CN107422113A - 抗环瓜氨酸肽抗体的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测临床样品中抗环瓜氨酸肽抗体的方法，所述方法包括用至少一种包含至少一种抗CCP抗体的特异结合物的均相试剂接触所述样品，由此在均相样品混合物中形成抗CCP抗体‑结合伴侣复合物的溶液或悬浮液，并检测均相液相中所述抗CCP抗体‑结合伴侣复合物的存在或水平。本发明同样涉及一种评估主体中类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性或倾向性的方法，所述方法包括在根据本发明的均相检测中检测所述主体的身体样品中的抗CCP抗体，由此确定所述样品中抗CCP抗体的水平，并将因此确定的水平与所述主体中类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性或倾向性相关联。

Description

抗环瓜氨酸肽抗体的检测方法

本申请是申请日2009年2月20日、申请号200980113814.3、发明名称为“抗环瓜氨酸肽抗体的检测方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及检测主体中类风湿性关节炎(RA)的存在、潜在性或倾向性的体外检测方法。本发明特别涉及自动检测，具体地，涉及评估类风湿性关节炎(RA)的检测方法，该检测方法包括检测主体中对环瓜氨酸肽具有特异性的内源抗体(抗CCP抗体)的存在或水平。本发明还涉及检测主体中对环瓜氨酸肽具有特异性的内源抗体(抗CCP抗体)的存在或水平的方法。

背景技术

类风湿性关节炎(RA)是常见的、系统性自身免疫性疾病，影响0.5-1％的成年人口。类风湿性关节炎的特点是滑液关节发炎。这能导致累积的关节磨损并因此降低生活质量。一般认为早期治疗对预防不可逆的关节损害是重要的，因此尽可能在病程的早期诊断类风湿性关节炎是重要的。1987年美国风湿病学会(ACR)分级广泛应用于类风湿性关节炎的诊断中，尽管事实上它们并不非常适合早期类风湿性关节炎(RA)的诊断。这是因为美国风湿病学会的标准非常依赖于临床症状的表现，而这些症状并不经常出现在早期类风湿性关节炎中。理想地需要一种对类风湿性关节炎高度特异和灵敏的血清学标记物，使得风湿病学家可以识别那些因作为积极治疗方案的候选者而受益的病患。目前，类风湿因子(RF)检测通常被用作类风湿性关节炎的血清学标记物，尽管该检测被认为缺少特异性并通常在疾病(血清反应阴性的类风湿性关节炎)中不存在。

最近几年中，已经记述了一种新的抗体标记物，报道其对类风湿性关节炎病患具有高度的特异性(>95％)和灵敏性(80％)。已经发现患有类风湿性关节炎的患者产生内源的抗环瓜氨酸肽自身抗体(抗CCP抗体)，并且这些被用作早期类风湿性关节炎的诊断中的标记物。自从1998年第一次报导存在于血液中并且与含有氨基酸瓜氨酸的合成肽反应的抗体对类风湿性关节炎具有高度特异性，检测病患血液或血清或血浆中的抗CCP抗体已经成为这种疾病的早期诊断和准确诊断中的选择方法。

特异于CCP的内源抗体(抗CCP抗体)的检测与类风湿因子检测一样灵敏，但具有更高的特异性。此外，抗CCP抗体的阳性检测可以预测类风湿性关节炎在无症状的个体和患有未分化关节炎的病患中的未来发展。同样已经显示呈现的抗体水平与侵蚀性疾病的进程相关。更早的诊断和治疗，优选地在症状发作最早的几个月内，可以帮助预防不可逆的关节损害。

在现有技术中，已经提出用非均相免疫测定检测抗CCP抗体。这样的非均相检测是基于直接或间接将CCP包覆在固相上，在能够使得抗CCP抗体结合至CCP的条件下，用已知含有或怀疑含有抗CCP抗体的样品培育固相，直接或间接检测结合的抗CCP抗体。进一步的检测形式是被称为双抗原桥检测，其中，在检测抗CCP抗体的情况下，CCP被用于这种免疫检测的固相侧以及检测侧，并且病患样品中的自身抗体形成这些“双”抗原之间的桥。典型地，当实施非均相免疫测定时包括几个清洗步骤。尽管这样的方法是有效的，它们相对地慢，并且对需要的反应物和设备有要求。自动操作这样的检测也很难，当自动操作时，可靠性也相对低。

考虑到上述问题，明确需要特别是基于生化参数的方法，帮助类风湿性关节炎的评估。此外，由于作为类风湿性关节炎的潜在性或倾向性的诊断或指示的选择检测的抗CCP抗体的出现，明确需要增加病患数量以检测抗CCP抗体的存在。这然后提出了对用于人体样品中抗CCP抗体的检测和/或量化的更简单、更快、更高灵敏度、更精确、更高通量和/或更自动的检测方法的需要。

发明内容

本发明人现在已经令人惊讶地确定：通过提供如本文指出的用于人体样品中抗CCP抗体的均相检测，可以改进一部分或全部上述因素的平衡并因此提供更有效的临床检测。

在第一个方面，本发明因此提供了检测临床样品中抗CCP抗体的方法，所述方法包括用至少一种包含至少一种抗CCP抗体的结合伴侣的均相试剂接触所述样品，从而在均相样品混合物中形成抗CCP抗体-结合伴侣复合物的溶液或悬浮液，并检测所述抗CCP抗体-结合伴侣复合物的存在或水平。

本发明的抗CCP抗体的评估目前的主要应用是分析主体中类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性和/或倾向性，其中临床样品从所述主体中取出。

在第二个方面，本发明因此提供用于评估主体中类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性或倾向性的方法，所述方法包括在根据本发明的均相检测中检测所述主体的身体样品中的抗CCP抗体，从而检测所述样品中的抗CCP抗体水平(如存在、不存在或相对或绝对的浓度)，并将因此测得的水平与所述主体中类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性或倾向性相关联。

在这个方法中，优选地，将抗CCP抗体的存在或高于一个或多个阈值的抗CCP抗体浓度与类风湿性关节炎的存在、增加的风险、增加的潜在性和/或增加的倾向性相关联，以及将抗CCP抗体的不存在或低于一个或多个阈值的浓度与不存在类风湿性关节炎、降低的风险、降低的潜在性和/或降低的倾向性相关联。

与评估主体中类风湿性关节炎相关的本发明所有的方面中，本方法可能同样可选地包括其它生化标记物的评估，如与抗CCP抗体评估结合的类风湿因子(RF)，正如上面所指示的。然后可以对每一个检测的因子进行适当的加权，以确定类风湿性关节炎的可能性或存在度、风险度、潜在性和/或倾向性。同样允许使用两个或多个独立因素以作为放在预测中的可信度评估。如果所有的因素合适，将存在高可信度。但是，如果因素不合适，可能考虑每一个个别因素提供假阳性或假阴性的倾向性(例如，已知大约20％的类风湿性关节炎患者对类风湿因子是阴性的)。

