JP5266301B2 - 部分二重鎖型核酸分子 - Google Patents
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Description
本発明は、プローブやプライマーとして利用可能な核酸分子、及びその用途に関するものである。この核酸分子をプローブとして用いることにより、一塩基変異などの遺伝子配列のわずかな違いを簡易かつ迅速に識別することが可能となる。
従来の技術で、一塩基変異などの微細な塩基配列の違いに対して十分な識別能を持つものは、酵素反応を利用したものに限定される。酵素を用いる解析法は、複雑な系が多く、操作性、コスト、分析時間などに問題がある。
一方、酵素を使わない従来技術に、モレキュラービーコン法等があるが、一塩基変異の解析には注意深いプローブ設計が必要となり、ハイスループット化上の問題となる。また、モレキュラービーコンは、プローブ核酸中に識別に関与しない塩基配列を必要とする点で、診断精度上問題になる可能性がある。
また、最近、単鎖部分と二重鎖部分とを持つ部分二重鎖型のプローブに関する文献が公表されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。これらの文献には、部分二重鎖型構造のプローブを用いて一塩基変異などを識別することが記載されているが、一塩基変異がプローブ上のどの位置に対応するように設計すればよいかといったことについては言及されていない。
Ｑｉｎｇｇｅ Ｌｉ，Ｇｕｏｙａｎ Ｌｕａｎ，Ｑｉｕｐｉｎｇ Ｇｕｏ ａｎｄ Ｊｉｘｕａｎ Ｌｉａｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．２
本発明は、塩基配列の微細な違いを簡便に識別できるプローブを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、プローブの構造を単鎖部分と二重鎖部分とを持つ部分二重鎖型構造とし、単鎖部分が検出しようとする核酸分子において遺伝的多型の存在が予想される部位などと対応するように、プローブを設計することにより、目的の核酸分子だけを高感度で検出できることを見出し、この知見から本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１６）を提供するものである。
（１）核酸分子を検出するための核酸分子であって、（ａ）検出対象とする核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、（ｂ）（ａ）の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする１又は２の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であり、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的であることを特徴とする核酸分子。
（２）二重鎖構造をとる領域の長さが、１０〜２００塩基である（１）記載の核酸分子。
（３）単鎖構造をとる領域の長さが、１〜１０塩基である（１）又は（２）記載の核酸分子。
（４）（ａ）の単鎖核酸分子、（ｂ）の単鎖核酸分子のいずれか一方が、ドナー蛍光色素で標識されており、他方がアクセプター蛍光色素で標識されている（１）乃至（３）のいずれか記載の核酸分子。
（５）（ａ）の単鎖核酸分子と（ｂ）の単鎖核酸分子とがリンカーによって繋げられている（１）乃至（４）のいずれか記載の核酸分子。
（６）リンカーが、核酸である（５）記載の核酸分子。
（７）（１）乃至（６）のいずれか記載の核酸分子を基板上に固定した核酸チップ。
（８）（１）乃至（６）のいずれか記載の核酸分子を、検出対象とする核酸分子とハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させる工程を含むことを特徴とする核酸分子の検出方法。
（９）アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、（１）乃至（６）のいずれか記載の核酸分子を検出対象とする核酸分子と接触させることを特徴とする（８）記載の核酸分子の検出方法。
（１０）カチオン性高分子の存在下で、（１）乃至（６）のいずれか記載の核酸分子を検出対象とする核酸分子と接触させることを特徴とする（８）又は（９）記載の核酸分子の検出方法。
（１１）試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子間のミスマッチ配列を検出する方法であって、（ａ）試料とする単鎖核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、（ｂ）（ａ）の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする１又は２の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であって、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該試料とする単鎖核酸分子におけるミスマッチ配列の存在が予想される部位を含む領域と相補的である核酸分子を、当該試料とする単鎖核酸分子とハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させる工程を含むことを特徴とするミスマッチ配列の検出方法。
（１２）アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、部分二重鎖型核酸分子を試料とする核酸分子と接触させることを特徴とする（１１）記載のミスマッチ配列の検出方法。
（１３）カチオン性高分子の存在下で、試料とする単鎖核酸分子を部分二重鎖核酸分子と接触させることを特徴とする（１１）又は（１２）記載のミスマッチ配列の検出方法。
（１４）検出対象とする核酸分子を含むサンプルに、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含まない領域と相補的な第一の検出プローブを加え、次いで、第一の検出プローブと同一の塩基配列を含み、かつ、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的な第二の検出プローブを加え、検出対象とする核酸分子、第一の検出プローブ及び第二の検出プローブの三者をハイブリダイゼーションが可能な条件で共存させ、その後、検出対象とする核酸分子と第二の検出プローブの結合、又は検出対象とする核酸分子と第一の検出プローブとの解離を指標として、核酸分子の検出を行うことを特徴とする核酸分子の検出方法。
（１５）アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、検出対象とする核酸分子、第一の検出プローブ及び第二の検出プローブを共存させることを特徴とする（１４）記載の核酸分子の検出方法。
（１６）カチオン性高分子の存在下で、検出対象とする核酸分子、第一の検出プローブ及び第二の検出プローブを共存させることを特徴とする（１４）又は（１５）記載の核酸分子の検出方法。
