CN1498275A - 检棒分析中改良的目标核酸的捕获及检测 - Google Patents

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Abstract

本发明叙述检棒分析中帮手探针的用途。在检棒分析中测试样品溶液中目标核酸的存在，样品溶液与检棒的接触端接触，使样品溶液通过毛细作用移至检棒的捕获带而使目标核酸被捕获。通过能杂交目标核酸的捕获探针，目标核酸能于捕获带中被捕获。能够杂交目标核酸的标记检测探针可用以在捕获带检测目标核酸。帮手探针可用以增强捕获和/或检测探针对目标核酸的结合，由此改良目标核酸检测的敏感度。亦述及检棒及试剂盒。

Description

检棒分析中改良的目标核酸的捕获及检测
本发明涉及改良的检棒(dipstick)核酸检测方法。本发明的方法用以测试样品溶液中目标核酸的存在，例如鉴定病患是否感染致病微生物，如砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)。
用于检测样品溶液中目标核酸存在的一些常规测试依赖利用聚合酶链式连锁反应(PCR)扩增目标核酸。此反应可检测小量的目标核酸，然而得到结果前需耗时数小时，但因通常希望可尽快得到结果，例如使病人等待的时间减至最少，故此为其显著缺点。这种方法的进一步缺点是需要昂贵的专家设备进行反应以及相当高成本的试剂。
相反，检棒可检测未扩增的目标核酸，不需任何专家设备且能比基于PCR的方法更快速地得到结果。病人就可于同时接受治疗，故特别有益于不喜欢或不能日后复诊的病人。检棒分析的成本也显著低于PCR基础的测试。
US 5,310,650所述的典型常规检棒中，单股DNA捕获探针固定于硝化纤维素滤器上远离过滤器末端(接触端)的捕获区。捕获探针序列互补于欲测目标核酸第一区域的序列。标记的单股DNA检测探针固定于硝化纤维素滤器上捕获区及滤器接触端间的探针区。检测探针含有互补于目标核酸第二区域序列(不同于第一区域)的序列。
在认为含有目标DNA的样品溶液中检测目标DNA时，将硝化纤维素滤器的接触端接触样品溶液。样品溶液通过毛细作用进入滤纸并经过探针区及捕获区。当样品溶液经过探针区时，可使检测探针移动并使其与样品溶液一起朝向捕获区上升。然后移动的检测探针能杂交到样品溶液中存在的任何目标DNA的第二区域。
当杂交的检测探针及目标DNA到达捕获区时，目标DNA的第一区域能杂交到固定的捕获探针。由此在目标核酸、捕获探针及标记的检测探针之间形成三重复合物。捕获区出现标记时说明样品溶液中存在目标DNA。
至于第二类常规检棒，标记的DNA检测探针未固定于硝化纤维素滤器上。而是在允许检测探针杂交到样品溶液中任何目标核酸的条件下将检测探针加入到样品溶液中。然后将硝化纤维素滤器的接触端接触样品溶液，且当样品溶液沿检棒上移时，杂交到检测探针的目标核酸沿硝化纤维素滤器上升，并可通过捕获探针在捕获区捕获。
虽然使用常规检棒获得结果比使用需扩增目标核酸的检测方法还快，但常规检棒的核酸检测敏感度还是低。常规检棒的双链目标核酸检测的敏感度特别低，尤其当目标核酸大小增加时，且认为事实上环状双链目标核酸使用常规检棒无法检测到。因此，样品溶液中目标核酸的存在有时不能被检测到，所以需要改良检棒的目标核酸检测敏感度，尤其是双链或环状双链目标核酸检测的敏感度。
在最广泛的意义中，本发明提供在检棒分析中帮手探针(helperprobe)的用途，来增强捕获和/或检测探针对目标核酸的杂交。
在此使用的术语“检棒分析”是指使用检棒的任何分析，其中样品溶液与检棒接触以使样品溶液通过毛细作用移至检棒的捕获区，由此可使样品溶液中的目标核酸于捕获带中被捕获及检测。
根据本发明的第一方面，其提供方法以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及捕获探针，其固定于层析片远离接触端的捕获带，该捕获探针能够杂交至目标核酸的第一序列；
b)在检测探针能附着目标核酸的条件下，孵育能附着目标核酸的检测探针和样品溶液，由此可利用检测探针直接或间接地检测目标核酸；且第一帮手探针能够杂交至目标核酸第二序列，并由此增强捕获探针对目标核酸的杂交，在第一帮手探针杂交目标核酸的条件下，孵育样品溶液及第一帮手探针；
c)层析片的接触端与样品溶液接触，而使检测探针、第一帮手探针及目标核酸之间所形成的复合物能通过毛细作用移至捕获带，且通过捕获探针杂交复合物的目标核酸而结合至捕获带；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
根据本发明的第一方面，其亦提供试剂盒以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，包括：
具有接触端以接触样品溶液的层析片；及
固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交至目标核酸的第一序列；
ii)第一帮手探针，其能够杂交目标核酸第二序列并因此增强捕获探针对目标核酸的杂交，及可选地
iii)检测探针，其能够附着目标核酸而允许利用该检测探针直接或间接地检测目标核酸。
在此使用的术语“层析片”是指能通过毛细现象运送溶液的任何多孔带状物质。
检测探针及第一帮手探针可以任何顺序与样品溶液孵育或同时添加入样品溶液中。
其可了解，根据步骤(b)，在样品溶液已与检测探针及第一帮手探针孵育之后，一般将层析片的接触端与样品溶液接触。然而，对于实施本发明来说是并非必需在步骤(b)完成后将接触端与样品溶液接触，即层析片的接触端可在步骤(b)之前或之中与样品溶液接触。
本发明的第一方面的捕获探针可包含单一探针或一种以上的探针。例如捕获探针可含有固定至层析片的通用探针(universal probe)及能杂交通用探针的吊钩捕获探针(hook capture probe)，该吊钩探针能够杂交目标核酸的第一序列。
使用通用探针及吊钩捕获探针作为捕获探针的优点在于其上具有固定的通用探针的层析片可用于检测任何目标核酸。在层析片用以测试所需目标核酸存在之前，简单选择能够杂交所需目标核酸的吊钩探针并将其杂交至通用探针。
根据本发明的第二方面，其提供方法以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
a)提供层析片，其具有：接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获部分(capture moiety)；
b)将样品溶液与以下内容孵育：
在检测探针附着目标核酸的条件下能够附着目标核酸的检测探针，因此可利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；
在捕获探针杂交第一序列的条件下能够杂交目标核酸的第一序列的捕获探针，当捕获探针已杂交了第一序列时，该捕获探针能够被捕获部分结合；及
能够杂交目标核酸第二序列的第一帮手探针，以增强捕获探针杂交目标核酸，而在第一帮手探针杂交第二序列的条件下，孵育样品溶液及第一帮手探针；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，而使得检测探针、捕获探针、第一帮手探针及目标核酸之间所形成的复合物能通过毛细作用移至捕获带，且通过捕获部分结合复合物的捕获探针而结合至捕获带；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
根据本发明的第二方面，其亦提供试剂盒以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，包括：
具有接触端以接触样品溶液的层析片；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获部分；
