CN1860241A - 部分双链型核酸分子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于检测核酸分子的核酸分子,其为部分双链型核酸分子,包含(a):与作为检测对象的核酸分子互补的单链核酸分子,和(b):与(a)的单链核酸分子的一部分杂交的1条或2条单链核酸分子,该部分双链型核酸分子中呈现单链结构的区域与该检测对象核酸分子中含有识别部位的区域互补。通过利用该核酸分子作为探针,可以简便地识别碱基序列的细微差别。
Description
技术领域
本发明涉及可作为探针或引物利用的核酸分子及其用途。通过将该核酸分子作为探针使用,对于一个碱基变异等基因序列的微小差异可以简易而且迅速地识别。
背景技术
在现有技术中,对一个碱基变异等细微碱基序列差异具有充分识别能力的技术局限于利用酶反应的技术。使用酶解析的方法大多是复杂的体系、在操作性、花费、分析时间等方面存在问题。
另一方面,在不使用酶的现有技术中虽然有分子信标法等,但在一个碱基变异的解析中需要特别注意探针设计,存在高流量化上的问题。另外,分子信标需要探针核酸中存在不参与识别的碱基序列,这可能产生诊断精度上的问题。
另外,最近公开了有关具有单链部分和双链部分的部分双链型探针的文献(专利文献1、专利文献2、非专利文献1)。在这些文献中虽然记载了使用部分双链型结构的探针识别一个碱基变异等内容,但没有谈到设计探针时,一个碱基变异对应于探针的哪个位置好。
专利文献1:国际公开第02/50308号小册子
专利文献2:特表2004-511227号公报(国际公开第02/30946号小册子)
非专利文献1:Qingge Li,Guoyan Luan,Qiuping Guo和Jixuan Liang,Nucleic Acids Research,2002,Vol.30,No.2
发明内容
本发明的目的在于提供能够简便识别碱基序列的细微差异的探针。
本发明者为了解决上述问题,进行了反复深入地研究,结果发现将探针的结构做成具有单链部分和双链部分的部分双链型结构,通过设计探针以使单链部分对应于欲检测核酸分子中预计存在遗传多态性的部位等,可以高灵敏度地只检测目的核酸分子,并从这一见解开始直至完成了本发明。
即本发明提供以下(1)~(16)项内容。
(1)核酸分子,其特征是:作为用于检测核酸分子的核酸分子,其为部分双链型核酸分子,包含(a):与成为检测对象的核酸分子互补的单链核酸分子,和(b):与(a)的单链核酸分子的一部分杂交的1条或2条单链核酸分子,该部分双链型核酸分子中呈现单链结构的区域与成为检测对象的核酸分子中含有识别部位的区域互补。
(2)(1)所述的核酸分子,其中呈双链结构的区域长度是10~200个碱基。
(3)(1)或(2)所述的核酸分子,其中呈单链结构的区域长度是1~10个碱基。
(4)(1)至(3)中任意一项所述的核酸分子,其中(a)的单链核酸分子、(b)的单链核酸分子中的任一方用供体荧光色素标记,而另一方用受体荧光色素标记。
(5)(1)至(4)中任意一项所述的核酸分子,其中(a)的单链核酸分子和(b)的单链核酸分子通过接头连接。
(6)(5)所述的核酸分子,其中接头是核酸。
(7)一种在基板上固定了(1)至(6)中任一项所述核酸分子的核酸芯片。
(8)一种核酸分子的检测方法,其特征是:包括使(1)至(6)中任一项所述的核酸分子与检测对象核酸分子在可杂交的条件下接触的步骤。
(9)(8)所述的核酸分子的检测方法,其特征是在胺类或季铵盐存在下,使(1)至(6)中任一项所述的核酸分子与作为检测对象的核酸分子接触。
(10)(8)或(9)所述的核酸分子的检测方法,其特征是在阳离子性高分子存在下,使(1)至(6)中任一项所述的核酸分子与作为检测对象的核酸分子接触。
(11)错配序列的检测方法,作为对样品单链核酸分子与标准单链核酸分子间的错配序列进行检测的方法,其特征在于:包括使这样的部分双链型核酸分子与作为样品的单链核酸分子在可杂交的条件下接触的步骤,所述部分双链型核酸分子包含(a):与作为样品的单链核酸分子互补的单链核酸分子,和(b):与(a)的单链核酸分子的一部分杂交的1条或2条单链核酸分子,该部分双链型核酸分子中呈现单链结构的区域与作为样品的单链核酸分子中包含预计存在错配序列部位的区域互补。
(12)(11)所述的错配序列的检测方法,其特征是在胺类或季铵盐存在下,使部分双链型核酸分子与作为样品的核酸分子接触。
