomis, skaičius demonstruoja, kad nuo 8 nt iki 30 nt ilgio nukleotidų sekų PO būdingas priešprasminis poveikis. Net ir PO su vienu nesutampančiu nukleotidu taip pat būdingas stiprus priešprasminis poveikis (žr. Hamel ir kt. „Inhibition ofgene expression by anti-sense C-5 propyne oligonucleotides detected by a reporter enzyme“ (Biochem J 339 (1999), 547-553 p.); VVagner ir kt. „Potent and selective inhibition ofgene expression by an antisense heptanucleotide“ (Nat Biotechnol 14 (1996), 840-844 p.); Fakler ir kt. „Short antisense oligonucleotide-mediated inhibition is strongly dependent on oligo length and concentration būt almost independent oflocation ofthe target sequence“ (J Biol Chem 269 (1994), 16187-16194 p.); Woolf ir kt. „Specificity of antisense oligonucleotides in vivo“ (Proc Natl Acad Sci USA 89 (1992), 7305-7309 p.)).
PO sintezė
Šiame išradime nurodytos naujos PO sekos gali būti sintetinamos ir modifikuojamos įvairiais būdais. Fosforotioatų formos oligodeoksiribonukleotidai, kaip pavaizduota 2 pavyzdyje, gali būti naudojami kaip skirtingų formų PO. Tokie fosforotioatų formos oligodeoksiribonukleotidai skiriasi nuo nemodifikuotų oligodeoksiribonukleotidų tuo, kad vienas iš deguonies atomų fosfodiesterio jungtyje yra pakeičiamas sieros atomu. Fosforotioatų formos oligodeoksiribonukleotidai gali būti chemiškai sintetinami, pavyzdžiui, Metabion International AG (Vokietija) naudojant automatizuota DNR sintezatorių ir forforamiditinį metodą pagal plačiai žinomą standartinį protokolą (žr., G. Zon „Oligonucleoside Phosphorothioates“ Ed. S. Agrawal „Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties“ (methods Mol Biol 20 (1993), 165-189 p., Humama Press Ine., Totovva, NJ); Guzaev „Reactivity of 3H-1,2,4-diathiazole-3-thiones and 3H-1,2-dithiole-3-thiones as sulfurizing agents for oligonucleotide synffaes/s“ (Tetrahedron Lett 52 (2011), 434-437 p.); Sanghvi „A status update ofmodified oligonucleotides for chemotherapeutics applications“ (Curr Protoc
Nucleic Acid Chem Suppl. 46 (2011), Unit 4.1.1-4.1.22)).
Fosforotioatų formos PO sintezė susideda iš 4 etapų sintetinių ciklų.
Sintetinis fosforotioatų formos oligodeoksiribonukleotidų ciklas prasideda nuo nukleotido, prisitvirtinusio prie kietos atramos (stiklo ar polisterino rutuliuko), atblokavimo 3'-pozicijoje. Šis pirmasis etapas vadinamas detrityliacija ir yra skirtas pašalinti rūgščiai atsparią dimetoksitritylo apsauginę grupę iš 5’-hidroksilo atraminės nukleozidų grupės, naudojant rūgšties tirpalą iš dichloracto rūgšties tirpalo dichlormetane ar toluene.
Tolesnis etapas yra 5‘hidroksilo nukleozidų grupės sujungimas su įeinančiu foforamidiniu reagentu, aktyvuojamu su 1H- tetrazolu arba 4,5-dicianoimidazolu.
Gautas 3’, 5’-internukleosido fosfito jungtis yra sulfurizuojama (trečiasis etapas) su Ν,Ν,Ν’Ν’-tetraetyltiuram disulfidu, kad suteikti tiono fosfotriesterio jungtį. Kita vertus, sulfurizacija gali būti atlikta naudojant kitus reagentus, pavyzdžiui, fenilacetil sulfidą su 3-pikolinu, 3H-1,2- benzoditiol-3-vienas-1,1-dioksidą (Beaucage reagentą) arba N,N-dimetil-N’-(3-tiokso-3H-1,2,4-ditazol-5-yl) metanimidamidą.
Ketvirtame etape yra pasiekiamas nesureagavusios 5’-hidroksilo nukleozidų grupės ribojimas su acto rūgšties anhidrido ir N-metilimidazolą/2,6-lutidiną/acetonitrilą.
Šio keturių etapų sintezės ciklo rezultatas yra papildoma DNR bazė ir ciklas yra kartojamas tol kol sukuriama visa norimo ilgio seka pagal norimą PO seką.
Po sintezės ciklų baigimo oligodeoksiribonukleotidai lieka prisijungę prie atramos su visomis apsaugos grupėmis. Todėl, siekiant atskirti ir pašalinti apsaugą nuo šių bazinių neatsparių grupių (pvz., cianoetilo grupė ant fosfatų triesterio), tvirta atrama yra veikiama trietilamino acetonitrilo tirpalu, o po to amonio hidroksidu.
Po to, atramos yra pašalinamos filtracijos pagalba ir oligodeoksiribonukleotidai yra surenkami po amonio hidroksido išgarinimo. Galiausiai atliekamas susintetintų fosforotioatų formos oligodeoksiribonukleotidų išvalymas naudojant efektyvią skysčių chromatografiją (HPLC), nudruskinimą ir liofilizavimą.
PO nešėjai
Šiame dokumente minimi PO gali būti efektyviau transportuojami j S. mutans ir S. sobrinus bakterijas (t.y., įsiskverbti per bakterijų ląstelės sienelę) naudojant nešėjus. Nešėjas gali būti transfekcijos reagentai ir katijoniniai polimerai, kurie yra žinomi. Visų PO formų su nešėju ar transfekcijos reagentu, sudarytu iš katijoninio polimero, pavyzdžiui, TurboFect™ (Thermo Fisher Scientific, Fermentas) gali būti naudojama tam, kad padidinti bakterijų PO įsisavinimą ir efektyviai padidinti bioplėvelės formavimosi S. mutans ir S. sobrinus inhibiciją.
Fosforotioato formos PO SEQ ID nr. 1, 13, 19, naudojami bioplėvelės formavimosi slopinimui pademonstruoti ant kieto paviršiaus, parodant jų dėka pasiekiamą priešprasminį efektą. Toks pats efektas pasiekiamas ir su kitų formų PO, aprašytais šiame dokumente, pvz., SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24, arba jų fragmentais, arba jų modifikacijomis.
Kiti nešėjai, naudojami įvairioms PO formoms, skirti PO įterpimui į eukariotines ir prokariotines ląsteles, gali būti įvairios cheminės medžiagos, galinčios sudaryti kompleksus su izoliuotais oligonukleotidais tam, kad apsaugoti juos nuo degradacijos ir pagerinti jų skvarbą į ląsteles. Šios medžiagos apima, bet neapsiriboja, kalcio druskos (pvz., kalcio fosfatas, kalcio chloridas), katijoniniai lipidai (pvz., N-(2,3 dioleoiloksipropyl) N, N, N-trimetilamonio chloridas, dioleoilfosfatidiletanolaminas, cholesterolis), katijoniniai polimerai (pvz., dietilaminoetilo dekstranas, polietileniminas, chitozanas, ciklodekstrinas, poliamidoamino dendrimerai, polipropilenimino dendrimerai), į ląsteles prasiskverbiantys peptidai (peptidai, paprastai turintys mažiau nei 30 amino rūgščių; pvz., penetratinas) ir skirtingų tipų nanodalelės (žr. D. Liu ir kt. „Chemical Methods for DNA Delivery“, Ed., E. C. Heiser, Volume 1 of Gene Delivery to Mammalian Cells (Methods Mol Biol 245 (2004), 3-23 p., Mumana Press Ine., Totovva, NJ); Zhu ir Mahato „Lipid andpolymeric carrier-mediatednucleic acid delivery (Expert Opin Drug Deliv 7 (2010), 1209-1226 p.); Bai ir kt. „Antisense antibioties: a brief revievv ofnovel target discovery and delivery“ (Curr Drug Discov Technol 7 (2010), 7685 p.); Yu ir kt. „Targeted delivery systems for oligonueleotide therapeuties” (AAPS J 11 (2009), 195-203 p.); Aalinkeel ir kt. „Quantum rods as nanocarriers ofgene therapy“ (Drug Deliv 19 (2012), 220-231 p.). Visi šie transfekcijos reagentai, išskyrus kalcio fosfatą, kuris formuoja kalcio-fosfato-DNR nuosėdas, veikia panašiai - jie sudaro junginius su oligonukleotidais per elektrostatinę sąveiką tarp neigiamo krūvio oligonukleotidų molekulių ir teigiamo krūvio reagento molekulių. Kadangi tokie kompleksai išlaiko teigiamą krūvį, jie gali susijungti su neigiamo krūvio eukariotinių ląstelių plazmine membrana ar bakterijos ląstelės sienele ir gali būti įsisavinti ląstelių.
Plačiausiai naudojama transfekcijos reagentai PO pristatymui į bakterines ląsteles yra katijoniniai polimerai ir į ląsteles įsiskverbiantys peptidai, kurie yra naudojami visiems šiame dokumente minimiems PO, skirtingoms šiame dokumente minimoms PO formoms ir modifikacijoms. Svarbu akcentuoti, kad j ląsteles prasiskverbiantys peptidai yra pajėgūs įsiskverbti j ląsteles ne tik elektrostatinės sąveikos dėka, bet ir formuojant trumpalaikes poras ląstelių plazminėje membranoje (žr. Guo ir kt. „Treatment of Streptococcus mutans with antisense oligodeoxyribonucleotides to gtfB mRNA inhibits GtfB expression and function“ (FEMS Microbial Lett 264 (2006), 8-14 p.) efektyviam fosforotioatų formos PO pristatymas iki
S. mutans bakterijų naudojant katijonų polimerą - So-Fast™ (Taiyangma).
Atliekant šj išradimą pagrindžiančius tyrimus buvo taikomas žinomas ir rinkoje prieinamas transfekcijos reagentas TurboFect™ (Thermo Fisher Scientific, Fermentas). Šio katijoninio polimero pagalba PO su SEQ ID nr. 1, 13, 19 buvo įterpti į S. mutans ir S. sobrinus bakterijas, tuo pademonstruojant šio transfekcijos reagento efektyvumą, eksperimentiškai.
Panaudojimas
Šis išradimas visomis savo išraiškomis suteikia priemones ir būdus bioplėvelės formavimosi ant kietų paviršių slopinimui be žymios įtakos S. mutans ir S. sobrinus bakterijų gyvybingumui. Išradime nurodytas būdas ir PO suteikia galimybę administruoti PO, atitinkančius SEQ nr. 1, 13, 19 ar jo fragmentus, atitinkančius SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24, į bakterinę kultūrą naudojant efektyvią koncentraciją tam, kad sumažinti S. mutans ir S. sobrinus adheziją, tarpusavio sukibimą ir bioplėvelės formavimąsi, bet be baktericidinio (bakterijas naikinančio) poveikio, kaip tai aiškiai pademonstruota su S. mutans Fig. 5
Išradimas leidžia naudoti PO, kurių seka yra SEQ ID nr. 1, 13, 19, arba šiame dokumente apibūdintų PO fragmentus, arba PO modifikacijas, pasiekiant priešprasminj efektą, aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prefencijai ir kontrolei, be reikšmingo poveikio žmogaus mikrobiomui.
Kaip matoma 2-Fig. 5 ir 1 lentelėje, efektyvi PO koncentracija sumažina S. mutans ir S. sobrinus adheziją, bakterijų sukibimą ir bioplėvelės formavimąsi be išreikšto bakteriostatinio ir baktericidinio poveikio. 5 pavyzdyje specifiškai parodyta efektyvios PO koncentracijos poveikį kraujo terpėje (kraujo serume), tokiu būdu parodant poveikį ateroskrerozės židinių formavimuisi kardiovaskuliarinėje sistemoje, audiniuose ir kraujo terpėje.
