CN1834258A - 一种鉴定结核分支杆菌菌种的多重pcr的引物设计方法 - Google Patents

Abstract

一种鉴定结核分支杆菌菌种的多重PCR的引物设计方法，其特征是按以下方式进行：a.分别在能够与细菌基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5’端加上一段非细菌的基因组序列，从而得到特异性长引物YB1－P1和YB2－P2，以此作为复合扩增过程中第一阶段聚合酶链反应的引物对，即特异性长引物对；b.直接以非细菌的基因组序列作为复合扩增第二阶段聚合酶链反应的引物对，即放量扩增引物对。

Description

一种鉴定结核分支杆菌菌种的多重PCR的引物设计方法

技术领域

本发明涉及一种一次性扩增多个细菌的基因片段，从而鉴定结核分支杆菌菌种的多重PCR的引物设计方法。

背景技术

20世纪90年代以来，随着分子生物学在医学领域取得的飞速发展，研究者也将分子生物学技术引入了结核病研究范围。聚合酶链反应(PCR)是一种以核酸生物化学为基础的分子生物学技术，是生物学领域内最有价值的技术之一。自1989年引入结核病的诊断以来，立即成为结核病细菌诊断领域中备受关注的焦点。经过多年的科学研究和临床检验，使这一方法不断完善，其反应灵敏、快速、特异的特性在多数报告中得到验证。

该项目以临床上常见的4种结核分支杆菌菌种(牛型、人型、鸟型、鼠型)为研究对象，选择各自不同类型结核杆菌的基因序列而设计特异性引物，在同一体系同时检测多种细菌，建立一种全新的多重PCR检测结核杆菌菌种，用于结核杆菌的快速诊断、分型。分子生物学技术的发展，PCR技术的应用，开辟了分类鉴定的新途径。目前基因鉴定技术具有快速、简便、分辨率高的特点，并可进行多相分类鉴定，能按照种系进化的关系确定精确的位置和定种，使分类鉴定方法更客观合理。

多重PCR即是在一个PCR反应体系中，设计多对引物进行扩增，这样产生不同特异性靶区域片段，经凝胶电泳观察各特异扩增片段，用于鉴定结核分枝杆菌至属种的水平。Thierry等在《Research inMicrobiology》1995年第146期中发表的《Mycobacteriumtuberculosis strains unidentified using the IS6110 probe canbe detected by oligonucleotides derived from the Mt308sequence》文章中设计了扩增IS6110序列片段(325bp)及65kD蛋白基因片段(383bp)并对扩增产物进行分析，取得了较好的结果。Liebana等在《Journal of Clinical Microbiology》1996年34期中发表的《Assessment of genetic markers for speciesdifferentiation within the Mycobacterium tuberculosiscomplex》文章报道了扩增16srDNA(1030bp)和MAB70的372bp基因片段，经琼脂糖凝胶电泳均可快速鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复合群。Ikonomopoulos JA等在《Moden Pathology》.1999年12期中发表的《Multiplex polymerase chain reaction for thedetection of mycobacterial DNA in cases of tuberculosis andsarcoidosis》文章则应用mpb64(243bp)，IS6110(916bp)及65kD蛋白(383bp)的基因片段，对300个临床标本进行分析，可以快速检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、慢生长分枝杆菌复合群。

上述是目前国内外利用多重PCR技术用于结核杆菌检测的例子。他们只是简单的将多重不同的检测的结核杆菌基因进行混合，在同一个反应中进行PCR扩增反应，从而达到多重PCR的目的。这些方法存在的问题是：(1)需要严格的PCR反应条件，例如各种反应成分的浓度、反应成分之间的比例、PCR扩增的温度、时间等。(2)由于多种不同的引物存在于同一反应管中，导致引物之间的反应比较明显，如引物二聚体的形成等，会导致很大量的引物的丢失，很容易导致到这种多重PCR反应的失败。(3)引物的选择将非常的严格，必须保证它们之间不会形成引物二聚体，这将大大降低多种不同类型结核分支杆菌一起多重PCR的可能性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种用于结核杆菌检测、效率高、灵敏度高的多重PCR的引物设计方法。

