KR102061924B1 - Ｐ３２ 저해제를 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 p32 저해제를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 p32 저해제는 아르기나아제 활성을 억제하는 효과가 있고, 아르기나아제 활성 억제를 통해 L-아르기닌 생산 농도를 증가시키고, 미토콘드리아의 칼슘 농도를 감소시키고, CaMKⅡ의 인산화를 증가시키는 활성을 나타낼 수 있다. 따라서 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 심혈관 질환의 예방 또는 치료를 위한 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

Ｐ３２ 저해제를 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating of cardiovascular disease comprising p32 inhibitor}

본 발명은 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 p32 저해제를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

생체 내에서 혈액은 복잡하고 정교한 조절 시스템에 의해 항상 평형을 이루고 있어 정상적인 상태에서는 출혈이나 혈전 등에 의해 흐름이 방해받지 않는다. 그러나 여러 가지 요인으로 이러한 평형상태가 깨지면 혈관의 흐름이 원활하지 못하여 혈관 질환들이 발생하게 된다. 혈관질환 중 가장 대표적인 경우가 동맥경화증인데, 심장이나 뇌 등 중요장기에 허혈성 상태를 초래하여 심근경색이나 뇌경색을 일으키는 매우 위험한 질환 중 하나이다.

한편, 심장과 혈관은 전신에 산소와 영양소를 공급하는 기관으로 인간이 생명을 유지하는데 없어서는 안 되는 핵심기관이라 할 수 있다. 따라서 여러 가지 원인으로 심혈관계에 이상이 생겨 각 조직 및 기관으로의 혈액과 산소공급이 원활하지 못할 경우 국소부위 조직괴사는 물론 심한 경우 생명에 위협을 주는 위험한 질환을 야기하게 된다. 심혈관 질환은 특히 나이가 들어감에 따라 인체의 노화 현상으로 더욱 빈번해진다. 이러한 이유로 심혈관질환의 예방과 치료가 매우 중요해지고 있다.

혈관근육세포(vascular smooth muscle cells)는 혈관을 형성하는 핵심세포로 수축과 이완을 통해 혈압을 조절하는 데 필수적인 역할을 하며 혈관평활근세포라고도 불린다. 이러한 혈관근육세포의 비정상적 증식은 고혈압, 동맥경화 등 심혈관질환의 원인이 된다. 혈관근육세포의 증식은 평활근세포 자체 및 내막세포, 대식세포, 혈소판 등에서 분비되는 자가분비(autocrine)와 측분비 성장인자(paracrine growth factor)에 의해 조절된다. 혈관근육세포의 증식에 관련된 성장인자로서는 대표적으로 platelet-derived growth factor(PDGF), basic fibroblast growth factor(bFGF)가 있으며, 혈관근육세포의 이상증식을 억제할 수 있다면 고혈압, 동맥경화, 심혈관계 질환, 이의 합병증과 같은 질환의 치료와 예방에 우수한 효과를 얻을 것으로 예상되며 현재 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.

현재까지 심혈관 질환의 치료제로 질산(Nitrate)계 제제인 슈와즈(Schwarz)사의 ISMO 등이 소개되어 있으나, 이 제제는 효과는 뛰어나나 체위성저혈압, 심계항진 등의 부작용이 있어, 저혈압, 녹내장 등의 환자에게는 신중히사용해야 하며, beta-차단제로 아스트라(Astra)사의 베타록(BETALOC)등이 소개되어 있는데, 이 제제 역시 효과는 확실하나 급격한 심장억제 등으로 울혈성심부전환자 등은 신중히 사용해야 한다.

한편, 내피 산화질소의 정상적인 생성은 혈관 기능의 유지를 위해 중요하다. 내피세포의 산화질소 방출이 증가하면 평활근(smooth muscle) 세포의 신축성 감소 및 저하된 혈관 저항(vascular resistance)을 초래한다. 그러나 고혈압 및 고지혈증의 상태 하에서 내피의 기능이상은 산화질소 방출의 현저한 감소를 발생시키며, 그 결과로 혈관수축 및 혈관경련이 증가되며, 단핵세포 및 LDL 침윤의 확대되고, 혈관 평활근 세포가 증식하며, 산화적스트레스의 증가 및 혈소판 응집의 증가를 초래한다. 따라서 내피의 기능 및 산화질소 대사를 회복시키는 물질은 심장동맥 질환 및 심장 기능 장애가 포함하는 혈관 질환의 치료에 있어서 효과적이라 할 수 있다.

산화질소를 합성하는 대부분의 세포들은 아르기나아제(arginase)라는 효소도 갖고 있는데, 아르기나아제는 L-아르기닌(arginine)의 가수분해를 촉매하여 L-오르니틴(ornithine)과 요소(urea)를 생성하는 효소 그룹이다. 아르기나아제 I 은 세포내에서 일정하게(constitutively) 발현되며, 아르기나아제 II는 내독소(endotoxin)에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 효소들은 염증(inflammatory) 조건에서 산화질소의 생산 변경에 매우 중요한 역할을 하지만, 산화질소의 일정한 합성에도 중요한 역할을 한다.