Visų šiame dokumente nurodytų poveikių atžvilgiu šis išradimas atskleidžia naują būdą kontroliuoti ir užkirsti kelią bioplėvėlių židiniams kardiovaskulinėje sistemoje, audiniuose ir kraujo terpėje, naudojant PO, kurių sekos yra SEQ ID nr. nr. 1, 13,19, arba visų šiame dokumente nurodytų PO fragmentus ar PO modifikacijas, ir taip pasiekiant priešprasminj poveikį S. mutans ir S. sobrinus gliukoziltransferazių atžvilgiu. Šis naujas būdas suteikia įrankį bioplėvelės formavimosi slopinimui ant įvairių kietų paviršių, tarp jų kardiovaskulinių audinių, implantų, taip pat, kitų paviršių kontaktuojančių su žmogaus audiniais ir krauju.
Išrasti nauji PO, kurių sekos SEQ ID nr. nr. 1, 13, 19, arba visų šiame dokumente nurodytų PO fragmentai ar PO modifikacijos, gali būti naudojami kaip biofarmacinių kompozicijų (tirpalų, suspensijų ir pan.) dalys, gali būti įtraukti j biofarmacinių kompozicijų formules, suteikiant tiek vietinį, tiek sisteminį aktualų poveikį gyvam organizmui - žmogui, arba negyviems paviršiams kontaktuojantiems su gyvo organizmo audiniais ir krauju.
Šiame išradime atskleisti nauji PO, kurių sekos SEQ ID nr. 1, 13, 19, arba visi šiame dokumente nurodytų PO fragmentai ar PO modifikacijos, geba susijungti su atitinkamomis Streptococcus mutans genomo dalimis koduojančiomis gliukoziltransferazę B ir gliukoziltransferazę C, ir šių gliukoziltransferazių iRNR vienu metu, taip pat su gliukoziltransferazę I iRNR S. sobrinus ir tokiu būdu slopinti gliukanų gamybą, sumažinant bioplėvelės formavimąsi, taip užkertant kelią aterosklerozės ir infekcinių židinių formavimuisi.
Be to, šiame išradime atskleisti nauji PO, kurių sekos SEQ ID nr. 1, 13, 19, arba visi šiame dokumente nurodytų PO fragmentai ar PO modifikacijos, užkerta kelią bakterijų adhezijai ir prikibimui prie kietų paviršių, tuo pačiu metu nesumažinant bakterijų gyvybingumo. Šis aspektas suteikia galimybę naudoti pateiktus PO kaip medžiagą kovai su ateroskleroze ir kardiovaskulinėmis infekcijomis, kuri reikšmingai nepaveikia žmogaus organizme esančios bakterijų ekosistemos - mikrobiomo.
Patentuojamo išradimo tikslas yra suteikti priemones ir būdą bioplėvelės formavimosi slopinimui būtent kardiovaskuliarinėje sistemoje ir kraujo terpėje. Tikslas pasiekiamas veikiant šiame išradime apibrėžų PO molekulėms, kurios slopina gliukanų gamybą S. mutans ir S. sobrinus, vienu metu taikantis į abiejų rūšių bakterijų gliukanų sintezės mechanizmus, su vieno tipo PO molekule.
Teiginys „vieno tipo priešprasminio oligonukleotido molekulė“ yra naudojamas norint pabrėžti, kad pastraipoje aukščiau nurodytas priešprasminis poveikis yra pasiekiamas su viena ar keliomis molekulėmis, kurių oligonukleotidų seka yra pirmą kartą atskleista šiame išradime.
PO pateikiami kaip viena ar kelios šiame išradime žemiau pateikiamų sekų molekulės, t.y., PO, kurių sekos yra SEQ ID nr. 1, 13, 19, taip pat jų fragmentai ir modifikacijos (pvz, kurių sekos yra viena iš SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24), tokiu kiekiu, kuris yra efektyvus ir pakankamos atsižvelgiant j terpę ir konkrečią kompoziciją.
Šio išradimo rezultate sukurtų naujų PO, kurių sekos SEQ ID nr. 1, 13, 19, arba visi šiame dokumente nurodytų PO fragmentai ar PO modifikacijos (pvz., kurių sekos yra viena iš SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24), efektas in vitro atitiko in silico sumodeliuotą poveikį į S.mutans ir S.sobrinus. Minėtos PO sekos slopina S.mutans ir S.sobrinus gebėjimą sintezuoti bioplėvelės formavimuisi reikalingus gliukanus. Ne bioplėvelėje esančios bakterijos yra lengviau atpažįstamos ir eliminuojamos natūraliu keliu žmogaus imuninės sistemos.
Atitinkamai, šis išradimas suteikia būdą ir priemones bioplėvelės slopinimui, mažinimui, taip pat užkerta kelią bioplėvelės židinių ant kietų paviršių in vitro ir in vivo atsiradimui. Jei in vivo kietas paviršius yra žmogaus audinių dalis, pavyzdžiui kraujagyslės sienelė, šį metodą sudaro efektyvios PO dozės, kaip aprašyta šiame dokumente, įvedimas į žmogaus kraują, t.y., PO kurių sekos yra SEQ ID nr. 1, 13, 19, arba visi šiame dokumente nurodytų PO fragmentai ar PO modifikacijos (pvz., kurių seka yra viena iš SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24), kaip biofarmacinės kompozicijos sudėtinės dalys yra panaudojamos bioplėvelės sąlygojamų kardiovaskulinės sistemos patologijų susijusių su ateroskleroze ir/ar S.mutans ar S.sobrinus sukeltomis infekcijomis prevencija ir gydymas.
Technologija
Priešprasminė technologija suteikia keletą privalumų, lyginant su kitomis antibakterinėmis technologijomis, tarp jų pagrindiniai privalumai yra:
specifinis ir sinchroninis gtf iRNR S. mutans ir S. sobrinus slopinimas;
šiame išradime atskleistų PO sekų naudojimas analogiškiems taikiniams dviejų rūšių streptokokuose (S. mutans ir S. sobrinus)', išorinis panaudojimas siekiant S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelių inhibicijai ant negyvų paviršių, tokių kaip kateteriai, protezai ar implantai, siekiant maksimaliai sumažinti infekcijos ar atmetiko rizikas, taip pat sumažinti sisteminius šalutinius poveikius.
Šiame išradime atskleistas PO panaudojimo būdas ir PO, kurių sekos yra SEQ ID nr. 1, 13, 19, arba visi šiame dokumente nurodytų PO fragmentai ar PO modifikacijos (pvz, kurių seka yra viena iš SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24), slopina bioplėvelės formavimąsi ir tuo pačiu ligų ir patologijų, sukeltų bioplėvelės formavimosi, atsiradimą, pvz., aterosklerozė, infekcinis endokarditas, infekcinės ir uždegiminės reakcijos j implantuos ar protezus, jų atmetimo reakcijos ir pan.
Gliukanai, sudarantys S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelių egzopolisacharidus, yra sudaryti iš besikartojančių gliukozės monomerų vienetų ir yra sintetinami veikiant gliukoziltransferazių fermentinėms reakcijomis. Gliukanai gali būti netirpūs vandenyje, tirpūs vandenyje ir dalinai tirpūs vandenyje. Gliukanai tarnauja kaip polisacharidinė matrica bioplėvelei su keliomis funkcijomis:
1) didina bakterijų prisitvirtinimą ir tolesnį kaupimąsi ant audinių;
2) suteikia struktūrinį vientisumą ir bioplėvelės lipnumą;
3) didina bioplėvelės matricos adhezines savybes.
S. mutans gamina trijų rūšių gliukanų polimerus - netirpius vandenyje gliukanus su alfa (a)-1,3 gliukozidinėmis jungtimis, dalinai tirpius vandenyje turinčius a-1,3 ir a-1,6 gliukozidinių jungčių mišinį ir taip pat vandenyje tirpius gliukanus su a1,6 gliukozidinėmis jungtimis, kurie yra sintetinami atitinkamai GtfB, GtfC ir GtfD fermentų (baltymų). Yra trys genai - gtfB, gtfC ir gtfD, kurie koduoja atitinkamai GtfB, GtfC ir GtfD baltymus.
Atskiras šio išradimo tikslas ir naujumas yra vienu metu ir lygiagrečiai slopinti gliukoziltransferazės iRNR ir gtf genų raišką S. mutans ir S. sobrinus.
Gliukoziltransferazės iRNR ir gtf genų raiškos inhibicijos efektas, taip pat vandenyje netirpių ir dalinai tirpių gliukanų sintezės slopinimo efektas ir atitinkamai bioplėvelės formavimosi slopinimo efektas pasiekiamas, panaudojant tokių sekų PO:
SEQ ID nr.1 (5'-GCAGACCATTGCTTAATCT-3'), kurios veikimo išdava yra visiškas vandenyje netirpių gliukanų gamybos ir rezultate bioplėvelės formavimosi slopinimas.
SEQ ID nr.13 (5’-TTGGCAGACCATTGCTTAATCTTAAC-3') ir/arba SEQ ID nr.19 (5-TTAGAGAAACCTTCAAACATGACGCG-3), veikimo išdava yra analogiška SEQ ID nr. 1;
Taip pat analogiškas efektas kaip nurodyti aukščiau pasiekiamas veikiant PO sekų fragmentams ir modifikuotoms sekoms (pvz, kurių seka yra viena iš SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24).
PO gali būti specifinė sekos, kaip nurodyta SEQ ID nr. 1, 13, 19 arba tų sekų dalys ar fragmentai. Taip pat gali būti PO, kurių sekos yra SEQ ID nr. 1,13, 19 dalis ir fragmentas, pasirinkti iš šio sąrašo:
5'-CAGACCATTGCTTAATCT-3' (SEQ ID nr. 4)
5'-AGACCATTGCTTAATCT-3' (SEQ ID nr. 5)
5'-GACCATTGCTTAATCT-3' (SEQ ID nr. 6)
5'-GCAGACCATTGCTTAATC-3' (SEQ ID nr. 7)
5'-GCAGACCATTGCTTAAT-3' (SEQ ID nr. 8)
5'-GCAGACCATTGCTTAA-3' (SEQ ID nr. 9)
S'-CAGACCATTGCTTAATC-S' (SEQ IDnr. 10)
5'-AGACCATTGCTTAATC-3' (SEQ ID nr. 11)
S'-CAGACCATTGCTTAAT-S' (SEQ IDnr. 12)
5-TTGGCAGACCATTGCTTAATCTTAAC-3' (SEQ ID nr. 13)
5-GAAACCTTCAAACATGACGC-3' (SEQ ID nr. 20)
5-AAACCTTCAAACATGACGC-3' (SEQ IDnr. 21)
5'-GAAACCTTCAAACATGACGCG-3’ (SEQ ID nr. 22)
5-GAAACCTTCAAACATGACG-3' (SEQ ID nr. 23)
5'-AGAAACCTTCAAACATGACGC-3' (SEQ ID nr. 24)
PO, kurių seka yra SEQ ID nr. 15 yra gautas iš SEQ ID nr. 13, kuris yra 100% komplementarus 26 nt S. mutans gtfB, S. mutans gtfC genuose ir taip pat su vienu iš nesuderintų nukleotidų S. sobrinus gtfl regione (žr. 1 pavyzdį).
PO, kurių seka yra SEQ ID nr. nr. 1, yra optimizuota 19 nukleotidų molekulė, atsižvelgiant į termodinamines savybes reikalingas S. mutans gtfB ir gtfC, S. sobrinus gtfl iRNR slopinimui.
PO su SEQ ID nr. 1 yra gaunami iš SEQ ID nr. 13 ir yra sudarytas iš 19 nt:
5'-TTG-GCAGACCATTGCTTAATCT-TAAC-3' (pabraukta ir nurodyta 1 pavyzdyje). SEQ ID nr. 4-12 yra gaunami iš SEQ ID nr. 1.
PO su SEQ ID nr. 13 yra izoliuoti sintetiniai PO sudaryti iš 26 nt:
5'-TTGGCAGACCATTGCTTAATCTTAAC-3', su kuriais pasiekiamas priešprasminis efektas natūraliai DNR sekos SEQ ID nr. 14 daliai.
PO su SEQ ID nr. 19 yra izoliuoti sintetiniai PO sudaryti iš 26nt:
5'-TTAGAGAAACCTTCAAACATGACGCG-3', su kuriais pasiekiamas priešprasminis efektas natūraliai DNR sekai SEQ ID nr. 18.
SEQ ID nr. 20-24 yra gaunamos iš SEQ ID nr. 19.
Todėl bet koks PO fragmentai, net ir trumpesnis nei 26 nt seka atitinkantis SEQ ID nr. 1 arba SEQ ID nr. 13, arba SEQ ID nr. 19, kurie taip pat apima ir atitinka šiame dokumente apibrėžtus gliukoziltransferazių kodavimo regionus, turi priešprasminj poveikį ir patenka į šių išradimu apibrėžiamas (ir pareiškiamas patentavimui) PO formas, kurios efektas atitinka šiame išradime įvardintą būdą ir priemones.
Šiame išradime nurodyti izoliuoti PO gali būti izoliuoti iš natūralaus ar gamtinio šaltinio per išsgrynintą restrikcijos reakciją, taip pat gaminami sintetiniais būdais, t.y., sintetinami chemiškai arba gaminamas rekombinantiniu būdu ar naudojant genų inžineriją, ar polimerizacijos ir amplifikacijos metodus, pvz., polimerazės grandininę reakciją (PGR) ir PGR amplifikaciją ar kurį nors kitą metodą. PO taip pat gali būti paruoštas atliekant žinomus veiksmus ar kitus metodus, aprašytus šiame dokumente atsižvelgiant į šį išradimą.
