CN114113611A - 一种用于肝癌诊断的生物标志物及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了用于卵巢癌诊断的生物标志物及检测试剂盒。本发明提供的用于肝癌诊断的生物标志物为抗肿瘤相关抗原ZIC2、CDC37L1、PCNA、MAP3K14的自身抗体中的至少一种，该标志物在肝癌患者血清中的表达水平高于正常人，差异具有统计学意义。本发明还提供了一种用于肝癌诊断的试剂盒，该试剂盒含有用于检测上述生物标志物的试剂，该试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。本发明通过检测人血清中上述生物标志物的表达水平，可以有效区分肝癌患者和健康人，可用于肝癌的辅助诊断。

Description

一种用于肝癌诊断的生物标志物及检测试剂盒
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于肝癌诊断的生物标志物及检测试剂盒。
背景技术
肝细胞癌是全球肿瘤致死的第二大病因，而中国肝细胞癌的发病率和病死率均居世界之首。全球癌症流行病学统计数据显示，2020年全球新增90.5万肝细胞癌病例，有83.0万人因肝细胞癌而死亡，肝细胞癌死亡率居于恶性肿瘤2位。由于早期症状不具有特异性容易被忽视，而且现行临床使用的AFP诊断肝细胞癌灵敏度仅为60％，因而大部分肝细胞患者确诊时已经是中晚期。另外，由于目前对肝细胞癌的治疗手段非常有限，因此，患者的预后较差，其总的5年生存率不足12％。但是，与中晚期HCC不同的是，现有的治疗方法对早期肝细胞患者治疗的5年生存率可达90％以上。因此，探索肝细胞癌早期诊断的分子标记物，具有重要的潜在临床价值。
越来越多的研究证实肿瘤的发生发展过程中常常伴随着蛋白质的异常表达，这些异常表达且与肿瘤发生相关的蛋白质被称为肿瘤相关抗原(tumor associated antigens，TAAs)，它可以在癌症的早期阶段进入血液循环被免疫系统识别，从而诱发宿主免疫反应产生抗肿瘤相关抗原自身抗体(autoantibody against tumor associated antigen，TAAb)，抗-TAA自身抗体在癌症患者血液中可在患者的血液中存在较长时间，同时易于被检测以及检测过程对患者创伤性小，因此，采用抗-TAA自身抗体作为癌症早期诊断的标志物比肿瘤相关抗原更具备吸引力，为早期肿瘤标志物的研究带来了全新的途径。
目前关于能够用于肝癌诊断的自身抗体的研究相对较少，为了提高肝癌早期诊断的效率，提高肝癌患者的生存率，亟需筛选更多的能够用于肝癌诊断的血清学自身抗体标志物。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的之一是提供一种用于肝癌诊断的生物标志物，本发明的目的之二旨在提供一种用于检测上述生物标志物的试剂在制备用于肝癌诊断的产品中的应用，本发明的目的之三在于提供一种用于肝癌诊断的试剂盒。
基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种用于肝癌诊断的生物标志物，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体中的至少一种。抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体在肝癌患者血清中的表达水平均高于正常人，且差异具有统计学意义。
根据上述的生物标志物，优选地，抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体均为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中相应的抗肿瘤相关抗原自身抗体。
根据上述的生物标志物，优选地，抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体为受试者接受肿瘤治疗之前血清、血浆、组织间隙液或尿液中的抗肿瘤相关抗原自身抗体。更加优选地，所述肿瘤治疗为化疗、放疗或肿瘤手术切除。
根据上述的生物标志物，优选地，所述受试者为哺乳动物，更加优选地，所述受试者为灵长类哺乳动物；最优选地，所述受试者为人。
本发明第二方面提供了用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂在制备用于肝癌诊断的产品中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。
根据上述的应用，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。
根据上述的应用，优选地，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原或抗体。更加优选地，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原，所述抗原为ZIC2蛋白、CDC37L1蛋白、PCNA蛋白、MAP3K14蛋白中的至少一种。
根据上述的应用，优选地，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。
根据上述的应用，优选地，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体的组合；所述产品进行肝癌诊断时，预测肝癌的概率计算公式为：PRE＝1/(1+EXP(-(-4.797-3.048×ZIC2+7.097×PCNA +3.906×CDC37L1+5.807×MAP3K14)))，其中，PRE表示概率，ZIC2表示抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体的表达量，PCNA表示抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体的表达量，CDC37L1表示抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体的表达量，MAP3K14表示抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体的表达量；EXP表示以自然常数e为底的指数函数。
