JPS60222771A - ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する抗体 - Google Patents
ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する抗体Info
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- JPS60222771A JPS60222771A JP60009985A JP998585A JPS60222771A JP S60222771 A JPS60222771 A JP S60222771A JP 60009985 A JP60009985 A JP 60009985A JP 998585 A JP998585 A JP 998585A JP S60222771 A JPS60222771 A JP S60222771A
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
生物学的に活性な物質、たとえばホルモン、薬剤および
ある種のタンパク質等、生物学的試験材料内に低濃度し
か生じない物質の検知には高い特異性と感度を有する試
験システムが要求さｎる。
ある種のタンパク質等、生物学的試験材料内に低濃度し
か生じない物質の検知には高い特異性と感度を有する試
験システムが要求さｎる。
この要求は、特異的なタンパク質（抗体）の相当する物
質（抗原および）１ゾテン）を結合する能力に基つく、
定性的および定量的免疫測定法によって満足さｎる。
質（抗原および）１ゾテン）を結合する能力に基つく、
定性的および定量的免疫測定法によって満足さｎる。
ホモおよびヘテロ試験システムが知られている。
最近報告さｎる酵素免疫測定法の大部分はへテロ相で行
わｎるもので、たとえばサンドウィッチ免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ ）等は、信頼性が高く応用範囲が広いの与で
なく、感度も高い。
わｎるもので、たとえばサンドウィッチ免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ ）等は、信頼性が高く応用範囲が広いの与で
なく、感度も高い。
ＥＬＩＳＡが応用さｎる重要な分野のひとつは、感染症
における免疫状態の測定や免疫診断のため特異的抗体の
測定である（ Ｃａｒｌｓｏｎ、 Ｂ、Ａ、、 Ｇｉｅ
ｂｉｎｋ。
における免疫状態の測定や免疫診断のため特異的抗体の
測定である（ Ｃａｒｌｓｏｎ、 Ｂ、Ａ、、 Ｇｉｅ
ｂｉｎｋ。
Ｇ、Ｓ、、 ５ｐｉｋａ、 Ｊ、Ｓ、 ＆ Ｇｒａｙ、
Ｅ、Ｄ、 ： Ｍｅａｓｕｒｅｒｎｅｎｔｏｆ ｉｍ
ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ａｎｄ Ｍ ａｎｔｉ
ｂｏｃｉｉｅｓ ｔｏ ｔ、ｙｐｅＩＩ ｐｎｅｕｍｏ
ｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉａｅ ｂｙ
ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｃｌ ｉｍｍｕｎｏ ５ｏｒ
ｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、 Ｊ、 Ｃ１１ｎ。
Ｅ、Ｄ、 ： Ｍｅａｓｕｒｅｒｎｅｎｔｏｆ ｉｍ
ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ａｎｄ Ｍ ａｎｔｉ
ｂｏｃｉｉｅｓ ｔｏ ｔ、ｙｐｅＩＩ ｐｎｅｕｍｏ
ｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉａｅ ｂｙ
ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｃｌ ｉｍｍｕｎｏ ５ｏｒ
ｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、 Ｊ、 Ｃ１１ｎ。
ＭｉＣｌ”ｏｂｉｏｌ、 １’６ ： ６３−６９．１
９８２）。
９８２）。
とくに、バクテリアの細胞壁構造に対する抗体の測定は
、こしらの分子が病原微生物と宿主の間の相互作用の一
次的原因になっているのできわめて重要である。この測
定はとくに、他の方法では感染を明らかにできないバク
テリアの感染を診断する場合、重要である。
、こしらの分子が病原微生物と宿主の間の相互作用の一
次的原因になっているのできわめて重要である。この測
定はとくに、他の方法では感染を明らかにできないバク
テリアの感染を診断する場合、重要である。
細菌学の分野でこｎまで実用化さ扛てきた問題の病原に
よるバクテリア感染を検知する方法は、時間がかかりし
かも信頼性が低い。また、通常の抗原または抗体検知法
を用い、病原特異的な診断のみが可能である。しかしな
がら、ある種の疾思（たとえば、腎孟腎症）では異なる
いくつかの病原が関与しているので、こｎらの抗原また
は抗体検知法を用いてバクテリア感染の診断を行ったの
では、装置および時間の点で、著しく高価についてしま
う。
よるバクテリア感染を検知する方法は、時間がかかりし
かも信頼性が低い。また、通常の抗原または抗体検知法
を用い、病原特異的な診断のみが可能である。しかしな
がら、ある種の疾思（たとえば、腎孟腎症）では異なる
いくつかの病原が関与しているので、こｎらの抗原また
は抗体検知法を用いてバクテリア感染の診断を行ったの
では、装置および時間の点で、著しく高価についてしま
う。
したがって、本発明の目的は、すべてのバクテシ
リアに共通の細胞壁抗原、すなわちペプチドグリカンの
グリカン鎖を用いて特異的免疫グロブリン０１Ａおよび
Ｍ全測定することにある。
グリカン鎖を用いて特異的免疫グロブリン０１Ａおよび
Ｍ全測定することにある。
本発明は、ａ）一般式（Ｉ）
〔式中Ｒは水素または式
０ ０
１１１
ＣＨ３ＣＨ３
（式中Ｒ′はアミノ酸残基またはペゾチドである）で示
される基であり、ｎは１から６までの数、好ましくは２
〜４である〕で示ざｎる糖誘導体に特異的に結合するか
、またはｂ）一般式（Ｉ）の糖誘導体を含ひ単離バクテ
リア細胞壁に特異的に結合することを特徴とする、ペプ
チドグリカンのグリカン鎖に対して生物学的試験材料中
に免疫グロブリンＧ％ＡおよびＭのクラスから生成する
抗体に関する。
される基であり、ｎは１から６までの数、好ましくは２
〜４である〕で示ざｎる糖誘導体に特異的に結合するか
、またはｂ）一般式（Ｉ）の糖誘導体を含ひ単離バクテ
リア細胞壁に特異的に結合することを特徴とする、ペプ
チドグリカンのグリカン鎖に対して生物学的試験材料中
に免疫グロブリンＧ％ＡおよびＭのクラスから生成する
抗体に関する。
一般式（１）にその−次構造の一部を示した巨大分子は
、Ｎ−アセチル−グルコサミンとＮ−アセチル−ムラミ
ノ酸（Ｎ−アセチルグルコサミンの３−０− Ｄ乳酸エ
ーテル）が交互にβ−１，４結合した＠鎖状ポリサッカ
ライドである（グリカン鎖、次回参照）。
、Ｎ−アセチル−グルコサミンとＮ−アセチル−ムラミ
ノ酸（Ｎ−アセチルグルコサミンの３−０− Ｄ乳酸エ
ーテル）が交互にβ−１，４結合した＠鎖状ポリサッカ
ライドである（グリカン鎖、次回参照）。
ムラミノ酸のカルボキシル基は、一般には配列：Ｌ−Ａ
ｉａ−Ｄ−Ｇｌｕ （Ｌ−ジアミノ酸Ｄ−Ａｌａ−（Ｄ
−Ａｌａ） ）のベノチドサブユニットに連結している
。こｎらのペノテドサブユニットは、直接（桿菌の場合
