ES2650170T3 - Agente para la medición de endotoxinas - Google Patents

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ES2650170T3 ES12710808.2T ES12710808T ES2650170T3 ES 2650170 T3 ES2650170 T3 ES 2650170T3 ES 12710808 T ES12710808 T ES 12710808T ES 2650170 T3 ES2650170 T3 ES 2650170T3
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Hikaru Mizumura
Maki Aizawa
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Abstract

Procedimiento para producir un agente de medición de endotoxinas que comprende las siguientes proteínas (1) a (3) de Tachypleus tridentatus, cada una de ellas es una proteína recombinante que no tienen una secuencia de marcador His en el extremo C-terminal o cualquier otro péptido en cualquier extremo terminal y se obtiene a partir de células de insectos como un huésped: (1) factor C que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 2; (2) factor B que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 4; y (3) enzima procoagulante que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 6, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas (A) a (E): (A) una etapa de incorporar cada uno de los siguientes ADN (1) a (3) de Tachypleus tridentatus en un ADN viral; (1) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 2; (2) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 4; y (3) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 6; (B) una etapa de infectar células de insectos con el virus en el que se ha incorporado cada uno de dichos ADN; (C) una etapa de permitir que las células de insecto infectadas con cada uno de dichos virus expresen la proteína codificada por cada uno de dichos ADN; (D) una etapa de recuperar el factor C, el factor B y el enzima procoagulante como una solución y eliminar el virus mediante una membrana de filtración de fibras huecas con un tamaño de poro de 500 kDa; y (E) una etapa de formular el agente de medición de endotoxinas.

Description

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DESCRIPCION
Agente para la medición de endotoxinas Sector de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de un agente de medición de endotoxinas. Antecedentes de la invención
La endotoxina es un lipopolisacárido existente en la membrana externa de la pared celular de bacterias gram- negativas y conocido por ser un pirógeno fuerte. Además, se sabe que incluso una pequeña cantidad de endotoxina provoca diferentes estados de enfermedad debido a una infección bacteriana, tal como la liberación de citocinas inflamatorias debido a la activación de los macrófagos y la inducción del choque de endotoxinas, además de fiebre. Por lo tanto, es importante la detección de endotoxinas en productos farmacéuticos, tales como los inyectables; agua; equipos médicos y demás. Además, la endotoxina está considerada como la principal causa de shock en infección de bacterias gram-negativas y, por lo tanto, se puede juzgar la presencia o ausencia de infección o un efecto farmacéutico mediante la medición de endotoxinas en la sangre.
Además, se sabe que infección de cangrejo de herradura americano (Limulus polyphemus) con bacterias gram- negativas produce la coagulación intravascular, y este fenómeno se ha utilizado para la detección de endotoxinas.
Es decir, es conocido un procedimiento para la medición de endotoxinas que utiliza un extracto de células sanguíneas de un cangrejo de herradura (lisado de amebocitos del cangrejo de herradura; a continuación, denominado también "lisado") (por ejemplo, documento no de patente 1). Este procedimiento se denomina "prueba de limulus" y utiliza una reacción en cascada de diferentes proteínas existentes en el lisado, reacción que está provocada por el contacto de la endotoxina con el lisado. En la figura 1 se muestra un diagrama esquemático de la reacción en cascada.
Al entrar en contacto la endotoxina con el lisado, el factor C existente en el lisado se activa para producir factor C de tipo activo. Este factor C de tipo activo activa el factor B existente en el lisado, para producir el factor B de tipo activo. Este factor B de tipo activo activa posteriormente un enzima procoagulante existente en el lisado, para producir una coagulación enzimática.
Este enzima coagulante hidroliza una parte específica de la molécula de coagulógeno existente en el lisado. Por esto, se produce gel de coagulina, para provocar la coagulación del lisado. De este modo, midiendo la reacción de coagulación del lisado, se puede medir la endotoxina.
Además, permitiendo además que una enzima coagulante reaccione con un sustrato sintético para provocar una reacción de color, la endotoxina se puede medir. Por ejemplo, un enzima coagulante reacciona con un sustrato sintético t-butoxicarbonil-leucil-glicil-arginil-pNA (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA) para hidrolizar su enlace amida, y de este modo, liberar pNA. De este modo, incluyendo de manera preliminar el sustrato sintético en el sistema de reacción, la endotoxina puede ser cuantificada mediante la medida de la absorbancia (405 nm) de la sustancia colorante (pNA).
Además, se sabe que el sistema de reacción en cascada se puede reconstruir utilizando el factor C, el factor B y un enzima procoagulante, que se purificaron a partir de lisado de un cangrejo de herradura japonés (documento no de patente 2).
Además, se conoce un caso en el que un factor C recombinante derivado de un cangrejo de herradura del sudeste asiático Carcinoscorpius rotundicauda; y un factor B recombinante y un enzima procoagulante recombinante derivados de un cangrejo de herradura japonés Tachypleus tridentatus se utilizaron para reconstruir el sistema de reacción en cascada (documento de patente 1).
Además, es conocido un sistema para detectar endotoxinas mediante la utilización de un factor C recombinante derivado de un cangrejo de herradura del sudeste asiático Carcinoscorpius rotundicauda y un sustrato que reacciona con el factor C de tipo activo para liberar una sustancia fluorescente (documento de patente 2). Este sistema está disponible comercialmente como un sistema de detección de endotoxinas (nombre comercial: PyroGene (marca registrada); Lonza).
Sin embargo, para poder utilizar el lisado o el factor C, factor B o el enzima procoagulante de origen natural, preparados a partir de los mismos, es necesario capturar cangrejos de herradura y recoger la sangre de los mismos. Por lo tanto, en vista de la conservación de recursos biológicos o similares, es difícil suministrar estos componentes ilimitadamente. Por lo tanto, se ha demandado una técnica para producir fácil y rápidamente un reactivo para la detección de endotoxinas a un bajo coste.
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Además, en los casos en los que se utiliza un factor C recombinante, un factor B recombinante y un enzima procoagulante recombinante, en cualquiera de los casos descritos anteriormente se requiere 1 hora o más para la medición, y no se ha conseguido una sensibilidad de detección en el orden de 0,001 UE/ml. Por lo tanto, se ha demandado una técnica para medir endotoxinas de manera altamente sensible y rápidamente.
DOCUMENTOS DE LOS ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
Documentos de patente
[Documento de patente 1] WO 2008/004674 [Documento de patente 2] US 6.849.426 B
Documentos no de patente.
[Documento no de patente 1] Iwanaga S., Curr Opin Immunol. Feb de 1993; 5(1): 74-82.
[Documento no de patente 2] Nakamura T. y otros, Biochem J. Mar de 1986; 99(3): 847-57.
Características de la invención
La presente invención tiene como objetivo dar a conocer un procedimiento para producir un agente de medición de endotoxinas que pueda medir endotoxinas de manera rápida y altamente sensible.
Los inventores de la presente invención han descubierto que la endotoxina se puede medir de manera rápida y altamente sensible utilizando un factor C recombinante (sin marcador His), un factor B recombinante y un enzima procoagulante recombinante, que se derivan de cangrejo de herradura japonés Tachypleus tridentatus y se expresan utilizando células de insectos como un huésped, completando de este modo la presente invención.
Es decir, la presente invención es tal como sigue.
[1] Un procedimiento para producir un agente de medición de endotoxinas, que comprende las siguientes proteínas (1) a (3) de Tachypleus tridentatus, cada una de ellas es una proteína recombinante que no tiene una secuencia de marcador His en el extremo C-terminal o cualquier otro péptido en cualquier extremo terminal, y se obtienen a partir de células de insectos como un huésped:
(1) factor C que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 2;
(2) factor B que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 4; y
(3) enzima procoagulante que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 6,
comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas (A) a (E):
(A) una etapa de incorporar cada uno de los siguientes ADN (1) a (3) de Tachypleus tridentatus en un ADN viral;
(1) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 2;
(2) ADN codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 4; y
(3) ADN codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 6;
(B) una etapa de infectar células de insectos con los virus en los que se ha incorporado cada uno de dichos ADN;
(C) una etapa de permitir que las células de insecto infectadas con cada uno de dichos virus expresen la proteína codificada por cada uno de dichos ADN;
(D) una etapa de recuperar el factor C, el factor B y el enzima procoagulante como una solución y eliminar
los virus mediante una membrana de filtración de fibras huecas con un tamaño de poro de 500 kDa; y
(E) una etapa de formular el agente de medición de endotoxinas.