根据上述的应用，优选地，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。
本发明第三方面提供了一种用于肝癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。更加优选地，所述试剂盒通过抗原抗体反应对样本中的所述生物标志物进行检测。
根据上述的试剂盒，优选地，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体的组合；所述试剂盒预测肝癌的概率计算公式为：PRE＝1/(1+EXP(-(-4.797-3.048×ZIC2+7.097×PCNA+3.906×CDC37L1+5.807×MAP3K14)))，其中，PRE表示概率，ZIC2表示抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体的表达量，PCNA表示抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体的表达量，CDC37L1表示抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体的表达量，MAP3K14表示抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体的表达量；EXP表示以自然常数e为底的指数函数。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。更加优选地，所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的抗原；所述抗原为ZIC2蛋白、CDC37L1蛋白、PCNA蛋白、MAP3K14蛋白中的至少一种。
根据上述的试剂盒，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。
根据上述的试剂盒，优选地，所述ELISA检测试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
本发明中肿瘤相关抗原ZIC2、CDC37L1、PCNA、MAP3K14的基本信息为：
ZIC2为ZIC家族成员2，作为转录激活因子或抑制因子。CDC37L1为细胞周期分裂周期蛋白，与多种蛋白质结合并促进它们与Hsp70和Hsp90相互作用的共伴侣。PCNA为增殖细胞核抗原，与DNA损伤、DNA 修复、DNA复制有关。MAP3K14为丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶14，有促进NFKB2/P100的蛋白水解加工，从而通过非经典途径激活NF-kappa-B，可以以受体选择性方式起作用功能。在NCBI中ZIC2蛋白的序列号为NP_009060.2；CDC37L1蛋白的序列号为NP_060383.2；PCNA蛋白的序列号为NP_872590.1；MAP3K14蛋白的序列号为NP_003945.2。
本发明中记载的肝癌均为肝细胞癌。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
(1)本发明首次发现抗肿瘤相关抗原ZIC2、CDC37L1、PCNA、MAP3K14的自身抗体在肝癌患者血清中的表达水平均显著高于正常人，且差异具有统计学意义，通过检测人血清中抗肿瘤相关抗原ZIC2、CDC37L1、PCNA、MAP3K14的自身抗体的表达水平，可以有效诊断区分肝癌和正常人；经验证，本发明单独采用抗肿瘤相关抗原ZIC2、CDC37L1、PCNA、MAP3K14的自身抗体中任意一个标志物诊断区分肝癌和正常人时，其ROC曲线的AUC值均在0.70以上；多个标志物联合使用时，ROC曲线的AUC值比单个指标更接近于1，区分效果好，诊断效果好。因此，本发明用于肝癌诊断的标志物可用于肝癌的辅助诊断。
(2)本发明将抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体这四种标志物作为一个组合用于诊断区分肝癌和正常人时，其ROC曲线的AUC为0.776，检测灵敏度高达72.5％(即肝癌患者中应用这四个标志物进行诊断时被正确的诊断为肝癌的比率为72.5％)，特异度达到了71.9％(即健康对照中应用这四个标志物进行诊断时确定为健康者的比率为71.9％)。因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了肝癌的检出率，有利于肝癌早期发现，从而大大降低了肝癌患者的死亡率，为肝癌患者和家庭带来极大的福祉。
(3)本发明将抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体这四种标志物联合构建了一个诊断模型，该诊断模型能够有效区分肝癌VS正常人、肝癌VS肝硬化、早期肝癌VS正常人、早期肝癌和肝硬化，可以用于肝癌的辅助诊断。
(4)本发明的试剂盒通过间接ELISA的方法检测人血清中抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体的表达水平，可以较准确地将肝癌患者和健康对照诊断区分开来，为临床医生对肝癌的诊断提供了新的参考依据。
(5)本发明的试剂盒的检测样本为血清，可避免侵入性诊断，通过微创方式取血清检测即可获得肝癌的患病风险，需血量少，被检测人员痛苦小、依从性高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。
附图说明
图1为ELISA检测四种抗肿瘤相关抗原自身抗体在肝癌组、肝硬化组和正常对照组中的表达水平结果图；其中，NC表示正常对照组，HCC表示肝癌组；LC表示肝硬化组；
图2为训练集中不同抗肿瘤相关抗原自身抗体诊断区分肝癌患者和正常人的ROC曲线图；
图3为训练集中不同抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分肝癌患者和正常人的ROC曲线图；
图4为训练集、验证集中四种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分肝癌患者和正常人的ROC曲线图；
