KR101885573B1 - 뎅기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 어피바디 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뎅기열 바이러스 NS1 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디(Affibody)를 코딩하기 위한 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 뎅기 바이러스 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하는 조성물과 상기 어피바디 및 조성물을 이용한 뎅기열 바이러스 진단을 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 뎅기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 어피바디에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 뎅기열 바이러스 NS1 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디(Affibody)를 코딩하기 위한 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 뎅기 바이러스 NS1에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하는 조성물, 상기 어피바디 및 조성물을 이용한 뎅기열 바이러스 진단을 위한 방법에 관한 것이다.
뎅기열은 뎅기열 바이러스에 의한 급성 열병으로 모기에 의해 매개되는 질환이다. 뎅기열 바이러스는 분류학상 플라비바이러스과 (Flaviviridae)의 플라비바이러스속(Flavivirus)에 속하는 양성 단일가닥(positive, single strand)의 RNA를 유전물질로 갖는 구형의 바이러스로, 웨스트나일 바이러스 (West Nile virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 진드기 매개뇌염 바이러스 (Tick-borne encephalitis virus) 및 황열 바이러스 (Yellow fever virus )등도 같은 종들이다. 대부분은 절지 동물 (모기 또는 진드기)에 의해 전염되기 때문에 아르보 바이러스 (arthropod-borne virus)라고도 불리기도 한다.
뎅기열 바이러스는 4개 (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4)의 혈청형을 갖고 있으며, 이 4개의 혈청형들은 약 60~90%의 서열 상동성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 하나의 혈청형에 의해 1 차 감염되면 그 혈청형에 대한 면역성을 갖지만, 이후 나머지 3 개중 하나의 혈청형에 의해 2차 감염이 발생할 수 있는데, 2차 감염이 되면 뎅기 바이러스 특성에 따른 항원-항체 복합체에 의한 보체 활성화에 기인하여 뎅기 출혈열 (dengue hemorrhagic fever) 또는 뎅기열 쇼크 증후군 (dengue shock syndrome)과 같은 중증 뎅기열이 발병하여 1차 질병에 비해 더 심각한 징후를 초래하기도 한다.
뎅기열 바이러스는 약 10.6 Kbp 크기의 작고 외피가 있는 구조로, 약 11000 염기쌍으로 이루어져 있는 한 가닥의 양성 센스 RNA 게놈을 가지고 있고, 이 RNA 게놈은 3 개의 구조 단백질 (캡시드 단백질, 막 단백질, 엔벨로프 단백질) 및 7 개의 비구조 단백질 (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5)을 만들어 낸다.
이들 비구조 단백질들의 역할은 바이러스 생존에 필수적인 수용체 결합, 적혈구 응집 및 중화 항체 (Ab)의 유도 및 방어 면역 반응과 같은 생물학적 특성과 바이러스 복제 및 조립과정 등에 영향을 주는 등의 중요한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다.
특히, 뎅기열 바이러스의 비구조 당 단백질인 NS1은 ~40KDa 의 기본 폴리 펩타이드에서 352 아미노산 잔기를 함유하고 12개의 불변 시스테인 잔기 및 2개의 N-글리코실화 부위를 갖고 있는 구조이다. 일부 연구에 의하면, 세포 내 NS1 당단백질은 바이러스 복제에 직-간접적으로 관여를 하며, 면역원성 복합체 형성에 영향을 주어 보체-매개성 (complement-mediated) 경로 및 항체-의존성 세포독성 (antibody-dependent cell cytotoxicity)의 원인이 되어 더 심한 형태의 합병증을 유발하는 것으로도 알려져 있다.
발병 후, 적어도 3~5일 이후에 검출되는 IgM 및 IgG 항체들과는 다르게 NS1 단백질은 바이러스 복제 과정에서 세포 표면과 결합하여 조기 증상의 발병 1일 후에 순환계로 방출되어, 임상 증상이 나타나기 직전의 감염된 사람의 혈청에서 급속히 농도가 증가하며 약 9일 정도까지 혈액에서 높은 농도로 검출이 된다. 따라서, 뎅기열 감염에 있어서 조기 진단이 중요하다.
