CN105025932A - 癌疫苗及使用其的治疗方法 - Google Patents

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Abstract

公开的是疫苗组合物，其包含编码一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)、酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)、黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)、生长激素释放激素(GHRH)、MART-1/melan-A抗原、癌睾丸抗原NY-ESO-1、癌睾丸抗原NY-ESO-2、在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)、维尔姆斯肿瘤1(WT-1)以及人端粒酶逆转录酶(hTERT)的氨基酸序列。该疫苗组合物可进一步包含编码一种或多种其他抗原的核酸，包括前列腺特异性抗原(PSA)。还公开了预防或治疗有此需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用包含特定数量的癌抗原的疫苗组合物以治疗或预防特定癌症。

Description

癌疫苗及使用其的治疗方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月15日提交的的优先权美国临时专利申请No.61/799,952的优先权，其全部内容在此通过引用并入。
技术领域
本文中公开了用于治疗癌症的组合物和方法，且特别地是治疗并提供抵御肿瘤生长的保护的疫苗。
背景
癌症是全世界死亡的主要原因之一，并且在美国是第二常见的死亡原因，每4例死亡中几乎占据1例。癌症产生于已从正常细胞转化成肿瘤细胞的单个细胞。这样的转化通常是多阶段过程，从癌变前损伤进展至恶性肿瘤。多个因素促成该进展，包括衰老、遗传贡献和对外部试剂诸如物理致癌物(例如，紫外辐射和电离辐射)、化学致癌物(例如，石棉、烟草烟的组分等)和生物致癌物(例如，某些病毒、细菌和寄生虫)的暴露。
癌症的预防、诊断和治疗可采取许多不同的形式。预防可包括筛选诱病因素(例如，特定基因变体)、改变行为(例如，吸烟、饮食和身体活动量)和抗病毒(例如，人乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒)疫苗接种。治疗可包括化学疗法、放射疗法和肿瘤或癌组织的手术切除。尽管可获得许多预防和治疗方法，但此类方法在有效地预防和/或治疗当前的癌症中通常达到有限的成功。
因此，存在对用于预防和/或治疗癌症以促进抵御疾病和疾病进展的保护作用的临床管理的组合物和方法的鉴定和开发的需要。此外，需要更有效的治疗来延缓疾病进展和/或减少患有癌症的受试者的死亡率。
发明概述
本发明涉及包含不再是自身抗原并且刺激针对特定癌症或与特定癌症相关的肿瘤的免疫应答的一种或多种核酸或氨基酸序列的疫苗。疫苗还可包含阻止免疫系统中的任何组分诸如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、或用于免疫细胞增殖和/或分化的任何细胞因子、趋化因子或信号转导的抑制的免疫检查点抑制剂，诸如抗-PD-1和抗-PDL-1抗体。疫苗的一种或多种癌抗原可以是编码一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与酪氨酸酶(Tyr)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)的氨基酸序列；与酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与MART-1/melan-A抗原(MART-1/Melan-A)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与癌睾丸抗原(NY-ESO-1)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与癌睾丸抗原II(NY-ESO-2)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与PRAME的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与WT1的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与hTERT的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；或其组合。疫苗还可包含编码一种或多种选自由以下组成的组的抗原的核酸：PSA、PSMA、STEAP、PSCA、MAGEA1、gp100、病毒抗原及其组合。
本发明进一步涉及用于预防或治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用用于治疗或预防特定癌症的包含特定数量的癌抗原疫苗。所述方法可以包括向有此需要的受试者施用包含CMV癌抗原的疫苗以治疗或预防成胶质细胞瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的CMV癌抗原的疫苗以治疗或预防成胶质细胞瘤；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原PSA、PSMA或STEAP的疫苗以治疗或预防前列腺癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的PSA、PSMA或STEAP的疫苗以治疗或预防前列腺癌；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV 16 E6或HPV 16 E7的疫苗以治疗或预防头颈癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合HPV 16 E6或HPV 16 E7的疫苗以治疗或预防头颈癌；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV6、HPV 11或HPV 16的疫苗以治疗或预防肛门癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HPV 6、HPV 11或HPV 16的疫苗以治疗或预防肛门癌；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCV NS34A、HCV NS5A、HCV NS5B或HCVNS4B的疫苗以治疗或预防肝癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCV NS34A、HCV NS5A、HCVNS5B或HCV NS4B的疫苗以治疗或预防肝癌；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV 16 E6/E7或HPV 18 E6/E7的疫苗以治疗或预防子宫颈癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HPV16 E6/E7或HPV 18 E6/E7的疫苗以治疗或预防子宫颈癌；或向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原PRAME、WT-1或hTERT的疫苗以治疗或预防血癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原NY-ESO-1或MAGE-A1中的任一种或多种的PRAME、WT-1或hTERT的疫苗以治疗或预防血癌，其中所述方法可进一步包括将(a)-(i)的施用步骤与选自由抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及其组合组成的组的免疫检查点抑制剂组合。
附图简述
图1A-E显示pTyr的构建体。
图2A和2B分别显示免疫策略和通过Tyr DNA接种进行的细胞介导的免疫应答的诱导。
图3显示对照小鼠和免疫的小鼠的流式荧光激活细胞分选(FACS)。
图4A和4B显示免疫的小鼠的酪氨酸酶-特异性抗体的诱导。
图5A和5B分别显示在对照小鼠和免疫的小鼠中进行肿瘤攻击后的卡普兰-迈耶存活曲线和肿瘤体积曲线。
图6A和6B显示免疫的小鼠和未免疫的小鼠中的MDSC细胞群体。
图7显示利用pVax1和pTyr免疫的小鼠中的MDSC的染色。
图8A和8b显示通过MDSC的MCP-1分泌。
图9显示指示的生物体间Tyr核苷酸序列的系统发育关系。
图10显示(A)举例说明pPRAME(在本文中也称为pGX1411)的质粒图谱的示意图；(B)利用DAPI对RD和293T细胞的细胞核的染色和共有PRAME抗原的染色；和(C)来自非转染细胞(“对照”)、利用pVAX(“pVAX”)转染的细胞和利用pPRAME(“PRAME-pVAX”)转染的细胞的裂解物中的共有PRAME抗原的免疫印迹。
图11在(A)和(B)中显示标绘小鼠的组对比针对干扰素γ(IFN-γ)的斑形成单位(SFU)/106个脾细胞的图。
图12显示(A)举例说明pNY-ESO-1(在本文中也称为pGX1409)的质粒图谱的示意图；(B)利用DAPI对细胞的细胞核的染色和共有NY-ESO-1抗原的染色；和(C)来自非转染细胞(“对照”)、利用pVAX(“pVAX”)转染的细胞和利用pNY-ESO-1(“pNY-ESO-1”)转染的细胞的RD和293T裂解物中的共有NY-ESO-1抗原的免疫印迹。
图13显示标绘小鼠的组对比针对干扰素γ(IFN-γ)的斑形成单位(SFU)/106个脾细胞的图。
图14显示标绘小鼠的组对比针对干扰素γ(IFN-γ)的斑形成单位(SFU)/106个脾细胞的图。
图15显示举例说明各种具有一些它们的相关癌抗原的癌症的示意图。
详述
本发明涉及可被定制用于特定癌症和肿瘤的疫苗。待用于疫苗的特定癌症相关抗原诸如酪氨酸酶(Tyr)(在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME))、酪氨酸酶相关蛋白1(Tyrp1)、癌睾丸抗原(NY-ESO-1)、乙型肝炎病毒抗原和维尔姆斯肿瘤1抗原(WT-1)的抗原共有序列已被设计用来允许定制的疫苗预防或治疗特定癌症。例如，酪氨酸酶抗原可被用于疫苗来预防或治疗黑色素瘤的疫苗。本发明的疫苗可提供用于需要治疗的受试者的癌症的特定预防或治疗的特定癌抗原的任意组合。
设计重组癌抗原的核酸及其编码的氨基酸序列的一个方式是通过引入改变天然癌抗原的完整氨基酸序列中的特定氨基酸的突变。突变的引入不会太多地改变癌抗原(以至其不能被普遍地跨哺乳动物受试者(优选地人或狗受试者)施用)，但使其改变得足以使所得氨基酸序列打破耐受性或被当作外源抗原以产生免疫应答。另一方式可以是生成与其相应的天然癌抗原具有至少85％和高达99％的氨基酸序列同一性、优选至少90％和高达98％的序列同一性、更优选至少93％和高达98％的序列同一性或甚至更优选至少95％和高达98％的序列同一性的共有重组癌抗原。在某些情况下，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。所述天然癌抗原是通常与特定癌症或癌症肿瘤相关的抗原。取决于癌抗原，癌抗原的共有序列可跨哺乳动物物种或在种的亚型内或跨病毒株或血清型。一些癌抗原不会与癌抗原的野生型氨基酸序列变化很大。一些癌抗原具有在种间具有如此大的差异以致不能产生共有序列的核酸/氨基酸序列。在这些情况下，产生可打破耐受性和产生免疫应答的重组癌抗原，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有至少85％和高达99％的氨基酸序列同一性、优选至少90％和高达98％的序列同一性、更优选至少93％和高达98％的序列同一性或甚至更优选至少95％和高达98％的序列同一性。在某些情况下，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。可组合前述方法，以使得最终的重组癌抗原具有如上论述的与天然癌抗原氨基酸序列的百分比相似性。
所述重组癌抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发针对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞、体液或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子。
可将疫苗进一步与针对检查点抑制剂诸如PD-1和PDL-1的抗体组合以增强对细胞和体液免疫应答的刺激。使用抗-PD-1或抗-PDL-1抗体防止PD-1或PDL-1抑制T细胞和/或B细胞应答。总体上，通过设计待被免疫系统识别的癌抗原，可帮助克服其它形式的由肿瘤细胞产生的免疫抑制，并且可将这些疫苗与压抑或抑制疗法(诸如抗-PD-1和抗-PDL-1抗体疗法)组合使用以进一步增强T细胞和/或B细胞应答。
1.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。下文中描述了优选的方法和材料，尽管可在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。本文中公开的材料、方法以及实施例仅仅是说明性的并非意在限制。本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案，并非意在限制。
如本文中所用，术语“包含/包括”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”及其变型意欲为不排除另外的行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“和(and)”以及“该(the)”包括复数参考物。本公开还涵盖“包含/包括”本文中提出的实施方案或组件、“由所述实施方案或组件组成”和“基本上由所述实施方案或组件组成”的其它实施方案，无论是否明确地显示。
对于本文中数值范围的引述，明确地以相同的精度包括其间的每一个中介数。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还包括数值7和8，而对于范围6.0-7.0，明确地包括数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文中所用，“佐剂”意指添加至本文中描述的DNA质粒疫苗以增强由DNA质粒和下文中描述的编码核酸序列编码的抗原的免疫原性的任何分子。
如本文中所用，“抗体”意指种类IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段的抗体、其片段或其衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，所述抗体展现足够的对期望的表位或来源于其的序列的结合特异性。
如本文中所用，“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可包括有效地连接于能够在施用了核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。
如本文中所用，“互补”或“互补的”意指可核酸，可意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
如本文中所用，“共有”或“共有序列”意指基于来自不同生物体的相同基因的多个序列的比对的分析的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含含有共有序列的蛋白和/或编码此类蛋白的核酸的疫苗可用于诱发针对抗原的广泛免疫。
如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电-透化”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱发生物膜中的微观通路(孔)；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过进入另一侧。
如本文中针对核酸序列所使用的，“片段”意指编码能够引发哺乳动物的免疫应答的多肽的核酸序列或其部分，所述免疫应答与本文中公开的抗原交叉反应。所述片段可以是选自编码下文中所示的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一个的DNA片段。片段可包含下文中所示的核酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。在一些实施方案中，片段可包含下文中所示的核酸序列的至少一个的至少20个核苷酸或更多、至少30个核苷酸或更多、至少40个核苷酸或更多、至少50个核苷酸或更多、至少60个核苷酸或更多、至少70个核苷酸或更多、至少80个核苷酸或更多、至少90个核苷酸或更多、至少100个核苷酸或更多、至少150个核苷酸或更多、至少200个核苷酸或更多、至少250个核苷酸或更多、至少300个核苷酸或更多、至少350个核苷酸或更多、至少400个核苷酸或更多、至少450个核苷酸或更多、至少500个核苷酸或更多、至少550个核苷酸或更多、至少600个核苷酸或更多、至少650个核苷酸或更多、至少700个核苷酸或更多、至少750个核苷酸或更多、至少800个核苷酸或更多、至少850个核苷酸或更多、至少900个核苷酸或更多、至少950个核苷酸或更多或至少1000个核苷酸或更多个核苷酸。
对于多肽序列，“片段”或“免疫原性片段”意指能够引发哺乳动物的免疫应答的多肽，所述免疫应答与本文中公开的抗原交叉反应。片段可以是选自下文中的各种氨基酸序列的至少一个的多肽片段。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，共有蛋白的片段可包含本文中公开的蛋白质序列的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多个氨基酸。
如本文中所用，“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包括有效地连接于能够在施用了核酸分子的个体的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。如本文中所用，术语“可表达的形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有有效地连接于编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，以便当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。
如本文中所用，术语“同源性”是指互补性的程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，相同)。至少部分抑制完全互补的序列与靶序列杂交的部分互补序列是指使用功能性术语"基本上同源的"。当用于指双链核酸序列诸如cDNA或基因组克隆时，如本文中所用，术语"基本上同源的"是指可在低严格度的条件下与双链核酸序列的链杂交的探针。当用于指单链核酸序列时，如本文中所用，术语"基本上同源的"是指可在低严格度条件下与单链核酸模板序列杂交(即，与其互补)的探针。
