JPH0731203B2

JPH0731203B2 - 多価抗原の定量的測定法及びその試薬並びに受容体の製造法

Info

Publication number: JPH0731203B2
Application number: JP63100445A
Authority: JP
Inventors: ヴエルナー・シユトツク; マンフレート・バイアー; クラウス・ペーター・カスパール; ペーター・キルヒ
Original assignee: ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 1987-04-28
Filing date: 1988-04-25
Publication date: 1995-04-10
Anticipated expiration: 2010-04-10
Also published as: DE3714147A1; KR900008958B1; DE3850439D1; EP0289003A2; EP0289003B1; EP0289003A3; KR880013013A; ES2056074T3; JPS63284470A; US4885255A; ATE108023T1

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、液状試料中の多価、すなわち少なくとも二官
能性の抗原の免疫化学的測定法、測定のための試薬及び
その製法に関する。

従来の技術様々の抗原決定因子に対応している２種の抗体の使用下
に多価抗原（ペプチド、蛋白質）の感度測定は、例えば
J.Clin.Chem.Clin.Biochem.18巻（1980年）197〜208頁
から公知である。この方法の多数の変法が、例えば西ド
イツ国特許公開公報（DE−OS）第3400027号明細書から
知られている。この公開公報によると、多価抗原の測定
のために３種の異なる受容体（Rezeptor）を用いて定温
保持を実施し、そのうち第１及び第３は液相で溶解して
存在し、かつ抗原と結合することができ、一方第２受容
体は固相で存在し、かつ第１受容体と結合することがで
き、かつ第３受容体は標識されていて、第１及び第２受
容体と交差反応しない。３種の受容体を用いて測定すべ
き抗原の異なる方法で実施可能な定温保持により、固相
に結合したサンドイツチ（Sandwich）−構造を最終的に
得て、その場合に、固相に結合した第２受容体は、第１
受容体を結合し、後者は再び抗原を結合しかつ抗原は最
後に標識された第３受容体を結合する。

この原則に基づく方法及び試薬の欠点は、このために使
用される試薬の不十分な安定性にある。この場合、安定
性とは長時間にわたる較正曲線の一定（分析物（Analyt
en）のシグナル／濃度）のことである。不十分な安定性
は、新たに製造した試薬の較性曲線が貯蔵された試薬の
較性曲線と一致しないという結果となる。通例、貯蔵が
長くなると共に較正曲線はより平坦となることが認めら
れる。これについての理由は知られていない。

発明が解決しようとする課題ところで本発明の課題は、前記の方法及び試薬を次のよ
うに改善することであり、すなわち較正曲線の安定性を
従来よりも長時間にわたつて得ること、換言すれば、二
重抗体−サンドイツチ法（Doppelantikrper−Sandwic
hverfahren）（DASP）の信頼性を改善することである。

課題を解決するための手段この課題は、本発明により、３種の異なる受容体（その
うち第１（R1）及び第３（R3）は液相で溶解して存在し
かつ抗原と結合することができ、第２受容体（R2）は固
相で存在し、かつ（R1）と結合することができ、かつ
（R3）は標識されていて、かつ（R1）及び（R2）と交差
結合しない）との定温保持による多価抗原の定量的測
定、液相から固相の分離及び相の一方における標識の測
定のための方法によつて解決され、この方法は、少なく
とも４個の相互に結合した抗体分子又は抗体分子断片
（そのうち少なくとも１個は測定すべき抗原と特異的に
結合する）よりなる第１受容体（R1）を使用することを
特徴とする。

意外にも、オリゴマー又はポリマーの第１受容体（R1）
の使用の際に、この方法もしくは試薬の安定性の実際の
改善を得ることが判明した。

本発明の範囲において受容体としては特異的に結合可能
な物質、特にポリクローナル又はモノクローナルであつ
てよい特異的に結合可能な完全抗体、その抗体断片又は
抗体又は抗体断片とハプテン又は抗原との結合体（Konj
ugate）を使用する。モノクローナル抗体を有利に使用
する。

本明細書中“抗体”もしくは“抗体分子”という表示は
完全抗体ばかりでなく、当業者に公知のその結合能力を
有する断片もこれに属する。ここで多価抗原とは、数個
の抗原決定因子を有する抗原である。