현재까지 알려진 뎅기열에 대한 진단 방법은 환자의 혈청이나 조직에서 바이러스를 직접 검출하거나, 바이러스핵산 검사를 위한 중합 효소 연쇄 반응방법 (polymerase chain reaction), 또는 숙주 반응 테스트를 위한 숙주 항체 (IgM, IgG)에 대한 혈청검사이다. 그 외에도 바이러스 배양, 면역 분석, 형광 분석, 또는 질량분석법 등에 의한 항원 검출법이 사용되고 있다.
그러나, 사용되고 있는 방법들의 경우, 진단을 위한 대부분의 장비가 고가이고 숙련된 인력이 필요하기 때문에, 발병이 되고 있는 지역 특성상 사용에 제한적인 점이 있다. 그리고 일부 혈청검사의 경우 교차반응으로 인해 각각의 혈청형을 구분하기 어렵고, 유사 바이러스의 존재 시에는 중복검출로 인해 진단 결과에 대한 신뢰도가 낮다는 단점이 있다. 또한, 대부분의 진단 방법이 1차 감염과 비교하여 2차 감염 진단시에 감수성이 떨어진다고 알려져 있으며, 특히 혈청학적 방법으로는 질병의 초기 단계에서 뎅기 바이러스의 감염 진단이 불가능할 수 있다.
따라서, 뎅기열 바이러스 감염의 진단 및 치료를 위해 효율적으로 뎅기열 바이러스를 효율적으로 감출할 수 있는 진단 검사 방법의 개발이 필요하다.
어피바디(affibody)는 인공 단백질의 일종으로 인공항체의 일종이기도 하다. 황색포도구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A(SPA) 중 IgG 결합 영역인 58 아미노산 잔기를 사용한다. IgG와 결합 면을 형성하는 13 아미노산 잔기 부분을 무작위적인 배열과 치환한 라이브러리(library)를 구축하고, 그중에서 표적물질과 특이적으로 결합하는 것을 선별하는 것으로서 표적물질에 대한 어피바디(affibody)를 취득하게 된다.
어피바디(affibody)는 약 150kDa인 항체와 비교하면 약 6kDa 정도로 분자 크기가 작기 때문에 조직을 깊게 투과하기 쉬운 성질을 갖추고, 또한 열 또는 알칼리 등에 대한 내성도 갖는 등인 이점도 있다. 또한 어피바디는 박테리아를 이용해서 대량 생산하기 때문에 동물세포에서 생산하는 항체에 비해 저렴하게 제작할 수 있다. 그리고, 어피바디는 분자 조영제로서 이용 또는 친화력(affinity) 분리 등에도 이용되고 있다.
그러나, 어피바디(affibody)를 이용한 뎅기열 바이러스의 진단 방법은 개발되지 않고 있었다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 뎅기열 바이러스의 감염 1일에 분비되는 NS1 단백질을 특이적으로 검출하여 감염 여부를 진단하는데 활용될 수 있는 새로운 어피바디를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 하기 화학식 1 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 뎅기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 어피바디를 제공한다.
[화학식 1]
VDNKFNKE-X1-X2-X3-A-X4-X5-EI-X6-X7-LPNLN-X8-X9-Q-X10-X11-AFI-X12-SL-X13-DDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
X1 은 페닐알라닌(F) 또는 글라이신(G) 잔기이고,
X2 은 아스파르트산(D), 티로산(Y) 또는 발린(V) 잔기이고,
X3 은 시스테인(C) 또는 메티오닌(M) 잔기이고,
X4 은 류신(L), 세린(S) 또는 티로산(Y) 잔기이고,
X5 은 발린 (V) 잔기이고,
X6 은 발린(V) 또는 류신(L) 잔기이고,
X7은 류신(L), 트립토판(W) 또는 아르기닌(R) 잔기이고,
X8 은 발린(V) 또는 아스파라긴(N) 잔류신기이고,
X9 은 페닐알라닌(F), 라이신(K) 또는 세린(S) 잔기이고,
X10 은 아이소류신(I), 글라이신(G) 또는 메티오닌(M) 잔기이고,
X11 은 발린(V), 글루타민(Q) 또는 아스파라긴(N) 잔기이고,
X12 은 세린(S) 또는 트레오닌(T) 잔기이고,
X13 은 세린(S), 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 잔기이고,
나머지 문자는 아미노산의 단문자 표기이다.