本发明方法的基本思路是：选取一对非细菌基因组的短DNA片段作为放量扩增引物对YB1和YB2，并在能与细菌基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物(P1、P2)之5′端分别加上该引物对YB1和YB2，从而得到特异性长引物YB1-P1和YB2-P2。

此处，能够与细菌基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2亦即是可以与待扩增基因座的细菌基因组结合的原始引物。由于多重PCR反应是同时对多个基因座进行的PCR扩增，相对于不同基因座来说，能够与该基因座的细菌基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2是不同的，与之相对应，各个待扩增基因座的特异性长引物YB1-P1和YB2-P2也因P1、P2的不同而不相同。

在进行多重PCR反应时，同时在PCR反应体系中加入上述放量扩增引物和针对不同待扩增基因座的特异性长引物(当然还需加入常规PCR反应所需的耐热聚合酶和单核苷酸等)。由于各个待扩增基因座的细菌基因组序列中并不含有放量扩增引物YB1、YB2所对应的序列，所以在该反应体系进行第一轮PCR反应时(经历变性、退火、延伸的一次循环过程)，引物对YB1和YB2并不会与细菌基因组序列结合，所扩增的DNA片段还是由特异性长引物YB1-P1和YB2-P2中所含的原来的引物对P1、P2所决定。但是，第一轮反应结束后，在待扩增基因座将会产生同时具有目的基因片段和非细菌基因组序列YB1、YB2的扩增产物。在PCR反应体系进行第二轮PCR反应(即经历变性、退火、延伸的第二次循环过程)时，上述同时具有目的基因片段和非细菌基因组序列YB1、YB2的产物被进一步扩增，扩增所用引物仍然是特异性长引物YB1-P1和YB2-P2，反应完成后，所得到的产物同时具有目的基因片段和与引物对YB1和YB2配对的非细菌基因组序列。在本发明中，我们将上述以特异性长引物作为反应引物的第一轮和第二轮PCR反应称之为第一阶段的反应，即多重PCR过程中第一阶段的聚合酶链反应。换句话说，复合扩增过程中第一阶段的聚合酶链反应包括了上述第一轮和第二轮反应。该阶段反应所得到的扩增产物同时具有目的基因片段和与引物对YB1和YB2配对的非细菌基因组序列，此处将其称之为多重PCR第一阶段的产物。从第三轮PCR反应开始，由于对于各个基因座已经具有上述第一阶段的产物，这样，放量扩增引物YB1、YB2就可以作为上述各个扩增基因座的引物，PCR反应就能以上述第一阶段的产物为模板进行扩增。与此相类似，在第三轮之后的各轮PCR反应中，均能够以放量扩增引物YB1、YB2充当各个扩增基因座的引物。在经历多轮(如30轮)PCR循环反应之后，上述第一阶段的产物就会被扩增至上百万倍。在本发明中，我们将上述以放量扩增引物引物作为反应引物的PCR反应称之为第二阶段的反应，即多重PCR过程中第二阶段的聚合酶链反应。需要说明的是，在本发明的上述设计思路中，第一阶段和第二阶段的反应是在同一反应体系中进行的，而不是截然地分成两次反应。实际上，即使是在第三轮及第三轮之后的PCR反应中，仍然存在着上述第一阶段的反应，只是其所占比例极低而已。另外，在进行第一阶段的PCR扩增反应时有多对引物同时参与反应，即相对于多个待扩增基因座且序列不同的多对特异性长引物同时参与反应(如前所述，各个待扩增基因座的特异性长引物YB1-P1和YB2-P2并不相同)，引物与引物间的反应与竞争在所难免，从而大大降低了PCR扩增的效率，这一弊端在前面讨论现有技术时已经提及。但是，就本发明来说，第一阶段的PCR扩增的目的并不是希望获得大量的扩增片段，而仅仅是使同时带有目的基因片段和与YB1、YB2配对的非细菌基因组序列的产物(第一阶段的产物)产生即可，因此上述弊端对整个多重PCR反应过程产生的影响是极其微弱的。而在第一阶段的PCR扩增之后，需要扩增的各个目的基因片段的5′端都带有与YB1、YB2配对的非细菌基因组序列，所以加入一对放量扩增引物(YB1、YB2)之后，就可以对多个基因座同时进行扩增。由于在此后进行的第二阶段扩增中，参与反应的引物只有一对，即放量扩增引物对YB1、YB2，不存在引物间的竞争与反应，也无需调整引物间的浓度，从而大大提高了各基因座的扩增效率。因此可以说，第一阶段的PCR反应是仅需扩增出少量模板，而第二阶段的扩增是高效率扩增所有基因座。就其实质而言，在第二阶段的PCR反应中，是把现有复合扩增方法中的多对引物同时扩增多个基因座，转变为一对引物(YB1、YB2)同时扩增多个基因座；同时，相对于被扩增的各个特异性DNA片段来说，YB1、YB2并非是特异引物，因此，上述过程还由现有复合扩增方法中的由多对特异引物同时扩增多个特异性基因片段，转变成了由一对非特异引物同时扩增多个特异性基因片段。