图5为四种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分早期肝细胞癌患者和正常人的ROC曲线图；
图6为四种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分肝癌和肝硬化、早期肝癌和肝硬化的ROC曲线图。
具体实施方式
以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：采用人类蛋白质组芯片筛选用于肝癌诊断的标志物
1、实验样本：
收集来自河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库的30例肝癌患者血清(肝癌组)和24例正常人血清(正常对照组)；其中，30例肝癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的肝癌患者；24例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无自身免疫性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，30例肝癌患者和24例健康受试者在性别之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。
将30例肝癌患者血清中每3例血清混合为1例混合肝癌血清样本，共得到10例混合肝癌血清样本；将21例正常人血清中每3例混合为1例混合正常血清样本，共得到7例混合正常血清样本。
血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5ml放于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于离心机中，设定为4℃，3000rpm离心10min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5ml的EP管中，在EP管的顶部和侧面均标记样本编号，放于-80℃冰箱进行冷冻保存，记录采血日期以及储存位置。在使用之前，取出血清放于4℃冰箱解冻并分装，避免反复冻融血清。
2、人类蛋白质组芯片检测
使用HuProt TM人类蛋白质组芯片检测10例混合肝癌血清样本，7例混合正常血清样本和3例正常人血清样本中自身抗体的表达水平。每张芯片可以同时检测14个血清样本，固定在芯片上的蛋白与血清中的特异性自身抗体相互作用以结合。
(1)实验方法：
1)复温：将HuProtTM人类蛋白质组芯片从-80℃冰箱中取出，放置4℃冰箱复温30min，随后室温继续复温15min；
2)封闭：将已复温的芯片正面朝上置于芯片孵育盒中，并加入10mL封闭液(3ml10％BSA，加入7ml 1×PBS溶液)，放置于侧摆摇床中，50-60rpm，室温封闭1h；
3)血清样本孵育：封闭完成后，弃去封闭液，迅速加入预先稀释好的血清孵育液(用稀释液将血清样本按1:200的比例进行稀释，得到稀释后的血清孵育液，稀释液的成分组成为：1ml 10％BSA加入9ml 1×PBST溶液中制备而成)，放置于侧摆摇床中，20rpm，4℃过夜孵育；
4)清洗：待孵育完成后，取出芯片放置于含有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min；
5)二抗孵育：待清洗结束后，将芯片转移至孵育盒中，并加入按1：1000比例稀释的二抗孵育液(二抗为荧光标记的抗人IgM、IgG抗体，稀释液成分组成为：1gBSA，100ml 1×PBST溶液，将二抗用稀释液按1：1000比例进行稀释得到二抗孵育液)3mL，置于侧摆摇床40rpm，避光，室温孵育1h；
6)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于芯片清洗盒，并加入芯片清洗液(1×PBST溶液)，放置水平摇床上，80rpm，清洗3次，每次10min。完成后用ddH2O重复清洗2次，每次10min；
7)干燥：待清洗完成后，将芯片放置于芯片干燥机进行离心干燥；
8)扫描：按照扫描仪的使用说明对干燥后的芯片进行规范性荧光扫描并记录荧光信号(荧光信号的强弱与相应抗体的亲和力以及数量具有正相关关系)；
9)数据提取：打开对应的GAL文件，将GAL文件上的每个阵列与芯片图像整体对齐后，点击自动对齐按钮，提取数据并保存为GPR。
(2)数据处理：
F532 Median是指在532nm通道下的信号点前景值的中位数，B532 Median是指在532nm通道下的信号点背景值的中位数。为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理，即定义信噪比(signal-noise ratio，SNR)＝F532 Median/B532 Median，按照SNR的计算公式进行计算，分别得到10例混合肝癌血清样本、7例混合正常血清样本和3例正常血清样本的SNR值，然后对血清样本的SNR值进行中位值线性归一化处理。对于任意一个自身抗体，计算肝癌癌症组与正常对照组的差异倍数(差异倍数＝肝癌组中位值线性归一化后的SNR均值/正常对照组中位值线性归一化后的SNR均值)，用以表示肝癌组高于正常对照组的程度，进一步设置筛选条件：差异倍数>2、灵敏度≥60％、特异度＝100％，从中筛选出符合条件的抗肿瘤相关抗原自身抗体。
(3)实验结果：
经过筛选，最终筛选出了4种抗肿瘤相关抗原自身抗体，分别为抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体；其中，抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体的差异倍数为1.30，灵敏度为66.9％，特异度为66.7％；抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体的差异倍数为1.39，灵敏度为64.6％，特异度为71.3％；抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体的差异倍数为1.18，灵敏度为53.4％，特异度为78.7％；抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体的差异倍数为1.45，灵敏度为59.6％，特异度为74.7％。