Šiame išradime nurodytais PO gali būti bet kokios molekulės, pagrįstos atitinkamomis nukleotidų sekomis, kurios jungiasi ar jungiasi naudojant bazinį nukleotindų suporavimą, įskaitant oligomerus arba polimerus, turinčius pagrindą, suformuotą iš natūraliai paplitusių nukleotidų ir/arba nukleino rūgščių analogų, sudarančių nestandartines nukleobazes ir/arba nestandartinius pagrindus, pvz., peptidinė nukleorūgštis (PNR) arba užrakinta nukleorūgštis (UNR), arba bet kokios išvestinės nukleorūgščių formos, kaip parodyta šiame dokumente. PO gali turėti dalinį, pvz., 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ar netgi 90% natūraliai paplitusių nukleotidų, o likusieji, t.y. 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ar netgi 10% yra nukleorūgšties analogai, sudaryti iš nestandartinių nukleobazių ir/arba nestandartinių pagrindų, kaip nurodyta šiame dokumente naudojant PNR, UNR ar bet kokią kitą išvestinę nukleorūgšties formą. PO gali būti toliau chemiškai modifikuojamas. Tokios modifikacijos gali būti fosforotioatų formos oligodeoksiribonukleotidai, kaip parodyta šiame dokumente. Visos šiame dokumente pateiktos PO sekos gali būti chemiškai susintetintos kaip fosforotioatų formos oligodeoksiribonukleotidai.
Fosforotioatų oligonukleotidai yra normalios DNR variantas, kuriame vienas iš nesujungtų deguonies atomų yra pakeistas sieros atomu. Vidinės nukleotido jungtys (sulfurizacija) ženkliai sumažina endonukleazių ir eksonukleozių veiklumą, tame tarpe, nuo 5' iki 3' ir nuo 3' iki 5' DNR pol 1 egzonukleazės, nukleazės S1 ir P1, RNazės, serumo nukleazės ir gyvatės nuodų fosfodiesterazės. Fosforotioatų formos PO turi padidintą potencialą įsiskverbti per lipidų dvisluoksnį.
Dar kitos PO formos gali būti pagrįstos nukleotidais, kur bent vienas nukleotidas turi modifikuotą pagrindą padidinti susijungimo savybes ir/arba sumažinti endonukleazių ir egzonukleazių, tame tarpe, nuo 5' iki 3' ir nuo 3' iki 5' DNR pol 1 egzonukleazės, nukleazės S1 ir P1, RNazės, serumo nukleazės ir gyvatės nuodų fosfodiesterazės.
Pavyzdžiai pavyzdys - Priešprasminių oligonukleotidų sekos parinkimas gliukoziltransferazės raiškos slopinimui
Bioinformaciniai metodai ir rezultatai
Parenkant šiame išradime atskleistas naujas PO sekas, pirmiausiai buvo identifikuotos konservatyvios homologinės sritys burnos streptokokų gtf genuose.
Šiam tikslui pasiekti, pirmiausiai atlikta palyginamoji aminorūgščių sekų analizė tarp S. mutans GtfB baltymo ir kitų Gtf baltymų, esančių burnos streptokokuose. S. mutans (padermė UA159, Bratthall serotipas c, Amerikietiško tipo kultūrų kolekcijos (ATKK) nr. 700610) genomas yra visiškai sekvenuotas, o sekos yra patalpintos GenBank duomenų bazėje Nacionaliniame biotechnologijos informacijos centre (National Center for Biotechnology Information) (NCBI). Todėl naudojant S. mutans (padermė UA159) GtfB baltymo aminorūgščių sekas, kaip užklausą, buvo atlikta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) homologų paieška tarp visų žinomų baltymų (BLAST paslauga yra prieinama http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, ir atlikta 2013 m. kovo mėn.). Buvo atskleista, kad S. mutans (padermė UA159) GtfB baltymas turi didelio laipsnio identiškumą su S. mutans GtfC baltymu (padermė UA159), o taip pat su kitais Gtf (t.y. Gtfl) baltymais S. criceti, S. dentirousetti, S. dentisuis, S. dovvnei ir S. sobrinus bakterijose, atsakinguose už vandenyje netirpių gliukanų sintezę. Galiausiai šiuos baltymus sudarančios aminorūgščių sekos buvo atrinktos ir daugybinė sekų palyginamoji analizė buvo atlikta naudojant MAFFT programos internetinj serverį, esantį Max-Planck Institute for Development Biology (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/mafft, atlikta 2013 m. kovo mėn.). Taikant tokį metodą, buvo nustatyta konservatyvi sritis S. mutans (padermė UA159) GtfB baltymo aminorūgščių sekoje, kuri yra 100% homologiška su atitinkamomis sritimis S. mutans (padermė UA159) GtfC, S. criceti Gtfl, S. dentirousetti Gtfl, S. dentisuis Gtfl ir S. orisuis Gtf baltymuose. Atitinkamas koduojantis segmentas šiai sričiai S. mutans (padermė UA159) gtfB gene turi šią 26 nukleotidų (nt) seką:
5'-GTTAAGATTAAGCAATGGTCTGCCAA-3' (SEQ ID nr. 16). Kaip ir palyginamosios aminorūgščių sekų analizės atveju, šis S. mutans (padermė UA159) gtfB geno segmentas taip pat turi 100% homologines sritis S. mutans (padermė UA159) gtfC, S. criceti gtfl, S. dentirousetti gtfl, S. dentisuis gtfl ir S. orisuis gtf genuose. Be to, taip pat buvo rasta labai didelio identiškumo sritis, turinti tik dviejų nukleotidų nesutapimą, S. dovvnei gtf pirmtako ir S. sobrinus gtfl genuose. Remiantis geriausiais Primer3 programos (Primer3 paslauga buvo pasinaudota http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm. siekiant išanalizuoti termodinamiką ir kitus ypatumus heteroduplekso formavimosi metu, atlikta 2013 m. kovo mėn.) rezultatais, buvo parinkta 19 nt seka, komplementari aukščiau tekste nurodytai koduojančiai sričiai:
5'-AGATTAAGCAATGGTCTGC-3' (koduojančios srities seka [SEQ ID nr.17]
1111111111111111111
3'-TCTAATTCGTTACCAGACG-5' (komplementari seka) [SEQ ID nr. 1]
Eksperimentiniame darbe, atliktame remiantis šiais bioinformaciniais rezultatais, buvo panaudotas žemiau nurodytos sekos oligonukleotidas:
5'-GCAGACCATTGCTTAATCT-3’ [SEQ ID nr. 1]
Tikslios šio segmento vietos S. mutans (padermė UA159) ir S. sobrinus (padermė SL1) gtf genuose kartu su duomenimis, esančiais NCBI GenBank duomenų bazėje, yra pateikti originaliame formate žemiau:
1. S. mutans (padermė UA159) gtfB gene (čia nurodytam kaip gtfl)·.
GenBank accession no. gb ĮAE014133.1Į
Streptococcus mutans UA159, complete genome Length=2030921
Features in this part glucosyltransferase-I of subject seguence:
Query 1 1]
Sbjct 954167 1]
GCAGACCATTGCTTAATCT
GCAGACCATTGCTTAATCT [SEQ ID nr.
954149 [SEQ ID nr.
2. S. mutans (padermė UA159) gtfC gene (čia nurodytam kaip gtfSI): GenBank accession no. gb ĮAE014133.1Į
Streptococcus mutans UA159, complete genome
Length=2030921
Features in this part of subject sequence:
glucosyltransferase-SI
GCAGACCATTGCTTAATCT 19 [SEQ ID
1] lllllllllllllllllll
GCAGACCATTGCTTAATCT 958853 [SEO ID nr.
Query 1 nr.
Sbjct 958871 1]
3. S. sobrinus (padermė SL1) gtfl gene:
GenBank accession no. dbj ĮD63570.1Į
Streptococcus sobrinus gene for glucosyltransferase GTFI, complete cds
Length=6838
Query 1 GCAGACCATTGCTTAATCT
Sbjct 4079 GCAGACCATTGTTTAATCT [SEQ ID nr. 1]
III III III II III III I
4061 [SEQ ID nr. 15]
Vieno nukleotido neatitikimas SEQ ID nr. 1 yra pabrauktas.
Remiantis aukščiau pateiktais duomenimis, buvo sumodeliuotas PO efektas S. sobrinus gliukoziltransferazės iRNR raiškai slopinti, nes priešprasminis efektas išlieka nepriklausomai nuo vieno nesutampančio nukleotido, kuris yra apytiksliai sekos viduryje. S. mutans gtfB iRNR antrinės struktūros modeliavimas buvo atliktas naudojantis Mfold programa, esančia Rensselaer bioinformatikos internetiniame serveryje (http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold, naudota 2013 m. kovo mėn.) tam, kad įvertinti pasirinktų PO prisijungimo vietą. Dėl to buvo sugeneruota vienas šimtas iRNR modelių, iš kurių atrinktas patikimiausias konstrukcinis variantas, rodantis PO prisijungimo sritį (Fig.1).
Siekiant nustatyti konservatyvias homologines sritis tik tarp susijusių su žmogaus kardiovaskuline patologija burnos streptokokų - S. mutans ir S. sobrinus gliukoziltransferazės genų ir parinkti joms komplementarias PO sekas, iš Europos nukleotidų archyvo (European Nucleotide Archive) (ENA) buvo atrinktos šių bakterijų įvairių klinikinių padermių ir klonų gtf genų sekos, koduojančios vandenyje netirpių gliukanų sintezę (atranka atlikta 2013 m. rugsėjo mėn.). Po to, pasirinkus S. mutans (padermė UA159) gtfB geną kaip etaloną, buvo atlikta daugybinė šių sekų palyginamoji analizė naudojant MAFFT programos internetinį serverį, esantį Max-Planck Institute for Development Biology (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/mafft, atlikta 2013 m. rugsėjo mėn.). Taikant tokį metodą, S. mutans ir S. sobrinus gliukoziltransferazės genuose buvo identifikuota konservatyvi homologinė sritis, sudaryta iš 26 nt: 5'CGCGTCATGTTTGAAGGTTTCTCTAA-3' (SEQ ID nr. 18). Komplementari priešprasminė šiai sričiai seka (t.y. priešprasminis oligonukleotidas) turi tokį 26 nt eiliškumą: 5'-TTAGAGAAACCTTCAAACATGACGCG-3' (SEQ ID nr. 19). Tikslios šio segmento vietos S. mutans (padermė UA159) ir S. sobrinus (padermė SL1) gtf genuose kartu su duomenimis, esančiais NCBI GenBank duomenų bazėje, yra pateikti originaliame formate žemiau:
1. S. mutans (padermė UA159) gtfB gene (čia nurodytam kaip gtfiy.
GenBank accession no. gb ĮAE014133.2 Į
Streptococcus mutans UA159, complete genome Length=2032925
Features in this part of subject sequence:
glucosyltransferase-I
Query 1 TTAGAGAAACCTTCAAACATGACGCG 26 [SEQ
ID nr. 19] llllllllllllllllllllllllll
Sbjct 953618 TTAGAGAAACCTTCAAACATGACGCG 953593 [SEQ
ID nr. 19]
2. S. mutans (padermė UA159) gtfC gene (čia nurodytam kaip gtfSI)·.
GenBank accession no. gb ĮAE014133.2 Į
Streptococcus mutans UA159, complete genome Length=2032925
Feature in this part of subject seąuence: glucosyltransferase-SI
Query 1 TTAGAGAAACCTTCAAACATGACGCG 26 [SEQ
ID nr. 19] llllllllllllllllllllllllll
Sbjct 958322 TTAGAGAAACCTTCAAACATGACGCG 958297 [SEQ
ID nr. 19]
3. S. sobrinus (padermė SL1) gtfl gene:
GenBank accession no. dbj ĮD63570.1Į
Streptococcus sobrinus gene for glucosyltransferase GTFI, complete cds
Length=6838
Query 1 ID nr. 19]
TTAGAGAAACCTTCAAACATGACGCG 26 [SEQ
Sbjct 3530 ID nr. 19]
TTAGAGAAACCTTCAAACATGACGCG 3505 [SEQ