반면, 아르기나아제(arginase)는 또한 공통 기질인 L-아르기닌(Arginine)의 이용을 통해 경쟁적으로 NOS를 저해하는 작용도 한다(Berkowitz et al., 2003; Holowatz et al., 2006; Morris et al., 1998; Peyton et al.,2009; Simon et al., 2003; Steppan et al., 2006). 마크로파지(macrophages), 간세포(hepatocytes) 및 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells)에서 아르기나아제I의 발현 및 기능은 lipopolysaccharide (LPS), IL-13, 변경된 산소분압 및 관상 동맥(coronary arteries)의 풍선확장술(balloon dilatation)에 의해 자극될 수 있으며(Chicoine et al., 2004; Klasen et al., 2001; Louis et al., 1998; Modolell et al., 1995; Morriset al., 2004; Nelin et al., 2007; Que et al., 1998; Ryoo et al., 2006), 또한 아르기나아제 Ⅱ의 활성 및 발현은 OxLDL, LPS, TNF-a, IFN-, 8-bromo-cGMP 및 hypoxia 를 포함한 다양한 혈관 인자들에 의해 유도될 수 있다.

한편 최근 보고된 자료에 의하면 아르기나아제의 억제는 산화질소의 생산을 활발히 증대시키며, 정상적인 심장기능 및 아테롬생성(atherogenesis), 노화, 발기부전 및 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell disease)에서 혈관기능 장애에 유용한 효과를 가져오는 것으로 밝혀진 바 있다(Berkowitz et al., 2003; Bivalacqua etal.,2001; Bivalacqua et al., 2007; Hsu et al., 2007; Morris et al., 2004; Steppan et al., 2006; Whiteet al., 2006; Xu et al., 2007).

따라서 아르기나제의 활성을 억제하는 물질의 경우 혈관 기능 장애를 개선 및 치료하는데 유용하게 사용할 수 있을 것으로 예측하고 있으나, 종래 개발된 아르기나제 활성 억제제의 경우, 부작용이 있으며 그 효과도 미비하여 새로운 아르기나제 활성 억제제의 개발이 시급한 실정이다.

일본공개특허 JP11089571A

이에 본 발명자들은 p32 기능 조절을 통하여 동맥경화 유발 동물모델에서 아르기나아제 활성에 어떠한 영향을 미치는지를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 p32 저해제를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 p32 저해제를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 p32 저해제는 아르기나아제 활성 억제 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아르기나제는 아르기나제 I 또는 아르기나아제 Ⅱ일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 p32 저해제는 아르기나아제 활성 억제를 통해 L-아르기닌 생산 농도를 증가시키는 활성, 미토콘드리아의 칼슘 농도를 감소시키는 활성 또는 CaMKⅡ의 인산화를 증가시키는 활성을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 p32 저해제는 p32 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자이거나, p32에 특이적인 siRNA, shRNA, RNA 앱타머 및 리보자임으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 심혈관 질환은 고혈압, 부정맥, 심부전, 심장발작, 심근경색증, 동맥경화증, 협심증, 뇌졸중, 뇌출혈, 혈관종, 관상동맥질환, 대동맥질환, 뇌혈관질환, 허혈성 질환 및 말초혈관질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 p32 저해제는 아르기나아제 활성을 억제하는 효과가 있고, 아르기나아제 활성 억제를 통해 L-아르기닌 생산 농도를 증가시키고, 미토콘드리아의 칼슘 농도를 감소시키고, CaMKⅡ의 인산화를 증가시키는 활성을 나타낼 수 있으며, 혈관 기능 향상과 심장 수축력을 향상시킬 수 있다. 따라서 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 고혈압, 동맥경화, 관상동맥질환, 뇌혈관질환, 말초혈관질환, 대동맥질환 등과 같은 심혈관 질환의 예방 또는 치료를 위한 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1 내지 도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 nLDL-자극된 혈관평활근세포(VSMCs)에서 아르기나아제 억제에 따른 미토콘드리아의 Ca^{2 +} 농도 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 아르기나아제 활성이 CaMKⅡ인산화에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 4 내지 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 p32 넉다운이 nLDL-유도 미토콘드리아 Ca^{2 +} 흡수에 따른 CaMKⅡ 인산화에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 7 내지 도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 스페르민이 p32 의존적 미토콘드리아의 Ca^{2 +} 흡수에 따른 CaMKⅡ 인산화에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 9 내지 10은 본 발명의 일실시예에 따른 탈내피화(de-endothelialized) 대동맥 혈관에서 작용물질 의존적 혈관수축을 증가시키는 p32에 대한 안티센스의 영향을 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 고콜레스테롤(HCD) 식이 ApoE-/- 마우스에서 증가된 p32 단백질의 발현을 확인한 결과이다.

본 발명은 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 p32 저해제를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다는 점에 그 특징이 있다.

본 발명에서는 p32 기능 조절이 심혈관 질환에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 동맥경화 유발 동물모델을 이용하여 p32 기능을 억제시킬 때 어떠한 영향을 미치는지를 연구하였다.

따라서 본 발명에서는 심혈관 질환과 p32 기능조절의 관련성에 대해 최초로 규명하였다. 구체적으로 동맥경화 유발 동물모델에서 p32 기능을 억제시킨 경우, 아르기나아제의 활성을 억제함에 따라 미토콘드리아의 칼슘 농도를 감소시키고, CaMKⅡ의 인산화를 증가시키는 것을 확인하였으며, 이러한 p32 저해제를 심혈관질환을 가진 환자에 유용한 치료제로 이용할 수 있는 기반을 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, nLDL-자극된 혈관평활근세포(VSMCs)에서 p32 저해제를 처리해 아르기나아제의 활성을 억제함에 따라 미토콘드리아의 칼슘 농도를 감소시키고, CaMKⅡ의 인산화를 증가시키는 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