如在本文中在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所用，“相同的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可通过如下步骤计算百分比：将两条序列最佳地比对，在指定的区域上比较两条序列，测定在两条序列中存在相同残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数，及将结果乘以100来得到序列同一性的百分比。在两条序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及指定的比较区域仅包括单条序列的情况下，将单条序列的残基包括在计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可将胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)认为是等同的。人工或通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST2.0来获得同一性。
如本文中所用，“免疫应答”意指宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统，响应抗原的引入的激活。免疫应答可以以细胞应答或体液应答的形式或这两种形式存在。
如本文中所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸还包括描述的单链的互补链。核酸的许多变体可出于相同的目的作为给定的核酸使用。因此，核酸还包括基本上相同的核酸和其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。核酸可以通过化学合成法或通过重组法获得。
如本文中所用，“有效连接的”意指基因的表达在与其空间上连接的启动子的控制下。启动子可位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与在所述启动子来源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如在本领域中是已知的，在不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。
如本文中所用，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可意指氨基酸的连接的序列，并且可以是天然的、合成的或者经修饰的或者天然和合成的组合。
如本文中所用，“启动子”意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以进一步增强所述序列的表达和/或改变其的空间表达和/或时间表达。启动子还可包含与转录起始位点相距多达数千碱基对的远端增强子或阻遏子元件。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可针对表达发生的细胞、组织或器官或针对表达发生所处的发育阶段，或响应外部刺激(诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地，或差异地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV 40晚期启动子和CMV IE启动子。
“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用，并且是指可被连接在本文中所示的蛋白质的氨基末端上的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文中使用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞分泌。在从细胞分泌后，通常从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)切割信号肽/前导序列。信号肽/前导序列连接在蛋白质的氨基末端(即，N末端)上。
如本文中所用，“严格杂交条件”意指第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶)(诸如在核酸的复杂混合物中)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下是不同的。可选择比特定序列在限定的离子强度、pH下的热熔点(Tm)低约5-10℃作为严格条件。Tm可以是50％的与靶互补的探针在平衡(由于靶序列过量存在，因此在Tm下，50％的探针在平衡时被占据)时与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件可以是在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，诸如约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)以及温度为至少约30℃(对于短探针(例如，约10-50个核苷酸))和至少约60℃(对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以为至少2至10倍本底杂交。示例性严格杂交条件包括下列条件：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS在65℃下孵育，在65℃于0.2xSSC和0.1％SDS中洗涤。
如本文中所用，“受试者”可意指想要或需要利用本文中描述的疫苗免疫的哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。
如本文中所用，“基本上互补的”意指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或两条序列在严格杂交条件下杂交。
如本文中所用的“基本上相同的”意指如果第一序列与第二序列的补体基本上互补的话则第一与第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域上或就核酸而言至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如本文中所用，“治疗”或“处理”可意指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病的方式来保护动物免受疾病侵害。预防疾病包括在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。抑制疾病包括在疾病引发后但在其临床表现之前向动物施用本发明的疫苗。压制疾病包括在疾病临床表现后向动物施用本发明的疫苗。
本文中针对核酸所用的“变体”意指(i)参考的核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考的核苷酸序列或其部分的补体；(iii)与参考核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
对于肽或多肽，“变体”是指通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上相异的，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可意指具有与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的的蛋白质。氨基酸的保守取代，即利用具有相似性质(例如，疏水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域中被认为通常包括较小变化。如本领域中所理解的，这些较小变化可部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathic index)来鉴定。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于显示可导致保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一种已被报导与抗原性和免疫原性密切相关的有用的度量。美国专利No.4,554,101，通过引用完全并入本文。如本领域中所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可导致保留生物活性例如免疫原性的肽。可利用彼此亲水性值在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，与生物功能相容的氨基酸取代被认为取决于氨基酸，并且具体地那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质显示的。
变体可以是在全长的全基因序列或其片段上基本上相同的核酸序列。核酸序列可在全长的基因序列或其片段上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。变体可以是在全长的氨基酸序列或其片段上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在全长的所述氨基酸序列或其片段上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
如本文中所用，“载体”意指含有复制起始点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主复制的染色体外载体，并且优选地，是DNA质粒。所述载体可含有或包括一种或多种异源核酸序列。
2.疫苗
本发明涉及抗-癌疫苗。疫苗可包含一种或多种癌抗原。疫苗可阻止肿瘤生长。疫苗可减少肿瘤生长。疫苗可阻止肿瘤细胞的转移。取决于癌抗原，疫苗可被靶向治疗肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、血癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、复发性呼吸道乳头状瘤病、肛门癌、子宫颈癌和脑癌。
疫苗开发中的第一步骤是鉴定不被免疫系统识别并且是自身抗原的癌抗原。将鉴定的癌抗原从自身抗原改变成外源抗原以被免疫系统识别。从自身抗原至外源抗原的重组癌抗原的核酸和氨基酸序列的重新设计打破免疫系统对抗原的耐受性。为了打破耐受性，可将几个重新设计措施应用于如下文中描述的癌抗原。
疫苗的重组癌抗原不被识别为自身的，因此打破耐受性。耐受性的打破可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发针对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子。
在特定实施方案中，疫苗可通过诱导如下应答来介导肿瘤细胞的清除或阻止其生长：(1)经由B细胞应答(以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生，从而延缓髓源抑制性细胞(MDSC)和抑制肿瘤生长的抗体)的体液免疫；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞诸如CD8+(CTL)以攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞应答；和(4)增加经由IFN-γ和TFN-α的炎症应答或优选地所有上述应答。疫苗可使无肿瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％和45％。在免疫后疫苗可使肿瘤质量减少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。疫苗可防止和阻止单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(一种由髓源抑制性细胞分泌的细胞因子)的增加。疫苗可使肿瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。
疫苗可使被施予所述疫苗的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予所述疫苗的受试者的细胞免疫应答增强约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，疫苗可使被施予所述疫苗的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予所述疫苗的受试者的细胞免疫应答增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
疫苗可使被施予所述疫苗的受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平相较于未被施予所述疫苗的受试者的IFN-γ水平升高约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，疫苗可使被施予所述疫苗的受试者的IFN-γ水平相较于未被施予所述疫苗的受试者的IFN-γ水平升高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
疫苗可以是DNA疫苗。在美国专利No.5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594(所述美国专利通过引用完整并入本文)中公开了DNA疫苗。DNA疫苗还可包含抑制其整合进染色体的元件或试剂。
疫苗可以是一种或多种癌抗原的RNA。可将所述RNA疫苗引入细胞。
疫苗可以是减毒活疫苗、使用重组载体递送抗原的疫苗、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗，例如但不限于美国专利No.：4,510,245、4,797,368、4,722,848、4,790,987、4,920,209、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,364、5,462,734、5,470,734、5,474,935、5,482,713、5,591,439、5,643,579、5,650,309、5,698,202、5,955,088、6,034,298、6,042,836、6,156,319和6,589,529(其各自通过引用并入本文)中描述的疫苗。
本发明的疫苗可具有有效疫苗所需的特性(诸如安全)，以使得所述疫苗本身不引起疾病或死亡；具有抵御疾病的保护作用；诱导中和抗体；诱导保护性T细胞应答；以及提供施用的容易性、几乎无副作用、生物稳定性和每剂量的低成本。疫苗可通过含有如下论述的癌抗原来实现这些特性的某些或所有特性。
如在下文中更详细地描述的，疫苗还可包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。在下文中更详细地描述免疫检查点分子。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分诸如MHC类呈递、T细胞内呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、用于免疫细胞增殖和/或分化的任何细胞因子、趋化因子或信号转导的抑制的任何核酸或蛋白质。如也在下文中更详细描述的，可将疫苗与针对检查点抑制剂诸如PD-1和PDL-1的抗体进一步组合，以增强细胞和体液免疫应答的刺激。使用抗-PD-1或抗-PDL-1抗体阻止PD-1或PDL-1抑制T细胞和/或B细胞应答。
a.癌抗原
疫苗可包含一种或多种癌抗原。癌抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核酸序列还可包括编码通过肽键连接于癌抗原的接头或标签序列的另外的序列。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。癌抗原可以是重组癌抗原。
设计重组癌抗原的核酸和其编码的氨基酸序列的一个方式是通过引入改变天然癌抗原的完整氨基酸序列中的特定氨基酸的突变。突变的引入不会太多地改变癌抗原(以至其不能被普遍地跨哺乳动物受试者(优选地人或狗受试者)施用)，但使其改变得足以使所得氨基酸序列打破耐受性或被当作外源抗原以产生免疫应答。另一方式可以是生成与其相应的天然癌抗原具有至少85％和高达99％的氨基酸序列同一性、优选至少90％和高达98％的序列同一性、更优选至少93％和高达98％的序列同一性或甚至更优选至少95％和高达98％的序列同一性的共有重组癌抗原。在某些情况下，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。所述天然癌抗原是通常与特定癌症或癌症肿瘤相关的抗原。取决于癌抗原，癌抗原的共有序列可跨哺乳动物物种或在种的亚型内或跨病毒株或血清型。一些癌抗原不会与癌抗原的野生型氨基酸序列变化很大。一些癌抗原具有在种间具有如此大的差异以致不能产生共有序列的核酸/氨基酸序列。在这些情况下，产生可打破耐受性和产生免疫应答的重组癌抗原，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有至少85％和高达99％的氨基酸序列同一性、优选至少90％和高达98％的序列同一性、更优选至少93％和高达98％的序列同一性或甚至更优选至少95％和高达98％的序列同一性。在某些情况下，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。可组合前述方法，以使得最终的重组癌抗原具有如上论述的与天然癌抗原氨基酸序列的百分比相似性。
癌抗原可以是下列抗原中的一种或多种：酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)、酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)、黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)、生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列、MART-1/melan-A抗原(MART-1/Melan-A)的氨基酸序列、癌睾丸抗原(NY-ESO-1)、癌睾丸抗原II(NY-ESO-1)和PRAME。疫苗可以是包含编码酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)、酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)、黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)、生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列、MART-1/melan-A抗原(MART-1/Melan-A)的氨基酸序列、癌睾丸抗原(NY-ESO-1)、癌睾丸抗原II(NY-ESO-1)、PRAME、病毒抗原或其组合的多核苷酸序列的DNA疫苗。病毒抗原可以是来自下列病毒的一种或多种抗原：乙型肝炎病毒(例如，核心蛋白和表面蛋白)、丙型肝炎病毒(例如，非结构蛋白(NS)34A(NS34A)、NS5A、NS5B、NS4B)和人乳头状瘤病毒(HPV)6、HPV 11、HPV 16和HPV 18。