(13)(11)或(12)所述的错配序列的检测方法,其特征是在阳离子性高分子存在下,使作为样品的单链核酸分子与部分双链型核酸分子接触。
(14)核酸分子的检测方法,其特征是向含有作为检测对象的核酸分子的样品中加入与作为该检测对象的核酸分子中不含识别部位的区域互补的第一检测探针,然后加入含有与第一检测探针相同的碱基序列的、并与作为该检测对象的核酸分子中含有识别部位的区域互补的第二检测探针,在可进行杂交的条件下使作为检测对象的核酸分子、第一检测探针和第二检测探针三者共存,然后将作为检测对象的核酸分子与第二检测探针的结合、或作为检测对象的核酸分子与第一检测探针的解离作为指标,进行核酸分子的检测。
(15)(14)所述的核酸分子的检测方法,其特征是在胺类或季铵盐存在下,使作为检测对象的核酸分子、第一检测探针和第二检测探针共存。
(16)(14)或(15)所述的核酸分子的检测方法,其特征是在阳离子性高分子存在下,使作为检测对象的核酸分子、第一检测探针和第二检测探针共存。
通过将本发明的核酸分子作为探针等使用,可以识别一个碱基变异等细微的碱基序列的差别。另外将本发明的核酸分子作为探针等使用时,不需要对温度等进行严密控制,可以通过简便操作对核酸分子进行检测。
附图说明
[图1]是表示本发明的核酸分子结构的图。
[图2]是表示本发明的核酸分子与目的核酸分子的链交换过程的图。
[图3]是表示不使用本发明核酸分子的检测方法的梗概图。
[图4]是表示在实施例中使用的与细胞色素P450基因相关的寡脱氧核苷酸(ODN)的互补性等关系的图。
[图5]是表示在实施例中使用的与ABC转运蛋白基因相关的ODN(20~25mer)的互补性等关系的图。
[图6]是表示在实施例中使用的与ABC转运蛋白基因相关的ODN(40~45mer)的互补性等关系的图。
[图7]是表示全配以及错配ODN的荧光强度随时间变化的图(荧光色素:FITC)。
[图8]是表示在高盐浓度下全配以及错配ODN的荧光强度随时间变化的图(荧光色素:FITC)。
[图9]是表示全配以及错配ODN的荧光强度随时间变化的图(荧光色素:TAMRA)。
[图10]是表示全配以及错配(错配对应于探针的单链部分)ODN的链交换率随时间变化的图。
[图11]是表示全配以及错配(错配对应于探针的双链部分)ODN的链交换率随时间变化的图。
[图12]是表示在各种温度的全配以及错配的ODN的链交换速度常数相对值的图。
[图13]是表示没有氯化四甲铵存在时全配以及错配ODN的链交换率随时间变化的图。
[图14]是表示有氯化四甲铵存在时全配以及错配ODN的链交换率随时间变化的图。
[图15]表示实施例9的链交换实验(使用与细胞色素P450基因相关的ODN)的结果。
[图16]表示实施例9的链交换实验(使用与ABC转运蛋白基因相关的ODN)的结果。
[图17]表示全配以及错配的ODN(45mer)的链交换率随时间变化的图。
符号说明
1:本发明的核酸分子
2:短的单链
3:长的单链
4:双链部分
5:单链部分
6:作为检测对象的核酸分子
7:识别部位
8:含有识别部位的区域
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
本发明的核酸分子作为用于检测核酸分子的核酸分子,其特征在于:其为部分双链型核酸分子,包含(a):与成为检测对象的核酸分子互补的单链核酸分子,和(b):与(a)的单链核酸分子的一部分杂交的1条或2条单链核酸分子,该部分双链型核酸分子中呈现单链结构的区域与成为检测对象的核酸分子中含有识别部位的区域互补。
本发明中所谓「核酸分子」虽然主要指的是DNA,但也包括RNA或核酸类似分子(例如肽核酸、LNA、吗啉代核苷酸(モルフオリノヌクレオチド)等)等。
所谓“识别部位”是指预计的作为检测对象的核酸分子和与该核酸分子类似的核酸分子之间序列不同的部位。预计的遗传多态性存在的部位通常可成为识别部位。本发明的核酸分子的特征就在于该识别部位与单链结构部分对应。如上所述,部分双链型核酸分子虽然已经众所周知,但在这些众所周知的核酸分子中,无论哪一个识别部位都与双链结构部分对应(例如专利文献2的实施例1)。
对作为检测对象的核酸分子没有特别限定,但本发明的核酸分子由于对一个碱基变异的识别有效,所以优选含有一个碱基变异的基因等作为检测对象。