在本发明中，上述放量扩增引物YB1、YB2的选择是极为关键的，其设计需要考虑以下三个要素：①、它必须是非细菌基因组序列，即它的序列不会与细菌基因组序列相同；②、选取适当的引物长度，18～24个碱基构成的寡核苷酸链是比较优化的引物长度；③、选取引物中碱基GC的含量和引物的退火温度Tm。

本发明在设计引物的Tm值时选择的温度是55℃，因为在该温度下，多重PCR中绝大多数的PCR反应都能进行，同时此温度将会使首次PCR反应后出现大量的非特异的杂带，我们就必须通过降低特异性长引物的浓度来减少杂带。降低长引物浓度后，各引物之间的相互作用降低，非特异性的产物减少，与此同时，我们所需的特异性的产物也降低，但是这并不会影响整个扩增效率。前已述及，前两轮PCR反应仅仅是上述复合扩增过程的开端，该轮PCR反应的产物并不要求有较大的量，只需产生少量同时具有非细菌基因组序列和目的基因的DNA片段，即生成少量用于第二阶段的PCR反应的模板，就能通过其后的PCR反应对该模板进行放量扩增。在第一阶段的PCR反应之后，参与反应的引物就不再是特异性长引物对(YB1-P1、YB2-P2)，而是放量扩增引物对(YB1、YB2)。

但是，并不是简单地满足上述三个要素的引物对就能够充当本发明中所说的放量扩增引物对YB1、YB2。虽然从理论上讲，该引物对YB1、YB2可以按一定的原理进行设计并得出，但在实践中可以发现，依据引物设计原理所设计出的引物能够实际应用且能取得较佳效果的并不多。也就是说，真正能够实际应用的“引物对”必须经过大量的、艰苦的试验才能得到，这是一个对引物的优选过程。

例如，基于上述三个要素的限制，我们曾经设计出了如下7对引物(YB3-YB16)：

$\left\{\begin{array}{c}\mathrm{YB}3(5^{\′}-\mathrm{CACCATTAGCACCCAAAGCT}-3^{\′})\\ \mathrm{YB}4(5^{\′}-\mathrm{TGATTTCACGGAGGATGGTG}-3^{\′})\end{array}\right.$

$\left\{\begin{array}{c}\mathrm{YB}5(5^{\′}-\mathrm{GGTCTATCACCCTATTAACCAC}-3^{\′})\\ \mathrm{YB}6(5^{\′}-\mathrm{CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA}-3^{\′})\end{array}\right.$

$\left\{\begin{array}{c}\mathrm{YB}7(5^{\′}-\mathrm{GGTGTTGATGATGACATGGCG}-3^{\′})\\ \mathrm{YB}8(5^{\′}-\mathrm{GTACCCTCTGCAGCATGAGAGTAG}-3^{\′})\end{array}\right.$

$\left\{\begin{array}{c}\mathrm{YB}9(5^{\′}-\mathrm{TGGAGAAATCTGGCACCAC}-3^{\′})\\ \mathrm{YB}10(5^{\′}-\mathrm{GAGGCGTACAGGGATAGCAC}-3^{\′})\end{array}\right.$