[2] Un procedimiento para producir a un agente de medición de endotoxinas que comprende las siguientes proteínas (1) a (3) de Tachypleus tridentatus, cada una de ellas es una proteína recombinante que no tiene una secuencia de marcador His en el extremo C-terminal o cualquier otro péptido en cualquier extremo terminal, y se obtienen a partir de células de insectos como un huésped:
(1) factor C que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 2;
(2) factor B que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 4; y
(3) enzima procoagulante que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 6,
comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas (A) a (E):
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(A) una etapa de incorporar cada uno de los siguientes ADN (1) a (3) de Tachypleus tridentatus en un vector;

(1) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 2;

(2) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 4; y

(3) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 6;
(B) una etapa de introducir el vector, en el que se ha incorporado cada uno de dichos ADN, en células de insectos para incorporar cada uno de dichos ADN en el cromosoma de las células de insecto;
(C) una etapa de permitir que las células de insecto, en el que se ha incorporado cada uno de dichos ADN, expresen la proteína codificada por cada uno de dichos ADN;
(D) una etapa de recuperar el factor C, el factor B y el enzima procoagulante como una solución; y
(E) una etapa de formular el agente de medición de endotoxinas.
Mediante la presente invención, se puede medir endotoxinas de manera rápida y altamente sensible. Por ejemplo, en una realización de la presente invención, se consigue una sensibilidad de detección en el orden de 0,0005 UE/ml con sólo 30 minutos de medición. Además, en la presente invención, el factor C recombinante, el factor B recombinante y el enzima procoagulante recombinante expresados pueden utilizarse sin purificación y, por lo tanto, un agente de medición de endotoxinas que comprende estas proteínas recombinantes se puede producir de manera sencilla y rápida a un coste bajo.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
[Figura 1] La figura 1 es un diagrama que muestra el sistema de reacción en cascada en un ensayo de limulus. [Figura 2] La figura 2 es un diagrama que muestra la estructura del vector pIZ/V5-His y la posición de inserción de cada uno de los genes. La flecha en la parte superior indica la posición de inserción de los genes.
[Figura 3] La figura 3 es una fotografía que muestra los niveles de expresión de varios factores C.
[Figura 4] La figura 4 es un diagrama que muestra las actividades de varios factores C.
[Figura 5] La figura 5 es una fotografía que muestra la estabilidad del factor C expresado mediante el procedimiento viral.
[Figura 6] La figura 6 es una fotografía que muestra la estabilidad del factor C expresado mediante el procedimiento celular de expresión estable.
[Figura 7] La figura 7 es un diagrama que muestra el efecto del tratamiento por filtración de membrana de fibras huecas en las reactividades de los factores expresados mediante el procedimiento viral.
[Figura 8] La figura 8 es un diagrama que muestra la reactividad del agente de medición de endotoxinas que contiene los factores expresados mediante el procedimiento viral.
[Figura 9] La figura 9 es un diagrama que muestra la reactividad del agente de medición de endotoxinas que contiene los factores expresados mediante el procedimiento de línea celular de expresión estable. (a) La reactividad en la concentración de endotoxina de 0 a 0,1 UE/ml. (b) La reactividad en la concentración de endotoxina de 0 a 0,01 UE/ml.
[Figura 10] La figura 10 es una fotografía que muestra las purezas y concentraciones del factor C recombinante purificado y el factor C natural purificado.
[Figura 11] La figura 11 es una curva de calibración que muestra una relación entre intensidades de banda y la cantidad de BSA.
[Figura 12] La figura 12 es un diagrama que muestra las actividades del factor C recombinante purificado y el factor C natural purificado.
Descripción
En la presente memoria descriptiva, una serie de reacciones en las que la endotoxina activa el factor C para producir el factor C de tipo activo, el factor C de tipo activo activa el factor B para producir el factor B de tipo activo y el factor B de tipo activo activa un enzima procoagulante para producir una coagulación enzimática puede ser denominada "reacción en cascada".
(1) Agente de medición de endotoxinas
El agente de medición de endotoxinas se compone del factor C, el factor B y un enzima procoagulante. A continuación, el factor C, el factor B y el enzima procoagulante en el agente de medición de endotoxinas pueden ser denominados "factor C de la presente memoria descriptiva", "factor B de la presente memoria descriptiva" y "enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva", respectivamente. Además, el factor C, el factor B y el enzima procoagulante pueden ser denominados colectivamente "factores".
Todo el factor C de la presente memoria descriptiva, el factor B de la presente memoria descriptiva, y el enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva son proteínas recombinantes que se pueden obtener por su expresión utilizando células de insectos como un huésped.
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El factor C de la presente memoria descriptiva es un factor de C derivado de un cangrejo de herradura japonés Tachypleus tridentatus. El factor C de la presente memoria descriptiva se caracteriza por que no tiene un marcador His enlazado en el extremo C-terminal. Además, el factor C de la presente memoria descriptiva preferentemente no tiene un marcador V5 en el extremo C-terminal. De forma más preferente, además, el factor C de la presente memoria descriptiva no tiene ningún péptido unido en el extremo C-terminal. De forma especialmente preferente, además, el factor C de la presente memoria descriptiva no tiene ningún péptido enlazado en cualquier extremo terminal. Una secuencia de aminoácidos del factor C de Tachypleus tridentatus se muestra en la SEQ ID No.: 2. Una secuencia de nucleótido del gen que codifica el factor C de Tachypleus tridentatus se muestra en la SEQ ID No.: 1.
El factor C de la presente memoria descriptiva puede ser una variante de la proteína con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 2, siempre y cuando la variante tenga la actividad del factor C.
“La actividad del factor C" significa una actividad por la que el factor C se convierte en el factor C de tipo activo en presencia de endotoxinas, para activar el factor B. El hecho de que el factor C de la presente memoria descriptiva "tenga la actividad de factor C" puede ser confirmado, por ejemplo, utilizando el factor C de la presente memoria descriptiva en combinación con un factor B adecuado y un enzima procoagulante adecuado y detectando el avance de la reacción en cascada en la presencia de endotoxinas. Más concretamente, se puede utilizar la proteína de la SEQ ID No.: 4 como el factor B adecuado, y se puede utilizar la proteína de la SEQ ID No.: 6 como el enzima procoagulante adecuado. El avance de la reacción en cascada puede medirse utilizando el sustrato mencionado más adelante para la detección.
El factor C de la presente memoria descriptiva puede ser una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 2, pero que incluye sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o varios residuos de aminoácidos, siempre y cuando el factor C tenga la actividad del factor C. El significado del término "uno o varios" varía dependiendo de las posiciones de los residuos de aminoácido en la estructura tridimensional de la proteína y los tipos de residuos de aminoácido y, más particularmente, el término significa preferentemente de 1 a 20, más preferentemente de 1 a 10, aún más preferentemente de 1 a 5, de forma especialmente preferente, de 1 a 3. La sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o varios aminoácidos descrita anteriormente, es una mutación conservadora que mantiene la función normal de la proteína. Un ejemplo representativo de la mutación conservadora es una sustitución conservadora. La sustitución conservadora es, por ejemplo, una mutación en la que una sustitución tiene lugar mutuamente entre Phe, Trp y Tyr, si el sitio de sustitución es un aminoácido aromático; entre Leu, Ile y Val, si el sitio de sustitución es un aminoácido hidrofóbico; entre Gln y Asn, si el sitio de sustitución es un aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, si el sitio de sustitución es un aminoácido básico; entre Asp y Glu, si el sitio de sustitución es un aminoácido ácido y entre Ser y Thr, si en el sitio de sustitución hay un aminoácido con un grupo hidroxilo. Entre los ejemplos de sustituciones consideradas como sustituciones conservadoras se incluyen, específicamente, sustitución de Ser o Thr por Ala, sustitución de Gln, His o Lys por Arg, sustitución del Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn, sustitución de Asn, Glu o Gln por Asp, sustitución de Ser o Ala por Cys, sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln, sustitución de Gly, Asn, Gln, Lys o Asp por Glu, sustitución de Pro por Gly, sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His, sustitución de Leu, Met, Val, o Phe por Ile, sustitución de Ile, Met, Val o Phe por Leu, sustitución de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys, sustitución de Ile, Leu, Val o Phe por Met, sustitución de Trp, Tyr, Met, His o Leu por Phe, sustitución de Thr o Ala por Ser, sustitución de Ser o Ala por Thr, sustitución de Phe o Tyr por Trp, sustitución de His, Phe o Trp por Tyr y sustitución del Met, His o Leu por Val. Además, la sustitución, eliminación, inserción, adición, inversión o similares, descritas anteriormente, pueden incluir también una mutación natural debido a la diferencia en el individuo, cepa o especie entre los cangrejos de herradura a partir de los que se deriva el gen.
Además, el factor C de la presente memoria descriptiva puede ser una proteína que tenga una homología o identidad de no menos del 80%, preferentemente, no menos del 90%, más preferentemente, no menos del 95%, todavía más preferentemente, no menos del 97%, de forma especialmente preferente, no menos del 99%, para toda la longitud de la secuencia de aminoácidos del factor C, tal como el que se ha descrito anteriormente, por ejemplo, a toda la longitud de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 2 y tiene la actividad del factor C.
