CN103439515B - 一种抗体效价的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗体效价的检测方法,包括如下步骤:1)将抗原偶联微球上,得到改性微球;2)将改性微球与抗体溶液混合反应;3)测定反应液的浊度,确定抗体效价。本发明的方法,利用生物素-链霉亲和素系统将CCP修饰在聚苯乙烯微球表面成功制备颗粒型CCP抗原;采用本方法制备的颗粒型CCP抗原检测血清中抗CCP抗体效价,检测结果线性良好,检测过程20min即可完成,相对于现有ELISA检测方法需耗时2~3h,可以更为快捷的获得检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗体效价的检测方法,特别涉及利用改性固相载体检测抗体效价的方法。
背景技术
抗体效价是疾病诊断、特异性免疫球蛋白制备和疫苗评价等领域的重要指标,对其检测具有非常实际的意义。在众多的抗体效价测定技术中,ELISA法因为操作简单,速度快,应用最为广泛。
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种累及周围关节为主的慢性多系统性炎症性的自身免疫病,特征性的临床表现为多个周围关节慢性炎症性病变,可造成永久性的关节畸形,致残率高,被称为“不死的癌症”。因此早期诊断、早期治疗,可延缓病情进展,降低致残率,改善预后。
环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide,CCP)是一条人工合成的含有21个氨基酸的多肽,其氨基酸序列为HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS,其中X代表瓜氨酸,其通过第3和第16位的半胱氨酸巯基氧化而形成环肽。瓜氨酸残基是类风湿关节炎特异的抗中间丝相关蛋白(filaggrin)抗体识别表位的必需组成部分。抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP)是环状聚丝蛋白的多肽片段,是以IgG型为主的抗体,对类风湿性关节炎(RA)具有很好的敏感性和特异性,且抗CCP抗体阳性的RA病人骨破坏较抗CCP抗体阴性者严重。2010年由美国风湿病学会(ACR)和欧洲抗风湿联盟(EULAR)一起宣布新的RA分类诊断标准,抗CCP 抗体被正式列入类风湿性关节炎的诊断标准之中。
目前,抗CCP 抗体的检测ELISA 法应用最广泛。其他检测方法多处于初步的摸索研究阶段,由于检测仪器设备、试剂价格等方面的限制,检测方法仍不成熟,影响检测及诊断性能的因素仍需进一步改进。然而,现有的ELISA法的检测时间还是过长,一般需要2个小时才可以获得结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗体效价的检测方法。
本发明所采取的技术方案是:
一种抗体效价的检测方法,包括如下步骤:
1) 将抗原偶联微球上,得到改性微球;
2) 将改性微球与抗体溶液混合反应;
3) 测定反应液的浊度,确定抗体效价。
一种抗CCP抗体效价的检测方法,包括如下步骤:
1) 在CCP多肽上偶联特异性亲和小分子,在微球上偶联特异性亲和小分子的特异性靶标分子;
2) 将修饰后的CCP多肽和微球混合,得到颗粒型CCP多肽抗原;
3) 将颗粒型CCP多肽抗原与抗体溶液混合,反应;
4) 测定反应体系的浊度,确定抗体效价。
作为本发明的进一步改进,CCP多肽上偶联的特异性亲和小分子为生物素,微球上偶联的特异性靶标分子为链霉亲和素。
在CCP多肽偶联生物素包括如下步骤:
1) 将CCP多肽溶解于缓冲液中,酯化生物素用二甲基亚砜溶解,混合;
2) 室温搅拌反应完全,去除未反应的生物素;
3) 收集、纯化得到偶联生物素的CCP多肽。
在微球上偶联链霉亲和素包括如下步骤:
1) 将羧基化胶乳微球与乙磺酸缓冲液混合,加入EDC和NHS活化,洗涤得到活化微球;
2) 将链霉亲和素溶解于PBS缓冲液中,加入活化微球,室温反应,反应完全后洗涤;
3) 用赖氨酸封闭,得到SA修饰微球。
特别的,上述在微球上偶联链霉亲和素的反应中,链霉亲和素溶解于pH6.8~7.8的PBS缓冲液中。
更进一步的,EDC和NHS的摩尔比为1:(1~2)。