$\left\{\begin{array}{c}\mathrm{YB}11(5^{\′}-\mathrm{TTGTCAACTTCAGATACCACTGGAG}-3^{\′})\\ \mathrm{YB}12(5^{\′}-\mathrm{CAAGGCAGATTTAACCACAGGTG}-3^{\′})\end{array}\right.$

$\left\{\begin{array}{c}\mathrm{YB}13(5^{\′}-\mathrm{AGGGAAGAGGAGAGAGAAAGAGC}-3^{\′})\\ \mathrm{YB}14(5^{\′}-\mathrm{CGGCAGTTAGTAGACTATCCAGG}-3^{\′})\end{array}\right.$

$\left\{\begin{array}{c}\mathrm{YB}15(5^{\′}-\mathrm{GATTGCTCAACAACCATG}-3^{\′})\\ \mathrm{YB}16(5^{\′}-\mathrm{TTTCACTCTAGACCAAGCTTTG}-3^{\′})\end{array}\right.$

通过检索细菌基因数据库，在细菌基因组中并不存在与上述引物YB3～YB16相对应的序列，从而确保了这些引物不与细菌基因组序列发生结合。

但是，在其后的实验发现，上述7对引物并不能够成功地进行第二阶段的放量扩增。

另外，与上述例子相类似，在形成本发明技术方案的过程中，我们还依据待扩增对象的特性，对满足上述三个要素的大量引物对进行了筛分、研究和实验，以期找到能够实际应用且能取得较佳效果的“引物对”。

正是通过上述大量的筛分、研究和实验，本发明方法优选出了引物对YB1、YB2：

YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′

YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′

通过检索细菌基因数据库，在细菌基因组中并不存在与上述引物YB1、YB2相对应的序列，从而确保了上述引物不与细菌基因组序列发生结合。同时，更为重要的是：实验研究表明，引物对(YB1，YB2)能够成功地进行第二阶段的放量扩增，从而构成了本发明所说的放量扩增引物。

将上述放量扩增引物加在能与细菌基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物(P1、P2)之5′端，就得到特异性长引物YB1-P1和YB2-P2。

综上所述，本发明的鉴定结核分支杆菌菌种的多重PCR的引物设计方法是：

a、分别在能够与细菌基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物

P1、P2的5′端加上一段非细菌的基因组序列：

YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′

YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′，

从而得到特异性长引物YB1-P1和YB2-P2，以此作为复合扩增过程中第一阶段聚合酶链反应的引物对，即特异性长引物对；

b、直接以非细菌的基因组序列：

YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′

YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′

作为复合扩增第二阶段聚合酶链反应的引物对，即放量扩增引物对。

与前述现有技术相比，本发明对多重PCR反应的引物进行了设计，从而能够高效率地大量扩增目的基因片段，实验结果的可重现性极高，同时，无需在实验过程中繁琐地调整各对引物的浓度，简化了整个实验过程。另外，采用本发明方法设计出的引物进行多重PCR反应之后，可以采用硝酸银染色方式检测结果，对实验设备的成本要求不高，因此本发明的方法更具优点有中国特色，符合当前中国大多数分子医院细菌检验的需要。

具体实施方式

在本实施例中，所设计的引物用于在同一PCR反应体系中同时对四个基因hsp65基因、32-KDa蛋白基因、IS6110基因和mtp40基因进行多重PCR反应。

所设计的放量扩增引物为：

YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′

YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′

与上述放量扩增引物相对应，各基因座所设计的特异性长引物YB1-P1、YB2-P2为：

hsp65基因：

YB1-P1：5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′

YB2-P2：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′

32-KDa蛋白基因：

YB1-P1：5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT CGGCAACGCGCCGTCGGTGG-3′

YB2-P2：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT CCCCCCACGGCACCGCCGGG-3′

IS6110基因：

YB1-P1：5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT CGGAGACGGTGCGTAAGTGG-3′

YB2-P2：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT GATGGACCGCCAGGGCTTGC-3′

mtp40基因：

YB1-P1：5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT TTCCTGACCAGCGAGCTGCCG-3′

