TWI281501B - Improved capture and detection of target nucleic acid in dipstick assays - Google Patents

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1281501 五、 發明說明 ( 1: ) 本 發 明 係 關 於 藉 由檢棒（d 1 p s t i c k )改 良 核 酸 偵 測 之 方 法 本 發 明 之 方 法 用以測試樣品溶液中目 標 核 酸 之 存 在 例 如 鑑 定 病 患 是 否 感染微生物引起之疾病 如 砂 眼 衣 原 體 ( Ch 1 a mydi a trachomatis, CT)。 ---- & 傳 統 試 驗 以 測試樣品溶液中目標核 酸 之 存在 乃 依 賴 使 用 聚 合 酶 鏈 狀 反 應（PCR)將目標核酸增 幅 雖 妖 > \ N \ 此 反 應 允 許 S 標 核 酸 之 少 量偵測，但在結果獲得 之 刖 需 化 費 數 小 時 此 爲 顯 著 不 利 的，因爲時常期望盡快 獲 得 結 果 例 如 要 病 患 等 待 一 小 段 時間。這些方法更不利 的 是 需 要 昂 貴 的 專 業 器 材 以 進 行 反 應，及相關高價之試劑 〇 相 較 之 下 檢 棒 可在無需要任何專業器 材 而 偵 測 未 增 幅 之 標 核 酸 且 結 果可獲致比基於PCR之 方 法 更 爲 快 速 因 此 病 患 僅 需 — 次 門診，且病患能於同一 次 門 診 治 療 ， 此 具 體 的 好 處 在 於 病 患不太可能或不必於曰 後 返 回 治 療 進 行 檢 棒 試 驗 之 費 用 亦可明顯低於基於PCR , 之: 方; 法1 的1 t J 〇 在典型 傳 統 檢 棒 分析中，於美國專利5 3 1 0 6 5 0 號 中 述 及 單 股 DNA 捕 丨獲 丨針 •固定於硝化纖維濾膜接 觸 端 另 一 端 之 捕 獲 帶 中 〇 捕 獲 探 針 之序列與偵測之目標核 酸 第 .. 之 序 列 互 補 標 示 單 股 DNA偵測探針可釋放地固 定於 硝 化 纖 維 濾 膜 上 1 而 位於 濾 膜 之捕獲帶及接觸端間的 探 針 帶 中 ? 偵 測 探 針之序列: S補於目標核酸第二區序列（不 同於: 第. 一區: )< > 偵 測 認 爲 含有 標DNA之樣品溶液中的 巨 標 DNA， 硝 化 纖 維 濾 膜 之 接 觸 丄山 m 與樣品溶液接觸，樣品 -3- 溶 液 藉 由 毛 細 作 1281501 五、發明說明（2) 用在濾膜上虹吸，且經過探針帶及捕獲帶，當樣品溶液通 過探針帶時，其移動偵測探針而與樣品溶液一起上升而朝 向捕獲帶，移動的偵測探針之後能雜交至存在於樣品溶液 中任何目標DNA之第二區。當雜交的偵測探針及目標DNA 到達捕獲帶，目標DNA之第一區能雜交至固定的捕獲探針 ，因此在目標核酸、捕獲帶及標示偵測探針間形成三元複 合物，因此，捕獲帶上標示之出現表示其樣品溶液中目標 DNA之存在。 依傳統檢棒之第二型態，標示DNA偵測探針並非固定於 硝化纖維濾膜上，反而是在偵測探針可雜交至樣品溶液中 的任何目標核酸之條件下，將偵測探針加入樣品溶液中， 之後硝化纖維濾膜之接觸端與樣品溶液接觸，當樣品溶液 虹吸至檢棒上，雜交至偵測探針之目標核酸上升至硝化纖 維濾膜，且於捕獲帶中被捕獲探針捕獲。 雖然使用傳統檢棒獲得結果比使用需增幅目標核酸之偵 測方法還快，但藉由傳統檢棒之核酸偵測的敏感度還是低 的，藉由傳統檢棒的雙股目標核酸之偵測敏感度特別的低 ，尤其當目標核酸大小增加時，且爲環狀雙股目標核酸時 使用傳統檢棒事實上被認爲是無法偵測的’因此’樣品溶 液中目標核酸之存在有時不能被偵測到，所以需要改良藉 由檢棒的目標核酸偵測之敏感度，尤其是雙股或環狀雙股 目標核酸偵測之敏感度。 在最明顯的意義中，本發明提供一種幫手探針（he iPer 1281501 五、 發明說明 ( 3 ) P r o b e〕 之用法 ，在檢棒分析中增強捕獲及/ 或 偵 測 探 針 對 g 標 核 酸 的 雜 交 〇 在 此 使 用 之 名 詞 “ 檢 棒 分 析 ” 系 表 示 使 用 檢 棒 之 任何 分 析 5 其 中 樣 品 溶 液 與 檢 棒 接 觸 以 引 起 樣 品 溶 液 藉 由 毛 細 作 用 移 至 檢 棒 之 捕 獲 Tm 5 因 此 可 使 樣 品 溶 液 中 巨 標 核 酸 於 捕 獲 帶 中 被 捕 獲 及 偵 測 〇 根 據 本 發 明 之 第 一 觀 點 j 其 提 供 —. 種 方 法 以 測 試 樣 品 溶 液 中 S 標 核 酸 之 存在 ? 其包含 ； a ) 提 供 一 種 具 有 接 觸 七山 m 以 接 觸 樣 品 試 劑 之 層 析 片 > 及 固 定 於 層 析 片 接 觸 端 另 一 七山 朗 之 捕 獲 帶 的 捕 獲 探 針 ? 捕 獲 探 針 能 夠 雜 交 至 巨 標 核 酸 第 一 序 列 > b)在 偵 測 探 針 連 接 至 標 核 酸 之 條 件 下 5 培 育 具 有 連 接 至 標 核 酸 之 偵 測 探 針 的 樣 品 溶 液 因 此 可 利 用 偵 測 探 針 來 直 接 或 間 接 偵 測目 標 核 酸 且 第 一 幫 手 探 針 能 夠 雜 交 至 g 標 核 酸 第 二 序 列 所 以 增 強 捕 獲 探 針 雜 交 至 標 核 酸 而 在 第 一 幫 手 探 針 雜 交 至 S 標 核 酸 之 條 件 下 培 育 樣 品 溶 液 及 第 一 幫 手 探 針 c ) 層 析 片 之 接 觸 端 與 樣 品 溶 液 接 觸 ? 故在 偵 測 探 針 Λ 第 一 幫 手 探 針 及 標 核 酸 間 所 形 成 之 複 合 物 能 藉 由 毛 細 作 用 移 至 捕 獲 帶 且 藉 由 捕 獲 探 針 雜 交 至 複 合 物 之 標 核 酸 而 結 合 至 捕 獲 帶 及 d) 檢 查 捕 獲 帶 上 偵 測 探 針 之 存在 〇 根 據 本 發 明 之 第 觀 點 其 -5- 亦 提 供 種 套 組 以 測 試 樣 品 1281501 五、 發明說明 ( 4； ) 溶 液 中目 標 核 酸 之 存在，其包含： 1 ) --. 種檢 棒 包 括 一種 具 有 接 觸 端以接觸樣品試劑之層析 片 及 一種 固 定 層 析 片接觸端另一端之捕獲帶 的 捕 獲 探 針 捕 獲探 針 能 夠 雜 交至目標核酸第一序列； i i ) 一'種 能 夠 雜 交 至目標核酸第二序列的第 一 幫 手 探 針 9 因此 增 強 捕 獲 探針雜交至目標核酸，且 可 c巳巳 擇 地 11 1 ) 一種 能 夠 連 接 至目標核酸之偵測探針， 其 可 利 用 偵 測 探針 直 接 或 間 接偵測目標核酸。 在 此使 用 之 名 詞 “層析片”系表示藉由毛 細 現 像 運 送 溶 液 的 任何 具 滲 透 性 帶狀物質。 偵 測探 針 及 第 — 幫手探針可在任何順序或 同 時 添 加 入 樣 品 溶 液中 與 樣 品 溶液一起培育。 其 可了 解 根 據 步驟（b )，在樣品溶液 已 與 偵 測 探 針 及 第 一幫 手 探 針培 育之後，層析片之接觸端 一 般 將 會 與 樣 品 溶 液接 觸 ， 妖 /\\\ 而 ，在步驟（b )完成後（ 即 層 析 片 之 接 觸 七山 朗 在步 驟 ( b : )之前或當時可與樣品溶液 接 觸 ) 接 觸 端 與 樣品 溶 液 接 觸 對於本發明來說是並非必 要1 的: 工1 ί乍 〇 本 發明 之 第 -- 觀 點的捕獲探針可包含單一 探 針 或 一 種 以 上 之 探針 例如 捕 獲探針可含固定至層析片 的 一 般 探 針 ( u η IV e r s a 1 p r 〇 b e ) 及能雜交'至一般探針之 吊 鈎 捕 獲 探 針 ( hook c ap t u re P r 〇 b e )，吊鈎探針能夠雜 交 至 巨 標 核 酸 第 序列 ο -6 - 1281501 五、發明說明（5 ) 使用一般探針及吊鈎捕獲探針作爲捕獲探針之優點在於 具有一般探針固定之層析片可被用於偵測任何，目標核酸， 在層析片用以測試所欲之核酸存在前，吊鈎探針能夠雜交 至所欲之目標核酸爲簡易選擇及雜交至一般探針。 