(b)的单链核酸分子可以是1条,也可以是2条。为1条时,可采取一侧为双链,另一侧为单链那样的结构,为2条时,可采取两侧是双链,而中央部分为单链那样的结构。
对本发明的核酸分子呈现双链结构的区域的长度没有特别限定,通常为10~200碱基左右。适合的长度根据核酸分子的用途而有所不同,例如,在溶液中进行杂交时,10~60个碱基左右合适,在核酸芯片等上进行固定的场合下15~100个碱基左右合适。
对本发明的核酸分子呈现单链结构的区域的长度没有特别限定,通常为1~10碱基左右,优选1~7个碱基左右。
(a)的单链核酸分子和(b)的单链核酸分子也可通过接头连接。接头可以是核酸,也可以是核酸以外的物质。
对本发明核酸分子的标记方法没有特别限定,例如,(a)的单链核酸分子、(b)的单链核酸分子中的任一方用供体荧光色素(例如,异硫氰酸荧光素等)标记,而另一方用受体荧光色素(例如,四甲基罗丹明、Dabsyl(ダブシル)等)标记的方法等。在所述标记方法中,由于通过(a)的单链核酸分子与(b)的单链核酸分子解离(意味着(a)的单链核酸分子与作为检测对象的核酸分子杂交)而产生荧光,所以可以以该荧光作为指标进行作为检测对象的核酸分子的检测。
以本发明的核酸分子作为探针进行DNA的检测时,使用的探针可以只是一种,也可以同时使用2种或2种以上。作为使用2种或2种以上的探针的场合可例示如下面描述的确定生物基因型那样的场合。
利用图1对本发明的核酸分子的结构进行说明。本发明的核酸分子1由短的单链2和长的单链3构成,由于两条单链的长度不同形成双链部分4和单链部分5。长的单链3与作为检测对象的核酸分子6互补,而长的单链3的单链部分5与作为检测对象的核酸分子6中含有识别部位7的区域8互补。
利用图2对本发明的核酸分子能够以高灵敏度对DNA等进行检测的原理进行说明。
如果使本发明的核酸分子和目的核酸分子共存(图2A),本发明的核酸分子的短链与目的核酸分子进行交换,本发明的核酸分子的长链和目的核酸分子形成双链结构(图2C)。该链交换经图2B所示那样的迁移状态进行。单链部位如果与目的核酸相同,可促进迁移复合体的生成。
然而,当目的核酸分子中含有错配序列时,就不能促进上述那样的迁移复合体形成(图2D),因此也不能引起链交换(图2E)。通过这样的迁移复合体形成的难易,可以识别细微的序列差别。
通过将本发明的核酸分子固定在基板上,可以制作核酸芯片。此时,使用的基板可以是通常的DNA芯片等中使用的基板。固定方法也可以使用与通常的DNA芯片同样的方法。另外,在基板上既可以固定(a)的单链核酸分子,也可以固定(b)的单链核酸分子。
通过本发明的核酸分子进行核酸分子的检测,例如可以通过使本发明的核酸分子与作为检测对象的核酸分子在可杂交的条件下接触而进行。使两个核酸分子接触的条件只要是可杂交的条件,并没有特别的限定,优选在胺类(例如伯胺、仲胺、叔胺等)或季铵盐存在下接触。
作为这里使用的胺类和季铵盐,可使用如异丙胺、丁胺、戊胺、己胺、二甲基胺、三甲基胺、二乙胺、三乙胺、二异丙胺、氯化四甲铵、溴化四甲铵、氯化四乙铵、溴化四乙铵、氯化四丙铵、溴化四丙铵、氯化四丁铵、溴化四丁铵等,其中优选使用氯化四甲铵。对使用的胺类或季铵盐的量没有特别限定,通常添加终浓度达到0.05~5M,优选达到0.5~4M左右即可。
在使核酸分子接触时,优选在阳离子性高分子存在下进行。
作为使用的阳离子性高分子如国际公开03/018841号小册子公开的亲水性接枝共聚物(由可形成阳离子基团的单体构成的聚合物作为主链,亲水性高分子作为侧链的接枝共聚物)以及PC聚合物(含有磷酸胆碱类似基团的单体以及带有阳离子性基团的阳离子性单体聚合形成的聚合物)等。具体的化合物包括国际公开03/018841号小册子公开的所有化合物,作为代表性的化合物,作为亲水性接枝共聚物如葡聚糖侧链修饰的α-聚(L-赖氨酸)、葡聚糖侧链修饰的ε-聚(L-赖氨酸)、葡聚糖侧链修饰的聚烯丙胺、作为PC聚合物,如2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2’-(三甲基铵)乙基磷酸酯和含有伯氨基的丙烯酸氨乙基酯(盐酸盐)聚合构成的聚合物、2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2’-(三甲基铵)乙基磷酸盐和含有季铵基的氯化[2-(甲基丙烯酰氧基氨基)乙基]三甲基铵、2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2’-(三甲基铵)乙基磷酸酯和氯化2-羟基-3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲基铵聚合形成的聚合物。对使用的阳离子性高分子的量没有特别限定,优选地阳离子性高分子的阳离子基因对核酸分子的磷酸基的比为0.01~1000。