本发明的有益效果是:
本发明的方法,利用生物素-链霉亲和素系统将CCP修饰在聚苯乙烯微球表面成功制备颗粒型CCP抗原;采用本方法制备的颗粒型CCP抗原检测血清中抗CCP抗体效价,检测结果线性良好,检测过程20min即可完成,相对于现有ELISA检测方法需耗时2~3h,可以更为快捷的获得检测结果。
本发明CCP多肽的生物素标记方法,反应条件温和,不会破坏CCP多肽的活性,具有很好的反应活性。
附图说明
图1为生物素修饰CCP结构示意图;
图2为验证生物素修饰CCP效果操作流程图;
图3和图5为实施例1、实施例2中生物素修饰CCP前后紫外吸收光谱变化曲线图;
图4和图6为ELISA验证实施例1、实施例2中生物素修饰CCP与抗体反应抗体浓度与吸光度值的变化关系图;
图7为CCP与聚苯乙烯微球连接过程示意图;
图8为通过颗粒增强免疫比浊法检测抗CCP抗体反应示意图;
图9和图10分别为实施例7、实施例8中通过免疫比浊法检测抗CCP抗体浓度与吸光度的变化值的变化关系图。
具体实施方式
CCP多肽的生物素修饰
合成的CCP多肽溶解于一定浓度一定pH范围的缓冲液中,酯化生物素用二甲基亚砜(DMSO)溶解,迅速与适量CCP多肽溶液混合,室温搅拌孵育4h,然后用脱盐柱去除多余的生物素示。放置收集管与脱盐柱下方,用一定浓度一定pH范围的 PBS缓冲液洗脱样品,收集洗脱液,工艺路线如图1所示。取洗脱收集液,根据紫外吸收光谱评价标记效果。ELISA法鉴定生物素化CCP效果,验证路线如图2所示。
链霉亲和素标记聚苯乙烯微球的制备
1) 取0.1mL羧基化胶乳微球,加入0.9mL乙磺酸缓冲液(MES)混合均匀后加入水溶性碳二亚胺类交联剂(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化,EDC浓度1.0-1.5g/L,EDC与NHS比例1:1-1:2之间,室温条件下温和搅拌,时间控制在15-30min;
2) 离心洗涤,转速12000-15000g离心10-30min,用0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)重复清洗沉淀三遍,去上清,沉淀经0.1mol/L PBS重悬、振荡、超声处理后即得到活化的胶乳微球;
3) 取2mg 链霉亲和素溶于pH6.5-7.8的PBS缓冲液中,加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中,室温条件下温和搅拌,反应时间2-4h;
4) 达到反应时间后,12000-15000g离心10-30min,沉淀用含有0.05-0.1%Tween20的PBS重复洗涤后的微球经超声分散重悬于PBS缓冲液中,加入30-40nmol赖氨酸,室温轻微震荡30-60min,12000-15000g离心10-30min洗涤三次,超声重悬于0.1M pH7.4 PBS缓冲液中备用。
下面结合实施例,进一步说明本发明。
CCP多肽的修饰:
实施例1
1) 溶解CCP多肽:制备好的CCP多肽溶解于0.15M pH9.0磷酸盐缓冲液中,4℃保存;
2) 溶解酯化生物素:用二甲基亚砜(DMSO)溶解酯化生物素;
3) 修饰:将溶解后的CCP多肽溶液与溶解后的酯化生物素溶液迅速混合,生物素与CCP的比例为10:1,室温搅拌孵育4h;
4) 用脱盐柱去除多余的生物素;
5) 用0.05M pH7.6的 PBS缓冲液洗脱样品。
收集洗脱液,根据紫外吸光谱评价标记结果:根据相同浓度(1mg/mL)生物素标记CCP产物与未经生物素标记CCP的紫外吸收光谱图比较,Biotin-CCP在210nm-230nm之间的吸光度值升高,如图3。用ELISA法鉴定生物素标记CCP效果:将制备的生物素化CCP包被到链霉亲和素包被的酶标板中,检测TMB显色后的OD值。如图4,随着血清中抗CCP抗体浓度的升高,TMB显色的OD值逐渐升高,并存在一定的正相关关系。说明CCP多肽成功标记生物素。
实施例2
1) 溶解CCP多肽:制备好的CCP多肽溶解于0.2M pH9.6磷酸盐缓冲液中,4℃保存;
2) 溶解酯化生物素:用二甲基亚砜(DMSO)溶解酯化生物素;
3) 修饰:将溶解后的CCP多肽溶液与溶解后的酯化生物素溶液迅速混合,生物素与CCP的比例为10:1。室温搅拌孵育4h;
4) 用脱盐柱去除多余的生物素;