그러므로, p32 저해제는 심혈관 질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 p32 저해제를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 p32 저해제는 아르기나아제 활성 억제 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아르기나제는 아르기나제 I 또는 아르기나아제 II일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 p32 저해제는 아르기나아제 활성 억제를 통해 L-아르기닌 생산 농도를 증가시키는 활성, 미토콘드리아의 칼슘 농도를 감소시키는 활성 또는 CaMKⅡ의 인산화를 증가시키는 활성을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 p32 저해제는 p32 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자이거나, p32에 특이적인 siRNA, shRNA, RNA 앱타머 및 리보자임으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 심혈관 질환은 고혈압, 부정맥, 심부전, 심장발작, 심근경색증, 동맥경화증, 협심증, 뇌졸중, 뇌출혈, 혈관종, 관상동맥질환, 대동맥질환, 뇌혈관질환, 허혈성 질환 및 말초혈관질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "p32 저해제"는 세포 내에서 p32의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 의미하는 것으로서, 구체적으로는 p32에 직접적으로 작용하거나 또는 p32의 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 p32의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나, 발현된 p32의 분해를 증가시키거나, 그 활성을 방해함으로써, p32의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 제제를 뜻한다.

본 발명의 p32 저해제는 이러한 p32이 활성화되어 기능하는 경로에 관여하여 p32의 발현 수준을 감소시키거나, 활성을 억제할 수 있다.

본 발명에서 이용할 수 있는 p32 저해제는 p32 저해활성을 가진 물질이라면, 특별히 제한되지 않으나, 당업계에 공지된 표준 기법을 통해 세포에 처리될 수 있는 핵산 또는 폴리펩티드 같은 생물학적 분자, 화합물, 세균이나 식물 또는 동물로부터 분리된 추출물일 수 있다. 바람직하게는 p32 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자, p32에 특이적인 siRNA, RNA 앱타머 및 리보자임 등을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 p32 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자이다.

본 발명의 p32 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 서열번호 1 또는 서열번호 2 로 기재되는 염기서열로 구성될 수 있다.

서열번호 1: 5’-TGT CTC CGT CGG TGT GCA GC-Cy5- 3’

서열번호 2 : 5’-TGT CTC CTT CCG TGT GCA GA-Cy5-3’

본 발명에서 용어 “상보적인”은 뉴클레오티드 서열과 다른 뉴클레오티드 서열의 각 염기가 매치되는, 즉 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기쌍을 형성할 수 있는 경우를 의미한다.

본 발명에서 용어 “안티센스 핵산”은 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체인 핵산서열을 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징을 가진다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당업계에서 생체 내뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용되는 것으로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막을 수 있다.

본 발명의 안티센스 서열은 p32 mRNA에 상보적이고 p32 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, p32 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 서열과 길이는 특별히 제한되지 않으며, mRNA에 대응하지 않는 일부의 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 10 내지 40 염기이다. 이들 서열은 p32단백질의 미트콘드리아 표적 서열에 대한 상보적인 염기 서열을 포함한다.

따라서 본 발명에서 사용될 수 있는 안티센스 핵산은 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 핵산을 포함한다. 또한 상기 핵산은 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당 분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있으며, 이들 변형은 당 분야에 널리 알려져 있으며 핵산 백본의 변형, 당 모이어티(moiety)의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 p32 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 세포 내의 p32 분자의 단일 가닥 단편에 상보적으로 결합하여 p32의 프로세프 효율을 감소시킴으로써, 이들의 발현을 억제하고, 기능을 저해시킬 수 있게 된다. p32 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙 마이크로RNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 마이크로RNA 분자는 주로 이중가닥 부분을 형성할 수 있는 적어도 부분적으로 자가-상보적인(예를 들어 스템- 및 루프-구조)이다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 전구체 마이크로RNA 분자의 단일 가닥 단편에 상보적이거나, 성숙 마이크로RNA 분자에 상보적일 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 RNA-RNA, RNA-DNA, RNA-PNA(단백질 핵산) 상호작용에 의해 p32 핵산에 결합하여 이들의 활성을 변이시키는 비효소적 핵산 화합물이며, 이들은 하나의 연속서열이 p32 염기서열에 상보적일 수 있고, 이들 자체적으로 루프를 형성하여 루프를 형성하는 p32에도 결합할 수 있다.

또한, 본 발명의 p32 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 안티올리고뉴클레오티드 형태인 것이 바람직하며, 이들은 세포에 도입되었을 때, p32의 발현을 저해시킬 수 있으며, 내인성 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 내성이며, 생체 내에서 안정적인 선택적으로 변형된 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생적인 염기, 당 및 당간(intersugar) 연결로 이루어진 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 또한, 이 용어는 유사하게 기능하는 비-자연 발생적인 단량체 또는 그의 부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 올리고머를 포함한다. 치환된 올리고머의 혼입은 세포 흡수 증대 또는 뉴클레아제 내성 증가를 비롯한 인자에 기초하며, 당업계에 공지된 바와 같이 선택된다. 전체 올리고뉴클레오티드 또는 그의 일부분이 치환된 올리고머를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 이들의 표적에 대한 친화성을 증가시키고 표적 서열의 미스매치(mismatch)에 대한 내성을 제공하도록 당업계에 공지된 방법으로 변형된 올리고머 모방체, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 및 고정(locked) 핵산(LNA)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 천연형 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포로디티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 메틸포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포르아미데이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, H-포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 트리에스테르형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 알파-아노머형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 펩티드핵산, 그외 인조 핵산 및 핵산-변형된 화합물을 포함한, 변형된 올리고뉴클레오티드 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 p32 단일 가닥 염기서열에 상보적인 이중나선 또는 단일 나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있으며, 이들 변형은 당업계에 알려져 있고, 올리고뉴클레오티드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 당 변형의 예로는, 1-6 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 -O-저급 알킬기, 또는 2-6 탄소 원자를 포함하는 -O-아릴, 또는 알릴기로 2'-O-치환된 것을 포함하는, 리보스 모이어티의 2' 위치에 변형이 있으며, 상기 -O-알킬, 아릴 또는 알릴기는 아미노 또는 할로기(예, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸 시아노, 니트로 아실 아실옥시, 알콕시, 카르복시, 카르브알콕실 또는 아미노기)로 비치환 또는 치환될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예로는, 3', 5' 또는 3' 및 5' 말단에 2'-O-알킬화된 리보뉴클레오티드를 가지며, 적어도 4개 또는 5개의 연속 뉴클레오티드가 그렇게 변형된다. 2'-O-알킬화된 기의 예로는, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필 및 2'-0-부틸이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 p32 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 10 내지 40 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 또는 2로 기재되는 염기서열로 구성된다.