而且，抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体在肝癌组血清中的表达水平均高于健康对照组，且差异具有统计学意义。
实施例2：ELISA检测抗肿瘤相关抗原ZIC2、CDC37L1、PCNA、MAP3K14的自身抗体的血清表达水平
采用间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)进一步在大样本人群血清中检测实施例1筛选出的四种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平。
1、实验样本：
本研究纳入的296例肝细胞癌患者(肝癌组)、296例肝硬化患者(肝硬化组)和296例正常对照血清(正常对照组)样本均来源于河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库。296例肝细胞癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的肝细胞癌患者，其中有91例肝细胞癌患者处于早期阶段(BCLC 0-B期)；296例肝硬化患者血清来源于河南省肿瘤流行病学实验室；296例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，296例肝细胞癌患者、296例肝硬化患者和296例健康受试者在性别和年龄之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。
血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5ml放于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于离心机中，设定为4℃，3000rpm离心10min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5ml的EP管中，在EP管的顶部和侧面均标记样本编号，放于-80℃冰箱进行冷冻保存，记录采血日期以及储存位置。在使用之前，取出血清放于4℃冰箱解冻并分装，避免反复冻融血清。
2、实验材料及试剂：
(1)4种肿瘤相关抗原蛋白：ZIC2重组蛋白、CDC37L1重组蛋白、PCNA重组蛋白、MAP3K14重组蛋白购买于武汉云克隆科技股份有限公司；
(2)96孔酶标板(8行×12列)；
(3)包被液：含0.15％碳酸钠(Na2 CO3)和0.29％碳酸氢钠(NaHCO3)的水溶液；
(4)封闭液：含2％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的0.2％(v/v)吐温20的PBST缓冲液；
(5)血清样本稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；
(6)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶(HRP)标记小鼠抗人免疫球蛋白抗体(以下简称HRP标记小鼠抗人IgG抗体)；
(7)抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；
(8)洗涤液：含0.2％(v/v)吐温20的PBST缓冲液；
(9)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为20％四甲基联苯胺二盐酸的水溶液，显色液B：3.7％Na2HPO4·12H2O，0.92％柠檬酸，0.75％过氧化氢脲素的水溶液)；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，现用现配；
(10)终止液：10％的硫酸。
3、实验方法：
(1)制备4种肿瘤相关抗原包被的酶标板：
分别制备肿瘤相关抗原ZIC2包被的酶标板、肿瘤相关抗原CDC37L1包被的酶标板、肿瘤相关抗原PCNA包被的酶标板和肿瘤相关抗原MAP3K14包被的酶标板。
以制备肿瘤相关抗原ZIC2包被的酶标板为例，其具体操作步骤如下：
1)制备肿瘤相关抗原ZIC2蛋白溶液：将ZIC2蛋白采用包被液配制成浓度为0.125μg/mL的ZIC2蛋白溶液。
2)包被酶标板：将步骤1)制备的ZIC2蛋白溶液加入到96孔酶标板的每个反应孔中，加样量为50μL/孔，在4℃下包被过夜，然后将剩余的包被液甩出并拍干。
3)封闭：向包被后的96孔酶标板的反应孔中加入封闭液，加样量为100μL/孔，在37℃水浴中封闭2h，然后去除封闭液，用洗涤液洗涤(加样量为300μl/孔)3次并拍干，得到肿瘤相关抗原ZIC2包被的酶标板。
肿瘤相关抗原CDC37L1包被的酶标板、肿瘤相关抗原PCNA包被的酶标板和肿瘤相关抗原MAP3K14包被的酶标板制备的操作步骤与肿瘤相关抗原ZIC2包被的酶标板基本相同，其包被的浓度也相同。其不同之处在于：步骤1)采用的肿瘤相关抗原不同。其中，制备肿瘤相关抗原CDC37L1包被的酶标板时，步骤1)中采用的肿瘤相关抗原为CDC37L1重组蛋白；制备肿瘤相关抗原PCNA包被的酶标板时，步骤1)中采用的肿瘤相关抗原为PCNA重组蛋白；制备肿瘤相关抗原MAP3K14包被的酶标板时，步骤1)中采用的肿瘤相关抗原为MAP3K14重组蛋白。
(2)血清样本中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体表达水平的检测：
同一血清样本，分别采用上述制备的4种肿瘤相关抗原包被的酶标板通过ELISA方法检测血清样本中抗肿瘤相关抗原ZIC2、CDC37L1、PCNA、MAP3K14的自身抗体表达水平。
以检测抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体表达水平为例，其具体操作步骤如下：
1)血清样本孵育：
将待检测的血清样本用血清样本稀释液按体积比1:100的比例进行稀释。将稀释后的血清样本加入上述步骤(1)制备的已包被ZIC2蛋白的96孔酶标板第1～11列的反应孔中，加样量为50μl/孔；在已包被ZIC2蛋白的96孔酶标板的第12列的第1-5反应孔加入按照1:100稀释的质控血清，加样量为50μl/孔，质控血清是作为质控，以进行不同酶标板之间的标化；在已包被ZIC2蛋白的96孔酶标板第12列的第6-8反应孔加入不含血清的抗体稀释液(加样量为50μl/孔)作为空白对照；然后将96孔酶标置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液(加样量为300μl/孔)洗涤5次并拍干。