YB2-P2：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT CCCCAGTACTCCCAGCTGTGC-3′

需要说明的是，细菌基因组序列特异性结合的引物P1、P2分别为：

hsp65基因：

P1：5′-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′

P2：5′-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′

32-KDa蛋白基因：

P1：5′-CGGCAACGCGCCGTCGGTGG-3′

P2：5′-CCCCCCACGGCACCGCCGGG-3′

IS6110基因：

P1：5′-CGGAGACGGTGCGTAAGTGG-3′

P2：5′-GATGGACCGCCAGGGCTTGC-3′

mtp40基因：

P1：5′-TTCCTGACCAGCGAGCTGCCG-3′

P2：5′-CCCCAGTACTCCCAGCTGTGC-3′

为进一步说明本实施例中所设计引物的使用方法和使用效果，下面继续说明本实施例中所设计引物用于鉴定结核分支杆菌菌种的多重PCR反应时的具体过程。

多重PCR反应在PE-9600扩增仪中进行。PCR反应体系中的成份主要有：模板DNA(细菌基因组序列)、特异性长引物对、放量扩增引物对、耐热DNA聚合酶、MgCl2、脱氧核苷三磷酸dNTP、BSA(小牛血清蛋白)、1×Buffer(缓冲液)和双蒸水DDH2O。其中，DNA耐热聚合酶、Mgl2和10×Buffer(缓冲液)直接由市售的PCR试剂盒(生产厂家为华美公司，中国，品名为耐热TaqDNA聚合酶)提供。

PCR反应体系中的各成份的浓度如下表：

试剂	单管式计量
						DDH2O	13.5μl
dNTP	7.5μl(200μM)
						10□buffer	3.75μl
引物	放量扩增引物	hsp65基因特异性长引物	32-KDa蛋白基因特异性长引物	IS6110基因特异性长引物	mtp40基因特异性长引物
						0.3μl(400nM)	0.3μl(40nM)	0.3μl(40nM)	0.3μl(40nM)	0.3μl(40nM)
	0.3μl(400nM)	0.3μl(40nM)	0.3μl(40nM)	0.3μl(40nM)	0.3μl(40nM)
						Taq酶	1μl(3u)
BSA	3.75μl
						Mgcl2	3μl(2.25mM)
Sample	2μl

扩增过程如下：

a、第一轮及第二轮PCR反应，即第一阶段扩增(少量扩增)，发生反应的引物是长引物。

①、变性：加热至94℃，使双链DNA解开；

②、退火：降温至55℃，在此温度下，长引物与模板DNA相结合；

③、延伸：升温至72℃，此温度是DNA聚合酶反应的最适合温度，聚合酶在Mgcl2等作用下，在长引物的5’端延着模板的5’→3’方向加入dNTP。

经第一轮及第二轮PCR反应之后，得到同时带有目的基因片段和与YB1、YB2配对的非细菌基因组序列的产物(第一阶段的产物)。

b、第三轮及其之后的PCR反应，即第二阶段扩增，起反应的引物是放量扩增引物。变性、退火和延伸的PCR反应机理与前几轮扩增相似，但在退火过程中，是以放量扩增引物与模板相结合，且该模板的5’端带有与YB1、YB2配对的非细菌基因组序列；同时，在延伸过程中，是在放量扩增引物的5’端延着上述模板的5’→3’方向加入dNTP。整个复合扩增共循环36轮，循环参数如下：

预变性：94℃                3分钟

变性：94℃                  50秒

复性：55℃                  50秒

延伸：72℃                  50秒

循环次数：                  36

延伸：72℃                  10分钟

另外，鉴于扩增产物的分子量大小、片段长短不同，特别地利用电泳检测法对其进行分离检测，以便检验扩增结果。进行分离检测时，先将扩增产物与上样缓冲液以一定的比例混匀，加入电泳槽中的聚丙烯酰胺凝胶孔中，在其两端加以电压进行电泳。由于各扩增产物的分子大小不同，在相同电场力的作用下，其在单位时间内在相同的介质中所运行的距离也不等。因此，在电泳仪中处理一段时间之后，各扩增产物的差距逐渐拉开，此后取出凝胶，对其进行染色(本例采用银染法)，最后即能直观地看到扩增结果。