한편, 본 발명에서 이용할 수 있는 p32 저해제로서, p32에 대한 siRNA, shRNA, RNA 앱타머 및 리보자임 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 p32 저해제로 이용할 수 있는 siRNA는 p32에 특이적으로 작용하여 p32 분자를 절단(cleavage)하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference)현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 말한다. 본 발명의 siRNA는 p32 핵산 서열의 일부 또는 전부와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되어 세포 내에서 p32에 혼성화될수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 p32 저해제로 이용할 수 있는 RNA 앱타머는 특정의 3차원 입체 형태를 채택하는 능력에 의해 p32와 결합하여 이에 대해 길항 효과를 갖는 핵산 리간드 분자를 의미한다. 전형적으로 앱타머는 규정된 이차 및 삼차 구조, 예컨대 스템-루프구조로 접혀지는 15^-50 염기 길이의 작은 핵산일 수 있다. 앱타머는 10^-6, 10^-8, 10^-10, 또는 10^-12보다 적은 kd로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 앱타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 표적 분자와 결합할 수 있다. 또한, 앱타머는 다수의 리보뉴클레오티드 단위, 데옥시리보뉴클레오티드 단위, 또는 두 가지 유형의 뉴클레오티드 잔기의 혼합물로 구성될 수 있다. 앱타머는 하나 이상의 변형된 염기, 당 또는 포스페이트 주쇄 단위를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 p32 저해제로 이용할 수 있는 리보자임은 화학적 반응을 분자 내적으로나 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 리보자임으로는 천연 시스템에서 발견되는 리보자임을 토대로 한 뉴클레아제나 핵산 중합효소 타입 반응을 촉매하는 리보자임의 상이한 유형들 모두 가능하며, 예를 들면 햄머헤드 리보자임, 헤어핀 리보자임 및 테트라히메나 리보자임이다. 또한, 천연 시스템에서는 발견되지 않지만, 생체내 특이한 반응을 촉매하기 위해 공학적으로 처리되는 리보자임도 이용가능하다. 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단할 수 있으며, 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 이어지는 절단을 통하여 핵산 기질을 절단하게 되는데, 이러한 인식은 대부분 염기쌍 상호작용을 토대로 하므로, 표적 특이적 절단이 가능한 특징을 가질 수 있다.

본 발명의 p32 저해제를 포함하는 조성물은 아르기나아제 활성 억제 효과를 나타낸다. 또한, 아르기나아제 활성 억제를 통해 L-아르기닌 생산 농도를 증가시키는 활성, 미토콘드리아의 칼슘 농도를 감소시키는 활성 또는 CaMKⅡ의 인산화를 증가시키는 활성을 나타낸다. 여기서 아르기나제는 아르기나제I 또는 아르기나아제Ⅱ일 수 있다.

본 발명에서 상기 심혈관 질환은 고혈압, 부정맥, 심부전, 심장발작, 심근경색증, 동맥경화증, 협심증, 뇌졸중, 뇌출혈, 혈관종, 관상동맥질환, 대동맥질환, 뇌혈관질환, 허혈성 질환 및 말초혈관질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 질환을 말한다.

또한, 본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 기존의 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료용 제제 또는 방법과 병용하여 사용할 수 있으며, 이 경우 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 표면에 전달하는 임의의 방식으로 개체에게 투여될 수 있다. 적합한 비경구 투여 경로는 혈관내 투여(예, 정맥 내 볼루스 주사, 정맥 내 주입, 동맥 내 볼루스 주사, 동맥 내 주입, 맥관 내로의 카테터 점적주입), 피하 주입을 포함하는 피하 주사 또는 침착(deposition)(예를 들면 삼투압 펌프 이용), 조직 주위 및 조직 내 투여(예: 종양주위 및 종양내 주사) 또는 침착 등을 포함한다.

본 발명의 조성물은 심혈관과 관련이 있는 질병을 앓고 있는 개체의 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 가능한 개체는 인간뿐만 아니라 새, 가금류, 가축 등의 동물도 포함한다. 본 발명에서, 치료는 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 경감시키거나, 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 포함한다.