）または中間ペプチド橋（連鎖球菌の場合はＬ−Ａｌａ
２〜３、ブドウ球菌の場合はＧｌｙ ５など）を介し
てたがいに結合することができる。このようにして、架
橋さｎた高分子ペプチドグリカンが得らｎ１バクテリア
の細胞の浸透圧安定性と形状が保持される。
ｉａ−Ｄ−Ｇｌｕ （Ｌ−ジアミノ酸Ｄ−Ａｌａ−（Ｄ
−Ａｌａ） ）のベノチドサブユニットに連結している
。こｎらのペノテドサブユニットは、直接（桿菌の場合
）または中間ペプチド橋（連鎖球菌の場合はＬ−Ａｌａ
２〜３、ブドウ球菌の場合はＧｌｙ ５など）を介し
てたがいに結合することができる。このようにして、架
橋さｎた高分子ペプチドグリカンが得らｎ１バクテリア
の細胞の浸透圧安定性と形状が保持される。
ブドウ球菌のペプチドグリカンの構造と５個の抗原決定
基ニゲリカン鎖（ａ）、中間ペプチド橋のＮ−末端（ｂ
）およびＣ−末端、ペゾチＶサプユ □ニットのテトラ
ペゾチド（ｄＪおよびにンタペプチド（ｅ） この方法で検出できるバクテリアは、たとえば、ブドウ
球菌、連鎖球菌、桿菌、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌
、シュードモナス菌、ナイセリア菌などが包含さｒる。
基ニゲリカン鎖（ａ）、中間ペプチド橋のＮ−末端（ｂ
）およびＣ−末端、ペゾチＶサプユ □ニットのテトラ
ペゾチド（ｄＪおよびにンタペプチド（ｅ） この方法で検出できるバクテリアは、たとえば、ブドウ
球菌、連鎖球菌、桿菌、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌
、シュードモナス菌、ナイセリア菌などが包含さｒる。
このペプチドグリカンのグリカン鎖は驚くべき相同性を
有し、すべてのバクテリアに共通の抗原でおる。多くの
挟思では関与するバクテリアの種類が不明であって、こ
扛らの場合、属または種に特異的な抗原に対する抗体を
使用することはできない。こ扛らの場合にすべてのバク
テリアに共通の抗原（ペプチドグリカンのグリカン鎖）
に対して特異性を有する抗体の定量ができねば、診断に
関して望ましいことである。
有し、すべてのバクテリアに共通の抗原でおる。多くの
挟思では関与するバクテリアの種類が不明であって、こ
扛らの場合、属または種に特異的な抗原に対する抗体を
使用することはできない。こ扛らの場合にすべてのバク
テリアに共通の抗原（ペプチドグリカンのグリカン鎖）
に対して特異性を有する抗体の定量ができねば、診断に
関して望ましいことである。
本発明はさらに、ペプチドグリカンのグリカン鎖に対す
る抗体を産生ずる方法、ならびに生物学的試験材料中の
これらの抗体を定量する方法訃よび試薬に関する。定量
方法の例には、二重抗体放射免疫定量法、二重抗体酵素
免疫定量法、比濁法、固相サンドウィッチ放射免疫定量
法、固相螢光免疫定量法およびラテックス凝集試験法が
包含さ扛る。
る抗体を産生ずる方法、ならびに生物学的試験材料中の
これらの抗体を定量する方法訃よび試薬に関する。定量
方法の例には、二重抗体放射免疫定量法、二重抗体酵素
免疫定量法、比濁法、固相サンドウィッチ放射免疫定量
法、固相螢光免疫定量法およびラテックス凝集試験法が
包含さ扛る。
抗体は次のようにして定量さｎた。
１、標準液の製造
ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する特異性をもつ抗
体の標準溶液は、この種の抗体が検知さＡ’Ｃ患者の血
清から親和性クロマトグラフィーによって得られる（マ
ドｖックスに結合した一般式■の糖誘導体との）。
体の標準溶液は、この種の抗体が検知さＡ’Ｃ患者の血
清から親和性クロマトグラフィーによって得られる（マ
ドｖックスに結合した一般式■の糖誘導体との）。
特異的抗体が親和性マトリックスに結合したのち、緩衝
液で洗浄して結合しない血清タンパク質を除去する。固
体マトリックスに結合した抗体の溶出は、一般式Ｉの糖
誘導体での結合免疫グロブリンの特異的脱着によって実
施する。脱着は、たとえば低ＰＨ値または高濃度の塩の
使用など、その原理はよく知られている技術によっても
実施できる。緩衝液で透析したのち、ペプチドグリカン
のグリカン鎖に対する特異的抗体の含量を精製分画の免
疫グロブリン含量によって定量する。
液で洗浄して結合しない血清タンパク質を除去する。固
体マトリックスに結合した抗体の溶出は、一般式Ｉの糖
誘導体での結合免疫グロブリンの特異的脱着によって実
施する。脱着は、たとえば低ＰＨ値または高濃度の塩の
使用など、その原理はよく知られている技術によっても
実施できる。緩衝液で透析したのち、ペプチドグリカン
のグリカン鎖に対する特異的抗体の含量を精製分画の免
疫グロブリン含量によって定量する。
２、試験のデザイン
ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する各種免疫グロブ
リンクラスの特異的′抗体の定量は、基本的に異なる２
種の方法を用いて実施できる。
リンクラスの特異的′抗体の定量は、基本的に異なる２
種の方法を用いて実施できる。
ａ）可溶システムにおける定量（ホモ試験相における測
定） ｂ）へテロ試験システムにおける測定での定量（ペテロ
試験相における測定：固相免疫定量法）２．１．ホモ試
験相における測定 ２．１．１． ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する
抗体の二重抗体放射免疫定量法による定量一般式Ｉの糖
誘導体を放射能で標識し、試験は以下の計画に従って進
める。
定） ｂ）へテロ試験システムにおける測定での定量（ペテロ
試験相における測定：固相免疫定量法）２．１．ホモ試
験相における測定 ２．１．１． ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する
抗体の二重抗体放射免疫定量法による定量一般式Ｉの糖
誘導体を放射能で標識し、試験は以下の計画に従って進
める。
苦ＳＤ、 ＋ＡＩ） −＊ ＳＤ、 −Ａｂ放射活性抗
体結合抗原から放射活性全もたない抗原の分離は、以下
の計画に従って第２の抗抗体を用い、免疫グロブリンの
特異的沈殿による二重Ｒ’ ＝ Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃ）
ｌｕ（Ｌ−Ｌｙｓ）またはＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ａ
２９ｍ）の抗原の放射能標識は、たとえば、ａ）一般式
■の糖誘導体、とチロシンのカップリング、ついで常゛
法による１２５■でのヨード化。
体結合抗原から放射活性全もたない抗原の分離は、以下
の計画に従って第２の抗抗体を用い、免疫グロブリンの
特異的沈殿による二重Ｒ’ ＝ Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃ）
ｌｕ（Ｌ−Ｌｙｓ）またはＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ａ
２９ｍ）の抗原の放射能標識は、たとえば、ａ）一般式
■の糖誘導体、とチロシンのカップリング、ついで常゛
法による１２５■でのヨード化。
ｂ）（Ｎ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシ、
ｓ −（１２５Ｉ）ヨードフェニル）プロピオネートに
よるヨード化 Ｃ） Ｎ−スクシンイミジル−（２、３−３Ｈ）プロピ
オネートによる抗原のトリチウム化で実施することがで
きる。