ii)捕获探针，能够杂交至目标核酸的第一序列，当捕获探针已杂交了第一序列，其能被捕获部分结合；
iii)第一帮手探针，能够杂交至目标核酸第二序列，由此可增强捕获探针对第一序列的杂交；及可选地
iii)检测探针，其能够附着目标核酸而允许直接或间接地检测目标核酸。
本发明的第二方面的捕获部分可包含能杂交至捕获带的通用捕获探针。或者，一旦捕获探针已杂交了目标核酸，该捕获部分就可以能够通过非碱基配对作用结合捕获探针。
例如捕获部分可包含能结合当捕获探针已杂交至目标核酸时形成的双链体的抗体或抗体片段。或者，捕获探针可包含一捕获配体，其能被捕获部分结合。当捕获探针包含捕获配体时，捕获部分可包含抗体或抗体片段。如果捕获配体包含生物素，则捕获部分能包含抗生物素抗体或链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白或其且保留生物素结合活性的衍生物。
本发明的第一及第二方面的第二序列应位于目标核酸中与的第一序列不同的区域。优选第二序列相隔第一序列多达10个核苷酸，更优选第二序列紧接着第一序列。
在本发明的第一及第二方面的优选方法中，样品溶液与能够杂交目标核酸第三序列的第二帮手探针孵育，由此增强捕获探针对目标核酸的杂交，在第二帮手探针杂交目标核酸的条件下，孵育样品溶液及第二帮手探针。
第三序列应位于目标核酸中与第一及第二序列不同的区域，优选第二及第三序列位于第一序列两侧，更优选第二及第三序列相隔第一序列各边多达10个核苷酸，最优选第二及第三序列紧接着第一序列各边。
捕获探针、检测探针及帮手探针可包含核酸或核酸类似物。捕获探针可包含单一探针或多于一种的探针。
本发明的第一及第二方面的检测探针可为标记，其共价附着目标核酸，由此可直接检测目标核酸。或者，检测探针可为配体，其共价附着目标核酸，由此可利用能结合配体的配体结合部分间接检测目标核酸。检测探针能以前体形式加至样品溶液中，其与目标核酸反应以共价地将检测探针附着至目标核酸。
或者，检测探针能够通过非共价相互作用附着目标核酸。例如检测探针能够杂交目标核酸的第四序列。检测探针能被标记，由此当检测探针通过非共价相互作用已附着目标核酸时，可直接检测目标核酸。或者，检测探针能包含配体，由此当检测探针通过非共价相互作用已附着目标核酸时，可利用配体结合部分间接检测目标核酸。
优选的标记为非放射性标记，适合的标记的例子包括纺织染料、如胶体金的金属溶胶，及如有色乳胶粒子的有色粒子。适合的配体的例子包括生物素(可检测的例如通过抗生物素抗体或抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白或其保留生物素结合活性的衍生物)、荧光素(可检测的例如通过抗荧光素抗体)及2，4-二硝苯酚(DPN)(例如通过抗DPN抗体而可检测)。
如果样品溶液与第三且优选亦与第四帮手探针孵育，则可获得进一步改良的检测目标核酸的敏感度。第三帮手探针能够杂交至目标核酸第五序列，且第四帮手探针能够杂交至目标核酸第六序列，由此可增强检测探针对第四序列的杂交。在第三与第四帮手探针杂交至目标核酸的条件下，孵育样品溶液及第三与第四帮手探针。
只有当目标核酸第一及第四序列相隔至少200核苷酸时，使用第三及第四帮手探针才可能获得检测敏感度任何明显的增强。
优选的第五及第六序列位于第四序列两侧，更优选第五及第六序列相隔第四序列各边多达10个核苷酸，最优选第五及第六序列紧接着第四序列各边。
根据本发明的第三方面，其提供方法以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸的第一序列；
b)样品溶液与以下内容孵育：
在检测探针杂交目标核酸的条件下能够杂交目标核酸第二序列的检测探针，由此可利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；且
第一帮手探针，能够杂交目标核酸第三序列，且由此增强检测探针对第二序列的杂交，在第一帮手探针杂交第三序列的条件下，孵育样品溶液及第一帮手探针；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，而使得检测探针、第一帮手探针及目标核酸之间所形成的复合物能通过毛细作用移至捕获带，且通过捕获探针杂交复合物的目标核酸而结合至捕获带；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
根据本发明的第三方面，其亦提供试剂盒以测试疑似含有目标核酸的样品溶液中目标核酸存在，其包含：
i)检棒，包括：
层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸的第一序列；
ii)检测探针，其能够杂交目标核酸第二序列而可直接或间接地检测目标核酸；及
iii)第一帮手探针，其能够杂交目标核酸第三序列，由此增强检测探针对第二序列的杂交。
本发明的第三方面的捕获探针可包含单一探针或一种以上的探针，例如捕获探针可包含固定于层析片的通用捕获探针及杂交通用捕获探针的吊钩捕获探针，该吊钩探针能够杂交目标核酸的第一序列。
根据本发明的第四方面，其提供提供方法以测试样品溶液中目标核酸的存在，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获探针；
b)样品溶液与以下内容孵育：
在捕获探针杂交第一序列的条件下能够杂交至目标核酸的第一序列的捕获探针，当捕获探针已杂交了第一序列时，该捕获探针能够被捕获部分结合；
在检测探针杂交至第二序列的条件下能够杂交至目标核酸第二序列的检测探针，由此可利用该检测探针来直接或间接地检测目标核酸；及
第一帮手探针，其能够杂交目标核酸第三序列，并由此增强检测探针对目标核酸的杂交，在第一帮手探针杂交第三序列的条件下，孵育样品溶液及第一帮手探针；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，而使检测探针、捕获探针、第一帮手探针及目标核酸之间所形成的复合物能通过毛细作用移至捕获带，且通过捕获部分结合至复合物的捕获探针而结合至捕获带；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
根据本发明的第四方面，其亦提供试剂盒以测试样品溶液中疑似含有目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，包括：
层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获部分；
ii)捕获探针，其能够杂交目标核酸的第一序列，且当捕获探针已杂交了第一序列时，其能被捕获部分结合；
iii)检测探针，其能够杂交至目标核酸第二序列而可直接或间接地检测目标核酸；及
iv)第一帮手探针，其能够杂交至目标核酸第三序列并由此增强检测探针对第二序列的杂交。
本发明的第四方面的捕获部分可包含能杂交捕获探针的通用捕获探针。或者，一旦捕获探针已杂交了目标核酸，捕获部分能通过非碱基配对作用结合该捕获探针。
例如捕获部分可包含能结合当捕获探针已杂交至目标核酸形成的双链体的抗体或抗体片段。或者，捕获探针可包含一捕获配体，其能被捕获部分结合。当捕获探针包含捕获配体时，捕获部分能包含抗体或抗体片段。如果捕获配体包含生物素，则捕获部分能包含抗生物素抗体或抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或其保留生物素结合活性的衍生物。
本发明的第三及第四方面的检测探针可被标记，由此当检测探针已杂交了目标核酸时，可直接检测目标核酸。或者，检测探针能包含配体，由此当检测探针已杂交了目标核酸时，可利用配体结合部分间接检测目标核酸。
本发明的第三及第四方面的第三序列优选相隔第一序列多达10个核苷酸，更优选第三序列紧接着第二序列。