另外本发明的核酸分子也可以用于错配序列的检测。即,对作为样品的单链核酸分子和作为标准的单链核酸分子间的错配序列进行检测时,通过使本发明的核酸分子与作为样品的单链核酸分子在可杂交的条件下接触,可以检测错配序列。此时预计的错配序列存在部位应当与本发明的核酸分子呈现单链结构的区域对应。
本发明的核酸分子可用于生物基因型的鉴定,即鉴定某种生物的基因型是野生型、异变异型、同变异型中的哪一种。具体来说,通过制作检测野生型基因的核酸分子和检测变异型基因的核酸分子,将它们分别用不同的方法标记(例如用不同荧光色素进行标记等),使两种核酸分子与来自被检测生物的核酸分子共存而实施。此时,如果只检测到野生型的基因,那么判定被检测生物为野生型,如果只检测到变异型的基因,那么判定被检测生物为同变异型,如果检测到双方的基因,那么判定被检测生物为异变异型。
不使用本发明的核酸分子,利用图3中说明的原理也可以进行核酸分子的检测。例如可考虑使用以下方法。
向含有作为检测对象的核酸分子的样品中加入与检测对象核酸分子中不含有识别部位的区域互补的第一检测探针。由此,第一检测探针与作为检测对象的核酸分子杂交(图3B)。此时作为检测对象的核酸分子中的识别部位维持单链状态。
然后加入含有与第一检测探针相同的碱基序列的、并与检测对象核酸分子中含有识别部位的区域互补的第二检测探针。此时作为检测对象的核酸分子的识别部位序列如果与第二检测探针的对应部位的序列互补,就可形成图3C所示的迁移复合物,进而引起第一检测探针的解离(图3D)。另一方面,当作为检测对象的核酸分子的识别部位序列与第二检测探针的对应部位序列不互补时,就不形成迁移复合物,也不会引起第一检测探针的解离。
因此将作为检测对象的核酸分子和第二检测探针的结合、或作为检测对象的核酸分子与第一检测探针的解离作为指标,可以高精度地判定样品中作为检测对象的核酸分子是否存在。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更详细说明。
首先就本实施例中使用的ODN进行说明。
(A)与细胞色素P450基因相关的ODN
作为与细胞色素P450基因相关的ODN,使用F1、D1、C1、M1、M2、M3、M4、T1这8种ODN。图4给出了这些ODN的关系。
(1)F1和D1
F1是5’末端用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的ODN,D1是3’末端用Dabsyl(DAB)标记的ODN。F1和D1虽然是互补的ODN,但链长分别为19个碱基和14个碱基,F1与D1即使形成双链DNA,在3’末端侧单链部分也存在连续的5个碱基。
F1与D1的碱基序列分别如序列编号2和1所示。
(2)C1
C1是可以与F1形成互补双链的完全互补的未标记ODN。
C1的碱基序列如序列编号3所示。
(3)M1、M2、M3
M1、M2、M3分别在5’末端附近、中央部分、3’末端附近带有一个碱基变异,在与F1的双链中形成错配碱基对。这些ODN的链长无论哪一个都是19个碱基。
M1、M2、M3的碱基序列分别如序列编号4、5、6所示。
(4)M4
M4具有与D1相同的序列,链长为14个碱基。
M4的碱基序列如序列编号7所示。
(5)T1
T1是5’末端用四甲基罗丹明(TAMRA)标记的ODN。T1虽然是与D1互补的ODN,但链长为19个碱基,与F1同样,即使与D1形成双链DNA,3’末端侧单链部分也存在连续的5个碱基。
T1与F1相反,与M1完全互补,与C1在5’末端附近形成错配碱基对。
T1的碱基序列如序列编号8所示。
(B)与ABC转运蛋白基因相关的ODN
作为与ABC转运蛋白基因有关连的ODN,使用F2、D2、A1、A2、A3、T2、D3、T3、45A1、45A2这10种ODN。F2、D2、A1、A2、A3、T2的关系以及D3、T3、45A1、45A2的关系分别如图5和图6所示。
(1)F2和D2
