JPH05508714A

JPH05508714A - 生物学的液体中のグラム陰性細菌性リポポリサッカライドの検出方法

Info

Publication number: JPH05508714A
Application number: JP91513070A
Authority: JP
Inventors: ハンセン，エリック，ジェイ．; マンフォード，ロバート，エス．; マートソラ，ジュシー
Original assignee: ボードオブリージェンツ，ザユニバーシティオブテキサスシステム
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 1993-12-02
Also published as: CA2084083A1; US5198339A; US5356778A; WO1992001228A1; DE69110287D1; EP0539497B1; DE69110287T2; AU8297191A; EP0539497A1; ATE123576T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的液体中のグラム陰性細菌性リポポリサッカライドの検出方法合衆国政府は、国立衛生研究所により与えられた許可番号ＨＤ２２７６６の条項に従って、本発明についである種の権利を育するであろう。

本願は、１９９０年７月１３日出願の米国出願番号環５５３．０７２号の一部継続出願である。

発明の分野本発明は、リポポリサッカライド捕捉剤として作用して広いｍ囲のグラム陰性菌と交差反応す４鼻ヰ壬使用する、生物学的液体中、または臨床的もしくは医薬的使用のための液体中の細菌性エンドトキシンの検出方法に関するものである。特に、この方法は、選択されたグラム陰性菌のエンドトキシンを検出するように修飾され得る高感度アッセイを提供する。

略号のリストＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ　タイプｂ　Ｈｉｂリボオリゴサツカライド　ＬＯＳポリミクシン　Ｂ　ＰＭＢイムノリムルス（ｉｍｍｕｎｏｌｉｍｕｌｕｓ　）　Ｉ　Ｍ　Ｌ発色性リムルスアメーバ様細胞アッセイ　ＣＬＡＬリムルスアメーバ様細胞溶解物　ＬＰＳ酵素結合免疫吸着剤アッセイ　ＥＬＩＳＡ外部膜粒子　ＯＭＶドデシル硫酸ナトリウム　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動　ＰＡＧＥ発熱因子−非含有　ｐｆイムノグロブリン　Ｇ　ＩｇＧリン酸緩衝食塩水　ＰＢＳトゥイーン　２０　ＴＶウシ血清アルブミン　ＢＳＡ脳を髄液　Ｃ３Ｆコロニ一形成単位　ＣＦＵレビンタール（Ｌｅｖｉｎｔｈａｌ）塩基添加脳心臓浸剤培養液　ＢＨＩｓ関連技術の記述敗血症は、最近重要性を増している潜在的な致死的臨床症状であり、それは多分、免疫無防備状態の患者のより長くなった生存期間および医療における侵入技術のより優れた利用のためであろう（ｌ、２）。この疾患の発症率は、最近の２０年間で１０倍に増大し、年間の発病者数は、米国のみについてみても１００，０００から３００．０００であると評価されている（３）。グラム陰性菌の敗血症にかかった患者の２０％から４０％は重症状態になり、それらの約７５％は死亡するであろう（１）。小児においては、敗血性重症状態の約４０％は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂ（Ｈｉｂ）を原因とする（４）。好中球減少症患者におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細菌は、敗血症の特に致命的な形態である。

グラム陰性敗血症の特定の実験室的診断は、通常は血液試料を培養して実施されている。しかしながら、これらの方法は、細菌の生育を検出するために数時間ないし数日間を要して比較的遅いものである。

エンドトキシンは、グラム陰性菌感染の間の炎症のカスケードにおいて重要な要素であると考えられている（５）。従って、敗血症患者の血液試料中のこれらの分子の定量が重要であると考えられてきた。エンドトキシン検出のための簡単でかつ比較的感度のよい方法は、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）のアメーバ様細胞溶解物（ＬＡＬ）アッセイに関連する（６）。しかしながら、ＬＡＬアッセイは、いくつかの問題を存しており、敗血症診断における存用性を制限している。このアッセイは、実験室の液体および試薬中の痕跡量のＬＰＳ汚染に対して感受性であり、従って偽陽性反応を生じる。更に、患者の血漿は、ＬＡＬ反応に関与する酵素の非特異的活性化因子および阻害剤を有している。最後に、通常の血漿の色および濁度は、ＣＬＡＬアッセイとして知られているＬＡＬ法の最近の改良法の高い感度を妨害する。後者の方法は、合成発色性物質に対する活性化溶解物酵素の作用により生じる色を測定する。これらの問題のため、ＬＡＬおよびＣＬＡＬアッセイの感度および特異性は、信頼できる臨床的診断としては最善のものとはいえないと考えられている。

リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の基本構造は、比較的よく定義される３つの領域からなり、すべてのグラム陰性菌において類似している。これらの領域は、〇 −特異的な側鎖、核オリゴサツカライド、および脂質Ａである。〇−特異的領域は、それぞれ２−６サツカライドを有して反復するオリゴサツカライド単位からなっている。

核は、〇−特異的側鎖と脂質Ａとの間にあり、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびガラクトース等の代表的糖類を有する分岐状オリゴサツカライドである。

脂質Ａに近接する核領域においては、ヘプトースおよびケト−デオキシオクトネートが共通して見出される。０−鎖領域ではグラム陰性菌の間でかなりの構造的変異が存在するが、核領域にわたって、脂質Ａ近傍の内部核領域で高度に保存的である構造を伴って、重要ではない変異のみが存在する。ＬＰＳ分子の最も高度に保存される部分は、脂質Ａであり、長鎖脂肪酸かホスホリル化グルコサミンジサッカライドに結合している。

ｔ（ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ、　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｌｉｄｉｓ。

Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　、およびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを含０ある種のグラム陰性菌は、リボオリゴサ・ツカライド（ＬＯ３）と称される異なる堅のＬＰＳ分子を合成する。

ＬＯ３は、〇−抗原を有さないが、脂質Ａおよびオリコ゛サツカライドからなることを除き、ＬＰＳ分子に極めて類似している。ＬＯ３は、ＬＰＳと同様にエンドトキシンである。

典型的グラム陰性リポポリサッカライド、Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの一般構造を図１に示しである。

細菌性リポポリサッカライドの核領域が高度に保存されていることの認識は、すべてのグラム陰性菌種のエンドトキシンと交差反応するであろう抗体の研究を招来した。要人かは、高度に交差反応性のモノクローナル抗体を得た旨を主張しており、例えば、それらのいくつかは脂質Ａに対するものである（　７−９　）　ｏ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株と特異的に結合するモノクローナル抗体が、０−側鎖および核ポリサッカライドの一部を欠く細菌変異株を用いてマウスを免疫することにより製造されている（１０）。多くの例において交差反応性が説得力をもって示されていない事実にかかわらず、報告されているモノクローナル抗体のうち少なくともいくつかは、ＬＰＳ検出において交差反応性を有している（１）。理論的には、グラム陰性菌のいずれか一つまたは多くとも数種のＬＰＳ核に対する抗体は、図１に示されるＬＰＳの一般核構造を有するすべてのグラム陰性菌と相互作用しなければならない。

ＸＭＭＥＮ−ＯＨ２は、グラム陰性菌のエンドトキシン核糖脂質に関連するＬＰＳ上のエピトープに結合するモノクローナル抗体を産生ずる（１１）。開示されている抗体は、異なる属のグラム陰性菌に対して広い交差反応性を有し、エンドトキシンを効果的に中和する。これらのモノクローナル抗体を使用する有力なアッセイが、当業者に周知の標準的ＥＬＩＳＡ技術を使用するエンドトキシンの定量を含めて示唆されている。しかしながら、免疫的診断の標準的方法は、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アッセイの高い感度を欠いている。