El gen que codifica el factor C de la presente memoria descriptiva no está particularmente limitado, siempre y cuando el gen codifique el factor C de la presente memoria descriptiva, tal como el que se ha descrito anteriormente. El gen que codifica el factor C de la presente memoria descriptiva puede ser una sonda preparada basada en una secuencia de genes conocidos, por ejemplo, un ADN que se hibrida con la secuencia complementaria de longitud completa de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID No.: 1, o con una parte de la misma, en condiciones estrictas y codifica una proteína con la actividad del factor C. En la presente memoria descriptiva, el término "condiciones estrictas" significa condiciones en las cuales se forma el denominado híbrido específico, pero no se forma un híbrido no específico. Entre los ejemplos de condiciones se incluyen condiciones en las que ADN altamente homólogos se hibridan entre sí, por ejemplo, se hibridan entre sí ADN homólogos en no menos del 80%, preferentemente homólogos en no menos del 90%, más preferentemente, homólogos en no menos del 95%, aún más preferentemente, homólogos en no menos del 97%, de forma especialmente preferente, homólogos en no menos del 99%, mientras que ADN menos homólogos que los anteriores no se hibridan entre sí; y las condiciones en las que el lavado se lleva a cabo una vez, más preferentemente 2 ó 3 veces, a una concentración salina y temperatura correspondientes a 60°C, 1xSSC y SDS al 0,1%; preferentemente 60°C, 0,1xSSC y SDS al 0,1%; más
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preferentemente 68°C, 0,1xSSC y SDS al 0,1%; que son las condiciones de lavado normal en la hibridación de Southern.
Además, las combinaciones de los codones en el gen que codifica el factor C de la presente memoria descriptiva se pueden modificar para que el gen esté optimizado para expresarse en células de insecto. La optimización puede realizarse utilizando, por ejemplo, un contrato de servicio disponible de manera general. El gen que codifica el factor C de la presente memoria descriptiva puede ser una variante de ADN cuyas combinaciones de codones estén optimizadas para su expresión en células de insectos.
La descripción anterior de las variantes del gen y la proteína pueden aplicarse de manera similar para el factor B y el enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva y a los genes que codifican a los mismos.
El factor B de la presente memoria descriptiva es un factor B que deriva de un cangrejo de herradura. Además, el enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva es un enzima procoagulante derivado de un cangrejo de herradura. Entre los ejemplos del cangrejo de herradura se incluyen cangrejo de herradura japonés Tachypleus tridentatus, cangrejo de herradura americano Limulus poliphemus, cangrejo de herradura del sudeste asiático Carcinoscorpius rotundicauda y cangrejo de herradura del sudeste asiático Tachypleus gigas. Los factores anteriores derivan, preferentemente, de entre los cangrejos de herradura, del cangrejo de herradura japonés Tachypleus tridentatus.
Las secuencias del aminoácido del factor B y del enzima procoagulante de Tachypleus tridentatus se muestran en las SEQ ID No.: 4 y 6, respectivamente. Secuencias de nucleótidos de los genes que codifican el factor B y el enzima procoagulante de Tachypleus tridentatus se muestran en las SEQ ID No.: 3 y 5, respectivamente.
El factor B de la presente memoria descriptiva puede ser una variante del factor B de cualquiera de los cangrejos de herradura descritos anteriormente, por ejemplo, una variante de la proteína con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 4, siempre y cuando el factor B de la presente invención tenga la actividad del factor B. Además, el gen que codifica el factor B de la presente memoria descriptiva no está particularmente limitado, siempre y cuando el gen codifique el factor B de la presente memoria descriptiva, tal como se ha descrito anteriormente. La descripción anterior en el factor C se aplica también mutatis mutandis a las variantes del gen y la proteína.
"La actividad del factor B" significa una actividad por la que factor B se convierte en el factor B de tipo activo en presencia del factor C de tipo activo, para cambiar un enzima procoagulante a su forma activa, un enzima coagulante. El hecho de que el factor B de la presente memoria descriptiva "tiene la actividad del factor B" puede confirmarse, por ejemplo, utilizando el factor B de la presente memoria descriptiva en combinación con un factor C adecuado y un enzima procoagulante adecuado, y detectar los avances de la reacción en cascada en presencia de endotoxinas. Más concretamente, la proteína de la SEQ ID No.: 2 se puede utilizar como el factor C adecuado, y la proteína de la SEQ ID No.: 6 se puede utilizar como el enzima procoagulante adecuado. El avance de la reacción en cascada puede medirse utilizando el sustrato mencionado más adelante para la detección.
El enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva puede ser una variante del enzima procoagulante de cualquiera de los cangrejos de herradura descritos anteriormente, por ejemplo, una variante de la proteína con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 6, siempre y cuando el enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva tenga la actividad del enzima procoagulante. Además, el gen que codifica el enzima procoagulante de la presente invención no está particularmente limitado, siempre y cuando el gen codifique el enzima procoagulante de la presente invención, tal como se ha descrito anteriormente. La descripción anterior sobre el factor C se aplica también mutatis mutandis a las variantes del gen y la proteína.
"La actividad del enzima procoagulante" significa una actividad por la cual una enzima procoagulante cambia a un enzima coagulante en presencia del factor B de tipo activo, para reaccionar con el sustrato para la detección que se menciona a continuación. La "actividad para reaccionar con un sustrato para la detección" significa, por ejemplo, una actividad para reaccionar con coagulógeno para provocar la coagulación y una actividad para reaccionar con Boc- Leu-Gly-Arg-pNA para liberar pNA. El hecho de que el enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva "tiene la actividad del enzima procoagulante" puede confirmarse, por ejemplo, mediante la coagulación enzimática de la presente invención en combinación con un factor C adecuado y un factor B adecuado y detectar el avance de la reacción en cascada en la presencia de endotoxinas. Más concretamente, se puede utilizar la proteína de la SEQ ID No.: 2 como el factor C adecuado, y se puede utilizar la proteína de la SEQ ID No.: 4 como el factor B adecuado. El avance de la reacción en cascada puede medirse utilizando el sustrato mencionado a continuación para la detección.
De forma similar al factor C de la presente memoria descriptiva, el factor B de la presente memoria descriptiva o el enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva que se van a utilizar, pueden ser cualquiera en los que no se añade el marcador His al extremo C-terminal, aquellos en los que no se añade el marcador V5 al extremo C- terminal, aquellos en los que no se añade ningún péptido al extremo C-terminal y aquellos en los que no se añade ningún péptido a ningún extremo terminal.
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Además, las combinaciones de codones en el gen que codifica el factor B de la presente memoria descriptiva o el gen que codifica el enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva se pueden modificar para que el o los genes estén optimizados para ser expresados en células de insectos. Entre los ejemplos del ADN que codifica el factor B de la SEQ ID No.: 4 y tiene las combinaciones de los codones optimizados para la expresión en células de insectos se incluye el ADN de la SEQ ID No.: 8. Entre los ejemplos del ADN que codifica el enzima procoagulante de la SEQ ID No.: 6 y tiene combinaciones de codones optimizados para la expresión en células de insectos se incluye el ADN de la SEQ ID No.: 9. Cada uno del gen que codifica el factor B de la presente memoria descriptiva o el gen que codifica el enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva puede ser una variante de ADN cuyas combinaciones de codones están optimizados para su expresión en células de insectos.
El agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva puede comprender el factor C de la presente memoria descriptiva, el factor B de la presente memoria descriptiva y el enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva.
El agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva puede comprender un sustrato para la detección del avance de la reacción en cascada. En la presente memoria descriptiva, este sustrato se puede denominar "sustrato para la detección".
Entre los ejemplos del sustrato para la detección se incluye coagulógeno. Debido al contacto del coagulógeno con un enzima coagulante, tiene lugar coagulación para producir coagulina. El avance de la reacción de coagulación puede ensayarse mediante la medición de la turbidez de la solución de reacción. El coagulógeno se puede recuperar de un extracto de células sanguíneas del cangrejo de herradura (lisado). Además, dado que se ha aclarado una secuencia de nucleótidos del gen que codifica el coagulógeno (Miyata, y otros, PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, Extra Edition, núm. 29, págs. 30-43 (1986)), se puede producir coagulógeno según un procedimiento convencional mediante ingeniería genética.