본 발명의 조성물에 함유되는 p32 활성을 저해하는 물질의 유효 투여량의 범위는 개체의 성별, 중증도, 연령, 건강상태, 체중, 약물에 대한 민감도, 투여방법과 횟수, 표적세포나 세포 및 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 p32 발현을 억제시키기에 충분한 양 또는 p32 작용을 억제하기에 충분한 양이다. 각 치료에 요구되는 총 용량은 수회 용량 또는 일회량으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 >

재료 및 방법

1. 세포배양

인간 대동맥 근육 세포는 Lonza로부터 구입하여 사용하였고, starvation medium의 배양없이 nLDL을 처리하고, 공급자의 프로토콜에 따라 SMGS(Invitrogen)에 있는 medium 231에서 배양하였다.

2. 실험동물

본 실험은 강원대학교 기관생명윤리위원회(Institutional Review Board)의 승인 하에 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침에 따라 수행되었다. C57BL/6로부터 만들어진 아르기나아제Ⅱ-/- mice는 Prof. Jaye Chin-Dusting으로부터 얻었다. 10주령 수컷 C57BL/6 WT mice에 일반식이(ND)를 하였고, 10주령 수컷 ApoE-/- mice에 고콜레스테롤 식이(HCD)를 하여 실험에 사용하였다.

3. 아르기나아제( Arginase ) 활성 측정

생쥐의 신장과 간을 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 0.1% triton X-100, 0.1 Mphenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF))로 4℃ 조건에서 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 파쇄하고 초음파처리(sonication) 한 뒤 12000 rpm, 4℃에서 20 분간 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 25μl에 리모닌 25μg/ml 또는 DMSO를 넣고 트리스 버퍼(Tris HCl, pH 7.5, 50 mM) 35 ul, L-아르기닌 25μl와 섞어 37 ℃에서 1시간 반응시킨다. Acid solution (H₂SO₄:H₃PO₄:D.W.= 1:3:7) 200μl를 넣어 효소반응을 정지시키고 에탄올에 녹인 α-isonitroso- propiophenone 9%를 12.5μl 넣어 95℃에서 45 분간 urea의 발색반응을 유도하였다. 상온에서 10 분간 암반응 한 뒤 550 nm서 흡광도를 측정하였다. 단백질은 Bradford 법을 이용하여 정량하였다. 아르기나아제 활성은 단백질(mg)이 1 분당 생성하는 우레아(urea)의 양으로 나타내었다.

4. 웨스턴블롯 ( Western Blot ) 분석

세포 추출과 조직 추출은 SDS-PAGE를 이용하여 모으고, NIH Image J를 사용하여 밴드의 농도계를 분석하였다.

5. 형광현미경을 이용한 미토콘드리아의 Ca ^{2 +} 측정

미토콘드리아의 Ca^{2 +} 측정은 칼세인 아세톡시메틸 에스터(Calcein acetoxymethyl ester; Calcein-AM)와 미토콘드리아에서 칼세인 염색약의 위치를 알려주는 CoCl₂를 사용하여 일반적인 절차에 따라 수행하였다. 간략하게, 세포는 칼세인-AM 500nM이 함유된 nLDL(100/ml) 성장배양액(growth media)에서 37℃에서 30분 동안 성장시켰다. 칼세인-AM은 세포 내 에스터기의 골에 결합하는 칼세인이 자유 형광을 발생시키고, CoCl₂ 는 미토콘드리아 내 칼세인이 염색되는 동안 세포질의 칼세인 형광을 잡아주는 역할을 한다. 이후 세포는 티로드 용액(150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES 및 10 mM glucose)으로 세척하였다. 칼세인 형광을 검출하기 위하여 470nm인 흡수량과 510nm인 방출량 필터를 사용하였다. Metamorph program을 이용하여 background 제거한 후 강도(Intensity) 값은 일반적으로 최초 형광값을 따른다.

6. 마우스 동맥 평활근세포(mAoSMCs)의 분리

실험에 사용한 동맥평활근세포(mAoSMCs)는 10주~12주령 수컷 생쥐의 흉곽으로부터 복부 위쪽 대동맥으로부터 분리하였다. 마취된 생쥐로부터 얻은 가느다란 대동맥을 1.5mm로 자른 후, type-Ⅱ collagenase(1mg/ml, Gibco)를 1시간 동안 처리하여 내피세포를 제거하였다. 이후, 0.1% 젤라틴으로 코팅된 세포배양 접시에 10% Fetal bovine serum, penicillin (100 U/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle medium)를 넣고 약 10일 동안 배양하였다. mAoSMCs는 그들의 방추형 형상(spindle-shape)으로 확인하였고, 나아가 SMC 특이적 마커인 α-smooth muscle actin과 내피세포 특이적 마커인 내피세포 부착분자-1을 사용하는 이중염색으로 확인하였다. 모든 세포는 anti α-smooth muscle actin antibody로 염색되고, mAoSMC는 passage 3~4를 이용하였다.

7. 면역조직화학염색( Immunohistochemistry ) 분석

p32 안티센스와 센스 처리된 내피세포가 제거된 대동맥은 4% 포름알데하이드로 고정하였고, 올리고(oligo)를 분석하기 위해 동결절편을 사용하였다. p32 말단에 처리된 Cy5의 시각화를 위해 Clara digital camera(Andor Technol)가 연결된 형광현미경(Olympus)을 사용하여 분석하였다.

8. 폴리아민 분석

L-아르기닌과 폴리아민, 스페르민(spermine), 스페르미딘(spermidine), 푸트레신(putrescine)의 세포 내 농도는 이전에 보고된 바에 따르면 o-프탈알데하이드를 가진 pre-column 유도체를 사용하는 HPLC으로 측정할 수 있다.