グラム陰性のエンドトキシンと反応させるためのＣＬＡＬアッセイにおいて使用されるアメーバ様細胞溶解物の能力が、リポポリサッカライド検出のためのアッセイを開発するために使用されている。エンドトキシンは、アメーバ様細胞溶解物から調製される捕捉剤に結合される（１２）。次いで、結合されたエンドトキシンが、例えば抗原的分析法により検出される。この方法によるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　２３５　Ｌ　Ｐ　Ｓの検出限界は、１０■であった。

この特許の方法は、グラム陰性エンドトキシンに対して選択的であると言えるが、それはピコグラム量を検出し得るＣＬＡＬアッセイに比べてかなり感度が低い。従って、クレームされた方法の一般的育用性は、特に極めて少量のＬＰＳまたは極めて少数の細菌を検出することが重要である臨床的応用において感度の欠如のために制限される。更には、インビボでの使用のための滅菌溶液の分析においては、極めて低い検出限界か臨界的である。

従って、迅速、特異的かつ少なくともピコグラムｌの感度をもった細菌性エンドトキシン検出の一般的方法か必要とされる。原理的に数種の異なるグラム陰性病原を検出し得る多面的アッセイは、グラム陰性細菌としての微生物の同定が、治療の特異的方法を決定するであろう臨床的状況においては、特に作用であろう。

本発明は、一般的に言えば、細菌性エンドトキシン検出のための高感度かつ選択的な方法に関するものである。

該方法は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の捕捉剤としての使用と、発色性のリムルスアメーバ様細胞溶解物検出系の公知の感度とを結合させるものである。

一般的に、本発明による細菌性エンドトキシンの検出は、細菌性エンドトキシンを含むと予想される試料を、そのような細菌性エンドトキシンに結合可能な少なくとも１種の抗体と接触させる工程を含み、ここにおいて試料を該抗体と、該抗体が試料中に存在するであろうエンドトキシンに対して結合するために効果的な条件下で接触させる。次いで、抗体−結合エンドトキシンを洗浄して夾雑物を除去し、次いでエンドトキシンをアメーバ様細胞溶解物を応用して検出する。

更に特定的な実施態様において、該方法は、所望の特異性を存する抗体を固体表面に結合させ、該表面をエンドトキシンを含むと予想される試料と共にインキュベートし、担体〜結合エンドトキシンを洗浄し、該結合エンドトキシンにリムルスアメーバ様細胞溶解物を加えてインキュベートし、最後に該溶解物の基質を加えて検出可能な生成物を形成させることにより実施される。好ましい実施態様において、エンドトキシンの量が測定され、ここで生成物の量は、一般的に言えば結合エンドトキシンの量に比例するであろう。

抗体の固体表面への結合は、一般に固定化のためであって、しばしば硬質表面を単に抗体で被覆することにより達成される。該抗体類は、それらが吸着するであろう任意の固体表面に結合され得る。通常、実際的には抗体類はマイクロタイタープレートのウェルのプラスチック表面に吸着されるが、吸着は任意の適当な表面に対してなされてもよい。試料由来の妨害物質の非特異的結合を防止するために、非被覆部位を封止しておくことは重要である。これは、通常は例えばアルブミン等の蛋白質によって行なわれるが、アッセイを妨害しない別の表面封止剤も使用し得る。

過剰な封止剤は、非特異的結合部位との反応の後に表面から洗浄除去される。洗浄溶液は、通常はトウイーン２０を含む発熱物質非含有のリン酸緩衝食塩水（ｐｆ−ＰＢＳ）である。洗浄剤の存在は、洗浄効果を増大させると思われる。アメーバ様細胞溶解物が捕捉剤として使用される場合には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートまたはデオキシコレート等の界面活性剤を用いる洗浄か、固定化溶解物に対する高水準の非特異的結合を生じることに注意しなければならず（１２）；［、かじながら、固定化溶解物が検出ではなく捕捉のために使用される点において本発明の系とは異なる系であることに注意しなければならない。

洗浄剤が抗体の捕捉結合に影響を与えることはあり得るが、該方法の高い感度から観るに、前書な影響はありそうにない。

発明者らは、抗体の性質（例えば、交差反応性の程度、結合親和性等）が、特定のエンドトキシン検出の広さまたは狭さを決定することを見出した。任意の交差反応性抗体を細菌性エンドトキシンの検出に捕捉剤として使用し得るが、広範囲のグラム陰性菌で見出されるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）およびリボオリゴサツカライド（ＬＯＳ）の検出においてエンドトキシン核糖脂質の高度に保存的な領域に向けられた限定された数のモノクローナル抗体を使用することが好ましい。これは、完全な細菌に加えて細菌が離脱した、または暴露した粒子または泡状物であって捕捉抗体が結合可能なものを含む。限定を意図するものではないが、検出可能な細菌由来のエンドトキシンの例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　、　Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ。

Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　、　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、　Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　、　ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｌＰｒｏｔｅｕｓ　５Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、　Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ　、　Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　１Ａｃｊｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　、　ＣｈｌａｍｙｄｉａおよびＮｅ１ｓｓｅｒｉａならびに一般にＬＰＳが選択された抗体類に結合可能である任意の細菌を含む。

当業者は、抗体の目的がグラム陰性菌の膜の毒性成分であるエンドトキシンの選択的結合における捕捉剤として作用することにあることを認識するであろう。従って、抗体のいくつかの選択可能かある。例えば、表面は、グラム陰性菌の任意の種において脂質Ａから離れた核オリゴサツカライドに対して特異的に指向する抗体で被覆されてもよい。捕捉特異性は、交差反応性に従って１種または限定された群の細菌に向けられている。他方において、脂質Ａに近接するエピトープまたは脂質Ａに対する抗体類は、実質的にすべての種類のグラム陰性菌に対して広い交差反応性を示すことが期待されるであろう。

捕捉剤として使用されるモノクローナル抗体の選択は、多面的機能を示す本発明の一面である。例えば、数種類のうちからある範囲の細菌性エンドトキシンを検出するために、脂質Ａに対する抗体、あるいはその核領域がグラム陰性菌の閏で高度に保存的であることからＬＰＳの脂質Ａ／ＫＤＯ領域に対する抗体を選択してもよい。

ＭＡｂの最適のパネルを得るためには、いくらかの実験が必要であろうが、良好な交差反応性を有する抗体の産生手法の詳細が示されるいくつかの参考文献が存在する（７．１３．１４．１６）。安定してモノクローナル抗体を分泌する少なくとも２種のクローンが、ＸＭＭＥＮ−０Ｅ５およびＸＭＭＥＮ−ＬＹＩとして入手可能であり、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９０８１およびＨＢ９０８２としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。これらの細胞系により産生されるモノクローナル抗体は、グラム陰性菌に対する広い交差反応性を示し、細菌性エンドトキシン検出用の捕捉剤として使用し得る。

抗体類は、当業者に公知の実験技術を使用して開発することもできる。特に、好適な抗体類は、免疫およびグラム陰性菌の粗製変異株のいくつかの種を含むハイブリドーマ融合体から得られたハイブリドーマから選択されてよい。粗製変異株は、野生型コロニーの平滑な外観と対照的なそれらの外観に基いて野生型コロニーから選択可能である。粗い外観は、〇−抗原の除去の結果である。

除去の結果として、核の部分がより露出され、露出領域中のエピトープに対する抗体の広い選択の形成を可能とする。最も好ましいモノクローナル抗体は、脂質Ａに対してか、または多分別法として脂質へのより小さい断片に対して特異的であろう。

広範囲な細菌性エンドトキシンの検出を確実にするため、好ましくは核のへブトース／ＫＤＯ領域に向けられた３−４種のモノクローナル抗体のパネルが選択されるであろう。この領域は、脂質Ａに隣接しており、数種の特殊な２−ケト糖類、特に３−デオキシ−Ｄ−マンノーオクツロソン酸（ＫＤＯ）を含む。選択される抗体類は、ＭＡｂｓ　４−７８５　（７）　、　８Ａ１　（９）　、　７Ｇ　（１６）、Ａ６　（Ｈ４Ｃ５）（１５）、８−２ＣＩ　（７）またはＨＡ−ＩＡ（２１）を含み得る。ハイブリドーマ細胞系　ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５　（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９０８１）により産生される広く交差反応性のモノクローナル抗体は、他の抗体との組合せにおいて、あるいは必要な交差反応性の程度に依存してそれ自体で、捕捉剤として供することもできる（１１）。