在本发明第二个方面的方法中，在接受或已经接受类风湿性关节炎治疗的患者中，抗CCP抗体的不存在，或低于至少一个阈值(如，本文中所说明的那些绝对值或相对值，或在同样主体上通过本方法从之前的检测中确定的值，包括对采取治疗或不采取治疗的疾病的预期进程的任何修正因素)的浓度可以被看作为有效治疗。相反地，抗CCP抗体的存在，或高于至少一个阈值(如，本文中所说明的那些绝对值或相对值，或在同样主体上通过本方法从之前的检测中确定的值，包括对采取治疗或不采取治疗的疾病的预期进程的任何修正因素)的浓度可以被看作为效果较差的治疗或无效治疗。这些方法将因此同样帮助监测患有类风湿性关节炎的病患的治疗效果或在具有高度的类风湿性关节炎的风险或倾向的病患中的预防。

在进一方面，本发明同样提供了用于实施根据本发明的方法的试剂盒，包括至少一种抗CCP抗体的均相特异结合物。本发明的试剂盒可选地包括用于实施检测的辅助试剂。

瓜氨酸肽是在患有类风湿性关节炎病患的血清中发现的重要自身抗体的抗原。对于类风湿性关节炎具有最大临床前景的自身抗体是靶向于含有瓜氨酸的抗原表位的抗瓜氨酸蛋白抗体。瓜氨酸是非标准氨基酸，由精氨酸残基通过肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)的翻译后修饰产生——这个过程被称为瓜氨酸化。

本发明的检测方法使用至少一种特异结合物以产生包含结合物和来自样品的抗CCP抗体的复合物，然后检测所述复合物。在优选实施方式中，使用一种或多种CCP作为抗原结合物来检测抗CCP抗体。然后通过适当的方法检测样品中包含的抗CCP抗体与CCP抗原的结合。可选地，或与抗原结合物结合，由抗CCP抗体自身产生的抗体(抗抗CCP)同样可以用作特异结合物。

如本文中所使用的，术语“结合伴侣”和“特异结合物”被用于指示与目标成分(通常是抗CCP抗体)特异性结合的结合物、伴侣或配体。这样的结合物通常表现出与样品中其它成分，如其它肽、蛋白或抗体很小的结合亲合力或没有结合亲合力。例如，与来自同样主体的非抗CCP抗体的亲合力应当不超过结合物或配体与抗CCP抗体的亲合力的1/100，优选地不超过1/1000，最优选地不超过1/10000。特别优选与非抗CCP抗体的相对亲合力是1/10⁴至1/10⁸。

本发明的检测是均相的，这在方法简化、易于自动操作、减少试剂数量和反应步骤、增加可靠性中提供了相当多的好处。但是，这的确对检测设计增加了相当大的要求，因为没有机会冲洗过量或未结合的试剂。

本发明的发明人现在已经意识到，通过适当的结合和检测技术，可以设计抗CCP抗体的均相检测，以得到高度灵敏性和可靠性而不需要清洗和异相分离。

本文中使用的术语“均相”表示样品试剂或其它混合物是稳定单液相。因此分子溶液将被认为是均相的，因为悬浮液的颗粒十分小，经过至少是实施所述实验所需要的时间内它们不会明显沉淀或漂浮在整体液相外，所述时间优选1小时，更优选3小时。最优选的是悬浮液在更长时间内稳定，如至少一周，优选至少一个月。用于检测，如通过比浊法，本发明的方法使用均相技术。这种情况下，仅需要混合物在足够时间内保持均相以获得精确的检测(典型地从20秒至3小时，更优选地在2-60分钟之间)。

与上文一致，本文使用的术语“均相检测”是一种检测方法，其中样品和至少一种试剂混合、产生信号、检测信号而不使用包括相分离的任何分离或清洗步骤。因此，本发明的均相检测方法中没有任何时刻是从整体液相中通过结合或捕获至固体载体上而分离的样品的抗CCP抗体成分或任何包含抗CCP抗体成分的复合物。因此不需要任何相分离步骤，本方法的过程明显简化。通过相分离的抗CCP抗体的预浓缩可能在本发明的方法之前，但这不是优选实施方式，因为这增加了步骤数和检测的整体复杂性。明显地，因为在这样均相检测方法中没有可能的清洗步骤，该方法、所述结合物和产生信号部分必须记住用这种选择，如在本文中所详细描述的。

与涉及例如固体表面的非均相技术的自动操作相比，合适的均相检测的自动操作相对容易做到。同样，进行的自动均相操作过程经常更可靠，由于需要更简单的器械使用，较少倾向于例如损坏。自动操作的均相检测同样很快，允许样品的高通量，并且运行相对便宜。

多种类型的已知检测形式可以用于提供均相检测，特别有价值的是在其中通过将样品成分集合在一起产生信号的那些。多价(特别是二价)种类的抗体作为交联剂，将它们的结合物成对集合在一起，或者至少一些特异结合物同样是多价，形成更大的集合体。因此，优选地，通过一种方式可检测抗CCP抗体-结合伴侣复合物，这种方式不明显地单独检测抗体或任何结合伴侣。合适的方法包括荧光共振能量转移(FRET-其中两个荧光团分别连接至两个抗CCP抗体结合伴侣上)；闪烁亲近检测法(SP-其中放射标记物和闪烁物分别连接至两个抗CCP抗体结合伴侣上)；荧光偏振(FP-其中翻转并且因此使连接至至少一个特异结合物的荧光团的去偏振由于更大复合物的形成而减慢)；以及最特别的集合作用，其中入射辐射(特别是光，如激光)的吸收或散射由于样品中的小微粒和/或成分的集合以产生更大微粒而增加，更大微粒比形成它们的小微粒/成分的效果总和具有更大的散射效果。典型地通过比浊法或散射比浊法检测微粒集合体。

因此本发明的非常优选实施方式是通过均相检测形式的抗CCP抗体的评估，该均相检测形式涉及包覆有或连接至抗CCP抗体结合物的微粒(如乳胶微粒)的凝集，其中该抗CCP抗体结合物如CCP肽和/或抗CCP抗体结合适体。最优选的是CCP肽。

阈值和参考范围可以通过许多惯例技术确定。任何阈值的基础最终必须检测患有不同阶段疾病的病患并且将那些结果与健康志愿者对照组进行比较。这是一种已知的惯例，并且应当优选地直接进行本发明的检测方法以建立在进行该检测的区域内的有关人群概况。优选的阈值将是至少80％临床确诊患有类风湿性关节炎的病患将提供产生高于选择值信号的样品(优选地，这将至少是90％，更优选地至少95％，如95％至基本上100％)。相似地，将选择优选的阈值使得至少80％，优选地至少90％和更优选地至少95％(如95％至基本上100％)的健康对照主体将提供产生高于阈值的信号的样品。