Panaudojant „AntiSense Design“ programą, esančią Integrated DNA Technologies internetiniame serveryje (http://eu.idtdna.com/Scitools/Applications/AntiSense/Antisense.aspx7source =menu. atlikta 2013 m. rugsėjo mėn.), aukščiau tekste minėtai sričiai (SEQ ID nr. 18) buvo optimizuotos papildomos komplementarios priešprasminės 19-21 nt ilgio sekos (t.y. priešprasminiai oligonukleotidai), kurios yra SEQ ID nr. 19 išvestinės: 5'-GAAACCTTCAAACATGACGC-3' (SEQ ID nr. 20) 5'-AAACCTTCAAACATGACGC-3' (SEQ ID nr. 21) 5-GAAACCTTCAAACATGACGCG-3' (SEQ ID nr. 22) 5'-GAAACCTTCAAACATGACG-3' (SEQ ID nr. 23) 5-AGAAACCTTCAAACATGACGC-3' (SEQ ID nr. 24) pavyzdys - Priešprasminių oligonukleotidų poveikis į bioplėvelės formavimąsi S. mutans kultūrose
Laboratoriniai metodai ir rezultatai
S. mutans padermė UA159 (Bratthall serotipas c), gauta iš Amerikietiško tipo kultūrų kolekcijos (ATKK nr. 700610), 24 vai. buvo kultivuota Todd Hewitt (TH) buljone (Difco) anaerobinėmis sąlygomis (95% N2 ir 5% CO2) esant 37 °C temperatūrai. Kultūros grynumas buvo patikrintas Mitis salivarius agare (Difco) ir Kolumbijos kraujo agare (E&O Laboratories). Po to, bakterinės kultūros optinis tankis (OT) buvo pakoreguotas iki 0,2 naudojant mikroplokštelių skaitymo spektrofotometrą (Dynex MRX) ir parinkus 630 nm bangos ilgį.
Prieš bakterijų išsėjimą, 24-ių šulinėlių plokščiadugnės polistireno ląstelių kultūrų plokštelės (Sarstedt) buvo užpildytos TH buljonu. Tada trys skirtingų sekų fosforotioato oligodeoksiribonukleotidai buvo pridėti j plokštelės šulinėlius (galutinė koncentracija - 10 μΜ) arba atskirai, arba kartu su transfekcijos reagentu TurboFect™:
1. PO1, turintis seką 5'-GCAGACCATTGCTTAATCT-3' (SEQ ID nr. 1), ir kuris naudojamas kaip bandomoji PO molekulė.
2. PO2, turintis seką: 5'-ACGCACTTTCTTGTCCAT-3' (SEQ ID nr. 2),ir kuris naudojamas kaip teigiamos kontrolės molekulė, nes yra žinomas ir įrodytas jo efektyvumas slopinant S. mutans gtfB geno raišką (žr. Guo ir kt. Treatment of
Streptococcus mutans with antisense oligodeoxyribonucleotides to gtfB mRNA inhibits
GtfB expression and function. FEMS Microbial. Lett. 264 (2006), 8-14 p.).
3. PO3, turintis seką 5'-ACTCGTATGCTACAGCTAT-3' (SEQ ID nr. 3), ir kuris naudojamas kaip neigiamos kontrolės molekulė, besiskirianti nuo bandomosios molekulės tuo, kad nukleotidų eiliškumas sekoje yra išmaišytas atsitiktine tvarka.
Šie PO buvo sintezuoti Metabion International AG (Vokietija), kaip pilnos fosforotioato formos oligodeoksiribonukleotidai, panaudojant 1 pmol sintezės skalę ir didelio efektyvumo skysčių chromatografijos gryninimą. Prieš eksperimentus, liofilizuoti PO buvo ištirpinti steriliame distiliuotame nukleazių neturinčiame vandenyje (Thermo Fisher Scientific, Fermentas), siekiant gauti pradinius koncentruotus tirpalus, turinčius 100 μΜ koncentraciją. Pagal reikalingumą, PO buvo derinami kombinacijoje su TurboFect™ reagentu atsižvelgiant į gamintojo protokolą - tai yra naudojant 2 pi reagento 1 pg oligonukleotidų ruošinio.
Pridėjus j plokšteles PO, S. mutans kultūros bakterijos buvo išsėtos j šulinėlius taip, kad gauti galutinį praskiedimą 1:100. Nedelsiant, sterilios 1 mm storio stiklo plokštelės, išpjautos iš standartinių mikroskopo objektinių stikliukų (76 * 26 mm; Thermo Fisher Scientific), buvo vertikaliai įdėtos j šulinėlius, o plokštelės inkubuotos anaerobinėmis sąlygomis papildomoms 2 vai. 37 °C temperatūroje. Paskui, sterilus sacharozės tirpalas buvo pridėtas j atitinkamus šulinėlius iki 1% galutinės koncentracijos, o plokštelės vėl inkubuotos anaerobinėmis sąlygomis (95% N2 ir 5% CO2) 37 °C temperatūroje dar papildomoms 22 vai. Šiame eksperimente skystos terpės (TH buljono) tūris vienam šulinėliui buvo 1 mL; šulinėliai tik su terpe (buljonu) be bakterijų buvo naudoti kaip „tuščia“ kontrolė; o nepaveiktos S. mutans bakterijos ir S. mutans bakterijos, paveiktos vien tik nukleazių neturinčiu vandeniu arba TurboFect™ reagentu, naudotos kaip eksperimentinės kontrolės.
Praėjus 24 vai. bendram inkubacijos laikotarpiui, stiklo plokštelės buvo ištrauktos iš šulinėlių, išdžiovintos ir toliau panaudotos S. mutans bioplėvelės analizei MicroXAM™ (ADE Phase Shift) optiniu profilometru. Tuo tikslu buvo atlikti penki matavimai (kiekvieno matavimo plotas - 200 χ 260 pm) per stiklo plokštelės vidurį nuo matomos bioplėvelės apačios iki viršaus panaudojant 50Χ objektyvą su priartinimo faktoriumi - 0,625. Papildomai, Gauso filtras (50 χ 50 pm) buvo parinktas ir pritaikytas tam, kad pašalinti paviršiaus formos klaidas ir banguotumą. Šioje analizėje buvo įvertintas keletas svarbių bioplėvelės paviršiaus šiurkštumo parametrų: St maksimalus skirtumas tarp paviršiaus viršutinių ir apatinių taškų (t.y. paviršiaus „viršūnių“ ir „slėnių“), Sa - vidurkio skirtumas tarp paviršiaus viršutinių ir apatinių taškų (t.y. paviršiaus „viršūnių“ ir „slėnių“), Sdr - bendras paviršiaus plotas (jeigu visi paviršiaus nelygumai būtų išlyginti) remiantis VVennenberg ir Albrektsson straipsniu Suggested guidelines for the topographic evaluation of implant surfaces (Int. J. Orai Maxillofac. Implants. 15 (2000), 331-344 p.). Šie paviršiaus parametrai atspindi bioplėvelės išsivystymo laipsnį arba „brandą“ - tai yra prisitvirtinusių bakterijų ir susiformavusių mikrokolonijų kiekį. Nustatytų paviršiaus parametrų statistinis reikšmingumas buvo įvertintas pritaikant One-Way ANOVA metodą su Tukey’s testu. Mažesnė už 0,05 p reikšmė buvo laikyta statistiškai reikšminga.
Taikant optinės profilometrijos metodą stiklo plokštelių su S. mutans bioplėvele paviršiaus analizei buvo atskleista, kad 1% sacharozės TH buljone žymiai padidina paviršiaus šiurkštumo parametrus - Sa ir St palyginus su švarios stiklo plokštelės paviršiumi, panaudotos šiame eksperimente kaip etaloninė kontrolė (p < 0,05) (1 lentelė). Šiuo atveju, tai rodo, kad 1% sacharozės terpėje stimuliavo bakterijų prisitvirtinimą (adheziją) prie stiklo plokštelės paviršiaus ir bioplėvelės formavimąsi (1 lentelė). Tačiau bandomoji PO1 molekulė (SEQ ID nr. 1) kombinacijoje su TurboFect™ reagentu ženkliai sumažino bioplėvelės formavimąsi ant stiklo plokštelės paviršiaus nepaisant buljone esančios 1% sacharozės (p = 0,06 [Sa parametras]). Svarbiausia, kad šis efektas buvo statistiškai reikšmingas palyginus su bakterijomis, paveiktomis PO2 (SEQ ID nr. 2) ir PO3 (SEQ ID nr. 3) kombinacijoje su TurboFect™ reagentu (p < 0,05 [Sa ir Sdr parametrai]), kaip tai matoma 1 lentelėje bei fig. 2a, 2b ir 2c. Remiantis šiais rezultatais galima daryti išvadą, kad bandomoji PO1 molekulė (SEQ ID nr. 1) efektyviai sumažina S. mutans adheziją ir bioplėvelės formavimąsi ant standaus paviršiaus (stiklo plokštelės) in vitro sąlygomis.
lentelė - Stiklo plokštelių su S. mutans bioplėvele paviršiaus parametrai
Poveikiai Sa pm St pm Sdr % Nuoroda j Fig. 2
Švari stiklo plokštelė (etaloninė kontrolė) 0,01 (0,00) 0,92 (0,53) 0,05 (0,02)
Nepaveiktos bakterijos be sacharozės 0,13 (0,03) 2,34 (1,12) 1,91 (1,38)
Nepaveiktos bakterijos + sacharozė 0,13 (0,04) 8,44 (4.03) 1,57 (0,95)
Nepaveiktos bakterijos + sacharozė + nukleazių neturintis vanduo + TurboFect™ 0,05 (0,03) 3,80 (2,25) 0,57 (0,40)
Bakterijos + sacharozė + PO1 0,27 (0.01) 7,27 (1,91) 10,09 (0,90)
Bakterijos + sacharozė + PO2 0,45 (0,04) 13,03 (1,93) 18,60 (2,24)
Bakterijos + sacharozė + PO3 0,14 (0,05) 5,74 (2,62) 1,11 (0,71)
Bakterijos + sacharozė + PO1 + TurboFect™ 0,07 (0,04) 6,94 (5,81) 0,99(1,37) Fig. 2a
Bakterijos + sacharozė + PO2 + TurboFect™ 0,31 (0,02) 7,99 (1,67) 10,08 (1,13) Fig. 2b
Bakterijos + sacharozė + PO3 + TurboFect™ 0,31 (0,02) 7,18 (0,64) 9,19(0,82) Fig. 2c
lentelė rodo stiklo plokštelių su S. mutans bioplėvele paviršiaus parametrus po 24 vai. inkubacijos esant skirtingiems poveikiams. Duomenys yra pateikti kaip 5 matavimų vidurkiai, o standartinės paklaidos yra pateiktos skliausteliuose.
pavyzdys - Priešprasminių oligonukleotidų poveikis j bakterijų agregaciją S. mutans kultūrose
Laboratoriniai metodai ir rezultatai
Eksperimento planas ir sąlygos buvo tokios pačios kaip aprašyta 2 pavyzdyje išskyrus tai, kad j užsėtas 24-ių šulinėlių plokšteles nebuvo įdėtos stiklo plokštelės. Pridėjus sacharozės, bakterijų agregacija buvo tikrinama spektrofotometriškai 3 vai. intervalais iki 14 vai., o po to - 24 vai. Tuo tikslu, paimtų bandinių optinis tankis (OT) buvo matuojamas naudojant mikroplokštelių skaitymo spektrofotometrą (Dynex MRX) ir parinkus 630 nm bangos ilgį. Be to, eksperimento pabaigoje (po 24 vai. bendro inkubacijos laikotarpio), iš plokštelės šulinėlių buvo paimti papildomi bandiniai tam, kad įvertinti S. mutans bakterijų morfologiją bei jų agregaciją pritaikant Gramo dažymo metodą ir šviesinę mikroskopiją su Leica DM500 mikroskopu.
Spektrofotometrinis bakterijų kultūrų, augančių plokštelės šulinėliuose, tikrinimas atskleidė, kad sacharozės pridėjimas ženkliai padidino OT 14 vai. ir 24 vai. palyginus su bakterijomis, augusiomis be sacharozės (fig. 3a ir 3b). Tai rodo, kad 1% sacharozės terpėje sukėlė bakterijų agregatų susidarymą dėl gliukano sintezės. Nei nukleazių neturintis vanduo, nei TurboFect™ reagentas neturėjo jokio ženklaus poveikio j šj procesą (fig. 3b). Tačiau poveikiai j bakterijas su bandomąja PO1 molekule (SEQ ID nr. 1) tiek atskirai, tiek ir kombinacijoje su TurboFect™ reagentu apytiksliai 1,5 karto sumažino OT lyginant su nepaveiktomis bakterijomis 24 vai., o tai žymi mažesnį bakterijų agregatų susiformavimą (fig. 3c ir 3d). Šis bandomosios PO1 molekulės (SEQ ID nr. 1) efektas toliau buvo patvirtintas dažant 24 vai. paimtus mėginius Gramo būdu. Kaip matoma fig.4b ir 4c, bandomoji PO1 molekulė (SEQ ID nr. 1) užslopino bakterijų agregatų susidarymą, o taip pat sumažino bakterijų grandinėlių ilgėjimą (buvo stebima daugiau paskirų bakterinių ląstelių) palyginus su nepaveiktomis bakterijomis. Priešingai, nei PO2 (SEQ ID nr. 2), nei PO3 (SEQ ID nr. 3) molekulės neturėjo tokio poveikio bakterijoms, augančioms TH buljone su 1% sacharozės (fig. 3c ir 3d, fig. 4d ir 4e). Todėl, sutinkant su šiais rezultatais, galima daryti išvadą, kad bandomoji PO1 molekulė (SEQ ID nr. 1) sumažina S. mutans bakterijų agregaciją, esant terpėje 1% sacharozės, ir netgi sumažina bakterijų grandinėlių ilgėjimą, o tai rodo užslopintą gliukanų gamybą.