在本发明的第三及第四方面的方法中，优选样品溶液与能够杂交至目标核酸第四序列的第二帮手探针孵育，由此能够增强捕获探针对目标核酸的杂交，在第二帮手探针杂交第四序列的条件下，孵育样品溶液及第二帮手探针。
对于本发明的第三及第四方面的方法，优选第三及第四序列位于第二序列两侧，更优选第四序列相隔第二序列多达10个核苷酸，最优选第四序列紧接着第二序列。
只有当目标核酸第一及第二序列相隔至少200核苷酸时，以本发明的第三及第四方面的方法使用第一及第二帮手探针，才可能观察到检测敏感度任何明显的增强。
如果本发明试剂盒的检测探针包含检测配体，则试剂盒可进一部包含能够结合检测配体的标记的检测配体结合部分，由此允许使用检测探针及检测配体结合部分检测目标核酸。检测配体结合部分可为抗体、抗体片段或非抗体。
本发明的试剂盒进一部包含使用层析片可在样品溶液中检测目标核酸所需的任何试剂。
根据本发明亦提供本质上分离的核酸分子或核酸类似物，其具有序列相对应于SEQ ID NOS：1-18任一的序列。
根据本发明亦提供本质上分离的本发明的核酸分子或核酸类似物的用途，在测试样品溶液中目标核酸的存在时，作为帮手探针以增强CT目标核酸的检测。
本发明所使用的帮手探针可增强捕获或检测探针结合单链或双链目标核酸。当目标核酸为单链时，认为通过保证目标核酸中捕获/检测探针结合的区域不形成显著的二级构造，帮手探针能增强捕获/检测探针对目标核酸的结合。
需知帮手探针结合的目标核酸的区域并不总是接近或紧接着捕获/检测探针所结合的区域。帮手探针杂交目标核酸的一个区域可改变位于遥远位置区域的二级结构，由此可使捕获/检测探针较容易结合至位于遥远位置的目标核酸。
因此根据目标核酸及捕获/检测探针而特性，帮手探针所结合的目标核酸的区域可能会不同。然而，通过用不同探针及不同探针长度实验，本领域技术人员可轻易的决定最有效的帮手探针。
当目标核酸为双链时，认为通过打开目标核酸中捕获或检测探针缀合区域的双链，帮手探针杂交至目标核酸增强了捕获或检测探针对目标核酸的杂交。因此对于双链目标核酸，通常期望帮手探针缀合区邻近捕获或检测探针缀合区域。
为了使帮手探针增强捕获或检测探针对目标核酸的结合，帮手探针应该在捕获或检测探针结合目标核酸之前或之时杂交至目标核酸，而不是在捕获或检测探针已经结合了目标核酸之后。
一些实施方案当中，帮手探针能增强捕获或检测探针对目标核酸的杂交。例如如果帮手探针杂交至目标核酸的区域介于捕获及检测探针之间，这是可以实现的。
在本发明的其它实施方案中，一或多种探针可以可释放地固定于层析片上，而介于接触端与捕获带之间，这些方法中，样品溶液通过毛细作用由接触端移动至捕获带，使得各探针自层析片上释放而进入样品溶液，然后释放的探针可杂交至样品溶液中的目标核酸。
对于本发明的具体例，提供帮手探针能增强检测探针对目标核酸的杂交，可以在样品溶液已与层析片的接触端接触而可在捕获带捕获目标核酸后，将帮手探针(优选与检测探针一同)与层析片的捕获带接触。这可通过将含有帮手探针(及检测探针)的不同的帮手探针溶液直接运用至捕获带，或在样品溶液之后通过将层析片的接触端接触帮手探针溶液而能完成，由此使得帮手探针通过毛细作用移至捕获带。如果检测探针不在帮手探针溶液中，则需要在帮手探针之后将其接触捕获带。
然而，在本发明优选的方法中，在样品溶液中探针杂交至目标核酸(有别于捕获探针被固定于捕获带上)在样品溶液接触层析片之前完成于样品溶液中。优选探针杂交完成于单一步骤。这样简化方法，由此使方法的操作更快且更容易。
多步骤杂交可通过在样品溶液中以不同探针对目标核酸进行连续杂交，或通过将检棒接触各含有不同探针的不同溶液而完成。一般来说，多步骤杂交的后一种方法包含在每次与不同探针溶液接触之间清洗检棒的步骤。
尽管有多步骤杂交为优选的情况，需知较为简单及快速的单一步骤杂交方式通常优选。
最优选样品溶液的适合的组成允许使杂交反应于单一杂交步骤中发生，亦允许非碱基配对作用发生(例如于检测配体与检测配体结合部分之间，及于捕获配体与捕获配体结合部分之间)，以及允许通过毛细作用运送含有目标核酸和一或多种杂交探针及(可选地)配体结合部分的复合物沿检棒上移。
使用这种样品溶液，需知在样品溶液直接接触检棒的接触端之前(不需要先稀释或改变样品溶液)，杂交反应能在单一反应中完成，且可发生任何配体-配体结合部分的相互作用。当样品溶液向捕获带移动时，如果需要配体-配体结合部分的相互作用能附加地或另外地在检棒上发生，由此便于简单及快速的目标核酸检棒检测。
本发明者已发现这些结果可以含具有盐、去污剂及如BSA或奶粉的封阻蛋白的标准杂交缓冲液(如SSPE缓冲液或Tris缓冲液)的样品溶液完成。使用此分析检测目标核酸的敏感度已发现大约等于或好于其它检棒分析。
本发明的实施方案现参考附图通过实施例描述，其中：
图1显示依照本发明的实施方案用以检测目标核酸的检棒；
图2列出依照本发明使用的帮手探针的序列；
图3显示实施例1的实验构成；
图4显示实施例2的实验构成；
图5显示实施例3的实验构成；
图6显示实施例4的实验构成；
图7显示实施例5的实验构成；
图8显示实施例6的实验构成；
图9显示单一步骤杂交分析的结果；
以下实施例说明使用本发明的方法以改良检测目标核酸的敏感度。实施例涉及检测砂眼衣原粒(CT)隐性质体的DNA片段。
CT为最常见的性传染性疾病的病因，CT传染病可引起不孕或怀孕时形成自然流产、死产或产后子宫内膜炎。在新生儿方面，CT传染病可引起视盲及慢性呼吸道疾病。大约10％感染的男性及高达70％感染的女性并不表现出CT感染的症状。因此，CT感染的正确诊断非常重要，以便可开始疾病的早期治疗。
在下列实施例中，使用检棒10在样品溶液14中检测双链CT目标核酸12。检棒10包含硝化纤维条16，其具有接触端18以接触样品溶液14，及固定于硝化纤维条16的捕获带22(远离接触端18的另一端)的捕获探针20。抗生物素抗体-染料缀合物24可释放地固定于硝化纤维条的缀合区26(介于接触端18及捕获带22之间)，捕获探针20能够杂交目标核酸12单链(第一链)的第一序列。
各能杂交双链目标核酸12第一链的不同区域的检测探针28及帮手探针30然后添加至样品溶液14，检测探针28包含偶联至生物素的核酸(使用的方法为本领域技术人员所熟知)。包含检测探针28及帮手探针30的样品溶液14加热至足够将双链目标核酸12的互补链相互分离，至少在第一链上检测探针28及帮手探针30结合的区域，之后冷却而使检测探针28及帮手探针30能够杂交双链目标核酸第一链。当检测探针及帮手探针杂交至第一链时，第二链再退火(re-annealing)至第一链，但避免再退火至第一链上检测探针28及帮手探针30结合的区域。
检棒10的接触端18随后与样品溶液14接触，样品溶液14及任何杂交了检测探针28及帮手探针30的目标核酸12通过毛细作用上升至检棒10。当样品溶液14通过缀合区26时，其带动抗生物素抗体-染料缀合物24。释放的抗生物素抗体-染料缀合物24随后能结合至生物素，后者偶联杂交了目标核酸12的检测探针28。
在抗生物素抗体-染料缀合物24、检测探针28、帮手探针30及目标核酸12之间形成的复合物然后移至检棒10的捕获带22，在那里复合物的目标核酸可杂交至固定的捕获探针20。捕获探针20固定于捕获带22上，而使其当样品溶液14通过捕获带22时，不能被移动。所以，结合捕获探针的复合物停留在捕获带，且可通过抗生物素抗体-染料缀合物中染料的存在而于捕获带中被检测出。
如果样品溶液中没有CT目标核酸，则检测探针28不能在捕获带22上被捕获，故无法在捕获带上见到染剂。如果样品溶液中有CT目标核酸，但没有充足的目标核酸在捕获带被捕获，样品溶液中存在的目标核酸将不会被检测到。
上述的目标核酸的捕获在如下列实施例中称作直接探针捕获。下列实施例5中，使用两种进一步的捕获方式，即通用探针捕获及抗体捕获。通用探针捕获凭借着使用杂交固定于检棒捕获带上的通用探针的吊钩探针而捕获目标核酸。吊钩探针能够杂交目标核酸。除了捕获探针被换为通用与吊钩探针，这种捕获方法完全相同于直接探针捕获。