両受容体R1及びR2は相互に特異的に結合することができ
る物質対を形成する。すなわち例えば受容体R1が抗体で
ある場合には、受容体R2は受容体R1に適合した免疫グロ
ブリン又は蛋白質Ａであつてよい。更に受容体R1がビオ
チニル化された又はアビジン（Avidin）を与えた抗体で
ある場合には、受容体R2は、アビジン、ストレプトアビ
ジン又はビオチンであつてよい。その他の物質対も好適
であり、当業者に公知である。

殊に第１受容体（R1）は相互に架橋された同一の抗体又
はその結合能力を有する断片よりなり、それはモノクロ
ーナル又はポリクローナルであつてよい。この際個々の
抗体分子は２価又は多価のリンカー（架橋形成体）によ
り相互に結合している。２価のリンカーによる架橋が有
利であり、それというのもこれは受容体の“重合度（Po
lymerisationsgrades）”のより容易な調整を可能にす
るからである。しかしながら本発明による作用は多価リ
ンカーを用いても達成される。

受容体（R1）がそれよりなる個々の抗体の結合位置がリ
ンカーによつて遮断されないように、抗体分子１個当り
10個以上のリンカーを結合させないようにするのが有利
である。抗体分子１個当り２〜５個のリンカーが有利で
ある。リンカーの結合官能基の反応性に依り、リンカー
及び抗体をモル比約1:1〜50:1で架橋のために使用する
場合に、この有利な結合生成物（Kupplungs−produkt
e）が得られる。

リンカー（架橋形成体）としては、水溶液中で蛋白質の
官能性基と共有構造の形成下に反応することができる反
応性の基を有するような化合物を使用することができ
る。このために好適な２官能又は多官能性の多数のリン
カーは当業者に公知である。本発明の範囲で好適なホモ
−又はヘテロ２官能性及び３官能性リンカーの典型例を
次の第１表に挙げる。

トラウトの（Traut′ｓ）試薬２−イミノチオラン …2,4,6トリクロル−Ｓ−トリアジン架橋の実施のために相互に結合すべき抗体の溶液にリン
カー分子を、直接架橋に至る条件下で、加えることがで
きる。架橋の程度はこの場合添加されるリンカーの量に
より調整する。

相互に結合すべき抗体の半分を第１リンカーと、リンカ
ーの官能基の１つだけが抗体との構造形成に至る条件下
で、反応させる方法で、架橋を有利に行なう。同様の方
法で、架橋すべき抗体のもう半分を第２リンカーと反応
させる。そうして得られる両抗体誘導体を次いで相互に
反応させる。この際、相互に結合すべき抗体誘導体のモ
ル比2:1〜1:2を使用するのが有利である。約1:1の比が
特に有利である。

受容体（R1）は有利に抗体分子４〜20個、特に有利に抗
体分子４〜12個を含有する。

前記の単一種の抗体から組成される受容体（R1）（オリ
ゴマーもしくはポリマーとして存在する同種抗体）の場
合のみならず、この受容体（R1）は、測定すべき抗原に
対してかつ受容体（R2）に対してそのつどそれ自体極め
て特異性の結合能力を有する２種の異なる抗体から組成
されてもよい。この場合には完全受容体（R1）の製造
は、両方の異なる抗体の各個の誘導体化及び引続く両方
の誘導体相互の反応の前記の有利な方法により行なう。

本発明の範囲での使用には、その重合度もしくはその中
に含有される個々の抗体分子の数に関してできる限り均
等の組成を有する受容体R1が有利である。これは簡単な
方法でクロマトグラフイーによる予備精製によつて達成
することができる。

受容体（R2）としては、受容体（R1）と結合することが
できる不溶相に結合した受容体を使用する。（R2）は有
利に前記の定義の意味における抗体である。（R2）は同
種抗体から組成される受容体（R1）の一部と結合するこ
とができるか又は異種組成受容体（R1）の場合には、測
定すべき抗原に対してより僅少の親和性を示す成分と結
合することができる。受容体（R2）は有利に受容体（R
1）における抗体分子のFc−部分に対応している。一般
に免疫グロブリンのFc−部分に対応している受容体（R
2）も適当である。