(1)酪氨酸酶(Tyr)
本发明的疫苗可包含癌抗原酪氨酸酶(Tyr)、其片段或其变体。酪氨酸酶是具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶催化活性的含铜酶，其可在微生物以及植物和动物组织中被发现。具体地，酪氨酸酶通过酚类诸如酪氨酸的氧化催化黑色素和其它色素的产生。TYR基因中的突变导致哺乳动物的眼皮肤白化病并且TYR基因的非病理多态性促成皮肤色素沉着的变化。
此外，在癌症或肿瘤诸如黑色素瘤中，酪氨酸酶可变得失调，从而导致增加的黑色素合成。因此，酪氨酸酶可以是与黑色素瘤相关的癌抗原。在罹患黑色素瘤的受试者中，酪氨酸酶可以是细胞毒性T细胞识别的靶。然而，在某些情况下，针对癌症或肿瘤(包括黑色素瘤)的免疫应答可被抑制，从而导致支持肿瘤形成和/或生长并从而疾病进展的微环境。
免疫抑制可通过髓源抑制性细胞(MDSC)来促进，所述细胞是未成熟巨噬细胞、粒细胞、树突细胞和髓系细胞的混合群体。所述髓系细胞可以骨髓祖代细胞和未成熟髓系细胞(IMC)的异质性群体。MDSC的标志物可包括Gr-1和CD11b的表达(即，Gr-1+和CD11b+细胞)。
MDSC的循环可因慢性感染而增加，并且MDSC群体的扩张可与自身免疫和炎症相关联。特别地，MDSC扩张(或在肿瘤或癌组织中的存在)可促进肿瘤生长和逃避免疫检测和/或调控，因此，MDSC可影响针对抗癌疫苗的免疫应答。
MDSC可受G-蛋白信号2(Rgs2)的调节剂调节，并且Rgs2可在源自肿瘤的MDSC中高度表达。Rgs2还可在多种细胞例如髓系细胞中广泛表达。源自荷瘤小鼠的MDSC可与源自非荷瘤小鼠的MDSC发挥不同的功能。一个这样的差异可以由MDSC分泌的趋化因子MCP-1的产生的上调。MCP-1可通过经由CCR2(在单核细胞、内皮细胞和T细胞上发现的G蛋白偶联受体(GPCR))的信号转导促进细胞迁移。因此、MCP-1可引起内皮细胞的迁移，从而促进血管形成。经由中和抗体阻断MCP-1可抑制血管生成，因此，可导致减少的肿瘤转移和增加的存活。因此、MCP-1可被当作血管生成因子。除了分泌MCP-1以外，MDSC还可分泌生长因子，从而进一步促进肿瘤生长。
所述Tyr抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发针对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞、体液或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
如本文中所表明的，Tyr抗原诱导抗原特异性T细胞和高滴度的针对癌细胞或肿瘤细胞(例如，黑色素瘤细胞)的抗体应答。特别地，Tyr抗原是通过诱导如下应答产生的免疫介导的清除的重要靶：(1)经由B细胞应答(以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生，从而延缓髓源抑制性细胞(MDSC)和抑制肿瘤生长的抗体)的体液免疫；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞诸如CD8+(CTL)以攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞应答；和(4)增加经由IFN-γ和TFN-α的炎症应答或优选地所有上述应答。因此，包含Tyr抗原(例如，共有Tyr抗原，在下文中将对其进行更详细描述)的疫苗提供了针对肿瘤形成和肿瘤生长的保护性免疫应答，因为这些疫苗通过减少在癌性组织或肿瘤组织中发现的MDSC的群体阻止免疫抑制并且通过减少MCP-1的产生或分泌来阻断癌性或肿瘤组织的血管形成。因此，任何用户可设计包括Tyr抗原的本发明的疫苗来提供针对肿瘤形成、肿瘤转移和肿瘤生长的广泛免疫。
Tyr抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-Tyr免疫应答的免疫原的蛋白质表位。Tyr抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。Tyr抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有Tyr抗原的核酸序列。编码共有Tyr抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有Tyr抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有Tyr抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有Tyr抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有Tyr抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有Tyr抗原的氨基酸序列。编码共有Tyr抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有Tyr抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有Tyr抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:1，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:1编码连接于IgE前导序列的共有Tyr蛋白。可将共有Tyr蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有Tyr蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有Tyr抗原可以是在SEQ ID NO:1中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有Tyr抗原可以是编码在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有Tyr抗原可以是在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与Tyr共有蛋白同源的蛋白、Tyr共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长Tyr共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、Tyr共有蛋白的免疫原性片段和与Tyr共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长Tyr共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达90％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达91％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达92％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达93％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达94％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达95％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达96％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达97％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达98％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的Tyr蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:1的片段。片段可以是SEQ IDNO:1的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:1的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:1的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有Tyr蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。连接于IgE前导序列的共有Tyr蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:2。连接于IgE前导序列的共有Tyr蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:2中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:2的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:2的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:2的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:2具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:2的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(2)酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)
本发明的疫苗可包含癌抗原酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)、其片段或其变体。由TYRP1基因编码的TYRP1为75kDa跨膜糖蛋白并且在正常和恶性黑素细胞及黑色素瘤细胞中表达。与酪氨酸酶一样，TYRP1含有可结合小眼症转录因子(MITF)的经修饰的(被称为)M盒，其在黑素细胞内在激活色素沉着、细胞增殖和分化中起中心作用。TYRP1可帮助稳定酪氨酸酶并且可形成异二聚体，其可通过减弱酪氨酸酶-介导的细胞毒性来阻止黑素细胞的成熟前死亡。
如上文中针对酪氨酸酶所描述的，酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP-1)还可参与黑素细胞的黑色素和色素机器的合成，并且可被患有黑色素瘤的受试者的免疫系统识别。因此，TYRP-1可以是与黑色素瘤相关的抗原。
TRYP-1抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
TYRP-1抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-TYRP-1免疫应答的免疫原的蛋白质表位。TYRP-1抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。TYRP-1抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有TYRP-1抗原的核酸序列。编码共有TYRP-1抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有TYRP-1抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有TYRP-1抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有TYRP-1抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有TYRP-1抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有TYRP-1抗原的氨基酸序列。编码共有TYRP-1抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有TYRP-1抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有TYRP-1抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:3，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:4。SEQ ID NO:3编码连接于IgE前导序列的共有TYRP-1蛋白。可将共有TYRP-1蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有TYRP-1蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有TYRP-1抗原可以是在SEQ ID NO:3中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有TYRP-1抗原可以是编码在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有TYRP-1抗原可以是在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与TYRP-1共有蛋白同源的蛋白、TYRP-1共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长TYRP-1共有蛋白具有特定百分比同一性的蛋白质、TYRP-1共有蛋白的免疫原性片段和与TYRP-1共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长TYRP-1共有序列具有高达80％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达85％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达90％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达91％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达92％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达93％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达94％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达95％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达96％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达97％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达98％的同一性和与全长TYRP-1共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的TYRP-1蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:3的片段。片段可以是SEQ IDNO:3的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:3的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:3的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有TYRP-1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。连接于IgE前导序列的共有TYRP-1蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:4。连接于IgE前导序列的共有TYRP-1蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:4中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有TYRP-1蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:4的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:4的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:4的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:4具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:4的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(3)酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)
本发明的疫苗可包含癌抗原酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2；也称为多巴色素互变异构酶(DCT))、其片段或其变体。由TYRP2/DCT基因编码的TYRP2/DCT为由519个氨基酸组成的蛋白并且在正常和恶性黑素细胞及黑色素瘤细胞中表达。TYRP2/DCT是良好表征的黑素细胞特异性酶，其在黑素细胞中与酪氨酸酶和TYRP1结合，在L-酪氨酸至黑色素的转化中起作用。DCT特异性催化黑色素前体L-多巴色素至5,6-二氢吲哚-2-羧酸(DHICA)的互变异构化，所述5,6-二氢吲哚-2-羧酸随后被TYRP1(如上所论述)氧化以形成真黑色素。研究已显示TYRP2/DCT可以是黑色素瘤细胞中耐药性的介导者，具有对于DNA损伤剂的特异性。由于经常报导TYRP2/DCT在黑色素瘤中高度表达，因此该黑素细胞特异性酶起着促成黑色素瘤的针对各种抗癌DNA损伤药物的固有耐药性表型的重要作用。
如上文中针对酪氨酸酶所描述的，酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP-2)还可参与黑色素的合成，并且可被患有黑色素瘤的受试者的免疫系统识别。此外，TYRP-2可介导黑色素瘤细胞的耐药性。因此，TYRP-2可以是与黑色素瘤相关的抗原。