2)二抗孵育：
将HRP标记小鼠抗人IgG抗体用抗体稀释液按1:5000(v/v)的比例进行稀释，然后将稀释后的HRP标记小鼠抗人IgG抗体加入96孔酶标板对应的反应孔中，加样量为50μl/孔，置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤(加样量为300μl/孔)5次并拍干。
3)显色及终止反应：
将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为50μl/孔，室温避光显色反应5-15min，然后向每个反应孔中再加入25μl终止液，终止显色反应；使用酶标仪分别读取其在450nm和620nm波长处的吸光度OD450、OD620，其中，620nm波长的吸光度OD620为背景值，以OD450与OD620的差值作为检测的吸光度值最终结果。
检测血清样本中抗肿瘤相关抗原CDC37L1、PCNA、MAP3K14的自身抗体表达水平的具体操作步骤与上述检测抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体基本相同，其不同之处在于：步骤1)中，检测时采用的酶标板分别为肿瘤相关抗原CDC37L1蛋白包被的酶标板、肿瘤相关抗原PCNA蛋白包被的酶标板、肿瘤相关抗原MAP3K14蛋白包被的酶标板；步骤2)中，对于包被肿瘤相关抗原CDC37L1的反应孔，加入的HRP标记小鼠抗人IgG抗体按体积比1:10000的比例进行稀释；对于包被肿瘤相关抗原PCNA的反应孔，加入的HRP标记小鼠抗人IgG抗体按体积比1:5000的比例进行稀释；对于包被肿瘤相关抗原MAP3K14的反应孔，加入的HRP标记小鼠抗人IgG抗体按体积比1:10000的比例进行稀释。
4、数据处理
对肝癌组、肝硬化组和正常对照组血清样本的吸光度值进行Kolmogorov-Smirnova检验，结果发现，研究对象血清样本中4种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平不符合正态分布(P<0.05)，因此采用第25百分位数(P25)、中位数(P50)以及第75百分位数(P75)来描述4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体的表达水平分布；然后采用非参数检验(Mann-Whitney U)比较肝癌组、肝硬化组和正常对照组中自身抗体的表达水平是否有差异。
5、实验结果
肝癌组、肝硬化组和正常对照组血清样本中4种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平分布如图1所示。由图1可知，抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体在肝癌，肝硬化和正常三组之间均居于差异，而且差异具有统计学意义(P<0.05)。由此说明，这4中肿瘤相关抗原的自身抗体对于肝癌的发生有预警作用。同时也说明4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体可以用于肝癌的辅助诊断。
实施例3：4种抗肿瘤相关抗原自身抗体用于肝癌诊断的能力评估
将实施例2中纳入的296例肝细胞癌患者和296例正常对照血清按6:4的比例随机分为训练集和验证集；其中，训练集中肝细胞癌患者176例(记作肝癌组)，正常对照176例(记作正常对照组)；验证集中肝细胞癌患者120例，正常对照120例。
根据实施例2采用ELISA检测到的训练集中各血清样本中抗肿瘤相关抗原ZIC2、CDC37L1、PCNA、MAP3K14自身抗体的表达水平结果，采用GraphPad Prism 8.0分别绘制单一抗肿瘤相关抗原自身抗体、多种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分肝癌和正常对照的ROC曲线，分析四种抗肿瘤相关抗原自身抗体用于肝癌诊断的价值。
1、单一抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断区分肝癌患者和正常人的能力：
基于训练集中176例肝癌患者和176例正常对照血清样本中抗肿瘤相关抗原ZIC2的自身抗体(记作抗ZIC2自身抗体)、抗肿瘤相关抗原CDC37L1的自身抗体(记作抗CDC37L1自身抗体)、抗肿瘤相关抗原PCNA的自身抗体(记作抗PCNA自身抗体)和抗肿瘤相关抗原MAP3K14的自身抗体(记作抗MAP3K14自身抗体)的表达水平，绘制每一种抗肿瘤相关抗原自身抗体的ROC曲线，通过ROC曲线来评估每一种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独诊断区分肝癌患者和正常人的能力。
抗ZIC2自身抗体、抗CDC37L1自身抗体、抗CDC37L1自身抗体和抗PCNA自身抗体诊断区分肝癌患者和正常人的ROC曲线如图2所示。根据ROC曲线，以约登指数最大的OD值为截断值，同时计算相应的AUC以及95％置信区间、灵敏度和特异度。
由图2可知，4种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独用于诊断区分肝癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC均能达到0.7以上；其中，抗MAP3K14自身抗体具有最高的诊断价值，AUC为0.735，灵敏度和特异度分别为59.6％和74.7％。由此说明4种抗肿瘤相关抗原自身抗体均可以用于肝癌的辅助诊断。
2、两种抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断区分肝癌患者和正常人的能力：