既然现有的检测抗CCP抗体的方法和这个与类风湿性关节炎的联系是可利用的和有效的，对以上方法的选择或补充的方法是对照多个现有的抗CCP抗体类风湿性关节炎检测方法中的一个标准来校准由本方法产生的信号。例如，从Axis-Shield Diagnostics,敦提,英国可得到的DIASTAT(TM)抗CCP抗体ELISA检测是商业上以及广泛利用的抗CCP抗体的异相检测方法，其提供了每ml任意单位的检测结果，定义为U/ml。明显地，本发明的方法可以对照这样一种方法校准：通过使用两种方法运行一系列样品并构建校准曲线以联系两个标准。这使得将阈值和参考值从已知平台转换至本发明的新的均相方法。

当本发明的方法已经对照上述的DIASTAT(TM)抗CCP抗体ELISA检测校准时，通常能够在其中找到抗CCP抗体浓度值的相当参考范围(对于健康个体)是<1.0-2.9U/ml。血清或血浆中的抗CCP抗体浓度高于5.0U/ml(如3.5-2000，优选地5.0-500，特别是8.0-200(或更高)U/ml)通常将是类风湿性关节炎潜在性或类风湿性关节炎倾向性非常强烈的指示。在一个实施方式中，抗CCP抗体值比阈值(如3U/ml，优选地5U/ml)越高，越将被认为是趋向类风湿性关节炎。

本发明中用于评估抗CCP抗体浓度特别优选的检测方法是基于微粒的免疫测定。这是一种灵敏的技术，其基于抗CCP抗体介导的悬浮液中纳米微粒集合体的比浊检测，以及相应地抗CCP抗体浓度的测定。由检测提供的灵敏度有利于以高水平精度检测体液(如血浆或血清)样品中相对低浓度的抗CCP抗体。同时，同样可以精确检测相对高浓度的抗CCP抗体。

典型地，抗CCP抗体含量超过宽范围的校准样品将被用于校准和标准化检测方法。最有效和最具代表性的校准样品通常来自于取自具有非常高的抗CCP抗体量的病患的临床样品，如果需要则对其稀释以形成校准范围。对照上述DIASTAT(TM)抗CCP抗体ELISA检测而标准化的0-2000U/ml的校准范围将是高度合适的，尽管实践中0-200U/ml的范围可能足以提供需要的临床信息。对于这个分析物目前没有国际参考标准，因此所述检测使用在本文中详细描述的任意的Axis-Shield单位(U/ml)。优选地本发明的检测方法对于低至0.5U/ml，优选地低至0.1U/ml浓度的CCP是灵敏的。因此，可检测的范围应当是大约0.1-2000U/ml，如0.1-200U/ml。

如上面所说明的，对照标准样品直接校准本发明的方法将是有利的，并且合适的阈值应当通过检测病患组和健康个体的对照组而确定。在许多例子中，并不需要知道多少绝对浓度的抗CCP抗体与特定阈值或检测的值相关。任意标准是足够的，假设它是可重复的，并优选地它可以与在其它普通方法中使用的标准关联，如上述的DIASTAT方法，以直接比较结果。在所有方面中本发明的检测方法可以是定性的、半定量的或全定量的，但是定性检测是最容易实践的实施方式，其中所述水平是对照一个或多个对照样品评估的。但是，通过合适的方法，如内插至标准曲线，可以实践对任意或绝对标准的半定量或全定量检测。

上述的0.1-200U/ml的标准被认为是相应于大约10ng/ml-20μg/ml的抗CCP抗体，但是，这取决于不同抗体亲合力的不同。因此，尽管二者都是优选的并且某种程度上需要通过参考患有和不患有类风湿性关节炎的主体人群以确定一个或多个阈值，对于人类主体可能使用这个作为合适的检测范围和阈值的指导。因此，对于存在或不存在类风湿性关节炎的合适阈值可以是大约0.1μg/ml-大约5μg/ml，特别是大约0.2μg/ml-大约2μg/ml，最优选地大约0.4μg/ml-大约1μg/ml。相应地，合适的检测范围和用于标准溶液或校准溶液的合适范围是大约1ng/ml-大约200μg/ml，优选地10ng/ml-大约100μg/ml。

既然浊度检测法是本发明高度优选的实施方式并且用于自动操作这样检测所需要的设备是已知的，如上所述，本发明将主要参考浊度检测法描述。但是，应当意识到，基于将成分集合在一起以产生新信号的任何检测方法，如本文上面所描述的，可以通过使用本领域常用的标记/检测系统改变下面公开的方法而等效地使用。因为浑浊溶液可以通过吸收(比浊法)或散射(散射比浊法)方法分析，本文中使用的术语“比浊法”包括上下文中允许的散射比浊法检测。

本发明中的浊度检测是均相的并因此同样具有优势：检测中不需要用于物质分离的固体表面以及不需要多个清洗和/或分离步骤。因此与现有技术(如ELISA)相比，在本发明的均相方法中，抗CCP抗体的检测是快速的并且容易实施以及例如容易地自动操作。

如上所述，自动操作的、均相的浊度检测同样是快速的，允许高通量的样品，并且运行相对便宜。典型地，可以使用商业可利用的自动机实施，如Cobas Mira或Hitachi 711，二者都购于Roche Diagnostics。当设想例行检测个体(如来自本文描述的高风险组的那些)的类风湿性关节炎潜在性或倾向性时，这样的自动操作检测特别有吸引力。

在本发明的所有方法中，关键步骤是抗CCP抗体浓度的测量，含有抗CCP抗体的样品将通常是体液，如尿液、脑脊髓液、唾液、滑液或肺气肿积液，或更优选地全血或源于血液的样品。当使用源于血液的样品时，用于分析的样品将优选地是去除细胞的(如血清或血浆)。细胞去除将典型地从样品中移除至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％的细胞。可以移除高达基本上100％的细胞。可以处理任何样品液体，包括血液和血液衍生物以移除任何细胞和/或不被检测的任何样品成分。同样可以处理样品以浓缩(如，通过转移抗CCP抗体至分离(如固体基质)的介质，分离，在更高浓度下再悬浮)或稀释样品。如果需要，样品预处理的其它已知方法，包括离心法、特定成分的分离、或防腐剂如抗凝结剂的添加同样是合适的。例如，可以通过添加水、缓冲液或其它水介质稀释样品。可选地和优选地，样品，特别是全血、血清或血浆样品，可以直接使用。本发明的方法中使用的样品通常是“包含抗CCP抗体的样品”，其在本文中用于指示典型地包含抗CCP抗体的样品，特别是在患有类风湿性关节炎或具有类风湿性关节炎倾向性的主体中。因此，这样的样品中抗CCP抗体的存在假定处于某一水平但是通过所述检测方法测量。相应地，在适当的检测水平上这样的样品中抗CCP抗体的不存在可以用于指示类风湿性关节炎的不存在，或降低的类风湿性关节炎风险或倾向性。