Como el sustrato para la detección, también puede utilizarse un sustrato sintético. El sustrato sintético no está particularmente limitado, siempre y cuando el sustrato tenga una propiedad adecuada para la detección, tal como una propiedad por la que la reacción catalítica de una enzima coagulante provoca el revelado de color o la emisión de fluorescencia. Entre los ejemplos del sustrato sintético se incluyen sustratos representados por la fórmula general X-Y-Z (en la que X representa un grupo protector, Y representa un péptido, y Z representa un colorante enlazado a Y través de un enlace amida). En los casos en los que la endotoxina existe en el sistema de reacción, la reacción catalítica de una enzima coagulante, que se produce como consecuencia de la reacción en cascada, escinde el enlace amida entre Y y Z, para liberar el colorante Z, que conduce al revelado de color o a la emisión de fluorescencia. El grupo protector X no está especialmente limitado, y puede utilizarse convenientemente un grupo protector conocido para péptidos. Entre los ejemplos de un grupo protector de este tipo se incluyen el grupo t- butoxicarbonilo y el grupo benzoílo. El colorante Z no está especialmente limitado y puede ser un colorante que puede detectarse bajo luz visible o un colorante fluorescente. Entre los ejemplos del colorante Z se incluyen pNA (para-nitroanilina), MCA (ácido 7-metoxicumarin-4-acético), DNP (2,4-dinitroanilina) y colorantes de dansilo. Entre los ejemplos del péptido Y se incluyen Leu-Gly-Arg (LGR), Ile-Glu-Gly-Arg (IEGR) (SEQ ID No.: 12) y Val-Pro-Arg (VPR). El colorante Z liberado se puede medir por un procedimiento seleccionado dependiendo de la propiedad del colorante.
Además, el agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva también puede comprender un componente diferente de los factores y el sustrato para la detección, siempre y cuando el agente se pueda utilizar para la medición de endotoxinas. Este componente no está especialmente limitado y puede seleccionarse en consideración de la capacidad de conservación, facilidad de manejo y la estabilidad de los factores y el sustrato para la detección. El agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva puede comprender, por ejemplo, un agente tamponador de pH y/o sal. Entre los ejemplos del agente tamponador de pH se incluyen tampón HEPES, tampón MES, tampón Tris y solución tampón de amplia gama GTA. El agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva puede comprender también disolventes orgánicos, tales como alcoholes, cetonas, ésteres y amidas.
El agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva puede formularse en una forma arbitraria entre las que se incluyen, por ejemplo, una forma sólida, una forma líquida y una forma del gel. Para la formulación, se pueden utilizar los aditivos utilizados normalmente como portadores de la formulación, tales como vehículos; aglutinantes; disgregantes; lubricantes; estabilizantes; agentes correctivos; diluyentes; surfactantes y disolventes. El agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva se puede utilizar para la medición de endotoxinas tal como se presenta, o después de ser diluido, disperso o disueltos en agua, solución salina fisiológica, solución tampón o similares. Ni que decir que la formulación resultante obtenida por esta dilución, dispersión, o disolución queda también dentro del ámbito del agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva.
En el agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva, los factores y los otros componentes puede existir como una o más mezclas o pueden existir por separado. Por ejemplo, los factores pueden ser mezclados en una relación arbitraria para ser formulados, o pueden formularse por separado.
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Las concentraciones de los factores y los otros componentes en el agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva no están particularmente limitadas y, preferentemente, se ajustan de manera que las concentraciones queden dentro de los intervalos preferentes mencionados a continuación cuando se mide la endotoxina. Preferentemente, la concentración de cada uno de los factores en el agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva (en términos de la solución preparada antes de entrar en contacto con la muestra) es, por ejemplo, de 20 a 100 mg/ml, más preferentemente de 40 a 80 mg/ml, de forma especialmente preferente, aproximadamente, 60 mg/ml.
El agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva se puede proporcionar como un kit de medición de endotoxinas. El kit de medición de endotoxinas no está particularmente limitado, siempre y cuando el kit contenga el agente de medición de endotoxinas de la presente invención.
(2) Procedimiento para producir el agente de medición de endotoxinas
Los factores que debe comprender el agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva se pueden producir mediante expresión utilizando células de insectos como un huésped.
Las células de insectos no están particularmente limitadas, siempre y cuando las células puedan expresar los factores, y pueden utilizarse convenientemente las células que se utilizan normalmente para la expresión de una proteína heteróloga. Entre los ejemplos de estas células de insectos se incluyen Sf9, Sf21, SF+ y High-five. Las células de insectos son preferentemente Sf9.
Las condiciones de cultivo en las que se cultivan las células de insectos no están particularmente limitadas, siempre y cuando las células de los insectos puedan cultivarse en dichas condiciones y, si es necesario, las condiciones de cultivo utilizadas normalmente para el cultivo de células de insectos pueden utilizarse después de las debidas modificaciones. Por ejemplo, como un medio de cultivo, puede utilizarse uno utilizado normalmente para el cultivo de células de insectos. Entre los ejemplos de un medio de este tipo se incluyen medios libres de suero para células de insectos disponibles en el mercado. Más concretamente, medio Sf900 II (Invitrogen) o similares pueden utilizarse convenientemente. El cultivo puede llevarse a cabo, por ejemplo, a 27°C a 28°C con agitación.
El procedimiento para expresar los factores utilizando células de insectos como un huésped no está particularmente limitado, siempre y cuando los factores se puedan expresar por el mismo y puede utilizarse convenientemente un procedimiento utilizado normalmente para la expresión heteróloga de una proteína. Por ejemplo, cada factor puede expresarse mediante infección de células de insectos con un virus en el que se ha incorporado un gen que codifica el factor (procedimiento viral). De forma alternativa, cada factor puede expresarse mediante la introducción de un vector, en el que se ha incorporado un gen que codifica el factor, en las células de insectos, incorporando de este modo el gen en el cromosoma del huésped (procedimiento de línea celular de expresión estable).
< Procedimiento viral >
El virus que se va a utilizar en el procedimiento viral no está particularmente limitado, siempre y cuando las células de los insectos puedan ser infectadas con el virus y los factores puedan ser expresados por las mismas, y puede utilizarse convenientemente un virus utilizado normalmente para la expresión de una proteína en células de insecto. Entre los ejemplos de un virus de este tipo se incluye un baculovirus. El baculovirus es preferentemente nucleopolihedrovirus (NPV). Entre los ejemplos de NPV se incluyen AcNPV (NPV Autographa californica) y BmNPV (NPV Bombix mori). El NpV es preferentemente AcNPV.
La introducción del ácido nucleico en el virus puede llevarse a cabo mediante un procedimiento convencional, por ejemplo, por recombinación homóloga con un vector de transferencia. Entre los ejemplos del vector de transferencia se incluyen pPSC8 (Protein Sciences), pFastBac (Invitrogen) y pVL1393 (Pharmingen). El vector de transferencia es preferentemente pPSC8.
Mediante infección, por un procedimiento convencional, de células de insectos con un virus en el que se ha incorporado el gen que codifica a cada factor, se pueden obtener células de insectos que albergan el virus y expresan el factor.
< Procedimiento de línea celular de expresión estable >
Mediante la incorporación del gen que codifica cada factor en el cromosoma de las células de los insectos, se puede obtener una línea celular de expresión estable, que expresa el factor de manera estable. El procedimiento de construcción de la línea celular de expresión estable no está especialmente limitado, y la construcción puede llevarse a cabo mediante un procedimiento convencional. Por ejemplo, la línea celular de expresión estable puede construirse utilizando el vector pIZ/V5-su (Invitrogen) según el manual.
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En cualquier caso, las células de expresión se construyen de forma que el factor C expresado tiene el extremo C- terminal en el que no está unido el marcador His. Además, en casos los que cada factor se va a expresar sin la adición de cualquier péptido, lo que no está limitado al marcador His en el extremo C-terminal del factor C, las células de expresión se pueden construir de forma que no se añada ningún péptido.
En cualquier caso, los factores podrán expresarse conjuntamente mediante un solo tipo de células de expresión, o las células de expresión pueden construirse para cada factor para expresar por separado los factores respectivos.
Que cada factor se expresa, o no, puede confirmarse mediante la medición de la actividad del factor. Que cada factor se expresa, o no, puede confirmarse también midiendo la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen que codifica el factor, o detectando el factor mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo.
Cada factor expresado puede ser recuperado como una solución que contiene el factor, para ser utilizado como un componente del agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva. La solución que contiene el factor puede ser, por ejemplo, un caldo de cultivo, un sobrenadante de cultivo, o un extracto celular o una mezcla de los mismos. Cada factor se puede utilizar después de la purificación o sin purificación. En la presente invención, se puede proporcionar un agente de medición de endotoxinas que tiene una eficacia suficientemente elevada incluso utilizando el sobrenadante del cultivo celular que contiene cada factor expresado sin la purificación del factor. En los casos en los que cada factor debe ser purificado, la purificación puede realizarse, por ejemplo, mediante un procedimiento conocido para la purificación de una proteína. Entre los ejemplos de este procedimiento se incluyen precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de hidroxiapatita. En los casos en los que un marcador, tal como un marcador His está unido a cada factor, el factor puede ser purificado también mediante cromatografía de afinidad utilizando afinidad contra el marcador.