L-아르기닌(100uM)과 폴리아민(30uM/each)은 내부 표준으로써 세포 용해액(cell lysate, 0.1mM)에 추가하였다. 샘플은 고체상 추출 카트리지(CBA Bond elute, Varian)에서 추출하였고, L-아르기닌에 대한 회복률은 87.5±3.9%으로 나타났다. 용출액은 nitrogen과 HPLC분석을 위해 2차 증류수에서 존재한다. HPLC는 자동 주입기(M7725i, Waters Co.) 및 형광 검출기(FP-1520, jasco Co.)로 구성된 컴퓨터가 조절하는 액체크로마토그래피 시스템에서 수행하였다. HPLC에서 자동 주입되기 전 샘플은 OPA 시약(5.4 mg/ml OPA in borate buffer, pH8.4, containing 0.4% 2-mercaptoethanol)에서 배양하였다. L-아르기닌의 파생물인 OPA는 Ex 340 nm과 Em 450 nm으로 세팅된 형광 검출기를 가진 150 X 4.6 mm-5 μm Zorbax Eclipse XDB-C18 컬럼에서 분리되었다. 샘플은 0.96% 시트르산/메탄올(70:30), pH6.8, 1.5 ml/min 흐름속도에서 용출되었다.

9. 미토콘드리아 분획( fractionation )

세포와 내피세포가 제거된 대동맥 조각을 준세포분획(subcellular fraction) 버퍼용액[250 mM sucrose, 20 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, protease inhibitors(Roche Co.)]에서 3분동안 2회 파쇄하고, 1000g에서 10분동안 원심분리하여 세포의 잔재와 파쇄되지 않은 세포들을 제거하였다. 상층액은 21000g로 45분동안 4℃에서 원심분리하였고, 20μg 단백질을 포함하는 세포질과 미토콘드리아 분획은 p32 단백질의 발현을 위한 웨스턴 블롯에 사용하였다.

10. 혈관 반응성( reactivity ) 분석

흉곽 대동맥은 마취된 생쥐(C57BL/6)로부터 분리하고, 지방과 결합조직을 제거하였다. 대동맥을 1.5mm로 자르고, 내피세포는 wooden stick을 이용하여 제거하고, 근운동기록기(myograph; Multi myograph system DMT-620)에 10 ml Krebs-ringer(95% O2-5%CO2, pH7.4, 37℃)을 넣고, 두개의 wire stirrup(150 μm) 사이에 놔두었다. 하나의 stirrup은 3차원 micromanipulator에 연결되어있고, 다른 하나는 force transducer에 연결되어있다. 혈관은 10분간격으로 늘어나 100mg에서 증가하여 기저장력(600mg)에 도달하였다. 동맥이 기저장력으로 도달한 후에 100mM KCl에 대한 수축반응이 결정된다. KCl의 최대 처리에 대한 반응은 전반적인 혈관 반응에 대해 일반화하였다. 혈관수축신경(vasoconstrictor) PE (10-10-10-6 M) 및 NE (10-9-10-5 M)에 대한 반응이 수행되었다.

11. p32 단백질의 안티센스 처리 및 넉다운( Knockdown )

hAoSMC는 phosphorothioated 안티센스 올리고뉴클레오타이드(100 nM, 5’-TGT CTC CGT CGG TGT GCA GC-Cy5- 3’) 또는 센스 올리고뉴클레오타이드(100 nM, 5’-GCT GCA CAC CGA CGG AGA CA-Cy5-3’)를 포함하는 성장배지와 뉴클레오타이드가 없는 성장배지에서 배양하였다.

생쥐로부터 수득한 흉곽 대동맥은 phosphorothioated 안티센스 올리고뉴클레오타이드(100 nM, 5’-TGT CTC CTT CCG TGT GCA GA-Cy5-3’) 또는 센스 올리고뉴클레오타이드(100 nM, 5’-CAG CAC AGC CCT GGA GCA CC-Cy5-3’)를 포함하는 DMEM (2% FBS, penicillin (100 U/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml))에서 24시간 배양하였다. 올리고뉴클레오타이드는 Cy5로 표지되어서 형광을 나타내므로 형광현미경으로 시각화하였다.

12. 통계처리

모든 데이터는 mean±SEM으로 기록되었다. 통계적 중요성은 unpaired 값에 대한 Bonferoni t test에 의해 결정되었고, <0.05P의 p value는 통계적 중요성에 대한 기준으로 사용되었다. 반응은 2-way ANOVA using Graphpad prism 4.0 Software에 의해 분석되었다.

< 실시예 1>

nLDL -자극된 혈관평활근세포(VSMCs)에서 아르기나아제Ⅱ 억제에 따른 미토콘드리아의 Ca ^{2 +} 농도 감소 효과

먼저, hAoSMC에서 아르기나아제를 억제했을 때 미토콘드리아의 칼슘 흡수에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 도 1을 참조하면, nLDL 자극을 30분간 주었을 때 미토콘드리아 칼슘 농도가 증가하는 것으로 나타났고(* vs. untreated, 147±6.6 vs. 100±7.9 %, p<0.01), 아르기나아제 억제제인 ABH와 칼슘 채널 억제제인 Ru360를 전처리하면 칼슘 농도 증가가 억제되는 것으로 나타났다(** vs. nLDL only, p<0.01).