본 발명에 의한 뎅기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 어피바디는 이하의 서열번호 1 내지 3 의 아미노산 서열로 구성된 그룹에서 선택되는 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
VDNKFNKEFDCALVEIVLLPNLNVFQIVAFISSLSDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA(서열번호 1)
VDNKFNKEGYMASVEILWLPNLNNKQGQAFITSLRDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA(서열번호 2)
VDNKFNKEFVCAYVEILRLPNLNNSQMNAFISSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA(서열번호 3)
본 발명에 의한 어피바디는 뎅기열 바이러스의 NS1 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 뎅기열 바이러스 NS1 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 분자를 포함하는 뎅기열 바이러스 NS1 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 뎅기열 바이러스 NS1 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 약제학적 유효량으로 포함하는 뎅기열 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 의한 어피바디는 뎅기열 바이러스의 NS1 에 특이적으로 결합하기 때문에, 본 발명에 의한 어피바디를 이용하면 뎅기열 바이러스 감염 1일에 분비되는 NS1 단백질을 특이적으로 검출함으로써, 증상이 나타나기 전에 미리 질병을 진단할 수 있는 효과를 나타낸다.
도 1은 각 패닝 단계에서 회수한 output 파아지/input 파아지 비율을 나타낸다.
도 2는 어피바디 라이브러리를 이용한 NS1 바이오패닝 과정 중 4차 단계에서 회수한 50개 재조합 파아지의 NS1 및 Streptavidin에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 3은 박테리아를 이용해서 발현 후 정제한 어피바디12,16,46을 나타낸다. SDS-PAGE 상을 보면 크기가 약 7 kDa, 순도가 90% 이상으로 정제됨을 볼 수 있다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 의한 어피바디 12의 NS1 특이성에 대한 ELISA 검사결과를 나타낸다. (NS1: NS1 influenza protein, Str: Streptoavidin, VEGF: Vascular endothelial growth factor)
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 어피바디 16의 NS1 특이성에 대한 ELISA 검사결과를 나타낸다. (NS1: NS1 influenza protein, Str: Streptoavidin, VEGF: Vascular endothelial growth factor)
도 6는 본 발명의 일 실시예에 의한 어피바디 46의 NS1 특이성에 대한 ELISA 검사결과를 나타낸다. (NS1: NS1 influenza protein, Str: Streptoavidin, VEGF: Vascular endothelial growth factor)
도 7은 어피바디 12,16,46의 SPR 바이오칩을 이용하여 NS1에 대해 결합 테스트 결과를 나타낸다.
도 8은 어피바디 12의 SPR 바이오칩을 이용하여 NS1에 대해 친화력 (Kd = 1uM) 결과를 나타낸다.
도 9은 어피바디 16의 SPR 바이오칩을 이용하여 NS1에 대해 친화력 (Kd = 4uM) 결과를 나타낸다.
도 10은 어피바디 46의 SPR 바이오칩을 이용하여 NS1에 대해 친화력 (Kd = 15uM) 결과를 나타낸다.
