KR101954685B1

KR101954685B1 - 뎅기열 바이러스 ns1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101954685B1
Application number: KR1020170109261A
Authority: KR
Inventors: 김성현; 방진호
Original assignee: 한국세라믹기술원
Priority date: 2017-08-29
Filing date: 2017-08-29
Publication date: 2019-05-23

Abstract

본 발명은 뎅기열 바이러스 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체, 상기 어피바디 동종이량체를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 어피바디 동종이량체를 포함하는 뎅기열 바이러스 진단용 약제학적 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

뎅기열 바이러스 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체 및 그의 용도{AFFIBODY HOMODIMER SPECIFIC TO DENGUE VIRUS NS1}

뎅기열은 뎅기열 바이러스에 의한 급성 열병으로 모기에 의해 매개되는 질환이다. 뎅기열 바이러스는 분류학상 플라비바이러스과 (Flaviviridae)의 플라비바이러스속(Flavivirus)에 속하는 양성 단일가닥(positive, single strand)의 RNA를 유전물질로 갖는 구형의 바이러스로, 웨스트나일 바이러스 (West Nile virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 진드기 매개뇌염 바이러스 (Tick-borne encephalitis virus) 및 황열 바이러스 (Yellow fever virus )등도 같은 종들이다. 대부분은 절지 동물 (모기 또는 진드기)에 의해 전염되기 때문에 아르보 바이러스 (arthropod-borne virus)라고도 불리기도 한다. 뎅기열 바이러스는 4개 (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4)의 혈청형을 갖고 있으며, 이 4개의 혈청형들은 약 60~90%의 서열 상동성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 하나의 혈청형에 의해 1 차 감염되면 그 혈청형에 대한 면역성을 갖지만, 이후 나머지 3 개중 하나의 혈청형에 의해 2차 감염이 발생할 수 있는데, 2차 감염이 되면 뎅기 바이러스 특성에 따른 항원-항체 복합체에 의한 보체 활성화에 기인하여 뎅기 출혈열 (dengue hemorrhagic fever) 또는 뎅기열 쇼크 증후군 (dengue shock syndrome)과 같은 중증 뎅기열이 발병하여 1차 질병에 비해 더 심각한 징후를 초래하기도 한다.

뎅기열 바이러스는 약 10.6 Kbp 크기의 작고 외피가 있는 구조로, 약 11000 염기쌍으로 이루어져 있는 한 가닥의 양성 센스 RNA 게놈을 가지고 있고, 이 RNA 게놈은 3 개의 구조 단백질 (캡시드 단백질, 막 단백질, 엔벨로프 단백질) 및 7 개의 비구조 단백질 (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5)을 만들어 낸다. 이들 비구조 단백질들의 역할은 바이러스 생존에 필수적인 수용체 결합, 적혈구 응집 및 중화 항체 (Ab)의 유도 및 방어 면역 반응과 같은 생물학적 특성과 바이러스 복제 및 조립과정 등에 영향을 주는 등의 중요한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 특히, 뎅기열 바이러스의 비구조 당 단백질인 NS1은 ~40KDa 의 기본 폴리 펩타이드에서 352 아미노산 잔기를 함유하고 12개의 불변 시스테인 잔기 및 2개의 N-글리코실화 부위를 갖고 있는 구조이다. 일부 연구에 의하면, 세포 내 NS1 당단백질은 바이러스 복제에 직-간접적으로 관여를 하며, 면역원성 복합체 형성에 영향을 주어 보체-매개성 (complement-mediated) 경로 및 항체-의존성 세포독성 (antibody-dependent cell cytotoxicity)의 원인이 되어 더 심한 형태의 합병증을 유발하는 것으로도 알려져 있다. 발병 후, 적어도 3~5일 이후에 검출되는 IgM 및 IgG 항체들과는 다르게 NS1 단백질은 바이러스 복제 과정에서 세포 표면과 결합하여 조기 증상의 발병 1일 후에 순환계로 방출되어, 임상 증상이 나타나기 직전의 감염된 사람의 혈청에서 급속히 농도가 증가하며 약 9일 정도까지 혈액에서 높은 농도로 검출이 된다. 따라서, 뎅기열 감염에 있어서 조기 진단이 중요하다.