細菌性ＬＯ３またはＬＰＳが検出されるべき試料は、通常は血漿、血清、脳を髄液、尿、唾液、尿道分泌物、痰等の体液であって、全ては通常は、無菌的であるか、または興味ある生物を含有しない液体である。しかしながら、該方法は一般的応用であって、また滅菌調製物、および臨床的または医薬的使用のための液体、または食製品における使用のための液体中のエンドトキシン汚染の検出のために使用され得る。

エンドトキシンについて試験されるべき試料は、通常は発熱物質非含有の希釈液、好ましくはリン酸緩衝食塩水により希釈されることが必要である。希釈は、試料の型および存在するエンドトキシンの量に依存するであろう。いずれの場合にも、固定化捕捉抗体を用いたインキュベーションに先立って、試験用試料は、ルミルス発色アッセイを後に妨害するであろう物質を不活性化するために、好ましくは７５℃にて約１２分間、加熱処理に付される。加熱は、結合部位の捕捉剤に対する露呈を促進する。

一旦、試料を分析のために調製した場合に、次いて、それは捕捉抗体または抗体類と共にインキュベートされる。マイクロタイタープレート・ウェルが使用される場合には、これは単に、測定された量の試料をウェルに加え、結合が起こるために充分な時間、通常は３７°Ｃにて約１時間インキュベートすることである。

他のインキュベーション時間は、検出されるエンドトキシンの種類に依存して要求されるように採用されてもよい。インキュベーションは、結合を生じさせるために、より長時間が必要であろうが、室温で実施されてもよい。

所望により、エンドトキシンの測定は、その放出かエンドトキシンの存在により促進されるプロテアーゼを検出可能な試薬の添加により実施される。アメーバ様細胞溶解物は、エンドトキシンの存在下、他のもののうちセリンプロテアーゼを放出するカスケードを開始する因子を含んでいる。溶解物の最も好ましい供給源は、リムルス・ポリフェムス（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血液であるが、他の生物、例えばタキブレウス・トリデンタツス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）を使用してもよい。エンドトキシンを含有する溶解物試料へのプロテアーゼ基質、通常は発色性化合物の添加は、基質の開裂を許容し、分光光度測定的に検出可能な発色物質を放出する。活性化されたプロテアーゼの量は、捕捉モノクローナル抗体に結合されたエンドトキシンの量に比例し、従って色生成の速度は、試料中に存在するエンドトキシンの量に比例するであろう。

好ましい実施態様において、発色性物質はＮ−ベンゾイル−ｖａｌ−ａｒｇ−ｐ −ニトロアニリドであり、Ｃ−末端発色性残基の放出が４１０ｎｍにて測定される。

他の発色原、例えばテトラメチルベンジジン、または別のｐ−ニトロアニリド基質を使用することができる。定量は、反応がエンドトキシンにより活性化されるプロテアーゼに比例する限り、螢光体、同位体性標識、または二次反応の開始等を含めて、他の標識および他の検出手段を用いて行なうこともできる。標準曲線は、精製エンドトキシンまたは好ましくは米国標準エンドトキシンを標準として使用して作成することかできる。

本発明の特定の例において、生物学的液体中のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂエンドトキシンの特・定の検出が例示される。捕捉モノクローナル抗体が、典型的にはプラスチックのマイクロタイターウェルである担体に結合され、次いで、これが好ましくは蛋白質、通常はウシ血清アルブミン、ウシ給仕性血清等によりブロックされる。試料中に存在する任意のＨｉｂ　ＬＯＳエンドトキシンが、捕捉抗体に結合され、また非露出表面には結合されないであろう。好ましい実施態様において、捕捉剤は、一方が第１のエンドトキシンのオリゴサツカライド領域のエピトープに向けられ、また他方が第２のエンドトキシンのオリゴサツカライド領域のエピトープに向けられた２種類のモノクローナル抗体を含んでなるＨｉｂエンドトキシンの検出において、好ましい実施態様は、Ｈｉｂ　ＬＯＳ　ＤＬ２６等の第１の株由来のエンドトキシンを認識する第１の抗体、およびＨｉｂＬＯ３ＤＬ４２等の第２の株由来のエンドＩ・キシンを認識する第２の抗体を採用する。好ましい例は、モノクローナル抗体、１２Ｄ９および４Ｃ４をそれぞれ含む（それぞれＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４６２およびＨＢ１０４６１）。両者は、１ｇＧ３タイプの免疫グロブリンである。単一の捕捉剤を使用することもできるか、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚタイプｂのすべての株を検出することはできないであろう。

試験試料を担体結合モノクローナル抗体と接触させた後、結合ＬＯ８は、存在する一未結合基質を除去するために、好ましくはトウィーン２０等の洗浄剤を含むｐｆ−ＰＢＳを用いて洗浄される。引続く工程において、表面結合ＬＯＳは、アメーバ様細胞溶解物、好ましくはリムルスアメーバ様細胞溶解物と共にインキュベートサレル。

インキュベーションは、通常３７℃にて行なわれ、結合エンドトキシンにより溶解物由来のプロテアーゼ系の活性化か許容される。最終工程において、発色性物質が添加され、室温にて好ましくは３０分間保持された後に、試料の光学密度か測定される。光学密度は、ＥＬＩＳＡ読取装置等の分光光度計にて読取られてよい。標準を試験試料と共にインキュベートしてもよく、それらから試料中のエンド１〜キシン濃度か決定される。

更に本発明は、Ｈａｅ＋ｎｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉを原因物質とする軟性下相の迅速、確実な診断を提供するために適用されてもよい。本発明の特定のリムルスアメーバ様細胞溶解物アッセイにおいて、Ｈ，ｄｕｅｒｅｙｉのＬＯＳに対して特異的なモノクロ−〜ナル抗体の使用を通して、５０ｃｆｕ程度のわずかなＨ，ｄｕｃｅｒｙｉかインビトロにて生育し、食塩水中への再懸濁されることが検出され得る。更に、軟性丁度のウサギモデルからの吸引材料において、５００ｃｆｕ程度の少量でも検出できた。

本発明の方法は、簡単かつ迅速である。試験は、試料調製後、一般に３時間以内に完了する。典型的には、試料が捕捉抗体と共に３７℃にて１時同インキュベートされ、洗浄され、アメーバ様細胞溶解物と共に室温にて約２０分間インキュベートされ、そして更に発色性物質の添加後に室温にてインキュベートされる。かくして、測定は、捕捉抗体により被覆されたマイクロタイターウェル中にてインキュベートして３時間以内に行なわれてもよい。

発明者らは、Ｈｉｂ　ＬＯ３検出について発明の特異性を例示したが、臨床的に重要な他の病原を適切な抗体を使用して容易に検出することかできることが認識されるてあろう。例えば、該方法は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ８９０９を存するハイブリドーマ細胞系（１１）により産生されるモノクローナル抗体ＸＭＭＰＳ− ６０５を使用することにより、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ　ｍａｌｔｏｐｈｌｌｉａの特異的検出に容易に適用される。他の特異的診断の開発は、必要とされる捕捉抗体または抗体類の入手可能のみによって制限され、方法の一般的適用可能性によっては制限されない。