F2是5’末端用FITC标记的ODN,D2是3’末端用DAB标记的ODN。F2和D2虽然是互补的ODN,但链长分别为25个碱基和20个碱基,F2与D2即使形成双链DNA,在3’末端侧单链部分也存在连续的5个碱基。F2/D2的单链部分为富含AT的序列。
F2与D2的碱基序列分别如序列编号14和9所示。
(2)A1
A1是可以与T2形成互补双链的完全互补的未标记ODN。
A1的碱基序列如序列编号11所示。
(3)A2
A2是在5’末端附近带有一个碱基变异,在与T2的双链中形成错配碱基对的链长为25个碱基的ODN。
A2的碱基序列如序列编号12所示。
(4)A3
A3是在中央部位带有一个碱基变异,在与T2的双链中形成错配碱基对的链长为25个碱基的ODN。
A3的碱基序列如序列编号13所示。
(5)T2
T2是5’末端用TAMRA标记的ODN。T2虽然是与D2互补的ODN,但链长为25个碱基,与F2同样,即使与D2形成双链DNA,3’末端侧单链部分也存在连续的5个碱基。
T2的碱基序列如序列编号10所示。
(6)T3和D3
T3是5’末端用TAMRA标记的ODN,D3是3’末端用DAB标记的ODN。T3和D3虽然是互补的碱基序列,但链长分别为45个碱基和40个碱基,T3与D3即使形成双链DNA,在3’末端侧单链部分也存在连续的5个碱基。
T3与D3的碱基序列分别如序列编号16和15所示。
(7)45A1
45A1是可以与T3形成互补双链的完全互补的未标记ODN。
45A1的碱基序列如序列编号17所示。
(8)45A2
45A2是在5’末端附近带有一个碱基变异,在与T3的双链中形成错配碱基对的链长为45个碱基的ODN。
45A2的碱基序列如序列编号18所示。
以上的ODN是从フアスマツク(公司)购入,经反相层析纯化的产品。
[实施例1]
将等摩尔量的F1和D1加到PBS缓冲液([Na+]=150mM,pH7.2)中。将该缓冲液加热到90℃,然后慢慢冷却,制备含有12nM的部分双链型探针F1/D1的溶液。将该溶液保持在20℃,按照终浓度为60nM加入作为单链的C1、M1、M2、M3或M4,使链交换反应开始。链交换的进行通过由DAB消光的FITC荧光(激发波长:490nm、荧光波长:520nm)的恢复进行检测。
反应开始后荧光强度随时间的变化如图7所示。另外,反应开始后5分钟、10分钟、20分钟的荧光强度如表1所示。进而表2给出了各单链的链交换速度常数的相对值。
[表1]
序列 | 5分钟 | 10分钟 | 20分钟 |
C1 | 123.7 | 140.9 | 150.1 |
M1 | 38.6 | 40.8 | 44.1 |
M2 | 47.8 | 53.2 | 61.8 |
M3 | 119.3 | 128.7 | 132.0 |
M4 | 38.7 | 40.5 | 44.1 |
[表2]
序列 | 链交换速度常数相对值 |
C1 | 1.00 |
M1 | 0.02 |
M2 | 0.06 |
M3 | 1.06 |
M4 | 0.02 |
就像这些图和表所示的那样,与含有变异的单链(M1、M2、M3)相比,完全互补的单链(C1)快速进行链交换。与C1的速度差按照5’末端附近部位含有变异的M1(变异对应于F1的单链部分)、中央部分含有变异的M2、3’末端附近部位含有变异的M3的顺序增大,C1和M3之间没有看到太大的差别。
由以上事实可以认为通过设计部分双链型探针使错配序列对应于单链部分,可以高灵敏度地检测错配序列。
[实施例2]
将PBS缓冲液的钠离子浓度调整到1000mM,另外所添加的单链为C1或M1这2种,其它与实施例1同样进行链交换反应。
图8给出了反应开始后荧光强度随时间的变化。另外表3给出了C1或M1的链交换速度常数的相对值。
[表3]
盐浓度-序列 | 链交换速度常数相对值 |
150mM C1 | 1.00 |
150mM M1 | 0.02 |
1000mM C1 | 5.36 |
1000mM M1 | 0.08 |
就像表所示的那样,钠离子浓度即使变更到1000mM,与实施例1的情况同样,在含有变异的单链(M1)和完全互补的单链(C1)链之间没有观察到链交换速度有大的差别。而通过将钠离子浓度提高,含有变异的单链以及完全互补的单链的任一情况下链交换速度都上升。
[实施例3]
作为部分双链型探针使用T1/D1,另外所添加的单链为C1或M1这2种,通过TAMRA荧光(激发波长:540nm、荧光波长:570nm)的恢复检测链交换的进行,其它与实施例1同样进行链交换反应。