5) 用0.1M pH7.2的 PBS缓冲液洗脱样品。
收集洗脱液,根据紫外吸光谱评价标记结果:根据相同浓度(1mg/mL)生物素标记CCP产物与未经生物素标记CCP的紫外吸收光谱图比较,Biotin-CCP在200nm-230nm之间的吸光度值升高,如图5。
用ELISA法鉴定生物素标记CCP效果:将制备的生物素化CCP包被到链霉亲和素包被的酶标板中,检测TMB显色后的OD值。如图6,随着血清中抗CCP抗体浓度的升高,TMB显色的OD值逐渐升高,并存在一定的正相关关系。说明CCP多肽成功标记生物素。
链霉亲和素标记聚苯乙烯微球的制备
实施例3
1) 活化:取0.1mL羧基化胶乳微球,加入0.9mL乙磺酸缓冲液(MES)混合。加入EDC和NHS活化,EDC浓度0.6g/L,EDC与NHS比例1:1,室温条件下温和搅拌15min;
2) 离心洗涤:PBS重复洗涤三遍,去上清,0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球;
3) 偶联反应:取2mg 链霉亲和素溶于pH6.8的PBS缓冲液中,加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中,室温条件下温和搅拌,反应时间2h;
4) 离心洗涤:PBS重复洗涤三遍,去上清,0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球;
5) 封闭:加入20nmol赖氨酸,室温轻微震荡30min,离心洗涤,超声重悬于0.15M pH7.0 PBS缓冲液中备用。
收集洗涤液,SA的浓度测定按照如下公式计算:C=A280/E (SA:E=3.4L/g),计算偶联的SA含量。SA偶联量为0.5mg,偶联效率为25%。
实施例4
1) 活化:取0.1mL羧基化胶乳微球,加入0.9mL乙磺酸缓冲液(MES)混合。加入EDC和NHS活化,EDC浓度0.9g/L,EDC与NHS比例1:2,室温条件下温和搅拌15min;
2) 离心洗涤:PBS重复洗涤三遍,去上清,0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球;
3) 偶联反应:取2mg 链霉亲和素溶于pH7.2的PBS缓冲液中,加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中,室温条件下温和搅拌,反应时间3h;
4) 离心洗涤:PBS重复洗涤三遍,去上清,0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球;
5) 封闭:加入20nmol赖氨酸,室温轻微震荡30min,离心洗涤,超声重悬于0.15M pH7.0 PBS缓冲液中备用;
收集洗涤液,SA的浓度测定按照如下公式计算:C=A280/E (SA:E=3.4L/g),计算偶联的SA含量。SA偶联量为0.8mg,偶联效率为40%。
实施例5
1) 活化:取0.1mL羧基化胶乳微球,加入0.9mL乙磺酸缓冲液(MES)混合。加入EDC和NHS活化,EDC浓度1.2g/L,EDC与NHS比例2:3,室温条件下温和搅拌15min;
2) 离心洗涤:PBS重复洗涤三遍,去上清,0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球;
3) 偶联反应:取2mg 链霉亲和素溶于pH7.6的PBS缓冲液中,加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中,室温条件下温和搅拌,反应时间4h;
4) 离心洗涤:PBS重复洗涤三遍,去上清,0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球;
5) 封闭:加入20nmol赖氨酸,室温轻微震荡30min,离心洗涤,超声重悬于0.15M pH7.0 PBS缓冲液中备用。
收集洗涤液,SA的浓度测定按照如下公式计算:C=A280/E (SA:E=3.4L/g),计算偶联的SA含量。SA偶联量为1.1mg,偶联效率为55%;
实施例6
1) 活化:取0.1mL羧基化胶乳微球,加入0.9mL乙磺酸缓冲液(MES)混合。加入EDC和NHS活化,EDC浓度1.5g/L,EDC与NHS比例3:4,室温条件下温和搅拌15min;