pavyzdys - Priešprasminių oligonukleotidų poveikis j S. mutans bakterijų gyvybingumą
Laboratoriniai metodai ir rezultatai
Eksperimento planas ir sąlygos buvo tokios pačios kaip aprašyta 2 pavyzdyje išskyrus tai, kad j užsėtas 24-ių šulinėlių plokšteles nebuvo įdėtos stiklo plokštelės bei į TH buljoną nebuvo pridėta sacharozės. Praėjus pirminiam 2 vai. inkubacijos laikotarpiui, toliau bakterijų augimas buvo tikrinamas spektrofotometriškai 3 vai. intervalais iki 14 vai., o po to - 24 vai. Tuo tikslu, paimtų bandinių optinis tankis (OT) buvo matuojamas naudojant mikroplokštelių skaitymo spektrofotometrą (Dynex MRX) ir parinkus 630 nm bangos ilgį.
Spektrofotometrinis bakterijų kultūrų, augančių plokštelės šulinėliuose, tikrinimas atskleidė, kad nukleazių neturintis vanduo ir TurboFect™ reagentas nepaveikė normalaus bakterijų augimo proceso per visą 24 vai. inkubacijos laikotarpį (5A pav.). Poveikiai į bakterijas su PO1 (SEQ ID nr. 1), PO2 (SEQ ID nr. 2) ir PO3 (SEQ ID nr. 3) molekulėmis tiek atskirai, tiek ir kombinacijoje su TurboFect™ reagentu tik labai nežymiai sumažino bakterijų augimo kreives (OT) lyginant su nepaveiktomis bakterijomis (fig. 5b ir 5c). Remiantis šiais duomenimis, galima daryti išvadą, kad nei vienas iš panaudotų PO ženkliai neslopina S. mutans augimo - tai yra nemažina bakterijų gyvybingumo.
pavyzdys - Priešprasminių oligonukleotidų poveikis j bioplėvelės formavimąsi maišytuose S. mutans ir S. sobrinus kultūrose su kraujo serumu
Laboratoriniai metodai ir rezultatai
Siekiant įvertinti bandomosios PO1 molekulės (SEQ ID nr. 1) poveikį j bakterinės bioplėvelės formavimąsi in vitro terpėje, turinčioje pagrindinio kraujo sudėtinio komponento - serumo, buvo panaudotos maišytos S. mutans ir S. sobrinus kultūros. S. mutans padermė UA159 (Bratthall serotipas c) ir S. sobrinus padermė SL1, kurios gautos iš Amerikietiško tipo kultūrų kolekcijos (ATKK nr. 700610 ir ATKK nr. 33478 atitinkamai), 18 vai. buvo kultivuotos Todd Hevvitt (TH) buljone (Difco), turinčiame 10 % karščiu inaktyvuoto arklio serumo, anaerobinėmis sąlygomis (95% N2 ir 5% CO2) esant 37 °C temperatūrai. Kultūrų grynumas buvo patikrintas Mitis salivarius agare (Difco) ir Kolumbijos kraujo agare (E&O Laboratories). Po to, bakterinių kultūrų optinis tankis (OT) buvo pakoreguotas iki 0,2 naudojant mikroplokštelių skaitymo spektrofotometrą (Dynex MRX) ir parinkus 630 nm bangos ilgį.
Prieš bakterijų išsėjimą, 24-ių šulinėlių plokščiadugnės polistireno ląstelių kultūrų plokštelės (Sarstedt) buvo užpildytos TH buljonu su 10 % karščiu inaktyvuoto arklio serumu. Tada PO1 (SEQ ID nr. 1) ir PO3 (SEQ ID nr. 3) fosforotioato oligodeoksiribonukleotidai, sintezuoti Metabion International AG kompanijoje (Vokietija) panaudojant 1 pmol sintezės skalę ir didelio efektyvumo skysčių chromatografijos gryninimą, buvo pridėti j plokštelės šulinėlius (galutinė koncentracija - 10 μΜ) kombinacijoje su transfekcijos reagentu - TurboFect™.
Pridėjus į plokšteles PO, S. mutans bei S. sobrinus kultūrų bakterijos buvo sumaišytos lygiomis dalimis ir išsėtos į šulinėlius taip, kad gauti galutinį praskiedimą 1:100. Nedelsiant, sterilios 1 mm storio stiklo plokštelės, išpjautos iš standartinių mikroskopo objektinių stikliukų (76 χ 26 mm; Thermo Fisher Scientific), buvo vertikaliai įdėtos į šulinėlius, o plokštelės inkubuotos anaerobinėmis sąlygomis papildomoms 4 vai. 37 °C temperatūroje. Paskui, sterilus sacharozės tirpalas buvo pridėtas į atitinkamus šulinėlius iki 1 % galutinės koncentracijos, o plokštelės vėl inkubuotos anaerobinėmis sąlygomis (95 % N2 ir 5 % CO2) 37 °C temperatūroje dar papildomoms 20 vai. Šiame eksperimente skystos terpės (TH buljono) tūris vienam šulinėliui buvo 1 mL; šulinėliai tik su terpe (buljonu) be bakterijų buvo naudoti kaip „tuščia“ kontrolė, o nepaveiktos maišytos S. mutans ir S. sobrinus bakterijos naudotos kaip eksperimentinė kontrolė.
Praėjus 24 vai. bendram inkubacijos laikotarpiui, stiklo plokštelės buvo ištrauktos iš šulinėlių, išdžiovintos ir toliau panaudotos maišytos S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelės analizei Sensofar PLu 2300 optiniu konfokaliniu profilometru. Tuo tikslu buvo atlikti šeši matavimai bioplėvelės šiurkštumui įvertinti ir penki matavimai bioplėvelės storiui įvertinti (kiekvieno matavimo plotas - 180 χ 240 pm) per stiklo plokštelės vidurį nuo matomos bioplėvelės apačios iki viršaus panaudojant 50Χ konfokalinį objektyvą. Nuskanuotų ir pamatuotų bandinių duomenys toliau buvo apdoroti Gvvyddion programa (2.27 versija, prieinama internete adresu http://gwyddion.net) tuo tikslu, kad kiekybiškai įvertinti bioplėvelės paviršiaus šiurkštumo ir jos storio parametrus, atspindinčius bioplėvelės susiformavimo laipsnį arba „brandą“. Papildomai, Medianinis filtras (dydis - 10 pikselių arba 3 pm) buvo parinktas ir pritaikytas tam, kad pašalinti paviršiaus formos klaidas ir banguotumą. Kiekybiškai vertinant bioplėvelės paviršiaus šiurkštumą buvo apskaičiuojamas vienas iš svarbiausių paviršiaus parametrų - Rq (išmatuoto aukščio nuokrypių vidurkis). Nustatytų paviršiaus parametrų statistinis reikšmingumas buvo įvertintas pritaikant SPSS statistinės programos (20.0 versija) One-Way ANOVA metodą su LSD Post Hoc testu. Mažesnė už 0,05 p reikšmė buvo laikyta statistiškai reikšminga.
Taikant optinės konfokalinės profilometrijos metodą stiklo plokštelių su maišytų S. mutans ir S. sobrinus bioplėvelių paviršiaus analizei buvo atskleista, kad 1% sacharozės ir 10% kraujo serumo TH buljone žymiai padidina bioplėvelės paviršiaus šiurkštumo parametrą - Rq bei bioplėvelės storį palyginus su nepaveiktomis bakterijomis, augusiomis su 10% serumu, bet be sacharozės (fig. 8a ir fig. 9a ir 9b). Šiuo atveju, tai rodo, kad 1% sacharozės terpėje stimuliavo bakterijų prisitvirtinimą (adheziją) prie stiklo plokštelės paviršiaus ir bioplėvelės formavimąsi. Tačiau bandomoji PO1 molekulė (SEQ ID nr. 1) kombinacijoje su TurboFect™ reagentu 25% sumažino maišytų S. mutans ir S. sobrinus kultūrų bioplėvelės šiurkštumą (Rq) TH buljone, turinčiame 1% sacharozės ir 10% kraujo serumo, lyginant su bakterijomis, paveiktomis PO3 (SEQ ID nr. 3) kombinacijoje su TurboFect™ reagentu (p < 0,05) (fig. 8b ir 8c ir fig.9a). Be to, bandomoji PO1 molekulė (SEQ ID nr. 1) kombinacijoje su TurboFect™ reagentu 44% sumažino maišytų S. mutans ir S. sobrinus kultūrų bioplėvelės storį TH buljone, turinčiame 1% sacharozės ir 10% kraujo serumo, palyginus su nepaveiktomis bakterijomis bei bakterijomis, paveiktomis PO3 (SEQ ID nr. 3) kombinacijoje su TurboFect™ reagentu (p < 0,05) (fig. 8 ir fig. 9b). Remiantis šiais rezultatais galima daryti išvadą, kad bandomoji PO1 molekulė (SEQ ID nr. 1) efektyviai sumažina S. mutans bei S. sobrinus adheziją ir bioplėvelės formavimąsi ant standaus paviršiaus (stiklo plokštelės) terpėje, turinčioje pagrindinio kraujo sudėtinio komponento - serumo, in vitro sąlygomis.
priedas. PO sekų sąrašas ir aprašymas Seka Nr. 1 (SEQ ID nr. 1): 5'-GCAGACCATTGCTTAATCT-3'
Ilgis: 19 nukleotidų (nt)
Cheminė struktūra: deoksiribonukleorūgštis (DNR)
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr. 13 išvestinė, pagal komplementarumo principą jungiasi su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą. Esamuose eksperimentuose tai yra testuojama seka.
Seka Nr. 2 (SEQ ID nr. 2):
5'-ACGCACTTTCTTGTCCAT-3'
Ilgis: 18 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka jungiasi pagal komplementarumo principą su sritimi, esančia S. mutans gtfB iRNR transliacijos pradžios srityje, sukeldama priešprasminj efektą, remiantis Guo ir kt. Treatment of Streptococcus mutans with antisense oligodeoxyribonucleotides to gtfB mRNA inhibits GtfB expression and function. FEMS Microbiol. Lett. 264 (2006), p. 8-14. Esamuose eksperimentuose ji naudojama kaip teigiama kontrolė.
Seka Nr. 3 (SEQ ID nr. 3):
5'-ACTCGTATGCTACAGCTAT-3'
Ilgis: 19 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr.1 analogas su tokia pačia molekuline mase ir nukleotidų kiekiu, tačiau turinti išmaišytą atsitiktine tvarka nukleotidų eiliškumą. Dėl pastarosios priežasties ji nesukelia priešprasminio efekto ir todėl esamuose eksperimentuose naudojama kaip neigiama kontrolė.
Seka Nr. 4 (SEQ ID nr. 4):
5-CAGACCATTGCTTAATCT-3'
Ilgis: 18 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr.1 analogas, turintis tokį patį nukleotidų išsidėstymo eiliškumą, tačiau sutrumpintas vienu nukleotidu nuo 5'- galo. Pagal komplementarumo principą ji gali jungtis su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą, remiantis literatūros duomenimis (Fakler ir kt. Short antisense oligonucleotide-mediated inhibition is strongly dependent on oligo length and concentration būt almost independent of location ofthe target seguence. J. Biol. Chem. 269 (1994), p. 16187-16194).
Seka Nr. 5 (SEQ ID nr. 5):
5-AGACCATTGCTTAATCT-3'
Ilgis: 17 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr.1 analogas, turintis tokį patį nukleotidų išsidėstymo eiliškumą, tačiau sutrumpintas dviem nukleotidais nuo 5'- galo. Pagal komplementarumo principą ji gali jungtis su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą, remiantis literatūros duomenimis (Fakler ir kt. Short antisense oligonucleotide-mediated inhibition is strongly dependent on oligo length and concentration būt almost independent of location ofthe target seguence. J. Biol. Chem. 269 (1994), p. 16187-16194).
Seka Nr. 6 (SEQ ID nr. 6): 5-GACCATTGCTTAATCT-3'