다음으로, 아르기나아제 억제에 의한 미토콘드리아의 칼슘 흡수를 확인하기 위하여, WT와 ArgⅡ-/- 생쥐에서 대동맥 평활근 세포를 분리하였다. 도 2A에서는 ArgⅡ 발현을 보여준다. WT에서 분리된 mAoSMCs에서 nLDL 자극을 주면 미토콘드리아 칼슘 농도가 증가했으나(도 2B 참조, * vs. untreated, 138.6±11.6 vs. 100±11.2%), ArgⅡ-/- 생쥐에서 분리된 mAoSMC에서는 nLDL자극에 의해 칼슘 농도가 증가하지 않는 것으로 나타났다(도 2B 참조, untreated vs. nLDL treated, 103.9±9.6 vs. 110.5±11.9, ns).

< 실시예 2>

아르기나아제 활성이 CaMK Ⅱ인산화에 미치는 영향

아르기나아제를 억제함에 따라 미토콘드리아의 칼슘 농도 증가가 억제되는 것을 확인함에 따라, 본 실시예에서는 아르기나아제 억제가 세포질의 Ca^{2 +}/칼모듈린-의존적 단백질 키나아제(CaMKⅡ)의 인산화를 조절하는지 확인하였다.

성장배지에서 배양한 hAoSMC에 nLDL 자극을 각각 다른 시간마다 처리하였다. 그 결과 도 3A를 참조하면, nLDL 자극을 주고나서 10분에 CaMKⅡ의 인산화가 약간 증가하였으나(108±3.6%), 30분 처리시 확실하게 CaMKⅡ 인산화가 감소하였다(56±4.2%).

다음으로, 아르기나아제 억제가 nLDL 자극에 의한 미토콘드리아 칼슘 흡수를 막기 때문에 아르기나아제 억제가 nLDL에 의한 CaMKⅡ 인산화를 회복시킬 수 있는지를 확인하였다. 그 결과 도 3B를 참조하면, 아르기나아제를 억제하는 경우 CaMKⅡ 인산화는 증가하였고(* vs. untreated, 168±11.3 vs. 100±5.1 AU, p<0.01), nLDL에 의한 CaMKⅡ 인산화를 회복시키는 것으로 나타났다(# vs.nLDL only, 97±7.1 vs. 52±4.2, p<0.01). 또한, 도 3C를 참조하면, WT 생쥐에 비해 ArgII-/- 생쥐의 AoSMC에서 CaMKⅡ 인산화가 증가하는 것을 확인하였다(* vs. WT, 142±6.8 vs. 100±11.2, p<0.01).

< 실시예 3>

p32 넉다운이 nLDL -유도 미토콘드리아 Ca ^{2 +} 흡수에 따른 CaMK Ⅱ 인산화에 미치는 효과

nLDL 의존적 미토콘드리아 칼슘 흡수를 조절하는 칼슘 이동 단백질을 확인하고 미토콘드리아 p32 단백질을 억제하는 안티센스(AS)와 센스(S) 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다. AS 올리고뉴클레오타이드를 처리한 hAoSMC는 세포질 내 p32단백질 양의 변화없이 미토콘드리아 p32 단백질을 특이적으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 4 참조). 센스와 안티센스 올리고뉴클레오타이드 모두 세포 내로 들어가는 것을 Cy5 파장에서 형광이미지로 확인하였다(도 5 참조). p32 단백질을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 nLDL 자극에 의한 미토콘드리아 칼슘 흡수를 억제하였으나(ns), 센스 올리고뉴클레오타이드는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 5 참조, * vs. untreated, p<0.01). 또한, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 nLDL 자극에 의해 감소된 CaMKⅡ 인산화를 회복시키는 것으로 나타났다(도 6 참조).

< 실시예 4>

스페르민이 p32 의존적 미토콘드리아의 Ca ^{2 +} 흡수에 따른 CaMK Ⅱ 인산화에 미치는 효과

미토콘드리아 p32 단백질이 칼슘 흡수의 원인이고, 아르기나아제 활성이 p32 의존적 미토콘드리아 칼슘 흡수에 영향이 미치는지 여부를 확인하였다.

먼저, 세포에 올리고뉴클레오타이드를 처리하지 않은 상태에서 폴리아민인 스페르민(spermine), 스페르미딘(spermidine), 푸트레신(putrescine)을 처리하였다. 그 결과, 스페르민(spermine)을 처리하는 경우에만 미토콘드리아 칼슘 농도 증가가 유도되었고(* vs. untreated, 126±8.9 vs. 100±12.5%, p<0.05), 스페르미딘과 푸트레신은 아무런 영향이 없는 것으로 나타났다(도 7 왼쪽 컬럼 참조).

또한, 스페르민 의존적 미토콘드리아 칼슘 흡수와 p32 단백질 사이의 관계를 알아보기 위하여, 세포에 안티센스를 전처리하고 폴리아민 자극을 주었다. p32 단백질 억제제인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리하는 경우 스페르민에 의해 유도된 미토콘드리아 칼슘 흡수를 억제하였고(도 7 오른쪽 컬럼 참조, 104±5.9 vs. 102±4.6%, ns), 센스 올리고뉴클레오타이드의 처리에 따른 영향은 없는 것으로 나타났다(도 7 가운데 컬럼 참조, * vs. untreated, 106±4.7 vs. 124±5.8%, p<0.01).

다음으로, 스페르민이 p32 의존적 미토콘드리아 칼슘 흡수를 유도했기 때문에 CaMKⅡ 인산화에서는 스페르민이 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 도 8를 참조하면, 스페르민을 처리하는 경우 CaMKⅡ 인산화가 감소하는 것을 확인하였다(* vs. untreated, 25±3.9 vs. 100±5.1 AU, p<0.01).