2) 离心洗涤:PBS重复洗涤三遍,去上清,0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球;
3) 偶联反应:取2mg 链霉亲和素溶于pH7.8的PBS缓冲液中,加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中,室温条件下温和搅拌,反应时间4h;
4) 离心洗涤:PBS重复洗涤三遍,去上清,0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球;
5) 封闭:加入20nmol赖氨酸,室温轻微震荡30min,离心洗涤,超声重悬于0.15M pH7.0 PBS缓冲液中备用。
收集洗涤液,SA的浓度测定按照如下公式计算:C=A280/E (SA:E=3.4L/g),计算偶联的SA含量。SA偶联量为1.0mg,偶联效率为50%。
颗粒型CCP抗原的制备
制备流程如图7所示,具体操作如下:
1) 洗涤胶乳微球:链霉亲和素标记微球用0.15M pH7.6 PBS缓冲液洗涤;
2) 微球与修饰的CCP结合:1mL10%自制的链霉亲和素化胶乳微球与1mg生物素标记CCP多肽,通过室温轻微震荡孵育30min;
3) 离心洗涤:12000g离心30min洗涤3次,超声重悬,制备颗粒型CCP抗原。
颗粒型CCP抗原的效果评价
通过检测不同效价的抗CCP抗体血清的吸光度值得变化关系,免疫比浊法检测过程如图8所示,具体操作为:
取不同效价的标准抗CCP抗体样品6μl,与200μl试剂R1混合,25℃温育5min;
加入50μl试剂R2,测定其在560nm下的浊度A1;
37℃温育15min,测定其在560nm下的浊度A2;
根据ΔA(A2- A1)值,计算抗体的效价;
其中,各试剂组成成分如下表:
组成成分 | 试剂R1 | 试剂R2 |
缓冲液 | pH8.0 PBS | pH8.0 PBS |
颗粒型CCP抗原(纳米微球) | — | 0.5% |
PEG6000 | 3.6% | — |
Tween-20 | 0.1% | 0.1% |
BSA | 0.05% | 0.05% |
叠氮钠(NaN3) | 0.05% | 0.05% |
整个检测过程20min即可完成。
实施例7
取实施例1的生物素标记CCP多肽和实施例3的链霉亲和素标记微球,按上述反应制备得到颗粒型CCP抗原。使用该颗粒型CCP抗原(浓度为0.5%)用于检测抗体的效价,检测过程耗时20min。颗粒型CCP多肽抗原的检测效果如图9,以数据点拟合直线方程为y=0.0009x+0.0329(相关系数r=0.9729),线性良好。
实施例8
取实施例2的生物素标记CCP多肽和实施例4的链霉亲和素标记微球,按上述反应制备得到颗粒型CCP抗原。使用该颗粒型CCP抗原(浓度为0.5%)用于检测抗体的效价,检测过程耗时20min。颗粒型CCP多肽抗原的检测效果如图10所示,以数据点拟合直线方程为y=0.001x+0.0667(相关系数r=0.9906),线性良好。
Claims (1)
1.一种抗CCP抗体效价的检测方法,包括如下步骤:
1) 在CCP多肽上偶联生物素,在微球上偶联链霉亲和素;
2) 将修饰后的CCP多肽和微球混合,得到颗粒型CCP多肽抗原;
3) 将颗粒型CCP多肽抗原与抗体溶液混合,反应;
4) 测定反应体系的浊度,确定抗体效价;
其中,在CCP多肽偶联生物素包括如下步骤:
a) 将CCP多肽溶解于pH9.0~9.6磷酸盐缓冲液中,4℃保存;将酯化生物素溶解二甲基亚砜;按生物素:CCP=10:1的摩尔比混合两种溶液;
b) 室温搅拌4h,使用脱盐柱去除未反应的生物素;
c) 用pH7.2~7.6的 PBS缓冲液洗脱,得到偶联生物素的CCP多肽;
在微球上偶联链霉亲和素包括如下步骤:
a) 将羧基化胶乳微球与乙磺酸缓冲液混合,加入EDC和NHS活化,EDC和NHS的摩尔比为1:(1~2),洗涤得到活化微球;
b) 将链霉亲和素溶解于pH6.8~7.8的PBS缓冲液中,加入活化微球,室温反应,反应完全后洗涤;
c) 用赖氨酸封闭,得到SA修饰微球。
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