反应开始后荧光强度随时间的变化如图9所示。反应开始后5分钟、10分钟、20分钟的荧光强度如表4所示。另外表5给出了各单链的链交换速度常数的相对值。
[表4]
序列 | 2分钟 | 5分钟 | 10分钟 |
C1 | 19.2 | 28.4 | 42.8 |
M1 | 126.1 | 143.4 | 146.1 |
[表5]
序列 | 链交换速度常数相对值 |
M1 | 1.00 |
C1 | 0.02 |
就像这些图和表所示的那样,与实施例1的情况同样,在含有变异的单链(C1)与完全互补的单链(M1)之间没有观察到链交换速度有大的差别。由该结果可以认为部分双链型探针不仅可高灵敏度地检测A-T和A-C间的碱基对的差别,而且也可以高灵敏度地检测难于检测的G-C和G-T间的碱基对的差别。
[实施例4]
将等摩尔量的T2和D2加入到PBS缓冲液([Na+]=150mM,pH7.2)中。将该缓冲液加热到90℃,然后慢慢冷却,制备含有12nM的部分双链型探针T2/D2的溶液。将该溶液保持在20℃,按照终浓度为60nM加入作为单链的A1或A2,使链交换反应开始。链交换的进行通过使用被DAB消光的TAMRA荧光的恢复进行检测。
反应开始后的链交换率(在链交换过程追踪后退火,之后的荧光强度作为100%)随时间的变化如图10所示。而反应开始后5分钟、10分钟、20分钟的荧光强度如表6所示。另外表7给出了各单链的链交换速度常数的相对值。
[表6]
序列 | 5分钟 | 10分钟 | 20分钟 |
A1 | 82.2 | 95.9 | 106.6 |
A2 | 12.8 | 14.8 | 17.7 |
[表7]
序列 | 链交换速度常数相对值 |
A1 | 1.00 |
A2 | 0.02 |
就像这些图和表所示的那样,在对应于T2的单链部分含有变异的单链(A2)与完全互补的单链(A1)之间没有看到链交换速度有大的差别。
[参考例1]
将添加的单链取A1或A3,其它与实施例4同样进行链交换反应。
反应开始后的链交换率随时间的变化如图11所示。而反应开始后5分钟、10分钟、20分钟的荧光强度如表8所示。另外表9给出了各单链的链交换速度常数的相对值。
[表8]
序列 | 5分钟 | 10分钟 | 20分钟 |
A1 | 155.5 | 172.9 | 188.8 |
A3 | 103.2 | 114.3 | 124.9 |
[表9]
序列 | 链交换速度常数相对值 |
A1 | 1.00 |
A3 | 0.49 |
就像这些图和表所表示的那样,在对应于T2的双链部分含有变异的单链(A3)与完全互补的单链(A1)之间没有看到链交换速度有太大的差别。由该结果以及实施例4的结果可以认为通过设计部分双链型探针使错配序列不对应于双链部分,可以使探针的检测灵敏度大幅度提高。
[实施例5]
将链交换反应时的溶液温度定为10℃、20℃、28℃、37℃四种温度条件,其它与实施例4同样进行链交换反应。
各个温度下含有变异的单链(A2)和完全互补的单链(A1)的速度常数的相对值如图12所示。而各个温度下含有变异的单链(A2)和完全互补的单链(A1)的速度比(A1的链交换速度常数除以A2的链交换速度常数后得到的值)如表10所示。
[表10]
温度 | 速度比(A1/A2) |
10℃ | 112 |
20℃ | 46 |
28℃ | 20 |
37℃ | 9 |
就像这些图和表所表示的那样,无论在那一个温度下,在含有变异的单链与完全互补的单链之间没有看到链交换速度有太大的差别。而温度低的情况下速度差(速度比)大。由以上结果认为只要是在10~37℃的温度范围内,就可以高灵敏度地检测错配序列。
[实施例6]
将部分双链型探针的浓度定为12nM、9nM、6nM、4nM、3nM、1.2nM这6种条件,另外将单链的浓度定为60nM、45nM、30nM、20nM、15nM、6nM这6种条件,其它与实施例4同样进行链交换反应。
在各个浓度的组合中含有变异的单链(A2)和完全互补的单链(A1)的速度比(A1的链交换速度常数除以A2的链交换速度常数后所得的值)如表11所示。
[表11]
部分双链型探针浓度(nM) | 单链浓度(nM) | 速度比(A1/A2) |
12nM | 60nM | 46 |
9nM | 45nM | 34 |
6nM | 30nM | 48 |
4nM | 20nM | 50 |
3nM | 15nM | 61 |