Ilgis: 16 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr.1 analogas, turintis tokį patį nukleotidų išsidėstymo eiliškumą, tačiau sutrumpintas trimis nukleotidais nuo 5'- galo. Pagal komplementarumo principą ji gali jungtis su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminį efektą, remiantis literatūros duomenimis (Fakler ir kt. Short antisense oligonucleotide-mediated inhibition is strongly dependent on oligo length and concentration būt almost independent of location ofthe target seguence. J. Biol. Chem. 269 (1994), p. 16187-16194).
Seka Nr. 7 (SEQ ID nr. 7):
5'-GCAGACCATTGCTTAATC-3'
Ilgis: 18 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr.1 analogas, turintis tokį patį nukleotidų išsidėstymo eiliškumą, tačiau sutrumpintas vienu nukleotidų nuo 3'- galo. Pagal komplementarumo principą ji gali jungtis su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminį efektą, remiantis literatūros duomenimis (Fakler ir kt. Short antisense oligonucleotide-mediated inhibition is strongly dependent on oligo length and concentration būt almost independent of location ofthe target seguence. J. Biol. Chem. 269 (1994), p. 16187-16194).
Seka Nr. 8 (SEQ ID nr. 8):
5-GCAGACCATTGCTTAAT-3'
Ilgis: 17 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr.1 analogas, turintis tokį patį nukleotidų išsidėstymo eiliškumą, tačiau sutrumpintas dviem nukleotidais nuo 3'- galo. Pagal komplementarumo principą ji gali jungtis su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą, remiantis literatūros duomenimis (Fakler ir kt. Short antisense oligonucleotide-mediated inhibition is strongly dependent on oligo length and concentration būt almost independent of location ofthe target seguence. J. Biol. Chem. 269 (1994), p. 16187-16194).
Seka Nr. 9 (SEQ ID nr. 9):
5'-GCAGACCATTGCTTAA-3'
Ilgis: 16 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr.1 analogas, turintis tokį patj nukleotidų išsidėstymo eiliškumą, tačiau sutrumpintas trimis nukleotidais nuo 3'- galo. Pagal komplementarumo principą ji gali jungtis su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą, remiantis literatūros duomenimis (Fakler ir kt. Short antisense oligonucleotide-mediated inhibition is strongly dependent on oligo length and concentration būt almost independent of location ofthe target seguence. J. Biol. Chem. 269 (1994), p. 16187-16194).
Seka Nr. 10(SEQ ID nr. 10):
5-CAGACCATTGCTTAATC-3'
Ilgis: 17 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr.1 analogas, turintis tokj patį nukleotidų išsidėstymo eiliškumą, tačiau sutrumpintas dviem nukleotidais - vienu nuo 5'- galo ir vienu nuo 3'- galo. Pagal komplementarumo principą ji gali jungtis su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą, remiantis literatūros duomenimis (Fakler ir kt. Short antisense oligonucleotidemediated inhibition is strongly dependent on oligo length and concentration būt almost independent of location ofthe target sequence. J. Biol. Chem. 269 (1994), p. 1618716194).
Seka Nr. 11 (SEQ ID nr. 11):
5'-AGACCATTGCTTAATC-3'
Ilgis: 16 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr.1 analogas, turintis tokį patį nukleotidų išsidėstymo eiliškumą, tačiau sutrumpintas trimis nukleotidais - dviem nuo 5'- galo ir vienu nuo 3'- galo. Pagal komplementarumo principą ji gali jungtis su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą, remiantis literatūros duomenimis (Fakler ir kt. Short antisense oligonucleotidemediated inhibition is strongly dependent on oligo length and concentration būt almost independent of location ofthe target sequence. J. Biol. Chem. 269 (1994), p. 1618716194).
Seka Nr. 12 (SEQ ID nr. 12):
5-CAGACCATTGCTTAAT-3'
Ilgis: 16 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr.1 analogas, turintis tokį patį nukleotidų išsidėstymo eiliškumą, tačiau sutrumpintas trimis nukleotidais - vienu nuo 5'- galo ir dviem nuo 3'- galo. Pagal komplementarumo principą ji gali jungtis su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą, remiantis literatūros duomenimis (Fakler ir kt. Short antisense oligonucleotidemediated inhibition is strongly dependent on oligo length and concentration būt almost independent of location ofthe target sequence. J. Biol. Chem. 269 (1994), p. 1618716194).
Seka Nr. 13(SEQ ID nr. 13):
5'-TTGGCAGACCATTGCTTAATCTTAAC-3'
Ilgis: 26 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka pagal komplementarumo principą gali jungtis su atitinkama 26 nt sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą. Ji yra komplementari sekai Nr. 16, kuri turi 100% homologines sritis S. mutans gtfB, gtfC, S. criceti gtfl, S. dentirousetti gtfl, S. dentisuis gtfl \r S. orisuis gtf genuose, o taip pat homologines sritis su dviejų nukleotidų neatitikimu S. dovvnei gtf pirmtako ir S. sobrinus gtfl genuose.
Seka Nr. 14 (SEQ ID nr. 14):
5'UCUGUUAAGAUUAAGCAAUGGUCUGCCAAGUACUUUAAUGGGACAAA
UAUUUUAGGGCGCGGAGCAGGCUAUGUCUUAAAAGA-3'
Ilgis: 83 nt
Cheminė struktūra: ribonukleorūgštis (RNR)
Kilmė: natūrali seka, esanti S. mutans gtfB iRNR
Funkcija: reikalinga transliacijai atlikti; koduoja amino rūgštis atitinkamoje S. mutans GtfB baltymo srityje. Prie šios sekos atitinkamos srities gali jungtis priešprasminiai oligonukleotidai, turintys sekas Nr. 1 ir Nr. 4-13, sukeldami priešprasminj efektą.
Seka Nr. 15 (SEQ ID nr. 15): 5'-GCAGACCATTGTTTAATCT-3'
Ilgis: 19 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: natūrali seka, esanti S. sobrinus gtfl gene
Funkcija: koduoja sritį S. sobrinus gtfl iRNR, prie kurios gali jungtis priešprasminiai oligonukleotidai (su vieno nukleotido neatitikimu), turintys sekas Nr. 1 ir Nr. 4-12, sukeldami priešprasminj efektą.
Seka Nr. 16 (SEQ ID nr. 16):
5'-GTTAAGATTAAGCAATGGTCTGCCAA-3'
Ilgis: 26 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: natūrali seka, esanti S. mutans gtfB gene
Funkcija: koduoja sritį S. mutans gtfB iRNR, prie kurios gali jungtis priešprasminiai oligonukleotidai, turintys sekas Nr. 1 ir Nr. 4-13, sukeldami priešprasminj efektą. Ši seka turi 100% homologines sritis S. mutans gtfC, S. criceti gtfl, S. dentirousetti gtfl, S. dentisuis gtfl ir S. orisuis gtf genuose, o taip pat homologines sritis su dviejų nukleotidų neatitikimu S. dovvnei gtf pirmtako ir S. sobrinus gtfl genuose.
Seka N r. 17(SEQIDnr. 17):
5'-AGATTAAGCAATGGTCTGC-3'
Ilgis: 19 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: natūrali seka, esanti S. mutans gtfB gene
Funkcija: koduoja sritį S. mutans gtfB iRNR, prie kurios gali jungtis priešprasminiai oligonukleotidai, turintys sekas Nr. 1 ir Nr. 4-12, sukeldami priešprasminj efektą. Ši seka yra SEQ ID nr. 16 išvestinė.
Seka Nr. 18 (SEQ ID nr. 18):
5'-CGCGTCATGTTTGAAGGTTTCTCTAA-3'
Ilgis: 26 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: natūrali seka, esanti S. mutans gtfB gene
Funkcija: koduoja sritį S. mutans gtfB iRNR, prie kurios gali jungtis priešprasminiai oligonukleotidai, turintys sekas Nr. 19-24, sukeldami priešprasminį efektą. Ši seka turi 100% homologines sritis fig. 7 nurodytuose Streptococcus rūšių ir padermių gliukoziltransferazių genuose.
Seka Nr. 19(SEQ ID nr. 19):
5-TTAGAGAAACCTTCAAACATGACGCG-3'
Ilgis: 26 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka pagal komplementarumo principą gali jungtis su atitinkama 26 nt sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminį efektą. Ji yra komplementari sekai Nr. 18, kuri turi 100% homologines sritis fig. 7 nurodytuose Streptococcus rūšių ir padermių gliukoziltransferazių genuose.
Seka Nr. 20 (SEQ ID nr. 20):
5'-GAAACCTTCAAACATGACGC-3'
Ilgis: 20 nt
Cheminė struktūra: DNR
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr. 19 išvestinė, pagal komplementarumo principą jungiasi su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminį efektą. Tai yra testuojama seka, kuri parinkta panaudojant „Antisense Design“ programą (Integrated DNA Technologies:
http://eu.idtdna.com/Scitools/Applications/AntiSense/Antisense.aspx?source=menu).
Seka Nr. 21 (SEQ ID nr. 21):
5-AAACCTTCAAACATGACGC-3'
Ilgis: 19 nt
Cheminė struktūra: deoksiribonukleorūgštis (DNR)
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr. 19 išvestinė, pagal komplementarumo principą jungiasi su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą. Tai yra testuojama seka, kuri parinkta panaudojant „Antisense Design“ programą (Integrated DNA Technologies: http://eu.idtdna.com/Scitools/Applications/AntiSense/Antisense.aspx?source=menu).
Seka Nr. 22 (SEQ ID nr. 22):
5-GAAACCTTCAAACATGACGCG-3'
Ilgis: 21 nt
Cheminė struktūra: deoksiribonukleorūgštis (DNR)
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr. 19 išvestinė, pagal komplementarumo principą jungiasi su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą. Tai yra testuojama seka, kuri parinkta panaudojant „Antisense Design“ programą (Integrated DNA Technologies: http://eu.idtdna.com/Scitools/Applications/AntiSense/Antisense.aspx?source=menu).
Seka Nr. 23 (SEQ ID nr. 23):
5-GAAACCTTCAAACATGACG-3'
Ilgis: 19 nt
Cheminė struktūra: deoksiribonukleorūgštis (DNR)
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr. 19 išvestinė, pagal komplementarumo principą jungiasi su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą. Tai yra testuojama seka, kuri parinkta panaudojant „Antisense Design“ programą (Integrated DNA Technologies: http://eu.idtdna.com/Scitools/Applications/AntiSense/Antisense.aspx?source=menu).
Seka Nr. 24 (SEQ ID nr. 24):
5'-AGAAACCTTCAAACATGACGC-3'
Ilgis: 21 nt
Cheminė struktūra: deoksiribonukleorūgštis (DNR)
Kilmė: dirbtinai susintetinta izoliuota priešprasminė nukleotidų seka
Funkcija: ši seka yra SEQ ID nr. 19 išvestinė, pagal komplementarumo principą jungiasi su atitinkama sritimi S. mutans gtfB ir gtfC iRNR bei S. sobrinus gtfl iRNR sukeldama priešprasminj efektą. Tai yra testuojama seka, kuri parinkta panaudojant „Antisense Design“ programą (Integrated DNA Technologies: http://eu.idtdna.com/Scitools/Applications/AntiSense/Antisense.aspx?source=menu).