En los casos en los que cada factor se produjo mediante el procedimiento viral, preferentemente, el virus se elimina. El procedimiento de eliminación del virus no está especialmente limitado, y la eliminación puede llevarse a cabo mediante un procedimiento convencional. Por ejemplo, el virus puede ser eliminado a través de una membrana de filtración de fibras huecas con un tamaño de poro de 500 kDa.
(3) Procedimiento para la medición de endotoxinas
Mediante la mezcla del agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva con una muestra, la reacción en cascada procede en los casos en los que la muestra contiene endotoxinas. Midiendo el avance de la reacción en cascada, puede medirse la endotoxina en la muestra. Es decir, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para la medición de endotoxinas en una muestra de ensayo, procedimiento que comprende una etapa de mezcla del agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva con una muestra de ensayo y una etapa de medición del avance de la reacción en cascada (denominada a continuación "primera realización").
Cada factor comprendido en el agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva puede haber estado contenido en el sistema de reacción desde el comienzo de la etapa de mezcla del agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva con una muestra, o se puede añadir secuencialmente al sistema de reacción.
Por ejemplo, la etapa de mezcla del agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva con una muestra de ensayo puede comprender las siguientes etapas (A) a (C):
(A) una etapa de adición del factor C de la presente memoria descriptiva al sistema de reacción;
(B) una etapa de adición del factor B de la presente memoria descriptiva al sistema de reacción; y
(C) una etapa de adición del enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva al sistema de reacción.
Las etapas (A) a (C) se pueden ser llevar a cabo por separado, parcialmente al mismo tiempo, o totalmente al mismo tiempo. Las etapas (A) a (C) se pueden ser llevar a cabo en un orden arbitrario. Por ejemplo, la etapa (A) puede estar seguida por la etapa (B), que a continuación puede estar seguida por la etapa (C).
El avance de la reacción en cascada puede medirse añadiendo un sustrato para la detección del sistema de
reacción y, a continuación, midiendo la reacción del sustrato (colorante, coagulación o similares). El sustrato para la
detección puede haber estado contenido en el sistema de reacción desde el comienzo de la etapa de mezcla del agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva con una muestra de ensayo, o puede añadirse al sistema de reacción durante el desarrollo o después de finalizar la etapa. La primera realización, incluye, por supuesto, casos en los que se utiliza el agente de medición de endotoxinas de la presente memoria descriptiva que contiene de manera preliminar un sustrato para la detección.
Siempre y cuando la reacción en cascada proceda en los casos en los que la endotoxina está contenida en la sustancia de ensayo, el factor B y el enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva pueden no
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necesariamente ponerse en contacto con la muestra de ensayo. Es decir, otra realización del procedimiento de la presente memoria descriptiva para la medición de endotoxinas (denominada a continuación "segunda realización") es un procedimiento para la medición de endotoxinas en una sustancia de ensayo, procedimiento que comprende las siguientes etapas (A) a (D).
(A) una etapa de mezcla del factor C de la presente memoria descriptiva con una muestra de ensayo;
(B) una etapa de mezcla del factor B de la presente memoria descriptiva con el factor C después de la mezcla
del mismo en la etapa A;
(C) una etapa de mezcla del enzima procoagulante de la presente memoria descriptiva con el factor B después
de la mezcla del mismo en la etapa B; y
(D) una etapa de medición del avance de la reacción en cascada.
En la segunda realización, las etapas (A) a (D) pueden proceder por separado, parcialmente al mismo tiempo, o totalmente al mismo tiempo. Por ejemplo, después de comenzar la etapa A, puede añadirse el factor B o el enzima procoagulante al sistema de reacción durante el desarrollo de la etapa o después de la terminación de la misma. De manera alternativa, después de comenzar la etapa B, puede añadirse el enzima procoagulante al sistema de reacción durante el desarrollo de la etapa o después de la terminación de la misma. De manera alternativa, los 3 factores pueden estar contenidos en el sistema de reacción desde el comienzo de la etapa A. De manera alternativa, por ejemplo, después de la puesta en contacto en la etapa A, el factor C puede ser recuperado para ser utilizado en la etapa B, y después de la puesta contacto en la etapa B, el factor B puede ser recuperado para ser utilizado en la etapa C.
En la segunda realización, puede medirse el avance de la reacción en cascada mediante adición de un sustrato para la detección del sistema de reacción y, a continuación, medir la reacción del sustrato (colorante, coagulación o similares). El sustrato para la detección puede estar contenido en el sistema de reacción desde el principio de etapa A, o puede añadirse al sistema de reacción durante el desarrollo de cada etapa o después de la terminación las mismas.
El procedimiento de la presente memoria descriptiva para la medición de endotoxinas puede comprender otra etapa arbitraria, siempre y cuando la reacción en cascada proceda en los casos en los que la muestra de ensayo contenga endotoxinas. Por ejemplo, el procedimiento de la presente memoria descriptiva para la medición de endotoxinas puede comprender una etapa de adición de un sustrato para la detección del sistema de reacción, o una etapa de mezcla de un enzima coagulante, producido por la reacción en cascada con un sustrato para la detección. Además, por ejemplo, el procedimiento de la presente memoria descriptiva para la medición de endotoxinas puede comprender una etapa de cálculo del nivel de endotoxinas en la muestra de ensayo sobre la base de la reacción del sustrato para la detección.
En el procedimiento de la presente memoria descriptiva para la medición de endotoxinas, la reacción se lleva a cabo preferentemente en un solvente acuoso, tal como agua o un tampón.
En el procedimiento de la presente memoria descriptiva para la medición de endotoxinas, la concentración de cada factor en la solución de reacción no está particularmente limitada, siempre y cuando la reacción en cascada proceda en los casos en los que la endotoxina se encuentra en la muestra de ensayo, y se puede configurar apropiadamente dependiendo de la propiedad del factor o similares. Por ejemplo, la concentración de cada factor es, generalmente, de 10 a 50 mg/ml, preferentemente, de 20 a 40 mg/ml, más preferentemente, de 30 mg/ml, en términos de la concentración final.
En el procedimiento de la presente memoria descriptiva para la medición de endotoxinas, la concentración del sustrato para la detección en la solución de reacción no está particularmente limitada, siempre y cuando la reacción en cascada proceda en los casos en los que la endotoxina se encuentra en la muestra de ensayo y se puede configurar apropiadamente dependiendo de la propiedad del sustrato para la detección o similares. Por ejemplo, en los casos en los que el sustrato para la detección es un sustrato sintético, la concentración de sustrato para la detección es, normalmente, de 0,001 mM a 100 mM, preferentemente, de 0,01 mM a 10 mM, en términos a la concentración final.
En cualquier realización, el sistema de reacción puede contener uno o más componentes arbitrarios que no sean el agente de medición de endotoxinas en la primera realización o los factores de la segunda realización, sustrato para la detección y muestra de ensayo, siempre y cuando la reacción en cascada proceda en los casos en los que la endotoxina se encuentra en la muestra de ensayo. Por ejemplo, el sistema de reacción puede contener un agente tamponador de pH y/o sal. Entre los ejemplos del agente tamponador de pH se incluyen tampón HEPES, tampón MES, tampón Tris y solución tampón de amplia gama GTA. El sistema de reacción puede contener también disolventes orgánicos, tales como alcoholes, cetonas, ésteres y amidas.
El pH de la solución de reacción no está limitado particularmente, siempre y cuando la reacción en cascada proceda en los casos en los que la endotoxina se encuentra en la muestra de ensayo, y puede configurarse correctamente
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según la propiedad de cada factor. Por ejemplo, el pH de la solución de reacción es, generalmente, de 5 a 10, preferentemente, de 7 a 8,5.
La temperatura de reacción no está limitada particularmente, siempre y cuando la reacción en cascada proceda en los casos en los que la endotoxina se encuentra en la muestra de ensayo, y puede configurarse correctamente según la propiedad de cada factor. La temperatura de reacción es, por ejemplo, generalmente de 10°C a 80°C, preferentemente, de 20°C a 50°C. Por ejemplo, la temperatura de reacción puede ser temperatura ambiente.
El tiempo de reacción no está limitado particularmente y pueden configurarse adecuadamente dependiendo de condiciones tales como la propiedad de cada factor y la temperatura de reacción. El tiempo de reacción es, por ejemplo, normalmente de 5 minutos a 1 hora, preferentemente, de 15 minutos a 45 minutos. Por ejemplo, el tiempo de reacción puede ser 30 minutos.