ｓ −（１２５Ｉ）ヨードフェニル）プロピオネートに
よるヨード化 Ｃ） Ｎ−スクシンイミジル−（２、３−３Ｈ）プロピ
オネートによる抗原のトリチウム化で実施することがで
きる。
別の免疫グロブリンクラスたとえばＩｇ（）またはＩｇ
Ｍ等は、第２の抗体の特異性を選択することにより、別
に定量することができる。
Ｍ等は、第２の抗体の特異性を選択することにより、別
に定量することができる。
略号：
ＳＤ、 ＝一般式Ｉの糖誘導体
Ａ２９ｍ ＝ジアミノビメル酸
使用前に、使用する抗抗体を一般式■の糖誘導体を結合
させたマトリックス上親和性クロマトグラフィーによっ
て精製し、含有する可能性のあるペプチドグリカンに対
する抗体を除去するか、あるいは好ましくはモノクロナ
ール抗抗体を使用する。
させたマトリックス上親和性クロマトグラフィーによっ
て精製し、含有する可能性のあるペプチドグリカンに対
する抗体を除去するか、あるいは好ましくはモノクロナ
ール抗抗体を使用する。
２．１．２． ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する
抗体の二重抗体酵素免疫定量法による定量試験法の構成
は、放射能の代わりにアルカリホキシダーゼーパーオキ
シダーゼ、グルコース−６゛ス７アターゼ、パーオキシ
ダーゼ、グルコースオーホスフェート−デヒドロｐ、＋
ナーゼ、マレート−デヒドロゲナーゼ等の酵素を用い
て抗抗体を標識するほかは、’２．１．１．０場合と同
じである。
抗体の二重抗体酵素免疫定量法による定量試験法の構成
は、放射能の代わりにアルカリホキシダーゼーパーオキ
シダーゼ、グルコース−６゛ス７アターゼ、パーオキシ
ダーゼ、グルコースオーホスフェート−デヒドロｐ、＋
ナーゼ、マレート−デヒドロゲナーゼ等の酵素を用い
て抗抗体を標識するほかは、’２．１．１．０場合と同
じである。
２．１．３． ペプチドグリカンのグリカン鎖に対す
”る抗体の比濁法による定量 一般式Ｉの糖誘導体を可溶性マトリックス、たとえばタ
ンパク質、ポリビニルピロリドン等に結合させ、以下の
計画に従って試験を実施する。−マトリックス−（ＳＤ
、）ｎ＋Ａｂ→マトリックス−（ＳＤ、）ｎ−Ａｂ複合
体（白濁） 一般式■の糖誘導体は担体材料と、たとえばｆｌ）一般
式ｘの糖誘導体のヨードアセチル化体をマトリックスに
結合することにより、 （２）カルボジイミド法により、 （３）二官能性試薬たとえばジイソシアネート、ゲルタ
ールジアルデヒド等を用いて カップリングさせることができる。
”る抗体の比濁法による定量 一般式Ｉの糖誘導体を可溶性マトリックス、たとえばタ
ンパク質、ポリビニルピロリドン等に結合させ、以下の
計画に従って試験を実施する。−マトリックス−（ＳＤ
、）ｎ＋Ａｂ→マトリックス−（ＳＤ、）ｎ−Ａｂ複合
体（白濁） 一般式■の糖誘導体は担体材料と、たとえばｆｌ）一般
式ｘの糖誘導体のヨードアセチル化体をマトリックスに
結合することにより、 （２）カルボジイミド法により、 （３）二官能性試薬たとえばジイソシアネート、ゲルタ
ールジアルデヒド等を用いて カップリングさせることができる。
２．２．ヘテロ試験相における測定
一般式■の糖誘導体を固体不溶性マ） ＩＪラックスた
とえば紙、プラスチックス、ラテックス等に結合させる
。カップリングは常法によって実施される。一般式■の
糖誘導体は、直接またはいわゆるスペーサーを介してマ
トリックスに結合させることができる。スペーサーとし
ては、脂肪族炭化水素鎖、アルブミンのようなタンパク
質、ＲＮａｓｅ 等が使用される。
とえば紙、プラスチックス、ラテックス等に結合させる
。カップリングは常法によって実施される。一般式■の
糖誘導体は、直接またはいわゆるスペーサーを介してマ
トリックスに結合させることができる。スペーサーとし
ては、脂肪族炭化水素鎖、アルブミンのようなタンパク
質、ＲＮａｓｅ 等が使用される。
２．２．１． ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する
抗体の、放射能標識抗抗体を用いる固相サンドウィッチ
放射免疫定量法による定量 ２、２．２． ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する
抗体の、固相酵素免疫定量法による定量試験法の構成は
、放射能の代わりに、 ２．１．２．で述べたような酵
素で抗抗体を標識するほかは、２、２．１．と同じであ
る。
抗体の、放射能標識抗抗体を用いる固相サンドウィッチ
放射免疫定量法による定量 ２、２．２． ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する
抗体の、固相酵素免疫定量法による定量試験法の構成は
、放射能の代わりに、 ２．１．２．で述べたような酵
素で抗抗体を標識するほかは、２、２．１．と同じであ
る。
２、２．３． ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する
抗体の、固相螢光免疫定量法による定量抗抗体を螢光染
料（ＦＩＡＸ■−８ｔｉＱＴＭシステム等を参照）で標
識する以外は、試験法の構成は２、２．１．と同、じで
ある。
抗体の、固相螢光免疫定量法による定量抗抗体を螢光染
料（ＦＩＡＸ■−８ｔｉＱＴＭシステム等を参照）で標
識する以外は、試験法の構成は２、２．１．と同、じで
ある。
２、２．４． ベプテ１グリカンのグリカン鎖に対する
抗体のラテックス凝集試験法による定量一般式■の糖誘
導体を、直接またはタンパク質のようなスペーサーを介
してラテックス粒子に結合させる。
抗体のラテックス凝集試験法による定量一般式■の糖誘
導体を、直接またはタンパク質のようなスペーサーを介
してラテックス粒子に結合させる。
２．１．および２．２．に記載した定量法においては、
１、に述べた抗体標準溶液を用いてプロットした検量曲
線によって定量化を行う。
１、に述べた抗体標準溶液を用いてプロットした検量曲
線によって定量化を行う。
次に本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明す
る。
る。
例
誘導体）の単離
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕＬ）ｔ、１ｌｉｓ ｆ大量培養
（４０１！りにより生育させ、対数生育相の後期に細胞
を収穫し、トリプシン処理した細胞壁を５ｃｂｌｅｉｆ
ｅｒ ａｃ Ｋａｎｄｌｅｒの方法（５ｃｈｌｅｊ４ｅ
ｒ、 Ｋ、Ｈ，＆ Ｋａｎｄｌｅｒ、 Ｏ，：Ｐｅｐｔ
、ｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｂａｃｔｅ
ｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓａｎａ １ｈｅｉｒ
ｔ、ａｘｏｎｏｍｉｃ ｉ、ｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、
Ｂａｃｔ、 Ｒｅｖ＋。
（４０１！りにより生育させ、対数生育相の後期に細胞
を収穫し、トリプシン処理した細胞壁を５ｃｂｌｅｉｆ
ｅｒ ａｃ Ｋａｎｄｌｅｒの方法（５ｃｈｌｅｊ４ｅ
ｒ、 Ｋ、Ｈ，＆ Ｋａｎｄｌｅｒ、 Ｏ，：Ｐｅｐｔ
、ｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｂａｃｔｅ
ｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓａｎａ １ｈｅｉｒ
