JP2022119887A - エンドトキシン測定剤 - Google Patents
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Abstract
Description
inoscorpius rotundicauda)由来の組換えファクターCと、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス(Tachypleus tridentatus)由来の組換えファクターBおよび組換えプロクロッティングエンザイムとを用いてカスケード反応系を再構築した例が知られている(特許文献1)。
ーダーの検出感度を実現していなかった。そのため、より迅速且つ高感度にエンドトキシンを測定する技術が求められていた。
[1]
下記のタンパク質(1)~(3)を含むエンドトキシン測定剤であって、該タンパク質(1)~(3)の各々は昆虫細胞をホストとして発現することにより得られる組換えタンパク質である、測定剤。
(1)タキプレウス・トリデンタツス(Tachypleus tridentatus)由来のファクターCで
あって、C末端にHisタグ配列を有さないファクターC。
(2)カブトガニのファクターB。
(3)カブトガニのプロクロッティングエンザイム。
[2]
前記ファクターBおよび前記プロクロッティングエンザイムが、タキプレウス・トリデンタツス(Tachypleus tridentatus)由来である、[1]に記載の測定剤。
[3]
前記ファクターCが下記のタンパク質(A)または(B)であり、前記ファクターBが下記のタンパク質(C)または(D)であり、且つ、前記プロクロッティングエンザイムが下記のタンパク質(E)または(F)である、[1]または[2]に記載の測定剤。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターCの活性を有するタンパク質。
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
(D)配列番号4に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターBの活性を有するタンパク質。
(E)配列番号6に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
(F)配列番号6に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイムの活性を有するタンパク質。
[4]
下記の工程(A)~(C)を含む、[1]~[3]のいずれかに記載の測定剤の製造方法。(A)下記のDNA(1)~(3)の各々をウイルスDNAに組み込む工程。
(1)タキプレウス・トリデンタツス(Tachypleus tridentatus)由来のファクターCであって、C末端にHisタグ配列を有さないファクターCをコードするDNA
(2)カブトガニのファクターBをコードするDNA
(3)カブトガニのプロクロッティングエンザイムをコードするDNA
(B)前記各DNAが組み込まれたウイルスを、各々昆虫細胞に感染させる工程。
(C)前記各ウイルスに感染した昆虫細胞に、各々のDNAにコードされるタンパク質を発現させる工程。
[5]
下記の工程(A)~(C)を含む、[1]~[3]のいずれかに記載の測定剤の製造方法。(A)下記のDNA(1)~(3)の各々をベクターに組み込む工程。
(1)タキプレウス・トリデンタツス(Tachypleus tridentatus)由来のファクターCであって、C末端にHisタグ配列を有さないファクターCをコードするDNA
(2)カブトガニのファクターBをコードするDNA
(3)カブトガニのプロクロッティングエンザイムをコードするDNA
(B)前記各DNAが組み込まれたベクターを、各々昆虫細胞に導入し、昆虫細胞の染色体に前記各DNAを組み込む工程。
(C)前記各DNAが組み込まれた昆虫細胞に、各々のDNAにコードされるタンパク質を発現させる工程。
[6]
前記ファクターCをコードするDNAが下記のDNA(A)または(B)であり、前記ファクターBをコードするDNAが下記のDNA(C)または(D)であり、且つ、前記プロクロッティングエンザイムをコードするDNAが下記のDNA(E)または(F)である、[4]または[5]に記載の測定剤の製造方法。
(A)配列番号1に示す塩基配列を含むDNA。
(B)配列番号1に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、ファクターCの活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(C)配列番号3または8に示す塩基配列を含むDNA。
(D)配列番号3または8に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ファクターBの活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(E)配列番号5または9に示す塩基配列を含むDNA。