第３受容体（R3）は受容体（R1）と同様に測定すべき多
価抗原と結合することができる。これはポリクローナル
又はモノクローナル抗体を含有することができる。モノ
クローナル抗体が問題となる場合には、それが（R1）の
ように他のエピトープに結合するように、それを選択す
る。これは簡単な方法で、測定すべき多価抗原と結合す
ることができるモノクローナル抗体を、そのつど（R1）
中で並びに（R3）中で使用することによつて達成され、
その際このモノクローナル抗体は種々の抗原決定因子を
認識する。これは両方の抗体が同一の実験動物から由来
しうるという利点を有する。

更になお受容体R3は標識を担持する。標識は酵素、放射
性物質、同位元素、螢光又は化学光物質であつてよく、
その測定は当業者に周知の方法により実施される。すな
わち例えば標識を酵素、例えばペルオキシダーゼ又はβ
−ガラクトシダーゼで行なう場合には、この酵素の活性
は、このために一般に公知の方法で、この標識酵素のた
めに公知の検出試薬、例えば呈色試薬を添加しかつ固相
の存在で又は分離後に測定することによつて測定され
る。この時測定した酵素活性は測定すべき多価抗原の量
に対する尺度である。

本発明のもう１つの目的は、３種の受容体（R1,R2,R3）
（そのうち（R1）及び（R3）は可溶性でありかつ抗原と
結合することができ、（R3）は標識されていてかつ（R
1）及び（R2）と交差反応しない）を含有する多価抗原
の定量的測定のための試薬であり、これは、（R1）が少
なくとも４個の相互に結合した抗体分子又は抗体分子断
片よりなる（そのうち少なくとも１個は測定すべき抗原
と特異的に結合する）ことを特徴とする。

この試薬の有利な実施態様は、測定方法と結びつけてす
でに詳細に述べてありかつ試薬の組成にも同様に適用す
る。

本発明により異種の免疫検定、例えば二重−抗体−サン
ドイツチ−法のための試薬の安定性の改善、特に長時間
にわたる較正曲線の不変性に関する改善が達成される。
達成される改善された較正曲線の不変性により測定の信
頼性が高められる。

次の実施例及び図によりこれを更に説明する。

第１図は西ドイツ国特許出願公告（DE−AS）第3425008.
2号明細書による回転子差込み部材を示している。

第２図は受容体R1′（非網状化）でのLH−較正曲線を示
す。

第３図は受容体R1（架橋）でのLH−較正曲線を示す。

実施例例１ AFPの測定１試薬の製造 1.1 緩衝液I: K₂HPO₄溶液50ミリモル／及びKH₂PO₄溶液50ミリモル／
をpH値6.0の達成まで混合することによつて製造され
る燐酸カリウム緩衝液（pH6.0）50ミリモル／。

1.2 緩衝液II: 緩衝液IIは、PH値としてpH7.5を調整しかつ緩衝液は付
加的にウシ血清アルブミン10g/及びNaCl150ミリモル
／を含有することを相違して、緩衝液Ｉと同様に製造
する。

1.3 受容体（R1′）（非架橋の抗−AFP−抗体）受容体（R1′）としてサブクラス（Subklasse）IgG₂a
（ECACC 87041002）のモノクローナルマウス−抗−AFP
−抗体を使用する。この抗体を含有する腹水液に硫酸ア
ンモニウム1.8Mまでを加える。沈殿を燐酸ナトリウム
（pH7.0）15ミリモル及び塩化ナトリウム50ミリモルよ
りなる緩衝液に入れる。そうして得られる溶液をDEAE−
セルロースを介して通過させる。そうして得られる、AF
Pと結合可能な抗体を含有する溶離液を引続き凍結乾燥
させる。