ｔ、ａｘｏｎｏｍｉｃ ｉ、ｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、
Ｂａｃｔ、 Ｒｅｖ＋。
３６：４０７〜４７７．１９７２）を用いて単離した。
１．２．ズブチリシンによるタンパク質の抽出トリプシ
ン処理細胞壁に１０％トリクロロ酢酸（５■の細胞壁に
１１１Ｌｌ）ｔ−加え、６０℃で６時間抽出し、さらに
プロテアーゼズブチリシンで精製した。トリクロロ酢酸
（２■／ｍｌ）で抽出した細胞壁を０．１ Ｍ ’Ｊン
酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁し、ズブチリシン（１
１単位／ｍ９； ＢＰＮ’ＥＣ３，４，２１，１４）と
ともに３７℃で一夜インキユベートした。遠心分離後、
細胞壁を４回洗浄し、凍結乾燥した。
ン処理細胞壁に１０％トリクロロ酢酸（５■の細胞壁に
１１１Ｌｌ）ｔ−加え、６０℃で６時間抽出し、さらに
プロテアーゼズブチリシンで精製した。トリクロロ酢酸
（２■／ｍｌ）で抽出した細胞壁を０．１ Ｍ ’Ｊン
酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁し、ズブチリシン（１
１単位／ｍ９； ＢＰＮ’ＥＣ３，４，２１，１４）と
ともに３７℃で一夜インキユベートした。遠心分離後、
細胞壁を４回洗浄し、凍結乾燥した。
１．３．細胞壁のりゾテームによる加水分解ズブチリシ
ン処理細胞壁を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
６，２）に懸濁し、１０■／ｌｉ’ｉｌのリゾチーム（
８ｅｒｖａ ： ２２．０００単位／■）を加え、３７
℃で約２４時間インキュベートした。トルエンを数滴加
えて、細菌およびかびの生育全防止した。
ン処理細胞壁を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
６，２）に懸濁し、１０■／ｌｉ’ｉｌのリゾチーム（
８ｅｒｖａ ： ２２．０００単位／■）を加え、３７
℃で約２４時間インキュベートした。トルエンを数滴加
えて、細菌およびかびの生育全防止した。
１．４．低分子グリコペプチド（式■の糖誘導体）の単
離 リゾチーム処堺細胞壁を４８．０００ ｇで２０分間遠
心分離し、上清分画を二重蒸留水で４時間の透析に２回
付した。透析液を真空中４０℃で濃縮し、ついで凍結乾
燥した。
離 リゾチーム処堺細胞壁を４８．０００ ｇで２０分間遠
心分離し、上清分画を二重蒸留水で４時間の透析に２回
付した。透析液を真空中４０℃で濃縮し、ついで凍結乾
燥した。
１．５．透析物の５ｅｐｈａｃｌｅｘによるｌ’ ルク
ロマトグラフイー 油状の残留物を五酸化リン上で乾燥し、二重蒸留水（５
０１Ｖ１０．１１１）にとった。不溶成分があｔば遠心
分離して除去した。分画１００１ずつを８ｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ ２５上クロマトグラフイーに付した。
ロマトグラフイー 油状の残留物を五酸化リン上で乾燥し、二重蒸留水（５
０１Ｖ１０．１１１）にとった。不溶成分があｔば遠心
分離して除去した。分画１００１ずつを８ｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ ２５上クロマトグラフイーに付した。
カラム床は１００ Ｘ ２．２−ムした。溶出は二重蒸
留水により、１分４滴の速度で実施した。各２ＴＩＬｅ
の分画を集め、その２ Ｄ ６ ｎｍにおける吸収を測
定し、グリコペプチド含有分画を集めて凍結乾燥した。
留水により、１分４滴の速度で実施した。各２ＴＩＬｅ
の分画を集め、その２ Ｄ ６ ｎｍにおける吸収を測
定し、グリコペプチド含有分画を集めて凍結乾燥した。
２、抱合ヒト血清アルプミングリコペプテドの調製
ヒト血清アルジミンを炭酸塩緩衝液（［）、１Ｍ％ｐＨ
９，６） ２．８５ ｍｌ中に、グリコペプチド４６．
２ ｍ９とともに溶解し、り。この溶液をグルタルアル
デヒド０Ｃで一夜攪拌した。残ったアルデヒド基があｎ
ばそｔｌ．を飽和するために反応混合ｗをＬ−’Ｊジン
（ ０．２ ｍｏｅ）と３時間インキュベートし、完全
に透析したのち二重蒸留水で透析し、上清分画全凍結乾
燥した。
９，６） ２．８５ ｍｌ中に、グリコペプチド４６．
２ ｍ９とともに溶解し、り。この溶液をグルタルアル
デヒド０Ｃで一夜攪拌した。残ったアルデヒド基があｎ
ばそｔｌ．を飽和するために反応混合ｗをＬ−’Ｊジン
（ ０．２ ｍｏｅ）と３時間インキュベートし、完全
に透析したのち二重蒸留水で透析し、上清分画全凍結乾
燥した。
本例では、内容量２成弱、高さ４ ｃｍ 、径１ｃｍの
ポリスチレン管を用いた。類似のプラスチック材料で製
造き扛たマイクロタイタープレート、サール、皿等も同
様、結合に適している。
ポリスチレン管を用いた。類似のプラスチック材料で製
造き扛たマイクロタイタープレート、サール、皿等も同
様、結合に適している。
抱合体溶液（ Ｑ．１ｍｏｇ Ｍ炭酸塩緩衝液ｐＨ９．
６中抱合体１００ｎｇに相当）をピペットで管にとり、
６７℃で２４時間乾燥した。乾燥した管を、等張食塩液
中に０．１％ＰＢＳ （ ＩＪン酸緩衝食塩液）／ツイ
ーン２０（ｉ−含有する１ ０ ｍｍｏｅ／ ｅリン酸
塩緩衝液ｐＨ７−２、２００μｅで１回洗浄し、洗液を
吸引濾過したのち、再び蒸留水２００μｅで洗浄し、吸
引濾過した。抱合体でコーティングさ扛た管は、乾燥棚
に６７°Ｃで保存した。
６中抱合体１００ｎｇに相当）をピペットで管にとり、
６７℃で２４時間乾燥した。乾燥した管を、等張食塩液
中に０．１％ＰＢＳ （ ＩＪン酸緩衝食塩液）／ツイ
ーン２０（ｉ−含有する１ ０ ｍｍｏｅ／ ｅリン酸
塩緩衝液ｐＨ７−２、２００μｅで１回洗浄し、洗液を
吸引濾過したのち、再び蒸留水２００μｅで洗浄し、吸
引濾過した。抱合体でコーティングさ扛た管は、乾燥棚
に６７°Ｃで保存した。
４、試験の実施
０、１μ９〜１０μｇのＩｇＣ） ′ｆＰＢＳ ／ツイ
ーン２０緩衝液中に含む特異的標準溶液（標準液のＦＡ
製の項参照）１００μｅを、前述のようにコーティング
した管にピペットでと９、２０°Ｃで１時゛間インキュ
ベートする。標準曲線の測定範囲内にくるように、生物
学的試験材料のサンプル、たとえば患者血清は、ＰＢＳ
／ツイーン２０緩衝液で力価１：５〜１ ： ２，０
０ ０に希釈し、同容量使用する。インキュベーション
混合物を吸引接遇し、ついでＰＢＳ７’） イー ７
２ ０緩衝液２ ０ ０．、ｔｔｅ テ２回洗浄し、再
び吸引濾過する。パーオキシダーゼ１′ｆｃはアルカリ
ホスファターゼで標識した（抗ヒ） ＩｇＧ）免疫グロ
ブリン（たとえばヤギから得る）１００μｅをピペット
で管にと９、２０℃、２５℃捷たは３７℃の一定温度で
１時間インキュベートする。
ーン２０緩衝液中に含む特異的標準溶液（標準液のＦＡ
製の項参照）１００μｅを、前述のようにコーティング
した管にピペットでと９、２０°Ｃで１時゛間インキュ
ベートする。標準曲線の測定範囲内にくるように、生物
学的試験材料のサンプル、たとえば患者血清は、ＰＢＳ
／ツイーン２０緩衝液で力価１：５〜１ ： ２，０
０ ０に希釈し、同容量使用する。インキュベーション
混合物を吸引接遇し、ついでＰＢＳ７’） イー ７
２ ０緩衝液２ ０ ０．、ｔｔｅ テ２回洗浄し、再
び吸引濾過する。パーオキシダーゼ１′ｆｃはアルカリ
ホスファターゼで標識した（抗ヒ） ＩｇＧ）免疫グロ
ブリン（たとえばヤギから得る）１００μｅをピペット
で管にと９、２０℃、２５℃捷たは３７℃の一定温度で