도 2는 어피바디 라이브러리를 이용한 NS1 바이오패닝 과정 중 4차 단계에서 회수한 50개 재조합 파아지의 NS1 및 Streptavidin에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 3은 박테리아를 이용해서 발현 후 정제한 어피바디12,16,46을 나타낸다. SDS-PAGE 상을 보면 크기가 약 7 kDa, 순도가 90% 이상으로 정제됨을 볼 수 있다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 의한 어피바디 12의 NS1 특이성에 대한 ELISA 검사결과를 나타낸다. (NS1: NS1 influenza protein, Str: Streptoavidin, VEGF: Vascular endothelial growth factor)
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 어피바디 16의 NS1 특이성에 대한 ELISA 검사결과를 나타낸다. (NS1: NS1 influenza protein, Str: Streptoavidin, VEGF: Vascular endothelial growth factor)
도 6는 본 발명의 일 실시예에 의한 어피바디 46의 NS1 특이성에 대한 ELISA 검사결과를 나타낸다. (NS1: NS1 influenza protein, Str: Streptoavidin, VEGF: Vascular endothelial growth factor)
도 7은 어피바디 12,16,46의 SPR 바이오칩을 이용하여 NS1에 대해 결합 테스트 결과를 나타낸다.
도 8은 어피바디 12의 SPR 바이오칩을 이용하여 NS1에 대해 친화력 (Kd = 1uM) 결과를 나타낸다.
도 9은 어피바디 16의 SPR 바이오칩을 이용하여 NS1에 대해 친화력 (Kd = 4uM) 결과를 나타낸다.
도 10은 어피바디 46의 SPR 바이오칩을 이용하여 NS1에 대해 친화력 (Kd = 15uM) 결과를 나타낸다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
1 :
어피바디
라이브러리 제작
어피바디
제작 및
파아지미드
벡터에의 삽입
뎅기 바이러스 NS1 어피바디의 최적화 라이브러리를 만들기 위해서, 서열번호 4 및 5로 표시되는 NS1의 h1-h2 부분에 대한 두 개의 올리고뉴클레오티드 Affibody-F1 및 Affibody-B1 (N은 A, T, G 또는 C; K는 G 또는 T; M은 C 또는 A)를 합성하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea).
5'-TTCTATGCGGCCCAGCTGGCCGTAGACAACAAATTCAACAAAGAANNKNNKNNKGCGNNKNNKGAGA TCNNKNNKTTACCTAACTTAAAC-3'(서열변호 4)
5'-AGCTTCTGCTAGCAAGTTAGCGCTTTGGCTTGGGTCATCMNNTAAACTMNNGATGAAGGCMNNMNNT TGMNNMNNGTTTAAGTTAGGTAA-3'(서열번호 5)
이중 사슬을 만들기 위해서 Affibody-F1 4μM, Affibody-B1 4μM, 2.5mM dNTP 혼합액 4 ㎕, ExTaq DNA 중합효소 1㎕ (Takara, Seoul, Korea) 및 10xPCR 버퍼 5㎕를 혼합하여 총 50㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다.
이 혼합액을 PCR 반응(94℃에서 5분, 60 회: 40℃에서 30초, 72℃에서 30초 및 72℃에서 7분)을 하여 이중 사슬로 만든 후, 정제하여 (PCR 정제 키트, GeneAll, Seoul, Korea), 어피바디 라이브러리 유전자를 얻었다.
어피바디 h3 유전자가 들어간 파아지미드 벡터(pIGT-h3)에 이 어피바디 h1-h2 유전자를 삽입하기 위해서 파아지미드 벡터와 인서트 DNA를 제한효소를 처리하였다. 약 10㎍의 인서트 DNA를 SfiI(New England Biolabs (NEB, Ipswich)및 NheI (NEB, Ipswich)으로 8시간 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다.
또한, 약 40㎍의 파아지미드 벡터를 SfiI 및 NheI으로 8시간 처리하고, CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 넣고 1시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA를 파아지미드 벡터와 18℃에서 15시간 동안 연결한 후, 에탄올로 침전시켜 TE 버퍼 100㎕로 DNA를 용해시켰다.
컴피턴트
세포의 준비
E. coli ER5739 세포(American Type Culture Collection, Manassas, USA)를 LB 아가-플레이트에 선상 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5㎖의 LB 배지에 접종한 후 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양하였다. 배양된 10㎖의 세포들을 2L의 LB 배지에 접종하고 같은 방식으로 600nm의 파장에서 흡광도가 0.3-0.4가 될 때까지 배양하였다.