根據本發明之第二觀點，其提供，一種方法以測試樣品溶 液中目標核酸之存在，其包含： a )提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品試劑；及 一種固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端）的 捕獲部分； b )樣品溶液與偵測探針一起培育： 在偵測探針連接至目標核酸之條件下，偵測探針能夠 連接至目標核酸，因此可利用偵測探針來直接或間接偵 測目標核酸； 在捕獲探針雜交至第一序列之條件下，捕獲探針能夠 雜交至目標核酸第一序列，當捕獲探針已雜交至第一序 列，捕獲探針能夠被捕獲部分連結；且 第一幫手探針能夠雜交至目標核酸第二序列，所以增 強捕獲探針雜交至目標核酸，而在第一幫手探針雜交至 第二序列之條件下，培育樣品溶液及第一幫手探針； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，故在偵測探針、捕獲 探針、第一幫手探針及目標核酸間所形成之複合物能藉 由毛細作用移至捕獲帶，且藉由捕獲部分連結至複合物 之捕獲探針而連結至捕獲帶；及 1281501 五、發明說明（6) d)檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 根據本發明之第二觀點，其亦提供一種套組以測試樣品 溶液中目標核酸之存在，其包含： i ) 一種檢棒，包括： 一種具有接觸端以接觸樣品試劑之層析片；及一種固 疋於層析片接觸端之另一端之捕獲帶的捕獲部分； 1 1 ) 一種能夠雜交至目標核酸第一序列之捕獲探針，當捕 獲探針已雜交至第一序列，期能被捕獲部分結合； 1 Π ) —種能夠雜交至目標核酸第二序列之第一幫手探針， 因此可增強捕獲探針雜交至第一序列；且任意地 1 π ) —種能夠連接至目標核酸之偵測探針，其可直接或間 接偵測目標核酸。 本發明之第二觀點的捕獲部分可包含能雜交至捕獲帶之 一般捕獲探針。或者是一旦捕獲探針已雜交至目標核酸， 捕獲部分能藉由非鹼基配對作用結合至捕獲探針。 例如當捕獲探針已雜交至目標核酸，捕獲部分可包含結 合之抗體或抗體片段而能形成雙股。或者是捕獲探針可包 含一捕獲配位體，其能被捕獲部分結合。當捕獲探針包含 捕獲配位體時，捕獲部分能包含抗體或抗體片段。如果捕 獲配位體包含生物素，則捕獲部分能包含抗生物素抗體或 抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白或其衍生物且保留生物素 結合之活性。 本發明之第一及第二觀點的第二序列應位於與目標核酸 1281501 劃線頁 五、發明說明（7) 第一序列不同之區域，較佳的第二序列相隔第一序列最多 10個核苷酸，更佳之第二序列則緊接著第一序列。 在本發明之第一及第二觀點的較佳方法中，樣品溶液與 能夠雜交至目標核酸第三序列的第二幫手探針一起培育， 因此能夠增強捕獲探針雜交至目標核酸，在第二幫手探針 雜交至目標核酸之條件下，培育樣品溶液及第二幫手探針 〇 第三序列應位於與目標核酸第一及第二序列不同之區域 ，較佳的第二及第三序列位於第一序列之側，更佳之第二 及第三序列相隔第一序列各邊最多10個核苷酸，最佳之 第二及第三序列則緊接著第一序列之各邊。 捕獲探針、偵測探針及幫手探針可包含核酸或核酸類似 物，捕獲探針可包含單一探針或多於一種探針。 在本發明之第一及第二觀點的偵測探針可爲一種標示， 其共價連結至目標核酸，因此可直接偵測目標核酸。或者 是偵測探針能爲一種配位體，其共價連結至目標核酸，因 此可利用能結合至配位體之配位體結合部分間接偵測目標 核酸。偵測探針能以前驅物之形式添加至樣品溶液中，其 與目標核酸反應以共價地連結偵測探針至目標核酸。 或者是偵測探針能夠藉由非共價交互作用連結至目標核 酸’例如偵測探針能夠雜交至目標核酸第四序列。偵測探 針能被標示’因此當偵測探針藉由非共價交互作用已連結 至目標核酸時’可直接偵測目標核酸。或者是偵測探針能 1281501 五、發明說明（8 ) 包含配位體，因此當偵測探針藉由非共價交互作用已_ _ 至目標核酸時，可利用配位體結合部分間接偵測目標核_ 較佳 紡織染 之有色 抗生物 物且保 藉由抗 (例如 假設 育，則 手探針 夠雜交 第四序 下，一 當目 ΓΠ /τ-/τ- -- 用弟二 感度。 較佳 及第六 第五及 根據 的標示爲非放射反應標示，適合的標示之例 料、如膠狀金之金屬膠質溶液，及如有色乳 粒子。適合的配位體之例子包括生物素（例 素抗體或抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白$ 留生物素結合之活性而可偵測的）、螢光g 螢光素抗體而可偵測的）及2，4-二硝苯, 藉由抗DPN抗體而可偵測的）。 樣品溶液與第三且較佳地亦與第四幫手探务卜 可獲得進一步改良偵測目標核酸之敏感度。 能夠雜交至目標核酸第五序列，且第四幫手 至目標核酸第六序列，因此可增強偵測探針 列。在第三與第四幫手探針雜交至目標核酸 同培育樣品溶液及第三與第四幫手探針。 標核酸第一及第四序列相隔至少200核音酸 及第四幫手探針而可僅獲得任何明顯增強之 子包括 液粒子 如藉由 其衍生 (例如 〔Dp[s| ) 第 同培 幫 探針能 雜交至 之條件 時，使 偵測敏 的弟五及弟八序列’fl/·於％四序列之側，更佳的第五 序列相隔第四序列各邊最多1 〇個核苷酸，最佳之 第六序列則緊接著第四序列之各邊。 本發明之第二_點’其提供一種方法以測試樣品溶 -10- 1281501 五、發明說明（9 ) 液中目標核酸之存在，其包含： a )提供一種具有接觸端以接觸樣品試劑之層析片；及一種 固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端）的捕獲 探針，捕獲探針能夠雜交至目標核酸第一序列； b )樣品溶液與偵測探針一起培育： 在偵測探針雜交至目標核酸之條件下，偵測探針能夠 雜交至目標核酸第二序列，因此可利用偵測探針來直接 或間接偵測目標核酸；且 第一幫手探針能夠雜交至目標核酸第三序列，所以增 強偵測探針雜交至第二序列，而在第一幫手探針雜交至 第三序列之條件下，培育樣品溶液及第一幫手探針； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，以便在偵測探針、 第一幫手探針及目標核酸間所形成之複合物能藉由毛 細作用移至捕獲帶，且藉由捕獲探針雜交至複合物之 目標核酸而連結至捕獲帶；及 d)檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 根據本發明之第三觀點，其亦提供一種套組以測試樣 品溶液中疑似含有目標核酸之存在，其包含： 1 ) 一種檢棒，包括： • 一種具有接觸端以接觸樣品試劑之層析片；及一種固 定於層析片之捕獲帶（接觸端之另一端）的捕獲探針， 捕獲探針能夠雜交至目標核酸第一序列； i i) 一種偵測探針，其能夠雜交至目標核酸第二序列而可 1281501 五、發明說明（1〇) 直接或間接偵測目標核酸；且 i i i ) 一種第一幫手探針，其能夠雜交至目標核酸第三序列 ，因此增強偵測探針雜交至第二序列。 本發明之第三觀點的捕獲探針可包含單一探針或一種以 上之探針，例如捕獲探針可含固定於層析片的一般捕獲探 針及雜交至一般捕獲探針之吊鈎捕獲探針，吊鈎探針能夠 雜交至目標核酸第一序列。 根據本發明之第四觀點，其提供提供一種方法以測試樣 品溶液中目標核酸之存在，其包含： a )提供一種具有接觸端以接觸樣品試劑之層析片；及一種 固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端）的捕獲 探針； b )樣品溶液與捕獲探針一起培育： 在捕獲探針雜交至第一序列之條件下，捕獲探針能夠 雜交至目標核酸第一序列，而當捕獲探針已雜交至第一 序列，捕獲探針能夠被捕獲部分結合； 在偵測探針雜交至第二序列之條件下，偵測探針能夠 雜交至目標核酸第二序列，因此可利用偵測探針來直接 或間接偵測目標核酸；且 第一幫手探針能夠雜交至目標核酸第三序列，因此增 強偵測探針雜交至目標核酸，而在第一幫手探針雜交至 第三序列之條件下，培育樣品溶液及第一幫手探針； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，以便在偵測探針、 -12- 1281501 五、發明說明（11 ) 捕獲探針、第一幫手探針及目標核酸間所形成之複合 物能藉由毛細作用移至捕獲帶，且藉由捕獲部分結合 至複合物之捕獲探針而連結至捕獲帶；及 d )檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 根據本發明之第四觀點，其亦提供一種套組以測試樣 品溶液中疑似含有目標核酸之存在，其包含： i ) 一種檢棒，包括： 一種具有接觸端以接觸樣品試劑之層析片；及一種固 足於層析片之捕獲帶（接觸端之另一端）的捕獲部分， 捕獲探針能夠雜交至目標核酸第一序列； 1 1 ) 一種捕獲探針，其能夠雜交至目標核酸第一序列，且 當捕獲探針已雜交至第一序列時，能藉由捕獲部分被 結合； 1 1 1 ) 一種能夠雜交至目標核酸第二序列之偵測探針，而可 直接或間接偵測目標核酸；且 1 V ) —種能夠雜交至目標核酸第三序列之第一幫手探針， 因此增強偵測探針雜交至第二序列。 本發明之第四觀點的捕獲部分可包含能雜交至捕獲探針 之一般捕獲探針。或者是一旦捕獲探針已雜交至目標核酸 ’捕獲部分能藉由非鹼基配對作用連結至捕獲探針。 例如當捕獲探針已雜交至目標核酸，捕獲部分可包含結 合之抗體或抗體片段而可形成雙股。或者是捕獲探針可包 含一捕獲配位體，其能被捕獲部分結合。當捕獲探針包含 1281501 五、發明說明（12 ) 捕獲配位體時，捕獲部分能包含抗體或抗體片段。如果捕 獲配位體包含生物素，則捕獲部分能包含抗生物素抗體或 抗生蛋白鍵菌素、抗生物素蛋白或具衍生树且保留生物素 結合之活性。 本發明之第三及第四觀點的偵測探針可被標示，因此當 偵測探針已雜交至目標核酸’可直接偵測目標核酸。