本発明の方法の実施のために、１種以上のキットか有用であろうことが期待される。そのようなキットは、すべてまたは限定的に選択された細菌性エンドトキシンの検出のために好適なモノクローナル抗体を含む分離された容器を含むであろう。加えて、アメーバ様細胞溶解物および溶解物プロテアーゼの放出を検出するための発色性基質を容れた容器も、好ましくは全で凍結乾燥形態において提供される。細菌性エンドトキシン検圧用の特定のキットにおいては、ハイブリドーマ細胞系Ｘ　Ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｎ−０Ｅ５由来のモノクローナル抗体が、単独またはモノクローナル抗体４−７８５．８Ａｌ、Ａ６および８−２ＣＩの１種以上との組合せにて提供される。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｊｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂの検出のためには、ＭＡｂ、４Ｃ４およびＭＡｂ　１２Ｄ９が提供される。

図１は、他のグラム陰性菌のりボボリサッカライドと類似するＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのりボボリサッカライドの構造を示す。Ｒａ　ｓ　Ｒｋ　ｓ　Ｒｅ　、Ｒｍ　ＩおよびＲ１は、Ｓａｍｏｎｅｌｌａの別の変異株により合成されるＬＰＳ分子の構造を示す。

図２は、イムノリムルス・アッセイによるＰＢＳ中（・）、および血清−ＰＢＳ　（１：　３に希釈）中（ム）のＨｉｂ　ＤＬ４２　ＬＯＳ、ならびに血清−ＰＢＳ（ｌ：３に希釈）中のＨｉｂ　ＤＬ４２細菌（■）の検出を示す。白ぬきの記号は、非特異的な背景を示す。結果は、２つ一組のウェルの平均である。

図３は、イムノリムルス・アッセイにより検出された新生ラット血漿中のＨｉｂ　ＤＬ４２（・）およびＤＬ３０１　（ム）両車の水準ならびにＨｉｂ　ＬＯＳの濃度を示す（ｒ＝０．８４５、ｐ＜０．００１）。白ぬきの記号は、非感染動物を示し、Ｘ−軸の左側にのみ存在する。

図４は、ＣＬＡＬアッセイにより検出された血漿試料中のＨｉｂ　ＤＬ４２（・）およびＤＬ３０１（ム）両車の水準ならびにＨｉｂ　ＬＯＳの濃度を示す（ｒ＝０゜７８７、ｐ＜Ｑ、００１）。白ぬきの記号は、非感染動物を示し、Ｘ−軸の左側にのみ存在する。

先に議論したように、本発明はグラム陰性菌エンドトキシンを検出するために設計でき、または細菌エンドトキシンの特定の種を検出すべく修飾可能な高感度かつ迅速なアッセイである。特に、該方法は、極めて低水準のエンドトキシンを検出するために有用である。

発明者らは、抗体を、彼らの方法の選択性の基礎として使用し、そして高感度のアッセイを提供するために以前に知られていたアメーバ様細胞溶解物との既知の反応を組合わせた。抗体は、好ましくはＬＰＳ／ＬＯ３の工ンドトキシン核の指定される領域に向けられたモノクローナル抗体である。該方法がいかに実施されるかの例として、以下の詳細は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂエンドトキシン（Ｈｉｂ　ＬＯＳ）の検出を特に示すか、しかしながら類似する考察は、１種以上の異なる抗体を使用する他の種の検出に適用される。グラム陰性菌エンドトキシンを検出するための包括的方法は、例えばエンドトキシン脂質Ａ核の領域、または極めて近接する領域に向けられた数種までのモノクローナル抗体を必要とする。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉ口ｏｓａを検出するための方法は、モノクローナル抗体ＸＭＭＰＳ−６０５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ８９０９　（１１））を採用し得る。

Ｈｉｂ株ＤＬ４２は、広範囲で特徴付けられた（１７）。この研究で使用された別のＨｉｂ株（ＤＬ３０１）は、ダラスのＨｉｂ髄膜炎の小児から最近単離された。

これらの株の両者は、コロニープロット−放射性イムノアッセイ系統においてＭＡｂ　４Ｃ４との反応性により決定されるように、Ｒｉｂ　ＬＯ３抗原性群２群属している。カプセル化されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　（７７−４３６）およびＨｉｂ　ＬＯ３抗原性群１由来のＨｉｂ株ＤＬ２６　（１７）を、対照実験のために使用した。これらの株は、ＭＡｂ　４Ｃ４とは反応しない。

Ｈｉｂ株は、以前に記述されているように（１８）、Ｌｅｖｉｎｔｈａｌの塩基の補充した脳−心臓融合培地（Ｂ　ＨＩ　ｓ　）　（ＤｉｆＣｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ　、　Ｍｌ）中で育成した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌは、補充のなイｆＱ−心臓融合培地で育生した。

エンドトキシン類Ｈｉｂ株ＤＬ４２由来のＬＯＳは、修飾された熱フェノールー水沫（１９）により精製された。精製ＬＯ３は、発熱物質非含有食塩水（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　ＮｏｒｔｈＣｈｉｃａｇｏ　、　ｒＬ）中に希釈され、ｌμｇ／−の濃度ニテアッセイの標準として使用するまで一７０℃にて保存された。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏｌ　１１　：　Ｂ　４から精製されたＬＰＳ　（Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ、Ｌ　−３３０１２）は、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯから購入され、またＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｔｉ　０１２７　：　Ｂ　８由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ、Ｌ　−３１３７）　、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｉａｅ由来のもの（Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ、　Ｌ　−１７７０）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のもの（Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ、　Ｌ　−８６４３）も同様である。

モノクローナル抗体Ｈｉｂ　ＬＯ３抗原性群２群属するＨｉｂ株のＬＯ３分子のオリゴサツカライド部分のエピトープに対するＭＡｂ　４Ｃ４（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４６１）は、先に記述されている。このＭＡｂは、Ｈｉｂ株ＤＬ４２およびＤＬ３０１由来のＬＯＳと反応し、加えて、最近試験されたＨｉｂの臨床的単離物の８６％を認識することかてきた（１７）。

他の材料滅菌ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートは、Ｃａｒ旧口ｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｈｏｕｓｔｏｎ　、ＴＸから購入された。すべてのプレートは、使用前に発熱物質非含有であることを検査された。ＬＡＬの各バイアル（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ、Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　ｏｆ　Ｃａｐｅ　Ｃｏｄｅ　％Ｗｏｏｄｓ　ＨｏｌｅＳＭＡ、　ＣＬ　Ａ　Ｌにおける使用に適しているとして特定されている）は、１ＯｒＩＬｌのｐｆ−水を用いて再構成され、−２０°Ｃの複数個所に３ケ月未満保存された。ＩＭＬアッセイのために、ＬＡＬは２０−のｐｆ −水により希釈された。Ｎ−ベンゾイル−ｖａ　Ｉ　−ｇ　１　ｙ−ａ　ｒ　ｙ −ｐ−ニートロアニリドハイドロクロライド（Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ、　Ｂ−４７５８）は、ｐｆ−水中に０．７■／−の濃度まで希釈され、アッセイで使用するまで４℃にて保存された。

統計的解析ＣＬＡＬおよびＩＭＬアッセイの結果の間の相関の強度、ならびに動物の画一の程度を評価するために、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数を使用した。

以下の例は、本発明の特定の実施態様を例示することを意図するもので、すべての可能な実施態様の記述の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は、開示された方法および応用に対して本発明の範囲にある修飾をなし得ることを認識するであろう。

精製Ｈｉｂ　ＬＯＳおよび細菌を使用するＨｉｂＬＯ３のイムノリムルスアッセイマイクロタイタープレートを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，６に１：５００で希釈した精製ＭＡｂ　４Ｃ４を用いて、室温にて一夜で被覆した（２０）。ウェル中でインキュベートされた抗体の最終量は、８００ｎｇであった。