所采用的电泳检测原料、设备及条件如下：

聚丙烯酰胺凝胶成份：

30％聚丙烯酰胺(PAG)溶液            9.5ml

5×TBE溶液                                7ml

DDH2O                                     18.5ml

10％过硫酸铵(PA)                          300μl

TEMED                                     30μl

电泳槽：DYY-III电泳槽(北京六一仪器厂)

电泳仪：pharmacia1000型多功能电泳仪

电泳条件：

1.上样量：样本3μl  凝胶载样缓冲液：2μl

电极缓冲液：1×TBE溶液

2.采用恒流方式电泳  电流：80mA  时间：1小时30分

染色过程如下：

采用银染法：

1、10％乙醇固定10分钟

2、DD H2O洗2次

3、1％硝酸固定3分钟

4、DD H2O洗2次

5、1％硝酸银染色20分钟

6、DD H2O洗3次

7、3％Na2CO3，甲醛溶液显色

8、DD H2O洗停止显色

采用本实施例设计的引物进行多基因座扩增所得结果同采用原来的特异性引物(即P1、P2)进行多基因座扩增的片段大小比较如下：

hsp65基因：用原来特异性引物扩增的片段大小为：443bp

           用实施例引物复合扩增后的片段大小为：485bp

32-KDa蛋白基因：用原来特异性引物扩增的片段大小为：396bp

                用实施例引物复合扩增后的片段大小为：438bp

IS6110基因：用原来特异性引物扩增的片段大小为：986bp

            用实施例引物复合扩增后的片段大小为：1028bp

Mtp40基因座：用原来特异性引物扩增的片段大小为：506bp

             用实施例引物复合扩增后的片段大小为：548bp

经电泳和染色处理后可以看到，采用本实施例设计的引物进行多基因座扩增后，其扩增效率高，扩增产物生成量大，凝胶经染色后谱带清晰易辨；同时，所得扩增产物经过测序仪测序后，证实扩增产物的DNA序列与目的DNA片段序列一致。而采用原来的特异性引物(P1、P2)进行多基因座扩增时，由于受到引物与引物间的反应与竞争的影响，其扩增产物的生成量极少，凝胶经染色后谱带完全无法辨认，扩增效果很差。

利用我们的引物设计方法和全新的结核分支杆菌菌种的多重PCR鉴定方法，我们成功的对100多个不同种类(人型，牛型，鸟型)的临床样本进行了检测，对照正常的样本和标准的分型样本，证实利用我们的方法能够成功的进行分型，实验结果的可重现性极高。

本发明所涉及的基因组序列表：

<210>1

<211>443

<212>DNA

<213>细菌(Mycobacterium sapiens)

<220>

<221>

<222>

<400>1

tcaccaacga tggtgtgtcc atcgccaagg agatcgagct ggaggacccgtacgagaaga 60

tcggcgctga gctggtcaag gaagttgcca agaagactga cgacgtcgcgggtgacggca 120

ctactaccgc caccgtgctt gcccaggctc tggtcaagga aggtctgcgtaacgtcgctg 180

ccggcgctaa cccgctcggc ctgaagcgcg gcatcgagaa ggccgtggaggccgtcacca 240

gctctctgct ggactccgcc aaggagatcg acaccaagga gcagatcgcggccaccgcgg 300

gcatctccgc gggtgaccag tccatcggtg atctgatcgc cgaggccatggacaaggtcg 360

gcaacgaggg tgtcatcacc gtcgaggagt ccaacacctt cggcctgcagctggagctca 420

ccgagggcat               gcgcttcgac                aag480

<210>2

<211>396

<212>DNA

<213>细菌(Mycobacterium sapiens)