关于抗体捕获，抗体替代捕获探针而固定于检棒的捕获带上。捕获探针包含的探针。其偶联能被抗体结合的配体(如DNP)，且捕获探针与帮手及检测探针一起加至样品溶液中。当样品溶液加热并然后冷却以便杂交帮手及检测探针至目标核酸上时，捕获探针杂交至目标核酸。
在样品溶液中孵育捕获、帮手及检测探针后，将检棒的接触端与样品溶液接触。包含目标核酸、捕获探针、帮手探针及检测探针(结合有抗生物素抗体-染料缀合物)的复合物随后于捕获带被固定于捕获带的抗体捕获。样品溶液中目标核酸的存在通过在捕获区出现抗生物素抗体-染料缀合物而再次被检测。因此，捕获探针同目标的杂交不发生于检棒上，而是在样品溶液中。
已发现如果目标核酸上捕获探针杂交区域与检测探针杂交区域的间隔小于26个核苷酸时，目标核酸检测的敏感度会降低。因此，优选这些区域的间隔至少为26个核苷酸，且优选至少200个核苷酸。
实施例1
实验构成
捕获形式：直接探针捕获(cp)，Seq ID No 13固定于检棒上；
检测形式：检测探针(dp)包含偶联至生物素的Seq ID No 14、15、16或17的核酸，以1012拷贝，且以抗生物素抗体-染料缀合物检测检测探针；
目标DNA：872bp DNA，以1011-109拷贝。
帮手探针：HP SEQ ID No 1’(24mer，G+C＝9个核苷酸，Tm＝72.2℃，当杂交至目标核酸时，其杂交于距离捕获探针5’端11个核苷酸的目标序列)，或HP SEQ ID No 1(24mer，G+C＝8个核苷酸，Tm＝70.5℃，当杂交至目标核酸时，其杂交于紧邻于捕获探针5’端的目标核酸序列)，以1012拷贝。
结果
目标拷贝                  1011        1010       5×109        109
对照(无帮手探针)          2.5          0.0         0.0            0.0
HP SEQ ID No 1’                      3.0          1.0         0.0            0.0
HP SEQ ID No 1            5.0          3.5         2.5            0.0
结论
帮手探针以大于10倍(10-fold)水平改良目标核酸检测的敏感度。
HP SEQ ID No：1，其当杂交至目标核酸时，杂交至紧邻于捕获探针5’端的目标核酸序列，具有比HP SEQ ID No 1’，其当杂交至目标核酸时，杂交至距离捕获探针5’端11个核苷酸的目标序列，有更强的帮手效果，HP SEQ ID No：1具有比HP SEQ ID No：1’高2℃的Tm，然而认为捕获探针与帮手探针之间的间隔比Tm及G+C含量更为重要。
实施例2
实验构成
捕获形式：直接探针捕获(cp)(Seq ID No 14)固定于检棒上；
检测形式：检测探针(dp)包含偶联生物素的Seq ID No 13的核酸，以1012拷贝，及抗生物素抗体-染料缀合物；
目标DNA：416bp DNA，以5×1010拷贝。
帮手探针：帮手探针HP SEQ ID No 1、HP SEQ ID No 2、HP SEQ IDNo3、Seq ID No 15、Seq ID No 16及Seq ID No 17的联合，以1012拷贝。
结果
见图4
结论
在此实施例中，杂交至目标核酸中紧邻于捕获探针辨识序列的序列，帮手探针对于目标核酸检测的敏感度具有最大的增强效果(比较信号4.5与作为控制组的无帮手探针的信号1.5)。
帮手探针杂交至目标核酸中紧邻于捕获探针辨识序列的序列，其对目标核酸检测敏感度的效果强于帮手探针杂交至目标核酸中远离捕获探针辨识序列的序列时的效果(比较信号4.5与信号2.5)。
实施例3
实验构成
捕获形式：直接探针捕获(cp)Seq ID No 14(固定于检棒上)；
检测形式：检测探针包含偶联生物素的Seq ID No 13(d1)、15(d3)、16(d4)或17(d5)的核酸，以1012拷贝，及抗生物素抗体-染料缀合物；
目标DNA：872 bp DNA，以1010拷贝。
帮手探针：帮手探针h1＝HP SEQ ID No 1、h2＝HP SEQ ID No 2、h3＝HP SEQ ID No 3、h4＝HP SEQ ID No 4的联合，计1012或1013拷贝。
结果
  帮手探针                              以E12拷贝  以E13拷贝
  添加   0  h2+h3  h2  h3  h1+h2+h3  h1+h2+h3+h4  h1+h2+h3+h4
  信号   1.5  3.5  2.5  3  3.5  3.5  3.5
结论
相较于仅使用一个帮手探针的检测敏感度，杂交至目标核酸中紧邻于捕获探针辨识序列的帮手探针(h2及h3)增强检测的敏感度。
增加帮手探针的浓度(比较1013及1012拷贝)在本实施例中对于检测的敏感度并无任何的效果。
实施例4
实验构成
捕获形式：直接探针捕获(cp)Seq ID No 14(固定于检棒上)；
检测形式：检测探针包含偶联生物素的Seq ID No 13(d1)、15(d3)、16(d4)或17(d5)的核酸，以1012拷贝，及抗生物素抗体-染料缀合物；
帮手探针：帮手探针h1＝HP SEQ ID No 1、h2＝HP SEQ ID No 2、h3＝HP SEQ ID No 3、h4＝HP SEQ ID No 4的联合，以1012或1013拷贝。
目标：环状双链DNA质粒pCTL15B(5.1Kbp)及pCTL131(6.3Kbp)、缺乏与捕获及检测探针互补的序列的质粒pCTL130(6.3Kbp)作为负控制组，及双链直线性DNA(872bp)以1011拷贝，作为正对照组。
结果
  目标     h2+h3     h1+h2+h3+h4     无hp
  pCTL130     0.0     0.0     0.0
  pCTL131     1.5     1.5     0.0
  pCTL15B     1.5     1.5     0.0
  872bp DNA     5.0     5.0     3.5
结论
使用杂交至目标核酸中紧邻于捕获探针辨识序列的帮手探针可检测长度超过5Kbp的环状双链DNA。
杂交至目标核酸中远离捕获探针辨识序列，但紧邻于检测探针辨识序列的帮手探针(帮手探针h1及h4)，在本实施例中并不能增强核酸检测的敏感度。在本实施例的条件下，该帮手探针显示主要增强在检棒上捕获探针对双链环状目标核酸的杂交。
环状双链DNA目标(5.1Kbp或6.3Kbp)的检测敏感度低于直链双链872bp DNA检测敏感度。当目标核酸的大小增加时，检测及捕获探针杂交至目标核酸的效率预期会下降。检测探针对抗生物素抗体-染料缀合物的可接近性在目标大小增加时，亦被认为会降低。认为双链目标核酸的检测效率低于单链目标核酸的检测，因为检测探针及捕获探针杂交目标核酸的效率降低的缘故。认为检测探针对抗生物素抗体-染料缀合物的可接近性，对双链相较对于单链目标核酸亦会降低。
实施例5
实验构成
捕获序列：SEQ ID No 15
捕获形式：
i)直接探针捕获-探针Seq ID No 15(固定于检棒上)；
ii)通用探针捕获-20个核苷酸通用探针(固定于检棒上)杂交至吊钩探针(其序列互补于通用探针的序列)及目标DNA序列(Seq IDNo 15)；
iii)抗体捕获-抗-DNP抗体固定于检棒上，捕获探针包含Seq IDNo 15的核酸，其在样品溶液中偶联DNP且杂交目标核酸；
检测形式：检测探针包含偶联生物素的Seq ID No 13、14、16或17的核酸，以1012拷贝，及抗生物素抗体-染料缀合物；