該マイクロタイターウェルを、０゜０５％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０を含むｐｆ−ＰＢＳ（ｐｆ　ＰＢＳ−Ｔｗ）を用いて３回洗浄し、次いで炭酸緩衝液中の１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ給仕血清を用いて３７℃にて１時間ブロックした（２０）。該プレートを、ｐｆ−ＰＢＳ−Ｔｗにより再度３回洗浄した。精製ＬＯ３試料の希釈用血漿を、５０匹の新生ラットから血管穿刺により血液を集め、遠心分離し、クエン酸ナトリウム法により誘導された血漿を貯留することによって得た。血漿の分別量を、−７０℃にて保存し、希釈剤として使用する前に発熱物質非含有リン酸緩衝食塩水（ｐｆ−ＰＢＳ、ｐＨ７，４）にてｌ：３に希釈した。

精製Ｈｉｂ　ＤＬ４２　ＬＯＳを、ｐｆ−ＰＢＳ中、および血漿：ＰＢＳ（１：３に希釈）中に希釈し、またＨｉｂ細菌を血漿：ＰＢＳ（１：３に希釈）中に希釈した。精製Ｈｉｂ　ＬＯＳ標準を、適切な希釈液中に０−１．０００ｐｇ／− の濃度で調製した。７５℃、１２分間の加熱不活性化の後に、５０μｌの試験試料および標準を、マイクロタイターウェル中で３７℃にて１時間インキュベートした。ウェルを、ｐｆ−ＰＢＳ−Ｔｗにより６回洗浄し、次いでｐｆ−水中のＬＡＬ抽出物５０μｌで満たした。室温にて２０分間インキュベートした後、５０ μ！の発色性基質を添加し、該プレートを室温にて３０分間インキュベートした。次いで光学密度を、ＥＬＩＳＡ読取り装置を使用して測定し、各プレートに含まれた標準から試験試料中のＬＯ３の濃度を得た。

感度の限界（背景の平均＋２ＳＤを越える光学密度読取を生じ６ＬＯ３（７）濃度）は、ｐｆ−ＰＢＳ中で２ｐｇ／−１また希釈血漿中で１０ｐｇ／ｍｌであった（図２）。

種々のＨｉｂ生物を含む希釈血漿中におけるＬＯＳ検出でのＩＭＬ法の感度は、それぞれ３００ＣＦＵ／−に対応した。

ＴＭＬアッセイの特異性は、ＭＡｂにより固相に結合されるＬＯ８分子のみを検出する能力に基いている。図２に示すように、非特異的背景（ＭＡｂなしのウェルにより得た）は、ＬＯ３（７）濃度が１．０００ｐｇ／ｒｄ未満の場合、または細菌の濃度かＩ　Ｏ’　ＣＦＵ／ｒＩＬ１未満の場合に、血漿試料の試験の間 −貫して低く保たれた。

ＬＯ３またはＨｉｂのいずれについても高濃度では背景が増大し、ＣＬＡＬ−型反応にてエンドトキシンの存在を示したが、ＩＭＬアッセイはその抗体依存的特異性を失った。特異的抗体結合は、これらの場合には試験試料を更に希釈することにより示された。

血漿中の精製Ｈｉｂ　ＬＯ３のイムノリムルス・アッセイ４種の異なるグラム陰性腸内菌由来の精製ＨｉｂＤＬ４２　ＬＯ３および精製ＬＰＳ試料を、濃度を変えて正常新生ラット血漿に加え、ＰＢＳに１：３に希釈し、次いで７５℃にて１２分間加熱した。該試料を、例１に詳細を示したイムノリムルス・アッセイにより試験した。

結果は表１に示され、ＩＭＬアッセイ系の特異性の高い程度を示している。ｔａｎｇ／−以下のＬＰＳ濃度においては、光学密度の結果は背景の水準であり、より高濃度では結果は非特異的反応のみを示した。

表１血漿中のＬＯ８／ＬＰＳの濃度 ”ＭＡｂ　４Ｃ４で被覆されたウェルから得た光学密度’ＭＡｂ　４Ｃ４を欠くウェル（非特異的結合の対照）から得た光学密度ゞウェルＡおよびＢの間の差１結果は一組のウェルの平均例３Ｈｉｂに感染したラット由来の血漿におけるＨｉｂＬＯ３のイムノリムルス・アッセイ５日令の新生ラットに、記述されているように（１９）、ｌ−３ＸｌＯ”ニア０＝−形成単位（ＣＦＵ）（７）Ｈｉｂを経鼻的に感染させた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　１を用いた対照実験のために、ラットに０，１−のＰＢＳ中の１００または１，０ＯＯＣＦＵを腹腔内的植菌により感染させた。血液培養物を、細菌の攻撃後の種々の時点（１５−４８時間）において尾部静脈から１０μｌの血液を取ることにより得た。両車症の程度を、血液試料をＢＨＩｓ＝寒天平板に展開することにより測定した。

尾部静脈からの血液採取の直後に、エーテルで麻酔した同じ動物について血管穿刺を行ない、３．８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のクエン酸ナトリウムを入れたシリンジに（０゜０５−のクエン酸ナトリウム１０．５−の血液）、血液を採取した。血液をエッペンドルフ遠心管中で５，０００ｒｐｍにて室温下、１０分間遠心分離し、血漿をポリプロピレンのネジ栓付チューブに移し、−７０℃で保存した。

培養で証明されたＨｉｂ　ＤＬ４２またはＤＬ３０１菌血症を有する４３匹のラット中、４２匹（９８％）はＩＭＬアッセイによって検出可能な濃度のＬＯ３を血漿中に有していた。更に、測定されたＬＯ８濃度と動物の両車症の程度との間には、音量な相関Ｃｒ＝０．８４５、ｐ＜Ｑ、００１）があった。非感染ラットは、いずれも血漿試料中に検出可能なＬＯ３を有しておらず、その一方、Ｈｉｂ　ＤＬ４２の攻撃を受けたラット由来の一つの血液培養で陰性の試料は、ＩＭＬで陽性であった。両者ともにＭＡｂ　４Ｃ４と反応性である２種類の異なるＨｉｂ株Ｄ　Ｊ、　４２およびＤＬ３０１を用いて得られたＩＭＬの結果間には、有意な差は無かった（図３）。

ＣＬＡＬアッセイは、Ｈｉｂ−感染ラットの２７匹（６３％）で陽性であり、検出可能な開直症を有していないすべてについて陰性であった（図４）。ＣＬＡＬアッセイで測定されたエンドトキシン濃度と開直症の程度との間に、有意な相関関係かあり（ｒ＝０．７８７、ｐく０．００１）、またＩＭＬとＣＬＡＬの結果との間の相関も有意なものであった（ｒ＝０．９３３、ｐく０゜Ｈｉｂ　ＬＯ３ＤＬ２６またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉｉ：：感染したラットの血漿のイムノリムルス・アッセイＨｉ　ｂ　Ｄ　Ｌ　２６により（１２匹の動物）、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｅｏｌｉ　Ｋ　ｌにより（１２匹の動物）感染したラットのすべては、検出可能な開直症を有し、またそれらの１９匹（９１％）は、ＣＬＡＬにより試験した場合に検出可能なエンドトキシン濃度を有していた（表２）。しかしながら、ＭＡｂ　４Ｃ４を使用したＩＭＬアッセイでは、すべて陰性であり；この特定のＭＡｂはこれらのいずれの株とも反応性ではない（表２）。血中に最も高い細菌濃度を有する９匹のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＫｌ−感染ラットのうち６匹は、ＩＭＬアッセイにおいて非特異的な陽性の結果を有し、先のインビトロ実験のＪＭＬアッセイにおける極めて高いＬＰＳｊ１度の効果を含む知見（表１）を連想させる。これらの血漿試料をＩＭＬにおいて１：１０および１：１００希釈で再試験した場合に、これらのすべての試料はＩＭＬアッセイで陰性の結果を生じ、従ってアッセイの特異的性質か確認された。結果を表２に表わす。