En cualquier realización, durante el proceso de reacción, además, la muestra de ensayo, los factores y los otros componentes pueden añadirse individualmente o en una combinación arbitraria al sistema de reacción. Estos componentes pueden añadirse a la vez o en una pluralidad de momentos, o pueden añadirse continuamente. Se pueden utilizar condiciones constantes desde el inicio de la reacción hasta el final de la reacción, o las condiciones pueden cambiarse durante el proceso de reacción.
Mediante la medición de la reacción del sustrato para la detección (colorante, coagulación o similares), puede medirse el avance de la reacción en cascada debido a la existencia de la endotoxina y, por lo tanto, puede medirse la endotoxina en la sustancia de ensayo. La reacción del sustrato para la detección (colorante, coagulación o similares) se puede medir por un procedimiento dependiendo del sustrato para la detección utilizado.
En los casos en los que la medición de endotoxinas se realiza cuantitativamente, se pueden utilizar una muestra patrón de endotoxina cuya concentración es conocida, para obtener una correlación de datos entre el nivel de endotoxinas y el grado de reacción del sustrato para la detección (grado de coloración, coagulación o similares), y las endotoxinas existentes en la muestra pueden cuantificarse a partir de los datos de correlación. Los datos de correlación pueden ser, por ejemplo, una curva de calibración. La cuantificación puede realizarse mediante el procedimiento cinético o mediante el procedimiento de punto final.
La muestra de ensayo objeto de la medición de endotoxinas no está limitada especialmente, y entre los ejemplos de la misma se incluyen agua médica, productos farmacéuticos, soluciones de infusión, preparaciones sanguíneas, equipos médicos, aparatos médicos, cosméticos, alimentos y bebidas, muestras ambientales (por ejemplo, de aire, de ríos y de suelos), componentes biológicos (por ejemplo, sangre, fluidos corporales y tejidos), proteínas de origen natural, proteínas recombinantes, ácidos nucleicos y carbohidratos. La muestra de ensayo se puede someter a la medición de la endotoxina mediante mezcla, dispersión, o disolviendo la muestra tal como está, o como un extracto o solución de lavado de la muestra de ensayo en un sistema de reacción.
EJEMPLOS
La presente invención se describirá ahora más particularmente por medio de ejemplos.
Ejemplo 1: Producción de agente de medición de endotoxinas de la presente invención
(1-1) Procedimiento de utilización de virus (a continuación, denominado "procedimiento viral")
En el presente ejemplo, se utilizó un baculovirus recombinante en el que se incorporó el gen que codifica a cada uno del factor C, el factor B y un enzima procoagulante, para expresar el factor en las células de insectos, y de este modo se produjo un agente de medición de endotoxinas.
(1-1-1) Preparación de baculovirus recombinante
Como un ADN de codificación de factor C con marcador His unido (gen del factor C con marcador His unido), se sintetizó totalmente el ADN de la SEQ ID No.: 7 mediante un contrato de servicio disponible de forma general (TAKARA BIO INC.). El factor C con marcador His unido es el factor C de un cangrejo de herradura japonés que se muestra en la SEQ ID No.: 2 en la que un marcador de 6 His se une en el extremo C-terminal. El aDn se insertó entre los sitios de reconocimiento de los enzimas de restricción NruI y Smal de un vector de transferencia pPSC8 (Protein Sciences), para obtener un vector para su recombinación. Utilizando el vector de recombinación, se incorporó el gen del factor C con marcador His unido en un baculovirus AcNPV, preparar un baculovirus recombinante.
A continuación, utilizando un cebador FC-N-Pst (SEQ ID No.: 10) y un cebador FC-notag-R-Bam (SEQ ID No.: 11) y el ADN descrito anteriormente que codifica el factor C con marcador His unido como una plantilla, se llevó a cabo PCR para preparar ADN que codifica un factor C en el que se eliminó la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de marcador His, en el extremo 3' (gen del factor C sin marcador). El ADN que codifica el factor C de
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cangrejo de herradura japonés se muestra en la SEQ ID No.: 2, en el que no está unido el marcador His en el extremo C-terminal. Además, para el gen del factor C sin marcador His, se preparó un baculovirus recombinante mediante el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente.
Como un ADN de codificación del factor B (gen del factor B), se sintetizó totalmente el ADN de la SEQ ID No.: 8 mediante un contrato de servicio disponible de forma general (TAKARA BIO INC.). El ADN que codifica el factor B de cangrejo de herradura japonés se muestra en la SEQ ID No.: 4 (sin marcador His), y las combinaciones de sus codones están optimizadas para su expresión en células de insectos. Se preparó también para el gen del factor B, un baculovirus recombinante mediante el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente. Sin embargo, la posición de inserción en el vector de pPSC8 estaba entre los sitios de reconocimiento de los enzimas de restricción PstI y Kpnl.
Como un ADN de codificación del enzima procoagulante (gen del enzima procoagulante), se sintetizó totalmente el ADN de la SEQ ID No.: 9 mediante un contrato de servicio disponible de forma general (TAKARA BIO INC.). El ADN que codifica el enzima procoagulante de cangrejo de herradura japonés que se muestra en la SEQ ID No.: 6 (sin marcador His), y las combinaciones de sus codones están optimizadas para su expresión en células de insectos. Se preparó también para el gen del enzima procoagulante, un baculovirus recombinante mediante el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente. Sin embargo, la posición de inserción en el vector de pPSC8 estaba entre los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción Xbal y Bglll.
(1-1-2) Infección de células de insectos (células Sf9) con Baculovirus recombinante
Se inocularon células Sf9 (Novagen) en un medio en 1,5 x 106 células/ml y se añadió al medio el baculovirus recombinante, en el que se había introducido el ADN que codifica el factor C unido al marcador His, para infectar las células con el virus. Como el medio para las células Sf9, se utilizó Sf900 II (Invitrogen) complementado con antibióticos (agentes antibióticos-antifúngicos (x100); Invitrogen) (concentración final, x1) (1 l). La multiplicidad de infección (MOI) de los virus se estableció en 1,0. Posteriormente, las células obtenidas se cultivaron a 28°C durante 48 horas con agitación.
Del mismo modo, se infectaron células Sf9 con el virus en el cual se había introducido el ADN que codifica el factor C sin marcador His.
Además, se infectaron también células Sf9 con cada uno de los virus en los que se había introducido el ADN que codifica el factor B y el virus en el que se había introducido el ADN que codifica el enzima procoagulante. En estos casos, la MOI se fijó a 0,5, y el tiempo de cultivo fue de 72 horas.
(1-1-3) Recuperación de la solución de la proteína recombinante expresada
Se centrifugó cada uno de los caldos de cultivo obtenidos después del cultivo anterior, a 4°C a 3000xg, durante 30 minutos para obtener el sobrenadante que, a continuación, se almacenó a -80°C.
(1-1-4) Eliminación de las impurezas y virus de la solución de la proteína recombinante
Se descongeló cada uno de los sobrenadantes que se habían almacenado congelados, tal como se ha descrito anteriormente, y se aplicó a un filtro con un tamaño de poro de 0,1 mm (filtro Cup (Millipore)). La filtración se llevó a cabo con succión, y se recuperó la solución que había pasado a través del filtro. Cada sobrenadante recuperado se aplicó a una membrana de filtración de fibras huecas con un tamaño de poro de 500 kDa (membrana de fibras huecas de poliéter sulfona; Spectrum Labs) y se filtró mediante el sistema de filtración de bomba de Kros Flow TFF (Spectrum Labs). Se recuperó cada solución que había pasado a través de la membrana.
(1-1-5) Preparación del reactivo
Se mezclaron conjuntamente a 4°C, 560 ml de cada solución obtenida en el (1-1-4) anterior (en las que están contenidos el factor C, el factor B y el enzima procoagulante), 134 ml de agua destilada, 126 ml de solución acuosa de un sustrato sintético (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA) 6,66 mM (concentración final, 0,3 mM) y 560 ml de solución acuosa de dextrano al 15% (concentración final, 3%). Esta mezcla se distribuyó en alícuotas de 5 ml de volumen en frascos y se liofilizó, para proporcionar al agente de medición de endotoxinas 1.
(1 - 2) Procedimiento utilizando plásmidos (a continuación, denominado también "procedimiento de la línea celular de expresión estable")
En el presente ejemplo, se incorporó un gen que codifica a cada uno de los factores C, factor B, enzima procoagulante en el cromosoma de las células de insectos para la construcción de una línea celular de expresión estable y, a continuación, se expresó cada factor, produciendo un agente de medición de endotoxinas.
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(1-2-1) Preparación y cultivo de la línea celular de expresión estable
Se introdujo cada uno del gen del factor C sin marcador His, el gen del factor B (SEQ ID No.: 8) y el gen del enzima de procoagulante (SEQ ID No.: 9), utilizados en el procedimiento viral descrito anteriormente, en las células Sf9 (Invitrogen) utilizando el kit del vector pIZ (Invitrogen).