取样主体及诊断或分析风险或可能性的主体是人类或非人动物主体，特别是哺乳动物，优选是人类、犬科或猫科哺乳动物。最优选是人类主体。主体可以是具有或不具有类风湿性关节炎任何现有临床表现的主体。任何主体都适合检测，但最合适的是具有一些已知的类风湿性关节炎风险或迹象的个体，和处于风险组中的那些，如较老的主体(如，超过50岁，特别是超过60以及最特别地超过65岁的人类主体，如在50-100之间的主体)，患有骨损伤或损害的主体，或那些关节遭受增加的或不正常的关节磨损的主体，如运动员，或从事或已经从事使他们倾向于关节磨损的职业的那些。具有使他们倾向于类风湿性关节炎的其它情况的主体同样是高度合适的，特别是患有炎症和/或自身免疫疾病的那些，具有类风湿性关节炎家族史的那些和/或遗传检测已经显示倾向于发展类风湿性关节炎的那些。其它潜在的主体组包括具有可能预示类风湿性关节炎的临床症状的那些，但是可能预示其它情况，如关节僵硬或关节疼。该方法在没有症状的患者(如高风险组中表面上健康的主体)或仅具有较小的类风湿性关节炎症状或类风湿性关节炎早期症状患者中特别有用，因此在不可逆的损害发生之前可以进行诊断、证实或维持以及开始适当的治疗。

本发明的关键方面涉及作为抗CCP抗体特异结合物的至少一种CCP肽抗原的应用。合成的CCP肽是已知的并且可以使用通常技术或商业肽合成得到。实施者同样可以制备重组肽并修饰(如果需要)以产生CCP肽。合适的CCP肽的序列和描述以及它们的类似物在WO98/22503中可以得到，WO98/22503全部的公开内容通过引用的方式结合至本文。合适的CCP肽可以结合、偶联或连接(直接或间接)至产生信号部分并因此用于产生与CCP/抗CCP抗体结合程度相应的信号。例如，在本发明的方法中可以使用通过制备肽的任何常规技术获得的任何CCP肽。

抗CCP抗体已经显示与适当序列的线性肽特异反应，以及与环瓜氨酸肽和它们的环状类似物特异反应(见WO98/22503)。用在本发明中的CCP肽可以因此是环状的，但不管是环状还是线性，它们将是具有至少一个修饰的精氨酸残基的肽，特别是精氨酸被修饰为瓜氨酸或它的类似物。由于链内二硫键的存在，这样的肽可以是环状的，尽管可以使用其它形式的交联。合适肽可以是任何大小，但优选的肽将是大约5-200个残基长度，优选地8-80个残基，更优选地大约10-30个残基长度。特别参考上述WO98/22503的公式页和它的权利要求2，它们一起包含特别优选的瓜氨酸部分的定义和特别优选的CCP肽序列。WO98/22503的公式页和它的权利要求2因此特别地合并至本发明的公开内容中。

产生信号部分可以是，例如在浊度检测情况中的微粒；在FP检测情况中荧光团作为第一产生信号部分，同样任选地更大的分子如微粒或巨大分子作为第二产生信号部分；在FRET检测情况中一个或两个所需要的荧光团；或者在SP检测中的闪烁物和/或放射性同位素。由于不同的产生信号部分通过结合，特别是通过样品中的抗CCP抗体双结合/交联而集合在一起，产生了相应的信号，并可以通过相应方法检测。在一些情况下，如FRET和SP，需要两个或多个产生信号部分，并且最有利地以特定比例(如1:1)或以控制的方式被集合在一起。在这样的情况下，将抗CCP抗体的单一特异结合物连接至每一类型的产生信号部分使得比例和结合是可以控制的，这可能是有利的。这些可以是不重叠的(如CCP肽和适当的抗CCP抗体结合适体)，使得抗CCP抗体将产生信号部分集合在一起成为足以控制的组合。在这些情况下，每一个产生信号部分将典型地连接至单一特异结合物。

在其它方法中，如比浊法，将几个信号结合部分集合在一起形成延伸的网络可能有更大的价值。这可以通过将多于一个(如2-1000，特别是2-100)特异结合物结合至单一产生信号部分而完成。在本发明的一个实施方式中，产生信号部分可以是特异结合物本身而不是单独实体。在这样的情况下，结合行为产生信号，这样的信号是典型地物理变化，如样品散射性质的差异，或由于释放的结合能使得的样品温度非常小的变化。当特异结合物是天然地多价(如二价)如抗体，并且特别是如果多种这样的结合物识别抗CCP抗体的不同区域(抗原表位)(如至少两个不同的抗CCP抗体结合适体识别不同区域)，大量结合物本身可以是产生信号部分，因为当特异结合物被集合在一起，交联网络将形成产生可检测大小的集合体。相似地，当几个CCP抗原序列被连接在一起，成为单一肽或作为连接至骨架分子或微粒的抗原，交联网络将形成产生可检测大小的集合体。

在浊度检测中，通过用CCP肽抗原(优选地结合至产生不透明性部分，如纳米微粒)接触含有抗CCP抗体的样品，或它的等分部分，可能产生不透明性。在特别优选的方法中，两个或多个(如2-1000，特别是2-100)抗CCP肽可以结合至各微粒。

本发明方法中使用的用于测定抗CCP抗体浓度的CCP肽优选地显示出与可能在洗出液中存在的其它血液蛋白没有或很少交叉反应。在任何情况中使用的肽的数量当然可以对照含有抗CCP抗体的标准样品优化。这在如比浊法和其它涉及交联/寡聚化的方法中特别重要，因为这些效果可能是非线性的。对于比浊法，乳浊化起于钩状效应，由此多个抗CCP抗体结合产生乳浊化中心。但是，这个效果所需要的结合程度将取决于如产生信号部分的大小和连接至这些中的每一个的特异结合物的平均数的因素。

在一个优选的浊度法实施方式中，CCP肽可以通过直接或间接结合或偶联至在均相浊度检测中通常用于固定的任何熟知的固体载体或基质而被固定。

在本发明的所有浊度方法中(包括使用散射比浊法检测的那些)，固体载体或基质优选地采取微粒的形式，最优选的微粒是悬浮在水介质中并且小于红色波长，优选地小于蓝色以及更优选地紫外线(如小于250nm)波长。纳米微粒是最优选的，特别是直径在0.5-800nm之间的那些，优选地，在2-250nm之间，更优选地在10-100nm之间的那些。便利地，所述固体载体可以由玻璃、硅石、乳胶、金属(如金)或聚合材料(如聚乙烯)制成。优选地，固体载体由聚合材料如聚乙烯制成。