或者 是偵測探針能包含一種配位體，因此當偵測探針已雜交至 目標核酸，可利用配位體結合部分間接偵測目標核酸。 本發明之第三及第四觀點的第三序列較佳的相隔第一序 列最多1 0個核苷酸，更佳之第三序列則緊接著第二序列 〇 在本發明之第三及第四觀點的較佳方法中，樣品溶液與 能夠雜交至目標核酸第四序列的第二幫手探針一起培育， 因此能夠增強捕獲探針雜交至目標核酸，在第二幫手探針 雜交至第四序列之條件下，培育樣品溶液及第二幫手探針 0 本發明之第三及第四觀點的較佳方法，第三及第四序列 位於第二序列之側，更佳的第四序列相隔第二序列最多1 〇 個核苷酸，最佳之第四序列則緊接著第二序列。 當目標核酸第一及第二序列相隔至少200核苷酸時，以 本發明之第三及第四觀點的方法使用第一及第二幫手探針 ，可僅觀察到任何明顯增強之偵測敏感度。 如果本發明套組之偵測探針包含偵測配位體，則套組能 -14- 1281501 五、發明說明（13) 進一部包含能夠結合至偵測配位體之標示偵測配位體結合 部分，因此使用偵測探針及偵測配位體結合部分以標示目 標核酸之偵測。偵測配位體結合部分可爲抗體、抗體片段 或非抗體。 本發明之套組進一部包含使用層析片可偵測樣品溶液中 目標核酸所需之任何試劑。 根據本發明亦提供一種本質上分離的核酸分子，或具有 相對應於任何SEQ I D NOS : 1 - 1 8序列之序列的核酸類似 物。 根據本發明亦提供一種本質上分離的本發明之核酸分子 或核酸類似物之用法，測試在樣品溶液中此目標核酸之存 在時，作爲幫手探針以增強CT目標核酸之偵測。 在本發明所使用之幫手探針可增強捕獲或偵測探針結合 至單股或雙股目標核酸，當目標核酸爲單股，其被認爲藉 由確定目標核酸中，捕獲/偵測探針結合至目標核酸之區 域不形成顯著的二級構造，幫手探針能增強捕獲/偵測探 針結合至目標核酸。 其可了解幫手探針結合的目標核酸之區域並不總是接近 或緊接著捕獲/偵測探針所結合之區域，幫手探針雜交至 目標核酸之一個區域可改變位於遙遠位置之二級結構，因 此可使捕獲/'偵測探針較容易結合至位於遙遠位置之目標 核酸。 因此幫手探針所結合的目標核酸之區域可能會不同於基 -15- 1281501 五、發明說明（μ) 於捕獲/偵測探針所鑑定之目標核酸。然而，藉由具不同 探針及不同探針長度的實驗，熟悉此項技術者可輕易的決 幫手探針是最有效的。 當目標核酸爲雙股時，其被認爲藉由打開目標核酸中捕 獲或偵測探針結合區域之雙股，幫手探針雜交至目標核酸 增強了捕獲或偵測探針雜交至目標核酸◦或者是對於雙股 目標核酸’一般會被預期幫手探針結合至鄰近捕獲或偵測 探針結合區域。 爲了使幫手探針增強捕獲或偵測探針結合至目標核酸， 幫手探針應該在捕獲或偵測探針結合至目標核酸之前或同 時被雜交至目標核酸，而不是捕獲或偵測探針已經結合至 目標核酸之後。 一些具體例當中，幫手探針能增強捕獲或偵測探針雜交 至目標核酸，例如假設幫手探針雜交至目標核酸之區域介 於捕獲及偵測探針之間這是能實現的。 在本發明的一些具體例中，一或多種探針可釋放地固定 於層析片上而介於接觸端及捕獲帶之間，這些方法中，樣 品溶液藉由毛細作用由接觸端移動至捕獲帶，使得探針自 層析片上釋放而進入樣品溶液，然後釋放之探針可雜交至 樣品溶液中的目標核酸。 本發明所提供作爲具體例之幫手探針能增強偵測探針雜 交至目標核酸，在樣品溶液已與層析片之接觸端接觸而可 在捕獲帶捕獲目標核酸後，幫手探針（與偵測探針一同較 -16- 1281501 五、發明說明（15) 佳）能與層析片之捕獲帶接觸，其可藉由含有幫手探針（ 及偵測探針）之不同的幫手探針溶液直接運用至捕獲帶， 或在樣品溶液之後藉由層析片之接觸端接觸幫手探針溶液 而能完成之，因此使得幫手探針藉由毛細作用移至捕獲帶 。如果偵測探針不在幫手探針溶液中，其必須在幫手探針 之後接觸捕獲帶。 然而，在本發明較佳的方法中，在樣品溶液中探針雜交 至目標核酸（有別於捕獲探針被固定於捕獲帶上）完成於 樣品溶液接觸層析片之前。以探針雜交完成於單一步驟爲 最佳。 多步驟雜交能藉由在樣品溶液中以不同探針之連續雜交 至目標核酸，或藉由檢棒接觸各含有不同探針之不同溶液 而完成。一般來說，近來多步驟雜交的方法包含在每次與 不同探針溶液接觸之間的淸洗檢棒步驟。 當多步驟雜交能爲較佳之情況時，其將可了解較爲簡單 及快速的單一步驟雜交方式通常爲較佳的。 其最佳的樣品溶液之適合的組成爲可使雜交反應於單一 雜交步驟中發生，亦可使非鹼基配對作用發生（例如介於 偵測配位體與偵測配位體結合部分之間，及介於捕獲配位 體與捕獲配位體結合部分之間），且藉由毛細作用運送含 有目標核酸及-或多種雜交探針與（任意地）配位體結合 部分之複合物至檢棒上。 使用這種樣品溶液，其將可了解在樣品溶液直接接觸於 -1 7 - 1281501 五、發明說明（16) 檢棒之接觸端前（不需要先稀釋或改變樣品溶液），雜交 反應屆時能在單一反應中完成，且可發生任何配位體-配 位體結合部分之增加，如果欲使如樣品溶液移至捕獲帶， 配位體-配位體結合部分之增加能附加地或替換地在檢棒 上發生，因此使簡單及快速的檢棒偵目標核酸測較爲容易 〇 本發明者已發現這些結果可伴隨含標準雜交緩衝液（如 SSPE緩衝液或三羥甲基氫基甲烷（Tr1S )緩衝液）與鹽、 淸潔劑及如BSA或粉狀乳之封阻蛋白的樣品溶液而完成， 使用此分析之偵測目標核酸的敏感度已發現較其他檢棒分 析大約相等或更好。 本發明之具體例現藉由以附圖爲參考資料之實例描述， 其中： 第1圖顯示依照本發明之具體例使用檢棒以偵測目標核 酸； 第2圖列出依照本發明使用之幫手探針序列； 第3圖顯示實例1的實驗構成； 第4圖顯示實例2的實驗構成； 第5圖顯示實例3的實驗構成； 第6圖顯示實例4的實驗構成； 第7圖顯示實例5的實驗構成； 第8圖顯示實例6的實驗構成； 第9圖顯示單一步驟雜交分析之結果； -18- 1281501 五、發明說明（17) 以下實例說明使用本發明之方法以改良偵測目標核酸之 敏感度，實例係關於偵測砂眼衣原體（CT )擊性質體之 DNA片段。 CT爲一種最常見的性別傳染性疾病之病因，CT傳染病 可引起不孕或當懷孕時導致自然流產、死產或產後子宮內 膜炎。在新生兒方面，CT傳染病可引起視盲及慢性呼吸道 疾病。大約10%感染之男性及高於70%感染之女性並不表 現出CT傳染病之症狀。因此，CT傳染病之正確診斷非常 重要，以便可開始疾病之早期治療。 在下列實例中，使用檢棒1 0測試在樣品溶液1 4中偵測 雙股CT目標核酸1 2，檢棒1 0包含具有接觸端1 8之硝化 纖維帶1 6以接觸樣品溶液1 4，及固定於硝化纖維帶1 6之 捕獲帶22 (位於接觸端1 8之另一端）的捕獲探針20，抗 生物素抗體-染料結合劑24可分離地固定於硝化纖維帶之 接合帶2 6 (介於接觸端1 8及捕獲帶2 2之間），捕獲探針 2〇能夠雜交至目標核酸1 2單股（第一股）之第一序列。 各能雜交至雙股目標核酸1 2之第一股不同區域的偵測 探針28及幫手探針30之後添加至樣品溶液丨4，偵測探針 2 8包含偶聯至生物素的核酸（使用之方法爲熟悉技術者所 熟知）。包含偵測探針28及幫手探針30之樣品溶液14 加熱至足夠將雙股目標核酸1 2之互補股相互分離（其至 少分離第一股上偵測探針28及幫手探針30結合之區域） ，之後冷卻至偵測探針2 8及幫手探針3 0能夠雜交至雙股 -19- 1281501 五、發明說明（18) 目標核酸第一股，當偵測探針及幫手探針雜交至第一股， 第二股再退火（r e - a η n e a 1 i n g )至第一股，但，避免再退火 至第一股上偵測探針28及幫手探針30結合區域。 檢棒1 0之接觸端1 8隨後與樣品溶液1 4接觸，樣品溶 液1 4及任何被偵測探針2 8及幫手探針3 0雜交之目標核 酸1 2藉由毛細作用上升至檢棒1 〇，當樣品溶液1 4通過接 合帶2 6，其移動抗生物素抗體-染料結合劑2 4，釋放的抗 生物素抗體-染料結合劑24隨後能結合至生物素（其與目 標核酸1 2雜交的偵測探針2 8連結）。 在抗生物素抗體-染料結合劑24、偵測探針28、幫手探 針3 0及目標核酸1 2之間形成複合物，之後移至檢棒1 〇 之捕獲帶22，複合物之目標核酸可雜交至固定的捕獲探針 20，捕獲探針20被固定於捕獲帶22上，在這方法中當其 通過捕獲帶2 2時，並不能藉由樣品溶液1 4移動。所以， 結合至捕獲探針之複合物停留在捕獲帶，且可藉由抗生物 素抗體-染料結合劑之染劑的存在於捕獲帶中被偵測出。 如果樣品溶液中沒有CT目標核酸，則偵測探針28不能 在捕獲帶22上被捕獲，故無法在捕獲帶上見到染劑。如 果樣品溶液中有CT目標核酸，但沒有充足的目標核酸在 捕獲帶被捕獲，樣品溶液中存在之目標核酸將不會被偵測 到。 … 由以上描述之目標核酸之捕獲參照如下列實例中的直接 探針捕獲。下列實例5中，使用兩種進一步捕獲方式，即 -20- 1281501 五、發明說明（19) 一般探針捕獲及抗體捕獲，一般探針捕獲憑藉著捕獲使用 吊鈎探針雜交至固定於檢棒捕獲帶上之一般探針上而目標 核酸’吊鈎探針能夠雜交至目標核酸，除了捕獲探針被至 換爲一般探針與吊鈎探針，捕獲的方法完全相同於直接的 探針捕獲。 關於抗體捕獲，抗體替代捕獲探針而固定於檢棒之捕獲 帶上’捕獲探針包含之探針，其偶聯至能被抗體結合的配 位體上（如DNP )，且與幫手及偵測探針一起添加至樣品 溶液中。