현재까지 알려진 뎅기열에 대한 진단 방법은 환자의 혈청이나 조직에서 바이러스를 직접 검출하거나, 바이러스핵산 검사를 위한 중합 효소 연쇄 반응방법 (polymerase chain reaction), 또는 숙주 반응 테스트를 위한 숙주 항체 (IgM, IgG)에 대한 혈청검사이다. 그 외에도 바이러스 배양, 면역 분석, 형광 분석, 또는 질량분석법 등에 의한 항원 검출법이 사용되고 있다. 그러나, 사용되고 있는 방법들의 경우, 진단을 위한 대부분의 장비가 고가이고 숙련된 인력이 필요하기 때문에, 발병이 되고 있는 지역 특성상 사용에 제한적인 점이 있다. 그리고 일부 혈청검사의 경우 교차반응으로 인해 각각의 혈청형을 구분하기 어렵고, 유사 바이러스의 존재 시에는 중복검출로 인해 진단 결과에 대한 신뢰도가 낮다는 단점이 있다. 또한, 대부분의 진단 방법이 1차 감염과 비교하여 2차 감염 진단시에 감수성이 떨어진다고 알려져 있으며, 특히 혈청학적 방법으로는 질병의 초기 단계에서 뎅기 바이러스의 감염 진단이 불가능할 수 있다. 따라서, 뎅기열 바이러스 감염의 진단 및 치료를 위해 효율적으로 뎅기열 바이러스를 효율적으로 감출할 수 있는 진단 검사 방법의 개발이 필요하다.

한편, 어피바디(affibody)는 인공 단백질의 일종으로 인공항체의 일종이기도 하다. 황색포도구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A(SPA) 중 IgG 결합 영역인 58 아미노산 잔기를 사용한다. IgG와 결합 면을 형성하는 13 아미노산 잔기 부분을 무작위적인 배열과 치환한 라이브러리(library)를 구축하고, 그중에서 표적물질과 특이적으로 결합하는 것을 선별하는 것으로서 표적물질에 대한 어피바디(affibody)를 취득하게 된다. 어피바디(affibody)는 약 150kDa인 항체와 비교하면 약 6kDa 정도로 분자 크기가 작기 때문에 조직을 깊게 투과하기 쉬운 성질을 갖추고, 또한 열 또는 알칼리 등에 대한 내성도 갖는 등인 이점도 있다. 또한 어피바디는 박테리아를 이용해서 대량 생산하기 때문에 동물세포에서 생산하는 항체에 비해 저렴하게 제작할 수 있다. 그리고, 어피바디는 분자 조영제로서 이용 또는 친화력(affinity) 분리 등에도 이용되고 있다.

본 발명자들은 특허출원 제10-2017-0028901호에서 뎅기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 어피바디를 개시한바 있다. 더 나아가, 본 발명자들은 상기 뎅기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 어피바디의 뎅기열 바이러스에 대한 특이성과 결합능을 더욱 향상시키기 위하여 예의 노력한 결과, 특정의 아미노산 서열로 이루어진 링커를 이용하여 어피바디 동종이량체를 제작하는 경우, 종래 어피바디에 비해 뎅기열 바이러스에 대한 특이성과 결합능이 더욱 향상됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 뎅기열 바이러스 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체, 상기 어피바디 동종이량체를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 어피바디 동종이량체를 포함하는 뎅기열 바이러스 진단용 약제학적 조성물 및 키트를 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “동종이량체(homodimer)"는 같은 단백질이 서로 두 개가 상호작용하여 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "특이적으로 결합(specifically binding)"은 상기 어피바디 동종이량체가 뎅기열 바이러스 NS1 이외의 다른 뎅기열 바이러스 항원에 실질적으로 결합하지 않거나 친화도에서 큰 차이를 보여 뎅기열 바이러스 NS1과 다른 항원의 구별을 가능하게 하는 것을 의미한다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은 어피바디1-링커-어피바디2로 이루어진 뎅기열 바이러스 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체를 제공하고자 하는 것으로,

상기 어피바디1은 하기의 화학식 1의 아미노산 서열로 이루어지고,

[화학식 1]

VDNKFNKE-X¹-X²-X³-A-X⁴-X⁵-EI-X⁶-X⁷-LPNLN-X⁸-X⁹-Q-X¹⁰-X¹¹-AFI-X¹²-SL-X¹³-DDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA

(상기 식에서,

X1은 페닐알라닌(F) 또는 글라이신(G) 잔기이고,

X2은 아스파르트산(D), 티로산(Y) 또는 발린(V) 잔기이고,

X3은 시스테인(C) 또는 메티오닌(M) 잔기이고,

X4은 류신(L), 세린(S) 또는 티로산(Y) 잔기이고,

X5은 발린 (V) 잔기이고,

X6은 발린(V) 또는 류신(L) 잔기이고,

X7은 류신(L), 트립토판(W) 또는 아르기닌(R) 잔기이고,

X8은 발린(V) 또는 아스파라긴(N) 잔류신기이고,

X9은 페닐알라닌(F), 라이신(K) 또는 세린(S) 잔기이고,

X10은 아이소류신(I), 글라이신(G) 또는 메티오닌(M) 잔기이고,

X11은 발린(V), 글루타민(Q) 또는 아스파라긴(N) 잔기이고,

X12은 세린(S) 또는 트레오닌(T) 잔기이고,

X13은 세린(S), 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 잔기이고,

나머지 문자는 아미노산의 단문자 표기이다)