Más concretamente, en primer lugar, se incorporó cada uno de los ADN entre los sitios de reconocimiento de EcoRV y MluI en un vector pIZ/V5-His comprendido en el kit, y cada vector resultante se mezcló con Celfectina comprendida en el kit, seguido de la introducción del vector en las células Sf9. La posición de incorporación de los ADN en pIZ/V5- His, y similares se muestran en la figura 2. En la región indicada por una flecha gruesa en la parte superior en la figura 2, se incorporó cada uno de los ADN. Como medio para las células Sf9, se utilizó Sf900 III (Invitrogen) complementado con antibióticos (agentes antibióticos antifúngicos (*100); Invitrogen) (concentración final, *1) y antibiótico Zeocina (Invitrogen) (concentración final, 50 mg/ml). La densidad de la línea celular obtenida de este modo, en la que se había introducido cada ADN, se ajustó a 6 * 105 células/ml (1 l) en el medio y las células se cultivaron a 28°C durante 96 horas con agitación.
Debe observarse que, aunque una secuencia de marcador His está contenida en pIZ/V5-His, todos los ADN descritos anteriormente tienen un codón de detención, de manera que tanto el factor C, el factor B como el enzima procoagulante se expresan sin adición del marcador His.
(1-2-2) Recuperación de la solución de proteína recombinante, eliminación de impurezas y preparación de reactivos
Se procesó cada caldo de cultivo obtenido después del cultivo descrito anteriormente de la misma manera que se ha descrito en "(1-1-3) Recuperación de la solución de la proteína recombinante expresada", "(1-1-4) Eliminación de las impurezas y el virus de la solución de la proteína recombinante" y "(1-1-5) Preparación del reactivo" para el procedimiento viral. Sin embargo, no se realizó el proceso de filtración utilizando una membrana de filtración de fibras huecas en "(1-1-4) Eliminación de las impurezas y el virus de la solución de la proteína recombinante". Se proporcionó el agente de medición obtenido de este modo como el agente de medición de endotoxinas 2.
Ejemplo 2: Propiedades y similares de las proteínas expresadas
(2 - 1) Comparación del nivel de expresión del factor C
Se comparó el nivel de expresión entre el factor C sin marcador His obtenido mediante el procedimiento viral y el procedimiento de línea celular de expresión estable, y el factor C unido a marcador His obtenido mediante el procedimiento viral.
Se evaluó el nivel de expresión mediante un muestreo de 0,5, 1,5, 5 ó 15 ml de la solución correspondiente después de la filtración y antes de la preparación del reactivo en el ejemplo 1 y sometiendo a las soluciones muestreadas a electroforesis en gel de poliacrilamida al 5-20% (en condiciones no reductoras) en presencia de SDS y, a continuación, a transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-factor C (2C12, obtenido del Profesor Shun-ichiro Kawabata, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Kyushu).
Los resultados se muestran en la figura 3. Los resultados indican que los niveles de expresión del factor C sin marcador His eran más bajos que el nivel de expresión del factor C unido a marcador His. Además, las intensidades de las bandas de la transferencia Western en la figura 3 se midieron utilizando un densitómetro, y se calculó la relación de volumen de cada solución con la que se consiguen concentraciones iguales de factor C, sobre la base de valores relativos de las intensidades medidas. La relación de volumen fue 50 para el factor C sin marcador His obtenido mediante el procedimiento viral, 17 para el factor C sin marcador His obtenido mediante el procedimiento de línea celular de expresión estable y 7 para el factor C unido a marcador His obtenido mediante el procedimiento viral.
(2-2) Comparación de la actividad del factor C
La capacidad de activar el enzima procoagulante de cada una de las soluciones de factor C fue estudiada utilizando la misma cantidad de factor C.
Más particularmente, se colocó cada una de solución de factor C unido a marcador His obtenida mediante el procedimiento viral (0,7 ml o 5 ml), solución de factor C sin marcador His obtenida mediante el procedimiento viral (5 ml) y solución de factor C sin marcador His obtenida mediante el procedimiento de la línea celular de expresión estable (1,7 pL) en un pocillo de una placa de 96 pocillos. Posteriormente, se añadió la solución que contenía el factor B (5 ml) y la solución que contenía el enzima procoagulante (5 ml) obtenidas después de la filtración a través del filtro 0,1 mm (1-1-4) en el procedimiento viral en el ejemplo 1 y Boc-Leu-Gly-Arg-pNA (concentración final, 0,3 mM), Tris-HCl (pH 8,0) (concentración final, 100 mM) y 50 ml de endotoxina (nombre del producto "Endotoxina patrón de referencia USP" (USP-RSE); disponible comercialmente de Seikagaku Biobusiness Corporation) (concentración
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de la muestra: 0, 0,05 ó 0,5 UE/ml) de manera que el volumen total en el pocilio fue de 100 pl y se mezcló conjuntamente, seguido de incubación a 37°C durante 3 horas, durante las cuales se midió la absorbancia a 405 nm con el tiempo. Como control negativo se utilizó agua destilada. La velocidad de incremento en la absorbancia (la velocidad de cambio de absorbancia) refleja la capacidad de activar el enzima procoagulante. El término "UE" significa la "unidad de endotoxina", que es una unidad que representa la cantidad de endotoxina (esto también se aplica a continuación).
Los resultados se muestran en la figura 4. En la figura 4, "DW" significa agua destilada; “Virus + marcador His (x1)” solución de factor C unido a marcador His obtenida mediante el procedimiento viral (0,7 p.L); “Virus + marcador His (x7)” significa la misma solución (5 pl); "Virus sin marcador (x1)" significa la solución de factor C sin marcador His obtenida mediante el procedimiento viral; y "Sf9 estable sin marcador (x1)" significa la solución de factor C sin marcador His obtenida mediante el procedimiento de la línea celular de expresión estable.
Como resultado, no se observó la activación del enzima procoagulante o apenas se observó en la solución de factor C unido a marcador His que contiene la misma cantidad de factor C (0,7 pl) e incluso en la solución que contiene aproximadamente 7 veces la cantidad del factor C (5 pl). Por otro lado, el factor C sin marcador His demostró una capacidad de activación del enzima procoagulante notable, independientemente de si se obtuvo mediante el procedimiento viral o mediante el procedimiento de línea celular de expresión estable.
De los resultados anteriores, se demostró que una molécula de factor C recombinante expresada sin adición de la secuencia de marcador His tiene una capacidad mucho mayor de activación del enzima procoagulante que una molécula de factor C recombinante expresada con adición de marcador His. Además, se demostró que cada una de las proteínas expresadas se puede utilizar sin purificación, en el estado el que la proteína está contenida en el sobrenadante de cultivo.
(2-3) Comparación de la estabilidad del factor C expresado
(2-3-1) Estabilidad del factor C expresado mediante el procedimiento viral
En la etapa de cultivo de las células infectadas por el virus a 28°C con agitación (1-1-2) en el procedimiento viral en el ejemplo 1, se recuperó el sobrenadante después de 48 horas, 72 horas y 96 horas de cultivo, y cada sobrenadante recuperado se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida al 5-20% (en condiciones no reductoras) en presencia de SDS, seguido por la evaluación de la cantidad restante de factor C mediante transferencia Western utilizando el anticuerpo anti-factor C (2C12, que es el mismo que se ha utilizado anteriormente). Además, se realizó el muestreo y el análisis por separado de la misma manera para el sobrenadante obtenido por adición de un inhibidor de proteasa (leupeptina a una concentración final de 0,5 pg/ml + pepstatina A a una concentración final de 0,7 pg/ml) al caldo de cultivo después de 24 horas de la infección con el virus.
Los resultados se muestran en la figura 5. Como resultado, se demostró que el factor C expresado mediante el procedimiento viral se descomponía con el tiempo durante el cultivo. Además, se demostró que la descomposición del factor C se producía también en cierta medida en el caso en el que se añadía el inhibidor de proteasa.
(2-3-2) Estabilidad del factor C expresado mediante el procedimiento de línea celular de expresión estable
Del mismo modo, en la etapa de cultivo de la línea celular de expresión estable a 28°C con agitación (1-2-1) en el procedimiento de línea celular de expresión estable en el ejemplo 1, se recuperó el sobrenadante después de 72 horas, 96 horas, 120, 144 y 168 horas de cultivo, y cada sobrenadante recuperado se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida al 5-20% (en condiciones no reductoras) en presencia de SDS, seguido por la evaluación de la cantidad restante de factor C mediante transferencia Western utilizando el anticuerpo anti-factor C (2C12, que es el mismo que se ha utilizado anteriormente). Además, se aplicó también el sobrenadante obtenido después de 48 horas de cultivo mediante el procedimiento viral.