배양된 플라스크를 30분 동안 얼음에 방치한 후, 4℃에서 4000xg로 20분 동안 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 1L의 냉각된 멸균 증류수로 현탁시켰다. 이것들 다시 같은 방법으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 1L의 냉각된 멸균 증류수로 재현탁시키고 같은 방식으로 10% 글리세롤 용액 40㎖로 세척을 반복하여 원심 분리한 후, 마지막으로 10% 글리세롤 용액 4㎖으로 현탁시킨 후, 200㎕씩 분주하여 액체 질소에 냉동시킨 뒤 -80℃에 보관하였다.
전기천공
파아지미드 벡터 12㎍과 어피바디 인서트 DNA 3㎍을 연결 반응시킨 100㎕를 25개로 분주하여 전기 천공을 수행하였다. 컴피턴트 세포를 얼음 위에서 녹이고, 200㎕의 컴피턴트 세포를 연결 반응시킨 용액 4㎕와 혼합한 후, 냉각하여 준비된 0.2 cm의 큐벳에 넣은 뒤 1분 동안 얼음 위에 두었다. 전기 천공기 (BioRAD, Hercules, CA)를 200Ω에서 25uF 및 2.5 kV의 조건으로 프로그램하고 준비된 큐벳의 물기를 제거하고 전기 천공기에 위치시킨 후 펄스를 주었다(시간 상수는 4.5-5 msec).
이후 즉시 37℃로 준비한 20mM의 글루코오스가 포함된 1㎖의 LB 액체배지에 넣고 얻어진 총 25㎖의 세포를 100㎖ 시험관에 옮겼다. 한 시간 동안 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하며 배양한 후 라이브러리의 개수를 측정하기 위해 10㎕를 희석해서 암피실린 아가 배지에 도말하였다.
남은 세포를 1L의 LB에 20mM 글루코오스 및 50㎍/㎖의 암피실린을 넣고 30℃에서 하루 동안 배양하였다.
4℃에서 4,000Xg로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 40㎖의 LB로 재현탁시킨 후 글리세롤을 최종 농도 20% 이상 넣고 -80℃에 보관하였다.
어피바디
라이브러리에서 재조합
파아지
생산
-80℃에 저장된 어피바디 라이브러리에서 재조합 파아지를 생산하였다. 30㎖ SB 액체배지에 -80℃에 보관된 라이브러리 1㎖을 추가하여 20분 동안 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하여 배양하였다. 여기에 Helper phage(1010pfu)과 암피실린(최종 농도 50μg/㎖)을 넣고 다시 한 시간 동안 같은 조건으로 배양하였다.
그리고 암피실린(50μg/㎖) 및 카나마이신(10μg/㎖)이 포함된 SB 액체배지 30㎖에 옮겨 같은 조건으로 16시간 이상 배양하여 재조합 파아지를 생산하였다. 배양액을 4℃에서 5,000rpm의 속도로 10분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액에 PEG/NaCl을 5:1 비율로 혼합하여 얼음에 1시간 동안 방치시킨 후, 4℃에서 20분 동안 13,000rpm의 속도로 원심 분리하여 상층액은 조심스럽게 제거하고 1㎖의 PBS로 펠렛을 재현탁시켰다.
실시예
2:
어피바디
-NS1의
바이오패닝
NS1(10㎍/㎖)을 96 well high binding plate의 8개의 well에 50㎕씩 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 PBS 200㎕로 1회 세척한 후, 2% BSA 200㎕를 넣고 상온에서 2시간 동안 블록킹한 후, 용액을 모두 버리고 PBS 200㎕로 3회 세척하였다.
여기에 상기 실시예 1에서 제조된 어피바디 재조합 파아지 포함용액 400㎕ 및 2% BSA 400㎕을 혼합하여 웰당 100㎕씩 넣고 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 8개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.1% PBST(tween-20)로 3회 세척한 뒤 0.2M 글리신(pH 2.2)을 웰당 100㎕씩 넣어 10분간 파아지를 용리시키고 800㎕ E-tube에 모아 여기에 1M Tris(pH 9.0) 200㎕를 넣어 중화시켰다.