以训练集中176例肝癌患者和176例正常对照血清样本中抗CDC37L1自身抗体和抗MAP3K14自身抗体的表达量作为自变量，是否为肝癌事件作为因变量，对抗CDC37L1自身抗体和抗MAP3K14自身抗体在肝癌组和正常对照组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分肝癌患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝HCC)＝1/(1+EXP(-(-2.949+5.130×CDC37L1+9.472×MAP3K14)))，该诊断模型中：EXP表示以自然常数e为底的指数函数；PRE表示预测概率，CDC37L1表示抗CDC37L1自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)，MAP3K14表示抗MAP3K14自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)。再将各血清样本中抗CDC37L1自身抗体和抗MAP3K14自身抗体的表达量代入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图3中A所示。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的PRE值为诊断区分肝癌患者和正常人的最佳截断值，并计算灵敏度和特异度。
由图3中A可知，抗CDC37L1自身抗体和抗MAP3K14自身抗体组合诊断区分肝癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.754，最佳截断值为0.533，对应的灵敏度为59.6％，特异度为74.7％。
3、三种抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断区分肝癌患者和正常人的能力：
以训练集中176例肝癌患者和176例正常对照血清样本中抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体和抗PCNA自身抗体的表达量作为自变量，是否为肝癌事件作为因变量，对抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体和抗PCNA自身抗体在肝癌组和正常对照组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分肝癌患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝HCC)＝1/(1+EXP(-(-4.534+3.928×CDC37L1+7.604×MAP3K14+8.161*PC NA)))，该诊断模型中：PRE表示预测概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数；CDC37L1表示抗CDC37L1自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)，MAP3K14表示抗MAP3K14自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)，PCNA表示抗PCNA自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)。再将各血清样本中抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体和抗PCNA自身抗体的表达量代入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图3中B所示。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的PRE值为诊断区分肝癌患者和正常人的最佳截断值，并计算灵敏度和特异度。
由图3中B可知，抗CDC37L1自身抗体，抗MAP3K14自身抗体和抗PCNA自身抗体组合诊断区分肝癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.764，最佳截断值为0.488，对应的灵敏度为69.7％，特异度为71.3％。
4、四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断区分肝癌患者和正常人的能力：
以训练集中176例肝癌患者和176例正常对照血清样本中抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和抗ZIC2自身抗体的表达量作为自变量，是否为肝癌事件作为因变量，对抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和抗ZIC2自身抗体在肝癌组和正常对照组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分肝癌患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝HCC)＝1/(1+EXP(-(-4.797-3.048×ZIC2+7.097×PCNA+3.906×CDC37L1+5.807×MAP3K14)))，该诊断模型中：PRE表示预测概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数；CDC37L1表示抗CDC37L1自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)，MAP3K14表示抗MAP3K14自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)，PCNA表示抗PCNA自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)，ZIC2表示抗ZIC2自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)。再将各血清样本中抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和ZIC2自身抗体的表达量代入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图4中A所示。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的PRE值为诊断区分肝癌患者和正常人的最佳截断值，并计算灵敏度和特异度。