Los resultados se muestran en la figura 6. Como resultado, el factor C expresado mediante el procedimiento de línea celular de expresión estable no se había descompuesto en ausencia de un inhibidor de proteasa, incluso después de 168 horas de cultivo. Por todo esto, se demostró que la utilización del procedimiento de línea celular de expresión estable puede evitar descomposición del factor C.
(2-4) Estudio sobre si es necesario el tratamiento de filtración por membrana de fibras huecas
Se estudió si es necesario el tratamiento de filtración por membrana de fibras huecas (1-1-4) en el procedimiento viral. Utilizando cada solución muestreada antes de la filtración a través de la membrana de fibras huecas (1-1-4) y cada solución muestreada después la filtración a través de la misma (3 lotes) en (1-1-4), se midió la velocidad de incremento en la absorbancia (la velocidad de cambio de absorbancia) de la misma manera que en el apartado (2-2) anterior, mediante la adición de la endotoxina (USP-RSE) a una concentración final de 0 ó 0,05 UE/ml.
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Los resultados se muestran en la figura 7. En la figura 7, "solución sin filtrar" significa una solución que permanecía en el cartucho de membrana de fibras huecas sin filtrar. En los casos en los que se utilizó cada solución muestreada después de la filtración a través de la membrana de fibras huecas, el grado de activación del enzima procoagulante fue bajo cuando la concentración de endotoxina fue 0 UE/ml (en otras palabras, el valor de blanco en la medición de endotoxina fue bajo) y, es decir, se obtuvo un excelente resultado. Por el contrario, se descubrió que, en los casos en los que se utilizó cada solución muestreada antes de filtración a través de la membrana de fibras huecas ("antes de la filtración" o "solución sin filtrar"), el grado de activación del enzima procoagulante fue elevado incluso en los casos de 0 UE/ml de endotoxinas, lo que conduce a un valor de blanco elevado en la medición de endotoxinas.
Por el contrario, mediante el procedimiento de línea celular de expresión estable, el grado de activación del enzima procoagulante en el caso de 0 UE/ml de endotoxinas (el valor de blanco en la medición de endotoxinas) se mantuvo bajo incluso sin un proceso de filtración a través de la membrana de filtración de fibras huecas (figura 4).
A partir de estos resultados, se observó que, aunque la filtración a través de una membrana de filtración de fibras huecas es indispensable en los casos en los que se utiliza el procedimiento viral, esta filtración no es necesaria en los casos en los que se utiliza el procedimiento de línea celular de expresión estable.
Ejemplo 3: Medición de endotoxinas con el agente de medición de endotoxinas de la presente invención
(3 - 1) Medición utilizando el agente de medición de endotoxinas 1
Se añadieron 3,3 ml de tampón de Tris 100 mM (pH 8,0) al agente de medición de endotoxinas 1 (producto liofilizado) para disolver el agente. En esta solución, la concentración de proteína de cada uno de los sobrenadantes de cultivo que contenían el factor C, el factor B y el enzima procoagulante, era aproximadamente 60 mg/ml.
En cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos, se distribuyeron 50 ml de alícuotas de una solución de endotoxina en una concentración de 0, 0,001, 0,01 ó 0,1 UE/ml y se añadieron a cada pocillo 50 ml de la solución de agente de medición de endotoxinas preparada disolviendo el agente, seguido por la mezcla de la mezcla resultante. A continuación, se incubó la mezcla a 37°C durante 30 minutos, y se midió la concentración de endotoxinas según el procedimiento de velocidad de reacción, en la cual se midió la absorbancia a 405 nm con el tiempo durante la incubación. En esta solución de reacción, la concentración de proteína de cada uno de los sobrenadantes de cultivo que contienen el factor C, el factor B y el enzima procoagulante, era aproximadamente 30 mg/ml.
Los resultados se muestran en la figura 8. Como resultado, se observó que, en casos en los que se utilizaron los factores expresados mediante el procedimiento viral, la velocidad de cambio de absorbancia aumentó linealmente dentro del intervalo de 0,001 a 0,10 UE/ml a medida que aumentaba la concentración de endotoxinas.
(3-2) Medición utilizando el agente de medición de endotoxinas 2
Se añadieron 3,3 ml de tampón Hepes 100 mM (pH 7.6) al agente de medición de endotoxinas 2 (producto liofilizado) para disolver el agente. En esta solución, la concentración de proteína de cada uno de los sobrenadantes de cultivo que contienen el factor C, el factor B y el enzima procoagulante, era aproximadamente 60 mg/ml.
En cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos, se distribuyeron 50 ml de alícuotas de una solución de endotoxina en una concentración de 0, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01 ó 0,1 UE/ml y se añadieron a cada pocillo 50 ml de la solución de agente de medición de endotoxinas preparada disolviendo el agente, seguido por la mezcla de la mezcla resultante. A continuación, se incubó la mezcla a 37°C durante 30 minutos, y se midió la concentración de endotoxinas según el procedimiento de velocidad de reacción, en la cual se midió la absorbancia a 405 nm con el tiempo durante la incubación. En esta solución de reacción, la concentración de proteína de cada uno de los sobrenadantes de cultivo que contienen el factor C, el factor B y el enzima procoagulante, era aproximadamente 30 mg/ml.
Los resultados se muestran en la figura 9. Como resultado, se observó que, en los casos en los que se utilizaron los factores expresados mediante el procedimiento de línea celular de expresión estable, la velocidad de cambio de absorbancia aumentó linealmente dentro del intervalo de 0,0005 a 0,1 UE/ml a medida que aumentaba la concentración de endotoxinas.
En base a los resultados anteriores, con cualquiera de los agentes de medición de endotoxinas, la cuantificación de endotoxinas a concentraciones de 0,001 UE/ml era posible en 30 minutos. Además, con el agente de medición de endotoxinas 2, se pudo medir endotoxinas a una concentración de 0,0005 que UE/ml en 30 minutos. De este modo, se demostró que los agentes medición de endotoxinas de la presente invención permiten una cuantificación más rápida y sensible de la endotoxina en comparación con los procedimientos convencionales (mediante los cuales la medición no tarda menos de 1 hora y no se ha conseguido una sensibilidad de detección de 0,001 UE/ml). Además, se ha demostrado que, en cualquier caso, los factores expresados pueden utilizarse para un agente de medición tal como están sin purificación.

Claims (2)

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para producir un agente de medición de endotoxinas que comprende las siguientes proteínas (1) a (3) de Tachypleus tridentatus, cada una de ellas es una proteína recombinante que no tienen una secuencia de marcador His en el extremo C-terminal o cualquier otro péptido en cualquier extremo terminal y se obtiene a partir de células de insectos como un huésped:
    (1) factor C que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 2;
    (2) factor B que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 4; y
    (3) enzima procoagulante que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 6,
    comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas (A) a (E):
    (A) una etapa de incorporar cada uno de los siguientes ADN (1) a (3) de Tachypleus tridentatus en un ADN viral;
    (1) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 2;
    (2) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 4; y
    (3) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 6;
    (B) una etapa de infectar células de insectos con el virus en el que se ha incorporado cada uno de dichos ADN;
    (C) una etapa de permitir que las células de insecto infectadas con cada uno de dichos virus expresen la proteína codificada por cada uno de dichos ADN;
    (D) una etapa de recuperar el factor C, el factor B y el enzima procoagulante como una solución y eliminar el virus mediante una membrana de filtración de fibras huecas con un tamaño de poro de 500 kDa; y
    (E) una etapa de formular el agente de medición de endotoxinas.
  2. 2. Procedimiento para producir a un agente de medición de endotoxinas que comprende las siguientes proteínas (1) a (3) de Tachypleus tridentatus, cada una de ellas es una proteína recombinante que no tiene una secuencia de marcador His en el extremo C-terminal o cualquier otro péptido en cualquier extremo terminal y se obtiene a partir de células de insectos como un huésped:
    (1) factor C que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 2;
    (2) factor B que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 4; y
    (3) enzima procoagulante que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID No.: 6,
    comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas (A) a (E):
    (A) una etapa de incorporar cada uno de los siguientes ADN (1) a (3) de Tachypleus tridentatus en un vector;
    (1) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 2;
    (2) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 4; y
    (3) ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 6;
    (B) una etapa de introducir el vector, en el que se ha incorporado cada uno de dichos ADN, en células de insectos para incorporar cada uno de dichos aDn en el cromosoma de las células de insecto;
    (C) una etapa de permitir que las células de insecto, en las que se ha incorporado cada uno de dichos ADN, exprese la proteína codificada por cada uno de dichos ADN;
    (D) una etapa de recuperar el factor C, el factor B y el enzima procoagulante como una solución y
    (E) una etapa de formular el agente de medición de endotoxinas.
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