< 실시예 5>

탈내피화 ( de - endothelialized ) 대동맥 혈관에서 작용물질 의존적 혈관수축을 증가시키는 p32 에 대한 안티센스

미오신 L사슬 키나아제(myosin light chain kinase)의 Ca^{2 +}-CaM 의존적 활성과 미오신 L사슬의 인산화는 평활근 수축의 주요한 조절 메커니즘이라는 것은 잘 알려져있다. 본 실시예에서는 대동맥에서 생쥐의 안티센스가 미토콘드리아로 표적되는 p32 단백질의 양을 감소시키는 것을 확인하였다(도 9A 참조). 또한, 센스와 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 평활근 세포로 들어갔는지 여부를 내피세포가 제거된 대동맥 혈관에 올리고뉴클레오타이드를 처리하여 대조군과 비교하여 면역형광 이미지로 확인하였다(도 9B 참조). 안티센스 처리군, 센스 처리군, 아무것도 처리하지 않은 대조군에서 페닐에프린(PE)와 노르에피네프린(NE)에 대한 혈관 수축반응을 확인한 결과, 안티센스 처리한 내피세포가 제거된 대동맥은 NE(도 10A 참조, *p<0.01, AS vs. control, 50.5±1.5 vs. 24.3±1.7% in Emax) 와 PE(도 10B참조, *p<0.01, AS vs. control, 73.2±1.9 vs. 44.5±2.8% in Emax) 농도 의존적으로 확실하게 증가하는 것으로 나타났다.

< 실시예 6>

고콜레스테롤 ( HCD ) 식이 ApoE -/- 마우스에서 증가된 p32 단백질의 발현

미토콘드리아 칼슘과 증가된 ArgⅡ 활성은 동맥경화와 같은 병리생리학에서 중심적인 역할을 하고 있는 것을 감안하여, 본 실시예에서는 동맥경화 모델인 ApoE-null 생쥐에 고콜레스테롤(HCD) 식이를 하여 p32 단백질의 발현이 어떻게 변화하는지 확인하였다.

HCD 식이한 Apo E-null 생쥐의 내피 제거된 대동맥에서 아르기나아제 활성도는 증가하는 것으로 나타났다(도 11A 참조, * vs. WT+NS, 120±1 vs. 100±2%, p<0.01). 또한, HCD 식이한 ApoE-/- 생쥐의 내피 제거된 대동맥에서 아르기나아제의 기질인 L-아르기닌의 농도는 감소하였고(도 11B 참조, * vs. WT+ND, 68.7±10 vs. 100±1%, p<0.01), 생성물인 스페르민(도 11B 참조, spm, # vs. WT+ND, 138.6±0.9 vs. 100±3%, p<0.01), 스페르미딘(도 11B 참조, spmd, # vs. WT+ND, 148.9±5% vs. 100±2%, p<0.01), 푸트레신(도 11B 참조, putr, # vs. WT+ND, 242.7±3% vs. 100±4%, p<0.01)의 농도는 증가하였다. 미토콘드리아 칼슘 농도는 HCD 식이한 ApoE-/- 생쥐에서 분리한 AoSMC에서 증가하였다(도 11C 참조, * vs. WT+ND, 111.8±2 vs. 100±2%, p<0.05). 미토콘드리아 p32 단백질의 발현은 HCD 식이한 ApoE-/- 생쥐의 내피 제거한 대동맥에서 증가하는 것으로 나타났으나(도 11D 참조, * vs. WT+ND, 321±26.1 vs. 100±5.8%, p<0.01), 세포질 내 p32 단백질의 발현은 차이가 없는 것으로 나타났다.

상기와 같은 결과들을 종합해보면, nLDL-자극된 혈관평활근세포(VSMCs)에서 p32 저해제를 처리해 아르기나아제의 활성을 억제함에 따라 미토콘드리아의 칼슘 농도를 감소시키고, CaMKⅡ의 인산화를 증가시키는 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 또한, 동맥경화 유발 동물모델에서 아르기나아제 활성이 증가하고, L-아르기닌 생산 농도는 감소하고, p32 단백질 발현이 증가하는 것을 통해 혈관 기능 향상과 심장 수축력을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 p32 저해제의 처리로 인해 아르기나아제의 활성이 억제되고, 고혈압, 동맥경화, 관상동맥질환, 뇌혈관질환, 말초혈관질환, 대동맥질환 등과 같은 심혈관 질환의 치료제 개발에 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Kangwon National University <120> Composition for preventing or treating of cardiovascular disease comprising p32 inhibitor <130> pn1510-284 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> p32 antisense oligonucleotide <400> 1 tgtctccgtc ggtgtgcagc 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> p32 antisense oligonucleotide <400> 2 gtctccttcc gtgtgcaga 19

Claims (6)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 p32 유전자의 안티센스 올리고 뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 동맥경화증 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 p32 유전자의 안티센스 올리고 뉴클레오타이드는 아르기나아제 활성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 동맥경화증 예방 또는 치료용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 아르기나제는 아르기나제 I 또는 아르기나아제 Ⅱ인 것을 특징으로 하는 동맥경화증 예방 또는 치료용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 p32 유전자의 안티센스 올리고 뉴클레오타이드는 아르기나아제 활성 억제를 통해 L-아르기닌 생산 농도를 증가시키는 활성, 미토콘드리아의 칼슘 농도를 감소시키는 활성 또는 CaMKⅡ의 인산화를 증가시키는 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 동맥경화증 예방 또는 치료용 조성물.
   
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