TRYP-2抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
TYRP2抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-TYRP2免疫应答的免疫原的蛋白质表位。TYRP2抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。TYRP2抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有TYRP2抗原的核酸序列。编码共有TYRP2抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有TYRP2抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有TYRP2抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有TYRP2抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有TYRP2抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有TYRP2抗原的氨基酸序列。编码共有TYRP2抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有TYRP2抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有TYRP2抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:5，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:6。SEQ ID NO:5编码连接于IgE前导序列的共有TYRP2蛋白。可将共有TYRP2蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有TYRP2蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有TYRP2抗原可以是在SEQ ID NO:5中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有TYRP2抗原可以是编码在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有TYRP2抗原可以是在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与TYRP2共有蛋白同源的蛋白、TYRP2共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长TYRP2共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、TYRP2共有蛋白的免疫原性片段和与TYRP2共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长TYRP2共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达90％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达91％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达92％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达93％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达94％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达95％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达96％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达97％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达98％的同一性和与全长TYRP2共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的TYRP2蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:5的片段。片段可以是SEQ IDNO:5的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:5的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:5的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有TYRP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。连接于IgE前导序列的共有TYRP2蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:6。连接于IgE前导序列的共有TYRP2蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:6中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:6中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:6中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:6中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:6中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:6相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:6的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:6的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:6的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:6具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:6的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(4)黑色素瘤-相关抗原4(MAGEA4)
本发明的疫苗可包含癌抗原黑色素瘤-相关抗原4(MAGEA4)、其片段或其变体。由MAGE-A4基因编码的MAGE-A4是由317个氨基酸组成的蛋白质，并且在雄性生殖细胞和不同组织学类型诸如胃肠癌、食管癌和肺癌的肿瘤细胞中表达。MAGE-A4结合癌蛋白Gankyrin。该MAGE-A4特异性结合由其C-末端介导。研究已显示外源性MAGE-A4可在体外部分抑制过表达Gankyrin的细胞的不依赖于贴壁的生长，并且在裸鼠中抑制从这些细胞形成迁移的肿瘤。该抑制依赖于MAGE-A4与Gankyrin之间的结合，从而表明Gankyrin与MAGE-A4之间的相互作用抑制Gankyrin-介导的癌发生。肿瘤组织中的MAGE表达可能不是原因，而是肿瘤发生的结果，并且MAGE基因参与通过靶向早期肿瘤细胞(以进行破坏)的免疫过程。
黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)可参与胚胎发育以及肿瘤转化和/或进展。MAGEA4通常在睾丸和胎盘中表达。然而，MAGEA4可在许多不同类型的肿瘤例如黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌、肺癌和乳腺癌中表达。因此，MAGEA4可以是与多种肿瘤相关的抗原。
MAGEA4抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
MAGEA4抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-MAGEA4免疫应答的免疫原的蛋白质表位。MAGEA4抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。MAGEA4抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有MAGEA4抗原的核酸序列。编码共有MAGEA4抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有MAGEA4抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有MAGEA4抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有MAGEA4抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有Tyr抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有MAGEA4抗原的氨基酸序列。编码共有MAGEA4抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有MAGEA4抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有MAGEA4抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:7，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:8。SEQ ID NO:7编码连接于IgE前导序列的共有MAGEA4蛋白。可将共有MAGEA4蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有MAGEA4蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有MAGEA4抗原可以是在SEQ ID NO:7中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有MAGEA4抗原可以是编码在SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有MAGEA4抗原可以是在SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与MAGEA4共有蛋白同源的蛋白、MAGEA4共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长MAGEA4共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、MAGEA4共有蛋白的免疫原性片段和与MAGEA4共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长MAGEA4共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达90％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达91％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达92％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达93％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达94％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达95％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达96％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达97％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达98％的同一性和与全长MAGEA4共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的MAGEA4蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:7的片段。片段可以是SEQ IDNO:7的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:7的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:7的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有MAGEA4蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。连接于IgE前导序列的共有MAGEA4蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:8。连接于IgE前导序列的共有MAGEA4蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:8中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:8的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:8的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:8的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:8具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:8的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(5)生长激素释放激素(GHRH)
本发明的疫苗可包含癌抗原生长激素释放激素(GHRH；也称为生长-激素-释放因子(GRF或GHRF)或生长激泌素)、其片段或其变体。GHRH是在下丘脑的弓状核中产生的44个氨基酸的肽激素。GHRH由下丘脑分泌并且刺激生长激素、生长、代谢和身体结构的调节剂从脑下垂体的释放。GHRH还刺激生长激素的产生。GHRH的拮抗剂可抑制多种癌症例如骨肉瘤、成胶质细胞瘤、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、结直肠癌和乳腺癌的生长。因此，GHRH可以是与多种肿瘤相关的抗原。
GHRH抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
GHRH抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-GHRH免疫应答的免疫原的蛋白质表位。GHRH抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。GHRH抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有GHRH抗原的核酸序列。编码共有GHRH抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有GHRH抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有GHRH抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有GHRH抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有GHRH抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有GHRH抗原的氨基酸序列。编码共有GHRH抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有GHRH抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有GHRH抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:9，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:10。SEQ ID NO:9编码连接于IgE前导序列的共有GHRH蛋白。可将共有GHRH蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有GHRH蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有GHRH抗原可以是在SEQ ID NO:9中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有GHRH抗原可以是编码在SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有GHRH抗原可以是在SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与GHRH共有蛋白同源的蛋白、GHRH共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长GHRH共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、GHRH共有蛋白的免疫原性片段和与GHRH共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长GHRH共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达90％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达91％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达92％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达93％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达94％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达95％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达96％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达97％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达98％的同一性和与全长GHRH共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的GHRH蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:9的片段。片段可以是SEQ IDNO:9的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:9的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:9的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有GHRH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。连接于IgE前导序列的共有GHRH蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:10。连接于IgE前导序列的共有GHRH蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:10中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:10的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:10的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:10的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:10具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:10的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(6)MART-1/Melan-A