當樣品溶液加熱時，捕獲探針雜交至目標核酸， 然後冷卻以便雜交幫手及偵測探針至目標核酸上。 在樣品溶液中培育捕獲、幫手及偵測探針後，檢棒之接 觸端與樣品溶液接觸，包含目標核酸、捕獲探針、幫手探 針及偵測探針（藉由抗生物素抗體-染料結合劑）之複合 物隨後於捕獲帶被固定於捕獲帶之抗體捕獲，樣品溶液中 目標核酸之存在藉由抗生物素抗體-染料結合劑再次被偵 測，因此，捕獲探針雜交至目標與其說是發生於檢棒上， 不如說是在樣品溶液中。 已發現如果目標核酸上捕獲探針雜交區域與偵測探針雜 交區域之間隔小於26個核苷酸，則目標核酸偵測之敏感 度會降低，因此，較佳的是這些區域之間隔至少爲2 6個 核苷酸，且最好爲至少2〇〇個核苷酸。 實例1 實驗構成 -21 - 1281501 五、發明說明（2〇 ) 捕獲形式：直接探針捕獲（C p ) ，s e q I D Ν ο 1 3固定 於檢棒上； ， 偵測形式：偵測探針（dp )包含偶聯至生物素的Seq ID No 1 4、1 5、1 6或1 7之核酸計1 〇12個複製體，且以抗生 物素抗體-染料結合劑偵測偵測探針； 目標DNA : 872 bp DNA計1011 - 109個複製體。 幫手探針：HP SEQ ID No 1，（24 mer，G+C=9 個核 苷酸，Tm二72 . ，當雜交至目標核酸，其雜交至距離捕 獲探針5’端1 1個核苷酸之目標序列），或HP SEQ ID No 1 ( 24 mer，G + C = 8個核苷酸，Tm = 70 . 5 t，當雜交至 目標核酸，其雜交至緊鄰於捕獲探針5 ’端之目標核酸序列 )計1〇12個複製體。 結果 目標複製體 ίο11 1〇10 5xl09 1〇9 控制組（無幫手探針） 2.5 0.0 0.0 〇.〇 HP SEQ ID No Γ 3.0 1.0 0.0 〇·〇 HP SEQ ID No 1 5.0 3 . 5 2.5 〇.〇 結論 幫手探針藉由大於1 〇次疊合（10 - f 〇 1 d )而改良目標核 酸偵測之敏感度。 HP SEQ ID No : 1 (當雜交至目標核酸，其雜交至緊鄰 於捕獲探針5,端之目標核酸序列）具有比HP SEQ ID No 1 ’（當雜交至目標核酸，其雜交至距離捕獲探針5，端11 -22- 1281501 五、發明說明（21) 個核苷酸之目標序列）較強之幫手效果，HP SEQ ID No : 1具有比HP S EQ ID N〇 : 1 ’高21：之Tm，然而揷獲探針與 幫手探針之間隔被認爲比Tm及G十C含量更爲重要。 實例2 實驗構成 捕獲形式·直接操針捕獲（c p ) ( S e q I D Νο 1 4 )固定 於檢棒上； 偵測形式：偵測探針（dp )包含偶聯至生物素的SeQ ID No 13之核酸計1〇12個複製體，及抗生物素抗體-染料結 合劑； 目標DNA : 416 bp DNA計5Χ101。個複製體。 幫手探針：幫手探針HP SEQ ID No 1、HP SEQ ID No 2 、HP SEQ ID N〇3 ' Seq ID No 15、Seq ID Nol6 及 Seq I D No 1 7之聯合體計1 0 12個複製體。 結果 詳見第4圖 糸吉論 在此實例中，雜交至目標核酸序列（緊接於被捕獲探針 辨識出之序列）之幫手探針對於目標核酸偵測之敏感度具 有最大之增強效果（比較信號4 . 5與作爲控制組之缺乏幫 手探針的信號1 .5 )。 藉由幫手探針雜交至目標核酸序列（緊接於被捕獲探針 辨識出之序列），目標核酸偵測之敏感度的效果較強於雜 -23- 1281501 五、發明說明（22) 交至目標核酸序列（遠離於被捕獲探針辨識出之序列）之 幫手探針的效果（比較信號4 . 5與信號2 . 5 )。. 實例3 實驗構成 捕獲形式：直接探針捕獲（cp) Seq ID No 14 (固定於 檢棒上）； 偵測形式：偵測探針包含偶聯至生物素的Seq ID Nq 13 (dl ) 、15 ( d3) 、16 ( d4)或 17 ( d5)之核酸計 1012 個複製體，及抗生物素抗體-染料結合劑； 目標DNA : 87 2 bp DNA計101ϋ個複製體。 幫手探針··幫手探針hi = HP SEQ ID No 1、h2= HP SEQ ID No 2、h3=HP SEQ ID No3、h4=HP SEQ ID No 4 之聯 合體計1 0 1 2或1 0 1 3個複製體。 結果 幫手探針 B12個 複製體 E13個複製體 添加 0 h2+h3 h2 h3 hl+h2+h3 hl+h2+h3+h4 h1+h2+h3+h4 信號 1.5 3.5 2.5 3 3.5 3.5 3.5 糸吉論 相較於僅使用一種幫手探針之偵測敏感度，雜交至目標 核酸序列（緊接於被捕獲探針辨識出之序列各邊）之幫手 探針（h2及h3 )增強了偵測之敏感度。 增加幫手探針之濃度敏感度（比較1〇13及1012個複製體 )在本實例中對於偵測之敏感度並無任何的效果。 實例4 -24- 1281501 五、發明說明（23) 實驗構成 捕獲形式：直接探針捕獲（cp ) Seq ID No Μ (固定於 檢棒上）； 偵測形式：偵測探針包含偶聯至生物素的Seq I D N〇 1 3 (d 1 ) 、1 5 ( d 3 ) 、1 6 ( d 4 )或 1 7 ( d 5 )之核酸計 1 〇 12 個複製體，及抗生物素抗體-染料結合劑； 幫手探針：幫手探針hi = HP SEQ ID No 1、h2= HP SEQ ID No 2、h3=HP SEQ ID N〇3、h4 二 HP SEQ ID No 4 之聯 合體計1 0 12或1 0 13個複製體。 目標：環狀雙股 DNA質體 pCTLl 5B ( 5 . 1 Kbp )及 PCTL13 1 ( 6.3 Kbp)、缺乏捕獲及偵測探針可反應的互補 序列之質體pCTL 130 ( 6.3 Kbp)作爲負控制組，及雙股直 鏈（87 2 bp)計1011個複製體反應作爲正控制組。 結果 目標 h2 + h3 h 1 +h2 + h3 + h4 無h p pCTLl30 0.0 0.0 0.0 pCTLl31 1.5 1.5 〇.0 pCTLl5B 1.5 1 . 5 〇.0 872 bp DNA 5.0 5 . 0 3 . 5 結論

使用雜交至目標核酸序列（緊接於被捕獲探針辨識出之 序列）之幫手探針可偵測長度超過5 Kbp之環狀雙股DNA -25- 1281501 五、發明說明（24 ) 雜交至目標核酸序列（遠離於被捕獲探針辨識出之序列 ，但緊接於被偵測探針辨識出之序列）之幫手f荣針（幫手 探針h 1及h4 )，在本實例中並不能增強核酸偵測之敏感 度。在本發明之條件下，幫手探針主要地顯示出在檢棒上 增強捕獲探針雜交至雙股環狀目標核酸。 環狀雙股DNA目標（5 · 1 Kbp或6 . 3 Kbp )之偵測敏感 度低於値鏈雙股872 bp DNA偵測敏感度，當目標核酸之 大小增加時，偵測及捕獲探針雜交至目標核酸之效率預期 會下降。偵測探針與抗生物素抗體-染料結合劑之可接近 性在目標大小增加時，亦被認爲會降低。雙股目標核酸之 偵測被認爲效率低於單股目標核酸之偵測，因爲偵測探針 及捕獲探針雜交至目標核酸之效率降低之故。偵測探針至 抗生物素抗體-染料結合劑之可接近性，雙股相較於單股 目標核酸亦被認爲會降低。 實例5 實驗構成 捕獲序列：SEQ ID No 15 捕獲形式： 1 )直接探針捕獲-探針Seq ID No 15 (固定於檢棒上）； 1 1 ) 一般探針捕獲-20個核苷酸一般探針（固定於檢棒上 )雜交至吊鈎探針（其序列互補於一般探針之序列） 及目標DNA序列（Seq ID No 15 ); 1 1 i )抗體捕獲-抗-DNP抗體固定於檢棒上，捕獲探針包含 -26- 1281501 五、發明說明（25) S e q I D No 1 5之核酸，其在樣品溶液中連結至DNP且 雜交至目標核酸； 偵測形式：偵測探針包含偶聯至生物素的Seq I d N〇 1 3 、1 4、1 6或1 7之核酸計丨〇 12個複製體，及抗生物素抗體 -染料結合劑； 幫手探針：HP SEQ ID Ν〇3 及 HP SEQ ID No 4 計 1〇12 個複製體。 目標·· 87 2 bp DNA計10Μ-1〇8個複製體。 糸吉果 詳見第7圖 糸吉論 使用直接探針捕獲（詳見上述（1 ))及一般探針捕獲 (詳見上述（i i))，幫手探針改良了目標核酸之偵測敏 感度。 這些結果支持了實例2、3及4之結論，即幫手探針在 檢棒上增強核酸間之雜交。 實例6 實驗構成 捕獲形式：直接探針捕獲（c p ) ( S e q I D No 1 0 )且固 定於檢棒上； 偵測形式：偵測探針（dP )包含偶聯至生物素的SeQ I D No 1 3之核酸計1 0 12個複製體，及抗生物素抗體-染料結 合劑； -27- 1281501 五、發明說明（26 ) 幫手探針：幫手探針HP SEQ ID No 5及HP SEQ ID No 6 ’其雜交之目標核酸序列鄰接於HP SEQ ID No 1 0所辨 識出之序列；HP SEQ ID No 1及HP SEQ ID No 2 ，其雜 交之目標核酸序列鄰接於HP SEQ ID No 13所辨識出之序 歹[」，計1 0 12個複製體。 