Claims (13)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Priešprasminiai oligonukleotidai (PO) aterosklerozės ir kardiovaskuliarinių infekcijų prevencijai, atitinkantys šiuos požymius:
    a) PO sudaryti iš nukleotidų sekų pagal SEQ ID nr. 1, 13, 19;
    b) PO sudaryti iš sekų SEQ ID nr. 1, 13, 19 fragmentų: arba
    c) PO, kurių nukleotidų sekos ne mažiau kaip 85% sutampa su sekomis SEQ IDnr. 1, 13, 19.
  2. 2. PO pagal 1 punktą, besiskiriantys tuo, kad nukleotidų sekos nurodytos SEQ ID nr. 1,13,19 skiriasi vienu, dviem, trim arba keturiais nukleotidais.
  3. 3. PO pagal 1 punktą, besiskiriantys tuo, kad nukleotidų sekas sudaro fragmentai ar dalys, kurie parinkti iš šių sekų grupės: SEQ ID nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24.
  4. 4. PO pagal bet kurj iš 1-3 punktų, besiskiriantys tuo, kad PO konjuguoti su peptidu prasiskverbiančiu per ląstelės membraną.
  5. 5. PO pagal bet kurj iš 1-4 punktų, panaudojami aterosklerozinių plokštelių ir/ar židinių susiformavimo profilaktikai, prevencijai, slopinimui ir mažinimui ant žmogaus kardiovaskulinių audinių ir/ar žmogaus kraujo terpėje.
  6. 6. Biofarmacinė kompozicija medicininiam panaudojimui susidedanti iš aktyviosios medžiagos ir adjuvantų ir/ar nešėjų, besiskirianti tuo, kad jos aktyviąją medžiagą sudaro PO pagal bet kurj iš 1-4 punktų.
  7. 7. Biofarmacinė kompozicija pagal 6 punktą, besiskirianti tuo, kad joje naudojamas nešėjas yra katijoninis polimeras.
  8. 8. Biofarmacinė kompozicija, pagal bet kurj iš 6,7 punktus, skirta aterosklerozės gydymui ar prevencijai.
  9. 9. Biofarmacinė kompozicija, pagal bet kurį iš 6,7 punktus, skirta bakterinio endokardito gydymui ar prevencijai.
  10. 10. Biofarmacinė kompozicija pagal bet kurj iš 6,7 punktus, skirta paviršių besiliečiančių su žmogaus krauju ir audiniais, vamzdelių, kateterių, dializės membranų, zondų, vožtuvų, protezų, implantų apdorojimui, siekiant antibakterinio poveikio nukreipto į S. mutans ir S. sobrinus ant tokių paviršių.
  11. 11. Biofarmacinė kompozicija, pagal bet kurį iš 6,7 punktus, skirta paviršių besiliečiančių su žmogaus krauju ir audiniais, vamzdelių, kateterių, dializės membranų, zondų, vožtuvų, protezų, implantų apdorojimui, aterosklerozinių plokštelių ir/ar židinių susiformavimo profilaktikai, prevencijai, slopinimui ir mažinimui ant tokių paviršių.
  12. 12. Biofarmacinė kompozicija, pagal bet kurį iš 6,7 punktus, skirta paviršių besiliečiančių su žmogaus krauju ir audiniais, vamzdelių, kateterių, dializės membranų, zondų, vožtuvų, protezų, implantų apdorojimui, siekiant sumažinti bakterinių bioplėvelų atsiradimą ir augimą.
  13. 13. S. mutans ir S. sobrinus bakterijų kolonijų kontrolės būdas, b e s i s k i r i antis tuo, kad naudojant biofarmacinę kompoziciją pagal 6,7 punktus specifiškai ir vienu metu slopina gtfB ir gtfC iRNR raišką S. mutans bakterijoje ir gtfl iRNR raišką S. sobrinus bakterijoje , taip pat vienu metu slopina šių bakterijų gebėjimą sintezuoti vandenyje netirpių gliukanų ir dalinai vandenyje tirpių gliukanų polimerus ir mažina šių bakterijų gebėjimą sintetinti bioplėvelių karkasą sudarančius ekzopolisacharidus.
LT2013109A 2013-10-07 2013-10-07 Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai LT6214B (lt)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
LT2013109A LT6214B (lt) 2013-10-07 2013-10-07 Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai
PCT/IB2014/065084 WO2015052630A1 (en) 2013-10-07 2014-10-06 Antisense oligonucleotides for prevention of atherosclerosis and cardiovascular infections