상기 링커는 (SSSSG)n의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 n은 1 내지 20의 정수를 나타내고,

상기 어피바디2는 상기 어피바디1과 동일한 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “아미노산”은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 또한, 상기 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 변역 후 변형은 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예를 들면, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예를 들면, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예를 들면, 이황화물 브릿지의 형성)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 상기 펩티드는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수도 있다. 인공 변이체뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 상기 보존성 치환은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)을 포함할 수 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 기술분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체로, 용어 “핵산”과 동등한 의미로 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA), 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid: PNA) 분자를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 어피바디 동종이량체에 있어서, 상기 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 어피바디 동종이량체에 있어서, 상기 링커는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 어피바디 동종이량체에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 어피바디 동종이량체에 있어서, 상기 어피바디 동종이량체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 어피바디 동종이량체에 있어서, 상기 어피바디 동종이량체는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 상기 제1구현예에 따른 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 의미한다. 상기 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pACYC184 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 상기 형질전환 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아-매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "숙주세포"는 다른 미생물 또는 유전자를 기생시켜 영양을 공급하는 세포로, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로써 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 같은 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 락토바실러스와 엔테로코커스 등 유산균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

제3구현예에 따르면,

본 발명은 상기 제1구현예에 따른 뎅기열 바이러스 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체를 포함하는 뎅기열 바이러스 진단용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 객체의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 (예를 들면, 뎅기열 바이러스의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후 (prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스 (therametrics) (예를 들면, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

제4구현예에 따르면,

본 발명은 상기 제1구현예에 따른 뎅기열 바이러스 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체를 포함하는 뎅기열 바이러스 진단용 키트를 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 어피바디 동종이량체는 종래 어피바디 보다 높은 친화력으로 뎅기열 바이러스의 NS1에 결합할 수 있으므로, 뎅기열 바이러스 NS1의 진단에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 실시예 1에 따른 NS1@Affibody-linker-Affibody homodimer의 스킴을 나타낸다.
도 2은 실시예 2에 따른 NS1@Affibody12-Affibody12 homodimer의 발현 및 정제 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 2에 따른 NS1@Affibody12와 NS1@Affibody12-Affibody12 homodimer의 크기 차이를 나타낸다.
도 4는 실험예 3에 따른 NS1@Affibody12 및 NS1@Affibody12-Affibody12 homodimer의 결합능 측정 결과를 나타낸다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1 : NS1@Affibody12-Affibody12 homodimer 제작

NS1 특이적인 Affibody12-linker(SSSSG)n-Affibody12의 유전자를 아래와 같이 합성하고 (Bioneer, Daejeon, Korea), 그 다음 expression vector인 pBT7-N-His에 클로닝하였다.

5‘-GTAGACAACAAATTCAACAAAGAATTTGATTGTGCGTTGGTGGAGATCGTGCTTTTACCTAACTTAAACGTTTTTCAAATTGTTGCCTTCATCAGTAGTTTATCGGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACTTGCTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCACAGGCGCCGAAAGCGGCCAGCTCTAGTTCCGGTTCATCGAGCAGTGGCTCTTCCTCATCGGGTAGCAGTTCTTCGGGGGTAGACAACAAATTCAACAAAGAATTTGATTGTGCGTTGGTGGAGATCGTGCTTTTACCTAACTTAAACGTTTTTCAAATTGTTGCCTTCATCAGTAGTTTATCGGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACTTGCTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCACAGGCGCCGAAAGCGGCCTGCTGA-3’ (서열번호 7)

실시예 2: NS1@Affibody12-Affibody12 homodimer의 발현 및 정제

상기　실시예 1에서 제조된 NS1@Affibody12-Affibody12 homodimer의 유전자가 들어간 vector를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/ml)이 포함된 5ml의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1ml을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/ml)이 포함된 20ml의 LB 배지에 stock 100ul를 접종하여 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/ml)이 포함된 400ml의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 15℃에서 220rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000xg로 10분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 Isopropanol 1ml에 녹인 후 용해된 E. coli에 1ml 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 증류수와 라이시스 버퍼로 Ni-NTA 친화성 레진(Elposbio, Daejeon, Korea)을 세척한 후 상층액을 레진에 결합시켰다. Washing buffer(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 40mM imidazole) 500ml로 washing 후 일루션 버퍼(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 250mM imidazole)을 이용하여 N-말단 His-tag Affibody homodimer 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Centrifugal Filter(Merck Milipore Ltd, lreland)에 넣고 4℃에서 4,000rpm의 속도로 10min 원심 분리하여 농축 후 PBS를 넣고 같은 방법으로 5회 Buffer change하여 순도 높은 Affibody12-Affibody12 homodimer 단백질을 얻었다 (도 2).