目標：8 72 bp DNA計5χ101ϋ個複製體。 結果 詳見第8圖 幺士三八 不口 Bfffl 當捕獲探針及偵測探針雜交至相隔大於2 0 0 n t之目標 核酸序列時，目標核酸之偵測敏感度會被幫手探針（雜交 之目標核酸序列鄰接於偵測探針所辨識出之序列各邊）雜 交至目標核酸序列所增進。 實例7 奮^探針在CT偵測上之效果 實驗構成 捕獲序列：S e q I D Ν ο 1 5 捕獲形式： 直接探針捕獲：探針包含偶聯於BSA之Seq ID No 15 核酸固定於檢棒上； 抗體捕獲：抗DNP抗體（a -DPN捕獲）固定於檢棒膜上 ;捕獲探針包含偶聯於DPN之S e q I D No 1 5核酸。 偵測形式：偵測探針（dp )包含各偶聯至數個生物素偵 -28- 1281501 五、發明說明（27) 測配位體的S e q I D No 1 8或1 3之核酸，及抗生物素抗體 -染料結合劑。偵測探針計1 〇 !2個複製體； 幫手探針：HP SEQ ID No 3 及 HP SEQ ID No 4 計 1〇12個複製體，幫手探針能夠雜交鄰接於目標核酸中被捕 獲探針所辨識出之區域； 目標· CT原粒體2 . 4 X 1 〇7複製體/測試。 結果 捕獲 直接探針捕獲 抗體捕獲 幫手 有 Μ > \ \ \ 有 無 信號 4.0 2.5 1.5 0.5 結論 利用直接探針捕獲或抗體捕獲之CT細胞隱性質體之偵 測可藉由使用幫手探針增進。 依照本發明使用幫手探針呈現增強檢棒膜上或溶液中所 發生之雜交。 以上實例1至7中，幫手探針與捕獲及偵測探針一樣雜 父至雙股目標核酸之同一股。在相似實驗中，無增強之目 標核酸的偵測敏感度被發現爲，幫手探針雜交至被捕獲及 偵測探針所辨識出的雙股目標核酸之相對股。 實例8 砂眼衣原體之單一步驟核酸.檢棒分析偵測 實驗構成 試劑： -29- 1281501 五、發明說明（28) 逋_.獲形式:被BSA載體固定於檢棒膜上之寡核苷酸探針 捕獲； ， 值_測形式:多生物素標示偵測探針；抗生物素抗體-膠 體黃金結合劑； 靈展製備:於PBS緩衝液中製備砂眼衣原體（c t )原粒 體細胞之濃度爲106個複製體/ml至1〇3個複製體/ml，且 於l〇(TC加熱20分鐘； |1__交/檢棒泳動緩衝液:標準雜交緩衝液包含鹽、淸潔 劑及如BSA或粉狀乳之封阻蛋白。 方法： 偵測探針、幫手探針及稀釋於雜交緩衝液的EB之5x 1 06 至1〇3個複製體配製成80ml，且於100°C加熱7分鐘◦之 後混合物短暫離心以收集所有配位體，且與20m 1抗生物 素抗體-膠體黃金混合，整個l〇〇ml混合物虹吸至檢棒上 ，使之顯示出信號。 糸吉果及g寸5侖 於下表及第9圖之結果顯示約C t EB之1 〇4個複製體可 以在少於一小時內（包含製備步驟）以單一步驟核酸檢棒 分析偵測。 雖然此檢棒偵測分析具有大約相當於三明治雜交分析（ sandwKh hybiMdlsaion assays)之偵測敏感度，但其具 有速度及簡單性之主要優點。 以三明治雜交分析偵測Ct揭示於PCT W0 9 3 / 1 3 22 (複 -30- 1281501 五、發明說明（29) 合多成分微滴定板形式分析）爲例’其不能於5小時內完 成’此分析爲多步驟分析，需要以限定之順序.逐漸添加其 成分而培育，且於添加每一新成分後須要淸洗步驟。 本發明之核酸檢棒分析主題可於單一步驟內完成，且不 需要不同步驟以添加成分及淸洗◦此三明治雜交分析並不 需要多於一種溶液條件，以便提供它們有利於雜交及其他 親合力配對的形成，相同之溶液條件能十分適合於成分經 由檢棒膜而自由移動。 本發明之方法已發現藉由檢棒而顯著的增加目標核酸之 偵測敏感度，尤其是雙股核酸及環狀雙股目標核酸之偵測 大爲改進。 元件符號對照表 10 檢棒 12 目標核酸 1 4 樣品溶液 16 硝化纖維帶 18 接觸端 20 捕獲探針 22 捕獲帶 24 抗生物素抗體-染料結合劑 26 接合帶 28 偵測探針 30 幫手探針 -31 - 1281501 “表眼衣原體之單一步驟核酸檢棒分析偵測

No EB* 5xl06 106 5x105 2.5χ105 105 7.5χ104 5x104 2.5χ1〇4 ΙΟ4 5χ103 NC** 第一次信 號時間 2·2〇， 2.50, 3.3〇， 4.30， 5.35, 8.10, 8.45’ 14.05, 24， - - 10分鐘之 信號 4 3 2.5 2 1.5 1 1 0.5 0 〇 〇 20分鐘之 信號 5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.25 〇 〇 30分鐘之 信號 5 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 0 1小時之 信號 5 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.0 0.5 〇 0 *砂眼衣原體之原粒體數目 *NC :負控制組

Claims (1)

1. I -I 本 4充 填請委員明示，本案修正後是否變更實 六、申請專利範圍 第9 0 1 1 6 5 6 9號「檢棒分析中目標核酸之捕獲及偵測的改良 」專利案 (93年9月修正） 六申請專利範圍 1 . 一種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a)提供一種層析片，其具有·_接觸端以接觸樣品溶液； 以及一種捕獲探針固定於層析片捕獲帶（位於接觸端 之另一端）上，捕獲探針能夠雜交至目標核酸第一序 列； b )培育樣品溶液與： 一種偵測探針，其在偵測探針連接至目標核酸之條件 下，能連接至目標核酸，因此可利用偵測探針來直接 或間接偵測目標核酸；以及一種第一幫手探針，能夠 雜交至目標核酸第二序列，藉此增強捕獲探針雜交至 目標核酸，而樣品溶液及第一幫手探針是在第一幫手 探針雜交至第二序列之條件下培育； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，故在偵測探針、第 一幫手探針及目標核酸間所形成之複合物能藉由毛細 作用移至捕獲帶，且藉由捕獲探針雜交至複合物之目 標核酸而結合至捕獲帶；及 d)檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 2 . —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a )提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； !2815〇i 六、申請專利範圍 及一種固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端 )的捕獲部分； b )培育樣品溶液與： 一種偵測探針’其在偵測探針連接至目標核酸之條 件下’能連接至目標核酸，因此可利用偵測探針來直 接或間接偵測目標核酸； 一種捕獲探針’其在捕獲探針雜交至第一序列之條 件下’能雜交至目標核酸第一序列，當捕獲探針已雜 交至第一序列’捕獲探針能夠藉由捕獲部分連結；及 一種第一幫手探針，其能雜交至目標核酸第二序列 ’藉此增強捕獲探針雜交至目標核酸，而樣品溶液及 第一幫手探針在第一幫手探針雜交至第二序列之條件 下培育； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，以便在偵測探針、 捕獲探針、第一幫手探針及目標核酸間所形成之複合 物能藉由毛細作用移至捕獲帶，且藉由捕獲部分之連 結至複合物之捕獲探針而連結至捕獲帶；及 d)檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 3 ·如申請專利第丨或2項之方法，其中第二序列與第一序 列最多間隔1 0個核苷。 4 .如申請專利第3項之方法，其中第二序列緊接於第一序 列。 5 ·如申請專利範圍第1或2項之方法，其中樣品溶液與能 1281501 s、申請專利範圍 夠雜交至目標核酸第三序列的第二幫手探針一起培育， 藉此增強捕獲探針雜交至目標核酸，在第二幫手探針雜 交至第三序列之條件下，培育樣品溶液及第二幫手探針 〇 6 .如申請專利範圍第5項之方法，其中第二及第三序列位 於第一序列之側邊。 7 .如申請專利範圍第6項之方法，其中第三序列與第一序 列最多間隔1 0個核苷。 8 .如申請專利範圍第7項之方法，其中第三序列緊接於第 一序列。 9 .如申請專利範圍第1或2項之方法，其中偵測探針包含 能夠雜交至目標核酸之吊鈎偵測探針，以及能夠雜交至 吊鈎偵測探針之一般偵測探針。 I 0 ·如申請專利範圍第1或2項之方法，其中偵測探針能夠 雜交至目標核酸第四序列以連結偵測探針至目標核酸。 II .