1.2nM | 6nM | 50 |
就像表所表示的那样,在任一个浓度的组合下,在含有变异的单链与完全互补的单链之间没有看到链交换速度有大的差别。
[实施例7]
将添加的单链取C1或M1这2种,在国际公开03/018841号小册子所述的阳离子性高分子(葡聚糖侧链修饰的α-聚(L-赖氨酸)存在下进行链交换反应,其它与实施例1同样进行链交换反应。阳离子性高分子按照N/P比(阳离子性高分子的氨基与ODN的磷酸基的量)为0.2和0.4的两个条件加入。
表12给出了在阳离子性高分子存在下(N/P=0.2,0.4)和不存在下(N/P=0)各单链的链交换速度常数的相对值、以及含有变异的单链(M1)和完全互补的单链(C1)的速度比(C1的链交换速度常数除以M1的链交换速度常数后所得的值)。
[表12]
N/P | C1 | M1 | 速度比(C1/M1) |
0 | 1.00 | 0.02 | 50 |
0.2 | 30.35 | 0.36 | 84 |
0.4 | 88.66 | 1.25 | 71 |
就像表表示的那样,通过加入阳离子性高分子,含有变异的单链以及完全互补的单链在任一场合下,链交换速度显著上升。由此结果可以认为即使是使链交换速度变低的条件(例如,单链或探针仅以低浓度存在的条件),通过添加阳离子性高分子,也可以高灵敏度地检测错配序列。
[参考例2]
将等摩尔量的F2和D2加到PBS缓冲液([Na+]=150mM,pH7.2)中。将该缓冲液加热到90℃,然后慢慢冷却,制备含有12nM的部分双链型探针F2/D2的溶液。将该溶液保持在37℃,按照终浓度为60nM加入作为单链的A1或A2,使链交换反应开始。链交换的进行通过使用DAB被消光的FITC荧光的恢复进行检测。
反应开始后链交换率随时间的变化如图13所示。含有变异的单链(A1)和完全互补的单链(A2)的速度比(A2的链交换速度常数除以A1的链交换速度常数后所得的值)为2.9。
就像图所表示的那样,在含有变异的单链(A1)和完全互补的单链(A2)之间没有看到链交换速度有太大的差别。另外无论使用哪一种单链,链交换速度都没有太高。由此结果认为由于要检测的单链GC含量或温度等条件不同,也存在不能高灵敏度地检测错配序列的情况。
[实施例8]
按照终浓度成为3M那样向PBS缓冲液中加氯化四甲铵(TMAC),其它与参考例2同样,进行链交换反应。
反应开始后的链交换率随时间的变化如图14所示。含有变异的单链(A1)和完全互补的单链(A2)的速度比(A2的链交换速度常数除以A1的链交换速度常数后所得的值)为10.8。
就像图所表示的那样,与参考例2不同,在含有变异的单链(A1)和完全互补的单链(A2)之间看到链交换速度有大的差别。链交换速度也有大的提高。由此结果可以认为即使在参考例2的条件下,通过添加TMAC也可以高灵敏度地检测错配序列。
[实施例9]
制作部分双链型探针F1/D1(FITC标记)和部分双链型探针T1/D1(TAMRA标记),将这两种探针按照终浓度分别为12nM那样加到含有3M TMAC的PBS缓冲液([Na+]=150mM,pH7.2)中。按照终浓度为60nM(对于C1+M1,两个单链合起来的浓度为60nM)那样向该缓冲液中添加M1、C1+M1、或C1,在室温条件下开始链交换反应。在反应开始5分钟后,用平板读出器同时测定FITC的荧光强度和TAMRA的荧光强度。该操作对于各单链进行4次,共计进行12次。图15给出了12次的测定值。
就像图所示的那样,加M1时,可检测到TAMRA的荧光,但几乎检测不到FITC的荧光,相反,加C1时,可检测到FITC的荧光,但几乎检测不到TAMRA的荧光。这意味着加M1时引起T1/D1探针的链交换,而几乎不引起F1/D1探针的链交换,当加C1时,几乎不引起T1/D1探针的链交换,而引起F1/D1探针的链交换。由于M1和T1、C1和F1分别完全互补,所以图15的结果表明T1/D1探针和F1/D1探针无论哪一个都可以高精度地识别完全互补的单链。
对于与ABC转运蛋白基因相关的ODN也进行了以上与细胞色素P450基因相关的ODN的实验。即,使用F2/D2探针取代F1/D1探针,使用T2/D2探针取代T1/D1探针,使用A2取代C1,使用A1取代M1,进行同样的实验。结果如图16所示。就像图所表示的那样,部分双链型探针如与细胞色素P450基因相关的ODN同样,可以高精度地识别完全互补的单链。