실험예 3. NS1에 대한 NS1@Affibody12-Affibody12 homodimer의 ELISA를 통한 결합능 측정

NS1에 대한 Affibody12-Affibody12 homodimer의 결합능을 측정하고자 Affibody12와 비교하였다. 96웰 ELISA 플레이트에 5 ug/㎖의 NS1을 각 웰당 50㎕씩 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰의 단백질을 제거하고 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블록킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. Affibody12-Affibody12 homodimer를 1uM, 2.5uM, 5uM, 10uM, 20uM, 40uM로 만들고 Affibody12는 1uM, 2.5uM, 5uM, 10uM, 20uM, 40uM, 80uM, 160uM로 만들어 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블록킹한 뒤 well에 각각 100ul씩 분주 하였다. 이후 상온에서 1시간 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 anti-Affibody-antibody를 1:1,000으로 희석하여 100㎕씩 분주하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 0.1% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 secondary antibody를 1:2,000으로 희석하여 100㎕씩 분주하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척한 후 TMB용액 100㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 4로부터 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 NS1@Affibody12-Affibody12 homodimer의 결합능이 NS1@Affibody12에 비해 현저히 우수함이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Institute of Ceramic Engineering and Technology <120> AFFIBODY HOMODIMER SPECIFIC TO DENGUE VIRUS NS1 <130> DP-2017-0162 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LINKER <400> 1 Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser 1 5 10 15 Ser Ser Ser Gly 20 <210> 2 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LINKER <400> 2 agctctagtt ccggttcatc gagcagtggc tcttcctcat cgggtagcag ttcttcgggg 60 g 61 <210> 3 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AFFIBODY <400> 3 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Asp Cys Ala Leu Val Glu Ile 1 5 10 15 Val Leu Leu Pro Asn Leu Asn Val Phe Gln Ile Val Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60 <210> 4 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AFFIBODY <400> 4 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gly Tyr Met Ala Ser Val Glu Ile 1 5 10 15 Leu Trp Leu Pro Asn Leu Asn Asn Lys Gln Gly Gln Ala Phe Ile Thr 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60 <210> 5 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AFFIBODY <400> 5 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Val Cys Ala Tyr Val Glu Ile 1 5 10 15 Leu Arg Leu Pro Asn Leu Asn Asn Ser Gln Met Asn Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60 <210> 6 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AFFIBODY HOMODIMER <400> 6 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Asp Cys Ala Leu Val Glu Ile 1 5 10 15 Val Leu Leu Pro Asn Leu Asn Val Phe Gln Ile Val Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Ser Ser 50 55 60 Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly 65 70 75 80 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Asp Cys Ala Leu Val Glu Ile 85 90 95 Val Leu Leu Pro Asn Leu Asn Val Phe Gln Ile Val Ala Phe Ile Ser 100 105 110 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 115 120 125 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala Cys 130 135 140 <210> 7 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFFIBODY HOMODIMER <400> 7 gtagacaaca aattcaacaa agaatttgat tgtgcgttgg tggagatcgt gcttttacct 60 aacttaaacg tttttcaaat tgttgccttc atcagtagtt tatcggatga cccaagccaa 120 agcgctaact tgctagcaga agctaaaaag ctaaatgatg cacaggcgcc gaaagcggcc 180 agctctagtt ccggttcatc gagcagtggc tcttcctcat cgggtagcag ttcttcgggg 240 gtagacaaca aattcaacaa agaatttgat tgtgcgttgg tggagatcgt gcttttacct 300 aacttaaacg tttttcaaat tgttgccttc atcagtagtt tatcggatga cccaagccaa 360 agcgctaact tgctagcaga agctaaaaag ctaaatgatg cacaggcgcc gaaagcggcc 420 tgctga 426

Claims

어피바디1-링커-어피바디2로 이루어진 뎅기열 바이러스 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체로서,
상기 어피바디 동종이량체는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인, 어피바디 동종이량체.
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제1항에 있어서,
상기 어피바디 동종이량체는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열로 코딩되는 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인, 어피바디 동종이량체.
제1항 또는 제6항에 따른 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 재조합 벡터.
제1항 또는 제6항에 따른 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 뎅기열 바이러스 진단용 약제학적 조성물.
제1항 또는 제6항에 따른 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 뎅기열 바이러스 진단용 키트.