本发明的疫苗可包含癌抗原MART-1(也称为Melan-A)，其片段或其变体。由MLANA基因编码的MART-1为含有单个跨膜结构域的118个氨基酸的蛋白质并且在大多数黑色素瘤细胞中表达。MART-1与结构蛋白形成复合物并且影响其表达、稳定性、黑色素小体结构和成熟所需要运输和加工。因此，MART-1是调控哺乳动物的色素沉着所必需的。黑色素小体成熟中的缺陷与对癌症的易感性相关。MART-1可在许多种癌症(包括但不限于黑色素瘤)中表达。
Melan-A，也称为被T细胞识别的黑色素瘤抗原(MART-1)，是黑素细胞分化抗原并且可见于正常皮肤、视网膜和黑素细胞中。Melan-a可与内质网和黑色素小体相关。Melan-A可被细胞毒性T细胞识别为黑色素瘤细胞上的抗原，但还可与具有黑色素细胞来源或分化(即，细胞具有黑色素小体)的其它肿瘤例如透明细胞肉瘤和黑色素型神经纤维瘤相关。因此，Melan-A可以是与多种源自具有黑色素小体的细胞的肿瘤相关的抗原。
Melan-A抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
Melan-A抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-Melan-A免疫应答的免疫原的蛋白质表位。Melan-A抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。Melan-A抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有Melan-A抗原的核酸序列。编码共有Melan-A抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有Melan-A抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有Melan-A抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有Melan-A抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有Melan-A抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有Melan-A抗原的氨基酸序列。编码共有Melan-A抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有Melan-A抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有Melan-A抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:11，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:12。SEQ ID NO:11编码连接于IgE前导序列的共有MELAN-A蛋白。可将共有Melan-A蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有Melan-A蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有Melan-A抗原可以是在SEQ ID NO:11中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有Melan-A抗原可以是编码在SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有Melan-A抗原可以是在SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与Melan-A共有蛋白同源的蛋白、Melan-A共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长Melan-A共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、Melan-A共有蛋白的免疫原性片段和与Melan-A共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长Melan-A共有序列具有高达80％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达85％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达90％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达91％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达92％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达93％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达94％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达95％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达96％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达97％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达98％的同一性和与全长Melan-A共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的Melan-A蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:11的片段。片段可以是SEQ IDNO:11的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:11的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:11的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有Melan-A蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:12。连接于IgE前导序列的共有Melan-A蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:12。连接于IgE前导序列的共有Melan-A蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:12中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:12的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:12的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:12的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:12具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:12的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:12中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(7)NY-ESO-1
本发明的疫苗可包含癌抗原纽约食管癌-1(NY-ESO-1；也称为CTAG1)、其片段或其变体。由CTAG1B基因编码的NY-ESO-1为180个氨基酸长的蛋白质，具有富含甘氨酸的N端区和极端疏水的C端区。NY-ESO-1在正常组织中具有有限的表达但频繁出现在癌症中。NY-ESO-1可在许多种癌症包括但不限于膀胱、结直肠、食管癌、胃癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、滑液癌和前列腺癌中表达。
癌-睾丸抗原(NY-ESO-1)可在睾丸和卵巢中表达。NY-ESO-1可与多种癌症相关并且可诱导体液免疫应答。患有癌症或肿瘤的受试者可产生针对NY-ESO-1的免疫原性。因此、NY-ESO-1可以是与多种肿瘤相关的抗原。
NY-ESO-1抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
NY-ESO-1抗原可使被施予NY-ESO-1抗原的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予NY-ESO-1抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，NY-ESO-1抗原可使被施予NY-ESO-1的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予NY-ESO-1抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
NY-ESO-1抗原可使被施予NY-ESO-1抗原的受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平相较于未被施予NY-ESO-1抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，NY-ESO-1抗原可使被施予NY-ESO-1抗原的受试者的IFN-γ水平相较于未被施予NY-ESO-1抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
NY-ESO-1抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-NY-ESO-1免疫应答的免疫原的蛋白质表位。NY-ESO-1抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。NY-ESO-1抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有NY-ESO-1抗原的核酸序列。编码共有NY-ESO-1抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有NY-ESO-1抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有NY-ESO-1抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有NY-ESO-1抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有NY-ESO-1抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有NY-ESO-1抗原的氨基酸序列。编码共有NY-ESO-1抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有NY-ESO-1抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有NY-ESO-1抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:13，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:14。SEQ ID NO:13编码连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-1蛋白。可将共有NY-ESO-1蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有NY-ESO-1蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有NY-ESO-1抗原可以是在SEQ ID NO:13中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有NY-ESO-1抗原可以是编码在SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有NY-ESO-1抗原可以是在SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与NY-ESO-1共有蛋白同源的蛋白、NY-ESO-1共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长NY-ESO-1共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、NY-ESO-1共有蛋白的免疫原性片段和与NY-ESO-1共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长NY-ESO-1共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达90％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达91％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达92％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达93％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达94％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达95％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达96％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达97％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达98％的同一性和与全长NY-ESO-1共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的NY-ESO-1蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:13的片段。片段可以是SEQ IDNO:13的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:13的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:13的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有NY-ESO-1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:14。连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-1蛋白的氨基酸序为SEQ IDNO:14。连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-1蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:14中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:14的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:14的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:14的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:14具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:14的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:14中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(8)NY-ESO-2