1.4 受容体（R1）（網状化の抗−AFP−抗体） 1.4.1 AFP−特異抗体の誘導体化受容体（R1′）（モノクローナルマウス抗−AFP−抗
体、1.3参照）10mgを0.1M燐酸−ナトリウム−緩衝液pH
7.5（1ml）中に溶かす、サクシンイミジル−３−（２−
ピリジルジチオ）−プロピオネート（SPDP）0.1mgの添
加後に反応を25℃で１時間行なう。pH値を酢酸でpH4.5
に変えかつジチオトレイト（Dithiothreit）8mgを添加
した後に更に20分間反応を25℃で行なう。生成物を、Na
Cl25ミリモル及びMgCl₂10ミリモルを有する燐酸カリウ
ム緩衝液pH6.15（10ミリモル）中、クロマトグラフイ−
カラム中でACA202−ゲル（製造者:LKB、スウエーデン）
10mlを介する通過により脱塩する。生成物を市販の限外
濾過装置（アミコン社（Amicon Corp.）、USA）を用い
て蛋白質濃度14mg/mlまで濃縮する。

1.4.2 架橋成分の誘導体化サブクラスIgG₁（ECACC 87041001）のモノクローナルマ
ウス−抗−hCG−抗体（1.3に記載したように製造）10mg
を公知方法により（イシカワ（Ishikawa）等著、J.Immu
noassay4巻（1983年）209頁以降）、Ｎ−サクシンイミ
ジル−４（Ｎ−マレイニミドメチル）−シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（SMCC）で誘導体化する。脱塩
及び濃縮は1.4.1の記載と同様に行なう。

1.4.3 結合（Konjugation） 1.4.1及び1.4.2からの抗体誘導体各10mgを一緒にpH7.0
及び25℃で1.5時間反応させる。反応を、１ミリモルま
でのシステインの添加（30分間、25C）及び引続いての
ヨードアセトアミド（１時間、25℃）の添加により止め
る。生成物を1.4.1に記載したように脱塩し、濃縮す
る。

1.5 標識化受容体（R3）溶液：受容体（R3）としてポリクローナルマウス−抗−AFP−
抗体を使用し、これを1.3に記載したように免疫吸着生
成により更に処理する。完全抗体を公知方法により、ポ
ーター（R.R.Porter）著、Biochem.J.73巻（1959年）11
9頁の方法により、Fab断片に分離する。得られるFab断
片をイシカワ等著のJ.of Immunoassay4巻（1983年）209
〜327頁により、β−ガラクトシダーゼと結合させる。
受容体（R3）溶液を緩衝液II中で500mU/ml（37℃でｏ−
ニトロフエニル−β−ガラクトシドで測定）の濃度まで
希釈する。

1.6 受容体（R2）溶液：ヒツジ−抗−マウス−Fcγ−抗血清に硫酸アンモニウム
を1.8Mまで加える。沈殿を燐酸ナトリウムpH7.0（15ミ
リモル）及び塩化ナトリウム（50ミリモル）よりなる緩
衝液中に入れる。そうして得られる溶液をDEAE−セルロ
ースを介して通過させる。特異抗体を含有する溶離液を
緩衝液Ｉ中で蛋白質濃度50μg/mlまで希釈する。

1.7 基質溶液：クロルフエノールロート−β−ガラクトシド（西ドイツ
特許（DE）第3345748号明細書より製造）５ミリモル／
（3.05g/） HEPES 70ミリモル／（16.7g/） NaCl 154ミリモル／（9g/）ウシ血清アルブミン 0.3％（3g/）ツイーン（Tween）20 0.2％（2g/） pH（NaOH）で 7.25 ２試薬担体の製造 2.1 試薬担体１′（比較；非架橋受容体（R1′））:1
当り、燐酸ナトリウムpH7.3（37℃）100ミリモル、塩
化マグネシウム２ミリモル、塩化ナトリウム9g、ウシ血
清アルブミン5g、マウスからの抗−AFP−モノクローナ
ル抗体（受容体R1′）5mg（200ngAK/試験）、抗−AFP−
抗体−（マウス）−Fab断片−β−ガラクトシダーゼ−
複合体（受容体R3溶液、37℃でオルト−ニトロフエニル
−β−Ｄ−ガラクトシドで活性を測定する）1.000Uを含
有する溶液40μを、市販のポリエステル紙製のフリー
ス上に滴下する。引続き室温で乾燥する。このフリース
をその使用まで４℃でかつ20％の相対空気湿度で保存す
る。