表２！Ｎｉｂ　ＤＬ　２６　Ｅｚｃｈｍｒｌｃｈｉａ　ｃａｌＩ　Ｋｌ！、　ｘ、５ｘｉｏ’　０．３１　＜０−０３　１．２ｘｌＯ’　１０．０　＜０．０３１２．９−２２１０’　＜０−０５　＜０．０３　ＮＯＮＤ　）ｉＤ“３匹のラットは採血前に死亡した。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ検出のためのイムノリムルス・アッセイイムノリムルス・アッセイを軟性下情の原因物質であるＨ、　ｄｕｃｒｅｙｉの検出に適用した。Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉの検出にイムノリムルス・アッセイを適用可能であることを例示す６　ｆ、−めに、基本的に例１に記載のアッセイにおいてＨ，ｄｕｃｒｅｙｉ　Ｌ　ＯＳに対して特異的なモノクローナル抗体を採用する研究を行なった。これらの研究で使用するＨ、　ｄｕｃｒｅｙｉ　Ｌ　ＯＳに対するモノクローナル抗体を次のように調製した：Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉ株３５０００由来の細胞エンベロープを、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫に使用した。０．１−のフロイント完全アジュバントに懸濁した５０ −１００μｇの量の細胞エンベロープ蛋白質を、数匹のマウスに腹腔内的に注射した。約４週間後に、これらのマウスのうち２匹に５０μｇのこれらの細胞エンベロープを静脈内注射し、次いで肺臓をハイブリドーマ融合プロトコールにおいて使用するために取出した。Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉに対して反応性のＩｇＧモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系３Ｅ６を、細胞エンベロープに対する、次いでプロティナーゼに一処理細胞エンベローブに対するウェスタンプロット分析において、ハイブリドーマ培養上澄をスクリーニングすることによって同定した。このＭａｂ　（３Ｅ６）は、今日までに試験したすべてのＨ，ｄｕｃｒｅｙｉ株（少くとも２０株）と反応性であり、またＨ、　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ株、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ、または２種類のＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株とは反応しないことが、コロニープロット−放射イムノアッセイ分析において見出された。

Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉ　Ｌ　ＯＳ−特異的抗体３Ｅ６を組入れたイムノリムルス・アッセイを、最初に、インビトロで育生され、発熱物質非含１ｒＰＢＳに再懸濁されたＨ、　ｄｕｃｒｅｙｉの検出に適用した。この試料は、Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉ株３５０００をロウツク消しビン中でチョコレート寒天平板上で３３°Ｃにて一夜育生することにより調製した。生じたコロニーを寒天表面からかき落とし、発熱物質非含有ＰＢＳ中に１０Ｘ８ｃｆｕの濃度で懸濁させた。激しい回転混合の後、該細胞懸濁物を発熱物質非含有ＰＢＳ中に−あたり約１０Ｘ７ｃｆｕで希釈した。この懸濁を、次いで７５°Ｃにて１２分間加熱した。次いで、この加熱細胞懸濁物の一連の希釈物を、発熱物質非含有ＰＢＳを使用して調製し、これらの希釈物の５０ｕＩｌの部分を、モノクローナル抗体３Ｅ６を用いるイムノリムルス系において試験試料として使用した。この系のＨ，ｄｕｃｒｅｙｉ検出の限界は、５０ｃｆｕまたは１０Ｘ３ｃｆｕ／−であった。

Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉにより生じた病変から得た第２の試料も前述のイムノリムルスアッセイを用いて試験した。この研究において、Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉを、ここに参考として組入れる１９９１年４月２３日出願の米国出願番号第６９０．１５２号に記述されているように、温度依存性ウサギモデルにてインビボで育生させた。略述すれば、そられたウサギの背部に壊死病変を次のように発達させた：雄のニューシーラント白色（ＮＺＷ）ウサギ（２，７−３，２キログラム）は、商業的供給元から入手し、１５−１７℃に温度ｐｓｍした室内で飼育した。細菌接種に先立って、各ウサギの背部上を、動物用手入れバサミモデルＡ−５（Ｏｓｔｅｒ　Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ　、ＷＩ）　を用いてそり落した。その後、ウサギの背部を毎日そった。

動物ヘノ接種に使用するＨ、　ｄｕｃｒｅｙｉ株３５０００を、ロウツク消しつぼ内で３３°Ｃにて１４−１６時間培養した。細菌を、滅菌した綿棒を用いて滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７，２に採取し、遠心分離と再懸濁を反復してＰＢＳにより２回洗浄し、Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉの種々のｃｆｕ数を含む細胞懸濁物を、発熱物質非含有食塩水中に調製した。該Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉ細胞懸濁物を、０．１−の注射体積を用いてウサギそった背に対となる部位に皮肉的に注射した。

ウサギを、それらの皮膚温度を低下させるために１５−１７°Ｃに温度制御された室内で飼育した。１５−１７°Ｃで飼育された動物は、２３−２５℃で飼育された動物よりも平均表面皮膚温度が２℃低い。約２−４日後、病変が発達することが見出された。皮肉注射の２−５日後、生じた病変から材料を吸引し、各試料中の生存するＨ、　ｄｕｃｒｅｙｉ生物体の含有量を測定した。細菌を、病変部位に２５ゲージの針を用いて、０．ｌｄの滅菌、発熱物質非含有ＰＢＳを注射し、次いで注入物質をシリンジに吸引することによって皮膚病変から回収した。各病変から吸引した材料を、発熱物質非含有ＰＢＳを用いて最終体積を１−とした。次いで５０ｕｉ？の分別量を、該吸引材料中の生存Ｈ−ｄｕｅｒｅｙｉの含有量を測定するために塗菌した。この材料の発熱物質非含有ＰＢＳ中のｌ：５希釈物を調製し、７５℃にて１２分間加熱した。次いで、この懸濁物およびその更なる希釈物の両試料の５０ｕｌを、イムノリムルス・アッセイにおいて使用した。

このアッセイにおいて陽性の反応が、１−あたり２００ｃｆｕ程度のわずかな生存Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉを含む試料で得られた。

前述の研究は、軟性丁度についての迅速な診断試験としてのイムノリムルス・アッセイの適用可能性を例示しこの例は、出願人か、グラム陰性菌リポポリサッカライドの検出の成功的実施に有用であると予想した手法の概略である。

グラム陰性菌血症、敗血症、内置血症の検出および液体中のグラム陰性菌エンドトキシンの存在の検出この方法において、グラム陰性菌の基本的にすべてのＬＰＳまたはＬＯＳ分子と広く交差反応性であるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体類か、捕捉剤として使用されるであろう。従うべき一般的プロトコールは、先の例に記述されたものである。この特定の例について好適な抗体は、限定されるものではないが、ＸＭＭＥＮ−ＯＰ５、ＸＭＭＥＮ−ＬＹＩ、ＸＭＭＥＮ−ＬＹＺ、およびＸＭＭＥＮ−Ｊ５Ｄを含む抗体の混合物であろう（１１）。

これらの抗体は、マイクロタイターウェルを被覆するために使用され、次いで試験液体は７５°Ｃにおいて１２分間の加熱に付され、次いでマイクロタイターウェルとの反応に付されるであろう。該ウェルの充分な洗浄の後に、リムルス溶解物検出系、次いで発色性基質をウェルに加える。

予想例７この例は、発明者によってＰｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ　ａｅｒｏｇｉｎｏｓａの検出に有用であると予想した手法の概略である。

Ｐｓｅｕ＋ｆｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａの検出Ｐｓｅｕｄａｍａｎａ’ｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａのいずれかのＬＰＳの存在を検出するために設計された系のためには、モノクローナル抗体ＸＭＭＰＳ−６０５（１１）が、適切な捕捉剤であろう。