１時間インキュベートする。
次に管をＰＢＳ ／ツイーン２０緩衝液２０マイクロタ
イターで２回洗浄する。抱合パーオキシダーゼ指示シス
テムを用いる場合には、基質としてＯーフエニレンジア
ミン、およびクエン酸緩衝液０、１ｍｏ（５ ／ ｅ
、 ＰＨ ５．０中過酸化水素を加え、混合物を１５分
間、一定温度でインキュベートする。
イターで２回洗浄する。抱合パーオキシダーゼ指示シス
テムを用いる場合には、基質としてＯーフエニレンジア
ミン、およびクエン酸緩衝液０、１ｍｏ（５ ／ ｅ
、 ＰＨ ５．０中過酸化水素を加え、混合物を１５分
間、一定温度でインキュベートする。
反応を停止させるため、５Ｎ硫酸５０μｅｋ加える。４
９ ２ ｎｍにおける吸光度は免疫グロブリンの使用
量に比例する。ヒト血清中濃度は１ｍ７！中１μ９から
ダの範囲筐でである。
９ ２ ｎｍにおける吸光度は免疫グロブリンの使用
量に比例する。ヒト血清中濃度は１ｍ７！中１μ９から
ダの範囲筐でである。
特異的ＩｇＧ測定の際の変動係数は、検量曲線の中央付
近で６．６％である。
近で６．６％である。
１、アルプミンーダリコペ７°チ１抱合体のＳｅｐｈａ
ｒｏｓｅケ８ル１０ｍｌｋ４〜５倍過剰の蒸留．水で５
回洗浄し、水１０鉤に懸濁する。こｎに、ブロモシアノ
ダン４ ３ ０Ｉｎ９’ｅ水８−に溶解して加える。反
応は室温で起こる。２ ｍｏｅ ／ ｅの水酸化ナトリ
ウム溶液を加えてＰＨを一定値１１．０に保持する。１
５分間穏やかに攪拌して反応させたのち、ｒ ｆｉＶｆ
ｙ” ７ す− Ｍ斗ｆｌｌ＆引濾過し、Ｑ．１ｍｏ
／／／１の炭酸水素ナトリウムｔ５０ｍｌで洗浄する。
ｒｏｓｅケ８ル１０ｍｌｋ４〜５倍過剰の蒸留．水で５
回洗浄し、水１０鉤に懸濁する。こｎに、ブロモシアノ
ダン４ ３ ０Ｉｎ９’ｅ水８−に溶解して加える。反
応は室温で起こる。２ ｍｏｅ ／ ｅの水酸化ナトリ
ウム溶液を加えてＰＨを一定値１１．０に保持する。１
５分間穏やかに攪拌して反応させたのち、ｒ ｆｉＶｆ
ｙ” ７ す− Ｍ斗ｆｌｌ＆引濾過し、Ｑ．１ｍｏ
／／／１の炭酸水素ナトリウムｔ５０ｍｌで洗浄する。
このＳｅｐｈａｒｏｓｅをアルブミンーグリコペプチド
抱合体５０ｍ９を含有する３．１ｍｏｇ ／ ｅ炭酸水
素ナトリウム溶液７．５ｍｌ中に攪拌下に加える。４℃
で一夜穏やかに攪拌してカップリングさせる。反応終了
後、混合物を再び吸引濾過し、カップリングゲル全３０
〜４０１ｎｌの水で２回、ライＴ Ｏ．ｉ ｍｏｅ／
（Ｊ炭酸水素ナトリウム溶液， ０．２ ｍｏｅ／ ｅ
酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ４．５、０．２ ｍｏｅ
／ ｅ ＩＪ ン’Ｈｌナト＋） ’ｙム緩衝液ｐＨ
７．２、およびＯ’．０ １ ｍｏｅ ／ ｌ ＰＢＳ
、 ＰＨ７、２で洗浄する。親和性ｒルはＰＢＳ緩衝
液ＰＨ７．２中、４℃で保存する。
抱合体５０ｍ９を含有する３．１ｍｏｇ ／ ｅ炭酸水
素ナトリウム溶液７．５ｍｌ中に攪拌下に加える。４℃
で一夜穏やかに攪拌してカップリングさせる。反応終了
後、混合物を再び吸引濾過し、カップリングゲル全３０
〜４０１ｎｌの水で２回、ライＴ Ｏ．ｉ ｍｏｅ／
（Ｊ炭酸水素ナトリウム溶液， ０．２ ｍｏｅ／ ｅ
酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ４．５、０．２ ｍｏｅ
／ ｅ ＩＪ ン’Ｈｌナト＋） ’ｙム緩衝液ｐＨ
７．２、およびＯ’．０ １ ｍｏｅ ／ ｌ ＰＢＳ
、 ＰＨ７、２で洗浄する。親和性ｒルはＰＢＳ緩衝
液ＰＨ７．２中、４℃で保存する。
２．親和性クロマトグラフィーの実施
ｒルを適当なカラムに充填し、抗体含有血清または高免
疫グロブリン分画を加える。充填したカラムを、溶出液
中の２８０ ｎｍにおける吸光度が０．０３以下になる
までＰＢＳ緩衝液（ツイーンを含まない）で洗浄する（
血清の約２倍の緩衝液を消費する）。溶出は０．１〜１
ｍＯｅ ／ ｅの酢酸で行う。
疫グロブリン分画を加える。充填したカラムを、溶出液
中の２８０ ｎｍにおける吸光度が０．０３以下になる
までＰＢＳ緩衝液（ツイーンを含まない）で洗浄する（
血清の約２倍の緩衝液を消費する）。溶出は０．１〜１
ｍＯｅ ／ ｅの酢酸で行う。
抗体は酢酸のはじめの分画に溶出さ扛る。抗体を含む分
画を合して中和する。合した溶出液を十分量のＰＢＳで
透析し、ついで濃縮し、５ｅｐｈａａｅｘＧ２００上ク
ロマトグラフイーに付す。
画を合して中和する。合した溶出液を十分量のＰＢＳで
透析し、ついで濃縮し、５ｅｐｈａａｅｘＧ２００上ク
ロマトグラフイーに付す。
６、抗体分画の特性
精製免疫グロブリンは、２８０ｎｍで測定すると、基準
化５ｅｐｈａｄｅＸ ０２００カラムから対称のピーク
として溶出した。この分画の分子量は約１５０．０００
であった。分子量および均一性は、さらに分析超遠心で
確認し、２８０ｎｍの紫外部吸収で測定した。タンパク
質は均一なバンドとした。酢酸セルロース電気泳動にお
いて、γ−グロブリンの領域に均一なバンドが得らｎた
。多価高血清を用いた免疫電気泳動において、沈降線は
免疫グロブリンＧ領域に検知さｎた。
化５ｅｐｈａｄｅＸ ０２００カラムから対称のピーク
として溶出した。この分画の分子量は約１５０．０００
であった。分子量および均一性は、さらに分析超遠心で
確認し、２８０ｎｍの紫外部吸収で測定した。タンパク
質は均一なバンドとした。酢酸セルロース電気泳動にお
いて、γ−グロブリンの領域に均一なバンドが得らｎた
。多価高血清を用いた免疫電気泳動において、沈降線は
免疫グロブリンＧ領域に検知さｎた。
代理人 浅 村 皓
第１頁の続き
■Ｉｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整州＠発明者 へ
ムット コルブ ドイツ連邦共。
ムット コルブ ドイツ連邦共。
−セ １３
０発 明 者 カール ハイフン ス ドイツ連邦共り
ライファー アー ０発 明 者 ハンス ピータ−ザ ドイツ連邦共イド
ル ２０ ［相］発 明 者 クラウス デイエター ドイツ連邦
共タイムブナ−セ ７０ ［相］発明者 ルドヴイッグ ヴアイ ドイツ連邦共ス
−セ ７ 印国ミュンヘン ８２．クランズホルンストラ印国ロホ
フ、シュヴアルペンストラーセ ３印国ミュンヘン ６
０．マルソプストラーセ印国ミュンヘン ７１．ヴアテ
ルローストラー和国ミュンヘン ７１．ハウベリゼル
ストラ手続補正書（方式） 昭和６０年９月３７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和乙ρ年特許願第 ９ｑ８≦−号 ２、発明の名称 △°フ０斗Ｆ′ヶパツＤ＞めグツＤ＞
企蹟ｌてケイ１３柄−１不 ３、補正をする者 事件との関係 特許出噸人 ５、補正命令の日付 昭和６０年ｑ 月３Ｄ日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 タイプ〔１］書により鮮明にｆＹ成した明１１１書と第
、Ｓ−、／７ １ｇ ノ？ 」：Ｌ 二ミ汐）に基づ（
、定性的および定量的免疫測定法によって満足される。
ライファー アー ０発 明 者 ハンス ピータ−ザ ドイツ連邦共イド
ル ２０ ［相］発 明 者 クラウス デイエター ドイツ連邦
共タイムブナ−セ ７０ ［相］発明者 ルドヴイッグ ヴアイ ドイツ連邦共ス
−セ ７ 印国ミュンヘン ８２．クランズホルンストラ印国ロホ
フ、シュヴアルペンストラーセ ３印国ミュンヘン ６
０．マルソプストラーセ印国ミュンヘン ７１．ヴアテ
ルローストラー和国ミュンヘン ７１．ハウベリゼル