如申請專利範圍第1或2項之方法，其中樣品溶液與能 夠雜交至目標核酸第五序列之第三幫手探針一同培育， 藉此可增強偵測探針雜交至第四序列，第三幫手探針與 樣品溶液是在第三幫手探針雜交至第五序列條件下培育 〇 1 2 · —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a )提供一種層析片具有：接觸端以接觸樣品溶液；及一 種固定於層析片捕獲帶（位於接觸端之另一端）的捕 Ϊ281501 六、申請專利範圍 獲探針，捕獲探針能夠雜交至目標核酸； b)樣品溶液與雜交至目標核酸之幫手探針接觸，藉此增 強捕獲探針雜交至目標核酸，在幫手探針雜交至目標 核酸之條件下，將樣品溶液與幫手探針接觸； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，藉由毛細作用使樣 品溶液移至捕獲帶，故在幫手探針及目標核酸間所形 成之複合物，能藉由捕獲探針雜交至複合物之目標核 酸於捕獲帶被捕獲；及 d)檢查捕獲帶上目標核酸之存在。 1 3 · —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a) 提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 及一種固定於層析片捕獲帶（位於接觸端之另一端） 的捕獲部分； b) 樣品溶液接觸與： 一種捕獲探針，其在捕獲探針雜交至目標核酸之條 件下能夠雜交至目標核酸，當捕獲探針已雜交至目標 核酸，捕獲探針能夠藉由捕獲部分連結；以及 一種幫手探針，能夠雜交至目標核酸，藉此增強捕 獲探針雜交至目標核酸，而樣品溶液與幫手探針是在 幫手探針雜交至目標核酸之條件下接觸； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，藉由毛細作用使樣 品溶液移至捕獲帶，以便在捕獲探針、幫手探針及目 標核酸間所形成之複合物，能藉由捕獲部分結合至複 1281501 六、申請專利範圍 合物之捕獲探針於捕獲帶被捕獲；及 d)檢查捕獲帶上目標核酸之存在。 1 4 ·如申請專利範圍第1 2或1 3項之方法，其中捕獲探針包 含能雜交至吊鈎捕獲之一般捕獲探針。 1 5 . —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a)提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 及一種固定於層析片捕獲帶（位於接觸端之另一端） 的捕獲探針，捕獲探針能夠雜交至目標核酸第一序列 b )培育樣品溶液與： 一種偵測探針，其在偵測探針雜交至目標核酸之條 件下，能夠雜交至目標核酸第二序列，藉此可利用偵 測探針來直接或間接偵測目標核酸；以及 一種第一幫手探針，能夠雜交至目標核酸第三序列 ，藉此增強偵測探針雜交至第二序列，而樣品溶液及 第一幫手探針在第一幫手探針雜交至第三序列之條件 下培育； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，以便在偵測探針、 第一幫手探針及目標核酸間所形成之複合物能藉由毛 細作用移至捕獲帶，且藉由捕獲探針雜交至複合物之 目標核酸而結合至捕獲帶；及 d)檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 1 6 . —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： 1281501 六、申請專利範圍 〇提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 及一種固定於層析片捕獲帶（位於接觸端之另一端） 的捕獲探針； b )培育樣品溶液與： 一種捕獲探針，其在捕獲探針雜交至第一序列之條 件下，捕獲探針能夠雜交至目標核酸第一序列，而當 捕獲探針已雜交至第一序列，捕獲探針能夠被捕獲部 分結合； 一種偵測探針，其在偵測探針雜交至第二序列之條 件下，能夠雜交至目標核酸第二序列，藉此可利甩偵 測探針來直接或間接偵測目標核酸；以及 一第一幫手探針，能夠雜交至目標核酸第三序列， 藉此增強偵測探針雜交至目標核酸，而樣品溶液及第 一幫手探針是在第一幫手探針雜交至第三序列之條件 下培育； c) 層析片之接觸端與樣品溶液接觸，以便在偵測探針、 捕獲探針、第一幫手探針及目標核酸間所形成之複合 物能藉由毛細作用移至捕獲帶，且藉由捕獲部分結合 至複合物之捕獲探針而連結至捕獲帶；及 d) 檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 1 7 .如申請專利範圍第1 5或1 6項之方法，其中第三序列與 第二序列最多間隔1 0個核苷。 1 8 .如申請專利範圍第1 7項之方法，其中第三序列緊接於第 1281501 六、申請專利範圍 二序列。 1 9 ·如申請專利範圍第1 5或1 6項之方法，其中樣品溶液與 能夠雜交至目標核酸第四序列的第二幫手探針一起培育 ，藉此能夠增強偵測探針雜交至目標核酸，而樣品溶液 及第二幫手探針是在第二幫手探針雜交至第四序列之條 件下培育。 20 ·如申請專利範圍第1 9項之方法，其中第三及第四序列位 於第二序列之側邊。 2 1 ·如申請專利範圍第20項之方法，其中第四序列與第二序 列最多間隔1 0個核苷。 22 ·如申請專利範圍第21項之方法，其中第四序列緊接於第 二序列。 23. 如申請專利範圍第15項或16項之方法，其中捕獲探針 包含能雜交至吊鈎捕獲探針之一般偵測探針。 24. 如申請專利範圍第15或16項之方法，其中探針雜交至 樣品溶液中之目標核酸是在單一步驟中進行。 2 5 · —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a)提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 一種固定於層析片捕獲帶（位於接觸端之另一端）的 捕獲探針，捕獲探針能夠雜交至目標核酸；以及一種 幫手探針可釋放地固定於層析片接觸端及捕獲帶之間 ，幫手探針能夠雜交至目標核酸，藉此增強捕獲探針 雜交至目標核酸； 1281501 六、申請專利範圍 b )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液藉由毛 細作用移至捕獲帶，藉此由層析片釋放幫手探針，故 當樣品溶液移動於捕獲帶時，可使釋放之幫手探針雜 交至樣品溶液中之目標核酸，以致含有目標核酸及幫 手探針之複合物可藉由捕獲探針雜交至複合物之目標 核酸而於捕獲帶被捕獲；及 c)檢查捕獲帶上目標核酸之存在。 2 6 · —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a) 提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 一種固定於層析片捕獲帶（位於接觸端之另一端）的 捕獲部分；以及一種捕獲探針，可釋放地固定於層析 片接觸端及捕獲帶之間，捕獲探針能夠雜交至目標核 酸，且當捕獲探針已雜交至目標核酸，能夠藉由捕獲 部分被連結； b) 培育樣品溶液與： 一種幫手探針，其在幫手探針雜交至目標核酸之條件 下，能雜交至目標核酸，藉此可增強捕獲探針雜交至 目標核酸；且 c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液藉由毛 細作用移至捕獲帶，藉此由層析片釋放捕獲探針，故 當樣品溶液移動於捕獲帶時，可使釋放之捕獲探針雜 交至樣品溶液中之目標核酸，以致含有目標核酸、捕 獲探針及幫手探針之複合物可藉由捕獲部分結合至複 1281501 六、申請專利範圍 合物之捕獲探針而於捕獲帶被捕獲；及 d)檢查捕獲帶上目標核酸之存在。 27 . —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a )提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 一種固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端） 的捕獲部分；一種捕獲探針可釋放地固定於層析片接 觸端及捕獲帶之間，捕獲探針能夠雜交至目標核酸， 且當捕獲探針已雜交至目標核酸，能夠被捕獲部分結 合；以及一種幫手探針可釋放地固定於層析片接觸端 及捕獲帶之間，幫手探針能夠雜交至目標核酸，藉此 增強捕獲探針雜交至目標核酸；且 b )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液藉由毛 細作用移至捕獲帶，藉此由層析片釋放捕獲探針及幫 手探針，故當樣品溶液移動於捕獲帶時，可使釋放之 捕獲探針及幫手探針雜交至樣品溶液中之目標核酸， 以致含有目標核酸、捕獲探針及幫手探針之複合物可 藉由捕獲部分結合至複合物之捕獲探針而於捕獲帶被 捕獲；及 c)檢查捕獲帶上目標核酸之存在。 