<220>

<221>

<222>

<400>2

cggcaacgcg ccgtcggtgg ttcccaacac cacgttaggg atgcactgcggcagcttcgg 60

cagcgctccc agcaacgggt ggctcaagtt gggtctggtc gaattcggtggagtcgcaaa 120

gttgaacgct gaggtcatgt cgccaaccac gccgtcgcgc caggcggtcatgttgggaac 180

cggcacgccg aaccgggcgc gaatcaactt caattgcgag gtgtggtcgaacgtgtcgga 240

gaccatcagc gggccgcggc tgtacggcga aatgacaatg cagggaacgcgaaaacccag 300

accgagcgga ccacgaatgc caccggaccc gggtactgcg tcgatgttgggcaccgtgac 360

gaattcgccg      ggtgtcccgg      gcggtgccgt      gggggg420

<210>3

<211>986

<212>DNA

<213>细菌(Mycobacterium sapiens)

<220>

<221>

<222>

<400>3

gatggaccgc cagggcttgc cgggtttgat cagctcggtc ttgtataggccgttgatcgt 60

ctcggctagt gcattgtcat aggagcttcc gaccgctccg accgacggttggatgcctgc 120

ctcggcgagc cgctcgctga accggatcga tgtgtactga gatcccctatccgtatggtg 180

gataacgtct ttcaggtcga gtacgccttc ttgttggcgg gtccagatggct tgctcgat 240

cgcgtcgagg accatggagg tggccatcgt ggaagcgacc cgccagcccaggaatcctgc 300

gagcgtaggc gtcggtgaca aaggccacgt aggcgaaccc tgcccaggtcgacacatagg 360

tgaggtctgc tacccacagc cggttaggtg ctggtggtcc gaagcggcgctggacgagat 420

cggcgggacg ggctgtggcc ggatcagcga tcgtggtcct gcgggctttgccgcgggtgg 480

tcccggacag gccgagtttg gtcatcagcc gttcgacggt gcatctggccacctcgatgc 540

cctcacggtt cagggttagc cacactttgc gggcaccgta aacaccgtagttggcggcgt 600

ggacgcggct gatgtgctcc ttgagttcgc catcgcgcag ctcgcggcggctgggctccc 660

ggttgatgtg gtcgtagtag gtcgatgggg cgatcggcac acccagctcggtcagctgtg 720

tgcagatcga ctcgacaccc caccgcaaac catcggggcc ctcgcggtggccctgatgat 780

cggcgatgaa ccgggtaatt agcgtgctgg ccggtcgagc tcggccgcgaagaaagccga 840

cgcggtcttt aaaatcgcgt tcgcccttcg caattcggcg ttgtcccgccgcaagcgctt 900

cagctcagcg gattcttcgg tcgtggtccc gggccgtgcg ccggcatcgacctgcgcctg 960

gcgcacccac           ttacgcaccg             tctccg1020

<210>4

<211>505

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>repeat_region

<222>(87)...(134)

<400>4

ttcctgacca gcgagctgcc gtcgtacctg gcctccaaca agggtgtgaagcgcaccggc 60

aacgccgcag tcggcatctc gatgtccgga tcctcggcga tgatcctggccgtcaaccat 120

cccgaccaat tcatctatgc cggatcgctc tcggccctgc tcgacccgtcccagggcatg 180

gggccgtcgc tgatcggtct ggcgatgggt gacgccggcg gctacaaggccgacgccatg 240

tggggcccgt ccagcgaccc ggcctggcag cgcaacgacc cgagcctgcacatccccgag 300

ctggtcggcc acaacacccg gctgtggctg tactgcggta acgggacaccgtcggagctg 360

ggtggcgcca acatgcccgc cgagttcctg gagaacttcg tgcgcagcagcaacctgaag 420

ttccaggacg cctacaacgg cgccggcggc cacaacgccg tgttcaacttcaacgccaac 480

ggaacgcaca              gctgggagta              ctgggg540

Claims (1)

1、一种鉴定结核分支杆菌菌种的多重PCR的引物设计方法，其特征是按以下方式进行：

a、分别在能够与细菌基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物P1、P2的5’端加上一段非细菌的基因组序列：

YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′

YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′，

从而得到特异性长引物YB1-P1和YB2-P2，以此作为复合扩增过程中第一阶段聚合酶链反应的引物对，即特异性长引物对；

b、直接以非细菌的基因组序列：

YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′

YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′

作为复合扩增第二阶段聚合酶链反应的引物对，即放量扩增引物对。