帮手探针：HP SEQ ID No 3及HP SEQ ID No 4，以1012拷贝。
目标：872bp DNA，以1011-108拷贝。
结果
见图7
结论
使用直接探针捕获(见上述(i))及通用探针捕获(见上述(ii))，帮手探针改良了目标核酸的检测敏感度。
这些结果支持了实施例2、3及4的结论，即帮手探针在检棒上增强核酸间的杂交。
实施例6
实验构成
捕获形式：直接探针捕获(cp)(Seq ID No 10)固定于检棒上；
检测形式：检测探针(dp)包含偶联生物素的Seq ID No 13的核酸，以1012拷贝，及抗生物素抗体-染料缀合物；
帮手探针：帮手探针HP SEQ ID No 5及HP SEQ ID No 6，其杂交目标核酸中邻接于HP SEQ ID No 10辨识序列的序列；HP SEQ ID No 1及HP SEQ ID No 2，其杂交目标核酸中邻接于HP SEQ ID No 13辨识序列的序列，以1012拷贝。
目标：872bp DNA计5×1010拷贝。
结果
见第8图
结论
当捕获探针及检测探针杂交至相隔大于200nt的目标核酸序列时，目标核酸的检测敏感度会被帮手探针改善，其杂交目标核酸中邻接于检测探针辨识序列的各边。
实施例7
帮手探针在CT检测上的效果
实验构成
捕获序列：Seq ID No 15
捕获形式：
直接探针捕获：探针包含偶联固定于检棒上的BSA的Seq ID No 15核酸；
抗体捕获：抗DNP抗体(α-DPN捕获)固定于检棒膜上；捕获探针包含偶联DPN的Seq ID No 15核酸。
检测形式：检测探针包含各偶联至数个生物素检测配体的Seq IDNo 18或13的核酸，及抗生物素抗体-染料缀合物。检测探针1012拷贝；
帮手探针：HP SEQ ID No 3及HP SEQ ID No 4，以1012拷贝，帮手探针能够杂交目标核酸中邻接于捕获探针辨识序列的区域；
目标：CT原粒体2.4×107拷贝/测试。
结果
    捕获     直接探针捕获     抗体捕获
    帮手     有     无     有     无
    信号     4.0     2.5     1.5     0.5
实施例7的结论
利用直接探针捕获或抗体捕获的CT细胞隐性质粒的检测可通过使用帮手探针而改进。
依照本发明使用帮手探针会增强检棒膜上或溶液中所发生的杂交。
以上实施例1至7中，帮手探针与捕获及检测探针杂交至双链目标核酸中的同一链。在相似实验中，当帮手探针杂交至双链目标核酸中捕获及检测探针辨识链的相对链时未发现其增强目标核酸的检测敏感度。
实施例8
砂眼衣原体的单一步骤核酸检棒分析检测
实验构成
试剂：
捕获形式：以BSA载体固定于检棒膜上的寡核苷酸探针捕获；
检测形式：多生物素标记的检测探针；抗生物素抗体-胶体金缀合物；
样品制备：于PBS缓冲液中制备砂眼衣原体(Ct)原粒体细胞的浓度为106拷贝/μl至103拷贝/μl，且于100℃加热20分钟；
杂交/检棒工作缓冲液：标准杂交缓冲液，含盐、去污剂及如BSA或奶粉的封阻蛋白。
方法：
检测探针、帮手探针及EB的5×106至103拷贝稀释于杂交缓冲液并配制成80μl，且于100℃加热7分钟。之后混合物短暂离心以收集所有液体，且与20ml抗生物素抗体-胶体金混合，将整个100μl混合物吸至检棒上，并使其显示出信号。
结果及讨论
结果示于下表且图9显示约104拷贝的Ct EB可以在少于一小时内(包括制备步骤)以单一步骤核酸检棒分析检测。
虽然如此出示的检棒检测分析具有大约相当于其他夹心式杂交分析(sandwich hybridisaion assays)的检测敏感度，但其具有快速及简单性的主要优点。
公布于PCT WO 93/1322的检测Ct夹心式杂交分析为复杂的多成分微滴定板式分析，其不能于5小时内完成。此分析为多步骤分析，需要以确定的顺序渐次添加其成分，且于添加每一新成分后需要孵育和清洗步骤。
本发明的核酸检棒分析主题可于单一步骤内完成，而不需要不同步骤以添加成分及清洗。此夹心式杂交分析并不需要多于一种的溶液条件，以使其有利于杂交和其它亲合配对形式。相同的溶液条件也十分适合于各成分在检棒膜上自由迁移。
已发现本发明的方法显著增加目标核酸的检棒检测敏感度。尤其是双链核酸及环状双链目标核酸的检测大为改进。
图例说明
图7
    A)抗体捕获   B)直接探针捕获   C)通用探针捕获
信号5xE9 3.5 2.0 3.0
灵敏度 E9 5xE9 E9
    D)抗体捕获-带有帮手探针   E)直接探针捕获-带有帮手探针   F)通用探针捕获-带有帮手探针
信号5xE9 3.5 4.0 3.0
灵敏度 E9 5xE8 5xE8(非常微弱)
图9
砂眼衣原体的单一步骤核酸检棒分析检测
数字指示砂眼衣原体原粒体的数量
*NC：负对照
图10
表：砂眼衣原体的单一步骤核酸检棒分析检测

Claims (54)

1.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及捕获探针，固定于层析片上远离接触端的捕获带，该捕获探针能够杂交目标核酸的第一序列；
b)将样品溶液同以下内容孵育：
在检测探针附着目标核酸的条件下能附着目标核酸的检测探针，由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；及
第一帮手探针，其能够杂交目标核酸第二序列，并由此增强捕获探针对目标核酸的杂交，在第一帮手探针杂交第二序列的条件下孵育样品溶液及第一帮手探针；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，而使检测探针、第一帮手探针及目标核酸之间所形成的复合物能通过毛细作用移至捕获带，且通过捕获探针杂交复合物的目标核酸而结合至捕获带；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
2.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有：接触端以接触样品溶液；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分；
b)将样品溶液与以下内容孵育：
在检测探针附着目标核酸的条件下能附着目标核酸的检测探针，由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；
在捕获探针杂交至第一序列的条件下能够杂交至目标核酸的第一序列的捕获探针，当捕获探针已杂交了第一序列时，该捕获探针能够被捕获部分结合；及
第一帮手探针，能够杂交至目标核酸第二序列并由此增强捕获探针对目标核酸的杂交，在第一帮手探针杂交第二序列的条件下，孵育样品溶液及第一帮手探针；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，以使检测探针、捕获探针、第一帮手探针及目标核酸之间所形成的复合物能通过毛细作用移至捕获带，且通过捕获部分结合复合物的捕获探针而结合至捕获带；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
3.根据权利要求第1或2项的方法，其中第二序列与第一序列间隔多达10个核苷酸。
4.根据权利要求第3项的方法，其中第二序列紧邻于第一序列。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将样品溶液与第二帮手探针孵育，后者能够杂交目标核酸第三序列的并由此增强捕获探针对目标核酸的杂交，在第二帮手探针杂交第三序列的条件下孵育样品溶液及第二帮手探针。
6.根据权利要求第5项的方法，其中第二及第三序列位于第一序列两侧。
7.根据权利要求第6项的方法，其中第三序列与第一序列间隔多达10个核苷酸。