在浊度法实施方式中特异结合物(如CCP肽、抗体、抗体片段或适体)可以结合的微粒典型地是球形。在检测中使用的微粒大小可能影响测定抗CCP抗体浓度所使用的精度。当较大的微粒允许较低浓度的抗CCP抗体被检测时，它们减少的表面积意味着它们具有较低的结合能力。例如，微粒直径加倍，质量单位微粒的结合能力减半。

此外，增加微粒直径增加了背景光吸光率水平和在这样的检测中典型使用的波长处(如330-600nm)的光暂停(light suspension)。因此，当较大微粒增加了检测的灵敏度时，这可能伴随一些精确性的损失，特别是获得的假阴性结果数量的增加。这特别可能是具有含有相对高的抗CCP抗体浓度的样品的情况(即，这些样品从具有高类风湿性关节炎潜在性或倾向性的个体中获得)，其中结合纳米微粒的结合位点可能饱和而不是所有的抗CCP抗体被结合。但是，通过合适的检测设计，可以确定这个饱和点在完全高于临床诊断的相应阈值的浓度达到。如果需要量化这个非常高的水平，可以提示该检测操作员以实现二级检测，使用适用于更高的抗CCP抗体浓度范围的可选的试剂，或更优选地，简单地将原样品稀释已知倍数(如10或100)并且用原来的检测方法中再一次检测。

这些与改变微粒大小相关的反作用效果(如增加微粒大小增加灵敏度但是减少了精确性)表现了在用于通过比浊法检测体液中存在的抗CCP抗体水平范围的灵敏检测的发展中要克服的重要问题。这样的检测在本文描述，并仍然在所附的实施例中举例说明。

本发明的检测方法进一步优选的是，使用的微粒和方法允许精确地检测宽范围抗CCP抗体浓度。这可能意味着对于阴性结果(即低于阈值的浓度)以及阳性结果高水平的可信度。在本发明的检测方法中特别优选的是，可以检测抗CCP抗体浓度在1pg/ml-100μg/ml，优选地1ng/ml-50μg/ml，更优选地10ng/ml-10μg/ml(如10ng/ml-1μg/ml或100ng/ml-10μg/ml，相应地接近于例如0.05U/mL-200U/mL，或0.5-200U/mL)范围内的样品。

抗CCP抗体结合物，如CCP肽、适体等可以结合的微粒典型地是球形，直径为1-150nm，例如10-90nm或15-60nm，如44nm。在本发明的特别优选的检测方法中，抗CCP抗体结合物，如CCP肽所结合的微粒的直径是55-140nm，更优选地65-110nm，例如70-90nm。

所述微粒，处于“裸”态和包覆状态，优选地具有的直径其本身不能吸收用于分光光度测量所使用的光的波长。因此，包覆的纳米微粒的悬浮液近似地(如基本上)透明直到抗CCP抗体诱导的集合体形成发生，导致具有更大直径的集合体形成。这样的集合体具有吸收和散射在分光光度计中使用的光的波长的能力。

此外，微粒优选地基本上是同一大小，更优选地是同一直径。因此，它可以是少于1％的微粒具有多于两倍平均值的直径。优选地，使用单分散性金属(如金)或聚合物微粒。单分散性聚合物微粒可以购自DynalBiotech AS，奥斯陆，挪威。

当不希望限制于理论时，认为通过使用基本上全部同样大小的固体载体或基质(如纳米微粒)，可以增加比浊法检测的灵敏度。

CCP肽或其它肽特异结合物的结合或固定可以使用任何惯常技术完成。例如，通过在缓冲液中搅动(如室温下24小时)抗生物素蛋白(购自Pierce Chemical Company)可以被固定在氯甲基活化的聚苯乙烯纳米微粒(购自Interfacial Dynamic Corporation，美国)上，然后与生物素标记的CCP肽联合使用(根据本领域常规技术制备)。因此，例如，从检测主体中取得的血浆被添加至分光光度计的石英比色杯中的抗生物素蛋白包覆的纳米微粒溶液中，然后添加生物素标记的CCP肽。然后读出浊度计数值。这样方法的结果在图1中说明。

可选地，生物素标记肽可以在添加血浆或血清之前添加。换言之，当典型地使用同样的试剂而不考虑在浊度检测中使用的仪器时，添加不同试剂的精确顺序可以变化。通常，使用的顺序应当依照附随使用的分光光度计(如Shimadzu UV-160分光光度计)的说明书。

读取浊度计读数(即每隔一定间隔测定在合适波长处的光吸收或光散射)，并确定相对于参考的测量值。对于其它的检测方法，使用类似方法，如本领域已知的。任选地，可以使用多波长仪器以进行浊度计读数并可以提供更精确的结果。用于阅读浊度计读数的合适仪器包括Cobas Mira、Roche Integra和Merck's Turbiquant。

在可选的实验设定中，CCP肽结合至或固定至产生微粒不透明性的部分可以使用任何其它常规技术实现。例如，通过在缓冲液中的搅动(如，在室温下24小时)非特异IgG或疏水蛋白可以被固定在氯甲基活化的聚苯乙烯纳米微粒上(购自Interfacial DynamicCorporation，美国)并在IgG分子结合在纳米微粒之前或之后使用交联试剂(购自Pierce，美国，根据本领域常规技术制备)偶联至CCP肽。因此，例如，取自检测类风湿性关节炎潜在性或倾向性的主体的血浆被添加至分光光度计的石英比色杯中的包覆的纳米微粒溶液中。然后进行浊度计读数。见图2和3。

典型地使用同样的试剂而不考虑在浊度检测中使用的仪器，不同试剂添加的精确顺序可以变化。通常，使用的顺序应当依照附随使用的分光光度计(如Shimadzu UV-160分光光度计)的说明书。

适用于依照本发明的浊度检测方法进行的浊度计读数的自动机的例子包括CobasMira和Hitachi 711，二者都购自于Roche Diagnostics。

通过使用基本上全部同样尺寸的固体载体或基质(如，纳米微粒)，比浊法检测的灵敏度可能进一步提高，如上面所显示的。

可以优化本发明的检测方法的不同特征以改进结果。这些包括以下优选的特征，都是可选的并独立可用的。

任选地，在检测抗CCP抗体浓度中，可以使用动力学阅读模式。这个方法可以优选地用在本发明所有方面，特别是比浊法技术。

通常，除评价的样品外，具有已知抗CCP抗体含量的校准样品将同样在检测方法的实施中评估。这样的检测结果可以用于描绘校准曲线，被评估样品的抗CCP抗体含量可以从此确定。