本发明的疫苗可包含癌抗原纽约食管癌-2(NY-ESO-2；也称为癌症/睾丸抗原2、ESO2和LAGE1)、其片段或其变体。NY-ESO-2是属于癌-睾丸抗原的ESO/LAGE家族的自身免疫原性肿瘤抗原。NY-ESO-2可在多种癌症(包括黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌)中表达，并且通常在睾丸组织中表达。此外、NY-ESO-2可在黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱、前列腺和头颈癌的25-50％的肿瘤样品中被观察到。编码NY-ESO-2的基因还含有称为CAMEL的蛋白(一种被黑色素瘤特异性细胞毒性T-淋巴细胞识别的肿瘤抗原)的替代开放阅读框架。
与NY-ESO-1类似，NY-ESO-2可在睾丸和卵巢中表达。NY-ESO-2还可与多种癌症和患有癌症或肿瘤的受试者中的免疫原性相关。因此，NY-ESO-2可以是与许多肿瘤相关的抗原。
NY-ESO-2抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
NY-ESO-2抗原可使被施予NY-ESO-2抗原的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予NY-ESO-2抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，NY-ESO-2抗原可使被施予NY-ESO-2抗原的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予NY-ESO-2抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
NY-ESO-2抗原可使被施予NY-ESO-2抗原的受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平相较于未被施予NY-ESO-2抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，NY-ESO-2抗原可使被施予NY-ESO-2抗原的受试者的IFN-γ水平相较于未被施予NY-ESO-2抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
NY-ESO-2抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-NY-ESO-2免疫应答的免疫原的蛋白质表位。NY-ESO-2抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。NY-ESO-2抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有NY-ESO-2抗原的核酸序列。编码共有NY-ESO-2抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有NY-ESO-2抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有NY-ESO-2抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有NY-ESO-2抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有NY-ESO-2抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有NY-ESO-2抗原的氨基酸序列。编码共有NY-ESO-2抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有NY-ESO-2抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有NY-ESO-2抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:15，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:16。SEQ ID NO:1编码连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-2蛋白。可将共有NY-ESO-2蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有NY-ESO-2蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有NY-ESO-2抗原可以是在SEQ ID NO:15中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有NY-ESO-2抗原可以是编码在SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有NY-ESO-2抗原可以是在SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与NY-ESO-2共有蛋白同源的蛋白、NY-ESO-2共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长NY-ESO-2共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、NY-ESO-2共有蛋白的免疫原性片段和与NY-ESO-2共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长NY-ESO-2共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达90％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达91％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达92％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达93％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达94％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达95％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达96％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达97％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达98％的同一性和与全长NY-ESO-2共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的NY-ESO-2蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:15的片段。片段可以是SEQ IDNO:15的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:15的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:15的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有NY-ESO-2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:16。连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-2蛋白的氨基酸序为SEQ IDNO:16。连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-2蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:16中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:16的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:16的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:16的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:16具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:16的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:16中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(9)PRAME
本发明的疫苗可包含癌抗原PRAME、其片段或其变体。由PRAME基因编码的PRAME是由509个氨基酸组成的蛋白并且在睾丸、胎盘、子宫内膜、卵巢、肾上腺中以及在源自黑色素瘤、肺癌、肾癌和头颈癌的组织中表达。PRAME也在成人和小儿急性白血病以及多发性骨髓瘤中表达。PRAME含有当由HLA-A24呈递时能够引发细胞毒性应答的免疫原性九肽。研究显示PRAME在培养细胞中的过表达诱导造成成更慢的增殖速率的不依赖于胱天蛋白酶的细胞死亡。其它研究表明PRAME的过表达还通过拮抗视黄酸受体(RAR)信号转导来赋予生长或存活有利方面，并且有原因地参与肿瘤发生过程。RAR信号转导的干扰导致调控细胞增殖、发育和分化的丧失。
PRAME可具有与癌-睾丸抗原MAGE、BAGE和GAGE类似的表达模式，即在睾丸中的表达。然而，PRAME可在人黑色素瘤和急性白血病中表达。PRAME可被细胞毒性T淋巴细胞识别。因此，PRAME可以是与黑色素瘤和白血病相关。
PRAME抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
PRAME抗原可使被施予PRAME抗原的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予PRAME抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，PRAME抗原可使被施予PRAME抗原的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予PRAME抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
PRAME抗原可使被施予PRAME抗原的受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平相较于未被施予PRAME抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，PRAME抗原可使被施予PRAME抗原的受试者的IFN-γ水平相较于未被施予PRAME抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
PRAME抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-PRAME免疫应答的免疫原的蛋白质表位。PRAME抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。PRAME抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有PRAME抗原的核酸序列。编码共有PRAME抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有PRAME抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有PRAME抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有PRAME抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有PRAME抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有PRAME抗原的氨基酸序列。编码共有PRAME抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有PRAME抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有PRAME抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:17，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:18。SEQ ID NO:17编码连接于IgE前导序列的共有PRAME蛋白。可将共有PRAME蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有PRAME蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有PRAME抗原可以是在SEQ ID NO:17中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有PRAME抗原可以是编码在SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有PRAME抗原可以是在SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与PRAME共有蛋白同源的蛋白、PRAME共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长PRAME共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、PRAME共有蛋白的免疫原性片段和与PRAME共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长PRAME共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达90％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达91％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达92％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达93％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达94％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达95％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达96％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达97％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达98％的同一性和与全长PRAME共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的PRAME蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:17的片段。片段可以是SEQ IDNO:17的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:17的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:17的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有PRAME蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。连接于IgE前导序列的共有PRAME蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:18。连接于IgE前导序列的共有PRAME蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:18中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:18的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:18的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:18的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:18具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:18的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:18中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(10)PSA
本发明的疫苗可包含癌抗原前列腺特异性抗原(PSA；也称为γ-精浆或激肽释放酶-3(KLK3))、其片段或其变体。PSA是由前列腺上皮细胞和前列腺细胞产生并由KLK3基因编码的雄激素-调控的丝氨酸蛋白酶。PSA通常用作前列腺癌的血清标志物。PSA是组织激肽释放酶家族的成员，并且在切割酶原被切割以释放活性酶后切割精液凝固物中的精液凝固蛋白，从而液化精液以使精子能够自由游动。此外，PSA酶活性受锌浓度调控，即高锌浓度抑制PSA的酶活性。
PSA抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