각 바이오패닝마다 input 파아지 및 output 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 E. coli 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 NS1 output 파아지 500㎕를 5㎖의 E. coli 세포와 섞어 37℃에서 200rpm의 속도로 30분 동안 혼합하며 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖) 및 헬퍼 파아지(7.5 x 1010 pfu) 첨가하여 같은 방법으로 30분 동안 배양하였다. 그 다음 암피실린(50μg/㎖)과 카나마이신(10μg/㎖)이 포함된 50㎖ SB 배지에 옮겨 같은 방법으로 하루 동안 배양하였다.
배양액을 4℃에서 5,000rpm의 속도로 10분동안 원심 분리하여 상층액에 PEG/NaCl [20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 5:1 비율로 첨가한 후 얼음에 1시간 동안 정치시켰다. 4℃에서 13,000rpm의 속도로 20분 동안 원심분리 후 상층액을 완전히 제거하고 1㎖의 PBS 용액으로 파아지 펠렛을 현탁한 다음 2차 바이오패닝에 사용하였다.
각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며, 아래 표 1에서 보는 바와 같이 세척 과정만 단계별로 각각 6회, 9회 및 12회(0.1% PBST) 증가시켰다. 아래 표 1 및 도 1 에서 세척 과정에 따라 output 파아지 / input 파아지 의 비율이 증가함을 볼 수 있다.
| 패닝 단계 (조건) | input 파아지 | output 파아지 | output/input | |
| 조건1 | Binding 상온 1hr Washing 3회 (0.1% PBST) |
1.3 x 1012 | 1.1 x 107 | 0.84 x 10-5 |
| 조건2 | Binding 상온 1hr Washing 6회 (0.1% PBST) |
1.3 x 1011 |
7.2 x 107 |
55.38 x 10-5 |
| 조건3 | Binding 상온 1hr Washing 9회 (0.1% PBST) |
6.8 x 1011 |
4.9 x 108 |
72.05 x 10-5 |
| 조건4 | Binding 상온 1hr Washing 12회 (0.1% PBST) |
8.4 x 1010 |
2.1 x 108 |
250 x 10-5 |
실시예
3: NS1에 특이적인
파아지
검색(colony ELISA)
상기 표 1에서 output/input 파아지 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계에서 회수한 조건 4의 파아지를 E. coli 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200개 정도가 되도록 도말하였다.
멸균된 팁을 이용하여 플라크 50개를 1㎖의 SB-암피실린(50 μg/㎖) 배양액에 접종한 후 37℃에서 5시간 동안 진탕 배양하여 헬퍼 파아지를 30㎕씩 첨가하여 37℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 배양액을 12,000rpm의 속도로 2분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 2% BSA를 넣고 이를 파아지 검색에 사용하였다. 96웰 ELISA 플레이트에 5μg/㎖의 NS1, Streptavidin을 각 웰당 50㎕씩 50개의 웰에 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰의 단백질을 제거하고 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블록킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 용액 100㎕씩을 모든 웰에 분주하고 30℃에서 1시간 동안 정치하였다.
0.1% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13항체(GE Healthcare)를 1:2,000으로 희석하여 100㎕씩 분주하고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척한 후 TMB용액 100㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100㎕의 1M HSO를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 결과에서 Streptavidin에 비해 2배 이상 흡광도가 높은 12,16,46 클론들을 선택하였다.
이들의 플라스미드를 정제하여 시퀀싱을 의뢰하였다(Bioneer, Daejeon, Korea). 시퀀싱 프라이머는 GATTACGCCAAGCTTTGGAGC (서열번호 6)를 사용하였다.
실시예
5:
어피바디의
발현 및 정제
어피바디 12, 16, 46의 유전자를 바이오니아에서 합성하여 expression vector pBT7-N-His에 클로닝하였다. 이를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 20㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 400㎖의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 220rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000xg로 10분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 Isopropanol 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다.