由图4中A可知，抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和ZIC自身抗体组合诊断区分肝癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.776，最佳截断值为0.475，对应的灵敏度为72.5％，特异度为71.9％。
为了便于对比，将上述单个抗肿瘤相关抗原自身抗体或多个抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分肺癌和正常对照的ROC曲线AUC、灵敏度、特异度、约登指数和截断值进行统计，结果如表1所示。
表1训练集中四种抗肿瘤相关抗原自身抗体诊断区分肝癌患者和正常人的评价结果
Figure BDA0003407337540000151
Figure BDA0003407337540000161
由表1可知，与单一抗肿瘤相关抗原自身抗体相比，两种、三种或四种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分肝癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC均能达到0.75以上，明显高于单一抗肿瘤相关抗原自身抗体；当四种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分肝癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC达到了最大为0.776；而且，随着组合中抗肿瘤相关抗原自身抗体数目的增加，肝癌的诊断灵敏度逐渐增大，当四种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分肝癌患者和正常人时，其诊断的灵敏度为72.5％，此时，诊断的特异度达到71.9％，由此说明四种抗肿瘤相关抗原自身抗体联合诊断效果最佳。
5、采用验证集验证四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断肝癌的价值
将验证集中120例肝癌患者和120例正常对照血清样本中抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和抗ZIC2自身抗体的表达量代入上述构建的诊断模型PRE(P＝HCC)＝1/(1+EXP(-(-4.797-3.048×ZIC2+7.097×PCNA+3.906×CDC37L1+5.807×MAP3K14)))中，即可得到各个血清样本的预测概率，根据预测概率绘制ROC曲线(如图4中B所示)，验证四种自身抗体组合诊断肝癌的价值。以约登指数最大时对应的PRE值为最佳截断值，并计算对应的灵敏度和特异度。
由图4中B可知，验证集中抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和ZIC自身抗体组合诊断区分肝癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.78，与训练集基本一致；而且，灵敏度达到了71.2％，特异度达到了71.2％。
这也再次证明抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和抗ZIC2自身抗体组合能够用于肝癌的诊断。而且，采用诊断模型PRE(P＝HCC)＝1/(1+EXP(-(-4.797-3.048×ZIC2+7.097×PCNA+3.906×CDC37L1+5.807×MAP3K14)))进行肝癌诊断时，将受试者的抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和抗ZIC2自身抗体检测结果带入上述诊断模型中，计算受试者的PRE值，若PRE值大于等于最佳截断值，则初步判定受试者为肝癌患者，后续可以再进行其它检查手段再进一步排查，若PRE值小于最佳截断值，则初步判定受试者为非肝癌患者。
实施例4：四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断区分早期肝癌和正常人的能力评估：
1、实验样本：
将实施例2中纳入的296例肝细胞癌患者中91例早期肝细胞癌患者(巴塞罗那分期BCLC 0-B期)血清作为早期肝癌组；将实施例2中纳入的296例正常对照血清中与91例早期肝细胞癌患者性别、年龄相匹配的91例正常对照血清作为正常对照组。
2、四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断区分早期肝癌和正常人的能力评估
将早期肝癌组和正常对照组血清样本中抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和抗ZIC2自身抗体的表达量代入上述构建的诊断模型PRE(P＝HCC)＝1/(1+EXP(-(-4.797-3.048×ZIC2+7.097×PCNA+3.906×CDC37L1+5.807×MAP3K14)))中，即可得到各个血清样本的预测概率，根据预测概率绘制ROC曲线(如图5所示)，评估四种自身抗体组合诊断区分早期肝癌患者和正常人的价值。以约登指数最大时对应的预测概率为最佳截断值PRE＝0.479，并计算对应的灵敏度和特异度。
由图5可知，抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和ZIC自身抗体组合诊断区分早期肝癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.836，而且，灵敏度达到了82.4％，特异度达到了72.3％。由此说明，抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和ZIC自身抗体的组合能够用于诊断区分早期肝癌和正常人。
实施例5：四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断区分肝癌和肝硬化的能力评估：
肝硬化被认为是肝癌的癌前病变。因此我们进一部分了该模型区分肝硬化和肝癌的能力。
1、实验样本：
将实施例2中纳入的296例肝细胞癌患者血清作为肝癌组；将实施例2中纳入的296例肝硬化患者血清作为肝硬化组。