8.根据权利要求第7项的方法，其中第三序列紧邻于第一序列。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中检测探针包含能够杂交目标核酸的吊钩检测探针，及能够杂交吊钩检测探针的通用检测探针。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中检测探针能够杂交至目标核酸的第四序列而将检测探针附着于目标核酸。
11.根据权利要求第10项的方法，其中样品溶液与第三帮手探针孵育，后者能够杂交目标核酸第五序列并由此增强检测探针对第四序列的杂交，在第三帮手探针杂交第五序列的条件下孵育样品溶液及第三帮手探针。
12.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸；
b)将样品溶液与帮手探针接触，后者能够杂交目标核酸并由此增强捕获探针对目标核酸的杂交，在帮手探针杂交目标核酸的条件下将样品溶液与帮手探针接触；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，通过毛细作用使样品溶液移至捕获带，而使帮手探针及目标核酸之间形成的复合物能通过捕获探针杂交复合物的目标核酸而在捕获带被捕获；及
d)检查捕获带上目标核酸的存在。
13.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分；
b)将样品溶液与以下内容接触：
在捕获探针杂交至目标核酸的条件下能够杂交目标核酸的捕获探针，当捕获探针已杂交了目标核酸时，该捕获探针能够被捕获部分结合；及
帮手探针，其能够杂交目标核酸并由此增强捕获探针对目标核酸的杂交，在帮手探针杂交目标核酸的条件下，将样品溶液与帮手探针接触；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，通过毛细作用使样品溶液移至捕获带，而使捕获探针、帮手探针及目标核酸之间所形成的复合物能通过捕获部分结合复合物的捕获探针而在捕获带被捕获；及
d)检查捕获带上目标核酸的存在。
14.根据前述权利要求任一项的方法，其中捕获探针包含杂交吊钩捕获的通用捕获探针。
15.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸的第一序列；
b)将样品溶液与以下内容孵育：
在检测探针杂交目标核酸的条件下能够杂交目标核酸第二序列的检测探针，由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；及
第一帮手探针，其能够杂交目标核酸第三序列并由此增强检测探针对第二序列的杂交，在第一帮手探针杂交第三序列的条件下孵育样品溶液及第一帮手探针；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，而使检测探针、第一帮手探针及目标核酸之间所形成的复合物能通过毛细作用移至捕获带，且通过捕获探针杂交复合物的目标核酸而结合至捕获带；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
16.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分；
b)将样品溶液与以下内容孵育：
在捕获探针杂交第一序列的条件下能够杂交目标核酸的第一序列的捕获探针，当捕获探针已杂交了第一序列时该捕获探针能够被捕获部分结合；
在检测探针杂交至第二序列的条件下能够杂交目标核酸第二序列的检测探针，由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；及
第一帮手探针，能够杂交至目标核酸第三序列并由此增强检测探针对目标核酸的杂交，在第一帮手探针杂交第三序列的条件下孵育样品溶液及第一帮手探针；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，而使检测探针、捕获探针、第一帮手探针及目标核酸之间所形成的复合物能通过毛细作用移至捕获带，且通过捕获部分结合复合物的捕获探针而结合至捕获带；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
17.根据权利要求第15或16项的方法，其中第三序列与第二序列间隔多达10个核苷酸。
18.根据权利要求第17项的方法，其中第三序列紧邻于第二序列。
19.根据权利要求第15至18项中任一项的方法，其中样品溶液与第二帮手探针孵育，后者能够杂交目标核酸第四序列并由此能够增强检测探针对目标核酸的杂交，在第二帮手探针杂交第四序列的条件下孵育样品溶液及第二帮手探针。
20.根据权利要求第19项的方法，其中第三及第四序列位于第二序列两侧。
21.根据权利要求第20项的方法，其中第四序列与第二序列间隔多达10个核苷酸。
22.根据权利要求第21项的方法，其中第四序列紧邻于第二序列。
23.根据权利要求第15至22项中任一项的方法，其中捕获探针包含杂交吊钩捕获探针的通用捕获探针。
24.根据前述权利要求中任一项的方法，其中探针同样品溶液中目标核酸的杂交于单一步骤中进行。
25.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸；及帮手探针，可释放地固定于层析片接触端及捕获带之间，该帮手探针能够杂交目标核酸并由此增强捕获探针对目标核酸的杂交；
b)将层析片的接触端与样品溶液接触，使样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放帮手探针，并且当样品溶液向捕获带移动时，允许释放的帮手探针杂交样品溶液中的目标核酸，以使包含目标核酸及帮手探针的复合物可通过捕获探针杂交复合物的目标核酸而在捕获带被捕获；及
c)检查捕获带上目标核酸的存在。
26.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分；及捕获探针，可释放地固定于层析片接触端及捕获带之间，该捕获探针能够杂交目标核酸，且当捕获探针已杂交了目标核酸时，其能够被捕获部分结合；
b)将样品溶液同以下内容孵育：
帮手探针，能杂交目标核酸并由此可增强捕获探针对目标核酸的杂交，在帮手探针杂交目标核酸的条件下；及
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，使样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放捕获探针并且当样品溶液向捕获带移动时，允许释放的捕获探针杂交样品溶液中的目标核酸，而使包含目标核酸、捕获探针及帮手探针的复合物可通过捕获部分结合复合物的捕获探针而在捕获带被捕获；及
d)检查捕获带上目标核酸的存在。
27.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获部分；及捕获探针，可释放地固定于层析片接触端于捕获带之间，该捕获探针能够杂交目标核酸，且当捕获探针已杂交了目标核酸时，能够被捕获部分结合；及帮手探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该帮手探针能够杂交目标核酸宾由此增强捕获探针对目标核酸的杂交；及
b)将层析片的接触端与样品溶液接触，使样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放捕获探针及帮手探针，并且当样品溶液向捕获带移动时，允许释放的捕获探针及帮手探针杂交样品溶液中的目标核酸，而使包含目标核酸、捕获探针及帮手探针的复合物可通过捕获部分结合复合物的捕获探针而在捕获带被捕获；及
c)检查捕获带上目标核酸的存在。