ストラ手続補正書（方式） 昭和６０年９月３７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和乙ρ年特許願第 ９ｑ８≦−号 ２、発明の名称 △°フ０斗Ｆ′ヶパツＤ＞めグツＤ＞
企蹟ｌてケイ１３柄−１不 ３、補正をする者 事件との関係 特許出噸人 ５、補正命令の日付 昭和６０年ｑ 月３Ｄ日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 タイプ〔１］書により鮮明にｆＹ成した明１１１書と第
、Ｓ−、／７ １ｇ ノ？ 」：Ｌ 二ミ汐）に基づ（
、定性的および定量的免疫測定法によって満足される。
ホモオよびペテロ試験システムが知られている。
最近報告される酵素免疫測定法の大部分はへテロ相で行
われるもので、たとえばサンドウィンチ免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）等は、信頼性が高く応用範囲が広いのみでな
く、感度も高い。
われるもので、たとえばサンドウィンチ免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）等は、信頼性が高く応用範囲が広いのみでな
く、感度も高い。
ＥＬＩＳＡが応用される重要な分野のひとつは、感染症
における免疫状態の測定や免疫診断のため特異的抗体の
測定である〔カールソン他３名（Ｃａｒｌｓｏｎ、 Ｂ
、Ａ、、 （）ｉｅｂｉｎｋ、 （）、Ｓ、、 ５ｐｉ
ｋａ、 Ｊ、Ｓ。
における免疫状態の測定や免疫診断のため特異的抗体の
測定である〔カールソン他３名（Ｃａｒｌｓｏｎ、 Ｂ
、Ａ、、 （）ｉｅｂｉｎｋ、 （）、Ｓ、、 ５ｐｉ
ｋａ、 Ｊ、Ｓ。
＆ Ｇｒａｙ、 Ｅ、Ｄ、 ） ：酵素結合免疫吸着検
定法によるタイプ■肺炎球菌ポリサンカライドに対する
免疫グロブリンＧおよびＭ抗体の測定、ジエイ、タリン
、ミクロパイオル、 （Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ
ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ａｎｄ Ｍ ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｙｐｅ ＩＩｐｎｅｕｍｏ
ｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｂｙ
ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏ ５ｏｒｂｅｎ
ｔ ａｓｓａｙ、 Ｊ 、Ｃ１１ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ ） 。
定法によるタイプ■肺炎球菌ポリサンカライドに対する
免疫グロブリンＧおよびＭ抗体の測定、ジエイ、タリン
、ミクロパイオル、 （Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ
ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ａｎｄ Ｍ ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｙｐｅ ＩＩｐｎｅｕｍｏ
ｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｂｙ
ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏ ５ｏｒｂｅｎ
ｔ ａｓｓａｙ、 Ｊ 、Ｃ１１ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ ） 。
１６：６３−６９．１９８２）。
とくに、バクテリアの細胞壁構造に対する抗体の測定は
、これらの分子が病原微生物と宿主の間の相互作用の一
次的原因罠なっているのできわめて重要である。この測
定はとくに、他の方法では感染を明らかにできないバク
テリアの感染を診断誘導体）の単離 胞壁の単離 バチルス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ ）を大量培養（４０１）により生育させ、対数
生育相の後期に細胞を収穫し、トリゾシン処理した細胞
壁をシュレイファーおよびカンドラ−（５ｃｈｌｅｉｆ
ｅｒ ＆ Ｋａｎｄｌｅｒ ）の方法〔シュレイファー
他（５ｃｈｌｅｉｆｅｒ、 Ｋ、Ｈ，＆ Ｋａｎｄｌｅ
ｒ、 Ｏ，） ： ｔ４クチリア細胞壁のペプチドグリ
カンタイブおよびそれらの分類学的関係：バクト、レビ
ュー。
、これらの分子が病原微生物と宿主の間の相互作用の一
次的原因罠なっているのできわめて重要である。この測
定はとくに、他の方法では感染を明らかにできないバク
テリアの感染を診断誘導体）の単離 胞壁の単離 バチルス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ ）を大量培養（４０１）により生育させ、対数
生育相の後期に細胞を収穫し、トリゾシン処理した細胞
壁をシュレイファーおよびカンドラ−（５ｃｈｌｅｉｆ
ｅｒ ＆ Ｋａｎｄｌｅｒ ）の方法〔シュレイファー
他（５ｃｈｌｅｉｆｅｒ、 Ｋ、Ｈ，＆ Ｋａｎｄｌｅ
ｒ、 Ｏ，） ： ｔ４クチリア細胞壁のペプチドグリ
カンタイブおよびそれらの分類学的関係：バクト、レビ
ュー。
（Ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓａｎｄ ｔｈ
ｅｉｒ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ： Ｂａｃｔ。
ａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓａｎｄ ｔｈ
ｅｉｒ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ： Ｂａｃｔ。
Ｒｅｖ、）、３６：４０７〜４７７．１９７２）を用い
て単離した。
て単離した。
１．２．ズブチリシンによるタンパク質の抽出トリジシ
ン処理細胞壁に１０％トリクロロ酢酸（５ツの細胞壁に
１−）を加え、６０℃で６時間抽出し、さらにプロテア
ーゼズブチリシンで精製した。トリクロロ酢酸（２ｔＲ
ｙ／ｍ）で抽出した細胞壁なＯ−ＩＭＩＪン酸塩緩衝液
（ｐＨ７，５）に懸濁し、ズブチリシン（１１単位／ツ
： ＢＰＮ’ＥＣ３，４，２１，１４）とともに５７℃
で一夜インキュベートした。遠心分離後、細胞壁を４回
洗浄し、凍結乾燥した。
ン処理細胞壁に１０％トリクロロ酢酸（５ツの細胞壁に
１−）を加え、６０℃で６時間抽出し、さらにプロテア
ーゼズブチリシンで精製した。トリクロロ酢酸（２ｔＲ
ｙ／ｍ）で抽出した細胞壁なＯ−ＩＭＩＪン酸塩緩衝液
（ｐＨ７，５）に懸濁し、ズブチリシン（１１単位／ツ
： ＢＰＮ’ＥＣ３，４，２１，１４）とともに５７℃
で一夜インキュベートした。遠心分離後、細胞壁を４回
洗浄し、凍結乾燥した。
１．６．細胞壁のリゾチームによる加水分解ズブチリシ
ン処理細胞壁を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
６，２）に懸濁し、１０■／ｒＩＬｌのりゾチーム〔セ
ルパ（５ｅｒｖａ ） ： ２２，０００単位／り〕を
加え、６７６Ｃで約２４時間インキュベートした。
ン処理細胞壁を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