28 . —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a)提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 一種固定於層析片捕獲帶（位於接觸端之另一端）的 捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交至目標核酸；以及一 1281501 六、申請專利範圍 種偵測探針可釋放地固定於層析片接觸端及捕獲帶之 間’偵測探針能夠雜交至目標核酸，因此可利用偵測 探針來直接或間接偵測目標核酸； b)培育樣品溶液與： 一種幫手探針，其能夠雜交至目標核酸，藉此可增強 偵測探針雜交至目標核酸，樣品溶液及幫手探針是在 幫手探針雜交至目標核酸之條件下培育； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液藉由毛 細作用移至捕獲帶，藉此由層析片釋放偵測探針，故 當樣品溶液移動於捕獲帶時，可使釋放之偵測探針雜 交至樣品溶液中之目標核酸，以致含有目標核酸、幫 手探針及偵測探針之複合物可藉由捕獲探針雜交至複 合物之目標核酸而於捕獲帶被捕獲；及 d )檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 29.—種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a )提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 一種固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端） 的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交至目標核酸；以及 一種偵測探針可釋放地固定於層析片接觸端及捕獲帶 之間，偵測探針能夠雜交至目標核酸，因此可利用偵 測探針來直接或間接偵測目標核酸；以及一種幫手探 針可釋放地固定於層析片接觸端及捕獲帶之間，幫手 探針能夠雜交至目標核酸，藉此增強偵測探針雜交至 -10- 1281501 六、申請專利範圍 目標核酸；且 b )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液藉由毛 細作用移至捕獲帶，藉此由層析片釋放幫手探針及偵 測探針，故當樣品溶液移動於捕獲帶時，可使釋放之 幫手探針及偵測探針雜交至樣品溶液中之目標核酸’ 以致含有目標核酸、幫手探針及偵測探針之複合物可 藉由捕獲探針雜交至複合物之目標核酸而於捕獲帶被 捕獲；及 c)檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 3 0 . —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a )提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 一種固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端） 的捕獲部分；以及一種捕獲探針可釋放地固定於層析 片接觸端及捕獲帶之間，偵測探針能夠雜交至目標核 酸，且當捕獲探針已雜交至目標核酸，能夠被捕獲部 分結合； b)培育樣品溶液與： 一種偵測探針，能夠雜交至目標核酸，因此可利用偵 測探針來直接或間接偵測目標核酸，偵測探針與樣品 溶液是在偵測探針雜交至目標核酸之條件下培育；以 及 一種幫手探針，能夠雜交至目標核酸，藉此增強偵 測探針雜交至目標核酸，樣品溶液與偵測探針是在幫 -1 1 - 1281501 六、申請專利祐圍 手探針雜交至目標核酸之條件下培育； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液藉由毛 細作用移至捕獲帶，藉此由層析片釋放捕獲探針，故 當樣品溶液移動於捕獲帶時，可使釋放之捕獲探針雜 交至樣品溶液中之目標核酸，以致含有目標核酸、捕 獲探針、幫手探針及偵測探針之複合物可藉由捕獲部 分結合至複合物之捕獲探針而於捕獲帶被捕獲；及 d)檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 31 . —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a )提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 一種固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端） 的捕獲部分；以及一種偵測探針可釋放地固定於層析 片接觸端及捕獲帶之間，偵測探針能夠雜交至目標核 酸，因此可利用偵測探針來直接或間接偵測目標核酸 9 b)培育樣品溶液與： 一種捕獲探針，在捕獲探針雜交至目標核酸之條件下 ’能夠雜交至目標核酸，且當捕獲探針已雜交至目標 核酸時，能夠被捕獲部分結合；以及 一種幫手探針，在幫手探針雜交至目標核酸之條件 下，能夠雜交至目標核酸，藉此增強偵測探針雜交至 目標核酸； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液藉由毛 -12- 1281501 々、申請專利範圍 細作用移至捕獲帶，藉此由層析片釋放偵測探針，故 當樣品溶液移動於捕獲帶時，可使釋放之偵測探針雜 交至樣品溶液中之目標核酸，以致含有目標核酸、 獲探針、幫手探針及偵測探針之複合物可藉由捕獲部 分結合至複合物之捕獲探針而於捕獲帶被捕獲；及 d)檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 3 2 · —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a )提供一種層析片’其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 一種固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端） 的捕獲部分；一種偵測探針可釋放地固定於層析片接 觸端及捕獲帶之間，偵測探針能夠雜交至目標核酸， 因此可利用偵測探針來直接或間接偵測目標核酸；以 及一種幫手探針可釋放地固定於層析片，幫手探針能 夠雜交至目標核酸，藉此增強偵測探針雜交至目標核 酸； b)培育樣品溶液與： 一種捕獲探針，能夠雜交至目標核酸，且當捕獲探針 已雜交至目標核酸時，能夠被捕獲部分結合，捕獲探 針與樣品溶液是在捕獲探針雜交至目標核酸之條件下 培育；以及 一種幫手探針，能夠雜交至目標核酸，藉此增強偵 測探針雜交至目標核酸，幫手探針與樣品溶液是在幫 手探針雜交至目標核酸之條件下培育； -13- 1281501 六、申請專利範圍 C )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液藉由毛 細作用移至捕獲帶，藉此由層析片釋放偵測探針及幫 手探針，故當樣品溶液移動於捕獲帶時，可使釋放之 偵測探針及幫手探針雜交至樣品溶液中之目標核酸， 以致含有目標核酸、捕獲探針、幫手探針及偵測探針 之複合物可藉由捕獲部分結合至複合物之捕獲探針而 於捕獲帶被捕獲；且 d)檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 3 3 · —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a )提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 一種固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端） 的捕獲部分；一種偵測探針可釋放地固定於層析片接 觸端及捕獲帶之間，偵測探針能夠雜交至目標核酸， 因此可利用偵測探針來直接或間接偵測目標核酸；以 及一種捕獲探針可釋放地固定於層析片接觸端及捕獲 帶之間，捕獲探針能夠雜交至目標核酸，且當捕獲探 針已雜交至目標核酸時，能夠被捕獲部分結合； b )培育樣品溶液與一種幫手探針，該幫手探針能夠雜交 至目標核酸，藉此增強偵測探針雜交至目標核酸，幫 手探針與樣品溶液是在幫手探針雜交至目標核酸之條 件下培育； c )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液藉由毛 細作用移至捕獲帶，藉此由層析片釋放偵測探針及捕 • 14- 1281501 六、申請專利範圍 獲探針，故當樣品溶液移動於捕獲帶時，可使釋放之 偵測探針及捕獲探針雜交至樣品溶液中之目標核酸， 以致含有目標核酸、捕獲探針、幫手探針及偵測探針 之複合物可藉由捕獲部分結合至複合物之捕獲探針而 於捕獲帶被捕獲；且 d)檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 3 4 . —種測試樣品溶液中目標核酸存在之方法，其包含： a)提供一種層析片，其具有：接觸端以接觸樣品溶液； 一種固定於層析片之捕獲帶（位於接觸端之另一端） 的捕獲部分；一種偵測探針可釋放地固定於層析片接 觸端及捕獲帶之間，偵測探針能夠雜交至目標核酸， 因此可利用偵測探針來直接或間接偵測目標核酸；一 種幫手探針可釋放地固定於層析片接觸端及捕獲帶之 間’幫手探針能夠雜交至目標核酸，藉此增強偵測探 針雜交至目標核酸；以及 一種捕獲探針可釋放地固定於層析片接觸端及捕獲 帶之間’捕獲探針能夠雜交至目標核酸，且當捕獲探 針已雜交至目標核酸時，能夠捕被獲部分結合； b )層析片之接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液藉由毛 細作用移至捕獲帶，藉此由層析片釋放偵測探針、幫 手探針及捕獲探針，故當樣品溶液移動於捕獲帶時， 可使釋放之偵測探針、幫手探針及捕獲探針雜交至樣 品溶液中之目標核酸，以致含有目標核酸、捕獲探針 -15- 1281501 六、申請專利範圍 、幫手探針及偵測探針之複合物可藉由捕獲部分結合 至複合物之捕獲探針而於捕獲帶被捕獲；且 C )檢查捕獲帶上偵測探針之存在。 