소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 증류수와 라이시스 버퍼로 Ni-NTA 친화성 레진(Elposbio, Daejeon, Korea)을 세척한 후 상층액을 레진에 결합시켰다. Washing buffer(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 20mM imidazole) 600㎖로 washing 후 일루션 버퍼(50mM 소sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 250mM imidazole)을 이용하여 N-말단 His-tag 어피바디 단백질을 용출시켜 획득하였다.
이렇게 획득한 단백질을 Centrifugal Filter(Merck Milipore Ltd, lreland)에 넣고 4℃에서 4,000rpm의 속도로 10min 원심 분리하여 농축 후 PBS를 넣고 같은 방법으로 5회 Buffer change하여 순도 높은 어피바디 12, 16, 46 단백질을 얻었다 (도 3).
선택된 뎅기 바이러스 NS1 진단용 어피바디 아미노산 서열은 다음 표 2와 같다.
| 서열번호 1 | NS1@Affibody12 | VDNKFNKEFDCALVEIVLLPNLNVFQIVAFISSLSDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA |
| 서열번호 2 | NS1@Affibody16 | VDNKFNKEGYMASVEILWLPNLNNKQGQAFITSLRDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA |
| 서열번호 3 | NS1@Affibody46 | VDNKFNKEFVCAYVEILRLPNLNNSQMNAFISSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA |
<
실험예
>
ELISA 에
의한
어피바디의
NS1 특이성 test
ELISA 에 의해 본 발명의 실시예에 의하여 분리된 어피바디들의 뎅기열 바이러스 NS1 에 대한 특이성 정도를 측정하였다.
96웰 ELISA 플레이트에 5 νg/㎖의 NS1, Streptavidin, VEGF 을 각 웰당 50㎕씩 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰의 단백질을 제거하고 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블록킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다.
각 클론별로 증폭된 파아지 용액 어피바디12, 어피바디16, 어피바디46 파아지를 각각 100㎕씩을 모든 웰에 분주하고 30℃에서 1시간 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13항체(GE Healthcare)를 1:2,000으로 희석하여 100㎕씩 분주하고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척한 후 TMB용액 100㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100㎕의 1M HSO를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하여 NS1에 대한 특이성을 확인하고 그 결과를 도 3 내지 도 5 에 나타내었다.
도 4 내지 도 6에서 본 발명에 의한 어피바디12, 어피바디16, 어피바디46 이 각각 NS1 에 특이성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
실시예
6: NS1에 대한
어피바디의
바이오센서칩을
이용한
결합정도
테스트
각 선택된 어피바디들의 NS1에 대한 결합정도를 확인하고자, 바이오센서 칩을 이용하여 surface plasmon resonance (SRP)실험을 진행하였다 (Biacore3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden).
선택된 NS1 단백질을 EDC/NHS을 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하고, 최대 400초까지 관찰하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 관찰조건은 러닝 버퍼 PBS (pH 7.4), 속도 30㎕/분, 농도 10 uM (어피바디 12,16,46)의 조건에서 수행하였다.
도 7 에서 어피바디 12,16,46의 결합은 10 uM 의 농도에서 관찰하였다(붉은색, 파란색, 회색). 어피바디 12의 최대치 RU는 30 RU, 어피바디 16의 최대치 RU는 20 RU, 어피바디 46의 최대치 RU는 12 RU를 보인다.
실시예
7: NS1에 대한
어피바디의
바이오센서칩을
이용한 친화력 테스트
각 선택된 어피바디들의 NS1에 대한 친화력을 확인하고자, 바이오센서 칩을 이용하여 surface plasmon resonance (SRP)실험을 진행하였다 (Biacore3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden).
선택된 NS1 단백질을 EDC/NHS을 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하고, 최대 500초까지 관찰하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 관찰조건은 러닝 버퍼 PBS (pH 7.4), 속도 30㎕/분, 농도 1~10 uM (어피바디 12), 농도 10~50 uM (어피바디 16,46)의 조건에서 수행하였다.