28.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸；及检测探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该检测探针能够杂交目标核酸并由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；
b)将样品溶液同以下内容孵育：
帮手探针，能够杂交目标核酸并由此可增强检测探针对目标核酸的杂交，在帮手探针杂交目标核酸的条件下，孵育样品溶液及帮手探针；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，使样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放检测探针，并且当样品溶液向捕获带移动时，允许释放的检测探针杂交样品溶液中的目标核酸，而使包含目标核酸、帮手探针及检测探针的复合物可通过捕获探针杂交复合物的目标核酸而在捕获带被捕获；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
29.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交至目标核酸；及检测探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该检测探针能够杂交目标核酸并由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；及帮手探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该帮手探针能够杂交目标核酸并由此增强检测探针对目标核酸的杂交；及
b)将层析片的接触端与样品溶液接触，使样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放帮手探针及检测探针，并且当样品溶液向捕获带移动时，允许释放的帮手探针及检测探针杂交至样品溶液中的目标核酸，而使包含目标核酸、帮手探针及检测探针的复合物可通过捕获探针杂交复合物的目标核酸而在捕获带被捕获；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
30.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获部分；及捕获探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该捕获探针能够杂交目标核酸，且当捕获探针已杂交了目标核酸时，能够被捕获部分结合；
b)将样品溶液同以下内容孵育：
检测探针，能够杂交目标核酸并由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸，在检测探针杂交目标核酸的条件下孵育检测探针与样品溶液；且
帮手探针，能够杂交目标核酸并由此增强检测探针对目标核酸的杂交，在帮手探针杂交目标核酸的条件下孵育样品溶液与帮手探针；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，使样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放捕获探针，并且当样品溶液向捕获带移动时，允许释放的捕获探针杂交样品溶液中的目标核酸，而使包含目标核酸、捕获探针、帮手探针及检测探针的复合物可通过捕获部分结合复合物的捕获探针而在捕获带被捕获；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
31.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获部分；及检测探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该检测探针能够杂交目标核酸并由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；
b)将样品溶液同以下内容孵育：
捕获探针，能杂交至目标核酸且当捕获探针已杂交了目标核酸时能够被捕获部分结合，在捕获探针杂交目标核酸的条件下；及
帮手探针，能杂交目标核酸并由此增强检测探针对目标核酸的杂交，在帮手探针能够杂交目标核酸的条件下；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，使样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放检测探针，并且当样品溶液向捕获带移动时，允许释放的检测探针杂交至样品溶液中的目标核酸，而使包含目标核酸、捕获探针、帮手探针及检测探针的复合物可通过捕获部分结合复合物的捕获探针而在捕获带被捕获；及
d)检查捕获带上检测探针的存在。
32.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获部分；及检测探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该检测探针能够杂交目标核酸，由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；及帮手探针，可释放地固定于层析片，该帮手探针能够杂交目标核酸，并由此增强检测探针对目标核酸的杂交；
b)将样品溶液同以下内容孵育：
捕获探针，能够杂交至目标核酸且当捕获探针已杂交目标核酸时能够被捕获部分结合，在捕获探针杂交目标核酸的条件下，将捕获探针与样品溶液孵育；及
帮手探针，能够杂交至目标核酸并由此增强检测探针对目标核酸的杂交，在帮手探针杂交目标核酸的条件下，将帮手探针与样品溶液一同孵育；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，使样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放检测探针及帮手探针，并且当样品溶液向捕获带移动时，允许释放的检测探针及帮手探针杂交至样品溶液中的目标核酸，而使包含目标核酸、捕获探针、帮手探针及检测探针的复合物可通过捕获部分结合复合物的捕获探针而在捕获带被捕获；且
d)检查捕获带上检测探针的存在。
33.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获部分；及检测探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该检测探针能够杂交至目标核酸，由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；及捕获探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该捕获探针能够杂交目标核酸，且当捕获探针已杂交至目标核酸，能够被捕获部分结合；
b)将样品溶液同帮手探针孵育，其能够杂交目标核酸并由此增强检测探针对目标核酸的杂交，在帮手探针杂交目标核酸的条件下，将帮手探针与样品溶液孵育；
c)将层析片的接触端与样品溶液接触，使样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放检测探针及捕获探针，并且当样品溶液向捕获带移动时，允许释放的检测探针及捕获探针杂交至样品溶液中的目标核酸，而使包含目标核酸、捕获探针、帮手探针及检测探针的复合物可通过捕获部分结合复合物的捕获探针而在捕获带被捕获；且
d)检查捕获带上检测探针的存在。
34.测试样品溶液中目标核酸存在的方法，其包含：
a)提供层析片，其具有接触端以接触样品溶液；及固定于层析片远离接触端的捕获带的捕获部分；及检测探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该检测探针能够杂交至目标核酸，由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；及帮手探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该帮手探针能够杂交至目标核酸并由此增强检测探针对目标核酸的杂交；
及捕获探针，可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间，该捕获探针能够杂交目标核酸，且当捕获探针已杂交了目标核酸时，能够被捕获部分结合；
b)将层析片的接触端与样品溶液接触，使样品溶液通过毛细作用移至捕获带，由此从层析片上释放检测探针、帮手探针及捕获探针，并且当样品溶液向捕获带移动时，允许释放的检测探针、帮手探针及捕获探针杂交至样品溶液中的目标核酸，而使包含目标核酸、捕获探针、帮手探针及检测探针的复合物可通过捕获部分结合复合物的捕获探针而在捕获带被捕获；且
c)检查捕获带上检测探针的存在。
35.试剂盒，用于在疑似含有目标核酸的样品溶液中测试目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有用以接触样品溶液的接触端；及
固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸的第一序列；
ii)帮手探针，能够杂交目标核酸第二序列并由此增强捕获探针对目标核酸的杂交，可选择地
iii)检测探针，能够附着目标核酸，而允许直接或间接地检测目标核酸。
36.根据权利要求第35项的试剂盒，其中帮手探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间。
37.试剂盒，用于在疑似含有目标核酸的样品溶液中测试目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有用以接触样品溶液的接触端；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸的第一序列；
ii)检测探针，能够杂交目标核酸第二序列，而允许直接或间接地检测目标核酸；及
iii)帮手探针，能够杂交目标核酸第三序列并由此增强检测探针对第二序列的杂交。
38.根据权利要求第37项的试剂盒，其中检测探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间。
39.根据权利要求第37项的试剂盒，其中检测探针及帮手探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间。
40.试剂盒，用于在疑似含有目标核酸的样品溶液中测试目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有用以接触样品溶液的接触端的；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分；
ii)捕获探针，能够杂交目标核酸的第一序列，且当捕获探针已杂交了目标核酸的第一序列时，其能够被捕获部分结合；
iii)帮手探针，能够杂交目标核酸第二序列并由此增强捕获探针对第一序列的杂交，及可选地
iii)检测探针，能够附着目标核酸，而允许直接或间接地检测目标核酸。
41.根据权利要求第40项的试剂盒，其中捕获探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间。
42.根据权利要求第40项的试剂盒，其中捕获探针及帮手探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间。
43.试剂盒，用于在疑似含有目标核酸的样品溶液中测试目标核酸的存在，其包含：
i)检棒，其包括：
层析片，其具有用以接触样品溶液的接触端；及固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分；
ii)捕获探针，能够杂交至目标核酸的第一序列且当捕获探针已杂交了第一序列时，其能够被捕获部分结合；
iii)检测探针，能够杂交目标核酸第二序列而允许直接或间接地检测目标核酸；及
iv)帮手探针，能够杂交目标核酸第三序列并由此增强检测探针对第二序列的杂交。
44.根据权利要求第43项的试剂盒，其中捕获探针和/或检测探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间。
45.根据权利要求第43项的试剂盒，其中帮手探针及检测探针，及可选地捕获探针可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间。
46.层析片，用于在样品溶液中测试目标核酸的存在，其包含：
用以接触样品溶液的接触端；固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸；及可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的帮手探针，该帮手探针能够杂交目标核酸并由此增强捕获探针对目标核酸的杂交。
47.层析片，用于在样品溶液中测试目标核酸的存在，其包含：
用以接触样品溶液的接触端；固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸；及可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的帮手探针，该帮手探针能够杂交目标核酸并由此增强检测探针对目标核酸的杂交。
48.层析片，用于在样品溶液中测试目标核酸的存在，其包含：
用以接触样品溶液的接触端；
固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分，该捕获部分能够结合杂交了目标核酸的捕获探针；
可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的捕获探针，该捕获探针能够杂交至目标核酸，及可选地
可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的帮手探针，该帮手探针能够杂交目标核酸并由此增强捕获探针对目标核酸的杂交。
49.层析片，用于在样品溶液中测试目标核酸的存在，其包含：
用以接触样品溶液的接触端；
固定于层析片上远离接触端的捕获带的捕获部分，该捕获部分能够结合杂交了目标核酸的捕获探针；
可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的检测探针，该检测探针能够杂交目标核酸，由此允许利用检测探针来直接或间接地检测目标核酸；及可选地
i)可释放地固定于层析片接触端与捕获带之间的捕获探针，该捕获探针能够杂交目标核酸，且能够被捕获部分结合；和/或
ii)帮手探针，能够杂交目标核酸并由此增强检测探针对目标核酸的杂交。
50.探针在检棒分析中的用途，以测试样品溶液中目标核酸的存在。
51.根据权利要求第50项的用途，其中帮手探针增强捕获探针或检测探针对目标核酸的杂交。
52.实质上分离的核酸分子或核酸类似物，其具有序列对应于SEQID NOS：1-18任何一项的序列。
53.根据权利要求第52项的实质上分离的核酸分子或核酸类似物的用途，在测试样品溶液中CT目标核酸的存在时作为帮手探针以增强对CT目标核酸的检测。
54.根据权利要求第35至49项中任一项的试剂盒或层析片的用途，以测试样品溶液中目标核酸的存在。
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