2.2 試薬担体１（本発明による；架橋受容体（R1）を
用いて）：その製造は、非架橋モノクローナル抗−AFP
−抗体（受容体（R1′））の代りにマウスからの架橋モ
ノクローナル抗−AFP−抗体（受容体（R1））を使用す
る点は相違して、試薬担体１′のための製造と同様に行
なう。

2.3 試薬担体2: マウス−抗体（受容体R3溶液）のFcγ−部分に対するヒ
ツジ−抗体を、ブロムシアン−活性化法（西ドイツ国特
許公開公報（DE−OS）第1768512号明細書）によりセル
ロース−フリース上に固定させ、この際繊維材料1g当り
抗体10μｇを固定に提供する。結合しなかつた抗体を洗
浄によつて除去し、フリースを室温で慎重に乾燥した。
そうして得られるフリースの貯蔵を試薬担体１と同様に
行なう。

３測定の実施この２つの試薬担体１及び２もしくは１′及び２を用い
る測定は、西ドイツ国特許出願公告（DE−AS）第342500
85号明細書に記載の、分析的測定の実施のための装置を
用いて行なう（第１図）。

これは、一定の試薬を浸み込ませた吸収力を有する担体
材料をそのつど含有する多数の試薬区分と連結している
試料装填室、少なくとも１個の混合弁室及び測定室を有
し、これらが共通して、差込み構成部材が回転子上に固
定されている場合に放射状に内から外へ至る試料液体移
送路を形成し、更に、液体の収容のためのもう１つの室
及びこの室から測定部に通じていて、試料液体移送路と
少なくとも部分的に同一である移送路を有する成形体よ
り成る、自動遠心分析機用の回転子差込み構成部材を示
す。この際、試料液体移送路は試料装填室（Ｐ）から吸
収力を有する材料を充した、緩衝液を含有する室
（ａ）、室（ｃ）及び室（ａ）と（ｃ）との間に配置さ
れた第１弁室（VK1）を経て第２弁室（VK2）に至り、か
つこれから室（ｄ）を経てかつ収容室（AK）を経て測定
室（Ｋ）に至る。もう１つの液体を収容するために、ポ
ンプ室として構成された基質室（PK）があらかじめ備え
られていて、これは配量室（DK）及び毛細管（Kap）よ
りなる配量装置及び溢流室（Ｋ）を経て第２弁室（VK
2）と結びついている。第１図は使用される回転子差込
み構成部材を図示している。

試薬担体１もしくは１′を回転子差込み構成部材のｃ区
分に入れ、かつ試薬担体２をｄ区分に入れる。この際、
0.9％NaCl溶液で1:3希釈した試料40μを上縁の開口部
を通して直接の区分にピペツトで入れる。基質溶液270
μを室PKにピペツトで入れる。次いで、高い回転数と
停止を交互に組合せた適当な遠心分離プログラムにより
試料及び基質溶液を分離マトリツクス及びキユベツトの
方向へ送る。

この際プログラムの経過につれて受容体（R3）及び（R
1）もしくは（R1′）はｃ区分の試料液体により流離さ
れかつ均質混合物を引続き反応させる。ｄ区分で、形成
された複合体（Komplex）を受容体（R2）に結合させ
る。ｃ区分からｄ区分への試料の移送は極めて短かい時
間内で行なわれる。

基質溶液を配量室DKを通して一定量に分配し、そのうち
第１分配分を複合しなかつた過剰の結合物の洗い出しの
ために用いる。ｄでの複合体形成を介して結合したβ−
グラクトシダーゼ活性は試料を含有するAFP−量にもし
くは試料空値に比例する。この活性をもう１つの基質分
で測定し、この際基質を５分間の反応で有色生成物に変
換させる。液相における生成した色及び他の色発限/min
をキユベツト中で576nmで測定する。