优选地使用抗CCP抗体含量高达10μg/ml的校准样品(如0、1、2、4、5、8和10μg/ml的任何选择，或它们之间的任何其它数值)。

当需要信号(如用于FRET或FP的荧光团)刺激时，这个刺激将典型地通过电磁辐射，特别是通过光，如单色光，包括激光。合适的波长将是例如，100-800nm，优选地250-600nm，以及最优选地300-600nm。检测(独立地在FRET情况下)可以在相似的范围内。

在优选的浊度检测方法中，可以对几个额外的特征进行优化以最好地实施该检测方法。

作为浊度检测中的程序，聚合的乳浊化增强剂，如聚乙二醇同样优选地添加至洗出液中。

在进行浊度测量之前，可以在室温下短时间地培育片段、抗体或抗体片段，优选地结合至纳米微粒，并且任选地包括乳浊化增强剂，如5分钟至1小时，优选地8-20分钟(如大约10分钟)。

在乳浊化测量中使用的光应当具有合适的波长，如300-600nm。在这点上，发现使用300-450nm滤光器，优选地340nm或405nm滤光器提供了显著好的结果。使用560nm的滤光器同样可以提供特别好的结果。

上述的检测抗CCP抗体的检测方法(特别是通过浊度方法)令人惊讶地可靠、快速、便宜、容易做到并能够自动操作。这与现在利用的检测方法形成对比，现在利用的检测方法相对复杂并且对于诊断实验室通常使用的自动操作的多任务诊断机器不能直接利用。

当包括多个混合、添加和/或稀释步骤时，特别期望自动操作，因为这些可能达到更高的精确程度。自动机同样可以提供更高水平的可靠性和/或重复性。自动操作同样增加了生产量。

但是，目前利用的可以提供合理水平精度的检测方法(如ELISA)难以自动操作。这至少是一部分，因为它们典型地包括许多清洗和分离步骤(如，连接至固体表面)，并且非均相过程的自动操作经常是有问题的。同样这些过程典型地包括相对大数量的步骤，这些步骤增加了自动操作方案的复杂性。

因此，根据高度优选的实施方式，本发明提供了检测含有抗CCP抗体体液中的抗CCP抗体的检测方法，所述方法包括步骤：(a)获得所述流体的或源于所述流体的包含抗CCP抗体的液体样品；(b)用任选地结合纳米微粒的CCP肽接触所述体液的样品以结合所述抗CCP抗体；(c)任选地添加不透明性增强剂；以及(d)通过比浊法评估抗CCP抗体含量。

这样的检测在特征是不正常水平(如，高水平)的抗CCP抗体的类风湿性关节炎情形的诊断中可能是有用的。因此提高的抗CCP抗体，如处在可测量的水平或高于预先确定的阈值(如在本文中所指出的那些)可以被作为任何人群(包括本文指出的任何个体或那些人群的组合)的类风湿性关节炎发展中的风险因素。本发明因此提供评估主体中类风湿性关节炎风险的相应的方法，包括存在类风湿性关节炎的风险，潜在的类风湿性关节炎的风险，和/或类风湿性关节炎倾向性的风险。提高的抗CCP抗体可以用作唯一的风险因素，或可以与其它风险因素结合使用。根据本发明的抗CCP抗体的评估同样可以用在检验或支持主体中类风湿性关节炎的存在，所述主体具有类风湿性关节炎的可能症状或处于类风湿性关节炎风险中。合适的人群包括在本文中以任何组合提及的那些。

在浊度检测方法中使用的身体样品可以是任何含有抗CCP抗体的样品，或任何潜在含有抗CCP抗体的样品，如体液或组织样品，或悬浮液等。优选的样品类型在上文描述。

在一个方面，本发明提供用于实施根据本发明的检测方法的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种抗CCP抗体的均相特异结合物。所述试剂盒优选地同样包含至少一种产生信号部分，优选地，已知浓度的抗CCP抗体溶液，更优选地，具有一定范围的抗CCP抗体浓度的一系列这样的溶液；优选地，导光管；以及优选地，检测器。

抗CCP抗体特异结合物优选地至少是一种CCP肽和/或至少一种抗抗CCP抗体。

当所述方法是浊度法，抗CCP抗体特异结合物优选地固定在固体载体上(如纳米微粒)，所述试剂盒优选地进一步包含乳浊化增强剂，如PEG和本文中所描述的那些。

如果期望可以设置自动操作设备以接收含有抗CCP抗体的体液样品，使用结合至产生信号部分(如纳米微粒)的抗CCP抗体特异结合物，任选地使用乳浊化增强剂并评估抗CCP抗体含量。这样的设备同样被认为是落入本发明的范围内。

附图说明

现在将参考下面的实施例描述本发明，下面的实施例是出于举例说明的目的而提供，并不计划解释为对本发明的限定。本发明通过附图进一步举例说明，其中：

图1通过抗生物素蛋白包覆的纳米微粒溶液中的抗CCP抗体和生物素标记的CCP肽示意性地表示了交联；

图2通过用结合有CCP的二抗包覆的纳米微粒溶液中的抗CCP抗体示意性地表示了交联；以及

图3通过用结合有CCP的疏水蛋白包覆的纳米微粒溶液中的抗CCP抗体示意性地表示了交联。

具体实施方式

实施例1

抗CCP抗体的浊度检测

(a)抗生物素蛋白包覆的纳米微粒的制备

600μl、4.2％w/v氯甲基活化的纳米微粒(直径44nm)(购自Interfacial DynamicCorporation，美国)用孔大小是300,000Da的膜进行水透析。

添加0.5ml的硼酸盐(10mM)和氯化钠(15mM)溶液(pH9.0)并混合。添加10mg抗生物素蛋白，其溶解在pH9.0的0.5ml的10mM硼酸盐和15mM NaCl溶液中(购自Pierce ChemicalCompany)，室温下搅动混合物24小时。然后添加40μl的甘氨酸溶液(2M，pH9.0)，在室温下继续搅拌所述混合物4小时。

然后将微粒稀释至100ml的体积并透析过滤，首先在500ml的10mM硼酸盐和15mM氯化钠溶液(pH9.0)中，然后在25mM Tris、150mM氯化钠和0.01％吐温20溶液(pH7.4)中(购自Sigma美国)，使用PelliconXL过滤器(截断300,000)和小型反应TTF系统(购自Millipore)，依照仪器厂商提供的说明书。期望浓度的抗生物素蛋白包覆的纳米微粒最终通过离心和微粒在25mM TRIS、150mM氯化钠和0.01％吐温20溶液中再悬浮而获得。在这个制备程序中形成的任何集合体可以通过慢速离心而除去。

(b)使用抗生物素蛋白包覆的纳米微粒检测抗CCP抗体

浓度是每ml大约0.30mg微粒的上述抗生物素蛋白包覆的纳米微粒的悬浮液通过离心及上述制品在pH7.4的25mM TRIS、150mM NaCl、0.1％吐温20和2％PEG 6000溶液中(购自Sigma)再悬浮而制备。500μl这样的微粒悬浮液与取自检测类风湿性关节炎倾向性的主体的血浆样品(大约20μl)混合在记录式分光光度计(如Shimadzu UV-160)的读取石英比色杯中。

记录340nm单色光的吸收率，60秒后，将在50μl的25mM TRIS、150mM NaCl和0.1％吐温20溶液(pH7.4)中稀释的用1.0nmol生物素标记的1.5μg CCP肽(如生物素标记的CCP肽)添加至石英比色杯中并混合。使用含有pH7.4的25mM TRIS、150mM NaCl和0.1％吐温20溶液的对照比色杯立即记录340nm单色光的吸收率，并再一次以一定间隔(如每2分钟)直至持续大约15分钟。在每一个时间点上吸收率的增加依照动力学模式的标准浊度读数或“终点”读数计算。即，在每一个时间点上的光吸收率的增加相对于添加CCP包覆的纳米微粒之前和/或记录末端时的读数计算。

使用已知浓度的抗CCP抗体标准品实施同样的过程以构建校准曲线。然后样品中的抗CCP抗体浓度从校准曲线中计算。

实施例2：可选的抗CCP抗体的浊度检测

(a)CCP肽包覆的纳米微粒的制备

1ml的4.2％w/v氯甲基活化的纳米微粒(直径44nm)(购自Interfacial DynamicCorporation，美国)用孔大小是300,000Da的膜进行水透析。

然后添加0.5ml的10mM硼酸盐和15mM氯化钠溶液(pH9.0)。1.5μg纯化的CCP肽(如，亲和纯化的CCP肽)用10mM硼酸盐和15mM氯化钠溶液(pH9.0)透析。

向纯化的CCP肽中添加纳米微粒后，混合物在室温下搅拌24小时。然后添加40μl的甘氨酸溶液(2M，pH9.0)，在室温下继续搅拌混合物4个小时。

然后将微粒稀释至100ml的总体积，并用1000ml的10mM硼酸盐和15mM氯化钠溶液(pH9.0)透析过滤，其中溶液中添加有0.10％吐温20和3mg/ml的卵蛋白，透析使用PelliconXL过滤器(截断300,000)和小型反应TFF系统(购自Millipore)，依照仪器厂商提供的说明书。

期望浓度的CCP肽包覆的纳米微粒最终通过离心和微粒在溶液中再悬浮而获得。在制备过程中形成的任何集合体任选地通过慢速离心除去。

(b)使用CCP肽包覆的纳米微粒检测抗CCP抗体

制备50μl的10mM硼酸盐、15mM NaCl、0.1％吐温20、3g/l卵清蛋白溶液(pH9.0)的悬浮液，其中包含400μg上述的CCP肽包覆的纳米微粒。

同时地，将在500μl检测缓冲液(pH 7.4的25mM TRIS、150mM NaCl、0.1％吐温20和2％PEG 6000(购自Sigma))中的从检测类风湿性关节炎潜在性的主体中取出的20μl血浆置于记录式分光光度计(如ShimadzuW-160)的读取石英比色杯中，并测量340nm单色光的光吸收率。

60秒后，添加上述包含400μg CCP肽包覆的纳米微粒的悬浮液，并在比色杯中混合。立即记录添加CCP包覆的纳米微粒后的光吸收率，并再一次间隔一定时间(如每2分钟)直到持续15分钟。每一个时间点上光吸收率的增加相对于添加CCP包覆的纳米微粒之前和/或记录终点的读数计算。换言之，进行动力学模式下的浊度读数或“终点”读数。

同样使用已知浓度的抗CCP抗体标准品实施同样的过程以构建校准曲线。然后从所述曲线中计算样品中的抗CCP抗体浓度。

实施例3：抗CCP抗体的浊度检测

(a)链霉亲和素包覆的纳米微粒的制备

600μl的4.2％w/v氯甲基活化的纳米微粒(直径67nm)(购自Interfacial DynamicCorporation，美国)用孔大小是300,000Da的膜进行水透析。

0.5ml的磷酸盐(10mM)和氯化钠(150mM)缓冲液(pH7.4)和溶解在0.5ml的10mM的磷酸盐和150mM NaCl缓冲液(pH7.4)中的10mg链霉亲和素(购自Pierce ChemicalCompany)一起添加，将得到的混合物在室温下搅动24小时。然后添加40μl的甘氨酸溶液(2M，pH9.0)，在室温下继续搅动得到的混合物4个小时。

然后将微粒稀释至100ml的体积并透析过滤，首先在500ml的10mM硼酸盐和15mM氯化钠溶液(pH9.0)中，然后在25mM Tris、150mM氯化钠和0.01％吐温20溶液(pH7.4)中(购自Sigma美国)，使用Pellicon XL过滤器(截断300,000)和小型反应TTF系统(购自Millipore)，依照仪器厂商提供的说明书。期望浓度的链霉亲和素包覆的纳米微粒最终通过离心和微粒在25mM TRIS、150mM氯化钠和0.01％吐温20溶液中再悬浮而获得。在这个制备程序中形成的任何集合体可以通过慢速离心而除去。

测量的链霉亲和素包覆的纳米微粒的平均微粒大小是82nm。

(b)使用链霉亲和素包覆的纳米微粒检测抗CCP抗体

浓度是每ml大约0.60mg微粒的上述链霉亲和素包覆的纳米微粒的悬浮液通过离心及上述制品在pH7.4的25mM TRIS、150mM NaCl、0.1％吐温20和1％PEG 6000溶液中(购自Sigma)再悬浮而制备。500μl这样的微粒悬浮液与取自检测类风湿性关节炎倾向性的主体的血浆样品(大约5μl)混合在记录式分光光度计(如Shimadzu W-160)的读取石英比色杯中。

记录560nm单色光的吸收率，60秒后，将在50μl的25mM TRIS、150mM NaCl和0.1％吐温20溶液(pH7.4)中稀释的用1.0nmol生物素标记的1.5μg CCP肽(如生物素标记的CCP肽)添加至石英比色杯中并混合。使用含有pH7.4的25mM TRIS、150mM NaCl和0.1％吐温20溶液的对照比色杯立即记录340nm单色光的吸收率，并再一次以一定间隔(如每2分钟)直至持续大约15分钟。在每一个时间点上吸收率的增加依照动力学模式的标准浊度读数或“终点”读数计算。即，在每一个时间点上的光吸收率的增加相对于添加CCP包覆的纳米微粒之前和/或记录末端时的读数计算。

使用已知浓度的抗CCP抗体标准品实施同样的过程以构建校准曲线。然后从校准曲线中计算样品中的抗CCP抗体浓度。

实施例4：抗CCP抗体的浊度检测

(a)疏水蛋白包覆的纳米微粒的制备

600μl的4.2％w/v氯甲基活化的纳米微粒(直径67nm)(购自Interfacial DynamicCorporation，美国)用孔大小是300,000Da的膜进行水透析。

0.5ml的磷酸盐(10mM)和氯化钠(150mM)缓冲液(pH7.4)和溶解在0.5ml的10mM的磷酸盐和150mM NaCl缓冲液(pH7.4)(购自Pierce Chemical Company)中的10mg疏水蛋白(如牛血清白蛋白)一起添加，将得到的混合物在室温下搅动24小时。然后添加40μl的甘氨酸溶液(2M，pH9.0)，得到的混合物在室温下继续搅动4个小时。

然后将微粒稀释至100ml的体积并透析过滤，首先在500ml的10mM硼酸盐和15mM氯化钠溶液(pH9.0)中，然后在25mM Tris、150mM氯化钠和0.01％吐温20溶液(pH7.4)中(购自Sigma美国)，使用Pellicon XL过滤器(截断300,000)和小型反应TTF系统(购自Millipore)，依照仪器厂商提供的说明书。期望浓度的疏水蛋白包覆的纳米微粒最终通过离心和微粒在25mM TRIS、150mM氯化钠和0.01％吐温20溶液中再悬浮而获得。在这个制备程序中形成的任何集合体可选地通过慢速离心而除去。

测量的疏水蛋白包覆的纳米微粒的平均微粒大小是82nm。

使用根据常规技术制备的交联试剂(购自Pierce，美国)将CCP肽偶联至疏水蛋白纳米微粒。

(b)使用疏水蛋白包覆的纳米微粒检测抗CCP抗体

浓度是每ml大约0.60mg微粒的上述疏水蛋白包覆的纳米微粒的悬浮液通过离心及上述制品在pH7.4的25mM TRIS、150mM NaCl、0.1％吐温20和1％PEG 6000溶液中(购自Sigma)再悬浮而制备。500μl这样的微粒悬浮液与取自检测类风湿性关节炎倾向性的主体的血浆样品(大约5μl)混合在记录式分光光度计(如Shimadzu W-160)的读取石英比色杯中。使用含有pH7.4的25mM TRIS、150mM NaCl和0.1％吐温20溶液的对照比色杯立即记录340nm单色光的吸收率，并再一次以一定间隔(如每2分钟)直至持续大约15分钟。在每一个时间点上吸收率的增加依照动力学模式的浊度读数或“终点”读数计算。即，在每一个时间点上的光吸收率的增加相对于添加CCP包覆的纳米微粒之前和/或记录末端时的读数计算。

使用已知浓度抗CCP抗体的标准品实施同样的过程以构建校准曲线。然后从校准曲线中计算样品中的抗CCP抗体浓度。

Claims (19)

1.一种检测临床样品中抗CCP抗体的方法，所述方法包括用至少一种包含至少一种抗CCP抗体的特异结合物的均相试剂接触所述样品，由此在均相样品混合物中形成抗CCP抗体-结合伴侣复合物的溶液或悬浮液，并检测均相液相中所述抗CCP抗体-结合伴侣复合物的存在或水平。

2.一种评估主体中类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性或倾向性的方法，所述方法包括在根据权利要求1的均相检测中检测所述主体的身体样品中的抗CCP抗体，由此确定所述样品中抗CCP抗体的水平，并将因此确定的水平与所述主体中类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性或倾向性相关联。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，抗CCP抗体的存在或高于一个或多个阈值的抗CCP抗体浓度与类风湿性关节炎的存在、程度增加、风险增加、潜在性增加和/或倾向性增加相关，抗CCP抗体的不存在或低于一个或多个阈值的抗CCP抗体浓度与类风湿性关节炎的不存在、程度降低、风险降低、潜在性降低和/或倾向性降低相关。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述阈值是通过Axis-Shield DIASTAT(TM)抗CCP抗体ELISA检测测定的5U/ml，以及其中高于所述阈值的抗CCP抗体浓度与类风湿性关节炎的存在、风险增加、潜在性增加和/或倾向性增加相关。

5.根据权利要求2-4任何一项所述的方法，包括其它生化标记物的评估，如与抗CCP抗体评估结合的类风湿因子(RF)。

6.根据权利要求1-5任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗CCP抗体的特异结合物结合至至少一种产生信号部分。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，可检测信号由复合物的形成产生，所述复合物包含所述产生信号部分和至少一种其它相同或不同类型的产生信号部分。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述产生信号部分是纳米微粒。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纳米微粒结合至多于一种抗CCP抗体的特异结合物。

10.根据权利要求1-9任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗CCP抗体的特异结合物是至少一种CCP肽。

11.根据权利要求1-10任何一项所述的方法，其特征在于，所述临床样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、唾液、滑液和肺气肿积液。

12.根据权利要求1-11任何一项所述的方法，其特征在于，所述检测通过比浊法完成。

13.根据权利要求12所述的方法，额外包括添加不透明性增强剂的步骤。

14.根据权利要求1-13任何一项所述的方法，进一步包括对通过Axis-Shield DIASTAT(TM)抗CCP抗体ELISA检测所测定的抗CCP抗体含量是0-2000U/ml的校准样品实施所述方法。

15.根据权利要求2-14任何一项所述的方法，其特征在于，所述主体选自以下主体组成的组：较老的主体、患有骨损伤或损害的主体、关节已经遭受增加的或不正常关节磨损的主体、患有炎症和/或自身免疫疾病的主体、具有类风湿性关节炎家族史的主体、遗传检测显示有类风湿性关节炎增加的倾向性的主体和具有疑似类风湿性关节炎临床症状的主体。

16.用于实施根据本发明的方法的试剂盒，包括至少一种抗CCP抗体的均相特异结合物和至少一种均相产生信号部分，该产生信号部分任选地结合至或天然存在于所述特异结合物。

17.用于实施根据本发明的方法的试剂盒，包括至少一种均相特异结合物，其中所述均相特异结合物和抗CCP抗体结合反应而产生信号。

18.根据权利要求16所述的试剂盒，进一步包括至少一种下列可选的成分；

至少一种产生信号部分；

至少已知浓度的抗CCP抗体溶液；

至少一种不透明性增强剂；

导光管；

检测器。

19.一种自动操作设备，用于接收含有抗CCP抗体的体液样品，使用结合至产生信号部分(如纳米微粒)的抗CCP抗体特异结合物，可选地使用乳浊化增强剂，和评估抗CCP抗体含量。