PSA抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-PSA免疫应答的免疫原的蛋白质表位。PSA抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。PSA抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有PSA抗原的核酸序列。编码共有PSA抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有PSA抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有PSA抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有PSA抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有PSA抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有PSA P抗原的氨基酸序列。编码共有PSA抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有PSA抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸编码共有PSA抗原可以是异源核酸序列和/或含有一个或多个异源核酸序列。
(11)PSMA
本发明的疫苗可包含癌抗原前列腺特异性膜抗原(PSMA；也称为谷氨酸羧肽酶II(GCPII)、N-乙酰基-L-天冬氨酰-L-谷氨酸肽酶I(NAALAD酶I)和NAAG肽酶)、其片段或其变体。PSMA由叶酸水解酶1(FOLH1)基因编码。PSMA为在膜和胞外空间中发现的锌金属酶。PSMA在人前列腺中高度表达并且在前列腺癌中被上调。PSMA也被发现在其它癌症诸如肾、乳腺和结肠的实体瘤中过表达。
PSMA抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
PSMA抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-PSMA免疫应答的免疫原的蛋白质表位。PSMA抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。PSMA抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有PSMA抗原的核酸序列。编码共有PSMA抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有PSMA抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有PSMA抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有PSMA抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有PSMA抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有PSMA P抗原的氨基酸序列。编码共有PSMA抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有PSMA抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸编码共有PSMA抗原可以是异源核酸序列和/或含有一个或多个异源核酸序列。
(12)STEAP
本发明的疫苗可包含癌抗原前列腺抗原的六次跨膜上皮抗原(STEAP)、其片段或其变体。STEAP为由STEAP1基因编码的金属还原酶。STEAP主要在前列腺组织中表达并且在癌细胞中被上调。STEAP经预测为六次跨膜蛋白并且为在细胞间连接中发现的细胞表面抗原。
STEAP抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
STEAP抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-STEAP免疫应答的免疫原的蛋白质表位。STEAP抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。STEAP抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有STEAP抗原的核酸序列。编码共有STEAP抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有STEAP抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有STEAP抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有STEAP抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有STEAP抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有STEAP抗原的氨基酸序列。编码共有STEAP抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有STEAP抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸编码共有STEAP抗原可以是异源核酸序列和/或含有一个或多个异源核酸序列。
(13)PSCA
本发明的疫苗可包含癌抗原前列腺特异性干细胞抗原(PSCA)、其片段或其变体。PSCA为糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的细胞表面蛋白并且由雄激素应答基因编码。PSCA为GPI-锚定的细胞表面抗原的Thy-1/Ly-6家族的成员。PSCA在许多种癌症(包括前列腺癌、膀胱和胰腺癌)中被上调。
PSCA抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
PSCA抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-PSCA免疫应答的免疫原的蛋白质表位。PSCA抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。PSCA抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有PSCA抗原的核酸序列。编码共有PSCA抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有PSCA抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有PSCA抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有PSCA抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有PSCA抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有PSCA抗原的氨基酸序列。编码共有PSCA抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有PSCA抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸编码共有PSCA抗原可以是异源核酸序列和/或含有一个或多个异源核酸序列。
(14)hTERT
本发明的疫苗可包含癌抗原hTERT、其片段或其变体。hTERT为在端粒酶的末端上合成TTAGGG标签以阻止因染色体的缩短而导致的细胞死亡的人端粒酶逆转录酶。过度增殖性细胞可具有异常高的hTERT表达。hTERT的异常表达还可在被HCV和HPV感染的过度增殖性细胞中发生。因此，HPV和HCV的免疫疗法可通过靶向以异常水平表达hTERT的细胞来增强。HPV和HCV抗原在下文中进行了更详细论述。hTERT癌抗原可进一步由2013年12月23日提交的美国专利申请No.14/139,660(其通过引用以其整体并入)来定义。
此外，用hTERT基因转染的树突细胞中的hTERT在可诱导CD8+细胞毒性T细胞并且以抗原特异性方式引发CD4+T细胞。因此，使用抗原呈递细胞(APC)中的hTERT表达来延迟衰老和支持它们呈递选择的抗原的能力可用于免疫治疗法诸如用于本文中所述的方法。
hTERT抗原可与许多种癌症(包括，但不限于黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病(RRP)、肛门癌、头颈癌和血癌)相关或在所述癌症中表达。因此，当包括本文中所述的hTERT抗原时，疫苗可用于治疗患有许多种癌症(包括，但不限于黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病(RRP)、肛门癌、头颈癌和血癌)的受试者。
nTERT抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
hTERT抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-hTERT免疫应答的免疫原的蛋白质表位。hTERT抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。hTERT抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸序列。编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列分别通过肽键连接于hTERT抗原或共有hTERT抗原的氨基酸序列。编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码hTERT抗原或共有HTERT抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸可以是异源核酸序列和/或含有一个或多个异源核酸序列。可相对野生型hTERT抗原突变编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸，以使得hTERT抗原或共有hTERT抗原的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸或残基分别被另一种氨基酸或残基替代或取代。可相对野生型hTERT抗原突变编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸，以使得hTERT抗原或共有hTERT抗原的氨基酸序列中的一个或多个残基分别被另一种残基替代或取代，从而使被施予编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸、hTERT抗原或共有hTERT抗原或其组合的哺乳动物的免疫系统不再耐受hTERT。相对于野生型hTERT抗原突变编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸，以使得hTERT抗原或共有hTERT抗原的氨基酸序列中的精氨酸589、天冬氨酸盐1005或精氨酸589和天冬氨酸盐1005被酪氨酸残基替代或取代。
hTERT抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:23，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:24。SEQ ID NO:23编码连接于IgE前导序列的hTERT蛋白。可将hTERT蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，hTERT蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，hTERT抗原可以是在SEQ ID NO:23中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，hTERT抗原可以是编码在SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。hTERT抗原可以是在SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与hTERT蛋白同源的蛋白、hTERT蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与序列具有高达95％的同源性、与序列具有高达96％的同源性、与序列具有高达97％的同源性、与序列具有高达98％的同源性、与序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长hTERT共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、hTERT共有蛋白的免疫原性片段和与hTERT共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长hTERT共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达90％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达91％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达92％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达93％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达94％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达95％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达96％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达97％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达98％的同一性和与全长hTERT共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的hTERT蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:23的片段。片段可以是SEQ IDNO:23的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:23的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:23的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，hTERT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:24。连接于IgE前导序列的hTERT蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:24。连接于IgE前导序列的hTERT蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:24中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。蛋白的片段可包含蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:24的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:24的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:24的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:18具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:24的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ IDNO:24中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
SEQ ID NO:23的片段可包含30个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含45或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含60个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含75或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含90个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含120个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含150个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含180个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含210个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含240个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含270个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含300个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含360个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含420个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含480个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含540个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含600个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含300个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含660个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含720个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含780或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含840个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含900或