（１）核酸分子を検出するための核酸分子であって、（ａ）検出対象とする核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、（ｂ）（ａ）の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする１又は２の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であり、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的であることを特徴とする核酸分子。
（２）二重鎖構造をとる領域の長さが、１０〜２００塩基である（１）記載の核酸分子。
（３）単鎖構造をとる領域の長さが、１〜１０塩基である（１）又は（２）記載の核酸分子。
（４）（ａ）の単鎖核酸分子、（ｂ）の単鎖核酸分子のいずれか一方が、ドナー蛍光色素で標識されており、他方がアクセプター蛍光色素で標識されている（１）乃至（３）のいずれか記載の核酸分子。
（５）（ａ）の単鎖核酸分子と（ｂ）の単鎖核酸分子とがリンカーによって繋げられている（１）乃至（４）のいずれか記載の核酸分子。
（６）リンカーが、核酸である（５）記載の核酸分子。
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（８）（１）乃至（６）のいずれか記載の核酸分子を、検出対象とする核酸分子とハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させる工程を含むことを特徴とする核酸分子の検出方法。
（９）アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、（１）乃至（６）のいずれか記載の核酸分子を検出対象とする核酸分子と接触させることを特徴とする（８）記載の核酸分子の検出方法。
（１０）カチオン性高分子の存在下で、（１）乃至（６）のいずれか記載の核酸分子を検出対象とする核酸分子と接触させることを特徴とする（８）又は（９）記載の核酸分子の検出方法。
（１１）試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子間のミスマッチ配列を検出する方法であって、（ａ）試料とする単鎖核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、（ｂ）（ａ）の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする１又は２の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であって、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該試料とする単鎖核酸分子におけるミスマッチ配列の存在が予想される部位を含む領域と相補的である核酸分子を、当該試料とする単鎖核酸分子とハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させる工程を含むことを特徴とするミスマッチ配列の検出方法。
（１２）アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、部分二重鎖型核酸分子を試料とする核酸分子と接触させることを特徴とする（１１）記載のミスマッチ配列の検出方法。
（１３）カチオン性高分子の存在下で、試料とする単鎖核酸分子を部分二重鎖核酸分子と接触させることを特徴とする（１１）又は（１２）記載のミスマッチ配列の検出方法。
（１４）検出対象とする核酸分子を含むサンプルに、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含まない領域と相補的な第一の検出プローブを加え、次いで、第一の検出プローブと同一の塩基配列を含み、かつ、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的な第二の検出プローブを加え、検出対象とする核酸分子、第一の検出プローブ及び第二の検出プローブの三者をハイブリダイゼーションが可能な条件で共存させ、その後、検出対象とする核酸分子と第二の検出プローブの結合、又は検出対象とする核酸分子と第一の検出プローブとの解離を指標として、核酸分子の検出を行うことを特徴とする核酸分子の検出方法。
（１５）アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、検出対象とする核酸分子、第一の検出プローブ及び第二の検出プローブを共存させることを特徴とする（１４）記載の核酸分子の検出方法。
（１６）カチオン性高分子の存在下で、検出対象とする核酸分子、第一の検出プローブ及び第二の検出プローブを共存させることを特徴とする（１４）又は（１５）記載の核酸分子の検出方法。
本発明の核酸分子をプローブ等として用いることにより、一塩基変異などの微細な塩基配列の違いを識別することが可能になる。また、本発明の核酸分子をプローブ等として用いた場合、温度などを厳密に制御する必要がなく、簡便な操作で核酸分子を検出することができる。
１：本発明の核酸分子
２：短い単鎖
３：長い単鎖
４：二重鎖部分
５：単鎖部分
６：検出対象とする核酸分子
７：識別部位
８：識別部位を含む領域
２：短い単鎖
３：長い単鎖
４：二重鎖部分
５：単鎖部分
６：検出対象とする核酸分子
７：識別部位
８：識別部位を含む領域
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の核酸分子は、核酸分子を検出するための核酸分子であって、（ａ）検出対象とする核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、（ｂ）（ａ）の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする１又は２の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であり、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的であることを特徴とするものである。
本発明の核酸分子は、核酸分子を検出するための核酸分子であって、（ａ）検出対象とする核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、（ｂ）（ａ）の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする１又は２の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であり、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的であることを特徴とするものである。
本発明において「核酸分子」とは、主としてＤＮＡを意味するが、ＲＮＡや核酸類似分子（例えば、ペプチド核酸、ＬＮＡ、モルフォリノヌクレオチドなど）なども含む。
「識別部位」とは、検出対象とする核酸分子と、それと類似する核酸分子との間で配列が異なっていると予想される部位をいう。遺伝的多型の存在が予想される部位は、通常識別部位となり得る。本発明の核酸分子は、この識別部位が単鎖構造部分と対応している点に特徴がある。前述したように、部分二重鎖型核酸分子は既に公知であるが、それら公知の核酸分子では、いずれも識別部位が二重鎖構造部分と対応している（例えば、特許文献２の実施例１）。
検出対象とする核酸分子は特に限定されないが、本発明の核酸分子は１塩基変異の識別に有効なので、１塩基変異を含む遺伝子などを検出対象とするのが好ましい。
（ｂ）の単鎖核酸分子は１本であってもよく、２本でもよい。１本の場合は片側が二重鎖でもう一方の側が単鎖というような構造をとり、２本の場合は両側が二重鎖で中央部分が単鎖というような構造をとる。
本発明の核酸分子の二重鎖構造をとる領域の長さは特に限定されないが、通常１０〜２００塩基程度である。好適な長さは、核酸分子の用途によって異なり、例えば、溶液中でハイブリダイゼーションを行う場合には、１０〜６０塩基程度が好適であり、核酸チップ等に固定するような場合には、１５〜１００塩基程度が好適である。
本発明の核酸分子の単鎖構造をとる領域の長さは特に限定されないが、通常１〜１０塩基程度であり、好ましくは１〜７塩基程度である。
（ａ）の単鎖核酸分子と（ｂ）の単鎖核酸分子とはリンカーによって繋げられていてもよい。リンカーは、核酸であってもよく、それ以外の物質であってもよい。
本発明の核酸分子の標識方法は特に限定されず、例えば、（ａ）の単鎖核酸分子、（ｂ）の単鎖核酸分子のいずれか一方をドナー蛍光色素（例えば、フルオレスセインイソチオシアネートなど）で標識し、他方をアクセプター蛍光色素（例えば、テトラメチルローダミン、ダブシルなど）で標識する方法などを例示できる。この標識方法では、（ａ）の単鎖核酸分子が（ｂ）の単鎖核酸分子と解離すること（これは、（ａ）の単鎖核酸分子が検出対象とする核酸分子とハイブリダイズすることを意味する）により、蛍光が生じるので、その蛍光を指標として検出対象核酸分子の検出を行うことができる。
本発明の核酸分子をプローブとしてＤＮＡの検出等を行う場合、使用するプローブは１種類だけでもよいが、２種類以上を同時に使用してもよい。２種類以上のプローブを用いる場合としては、後述する生物の遺伝子型を決めるような場合を例示できる。
本発明の核酸分子の構造を図１を用いて説明する。本発明の核酸分子１は、短い単鎖２と長い単鎖３とから構成され、両単鎖の長さの違いから二重鎖部分４と単鎖部分５とを持っている。長い単鎖３は、検出対象とする核酸分子６と相補的であり、また、長い単鎖３の単鎖部分５は、検出対象とする核酸分子６における識別部位７を含む領域８と相補的である。
本発明の核酸分子がＤＮＡ等を高感度で検出できる原理を図２を用いて説明する。
本発明の核酸分子と標的核酸分子を共存させると（図２Ａ）、本発明の核酸分子の短鎖と標的核酸分子が交換し、本発明の核酸分子の長鎖と標的核酸分子との二重鎖構造が形成される（図２Ｃ）。この鎖交換は、図２Ｂに示すような遷移状態を経て行われる。単鎖部位が標的核酸と相同的であれば、遷移複合体の生成が促される。
しかし、標的核酸分子にミスマッチ配列が含まれている場合には、上述したような遷移複合体形成は促されず（図２Ｄ）、従って、鎖交換も起こらない（図２Ｅ）。このような遷移複合体の形成の難易により、微細な配列の違いを識別できるようになる。
本発明の核酸分子を基板上に固定することにより、核酸チップを作製することができる。この際、使用する基板は一般的なＤＮＡチップなどに用いられるものでよい。固定方法も一般的なＤＮＡチップと同様の方法でよい。なお、基板には、（ａ）の単鎖核酸分子の方を固定しても（ｂ）の単鎖核酸分子を固定してもよい。
本発明の核酸分子による核酸分子の検出は、例えば、本発明の核酸分子を検出対象とする核酸分子とハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させることにより行うことができる。両核酸分子を接触させる際の条件は、ハイブリダイゼーションが可能な条件であれば特に限定されないが、アミン類（例えば、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミンなど）又は第四級アンモニウム塩の存在下で接触させることが好ましい。
ここで使用するアミン類および第四級アンモニウム塩としては、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラメチルアンモニウムブロミド、テトラエチルアンモニウムクロリド、テトラエチルアンモニウムブロミド、テトラプロピルアンモニウムクロリド、テトラプロピルアンモニウムブロミド、テトラブチルアンモニウムクロリド、テトラブチルアンモニウムブロミドなどを挙げることができ、これらの中でも、テトラメチルアンモニウムクロリドを使用するのが好ましい。使用するアミン類または第四級アンモニウム塩の量は特に限定されず、通常、０．０５〜５Ｍ、好ましくは０．５〜４Ｍ程度になるように添加すればよい。
核酸分子を接触させる際には、カチオン性高分子の存在下で行うことも好ましい。
使用するカチオン性高分子としては、国際公開０３／０１８８４１号パンフレットに開示されている親水性グラフト共重合体（カチオン性基を形成し得るモノマーから構成されるポリマーを主鎖とし、親水性高分子を側鎖とするグラフト共重合体）及びＰＣ重合体（ホスホリルコリン類似基含有単量体、およびカチオン性基を有するカチオン性単量体を重合してなる重合体）などを挙げることができる。具体的な化合物は、国際公開０３／０１８８４１号パンフレットに開示されている化合物すべてが含まれるが、代表的なものとして、親水性グラフト共重合体としては、デキストラン側鎖修飾α−ポリ（Ｌ−リジン）、デキストラン側鎖修飾ε−ポリ（Ｌ−リジン）、デキストラン側鎖修飾ポリアリルアミンを例示でき、ＰＣ重合体としては、２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートと一級のアミノ基を有するアミノエチルアクリレート（塩酸塩）とを重合してなる重合体、２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートと四級のアンモニウム基を有する［２−（アクリロイルオキシアミノ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド、２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドとを重合してなる重合体を例示できる。使用するカチオン性高分子の量は特に限定されないが、核酸分子のリン酸基に対するカチオン性高分子のカチオン性基の比が０．０１〜１０００になるようにするのが好ましい。
また、本発明の核酸分子は、ミスマッチ配列の検出にも利用できる。即ち、試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子間のミスマッチ配列を検出する際に、本発明の核酸分子を、当該試料とする単鎖核酸分子とハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させることにより、ミスマッチ配列を検出できる。この際、ミスマッチ配列の存在が予想される部位が、本発明の核酸分子の単鎖構造をとっている領域と対応するようにする。
本発明の核酸分子は、生物の遺伝子型の決定、即ち、ある生物の遺伝子型が野生型、ヘテロ変異型、ホモ変異型のいずれであるかを決定することに利用できる。具体的には、野生型の遺伝子を検出する核酸分子と変異型の遺伝子を検出する核酸分子を作製し、それぞれを異なる方法で標識し（例えば、異なる蛍光色素で標識するなど）、２種類の核酸分子を被検生物由来の核酸分子と共存させることにより行う。このとき、野生型の遺伝子だけが検出されれば被検生物は野生型であり、変異型の遺伝子だけが検出されれば被検生物はホモ変異型であり、両方の遺伝子が検出されれば被検生物はヘテロ変異型であると判定できる。
本発明の核酸分子を使わずに、図３で説明した原理を利用して、核酸分子の検出を行うことも可能である。例えば、以下のような方法が考えられる。
検出対象とする核酸分子を含むサンプルに、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含まない領域と相補的な第一の検出プローブを加える。これにより、第一の検出プローブは、検出対象とする核酸分子とハイブリダイズする（図３Ｂ）。このとき、検出対象とする核酸分子における識別部位は、単鎖状態のままである。
次に、第一の検出プローブと同一の塩基配列を含み、かつ、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的な第二の検出プローブを加える。このとき、検出対象とする核酸分子の識別部位の配列が、第二の検出プローブの対応部位の配列と相補的であれば、図３Ｃに示すような遷移複合体が形成され、更に、第一の検出プローブの解離が起こる（図３Ｄ）。一方、検出対象とする核酸分子の識別部位の配列が、第二の検出プローブの対応部位の配列と相補的でない場合は、遷移複合体は形成されず、第一の検出プローブの解離も起こらない。
従って、検出対象とする核酸分子と第二の検出プローブの結合、又は検出対象とする核酸分子と第一の検出プローブとの解離を指標として、サンプル中に検出対象とする核酸分子が存在したかどうかを高い精度で判定することができる。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
最初に本実施例で使用したＯＤＮについて説明する。
（Ａ）シトクロムＰ４５０遺伝子関連ＯＤＮ
シトクロムＰ４５０遺伝子に関連するＯＤＮとしては、Ｆ１、Ｄ１、Ｃ１、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｔ１の８種類のＯＤＮを使用した。これらのＯＤＮの関係を図４に示す。
（１）Ｆ１及びＤ１
Ｆ１は、５'末端がフルオレスセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識されているＯＤＮであり、Ｄ１は、３'末端がダブシル（ＤＡＢ）で標識されているＯＤＮである。Ｆ１とＤ１は互いに相補的なＯＤＮであるが、鎖長はそれぞれ１９塩基と１４塩基であり、Ｆ１は、Ｄ１と二重鎖ＤＮＡを形成しても、３'末端側に単鎖部分が連続して５塩基存在する。
Ｆ１及びＤ１の塩基配列をそれぞれ配列番号２及び配列番号１に示す。
（２）Ｃ１
Ｃ１はＦ１と相補的二重鎖を形成できる完全に相補的な未標識ＯＤＮである。
Ｃ１の塩基配列を配列番号３に示す。
（３）Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３
Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３は、それぞれ５'末端近傍、中央部、３'末端近傍に一塩基変異を持ち、Ｆ１との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する。これらのＯＤＮの鎖長はいずれも１９塩基である。
Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３の塩基配列をそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示す。
（４）Ｍ４
Ｍ４は、Ｄ１と同一の配列を持ち、鎖長は１４塩基である。
Ｍ４の塩基配列を配列番号７に示す。
（５）Ｔ１
Ｔ１は、５'末端がテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識されているＯＤＮである。Ｔ１は、Ｄ１と相補的なＯＤＮであるが、鎖長は１９塩基であり、Ｆ１と同様に、Ｄ１と二重鎖ＤＮＡを形成しても３'末端側に単鎖部分が連続して５塩基存在する。
Ｔ１は、Ｆ１とは逆に、Ｍ１と完全に相補的で、Ｃ１とは５'末端近傍でミスマッチ塩基対を形成する。
Ｔ１の塩基配列を配列番号８に示す。
（Ａ）シトクロムＰ４５０遺伝子関連ＯＤＮ
シトクロムＰ４５０遺伝子に関連するＯＤＮとしては、Ｆ１、Ｄ１、Ｃ１、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｔ１の８種類のＯＤＮを使用した。これらのＯＤＮの関係を図４に示す。
（１）Ｆ１及びＤ１
Ｆ１は、５'末端がフルオレスセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識されているＯＤＮであり、Ｄ１は、３'末端がダブシル（ＤＡＢ）で標識されているＯＤＮである。Ｆ１とＤ１は互いに相補的なＯＤＮであるが、鎖長はそれぞれ１９塩基と１４塩基であり、Ｆ１は、Ｄ１と二重鎖ＤＮＡを形成しても、３'末端側に単鎖部分が連続して５塩基存在する。
Ｆ１及びＤ１の塩基配列をそれぞれ配列番号２及び配列番号１に示す。
（２）Ｃ１
Ｃ１はＦ１と相補的二重鎖を形成できる完全に相補的な未標識ＯＤＮである。
Ｃ１の塩基配列を配列番号３に示す。
（３）Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３
Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３は、それぞれ５'末端近傍、中央部、３'末端近傍に一塩基変異を持ち、Ｆ１との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する。これらのＯＤＮの鎖長はいずれも１９塩基である。
Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３の塩基配列をそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示す。
（４）Ｍ４
Ｍ４は、Ｄ１と同一の配列を持ち、鎖長は１４塩基である。
Ｍ４の塩基配列を配列番号７に示す。
（５）Ｔ１
Ｔ１は、５'末端がテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識されているＯＤＮである。Ｔ１は、Ｄ１と相補的なＯＤＮであるが、鎖長は１９塩基であり、Ｆ１と同様に、Ｄ１と二重鎖ＤＮＡを形成しても３'末端側に単鎖部分が連続して５塩基存在する。
Ｔ１は、Ｆ１とは逆に、Ｍ１と完全に相補的で、Ｃ１とは５'末端近傍でミスマッチ塩基対を形成する。
Ｔ１の塩基配列を配列番号８に示す。
（Ｂ）ＡＢＣトランスポーター遺伝子関連ＯＤＮ
ＡＢＣトランスポーター遺伝子に関連するＯＤＮとしては、Ｆ２、Ｄ２、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｔ２、Ｄ３、Ｔ３、４５Ａ１、４５Ａ２の１０種類のＯＤＮを使用した。Ｆ２、Ｄ２、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｔ２の関係及びＤ３、Ｔ３、４５Ａ１、４５Ａ２の関係をそれぞれ図５及び図６に示す。
（１）Ｆ２及びＤ２
Ｆ２は、５'末端がＦＩＴＣで標識されているＯＤＮであり、Ｄ２は、３'末端がＤＡＢで標識されているＯＤＮである。Ｆ２とＤ２は互いに相補的なＯＤＮであるが、鎖長はそれぞれ２５塩基と２０塩基であり、Ｆ２はＤ２と二重鎖ＤＮＡを形成しても３'末端側に単鎖部分が連続して５塩基存在する。Ｆ２／Ｄ２の単鎖部分は、ＡＴリッチな配列になっている。
Ｆ２及びＤ２の塩基配列をそれぞれ配列番号１４及び配列番号９に示す。
（２）Ａ１
Ａ１はＴ２と相補的二重鎖を形成できる完全に相補的な未標識ＯＤＮである。
Ａ１の塩基配列を配列番号１１に示す。
（３）Ａ２
Ａ２は、５'末端近傍に一塩基変異を持ち、Ｔ２との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する鎖長２５塩基のＯＤＮである。
Ａ２の塩基配列を配列番号１２に示す。
（４）Ａ３
Ａ３は、中央部に一塩基変異を持ち、Ｔ２との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する鎖長２５塩基のＯＤＮである。
Ａ３の塩基配列を配列番号１３に示す。
（５）Ｔ２
Ｔ２は、５'末端がＴＡＭＲＡで標識されているＯＤＮである。Ｔ２は、Ｄ２と相補的なＯＤＮであるが、鎖長は２５塩基であり、Ｆ２と同様に、Ｄ２と二重鎖ＤＮＡを形成しても３'末端側に単鎖部分が連続して５塩基存在する。
Ｔ２の塩基配列を配列番号１０に示す。
（６）Ｔ３及びＤ３
Ｔ３は、５'末端がＴＡＭＲＡで標識されているＯＤＮであり、Ｄ３は、３'末端がＤＡＢで標識されているＯＤＮである。Ｔ３とＤ３は互いに相補的な塩基配列であるが、鎖長はそれぞれ４５塩基と４０塩基であり、Ｔ３はＤ３と二重鎖ＤＮＡを形成しても３'末端側に単鎖部分が連続して５塩基存在する。
Ｔ３及びＤ３の塩基配列をそれぞれ配列番号１６及び配列番号１５に示す。
（７）４５Ａ１
４５Ａ１はＴ３と相補的二重鎖を形成できる完全に相補的な未標識ＯＤＮである。
４５Ａ１の塩基配列を配列番号１７に示す。
（８）４５Ａ２
４５Ａ２は、５'末端近傍に一塩基変異を持ち、Ｔ３との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する鎖長４５塩基のＯＤＮである。
４５Ａ２の塩基配列を配列番号１８に示す。
なお、以上のＯＤＮは、ファスマック（株）より購入し、逆相クロマトグラフィーにより精製したものである。
ＡＢＣトランスポーター遺伝子に関連するＯＤＮとしては、Ｆ２、Ｄ２、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｔ２、Ｄ３、Ｔ３、４５Ａ１、４５Ａ２の１０種類のＯＤＮを使用した。Ｆ２、Ｄ２、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｔ２の関係及びＤ３、Ｔ３、４５Ａ１、４５Ａ２の関係をそれぞれ図５及び図６に示す。
（１）Ｆ２及びＤ２
Ｆ２は、５'末端がＦＩＴＣで標識されているＯＤＮであり、Ｄ２は、３'末端がＤＡＢで標識されているＯＤＮである。Ｆ２とＤ２は互いに相補的なＯＤＮであるが、鎖長はそれぞれ２５塩基と２０塩基であり、Ｆ２はＤ２と二重鎖ＤＮＡを形成しても３'末端側に単鎖部分が連続して５塩基存在する。Ｆ２／Ｄ２の単鎖部分は、ＡＴリッチな配列になっている。
Ｆ２及びＤ２の塩基配列をそれぞれ配列番号１４及び配列番号９に示す。
（２）Ａ１
Ａ１はＴ２と相補的二重鎖を形成できる完全に相補的な未標識ＯＤＮである。
Ａ１の塩基配列を配列番号１１に示す。
（３）Ａ２
Ａ２は、５'末端近傍に一塩基変異を持ち、Ｔ２との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する鎖長２５塩基のＯＤＮである。
Ａ２の塩基配列を配列番号１２に示す。
（４）Ａ３
Ａ３は、中央部に一塩基変異を持ち、Ｔ２との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する鎖長２５塩基のＯＤＮである。
Ａ３の塩基配列を配列番号１３に示す。
（５）Ｔ２
Ｔ２は、５'末端がＴＡＭＲＡで標識されているＯＤＮである。Ｔ２は、Ｄ２と相補的なＯＤＮであるが、鎖長は２５塩基であり、Ｆ２と同様に、Ｄ２と二重鎖ＤＮＡを形成しても３'末端側に単鎖部分が連続して５塩基存在する。
Ｔ２の塩基配列を配列番号１０に示す。
（６）Ｔ３及びＤ３
Ｔ３は、５'末端がＴＡＭＲＡで標識されているＯＤＮであり、Ｄ３は、３'末端がＤＡＢで標識されているＯＤＮである。Ｔ３とＤ３は互いに相補的な塩基配列であるが、鎖長はそれぞれ４５塩基と４０塩基であり、Ｔ３はＤ３と二重鎖ＤＮＡを形成しても３'末端側に単鎖部分が連続して５塩基存在する。
Ｔ３及びＤ３の塩基配列をそれぞれ配列番号１６及び配列番号１５に示す。
（７）４５Ａ１
４５Ａ１はＴ３と相補的二重鎖を形成できる完全に相補的な未標識ＯＤＮである。
４５Ａ１の塩基配列を配列番号１７に示す。
（８）４５Ａ２
４５Ａ２は、５'末端近傍に一塩基変異を持ち、Ｔ３との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する鎖長４５塩基のＯＤＮである。
４５Ａ２の塩基配列を配列番号１８に示す。
なお、以上のＯＤＮは、ファスマック（株）より購入し、逆相クロマトグラフィーにより精製したものである。
〔実施例１〕
等モル量のＦ１とＤ１をＰＢＳ緩衝液（［Ｎａ+］＝１５０ｍＭ，ｐＨ７．２）に加えた。この緩衝液を９０℃に加熱し、その後徐冷し、１２ｎＭの部分二重鎖型プローブＦ１／Ｄ１を含む溶液を調製した。この溶液を２０℃に保ち、単鎖としてＣ１、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、又はＭ４を６０ｎＭになるように加え、鎖交換反応を開始させた。鎖交換の進行はＤＡＢにより消光されていたＦＩＴＣの蛍光（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）の回復により検出した。
反応開始後の蛍光強度の経時的変化を図７に示す。また、反応開始から５分後、１０分後、２０分後の蛍光強度を表１に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表２に示す。
等モル量のＦ１とＤ１をＰＢＳ緩衝液（［Ｎａ+］＝１５０ｍＭ，ｐＨ７．２）に加えた。この緩衝液を９０℃に加熱し、その後徐冷し、１２ｎＭの部分二重鎖型プローブＦ１／Ｄ１を含む溶液を調製した。この溶液を２０℃に保ち、単鎖としてＣ１、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、又はＭ４を６０ｎＭになるように加え、鎖交換反応を開始させた。鎖交換の進行はＤＡＢにより消光されていたＦＩＴＣの蛍光（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）の回復により検出した。
反応開始後の蛍光強度の経時的変化を図７に示す。また、反応開始から５分後、１０分後、２０分後の蛍光強度を表１に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表２に示す。
これらの図及び表に示すように、変異を含む単鎖（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）よりも、完全に相補的な単鎖（Ｃ１）の方が速やかに鎖交換が進行した。Ｃ１との速度差は、５'末端近傍部位に変異を含むＭ１（変異はＦ１の単鎖部分に対応する）、中央部分に変異を含むＭ２、３'末端近傍部位に変異を含むＭ３の順に大きく、Ｃ１とＭ３の間にはあまり大きさ差はみられなかった。
以上のことから、ミスマッチ配列が単鎖部分に対応するように、部分二重鎖型プローブを設計することにより、高感度でミスマッチ配列を検出できると考えられる。
以上のことから、ミスマッチ配列が単鎖部分に対応するように、部分二重鎖型プローブを設計することにより、高感度でミスマッチ配列を検出できると考えられる。
〔実施例２〕
ＰＢＳ緩衝液のナトリウムイオン濃度を１０００ｍＭとし、また、添加する単鎖をＣ１又はＭ１の２種類とし、他は実施例１と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の蛍光強度の経時的変化を図８に示す。また、Ｃ１又はＭ１の鎖交換速度定数の相対値を表３に示す。
ＰＢＳ緩衝液のナトリウムイオン濃度を１０００ｍＭとし、また、添加する単鎖をＣ１又はＭ１の２種類とし、他は実施例１と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の蛍光強度の経時的変化を図８に示す。また、Ｃ１又はＭ１の鎖交換速度定数の相対値を表３に示す。
表に示すように、ナトリウムイオン濃度を１０００ｍＭに変更しても、実施例１の場合と同様に、変異を含む単鎖（Ｍ１）と完全に相補的な単鎖（Ｃ１）の間には、鎖交換速度に大きな差異がみられた。また、ナトリウムイオン濃度を高めることにより、変異を含む単鎖及び完全に相補的な単鎖のいずれの場合も鎖交換速度が上昇した。
〔実施例３〕
部分二重鎖型プローブとしてＴ１／Ｄ１を使用し、また、添加する単鎖をＣ１又はＭ１の２種類とし、更に、鎖交換の進行をＴＡＭＲＡの蛍光（励起波長：５４０ｎｍ、蛍光波長：５７０ｎｍ）の回復により検出することとし、他は実施例１と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の蛍光強度の経時的変化を図９に示す。また、反応開始から５分後、１０分後、２０分後の蛍光強度を表４に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表５に示す。
部分二重鎖型プローブとしてＴ１／Ｄ１を使用し、また、添加する単鎖をＣ１又はＭ１の２種類とし、更に、鎖交換の進行をＴＡＭＲＡの蛍光（励起波長：５４０ｎｍ、蛍光波長：５７０ｎｍ）の回復により検出することとし、他は実施例１と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の蛍光強度の経時的変化を図９に示す。また、反応開始から５分後、１０分後、２０分後の蛍光強度を表４に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表５に示す。
これらの図及び表に示すように、実施例１の場合と同様に、変異を含む単鎖（Ｃ１）と完全に相補的な単鎖（Ｍ１）の間には、鎖交換速度に大きな差異がみられた。この結果から、部分二重鎖型プローブは、Ａ−ＴとＡ−Ｃ間の塩基対の違いだけでなく、検出の難しいＧ−ＣとＧ−Ｔ間の塩基対の違いも高感度で検出できると考えられる。
〔実施例４〕
等モル量のＴ２とＤ２をＰＢＳ緩衝液（［Ｎａ+］＝１５０ｍＭ，ｐＨ７．２）に加えた。この緩衝液を９０℃に加熱し、その後徐冷し、１２ｎＭの部分二重鎖型プローブＴ２／Ｄ２を含む溶液を調製した。この溶液を２０℃に保ち、単鎖としてＡ１又はＡ２を６０ｎＭになるように加え、鎖交換反応を開始させた。鎖交換の進行はＤＡＢにより消光されていたＴＡＭＲＡの蛍光の回復により検出した。
反応開始後の鎖交換率（鎖交換過程の追跡後にアニーリングさせ、その後の蛍光強度を１００％とした。）の経時的変化を図１０に示す。また、反応開始から５分後、１０分後、２０分後の蛍光強度を表６に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表７に示す。
等モル量のＴ２とＤ２をＰＢＳ緩衝液（［Ｎａ+］＝１５０ｍＭ，ｐＨ７．２）に加えた。この緩衝液を９０℃に加熱し、その後徐冷し、１２ｎＭの部分二重鎖型プローブＴ２／Ｄ２を含む溶液を調製した。この溶液を２０℃に保ち、単鎖としてＡ１又はＡ２を６０ｎＭになるように加え、鎖交換反応を開始させた。鎖交換の進行はＤＡＢにより消光されていたＴＡＭＲＡの蛍光の回復により検出した。
反応開始後の鎖交換率（鎖交換過程の追跡後にアニーリングさせ、その後の蛍光強度を１００％とした。）の経時的変化を図１０に示す。また、反応開始から５分後、１０分後、２０分後の蛍光強度を表６に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表７に示す。
これらの図及び表に示すように、Ｔ２の単鎖部分に対応する変異を含む単鎖（Ａ２）と完全に相補的な単鎖（Ａ１）の間には、鎖交換速度に大きな差異がみられた。
〔参考例１〕
添加する単鎖をＡ１又はＡ３とし、他は実施例４と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図１１に示す。また、反応開始から５分後、１０分後、２０分後の蛍光強度を表８に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表９に示す。
添加する単鎖をＡ１又はＡ３とし、他は実施例４と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図１１に示す。また、反応開始から５分後、１０分後、２０分後の蛍光強度を表８に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表９に示す。
これらの図及び表に示すように、Ｔ２の二重鎖部分に対応する変異を含む単鎖（Ａ３）と完全に相補的な単鎖（Ａ１）の間には、鎖交換速度にあまり大きな差異はみられなかった。この結果及び実施例４の結果から、ミスマッチ配列が、二重鎖部分ではなく、単鎖部分に対応するように、部分二重鎖型プローブを設計することにより、プローブの検出感度を大幅に向上させることができると考えられる。
〔実施例５〕
鎖交換反応時の溶液の温度を１０℃、２０℃、２８℃、３７℃の四通りの条件とし、他は実施例４と同様に鎖交換反応を行った。
各温度における変異を含む単鎖（Ａ２）と完全に相補的な単鎖（Ａ１）の速度定数の相対値を図１２に示す。また、各温度における変異を含む単鎖（Ａ２）と完全に相補的な単鎖（Ａ１）との速度比（Ａ１の鎖交換速度定数をＡ２の鎖交換速度定数で割った値）を表１０に示す。
鎖交換反応時の溶液の温度を１０℃、２０℃、２８℃、３７℃の四通りの条件とし、他は実施例４と同様に鎖交換反応を行った。
各温度における変異を含む単鎖（Ａ２）と完全に相補的な単鎖（Ａ１）の速度定数の相対値を図１２に示す。また、各温度における変異を含む単鎖（Ａ２）と完全に相補的な単鎖（Ａ１）との速度比（Ａ１の鎖交換速度定数をＡ２の鎖交換速度定数で割った値）を表１０に示す。
これらの図及び表に示すように、いずれの温度においても変異を含む単鎖と完全に相補的な単鎖の間には、鎖交換速度に大きな差異がみられた。また、温度が低い方が速度の差（速度比）が大きかった。以上の結果から、１０〜３７℃といった温度範囲内であれば、高感度でミスマッチ配列を検出できると考えられる。
〔実施例６〕
部分二重鎖型プローブの濃度を１２ｎＭ、９ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、１．２ｎＭの六通りの条件とし、また、単鎖の濃度を６０ｎＭ、４５ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、６ｎＭの六通りの条件とし、他は実施例４と同様に鎖交換反応を行った。
各濃度の組み合わせにおける変異を含む単鎖（Ａ２）と完全に相補的な単鎖（Ａ１）との速度比（Ａ１の鎖交換速度定数をＡ２の鎖交換速度定数で割った値）を表１１に示す。
部分二重鎖型プローブの濃度を１２ｎＭ、９ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、１．２ｎＭの六通りの条件とし、また、単鎖の濃度を６０ｎＭ、４５ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、６ｎＭの六通りの条件とし、他は実施例４と同様に鎖交換反応を行った。
各濃度の組み合わせにおける変異を含む単鎖（Ａ２）と完全に相補的な単鎖（Ａ１）との速度比（Ａ１の鎖交換速度定数をＡ２の鎖交換速度定数で割った値）を表１１に示す。
表に示すように、いずれの濃度の組み合わせにおいても変異を含む単鎖と完全に相補的な単鎖の間には、鎖交換速度に大きな差異がみられた。
〔実施例７〕
添加する単鎖をＣ１又はＭ１の２種類とし、鎖交換反応を国際公開０３／０１８８４１号パンフレット記載のカチオン性高分子（デキストラン側鎖修飾α−ポリ（Ｌ−リジン））の存在下で行うこととし、他は実施例１と同様に鎖交換反応を行った。カチオン性高分子は、Ｎ／Ｐ比（カチオン性高分子のアミノ基に対するＯＤＮのリン酸基の量）が０．２と０．４の二通りの条件で加えた。
カチオン性高分子存在下（Ｎ／Ｐ＝０．２，０．４）及び非存在下（Ｎ／Ｐ＝０）における各単鎖の鎖交換速度定数の相対値、並びに変異を含む単鎖（Ｍ１）と完全に相補的な単鎖（Ｃ１）との速度比（Ｃ１の鎖交換速度定数をＭ１の鎖交換速度定数で割った値）を表１２に示す。
添加する単鎖をＣ１又はＭ１の２種類とし、鎖交換反応を国際公開０３／０１８８４１号パンフレット記載のカチオン性高分子（デキストラン側鎖修飾α−ポリ（Ｌ−リジン））の存在下で行うこととし、他は実施例１と同様に鎖交換反応を行った。カチオン性高分子は、Ｎ／Ｐ比（カチオン性高分子のアミノ基に対するＯＤＮのリン酸基の量）が０．２と０．４の二通りの条件で加えた。
カチオン性高分子存在下（Ｎ／Ｐ＝０．２，０．４）及び非存在下（Ｎ／Ｐ＝０）における各単鎖の鎖交換速度定数の相対値、並びに変異を含む単鎖（Ｍ１）と完全に相補的な単鎖（Ｃ１）との速度比（Ｃ１の鎖交換速度定数をＭ１の鎖交換速度定数で割った値）を表１２に示す。
表に示すように、カチオン性高分子を加えることにより、変異を含む単鎖及び完全に相補的な単鎖のいずれの場合も鎖交換速度が著しく上昇した。この結果から、鎖交換速度が低くなるような条件（例えば、単鎖やプローブが低濃度でしか存在しない条件）であっても、カチオン性高分子を添加することにより、高感度でミスマッチ配列を検出できると考えられる。
〔参考例２〕
等モル量のＦ２とＤ２をＰＢＳ緩衝液（［Ｎａ+］＝１５０ｍＭ，ｐＨ７．２）に加えた。この緩衝液を９０℃に加熱し、その後徐冷し、１２ｎＭの部分二重鎖型プローブＦ２／Ｄ２を含む溶液を調製した。この溶液を３７℃に保ち、単鎖としてＡ１又はＡ２を６０ｎＭになるように加え、鎖交換反応を開始させた。鎖交換の進行はＤＡＢにより消光されていたＦＩＴＣの蛍光の回復により検出した。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図１３に示す。また、変異を含む単鎖（Ａ１）と完全に相補的な単鎖（Ａ２）との速度比（Ａ２の鎖交換速度定数をＡ１の鎖交換速度定数で割った値）は２．９であった。
図に示すように、変異を含む単鎖（Ａ１）と完全に相補的な単鎖（Ａ２）の間には、鎖交換速度にあまり大きな差異がみられなかった。また、いずれの単鎖を用いた場合も、鎖交換速度はあまり高くなかった。この結果から、検出しようとする単鎖のＧＣ含量や温度等の条件によっては、高感度でミスマッチ配列を検出できない場合もあり得ると考えられる。
等モル量のＦ２とＤ２をＰＢＳ緩衝液（［Ｎａ+］＝１５０ｍＭ，ｐＨ７．２）に加えた。この緩衝液を９０℃に加熱し、その後徐冷し、１２ｎＭの部分二重鎖型プローブＦ２／Ｄ２を含む溶液を調製した。この溶液を３７℃に保ち、単鎖としてＡ１又はＡ２を６０ｎＭになるように加え、鎖交換反応を開始させた。鎖交換の進行はＤＡＢにより消光されていたＦＩＴＣの蛍光の回復により検出した。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図１３に示す。また、変異を含む単鎖（Ａ１）と完全に相補的な単鎖（Ａ２）との速度比（Ａ２の鎖交換速度定数をＡ１の鎖交換速度定数で割った値）は２．９であった。
図に示すように、変異を含む単鎖（Ａ１）と完全に相補的な単鎖（Ａ２）の間には、鎖交換速度にあまり大きな差異がみられなかった。また、いずれの単鎖を用いた場合も、鎖交換速度はあまり高くなかった。この結果から、検出しようとする単鎖のＧＣ含量や温度等の条件によっては、高感度でミスマッチ配列を検出できない場合もあり得ると考えられる。
〔実施例８〕
ＰＢＳ緩衝液中にテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を３Ｍになるように加え、他は参考例２と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図１４に示す。また、変異を含む単鎖（Ａ１）と完全に相補的な単鎖（Ａ２）との速度比（Ａ２の鎖交換速度定数をＡ１の鎖交換速度定数で割った値）は１０．８であった。
図に示すように、参考例２の場合とは異なり、変異を含む単鎖（Ａ１）と完全に相補的な単鎖（Ａ２）の間には、鎖交換速度に大きな差異がみられた。また、鎖交換速度も大きく向上した。この結果から、参考例２の条件であっても、ＴＭＡＣを添加することにより、高感度でミスマッチ配列を検出できるようになると考えられる。
ＰＢＳ緩衝液中にテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を３Ｍになるように加え、他は参考例２と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図１４に示す。また、変異を含む単鎖（Ａ１）と完全に相補的な単鎖（Ａ２）との速度比（Ａ２の鎖交換速度定数をＡ１の鎖交換速度定数で割った値）は１０．８であった。
図に示すように、参考例２の場合とは異なり、変異を含む単鎖（Ａ１）と完全に相補的な単鎖（Ａ２）の間には、鎖交換速度に大きな差異がみられた。また、鎖交換速度も大きく向上した。この結果から、参考例２の条件であっても、ＴＭＡＣを添加することにより、高感度でミスマッチ配列を検出できるようになると考えられる。
〔実施例９〕
部分二重鎖型プローブＦ１／Ｄ１（ＦＩＴＣ標識）と部分二重鎖型プローブＴ１／Ｄ１（ＴＡＭＲＡ標識）とを作製し、３ＭのＴＭＡＣを含むＰＢＳ緩衝液（［Ｎａ+］＝１５０ｍＭ，ｐＨ７．２）に、この２種類のプローブをそれぞれ１２ｎＭになるように加えた。この緩衝液に、Ｍ１、Ｃ１＋Ｍ１、又はＣ１を６０ｎＭ（Ｃ１＋Ｍ１の場合は両単鎖の合わせた濃度が６０ｎＭになるようにした。）になるように添加し、室温条件下で、鎖交換反応を開始させた。反応開始から５分後に、プレートリーダーでＦＩＴＣの蛍光強度とＴＡＭＲＡの蛍光強度を同時に測定した。この操作を、各単鎖について４回、合計１２回行った。１２回の測定値を図１５に示す。
図に示すように、Ｍ１を加えた場合にはＴＡＭＲＡの蛍光は検出されたが、ＦＩＴＣの蛍光はほとんど検出されず、逆に、Ｃ１を加えた場合にはＦＩＴＣの蛍光は検出されたが、ＴＡＭＲＡの蛍光はほとんど検出されなかった。このことは、Ｍ１を加えた場合には、Ｔ１／Ｄ１プローブの鎖交換は起きたが、Ｆ１／Ｄ１プローブの鎖交換はほとんど起きず、Ｃ１を加えた場合には、Ｔ１／Ｄ１プローブの鎖交換はほとんど起きなかったが、Ｆ１／Ｄ１プローブの鎖交換は起きた、ということを意味する。Ｍ１とＴ１、Ｃ１とＦ１がそれぞれ完全に相補的なので図１５の結果は、Ｔ１／Ｄ１プローブ及びＦ１／Ｄ１プローブのいずれも、完全に相補的な単鎖を高い精度で識別していたことを示すものである。
以上のシトクロムＰ４５０遺伝子関連ＯＤＮの実験をＡＢＣトランスポーター遺伝子関連ＯＤＮについても行った。即ち、Ｆ１／Ｄ１プローブの代わりにＦ２／Ｄ２プローブを使用し、Ｔ１／Ｄ１プローブの代わりにＴ２／Ｄ２プローブを使用し、Ｃ１の代わりにＡ２を使用し、Ｍ１の代わりにＡ１を使用し、同様の実験を行った。この結果を図１６に示す。図に示すように、シトクロムＰ４５０遺伝子関連ＯＤＮの場合と同様、部分二重鎖型プローブは完全に相補的な単鎖を高い精度で識別していた。
部分二重鎖型プローブＦ１／Ｄ１（ＦＩＴＣ標識）と部分二重鎖型プローブＴ１／Ｄ１（ＴＡＭＲＡ標識）とを作製し、３ＭのＴＭＡＣを含むＰＢＳ緩衝液（［Ｎａ+］＝１５０ｍＭ，ｐＨ７．２）に、この２種類のプローブをそれぞれ１２ｎＭになるように加えた。この緩衝液に、Ｍ１、Ｃ１＋Ｍ１、又はＣ１を６０ｎＭ（Ｃ１＋Ｍ１の場合は両単鎖の合わせた濃度が６０ｎＭになるようにした。）になるように添加し、室温条件下で、鎖交換反応を開始させた。反応開始から５分後に、プレートリーダーでＦＩＴＣの蛍光強度とＴＡＭＲＡの蛍光強度を同時に測定した。この操作を、各単鎖について４回、合計１２回行った。１２回の測定値を図１５に示す。
図に示すように、Ｍ１を加えた場合にはＴＡＭＲＡの蛍光は検出されたが、ＦＩＴＣの蛍光はほとんど検出されず、逆に、Ｃ１を加えた場合にはＦＩＴＣの蛍光は検出されたが、ＴＡＭＲＡの蛍光はほとんど検出されなかった。このことは、Ｍ１を加えた場合には、Ｔ１／Ｄ１プローブの鎖交換は起きたが、Ｆ１／Ｄ１プローブの鎖交換はほとんど起きず、Ｃ１を加えた場合には、Ｔ１／Ｄ１プローブの鎖交換はほとんど起きなかったが、Ｆ１／Ｄ１プローブの鎖交換は起きた、ということを意味する。Ｍ１とＴ１、Ｃ１とＦ１がそれぞれ完全に相補的なので図１５の結果は、Ｔ１／Ｄ１プローブ及びＦ１／Ｄ１プローブのいずれも、完全に相補的な単鎖を高い精度で識別していたことを示すものである。
以上のシトクロムＰ４５０遺伝子関連ＯＤＮの実験をＡＢＣトランスポーター遺伝子関連ＯＤＮについても行った。即ち、Ｆ１／Ｄ１プローブの代わりにＦ２／Ｄ２プローブを使用し、Ｔ１／Ｄ１プローブの代わりにＴ２／Ｄ２プローブを使用し、Ｃ１の代わりにＡ２を使用し、Ｍ１の代わりにＡ１を使用し、同様の実験を行った。この結果を図１６に示す。図に示すように、シトクロムＰ４５０遺伝子関連ＯＤＮの場合と同様、部分二重鎖型プローブは完全に相補的な単鎖を高い精度で識別していた。
〔実施例１０〕
部分二重鎖型プローブとしてＴ３／Ｄ３を使用し、また、添加する単鎖を４５Ａ１又は４５Ａ２のとし、他は実施例４と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図１７に示す。また、反応開始から５分後、１０分後、２０分後の蛍光強度を表１３に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度の相対値を表１４に示す。
部分二重鎖型プローブとしてＴ３／Ｄ３を使用し、また、添加する単鎖を４５Ａ１又は４５Ａ２のとし、他は実施例４と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図１７に示す。また、反応開始から５分後、１０分後、２０分後の蛍光強度を表１３に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度の相対値を表１４に示す。
これらの図及び表に示すように、変異を含む単鎖（４５Ａ２）と完全に相補的な単鎖（４５Ａ１）の間には、鎖交換速度に大きな差異がみられた。
以上の結果から、二重鎖部分が４０塩基程度の長さであっても、高感度でミスマッチ配列を検出できると考えられる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００３−２８２３１１の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。
Claims (3)
- 試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子間のミスマッチ配列を検出する方法であって、（ａ）基準となる単鎖核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、（ｂ）（ａ）の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする１又は２の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であって、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該試料とする単鎖核酸分子におけるミスマッチ配列の存在が予想される部位を含む領域と相補的である核酸分子を、当該試料とする単鎖核酸分子とハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させる工程と、ミスマッチ配列のない場合は交換速度が速く、ミスマッチ配列のある場合は交換速度が遅くなることを利用して、ミスマッチ配列の有無を検出する工程とを含むことを特徴とするミスマッチ配列の検出方法。
- アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、部分二重鎖型核酸分子を試料とする核酸分子と接触させることを特徴とする請求項１記載のミスマッチ配列の検出方法。
- カチオン性高分子の存在下で、試料とする単鎖核酸分子を部分二重鎖核酸分子と接触させることを特徴とする請求項１又は２記載のミスマッチ配列の検出方法。
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