この抗体（ＸＭＭＰＳ−６−５）は、単独で、あるいは次のモノクローナル抗体：　ＸＭＭＰＳ−ＯＰ　１、ＸＭＭＰＳ−ＯＰ２、ＸＭＭＰＳ−ＯＰ３、ＸＭＭＰＳ−ＯＰ４およびＸＭＭＰＳ−ＯＰ７との組合せにおいて使用され得る。これらの付加的な５種のモノクローナル抗体は、７種のＦｉｓｈｅｒ型のＰｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのうちの５種と反応する（１１）。この特定の方法において、モノクローナル抗体または抗体類は、マイクロタイタープレートのウェルを被覆するために使用されるであろう。

次いで、上記の例に記述されたものと同様に、これらのウェルは洗浄され、リムルス溶解物検出系、次いで発色性基質が添加され、そして発色が測定され、存在するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｌ　Ｐ　Ｓの量と関連付けられるであろう。

本発明が、発明の実施のために好適な態様を含むべ〈発明者らにより見出され、提案された特定の実施態様によって記述された。本願の開示に照らしてみれば、例示された特定の実施態様において多くの変更および修飾を、本発明の意図する範囲から離脱することなく行ない得ることは、当業者に認識されるであろう。例えば、Ｈｉｂまたは他のＬＯ３の特異的検出のために、他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体が使用し得る。エンドトキシンに対して選択的な抗体の断片または機能的同等物を、与えられた例について交換してもよい。このようなすべての修飾は、添付される請求の範囲の範囲内に包含されることを意図するものである。

文献本願の本文中に表わされた引用文献は、それらが、ここで採用された方法論、技術および／または組成物を補足し、説明し、背景を与え、または教示する範囲において、ここに参考として取入れる。

Ｌ　Ｂａｙｓｔｏｎ、Ｋ−Ｆ、、Ｃｏｈｅｎ、Ｊ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ−３１，７３−８３（！９９０）。

ｌ　Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　Ｗ＠ｅｋｌｙ　Ｒ＠ｐｏｒｔ　９０．３ｘ−３４（１９９０）。

４、　Ｊａｃｏｂｓ、　Ｒ，Ｆ、、　Ｓｏｗ＠ｌｌ、　ＰＬＸ−、Ｎｏｍ５．　Ｍ−Ｍ−、Ｆｉｎｅｒ、　Ｄ、ＨｌＰｅｄｉａｔｒ、工ｎｆａｃｔ＋Ｄｉｓ、　Ｊ−９，１９６−２００（１９９０）−３、ｌ１ｌｎａｒ、Ｊ、Ｊ−Ｐ＊ｄｉａｔｒ−Ｃｌ１ｎ−Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ−３０，：１６５−３７１（１９８３）　＋５−　Ｃｙｂｕｌｓｋｙ、　Ｍ、Ｉ−、Ｃｈａｎ、　Ｍ、に、Ｗ、、　ａｎｄ　Ｍｏｖａｔ、　Ｈ，Ｚ＋し山＋　Ｘｎｖｅｓｔ−１１５，３６５−３７８（１９８Ｂ）。

６、Ｌａｖｉｎ、　Ｊ−ａｎｄ　Ｂａｎｇ、　Ｆ−Ｂ、　Ｂｕｌｌ、　ＪｏｈｎｓＨｏｐｋｉｎｓ　Ｈｏ５ｐ。

１１５、　２６５−２７４　（１９６４）。

７、ｄｅＪｏｎｇｈ−Ｌｅｕｖｓｎｉｎ）ｃ、　Ｊ−、５ｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｖａｒｈｏａｆ。

Ｊ、工ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｒｉｄｌｍａｕｎｉｔｙ　５８．４２１−４２６　（１９９０）。

Ｂ−Ｙｏｕｎｇ　装置１．．　Ｃ１１ｎ−Ｒａｓ、　３２．５２２Ａ　（１９８４）−９、Ｄｕｎｎ、　Ｄ、Ｌ、、　Ｂｏｇａｒｄ、　Ｗ−Ｃ，ａｎｄ　Ｃｅｒｒａ、　Ｆ、Ｂ、　ｓｕｒｇｅｒｙ　９８゜２８３−９０　（１９８５）。

１０、　８ａｌｌｅｓ、　Ｍ＋−Ｆ、、　Ｍａｎｄｉｎｅ、　！＋、　Ｚａｌｉｓｚ、　Ｒ，、Ｇｕｅｎｏｕｎｏｕ。

Ｍ、　ａｎｄ　５ｎａｔｓ、Ｐ、　Ｊ、工ｎｆａｃｔ、　Ｄｌｇ、　１５９．６４１−６４７（１９８９）。

ＩＬ　ＹＯｕＭｄｊＬし、米国特許第　４，９１８，１６３号、１９９０年４月１７日、　。

１コ。　ｈｉｃｈ、Ｔ、、５ｃｈｅｌｌｅｊｃｅｎｓ、Ｊ。、　ａｏｕｔｅｒ、Ａ−、ＶＭＫｒａｎｅｎ、　Ｊ、、　Ｉｌｒｏｕｗｅｒ、　！−，ａｎｄ　Ｖｅｒｈｏｅｆ　Ｊ−Ｉｍｍｕｎｏｌ＋Ｌ４３．　４０５３−４０６０　（１９８９１゜１４、Ｐｏ１Ｉａｃｋ、　Ｍ−、Ｃｈｉａ、　Ｊ、に、５−、　Ｋｏｌｅｓ、　Ｎ、Ｌ−、Ｍｉｌｌｅｒ。

Ｍ−、ａｎｄ　Ｇｕｅｌｄｅ、　Ｇ−Ｊ−工ｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１５９．１６８−１８８（１９Ｂ９）。

３６エ４−３６１９　（１９８６）。

５１３−５２０　（１９８７）。

Ｉ＋ｍｕｎ−５５，１９７９−４９８６（１９８））。

２フ００−２７０６　（１９９０）＋ドー　Ｏ鴫　−←−−Ｒコー　ドー＋１０２１０３１０’　１０５１０６Ｈｉｂ（ＣＰＵ／ｍ１）ＬＯ８（ｐｇ／ｍｌ血蒙）ＬＯ５（ρｇ／ｍｌ血漿ン要　約　書本発明は、アメーバ様細胞溶解物発色性検出法と組合わされた抗体捕捉を使用するグラム陰性菌エンドトキシンの検出方法に関する。該方法は、高感度かつ迅速であり、特定のエンドトキシンの検出に使用されてもよい。

特定の応用において、ピコグラム水準のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆ　１ｕｅｎｚａｅタイプｂのエンドトキシンが、先に感染した哺乳動物から取られた血漿中にて検出される。他の特定の応用において、該方法は疾患原因生物由来のエンドトキシンの検出を介して、疾患の検出および診断に応用される。特定の例は、Ｈ，ｄｕｃｒｅｙｉ由来のエンドトキシンの検出を介した軟性下燈の診断である。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法制８４条の８）平成５年１月１２８