(F)配列番号5または9に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイムの活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[7]
[1]~[3]のいずれかに記載の測定剤と被験試料とを混合する工程、およびカスケード反応の進行を測定する工程を含む、被験試料中のエンドトキシン測定法。
[8]
カスケード反応の進行を検出するための基質を反応系に添加する工程を含む、[7]に記載の測定法。
[9]
さらに、前記基質の反応に基づき、被験試料中のエンドトキシン量を算出する工程を含む、[8]に記載の測定法。
本発明のエンドトキシン測定剤は、ファクターC、ファクターB、およびプロクロッティングエンザイムを含む。本発明のエンドトキシン測定剤に含まれるファクターC、ファクターB、およびプロクロッティングエンザイムを、以下、それぞれ本発明のファクターC、本発明のファクターB、および本発明のプロクロッティングエンザイムという場合がある。また、ファクターC、ファクターB、およびプロクロッティングエンザイムを総称して「因子」という場合がある。
つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみ
なされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへ
の置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys
、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met
、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu
、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記の
ようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来するカブトガニの個体差、株、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異も含まれる。
SDSに相当する塩濃度、温度で、1回、より好ましくは2~3回洗浄する条件が挙げられる。
わせが昆虫細胞での発現に最適化されたDNAとしては、配列番号8のDNAが挙げられる。配列番号6のプロクロッティングエンザイムをコードし、且つコドンの組み合わせが昆虫細胞での発現に最適化されたDNAとしては、配列番号9のDNAが挙げられる。なお、本発明のファクターBをコードする遺伝子および/または本発明のプロクロッティングエンザイムをコードする遺伝子は、コドンの組み合わせが昆虫細胞での発現に最適化されたDNAのバリアントであってもよい。
る。このように希釈、分散、又は溶解等した場合にも、本発明のエンドトキシン測定剤の範囲に含まれることは言うまでもない。
~80μg/mLであるのがより好ましく、約60μg/mLであるのが特に好ましい。
本発明のエンドトキシン測定剤に含まれる各因子は、昆虫細胞をホストとして用いて発現することで製造できる。
900 II培地(インビトロジェン(Invitrogen)社)等を好適に用いることができる。培養は、例えば、27℃~28℃で、振とう培養により行うことができる。
ウイルス法に用いるウイルスは、昆虫細胞に感染し各因子を発現させることができる限り特に制限されず、昆虫細胞でのタンパク質の発現に通常用いられるものを好適に利用できる。そのようなウイルスとしては、バキュロウイルス(Baculovirus)が挙げられる。
バキュロウイルスとしては、核多角体病ウイルス(Nucleopolyhedrovirus;NPV)が好ま
しい。NPVとしては、AcNPV(Autographa californica NPV)、BmNPV(Bombix mori NPV)が挙げられる。NPVとしては、AcNPVが好ましい。
nvitrogen)社)、pVL1393(ファーミンジェン(Pharmingen)社)が挙げられる。トランスファーベクターとしては、pPSC8が好ましい。
各因子をコードする遺伝子を昆虫細胞の染色体上に組み込むことで、各因子を安定に発現する安定発現細胞株が得られる。安定発現細胞株の構築手法は、特に制限されず、常法により行うことができる。例えば、pIZ/V5-Hisベクター(インビトジェン(Invitrogen)社)を用いて、マニュアルに従って安定発現細胞株を構築することができる。
本発明のエンドトキシン測定剤を被験試料と混合することにより、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にはカスケード反応が進行する。カスケード反応の進行を測定することにより、被験試料中のエンドトキシンを測定することができる。すなわち、本発明は、本発明のエンドトキシン測定剤と被験試料とを混合する工程、およびカスケード反応の進行を測定する工程を含む被験試料中のエンドトキシン測定法(以下、第1の態様ともいう)を提供する。