６，２）に懸濁し、１０■／ｒＩＬｌのりゾチーム〔セ
ルパ（５ｅｒｖａ ） ： ２２，０００単位／り〕を
加え、６７６Ｃで約２４時間インキュベートした。
トルエンを数滴加えて、細菌およびかびの生育を防止し
た。
た。
の単離
リゾチーム処理細胞壁を４８，０００ Ｎで２０分間遠
心分離し、上清分画を二重蒸留水で４時間の透析に２回
付した。透析液を真空中４０℃で濃縮し、ついで凍結乾
燥した。
心分離し、上清分画を二重蒸留水で４時間の透析に２回
付した。透析液を真空中４０℃で濃縮し、ついで凍結乾
燥した。
油状の残留物を五酸化リン上で乾燥し、二重蒸留水（５
０η１０．１ＴＬｌ）にとった。不溶成分があれば遠心
分離して除去した。分画１００μｌずつをセファデック
ス（８ｅｐｈａｄｅｘ ） Ｇ ２５上りｏｖトゲラフ
イーに付した。
０η１０．１ＴＬｌ）にとった。不溶成分があれば遠心
分離して除去した。分画１００μｌずつをセファデック
ス（８ｅｐｈａｄｅｘ ） Ｇ ２５上りｏｖトゲラフ
イーに付した。
カラム床は１００Ｘ２．２ＣｒｒＬとした。溶出は二重
蒸留水により、１分４滴の速度で実施した。各２ｒｒＬ
ｌＯ分画を集め、その２０６ ｎｍにおける吸収を測定
し、グリコペプチド含有分画を集めて凍結乾燥した。
蒸留水により、１分４滴の速度で実施した。各２ｒｒＬ
ｌＯ分画を集め、その２０６ ｎｍにおける吸収を測定
し、グリコペプチド含有分画を集めて凍結乾燥した。
調整
ヒト血清アルジミンを炭酸塩緩衝液（０，１ＭＮｐＨ９
，６） ２．８５ ｒｄ中に、グリコペプチド４６．２
■とともに溶解した。この溶液をグルタルアルデヒド〔
シダーｒ （Ｓｉｇｍａ ） １２５％溶液１５０ ｔ
ｔｌｌと混合し、４℃で一夜攪拌した。残ったアルデヒ
ド基があればそれを飽和するために反応混合物をＬ−リ
ジン（０，２ｍｏｌ）と６時間インキュベートし、完全
に透析したのち二重蒸留水で透析し、上清分画を凍結乾
燥した。
，６） ２．８５ ｒｄ中に、グリコペプチド４６．２
■とともに溶解した。この溶液をグルタルアルデヒド〔
シダーｒ （Ｓｉｇｍａ ） １２５％溶液１５０ ｔ
ｔｌｌと混合し、４℃で一夜攪拌した。残ったアルデヒ
ド基があればそれを飽和するために反応混合物をＬ−リ
ジン（０，２ｍｏｌ）と６時間インキュベートし、完全
に透析したのち二重蒸留水で透析し、上清分画を凍結乾
燥した。
本例では、内容量２ゴ弱、高さ４ｃＴＬ１径１確のポリ
スチレン管を用いた。類似のプラスチック材１、アルブ
ミンーグリコペプチド抱合体の！ セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ）デル１０ｍ１を
４〜５倍過剰の蒸留水で５回洗浄し、水１０ｍ１Ｋ懸濁
スル。これに、プロモシアノデン４３０”Ｆを水８ｍｌ
に溶解して加える。反応は室温で起こる。２ｍ０ｌ／ｌ
の水酸化ナトリウム溶液を加えてＰＨを一定値１１．０
に保持する。１５分分間中かに攪拌して反応させたのち
、デルをプフナー濾斗で吸引濾過し、０．１ｍｏｌ／ｌ
の炭酸水素ナトリウム６ＣＪｒｎｌで洗浄する。このセ
ファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ）をアルブミン−グ
リコペプチド抱合体５０ツを含有する０、１ ｍｏｂ
／ ｌ炭酸水素ナトリウム溶液７．５ｒｎ７ｉ中に攪拌
下に加える。４°Ｃで一夜穏やかに攪拌してカンシリン
グさせる。反応終了後、混合物を再び吸引濾過し、カッ
プリングデルをろＯ〜４０ｍＪの水で２回、ついで０．
１ ｍｏｌ ／ ｌ炭酸水素ナトリウム溶液、０．２
ｍｏｌ ／ ｌ酢酸ナトリウム緩衝液ＰＨ４，５，０，
２！ ｍｏｂ ／ Ａ！リン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ
７２、および０．０１ ｍ０１１ ／ １ＰＢＳ ＸＰ
Ｈ７，２で洗浄する０親和性ゲルはＰＢＳ緩衝液ｐＨ７
，２ 中、４°Ｃで保存する。
スチレン管を用いた。類似のプラスチック材１、アルブ
ミンーグリコペプチド抱合体の！ セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ）デル１０ｍ１を
４〜５倍過剰の蒸留水で５回洗浄し、水１０ｍ１Ｋ懸濁
スル。これに、プロモシアノデン４３０”Ｆを水８ｍｌ
に溶解して加える。反応は室温で起こる。２ｍ０ｌ／ｌ
の水酸化ナトリウム溶液を加えてＰＨを一定値１１．０
に保持する。１５分分間中かに攪拌して反応させたのち
、デルをプフナー濾斗で吸引濾過し、０．１ｍｏｌ／ｌ
の炭酸水素ナトリウム６ＣＪｒｎｌで洗浄する。このセ
ファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ）をアルブミン−グ
リコペプチド抱合体５０ツを含有する０、１ ｍｏｂ
／ ｌ炭酸水素ナトリウム溶液７．５ｒｎ７ｉ中に攪拌
下に加える。４°Ｃで一夜穏やかに攪拌してカンシリン
グさせる。反応終了後、混合物を再び吸引濾過し、カッ
プリングデルをろＯ〜４０ｍＪの水で２回、ついで０．
１ ｍｏｌ ／ ｌ炭酸水素ナトリウム溶液、０．２
ｍｏｌ ／ ｌ酢酸ナトリウム緩衝液ＰＨ４，５，０，
２！ ｍｏｂ ／ Ａ！リン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ
７２、および０．０１ ｍ０１１ ／ １ＰＢＳ ＸＰ
Ｈ７，２で洗浄する０親和性ゲルはＰＢＳ緩衝液ｐＨ７
，２ 中、４°Ｃで保存する。
２、親和性クロマトグラフィーの実施
ゲルを適当なカラムに充填し、抗体含有血清または高免
疫グリプリン分画を加える。充填したカラムを、溶出液
中の２８０ ｎｍにおける吸光度が０．０６以下になる
までＰＢＳ緩衝液（ツイーンを含まない）で洗浄する（
血清の約２倍の緩衝液を消費する）。溶出は０．１〜１
ｍ０ｌ／ｌの酢酸で行う。
疫グリプリン分画を加える。充填したカラムを、溶出液
中の２８０ ｎｍにおける吸光度が０．０６以下になる
までＰＢＳ緩衝液（ツイーンを含まない）で洗浄する（
血清の約２倍の緩衝液を消費する）。溶出は０．１〜１
ｍ０ｌ／ｌの酢酸で行う。
抗体は酢酸のはじめの分画に溶出される。抗体を含む分
画を合して中和する。合した溶出液を十分量のＰＢＳで
透析し、ついで濃縮し、セファデックス（５ｅｐｈａｄ
ｅｘ ） （） ２００上クロマトグラフイーに付す。
画を合して中和する。合した溶出液を十分量のＰＢＳで
透析し、ついで濃縮し、セファデックス（５ｅｐｈａｄ
ｅｘ ） （） ２００上クロマトグラフイーに付す。
６、抗体分画の特性
精製免疫グロブリンは、２８０ｎｍで測定すると、基準
化セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ） ’０２００
カラムから対称の−一りとして溶出した。この分画の分
子量は約１５０，０００であった。分子量および均一性
は、さらに分析超遠心で確認し、２８０ ｎｍの紫外部
吸収で測定した。タンパク質は均一なバンドとして分析
された。標準条件下、５２０Ｗは７．８であつ
化セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ） ’０２００
カラムから対称の−一りとして溶出した。この分画の分
子量は約１５０，０００であった。分子量および均一性
は、さらに分析超遠心で確認し、２８０ ｎｍの紫外部
吸収で測定した。タンパク質は均一なバンドとして分析
された。標準条件下、５２０Ｗは７．８であつ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ａ）一般式（Ｉ） 〔式中Ｒは水素または式 ｌ ＣＨ３ＣＨ３ （式中Ｒ′はアミノ酸残基またはペプチドである）で示
さｎる基でｓｐ、ｎは１から６までの数、好ましくは２
〜４である〕で示さｎる糖誘導体への特異的結合、また
はｂ）一般式（Ｉ）の糖誘導体を含む単離バクテリア細
胞壁への特異的結合を特徴とする、ペプチドグリカンの
グリカン鎖に対し生物学的試験材料中に免疫グロブリン
Ｇ、ＡおよびＭのクラスから生成する抗体 （２）一般式（Ｉ）におけるＰは水素または式０ ０ ＣＨ３ＣＨ３ 〔式中Ｒ′はアミノ酸Ｌ−Ａｌａ 、 Ｌ−８ｅｒ ％
ＧｌｙまたはペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ 、 Ｌ
−Ａｌａ−Ｄ−ｉ−Ｇｌｎ 。 Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−Ａｌａ−
Ｄ−Ｇｌｕ（Ａ２ｐｍ）のひとつである〕で示さ扛る基
であり、］は２から４までの数である特許請求の範囲第
１項記載の抗体（３）特許請求の範囲第１項における一
般式（Ｉ）の糖誘導体を公知の方法を用いて固相にカッ
プリングさせ、この形で沈殿により豊富化したヒト血漿
免疫グロブリン分画からの免疫グロブリンＧ、 Ａおよ
びＭのクラスの特異的抗体の選択的結合ついで選択的溶
出に使用することを特徴とする、ペプチドグリカンのグ
リカン鎖およびこのグリカン鎖を含むバクテリア細胞壁
に対する抗体の製造方法およびそれに要する試薬 （４） 一般式 〔式中Ｒは水素または式 ０ ０ ＩＩ ＩＩ Ｃ）Ｉ 、 ＣＨ３ （式中Ｒ′はアミノ酸残基またはペゾチドである）で示
される基であり、ｎは１から６までの数である〕で示さ
扛る化合＠を抗原として使用することを特徴とする、生
物学的試験材料中のペプチドグリカンのグリカン鎖に対
する免疫グロブリン０１ＡおよびＭのクラスからの抗体
をそｎ自体公知の免疫化学的方法で定量的に測定する方
法およびそｎに要する試薬 （５）抗体の定量的測定は二重抗体酵素免疫測定法で行
う特許請求の範囲第４項記載の方法（６）抗体の定量的
測定は比濁法によって行う特許請求の範囲第４項記載の
方法 （７）抗体の定量的測定は二重抗体放射免疫測定法によ
って行う特許請求の範囲第４項記載の方法（８）抗体の
定量的測定は固相サンドウィッチ放射免疫測定法によっ
て行う特許請求の範囲第４項記載の方法 （９）抗体の定量的測定は固相酵素免疫測定法によって
行う特許請求の範囲第４項記載の方法（１ｏ）抗体の定
量的測定は固相螢光免疫測定法によって行う特許請求の
範囲第４項記載の方法ａυ 抗体の定量的測定はラテッ
クス凝集杯験で行う特許請求の範囲第４項記載の方法
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3402739.4 | 1984-01-27 | ||
| DE19843402739 DE3402739A1 (de) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Antikoerper gegen den glycanstrang des peptidoglycans, verfahren und reagenzien zu ihrer herstellung und methoden zu ihrer quantitativen bestimmung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60222771A true JPS60222771A (ja) | 1985-11-07 |
Family
ID=6226019
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60009985A Pending JPS60222771A (ja) | 1984-01-27 | 1985-01-24 | ペプチドグリカンのグリカン鎖に対する抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0150466A3 (ja) |
| JP (1) | JPS60222771A (ja) |
| AU (1) | AU3810485A (ja) |
| DE (1) | DE3402739A1 (ja) |
| IL (1) | IL74163A0 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8501613D0 (sv) * | 1985-04-01 | 1985-04-01 | Bio Carb Ab | Foreningar for terapeutisk eller diagnostisk anvendning jemte forfarande for terapeutisk behandling |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8001748L (sv) * | 1980-03-05 | 1981-09-06 | Kaellenius Gunilla | Kompositioner for terapeutisk eller diagnostisk anvendning jemte forfarande for terapeutik |
| AU561066B2 (en) * | 1982-03-22 | 1987-04-30 | Biocarb Ab | Antibacterial composition containing an oligosaccharide |
| DE3231204A1 (de) * | 1982-08-21 | 1984-03-01 | Boehringer Ingelheim Diagnostika GmbH, 8046 Garching | Antikoerper gegen bakterielle peptidoglycane, verfahren zu ihrer herstellung und methoden zu ihrer quantitativen bestimmung |
-
1984
- 1984-01-27 DE DE19843402739 patent/DE3402739A1/de not_active Withdrawn
- 1984-12-21 EP EP84116028A patent/EP0150466A3/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-01-24 JP JP60009985A patent/JPS60222771A/ja active Pending
- 1985-01-25 AU AU38104/85A patent/AU3810485A/en not_active Abandoned
- 1985-01-25 IL IL74163A patent/IL74163A0/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3810485A (en) | 1985-08-01 |
| EP0150466A2 (de) | 1985-08-07 |
| DE3402739A1 (de) | 1985-08-01 |
| EP0150466A3 (de) | 1988-07-27 |
| IL74163A0 (en) | 1985-04-30 |
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