2、四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断区分肝癌和肝硬化的能力评估
将肝癌组和肝硬化组血清样本中抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和抗ZIC2自身抗体的表达量代入上述构建的诊断模型PRE(P＝HCC)＝1/(1+EXP(-(-4.797-3.048×ZIC2+7.097×PCNA+3.906×CDC37L1+5.807×MAP3K14)))中，即可得到各个血清样本的预测概率，根据预测概率绘制ROC曲线(如图6中A所示)，评估四种自身抗体组合诊断区分肝癌和肝硬化的价值。以约登指数最大时对应的预测概率为最佳截断值PRE＝0.629，并计算对应的灵敏度和特异度。
由图6中A可知，抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和ZIC自身抗体组合诊断区分肝癌患者和肝硬化患者的ROC曲线下面积AUC为0.619，而且，灵敏度达到了50.7％，特异度达到了67.8％。由此说明，抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和ZIC自身抗体的组合能够用于诊断区分肝癌和肝硬化患者。
实施例6：四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断区分早期肝癌和正常人的能力评估：
1、实验样本：
将实施例2中纳入的296例肝细胞癌患者中91例早期肝细胞癌患者(巴塞罗那分期BCLC 0-B期)血清作为早期肝癌组；将实施例2中纳入的296例肝硬化患者血清中与91例早期肝细胞癌患者性别、年龄相匹配的91例肝硬化患者血清作为肝硬化组。
2、四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断区分早期肝癌和正常人的能力评估
将早期肝癌组和肝硬化组血清样本中抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和抗ZIC2自身抗体的表达量代入上述构建的诊断模型PRE(P＝HCC)＝1/(1+EXP(-(-4.797-3.048×ZIC2+7.097×PCNA+3.906×CDC37L1+5.807×MAP3K14)))中，即可得到各个血清样本的预测概率，根据预测概率绘制ROC曲线(如图6中B所示)，评估四种自身抗体组合诊断区分早期肝癌患者和肝硬化的价值。以约登指数最大时对应的预测概率为最佳截断值PRE＝0.614，并计算对应的灵敏度和特异度。
由图6中B可知，抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和ZIC自身抗体组合诊断区分早期肝癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.689，而且，灵敏度达到了68.1％，特异度达到了64.2％。由此说明，抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和ZIC自身抗体的组合能够用于诊断区分早期肝癌和肝硬化。
综上所述，本发明中抗CDC37L1自身抗体、抗MAP3K14自身抗体、抗PCNA自身抗体和ZIC自身抗体的组合能够用于有效区分肝癌与肝硬化、健康对照，可以用于肝癌的辅助诊断。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种用于肝癌诊断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体中的至少一种。
2.用于检测权利要求1所述生物标志物的试剂在制备用于肝癌诊断的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原或抗体。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体的组合；所述产品进行肝癌诊断时，预测肝癌的概率计算公式为：
PRE=1/(1+EXP(−(−4.797-3.048 × ZIC 2 + 7.097 × PCNA + 3.906 × CDC37L1 +5.807 × MAP3K14)))，其中，PRE表示概率，ZIC2表示抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体的表达量，PCNA表示抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体的表达量，CDC37L1表示抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体的表达量，MAP3K14表示抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体的表达量。
7.根据权利要求2-6任一所述的应用，其特征在于，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。
8.一种用于肝癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测权利要求1所述生物标志物的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体、抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体、抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体的组合；所述试剂盒预测肝癌的概率计算公式为：
PRE=1/(1+EXP(−(−4.797-3.048 × ZIC2 + 7.097 × PCNA + 3.906 × CDC37L1 +5.807 × MAP3K14)))，其中，PRE表示概率，ZIC2表示抗肿瘤相关抗原ZIC2自身抗体的表达量，PCNA表示抗肿瘤相关抗原PCNA自身抗体的表达量，CDC37L1表示抗肿瘤相关抗原CDC37L1自身抗体的表达量，MAP3K14表示抗肿瘤相关抗原MAP3K14自身抗体的表达量。
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