ンドトキシン測定剤を被験試料と混合する工程の当初から反応系に含まれていてもよく、逐次反応系に添加されてもよい。
(A)本発明のファクターCを反応系に添加する工程。
(B)本発明のファクターBを反応系に添加する工程。
(C)本発明のプロクロッティングエンザイムを反応系に添加する工程。
(B)本発明のファクターBと、工程Aの混合後のファクターCとを混合する工程。
(C)本発明のプロクロッティングエンザイムと、工程Bの混合後のファクターBとを混合する工程。
(D)カスケード反応の進行を測定する工程。
であるのがより好ましい。
ばよい。相関データとは、例えば検量線である。定量はカイネティック法により行ってもよく、エンドポイント法によって行ってもよい。
(1-1)ウイルスを利用した方法(以下、「ウイルス法」ともいう)
本実施例では、ファクターC、ファクターB、プロクロッティングエンザイムのそれぞれをコードする遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルスを利用して、昆虫細胞で各因子を発現させ、エンドトキシン測定剤を製造した。
Hisタグ付ファクターCをコードするDNA(Hisタグ付ファクターC遺伝子)として、配列番号7のDNAを、一般の受託サービス(タカラバイオ)を利用して全合成した。当該Hisタグ付ファクターCは、配列番号2に示す日本産カブトガニのファクターCのC末端に6×Hisタグが付加されたものである。当該DNAをトランスファーベクターpPSC8(プロテインサイエンス(Protein Sciences)社)の制限酵素NruIとSmaI認識部位間に挿入し、組換え用ベクターを得た。当該組換え用ベクターを用いて、Hisタグ付ファクターC遺伝子をバキュロウイルスAcNPVに組み込み、組換えバキュロウイルスを作製した。
組換えバキュロウイルスを作製した。ただし、pPSC8ベクターへの挿入位置を、制限酵素XbaIとBglII認識部位の間とした。
Sf9細胞(ノバジェン(Novagen)社)を、1.5×106細胞/mLとなるように
培地に播種し、これに、前記Hisタグ付ファクターCをコードするDNAが導入された組換えバキュロウイルスを添加して、ウイルスを細胞に感染させた。Sf9細胞用の培地として、抗生物質(抗生物質-抗真菌剤(x100);インビトロジェン(Invitrogen)社)(終濃度x1)を含有するSf900 II培地(インビトロジェン(Invitrogen)社)(1L)を用いた。また、ウイルスの多重感染度(MOI)は、1.0とした。その後、これにより得られた細胞を28℃で48時間、振とう培養した。
前記培養後の各々の培養液を、4℃で、3000×g、30分間遠心分離し、得られた各上清を-80℃で保存した。
前記凍結保存していた各上清を融解し、ポアサイズ0.1μmのフィルター(カップフィルター(ミリポア(Millipore)社))にアプライして、吸引圧力でろ過し、膜を通過
した溶液を回収した。回収された各上清を、ポアサイズ500kDaの中空糸ろ過膜(ポリエーテルスルホン製の中空糸膜;スペクトラムラボラトリーズ(Spectrumlabs)社)にアプライし、Kros Flow TFFポンプろ過システム(スペクトラムラボラトリーズ(Spectrumlabs)社)を用いてろ過し、通過した各溶液を回収した。
前記(1-1-4)で得られた各溶液(ファクターC、ファクターB、又はプロクロッティングエンザイムを含有する)を560mL、蒸留水134mL、6.66mMの合成基質(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)水溶液126mL(終濃度0.3mM)、及び15%デキストラン水溶液560mL(終濃度3%)を4℃下で混合した。この混合液を5mLずつバイアルに分注し、凍結乾燥させて、エンドトキシン測定剤1とした。
本実施例では、ファクターC、ファクターB、プロクロッティングエンザイムのそれぞれをコードする遺伝子を昆虫細胞の染色体に組み込んで安定発現細胞株を構築し、各因子を発現させてエンドトキシン測定剤を製造した。
上述のウイルス法で用いたHisタグなしファクターC遺伝子、ファクターB遺伝子(配列番号8)、およびプロクロッティングエンザイム遺伝子(配列番号9)の各々を、pIZベクターキット(インビトロジェン(Invitrogen)社)を用いてSf9細胞(インビトロジェン(Invitrogen)社)に導入した。
培地(Invitrogen)を用いた。これにより得られた各DNAが導入された細胞株を、6×105細胞/mL(1L)となるように前記培地で調製し、28℃で96時間、振とう培養した。
前記培養後の各々の培養液につき、上述のウイルス法の「(1-1-3)発現された組換えタンパク質溶液の回収」、「(1-1-4)組換えタンパク質溶液からの不純物・ウイルス除去」、「(1-1-5)試薬調製」と同様に処理した。ただし、「(1-1-4)組換えタンパク質溶液からの不純物・ウイルス除去」における中空糸ろ過膜を用いたろ過のプロセスは行わなかった。これにより得られた測定剤を、エンドトキシン測定剤2とした。
(2-1)ファクターCの発現量比較
ウイルス法及び安定発現細胞株法により得られたHisタグが付加されていないファクターC、並びに、ウイルス法により得られたHisタグ付ファクターCについて、各々の発現量を比較した。
ル電気泳動(非還元条件下)に供した後、抗ファクターC抗体(2C12、国立大学法人九州大学 大学院 理学研究院 生物化学部門 川畑 俊一郎教授より入手)を用いたウエスタンブロット法により評価した。
前記各ファクターC溶液につき、ファクターCの量を揃えて、プロクロッティングエンザイムの活性化能を調べた。
μL)、安定発現細胞株法により得られたファクターC(Hisタグなし)溶液(1.7μL)を、各々96穴プレートのウェルに入れた。次に、各ウェルの全量が100μLとなるように、実施例1のウイルス法の(1-1-4)における0.1μmのフィルター通過後に得られたファクターB含有溶液(5μL)、プロクロッティングエンザイム含有溶液(5μL)、およびBoc-Leu-Gly-Arg-pNA(終濃度0.3mM)、Tris-HCl(pH8.0)(終濃度100mM)、エンドトキシン(製品名 USP-Reference Standard Endotoxin、生化学バイオビジネス(株)販売)(検体濃度0、0.05又は0.5EU/mL)50μLをウェルに添加し、混合した後、37℃で3時間インキュベートして、経時的に405nmの吸光度を測定した。陰性対照として蒸留水を用いた。かかる吸光度の増加の速度(吸光度変化率)は、プロクロッティングエンザイムの活性化能を反映する。なお、「EU」とは「エンドトキシンユニット」であり、エンドトキシン量を示す単位である(以下、同じ)。
(2-3-1)ウイルス法により発現されるファクターCの安定性
実施例1のウイルス法の(1-1-2)のウイルス感染細胞を28℃で振とう培養する工程において、培養後48時間、72時間、96時間の各タイミングで上清を回収し、これをSDS存在下、5-20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(非還元条件下)に供した
後、抗ファクターC抗体(2C12。前記と同じ。)を用いたウエスタンブロット法によりファクターCの残存量を評価した。また、別途、ウイルス感染後24時間目に培養液にプロテアーゼ阻害剤(終濃度0.5μg/mLのロイペプチン+終濃度0.7μg/mLのペプスタチンA)を添加したものについても、同様にサンプリングして分析した。
同様に、実施例1の安定発現細胞株法の(1-2-1)の安定発現細胞株を28℃で振とう培養する工程において、培養後72時間、96時間、120時間、144時間、168時間の各タイミングで上清を回収し、これをSDS存在下、5-20%ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(非還元条件下)に供した後、抗ファクターC抗体(2C12。前記と同じ。)を用いたウエスタンブロット法によりファクターCの残存量を評価した。また、ウイルス法の培養後48時間目の上清についても、併せてアプライした。
ウイルス法における、(1-1-4)の中空糸ろ過膜による処理の必要性を検討した。(1-1-4)における中空糸膜ろ過前の各溶液、同ろ過後の各溶液(3ロット)を用いて、前記(2-2)と同様の方法で、エンドトキシン(USP-RSE)を終濃度0又は0.05EU/mL添加した場合の、吸光度の増加の速度(吸光度変化率)を測定した。
(3-1)エンドトキシン測定剤1を用いた測定
前記エンドトキシン測定剤1(凍結乾燥物)に、3.3mLの100mM Tris(pH8.0)緩衝液を添加して溶解した。この溶液中における、ファクターC、ファクターB及びプロクロッティングエンザイムを含む培養上清のタンパク質濃度は、各々、約60μg/mLである。
96穴マイクロタイタープレートのウェルに濃度0、0.001、0.01、又は0.1EU/mLのエンドトキシン溶液50μLを分注し、溶解したエンドトキシン測定剤溶液50μLを添加、混合した後、37℃で30分間インキュベートして、405nmにおける吸光度を経時的に測定することによる反応速度法により、エンドトキシン濃度を測定した。この反応液中における、ファクターC、ファクターB及びプロクロッティングエンザイムを含む培養上清のタンパク質濃度は、各々、約30μg/mLである。
前記エンドトキシン測定剤2(凍結乾燥物)に、3.3mLの100mM Hepes(pH7.6)緩衝液を添加して溶解した。この溶液中における、ファクターC、ファク
ターB及びプロクロッティングエンザイムを含む培養上清のタンパク質濃度は、各々、約60μg/mLである。