35 · —種測試疑似含有目標核酸之樣品溶液中目標核酸存在 之套組，包含·· i ) 一種檢棒，包括： 一種具有用以接觸樣品溶液之接觸端的層析片；及 一種固定於捕獲帶接觸端另一端之捕獲探針，捕獲 探針能夠雜交至目標核酸第一序列； i i ) 一種能夠雜交至目標核酸第二序列幫手探針，因此 增強捕獲探針雜交至目標核酸，以及可含有 1 i i ) 一種能夠連接至目標核酸之偵測探針，而可直接或 間接偵測目標核酸。 36·如申請專利範圍第35項之套組，其中幫手探針可釋放 地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間。 37 · —種測試疑似含有目標核酸之樣品溶液中目標核酸存在 之套組，包含： i ) 一種檢棒，包括： 一種具有用以接觸樣品溶液之接觸端的層析片；及 一種固定於捕獲帶接觸端另一端之捕獲探針，捕獲探 針能夠雜交至目標核酸第一序列； i i ) 一種能夠雜交至目標核酸第二序列之偵測探針，而 可直接或間接偵測目標核酸；以及 -16- 1281501 六、申請專利範圍 i i i ) 一種能夠雜交至目標核酸第三序列之幫手探針，藉 此增強偵測探針雜交至第二序列。 3 8 ·如申請專利範圍第3 7項之套組，其中偵測探針可釋放 地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間。 3 9 ·如申請專利範圍第3 7項之套組，其中偵測探針及幫手 探針可釋放地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間。 40 · —種測試疑似含有目標核酸之樣品溶液中目標核酸存在 之套組，包含： i ) 一種檢棒，包括： 一種具有用以接觸樣品溶液之接觸端的層祈片；及 一種固定於捕獲帶接觸端另一端之捕獲部分； 1 1 ) 一種能夠雜交至目標核酸第一序列之捕獲探針，且 當捕獲探針已雜交至目標核酸第一序列，其能夠被 捕獲部分結合； i i i ) 一種能夠雜交至目標核酸第二序列之幫手探針，藉 此增強捕獲探針雜交至第一序列；以及可含有 i v ) —種能夠連接至目標核酸之偵測探針，而其可直接 或間接偵測目標核酸。 4 1 ·如申請專利範圍第40項之套組，其中捕獲探針可釋放: 地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間。 42·如申請專利範圍第40項之套組，其中捕獲探針及幫手 探針可釋放地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間。 43 . —種測試疑似含有目標核酸之樣品溶液中目標核酸存在 -17- 1281501 六、申請專利範圍 之套組，包含： i ) 一種檢棒，包括： 一種具有用以接觸樣品溶液之接觸端的層析片；及 一種固定於捕獲帶接觸端另一端之捕獲部分； i 1 ) 一種能夠雜交至目標核酸第一序列之捕獲探針，且 當捕獲探針已雜交至第一序列，其能夠被捕獲部分 結合； i Π ) —種能夠雜交至目標核酸第二序列之偵測探針，而 其可直接或間接偵測目標核酸；以及 i v ) —種能夠雜交至目標核酸第三序列之幫手探針，藉 此增強偵測探針雜交至第二序列。 44·如申請專利範圍第43項之套組，其中捕獲探針及/或偵 測探針可釋放地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間。 45 ·如申請專利範圍第43項之套組，其中幫手探針及偵測 探針與任意的捕獲探針可釋放地固定於層析片接觸端與 捕獲帶之間。 46 · —種測試樣品溶液中目標核酸存在之層析片，包含： 用以接觸樣品溶液之接觸端；固定於捕獲帶接觸端另 一端之捕獲探針，捕獲探針能夠雜交至目標核酸；及可 釋放地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間的幫手探針， 幫手探針能夠雜交至目標核酸，藉此增強捕獲探針雜交 至目標核酸。 47 · —種測試樣品溶液中目標核酸存在之層析片，包含： -18- 1281501 六、申請專利範圍 用以接觸樣品溶液之接觸端；固定於捕獲帶接觸端另 一端之捕獲探針，捕獲探針能夠雜交至目標核酸；及可 釋放地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間的幫手探針， 幫手探針能夠雜交至目標核酸，藉此增強偵測探針雜交 至目標核酸。 48 · —種測試樣品溶液中目標核酸存在之層析片，包含： 用以接觸樣品溶液之接觸端； 固定於捕獲帶接觸端另一端之捕獲部分，捕獲部分能 夠結合雜交於目標核酸的捕獲探針； 可釋放地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間的捕獲探 針，捕獲探針能夠雜交至目標核酸，及任意地 可釋放地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間的幫手探 針’幫手探針能夠雜交至目標核酸，藉此增強捕獲探針 雜交至目標核酸。 49 . 一種測試樣品溶液中目標核酸存在之層析片，包含·· 用以接觸樣品溶液之接觸端； 固定於捕獲帶接觸端另一端之捕獲部分，捕獲部分能 夠結合雜交於目標核酸的捕獲探針； 可釋放地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間的偵測探 針，偵測探針能夠雜交至目標核酸，因此可利用偵測探 針來直接或間接偵測目標核酸；以及可含有 i)可釋放地固定於層析片接觸端與捕獲帶之間的捕獲 探針，捕獲探針能夠雜交至目標核酸，且能夠被捕 -19- 1281501 \、申請專利範圍 獲部分結合；及/或 Π ) —種幫手探針能夠雜交至目標核酸，藉此增強偵測 探針雜交至目標核酸。 50 . —種實質上經分離之核酸分子或核酸類似物，.其具有之 序列相對應於任一 SEQ ID N0S : 1-18之序列，其可使 用作爲幫手探針，於樣品溶液中砂眼衣原體（CA j j a trachomatis , CT)目標核酸存在之測試中增強CT目標 核酸的偵測，其中該SEQ ID NOS :1-18如下所示： HP SEQ ID No 1: 59 GAT AAA ATC CCT TTA CCC ATG AAA HP SEQ ID No Γ: 59 CTT GCT GCA AAG ATA AAA TCC CTT HP SEQ ID No 2: 5， TAA AAT GTC CTG ATT AGT GAA ATA AT HP SEQ ID No 3: 55 TCG GTA TTT TTT TAT ATA AAC ATG AAA A HP SEQ ID No 4: 5， TGC AAG ATA TCG AGT ATG CGT TGT TA HP SEQ ID No 5: 5? AAA GGG AAA ACT CTT GCA GA HP SEQ ID NO 6: 5? TCT TTT CTA AAG ACA AAA AAG ATC CTC GAT SEQ ID No 7: 59 CTT GCT GCT CGA ACT TGT TTA GTA C SEQ ID No 8: 59 AGA AGT CTT GGC AGA GGA AAC TTT T SEQ ID No 9: 55 CTA GAA TTA GAT TAT GAT TTA AAA GGG SEQ ID No 10: 55 TTC ATA TCC AAG GAC AAT AGA CCA A SEQ ID No 11: 5， TGA TCT ACA AGT ATG TTT GTT GAG T SEQ ID NO 12: 5? TGC ATA ATA ACT TCG AAT AAG GAG AAG SEQ ID NO 13: 55 TCC CTC GTG ΑΤΑ TAA CCT ATC CG SEQ ID NO 14: 5， CAG GTT GTT AAC AGG ATA GCA CGC -20- 1281501 t、申請專利範圍 SEQ ID NO 15: 55 SEQ ID NO 16: 55 SEQ ID NO 17: 5, SEQ ID NO 18: 55 CTC GTT CCG AAA TAG AAA ATC GCA GGT AAA GCT CTG ΑΤΑ TTT GAA GAC CTG AGG CAG CTT GCT AAT TAT GAG T GTT GGC AAA AAT AGA CAT GGA TCG G 。 -21 -