この条件下で負荷無しで、並びに35℃で３週間負荷し
て、その試薬担体を含めた回転子差込み構成部材を用い
て較正直線を調べた。この際次の結果を得た：例２ 2.1 試薬の製造 2.1.1 受容体（R1′）（比較；非架橋抗−hLH−抗体）受容体（R1′）としてサブクラスIgG₁（NCACC 8412200
1）のモノクローナルマウス−抗−hLH−抗体を使用す
る。この抗体を含有する腹水液に硫酸アンモニウムを1.
8Mまで加える。沈殿を燐酸ナトリウム15ミリモル、pH7.
0及び塩化ナトリウム50ミリモルよりなる緩衝液に入れ
る。そうして得られる溶液をDEAE−セルロースを介して
通過させる。そうして得られる、hLH−結合能力を有す
る抗体を含有する溶離液を引続き凍結乾燥させる。

2.1.2 受容体（R1）（本発明による；架橋抗−hLH−抗
体）例１とは反対に例２ではそれ自体と架橋した抗体を使用
する。製造には例１、1.4.1及び1.4.2により受容体（R
1′）を誘導体化する。

これらの抗体−誘導体各10mgを一緒にpH7.0及び25℃で
1.5時間反応させる。反応をシステインの１ミリモルま
での添加により（30分間、25℃）かつ引続きヨードアセ
トアミドの添加により（１時間、25℃）中止させる。生
成物を例１、1.4.1で記載したように脱塩しかつ濃縮す
る。

2.1.3 標識化された受容体（R3）溶液（R3）はβ−ガラクトシダーゼ及びモノクローナル抗−
LH−抗体−Fab断片よりなる結合体である。Fab断片を、
公知方法で、ポーター著、Biochem.J.73巻（1959年）11
9頁により、完全なモノクローナル抗−LH−抗体（NCACC
84122005）の分離により得る。（R3）の特異性は（R
1）と異なる。（R3）はLH−分子上で種々の抗原決定因
子を検出し、かつ（R1）とサンドイツチ構造を形成する
ことができる。抗体製造及び結合体合成は例１、1.5項
に相応する。

2.1.4 他の試薬他の試薬（例えば緩衝液Ｉ及びII、受容体（R2）溶液及
び基質溶液は例１に使用した試薬と同一である。

2.2 試薬担体の製造 2.2.1 試薬担体１′（非架橋受容体（R1′）を用い
て）:1当り燐酸ナトリウム（pH7.3）（37℃）100ミリ
モル、塩化マグネシウム２ミリモル、塩化ナトリウム9
g、ウシ血清アルブミン5g、マウスからの抗−hLH−モノ
クローナル抗体（受容体R1′）10mgもしくは20mg（400n
gAK/試験もしくは800ngAK/試験）、抗−hLH−抗体−
（マウス）−Fab断片−β−ガラクトシダーゼ−結合体
（受容体R3溶液、活性をオルト−ニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトシドで37℃で測定）1.000Uを含有する溶液
40μを、市販のポリエステル紙よりなるフリース上に
滴下する。引続き室温で乾燥する。このフリースをその
使用まで４℃及び相対空気湿度20％で保持する。

2.2.2 試薬担体1: 製造は、受容体（R1′）の代りにそれ自体と架橋した受
容体（R1）を使用する点で相違して、試薬担体１′のた
めの製造と同様に行なう。

2.2.3 試薬担体2: セルロース−フリース上にプロムシアン活性化法（西ド
イツ国特許公開公報（DE−OS）第1768512号明細書）に
よりマウス−抗体（受容体R2溶液）のFcγ−部分に対す
るヒツジ抗体を固定し、この際固定のために繊維材料1g
当り抗体10μｇを使用する。洗浄により結合しなかつた
抗体を除去し、フリースを慎重に室温で乾燥する。そう
して得られるフリースの貯蔵は試薬担体１と同様に行な
う。