<110> ceramic
<120> AFFIBODY SPECIFIC TO DENGUE VIRUS
<130> DP-2017-0034
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NS1@Affibody12
<400> 1
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Asp Cys Ala Leu Val Glu Ile
1 5 10 15
Val Leu Leu Pro Asn Leu Asn Val Phe Gln Ile Val Ala Phe Ile Ser
20 25 30
Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala
50 55 60
<210> 2
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NS1@Affibody16
<400> 2
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gly Tyr Met Ala Ser Val Glu Ile
1 5 10 15
Leu Trp Leu Pro Asn Leu Asn Asn Lys Gln Gly Gln Ala Phe Ile Thr
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala
50 55 60
<210> 3
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NS1@Affibody46
<400> 3
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Val Cys Ala Tyr Val Glu Ile
1 5 10 15
Leu Arg Leu Pro Asn Leu Asn Asn Ser Gln Met Asn Ala Phe Ile Ser
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala
50 55 60
Claims (6)
- 하기 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 구성된 그룹에서 선택되는 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 뎅기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 어피바디
VDNKFNKEFDCALVEIVLLPNLNVFQIVAFISSLSDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA(서열번호 1)
VDNKFNKEGYMASVEILWLPNLNNKQGQAFITSLRDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA(서열번호 2)
VDNKFNKEFVCAYVEILRLPNLNNSQMNAFISSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA(서열번호 3)
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 어피바디는 뎅기열 바이러스 NS1 도메인에 특이적으로 결합하는 것인 어피바디.
- 제 1 항 또는 제 3 항의 뎅기열 바이러스 NS1 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 코딩하는 핵산 분자.
- 제 4 항의 핵산 분자를 포함하는 뎅기열 바이러스 NS1 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 발현용 벡터.
- 제 1 항 또는 제 3 항의 뎅기열 바이러스 NS1 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 약제학적 유효량으로 포함하는 뎅기열 바이러스 진단용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170028901A KR101885573B1 (ko) | 2017-03-07 | 2017-03-07 | 뎅기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 어피바디 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170028901A KR101885573B1 (ko) | 2017-03-07 | 2017-03-07 | 뎅기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 어피바디 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101885573B1 true KR101885573B1 (ko) | 2018-08-06 |
Family
ID=63252208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170028901A KR101885573B1 (ko) | 2017-03-07 | 2017-03-07 | 뎅기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 어피바디 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101885573B1 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101954663B1 (ko) * | 2017-09-06 | 2019-03-06 | 한국세라믹기술원 | 뎅기열 바이러스 ns1에 특이적으로 결합하는 어피바디 이종이량체 및 그의 용도 |
| KR101954685B1 (ko) * | 2017-08-29 | 2019-05-23 | 한국세라믹기술원 | 뎅기열 바이러스 ns1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체 및 그의 용도 |
| KR20230107461A (ko) | 2022-01-08 | 2023-07-17 | 광운대학교 산학협력단 | 중증 뎅기열 면역진단기기를 이용한 중증 뎅기열 관제 시스템 및 이에 의한 중증 뎅기열 관제방법 |
-
2017
- 2017-03-07 KR KR1020170028901A patent/KR101885573B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Chemosensors 2016, 4(4), 23. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101954685B1 (ko) * | 2017-08-29 | 2019-05-23 | 한국세라믹기술원 | 뎅기열 바이러스 ns1에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체 및 그의 용도 |
| KR101954663B1 (ko) * | 2017-09-06 | 2019-03-06 | 한국세라믹기술원 | 뎅기열 바이러스 ns1에 특이적으로 결합하는 어피바디 이종이량체 및 그의 용도 |
| KR20230107461A (ko) | 2022-01-08 | 2023-07-17 | 광운대학교 산학협력단 | 중증 뎅기열 면역진단기기를 이용한 중증 뎅기열 관제 시스템 및 이에 의한 중증 뎅기열 관제방법 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |