JP5266301B2 - 部分二重鎖型核酸分子 - Google Patents
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Description
(1)核酸分子を検出するための核酸分子であって、(a)検出対象とする核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、(b)(a)の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする1又は2の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であり、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的であることを特徴とする核酸分子。
(2)二重鎖構造をとる領域の長さが、10〜200塩基である(1)記載の核酸分子。
(3)単鎖構造をとる領域の長さが、1〜10塩基である(1)又は(2)記載の核酸分子。
(4)(a)の単鎖核酸分子、(b)の単鎖核酸分子のいずれか一方が、ドナー蛍光色素で標識されており、他方がアクセプター蛍光色素で標識されている(1)乃至(3)のいずれか記載の核酸分子。
(5)(a)の単鎖核酸分子と(b)の単鎖核酸分子とがリンカーによって繋げられている(1)乃至(4)のいずれか記載の核酸分子。
(6)リンカーが、核酸である(5)記載の核酸分子。
(7)(1)乃至(6)のいずれか記載の核酸分子を基板上に固定した核酸チップ。
(8)(1)乃至(6)のいずれか記載の核酸分子を、検出対象とする核酸分子とハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させる工程を含むことを特徴とする核酸分子の検出方法。
(9)アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、(1)乃至(6)のいずれか記載の核酸分子を検出対象とする核酸分子と接触させることを特徴とする(8)記載の核酸分子の検出方法。
(10)カチオン性高分子の存在下で、(1)乃至(6)のいずれか記載の核酸分子を検出対象とする核酸分子と接触させることを特徴とする(8)又は(9)記載の核酸分子の検出方法。
(11)試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子間のミスマッチ配列を検出する方法であって、(a)試料とする単鎖核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、(b)(a)の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする1又は2の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であって、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該試料とする単鎖核酸分子におけるミスマッチ配列の存在が予想される部位を含む領域と相補的である核酸分子を、当該試料とする単鎖核酸分子とハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させる工程を含むことを特徴とするミスマッチ配列の検出方法。
(12)アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、部分二重鎖型核酸分子を試料とする核酸分子と接触させることを特徴とする(11)記載のミスマッチ配列の検出方法。
(13)カチオン性高分子の存在下で、試料とする単鎖核酸分子を部分二重鎖核酸分子と接触させることを特徴とする(11)又は(12)記載のミスマッチ配列の検出方法。
(14)検出対象とする核酸分子を含むサンプルに、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含まない領域と相補的な第一の検出プローブを加え、次いで、第一の検出プローブと同一の塩基配列を含み、かつ、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的な第二の検出プローブを加え、検出対象とする核酸分子、第一の検出プローブ及び第二の検出プローブの三者をハイブリダイゼーションが可能な条件で共存させ、その後、検出対象とする核酸分子と第二の検出プローブの結合、又は検出対象とする核酸分子と第一の検出プローブとの解離を指標として、核酸分子の検出を行うことを特徴とする核酸分子の検出方法。
(15)アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、検出対象とする核酸分子、第一の検出プローブ及び第二の検出プローブを共存させることを特徴とする(14)記載の核酸分子の検出方法。
(16)カチオン性高分子の存在下で、検出対象とする核酸分子、第一の検出プローブ及び第二の検出プローブを共存させることを特徴とする(14)又は(15)記載の核酸分子の検出方法。
2:短い単鎖
3:長い単鎖
4:二重鎖部分
5:単鎖部分
6:検出対象とする核酸分子
7:識別部位
8:識別部位を含む領域
本発明の核酸分子は、核酸分子を検出するための核酸分子であって、(a)検出対象とする核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、(b)(a)の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする1又は2の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であり、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該検出対象とする核酸分子における識別部位を含む領域と相補的であることを特徴とするものである。
(A)シトクロムP450遺伝子関連ODN
シトクロムP450遺伝子に関連するODNとしては、F1、D1、C1、M1、M2、M3、M4、T1の8種類のODNを使用した。これらのODNの関係を図4に示す。
(1)F1及びD1
F1は、5'末端がフルオレスセインイソチオシアネート(FITC)で標識されているODNであり、D1は、3'末端がダブシル(DAB)で標識されているODNである。F1とD1は互いに相補的なODNであるが、鎖長はそれぞれ19塩基と14塩基であり、F1は、D1と二重鎖DNAを形成しても、3'末端側に単鎖部分が連続して5塩基存在する。
F1及びD1の塩基配列をそれぞれ配列番号2及び配列番号1に示す。
(2)C1
C1はF1と相補的二重鎖を形成できる完全に相補的な未標識ODNである。
C1の塩基配列を配列番号3に示す。
(3)M1、M2、M3
M1、M2、M3は、それぞれ5'末端近傍、中央部、3'末端近傍に一塩基変異を持ち、F1との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する。これらのODNの鎖長はいずれも19塩基である。
M1、M2、及びM3の塩基配列をそれぞれ配列番号4、配列番号5及び配列番号6に示す。
(4)M4
M4は、D1と同一の配列を持ち、鎖長は14塩基である。
M4の塩基配列を配列番号7に示す。
(5)T1
T1は、5'末端がテトラメチルローダミン(TAMRA)で標識されているODNである。T1は、D1と相補的なODNであるが、鎖長は19塩基であり、F1と同様に、D1と二重鎖DNAを形成しても3'末端側に単鎖部分が連続して5塩基存在する。
T1は、F1とは逆に、M1と完全に相補的で、C1とは5'末端近傍でミスマッチ塩基対を形成する。
T1の塩基配列を配列番号8に示す。
ABCトランスポーター遺伝子に関連するODNとしては、F2、D2、A1、A2、A3、T2、D3、T3、45A1、45A2の10種類のODNを使用した。F2、D2、A1、A2、A3、T2の関係及びD3、T3、45A1、45A2の関係をそれぞれ図5及び図6に示す。
(1)F2及びD2
F2は、5'末端がFITCで標識されているODNであり、D2は、3'末端がDABで標識されているODNである。F2とD2は互いに相補的なODNであるが、鎖長はそれぞれ25塩基と20塩基であり、F2はD2と二重鎖DNAを形成しても3'末端側に単鎖部分が連続して5塩基存在する。F2/D2の単鎖部分は、ATリッチな配列になっている。
F2及びD2の塩基配列をそれぞれ配列番号14及び配列番号9に示す。
(2)A1
A1はT2と相補的二重鎖を形成できる完全に相補的な未標識ODNである。
A1の塩基配列を配列番号11に示す。
(3)A2
A2は、5'末端近傍に一塩基変異を持ち、T2との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する鎖長25塩基のODNである。
A2の塩基配列を配列番号12に示す。
(4)A3
A3は、中央部に一塩基変異を持ち、T2との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する鎖長25塩基のODNである。
A3の塩基配列を配列番号13に示す。
(5)T2
T2は、5'末端がTAMRAで標識されているODNである。T2は、D2と相補的なODNであるが、鎖長は25塩基であり、F2と同様に、D2と二重鎖DNAを形成しても3'末端側に単鎖部分が連続して5塩基存在する。
T2の塩基配列を配列番号10に示す。
(6)T3及びD3
T3は、5'末端がTAMRAで標識されているODNであり、D3は、3'末端がDABで標識されているODNである。T3とD3は互いに相補的な塩基配列であるが、鎖長はそれぞれ45塩基と40塩基であり、T3はD3と二重鎖DNAを形成しても3'末端側に単鎖部分が連続して5塩基存在する。
T3及びD3の塩基配列をそれぞれ配列番号16及び配列番号15に示す。
(7)45A1
45A1はT3と相補的二重鎖を形成できる完全に相補的な未標識ODNである。
45A1の塩基配列を配列番号17に示す。
(8)45A2
45A2は、5'末端近傍に一塩基変異を持ち、T3との二重鎖ではミスマッチ塩基対を形成する鎖長45塩基のODNである。
45A2の塩基配列を配列番号18に示す。
なお、以上のODNは、ファスマック(株)より購入し、逆相クロマトグラフィーにより精製したものである。
等モル量のF1とD1をPBS緩衝液([Na+]=150mM,pH7.2)に加えた。この緩衝液を90℃に加熱し、その後徐冷し、12nMの部分二重鎖型プローブF1/D1を含む溶液を調製した。この溶液を20℃に保ち、単鎖としてC1、M1、M2、M3、又はM4を60nMになるように加え、鎖交換反応を開始させた。鎖交換の進行はDABにより消光されていたFITCの蛍光(励起波長:490nm、蛍光波長:520nm)の回復により検出した。
反応開始後の蛍光強度の経時的変化を図7に示す。また、反応開始から5分後、10分後、20分後の蛍光強度を表1に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表2に示す。
以上のことから、ミスマッチ配列が単鎖部分に対応するように、部分二重鎖型プローブを設計することにより、高感度でミスマッチ配列を検出できると考えられる。
PBS緩衝液のナトリウムイオン濃度を1000mMとし、また、添加する単鎖をC1又はM1の2種類とし、他は実施例1と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の蛍光強度の経時的変化を図8に示す。また、C1又はM1の鎖交換速度定数の相対値を表3に示す。
部分二重鎖型プローブとしてT1/D1を使用し、また、添加する単鎖をC1又はM1の2種類とし、更に、鎖交換の進行をTAMRAの蛍光(励起波長:540nm、蛍光波長:570nm)の回復により検出することとし、他は実施例1と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の蛍光強度の経時的変化を図9に示す。また、反応開始から5分後、10分後、20分後の蛍光強度を表4に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表5に示す。
等モル量のT2とD2をPBS緩衝液([Na+]=150mM,pH7.2)に加えた。この緩衝液を90℃に加熱し、その後徐冷し、12nMの部分二重鎖型プローブT2/D2を含む溶液を調製した。この溶液を20℃に保ち、単鎖としてA1又はA2を60nMになるように加え、鎖交換反応を開始させた。鎖交換の進行はDABにより消光されていたTAMRAの蛍光の回復により検出した。
反応開始後の鎖交換率(鎖交換過程の追跡後にアニーリングさせ、その後の蛍光強度を100%とした。)の経時的変化を図10に示す。また、反応開始から5分後、10分後、20分後の蛍光強度を表6に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表7に示す。
添加する単鎖をA1又はA3とし、他は実施例4と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図11に示す。また、反応開始から5分後、10分後、20分後の蛍光強度を表8に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度定数の相対値を表9に示す。
鎖交換反応時の溶液の温度を10℃、20℃、28℃、37℃の四通りの条件とし、他は実施例4と同様に鎖交換反応を行った。
各温度における変異を含む単鎖(A2)と完全に相補的な単鎖(A1)の速度定数の相対値を図12に示す。また、各温度における変異を含む単鎖(A2)と完全に相補的な単鎖(A1)との速度比(A1の鎖交換速度定数をA2の鎖交換速度定数で割った値)を表10に示す。
部分二重鎖型プローブの濃度を12nM、9nM、6nM、4nM、3nM、1.2nMの六通りの条件とし、また、単鎖の濃度を60nM、45nM、30nM、20nM、15nM、6nMの六通りの条件とし、他は実施例4と同様に鎖交換反応を行った。
各濃度の組み合わせにおける変異を含む単鎖(A2)と完全に相補的な単鎖(A1)との速度比(A1の鎖交換速度定数をA2の鎖交換速度定数で割った値)を表11に示す。
添加する単鎖をC1又はM1の2種類とし、鎖交換反応を国際公開03/018841号パンフレット記載のカチオン性高分子(デキストラン側鎖修飾α−ポリ(L−リジン))の存在下で行うこととし、他は実施例1と同様に鎖交換反応を行った。カチオン性高分子は、N/P比(カチオン性高分子のアミノ基に対するODNのリン酸基の量)が0.2と0.4の二通りの条件で加えた。
カチオン性高分子存在下(N/P=0.2,0.4)及び非存在下(N/P=0)における各単鎖の鎖交換速度定数の相対値、並びに変異を含む単鎖(M1)と完全に相補的な単鎖(C1)との速度比(C1の鎖交換速度定数をM1の鎖交換速度定数で割った値)を表12に示す。
等モル量のF2とD2をPBS緩衝液([Na+]=150mM,pH7.2)に加えた。この緩衝液を90℃に加熱し、その後徐冷し、12nMの部分二重鎖型プローブF2/D2を含む溶液を調製した。この溶液を37℃に保ち、単鎖としてA1又はA2を60nMになるように加え、鎖交換反応を開始させた。鎖交換の進行はDABにより消光されていたFITCの蛍光の回復により検出した。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図13に示す。また、変異を含む単鎖(A1)と完全に相補的な単鎖(A2)との速度比(A2の鎖交換速度定数をA1の鎖交換速度定数で割った値)は2.9であった。
図に示すように、変異を含む単鎖(A1)と完全に相補的な単鎖(A2)の間には、鎖交換速度にあまり大きな差異がみられなかった。また、いずれの単鎖を用いた場合も、鎖交換速度はあまり高くなかった。この結果から、検出しようとする単鎖のGC含量や温度等の条件によっては、高感度でミスマッチ配列を検出できない場合もあり得ると考えられる。
PBS緩衝液中にテトラメチルアンモニウムクロリド(TMAC)を3Mになるように加え、他は参考例2と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図14に示す。また、変異を含む単鎖(A1)と完全に相補的な単鎖(A2)との速度比(A2の鎖交換速度定数をA1の鎖交換速度定数で割った値)は10.8であった。
図に示すように、参考例2の場合とは異なり、変異を含む単鎖(A1)と完全に相補的な単鎖(A2)の間には、鎖交換速度に大きな差異がみられた。また、鎖交換速度も大きく向上した。この結果から、参考例2の条件であっても、TMACを添加することにより、高感度でミスマッチ配列を検出できるようになると考えられる。
部分二重鎖型プローブF1/D1(FITC標識)と部分二重鎖型プローブT1/D1(TAMRA標識)とを作製し、3MのTMACを含むPBS緩衝液([Na+]=150mM,pH7.2)に、この2種類のプローブをそれぞれ12nMになるように加えた。この緩衝液に、M1、C1+M1、又はC1を60nM(C1+M1の場合は両単鎖の合わせた濃度が60nMになるようにした。)になるように添加し、室温条件下で、鎖交換反応を開始させた。反応開始から5分後に、プレートリーダーでFITCの蛍光強度とTAMRAの蛍光強度を同時に測定した。この操作を、各単鎖について4回、合計12回行った。12回の測定値を図15に示す。
図に示すように、M1を加えた場合にはTAMRAの蛍光は検出されたが、FITCの蛍光はほとんど検出されず、逆に、C1を加えた場合にはFITCの蛍光は検出されたが、TAMRAの蛍光はほとんど検出されなかった。このことは、M1を加えた場合には、T1/D1プローブの鎖交換は起きたが、F1/D1プローブの鎖交換はほとんど起きず、C1を加えた場合には、T1/D1プローブの鎖交換はほとんど起きなかったが、F1/D1プローブの鎖交換は起きた、ということを意味する。M1とT1、C1とF1がそれぞれ完全に相補的なので図15の結果は、T1/D1プローブ及びF1/D1プローブのいずれも、完全に相補的な単鎖を高い精度で識別していたことを示すものである。
以上のシトクロムP450遺伝子関連ODNの実験をABCトランスポーター遺伝子関連ODNについても行った。即ち、F1/D1プローブの代わりにF2/D2プローブを使用し、T1/D1プローブの代わりにT2/D2プローブを使用し、C1の代わりにA2を使用し、M1の代わりにA1を使用し、同様の実験を行った。この結果を図16に示す。図に示すように、シトクロムP450遺伝子関連ODNの場合と同様、部分二重鎖型プローブは完全に相補的な単鎖を高い精度で識別していた。
部分二重鎖型プローブとしてT3/D3を使用し、また、添加する単鎖を45A1又は45A2のとし、他は実施例4と同様に鎖交換反応を行った。
反応開始後の鎖交換率の経時的変化を図17に示す。また、反応開始から5分後、10分後、20分後の蛍光強度を表13に示す。更に、各単鎖の鎖交換速度の相対値を表14に示す。
Claims (3)
- 試料とする単鎖核酸分子と基準となる単鎖核酸分子間のミスマッチ配列を検出する方法であって、(a)基準となる単鎖核酸分子と相補的な単鎖核酸分子と、(b)(a)の単鎖核酸分子の一部分とハイブリダイズする1又は2の単鎖核酸分子とからなる部分二重鎖型核酸分子であって、当該部分二重鎖型核酸分子の単鎖構造をとっている領域が、当該試料とする単鎖核酸分子におけるミスマッチ配列の存在が予想される部位を含む領域と相補的である核酸分子を、当該試料とする単鎖核酸分子とハイブリダイゼーションが可能な条件で接触させる工程と、ミスマッチ配列のない場合は交換速度が速く、ミスマッチ配列のある場合は交換速度が遅くなることを利用して、ミスマッチ配列の有無を検出する工程とを含むことを特徴とするミスマッチ配列の検出方法。
- アミン類又は第四級アンモニウム塩の存在下で、部分二重鎖型核酸分子を試料とする核酸分子と接触させることを特徴とする請求項1記載のミスマッチ配列の検出方法。
- カチオン性高分子の存在下で、試料とする単鎖核酸分子を部分二重鎖核酸分子と接触させることを特徴とする請求項1又は2記載のミスマッチ配列の検出方法。
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