３測定の実施測定の実施は例１と同様に行う。第２図及び第３図は試
薬担体１′もしくは１における400ng/AK/試験を使用し
ての結果を示す。

表IIは400もしくは800ngAK/試験についての結果を示
す。

【図面の簡単な説明】

第１図は回転子差込み構成部材の平面図を示し、第２図
及び第３図は試薬担体１′及び１における400ng/AK/試
験の使用の際のLH−較正曲線を示す。Ｐ……試料装填室、VK1……第１弁室、VK2……第２弁
室、AK……収容室、Ｋ……測定室、PK……基質室、DK…
…配量室、Ｋ……溢流室。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クラウス・ペーター・カスパールパラグアイ国アスンシオン・バリオ・ルイス・ア・デ・ヘレラ・カレ・ベルトーニ・イ・カプレラ（番地なし) (72)発明者ペーター・キルヒドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・ヴアイゼンハウスシユトラーセ 16 (56)参考文献特開昭59−23251（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−177264（ＪＰ，Ａ) 欧州特許公開105714（ＥＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】３種の異なる受容体（そのうち第１（R1）
及び第３受容体（R3）は、液相で溶解して存在し、かつ
抗原と結合することができ、第２受容体（R2）は固相で
存在し、かつ（R1）と結合することができ、かつ（R3）
は標識を有し、かつ（R1）及び（R2）と交差反応しな
い）との恒温保持、液相から固相の分離及び相の１方に
おける標識の測定によって多価抗原を定量的に測定する
方法において、測定すべき抗体と特異的に結合する、少
なくとも４個の相互に結合した抗体分子又は抗体分子断
片よりなるオリゴマー又はポリマーの形の第１受容体
（R1）を使用することを特徴とする、多価抗原の定量的
測定法。
【請求項２】（R1）は相互に架橋した同一のモノクロー
ナル又はポリクローナル抗体又は結合能力を有するそれ
らの断片よりなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】（R1）は相互に架橋した不同一のモノ−又
はポリ−クローナル抗体又はそれらの結合能力を有する
断片よりなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】（R1）は抗原に対して特異的な親和力を有
する第１抗体及び（R2）に対して特異的な結合能力を有
する第２抗体を含有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】（R1）の個々の抗体成分は、２価又は多価
のリンカーによって結合されている、請求項１から４ま
でのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】４〜20個の抗体分子又はそれらの断片を有
する受容体（R1）を使用する、請求項５記載の方法。
【請求項７】４〜12個の抗体分子又はそれらの断片を含
有する受容体（R1）を使用する、請求項６記載の方法。
【請求項８】（R2）の濃度の0.5〜１倍に相応する濃度
で（R1）を使用する、請求項１から７までのいずれか１
項記載の方法。
【請求項９】同一の完全抗体よりなる（R1）において、
（R1）の１部と結合することができる受容体（R2）を使
用する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方
法。
【請求項１０】（R2）は（R1）中の抗体のFc−部分と結
合することができる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】請求項１から10までのいずれか１項に記
載の方法のための受容体（R1）を製造する方法におい
て、結合すべき抗体又は結合能力を有するその断片の各
1/4〜3/4量を、２価又は多価リンカー各１個の１官能基
と反応させて誘導体とし、次いで、リンカーの第２又は
その他の官能基が反応する条件下で、この誘導体２個を
相互に結合させることを特徴とする、受容体（R1）の製
法。
【請求項１２】両方の誘導体をモル比2:1〜1:2で相互に
反応させる、請求項11記載の方法。
【請求項１３】３種の受容体（R1,R2,R3）（そのうち
（R1）及び（R3）は可溶性であり、かつ抗原と結合する
ことができ、（R3）は標識されており、かつ（R1）及び
（R2）と交差反応しない）を含有する、多価抗原の定量
的測定のための試薬において、測定すべき抗原と特異的
に結合する少なくとも４個の相互に結合した抗体分子又
は抗体分子断片よりなるオリゴマー又はポリマーの形の
第１受容体（R1）を使用することを特徴とする、多価抗
原の定量測定用試薬。
【請求項１４】（R1）は、相互に架橋した同一又は不同
一のモノクローナル又はポリクローナル抗体又は結合能
力を有するそれらの断片よりなる、請求項13記載の試
薬。
【請求項１５】（R1）は、抗原に対する特異的結合能力
を有する第１抗体及び（R2）に対する特異的結合能力を
有する第２抗体を含有する、請求項13又は14記載の試
薬。
【請求項１６】（R1）は、４〜20個の抗体分子又はその
断片を含有する、請求項13から15までのいずれか１項記
載の試薬。
【請求項１７】（R1）は４〜12個の抗体分子又はその断
片を含有する、請求項16記載の試薬。
【請求項１８】（R1）は（R2）の0.5〜１倍の活性量で
存在する、請求項13から17までのいずれか１項記載の試
薬。