96穴マイクロタイタープレートのウェルに濃度0、0.0005、0.001、0.005、0.01、又は0.1EU/mLのエンドトキシン溶液50μLを分注し、溶解したエンドトキシン測定剤溶液50μLを添加、混合した後、37℃で30分間インキュベートして、405nmにおける吸光度を経時的に測定することによる反応速度法により、エンドトキシン濃度を測定した。この反応液中における、ファクターC、ファクターB及びプロクロッティングエンザイムを含む培養上清のタンパク質濃度は、各々、約30μg
/mLである。
(4-1)組換えFactor Cタンパク質と天然Factor Cタンパク質の精製
抗Factor C抗体(2C12、前記と同様)2mgをセファロースカラム1ml(ジーイーヘル
スケア(GE helthcare)社)に共有結合させてFactor C抗体カラムを2本作製した。作製方法は添付の説明書に従った。上述「(1-2-2)組換えタンパク質の回収」と同様の処理で調製した安定発現細胞法由来の組換えFactor Cタンパク質を含む培養上清液76mLに等量の2M 塩化ナトリウムと2mMEDTAを含む20mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0)を加えて薄めた後に、Factor C抗体カラム1本にかけた。カブトガニ血球細胞の抽出液76mLに対しても同様に等量の2M 塩化ナトリウムと2mMEDTAを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を添加
して薄めた後、もう一方のFactor C抗体カラムにかけた。両カラム共に、200mMまたは450mMの塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、各20mLで順次洗浄後、50mM グリシン緩衝液(pH2.5)で溶出をおこなった。1M Trizma base(シグマ(Sigma)社)0.025mLを予め添加した1.5mLのチューブに対し、溶出画分1mLを回収して溶出液のpHを中
性に戻した。
精製した組換えおよび天然Factor Cタンパク質の溶出画分をSDS存在下、5-20%ポリアクリルアミド電気泳動(非還元条件下)で分離した。その際に同一ゲルに濃度が既知の精製牛血清アルブミン(=BSA)を濃度参照サンプルとして分離した(図10)。クマシーブリリアントブルー染色したゲルのBSAバンド強度をデンシトメーターで定量してBSAタンパク質濃度とプロットし検量線を作成した(図11)。精製したFactor Cのタンパク質のバンド強度と検量線から精製Factor Cタンパク質の濃度を概算した。その結果、精製サンプルについて、天然Factor Cタンパク質の方が組換えFactor Cタンパク質よりも約4倍濃度が
濃いことが判明した。
精製した組換えおよび天然由来のFactor Cタンパク質を使用して、活性の比較をおこな
った。この際に(4-2)の結果より、精製Factor Cのタンパク質濃度を揃えた。96穴マイクロタイタープレートのウェルに濃度0、0.05、0.1、又は0.5EU/mLのエンドトキシン溶液50μLを分注した。Tris(pH8.0)緩衝液が50mM、精製Factor Cタンパク質が0.2μg/mL、組換えFactor Bと組換えプロクロッティングエンザイ
ムを含む培養上清がそれぞれ30μg/mL、合成基質Boc-Leu-Gly-Arg-pNAが0.3 mMになるように添加し、反応液の総体積が100μLになるように注射用水で調製した。37℃で30分間インキュベートして、405nmにおける吸光度を経時的に測定することによる反応速度法による解析をおこなった。
然Factor Cよりも比活性が優れていることを示唆している。
配列番号1:日本産カブトガニのファクターC遺伝子のDNA配列
配列番号2:日本産カブトガニのファクターCのアミノ酸配列
配列番号3:日本産カブトガニのファクターB遺伝子のDNA配列
配列番号4:日本産カブトガニのファクターBのアミノ酸配列
配列番号5:日本産カブトガニのプロクロッティングエンザイム遺伝子のDNA配列
配列番号6:日本産カブトガニのプロクロッティングエンザイムのアミノ酸配列
配列番号7:Hisタグ付ファクターC遺伝子のDNA配列
配列番号8:昆虫細胞での発現にコドンを最適化したファクターB遺伝子のDNA配列
配列番号9:昆虫細胞での発現にコドンを最適化したプロクロッティングエンザイム遺伝子のDNA配列
配列番号10:HisタグなしファクターC遺伝子作成用プライマー
配列番号11:HisタグなしファクターC遺伝子作成用プライマー
配列番号12:ペプチド配列
Claims (1)
- 下記のタンパク質(1)~(3)を含むエンドトキシン測定剤であって、該タンパク質(1)~(3)の各々は昆虫細胞をホストとして発現することにより得られる組換えタンパク質である、測定剤。
(1)タキプレウス・トリデンタツス(Tachypleus tridentatus)由来のファクターCであって、C末端にHisタグ配列を有さないファクターC。
(2)カブトガニのファクターB。
(3)カブトガニのプロクロッティングエンザイム。
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