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
LT2013109A LT6214B (lt) 2013-10-07 2013-10-07 Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LT2013109A LT2013109A (lt) 2015-04-27
LT6214B true LT6214B (lt) 2015-08-25

Family

ID=51871111

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LT2013109A LT6214B (lt) 2013-10-07 2013-10-07 Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai

Country Status (2)

Country Link
LT (1) LT6214B (lt)
WO (1) WO2015052630A1 (lt)

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5641625A (en) 1992-05-22 1997-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5766855A (en) 1991-05-24 1998-06-16 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity and sequence specificity
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US6228982B1 (en) 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
GB9211979D0 (en) 1992-06-05 1992-07-15 Buchard Ole Uses of nucleic acid analogues
US5527675A (en) 1993-08-20 1996-06-18 Millipore Corporation Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
DE4331012A1 (de) 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
GB2284209A (en) 1993-11-25 1995-05-31 Ole Buchardt Nucleic acid analogue-induced transcription of RNA from a double-stranded DNA template
US5705333A (en) 1994-08-05 1998-01-06 The Regents Of The University Of California Peptide-based nucleic acid mimics(PENAMS)
AU3584897A (en) * 1996-06-21 1998-01-07 Virginia Commonwealth University Vaccine to prevent streptococcal endocarditis
US6107470A (en) 1997-05-29 2000-08-22 Nielsen; Peter E. Histidine-containing peptide nucleic acids
JP4932731B2 (ja) * 2004-12-06 2012-05-16 ケイン バイオテック インコーポレイテッド シグナルペプチド、核酸分子及び治療方法
WO2014033314A1 (en) * 2012-09-03 2014-03-06 Uab Bioseka Antisense oligonucleotide targeting bacterial glucosyltransferases

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOWEN ET AL.: "Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms", CARIES RES., 2011, pages 69 - 86
KOREN ET AL.: "Human oral, gut and plaque microbiota in patients with atherosclerosis", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 2011, pages 4592 - 4598, XP055001767, DOI: doi:10.1073/pnas.1011383107
NAKANO ET AL.: "Detection of cariogenic Streptococcus mutans in extirpated heart valve and atheromatous plaque specimens", J. CLIN. MICROBIOL., 2006, pages 3313 - 3317
NAKANO ET AL.: "Detection of oral bacteria in cardiovascular specimens", ORAL MICROBIOL. IMMUNOL., 2009, pages 64 - 68
NAKANO ET AL.: "Streptococcus mutans and cardiovascular diseases.", J. DENT. SCI. REV., 2008, pages 29 - 37, XP025406280, DOI: doi:10.1016/j.jdsr.2007.09.001
S. MENDIS ET AL.: "Global Atlas on cardiovascular disease prevention and control", pages: 8 - 14

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015052630A1 (en) 2015-04-16
LT2013109A (lt) 2015-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6902869B2 (ja) アタキシン２の発現を調節するための組成物
AU2020200247A1 (en) Organic compositions to treat KRAS-related diseases
CN108368507A (zh) 程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)的iRNA组合物及其使用方法
KR20160054595A (ko) 보체 인자 b의 조절자
US10941404B2 (en) Treatment of angiopoietin like 7 (ANGPTL7) related diseases
US20180282728A1 (en) Organic compositions to treat beta-catenin-related diseases
CA2764449A1 (en) Nucleic acid modulators of glycoprotein vi
US20230357774A1 (en) Compositions and methods for the treatment of angiopoietin like 7 (angptl7) related diseases
KR20210008498A (ko) Fxi 발현을 감소시키기 위한 화합물 및 방법
CN107002082A (zh) 反义寡核苷酸作为tgf‑r信号传导的抑制剂
CN109328236A (zh) 体外肾毒性筛选测定法
EP3545094B1 (en) Aptamers for use in inhibition and/or suppression of tlr9 activation
JP7141621B2 (ja) コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンス核酸
KR20150103739A (ko) 톨－유사 수용체 기반 면역 반응을 조절하기 위한 면역 조절 올리고누클레오티드 （ｉｒｏ） 화합물
WO2005080568A1 (en) Methods and compositions for treatment or prevention of secondary ischemic injury
WO2007058323A1 (ja) 核酸ホモポリマー結合機能性核酸医薬品の製造法
KR102588627B1 (ko) Mast4 유전자를 이용한 세포외 기질 생산용 조성물 및 그 제조방법
LT6214B (lt) Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai
KR20210144601A (ko) 이중가닥 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 코로나바이러스감염증-19〔covid-19〕치료용 조성물
JP4762909B2 (ja) 抗アポトーシス活性アプタマー
LT6426B (lt) Priešprasminis oligonukleotidas bakterinių bioplėvelių ir atsparumo antibiotikams prevencijai
KR20010042796A (ko) 인테그린 αｖ-아단위 발현 억제를 위한 안티센스올리고뉴클레오티드
WO2009147742A1 (ja) ヒト・オステオポンチンｓｉＲＮＡ
WO2023192828A2 (en) Compositions and methods for the treatment of angiopoietin like 7 (angptl7) related diseases
KR20230108728A (ko) 앤지오텐시노겐 발현을 조절하기 위한 화합물 및 방법

Legal Events

Date Code Title Description
BB1A Patent application published

Effective date: 20150427

FG9A Patent granted

Effective date: 20150825

MM9A Lapsed patents

Effective date: 20161007