Claims

【特許請求の範囲】

１．試料中の細菌性エンドトキシンの検出に際し：（ａ）細菌性エンドトキシンを含有すると予想される試料を、かかる細菌性エンドトキシンを結合可能な少なくとも１種の抗体と接触させ、該試料は、該抗体が試料中に存在するであろうエンドトキシンに結合するために有効な条件下で接触させられるものであり；（ｂ）抗体−結合エンドトキシンを洗浄して來雑物を除去し；および（ｃ）エンドトキシンをアメーバ様細胞溶解物により検出する、工程を含んでなる検出方法。
２．該エンドトキシンが：（ａ）洗浄された抗体−結合エンドトキシンをアメーバ様細胞溶解物とともにインキュベートして、該溶解物のプロテアーゼ系を活性化させ；（ｂ）該溶解物に、該溶解物のプロテアーゼ系の基質を添加し；および（ｃ）前記プロテアーゼ系の添加基質に対する作用により形成された生成物の量を測定し、該生成物は、該試料中の細菌性エンドトキシンの水準に比例的である、ことにより検出される請求の範囲第１項に記載の方法。
３．該抗体が、担体に結合される請求の範囲第１項に記載の方法。
４．該抗体が、細菌性エンドトキシンの核糖脂質に対して結合親和性を有する請求の範囲第１項に記載方法。
５．該抗体が、細菌性エンドトキシン脂質Ａに近接する領域に対して結合親和性を有する請求の範囲第１項に記載の方法。
６．該抗体が、脂質Ａを含むエピトープに対して結合親和性を有する請求の範囲第１項に記載の方法。
７．該抗体が、ヘプトースおよびケト−デオキシオクタネートを含むエピトープに対して結合親和性を有する請求の範囲第１項に記載の方法。
８．該抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９０８１を有するハイプリドーマ細胞系ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５、またはＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９０８２を有するハイプリドーマ細胞系ＸＭＭＥＮ−ＬＹ１から得られるＭＡｂである請求の範囲第１項に記載の方法。
９．該抗体が、その結合性断片を含んでなる請求の範囲第１項に記載の方法。
１０．細菌性エンドトキシンが、グラム陰性菌のリポオリゴサッカライドまたはりポポリサッカライドである請求の範囲第１項に記載の方法。
１１．細菌性エンドトキシンが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅ１１ａ、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ａｃｉｎｃｔｏｂａｃｔｅｒ　またはＮｅｉｓｓｅｉａ　属のグラム陰性菌のものである請求の範囲第１項に記載の方法。
１２．該抗体が、Ｏ−抗原に対して結合親和性を有する請求の範囲第１項に記載の方法。
１３．該抗体が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉのＯ−抗原に対するものである請求の範囲第１２項に記載の方法。
１４．アメーバ様細胞溶解物が、Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ、Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｇｉｇａｓ、ＣａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａまたはＬｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓの血液から得られる請求の範囲第１項に記載の方法。
１５．反応物に添加される基質が、発色性基質を含んでなる請求の範囲第２項に記載の方法。
１６．試料が、血漿、血清、脳脊髄液または尿を含んでなる請求の範囲第１項に記載の方法。
１７．試料が、抗体との接触に先だって加熱される請求の範囲第１項に記載の方法。
１８．試料が、約７５℃で加熱される請求の範囲第１項に記載の方法。
１９．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂリポオリゴサッカライド（Ｈｉｂ　ＬＯＳ）を含むと予想される試料のＬＯＳを検出するに際し：（ａ）試料をＨｉｂ　ＬＯＳに対する少なくとも２種の抗体と接触させて該抗体とＨｉｂ　ＬＯＳとの間の免疫複合体の形成を促進し；（ｂ）該免疫複合体を洗浄し；（ｃ）洗浄されたＨｉｂ　ＬＯＳを、リムルスアメーバ様細胞溶解物と共にインキュベートして該リムルスアメーバ様細胞溶解物のプロテアーゼ系活性化を促進し；および（ｄ）プロテアーゼ系の基質に対する作用により形成された生成物を検出することによりＬＯＳの存在を検出する、工程を含んでなる検出方法。
２０．該抗体が、脂質Ａ−遠方外側核オリゴサッカライドに対するものである請求の範囲第１９項に記載の方法。
２１．該抗体が、Ｈｉｂ　ＬＯＳ　ＤＬ２６またはＨｉｂ　ＬＯＳ　ＤＬ４２のオリゴサッカライド領域におけるエピトープに対するＩｇＧ３モノクローナル抗体である請求の範囲第１９項に記載の方法。
２２．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ　ＬＯＳを含むと予想される試料のＬＯＳを検出するに際し：（ａ）試料を、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ　ＬＯＳに対する少なくとも１種の抗体と接触させて該抗体と試料中に存在するであろうＬＯＳとの間の免疫複合体の形成を促進し；（ｂ）該免疫複合体を洗浄し；（ｃ）洗浄されたＨ．ｄｕｃｒｅｙｉ　ＬＯＳを、リムルスアメーバ様細胞溶解物と共にインキュベートして該リムルス溶解物のプロテアーゼ系の活性化を促進し；および（ｄ）プロテアーゼ系の基質に対する作用により形成された生成物を検出することによりＬＯＳの存在を検出する、工程を含んでなる検出方法。
２３．（ａ）少なくとも２個の容器を閉じこめて受容する区画された担体；（ｂ）区画の一つに配置される第１の容器であって、該第１の容器は、細菌性エンドトキシンに対して結合親和性を有する少なくとも１種の抗体を含む容器；および（ｃ）他の区画に配置される第２の容器であって、アメーバ様細胞溶解物または細菌性エンドトキシンによるプロテアーゼ系の放出を検出するための発色性基質を含む容器、を含んでなる試料中の細菌性エンドトキシンの検出に有用なキット。
２４．アメーバ様細胞溶解物を含む容器および発色性基質を含む容器の両者を包含することにより更に定義される請求の範囲第２３項に記載のキット。
２５．該抗体が、モノクローナル抗体を含む請求の範囲第２３項に記載のキット。
２６．該抗体が、脂質Ａまたはグラム陰性菌の内部核領域内の脂質Ａに近接オリゴサッカライドのエピトープを認識する抗体を含む請求の範囲第２３項に記載のキット。
２７．前記抗体が、個体担体に固定化されている請求の範囲第２３項に記載のキット。
２８．該抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９０８１を有するハイブリドーマ細胞系ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５、またはＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９０８２を有するハイプリドーマ細胞系ＸＭＭＥＮ−ＬＹＩから得られるモノクローナル抗体である請求の範囲第２３項に記載のキット。
２９．アメーバ様細胞溶解物が、Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ、Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｇｉｇａｓ、ＣａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａまたはＬｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓの血液から得られる請求の範囲第２３項に記載のキット。
３０．（ａ）少なくとも２個の容器を閉じこめて受容する区画された担体；（ｂ）区画の一つに配置される第１の容器であって、該第１の容器は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂエンドトキシンのエピトープに対して特異的に結合する２種の抗体を含む容器；および（ｃ）他の区画に配置される第２の容器であって、アメーバ様細胞溶解物またはかかる溶解物からのプロテアーゼ系の放出を検出するための発色性基質を含む容器、を含んでなる試料中のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂの検出に有用なキット。
３１．アメーバ様細胞溶解物を含む容器および発色性基質を含む容器の両者を包含することにより更に定義される請求の範囲第３０項に記載のキット。
３２．該抗体が、Ｈｉｂ　ＬＯＳ　ＤＬ４２またはＨｉｂ　ＬＯＳ　ＤＬ２６のオリゴサッカライド領域におけるエピトープに対するＩｇＧ３モノクローナル抗体である請求の範囲第３０項に記載の方法。
３３．第１の容器が、ＭＡｂ　４Ｃ４およびＤＬ４２を含む請求の範囲第３０項に記載のキット。
３４．１種以上の成分が凍結乾燥形態で供給される請求の範囲第３０項に記載のキット。
３５．（ａ）少なくとも２個の容器を閉じこめて受容する区画された担体；（ｂ）区画の一つに配置される第１の容器であって、該第１の容器は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｄｕｃｒｅｙｉ　のエピトープに対して特異的に結合する少なくとも１種の抗体を含む容器；および（ｃ）他の区画に配置される第２の容器であって、アメーバ様細胞溶解物またはかかる溶解物からのプロテアーゼ系の放出を検出するための発色性基質を含む容器、を含んでなる試料中のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ　の検出に有用なキット。
３６．アメーバ様細胞溶解物を含む容器および発色性基質を含む容器の両者を包含することにより更に定義される請求の範囲第３５項に記載のキット。
３７．１種以上の成分が凍結乾燥形態で供給される請求の範囲第３５項に記載のキット。