[实施例10]
作为部分双链型探针使用T3/D3,另外,添加的单链取45A1或45A2,其它与实施例4同样进行链交换反应。
反应开始后的链交换率随时间的变化如图17所示。而反应开始后5分钟、10分钟、20分钟的荧光强度如表13所示。另外表14给出了各单链的链交换速度的相对值。
[表13]
序列 | 5分钟 | 10分钟 | 20分钟 |
45A1 | 39.0 | 47.5 | 58.9 |
45A2 | 15.2 | 17.2 | 19.3 |
[表14]
序列 | 链交换速度常数相对值 |
45A1 | 1.00 |
45A2 | 0.11 |
就像这些图和表所表示的那样,在含有变异的单链(45A2)和完全互补的单链(45A1)之间没有看到链交换速度有大的差别。
由以上结果可以认为双链部分即使是40个碱基左右的长度,也可以高灵敏度地检测错配序列。
本说明书包含作为本申请优先权基础的日本专利申请、特愿2003-282311的说明书和/或图记载的内容。另外,在本发明中引用的所有刊物、专利和专利申请直接作为参考也都并入到本申请书中。
Claims (16)
1.核酸分子,是用于检测核酸分子的核酸分子,其特征是:为部分双链型核酸分子,包含(a):与成为检测对象的核酸分子互补的单链核酸分子,和(b):与(a)的单链核酸分子的一部分杂交的1条或2条单链核酸分子,该部分双链型核酸分子中呈现单链结构的区域与成为检测对象的核酸分子中含有识别部位的区域互补。
2.权利要求1所述的核酸分子,其中呈双链结构的区域长度是10~200个碱基。
3.权利要求1或2所述的核酸分子,其中呈单链结构的区域的长度是1~10个碱基。
4.权利要求1至3中任一项所述的核酸分子,其中(a)的单链核酸分子、(b)的单链核酸分子中的任一方用供体荧光色素标记,而另一方用受体荧光色素标记。
5.权利要求1至4中任一项所述的核酸分子,其中(a)的单链核酸分子和(b)的单链核酸分子通过接头连接。
6.权利要求5所述的核酸分子,其中接头是核酸。
7.核酸芯片,其为在基板上固定了权利要求1至6中任一项所述的核酸分子的核酸芯片。
8.核酸分子的检测方法,其特征是:包括使权利要求1至6中任一项所述的核酸分子与作为检测对象的核酸分子在可杂交的条件下接触的步骤。
9.权利要求8所述的核酸分子的检测方法,其特征是:在胺类或季铵盐存在下,使权利要求1至6中任一项所述的核酸分子与作为检测对象的核酸分子接触。
10.权利要求8或9所述的核酸分子的检测方法,其特征是:在阳离子性高分子存在下,使权利要求1至6中任一项所述的核酸分子与作为检测对象的核酸分子接触。
11.错配序列的检测方法,是对样品单链核酸分子与标准单链核酸分子间的错配序列进行检测的方法,其特征在于:包括使这样的部分双链型核酸分子与作为样品的单链核酸分子在可杂交的条件下接触的步骤,所述部分双链型核酸分子包含(a):与作为样品的单链核酸分子互补的单链核酸分子,和(b):与(a)的单链核酸分子的一部分杂交的1条或2条单链核酸分子,该部分双链型核酸分子中呈现单链结构的区域与作为样品的单链核酸分子中包含预计存在错配序列部位的区域互补。
12.权利要求11所述的错配序列的检测方法,其特征是在胺类或季铵盐存在下,使部分双链型核酸分子与作为样品的核酸分子接触。
13.权利要求11或12所述的错配序列的检测方法,其特征是在阳离子性高分子存在下,使作为样品的单链核酸分子与部分双链型核酸分子接触。
14.核酸分子的检测方法,其特征是向含有作为检测对象的核酸分子的样品中加入与检测对象核酸分子中不含有识别部位的区域互补的第一检测探针,然后加入含有与第一检测探针相同的碱基序列的、并与检测对象核酸分子中含有识别部位的区域互补的第二检测探针,使作为检测对象的核酸分子、第一检测探针和第二检测探针三者在可杂交的条件下共存,然后将作为检测对象的核酸分子与第二检测探针的结合、或作为检测对象的核酸分子与第一检测探针的解离作为指标,进行核酸分子的检测。
15.权利要求14所述的核酸分子的检测方法,其特征是在胺类或季铵盐存在下,使作为检测对象的核酸分子、第一检测探针和第二检测探针共存。
16.权利要求14或15所述的核酸分子的检测方法,其特征是在阳离子性高分子存在下,使作为检测对象的核酸分子、第一检测探针和第二检测探针共存。
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