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含960或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1020或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1080个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1140或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:23的片段可包含1200个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1260个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1320或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含1380或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1440或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1500或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1560个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1620个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1680个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1740个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1800个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1860个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1920个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:34的片段可包含1980个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:23的片段可包含2040个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2100个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2160个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含2220个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2280个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2340个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2400个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2460个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2520个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2580个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2640个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2700个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2760个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2820个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:23的片段可包含2880个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2940个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3000个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含3060个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3120个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3180个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3240个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3300个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3360个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3420个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3480个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
片段可包含少于60个核苷酸，在一些实施方案中少于75个核苷酸，在一些实施方案中少于90个核苷酸，在一些实施方案中少于120个核苷酸，在一些实施方案中少于150个核苷酸，在一些实施方案中少于180个核苷酸，在一些实施方案中少于210个核苷酸，在一些实施方案中少于240个核苷酸，在一些实施方案中少于270个核苷酸，在一些实施方案中少于300个核苷酸，在一些实施方案中少于360个核苷酸，在一些实施方案中少于420个核苷酸，在一些实施方案中少于480个核苷酸，在一些实施方案中少于540个核苷酸，在一些实施方案中少于600个核苷酸，在一些实施方案中少于660个核苷酸，在一些实施方案中少于720个核苷酸，在一些实施方案中少于780个核苷酸，在一些实施方案中少于840个核苷酸，在一些实施方案中少于900个核苷酸，在一些实施方案中少于960个核苷酸，在一些实施方案中少于1020个核苷酸，在一些实施方案中少于1080个核苷酸，在一些实施方案中少于1140个核苷酸，在一些实施方案中少于1200个核苷酸，在一些实施方案中少于1260个核苷酸，在一些实施方案中少于1320个核苷酸，在一些实施方案中少于1380个核苷酸，在一些实施方案中少于1440个核苷酸，在一些实施方案中少于1500个核苷酸，在一些实施方案中少于1560个核苷酸，在一些实施方案中少于1620个核苷酸，在一些实施方案中少于1680个核苷酸，在一些实施方案中少于1740个核苷酸，在一些实施方案中少于1800个核苷酸，在一些实施方案中少于1860个核苷酸，在一些实施方案中少于1920个核苷酸，在一些实施方案中少于1980个核苷酸，在一些实施方案中少于2040个核苷酸，在一些实施方案中少于2100个核苷酸，在一些实施方案中少于2160个核苷酸，在一些实施方案中少于2220个核苷酸，在一些实施方案中少于2280个核苷酸，在一些实施方案中少于2340个核苷酸，在一些实施方案中少于2400个核苷酸，在一些实施方案中少于2460个核苷酸，在一些实施方案中少于2520个核苷酸，在一些实施方案中少于2580个核苷酸，在一些实施方案中少于2640个核苷酸，在一些实施方案中少于2700个核苷酸，在一些实施方案中少于2760个核苷酸，在一些实施方案中少于2820个核苷酸，在一些实施方案中少于2860个核苷酸，在一些实施方案中少于2940个核苷酸，在一些实施方案中少于3000个核苷酸，在一些实施方案中少于3060个核苷酸，在一些实施方案中少于3120个核苷酸，在一些实施方案中少于3180个核苷酸，在一些实施方案中少于3240个核苷酸，在一些实施方案中少于3300个核苷酸，在一些实施方案中少于3360个核苷酸，在一些实施方案中少于3420个核苷酸，在一些实施方案中少于3480个核苷酸以及在一些实施方案中少于3510个核苷酸。
SEQ ID NO:24的片段可包含15个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含18个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含21个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:24的片段可包含24个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含30个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含36个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含42个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含48个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:24的片段可包含54个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含60个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含66个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含72个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含90个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:24的片段可包含120个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含150个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含180个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含210个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含240个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含270个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含300个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含330个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:24的片段可包含360个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含390个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含420个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含450个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含480个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含510个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含540个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含570个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:24的片段可包含600个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含630个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含660个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含690个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含720个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含750个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含780个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含810个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:24的片段可包含840个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含870个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含900个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含930个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含960个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含990个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1020个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1050个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:24的片段可包含1080个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1110个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1140个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:24的片段可包含1170个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1200个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1230个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1260个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1290个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1320个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1350个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1380个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1410个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1440个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1470个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:24的片段可包含1500个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段不含IgE前导序列的编码序列。
片段可包含少于24个氨基酸，在一些实施方案中少于30个氨基酸，在一些实施方案中少于36个氨基酸，在一些实施方案中少于42个氨基酸，在一些实施方案中少于48个氨基酸，在一些实施方案中少于54个氨基酸，在一些实施方案中少于60个氨基酸，在一些实施方案中少于72个氨基酸，在一些实施方案中少于90个氨基酸，在一些实施方案中少于120个氨基酸，在一些实施方案中少于150个氨基酸，在一些实施方案中少于180个氨基酸，在一些实施方案中少于210个氨基酸在一些实施方案中少于240个氨基酸，在一些实施方案中少于260个氨基酸，在一些实施方案中少于290个氨基酸，在一些实施方案中少于320个氨基酸，在一些实施方案中少于350个氨基酸，在一些实施方案中少于380个氨基酸，在一些实施方案中少于410个氨基酸在一些实施方案中少于440个氨基酸，在一些实施方案中少于470个氨基酸在一些实施方案中少于500个氨基酸，在一些实施方案中少于530个氨基酸在一些实施方案中少于560个氨基酸，在一些实施方案中少于590个氨基酸，在一些实施方案中少于620个氨基酸，在一些实施方案中少于650个氨基酸，在一些实施方案中少于680个氨基酸，在一些实施方案中少于710个氨基酸，在一些实施方案中少于740个氨基酸，在一些实施方案中少于770个氨基酸，在一些实施方案中少于800个氨基酸，在一些实施方案中少于830个氨基酸，在一些实施方案中少于860个氨基酸，在一些实施方案中少于890个氨基酸，在一些实施方案中少于920个氨基酸，在一些实施方案中少于950个氨基酸，在一些实施方案中少于980个氨基酸，在一些实施方案中少于1010个氨基酸，在一些实施方案中少于1040个氨基酸，在一些实施方案中少于1070个氨基酸，在一些实施方案中少于1200个氨基酸，在一些实施方案中少于1230个氨基酸，在一些实施方案中少于1260个氨基酸，在一些实施方案中少于1290个氨基酸，在一些实施方案中少于1320个氨基酸，在一些实施方案中少于1350个氨基酸，在一些实施方案中少于1380个氨基酸，在一些实施方案中少于1410个氨基酸，在一些实施方案中少于1440个氨基酸，在一些实施方案中少于1470个氨基酸以及在一些实施方案中少于1500个氨基酸。
(15)MAGE A1
本发明的疫苗可包含癌抗原黑色素瘤-相关抗原1(MAGE A1)、其片段或其变体。由MAGEA1基因编码的MAGE A1为280个氨基酸的蛋白质，并且被发现仅由肿瘤细胞和精细胞表达。MAGE A1正常躯体组织中的表达依赖于DNA甲基化。这些基因在全基因组去甲基化过程的过程中在许多类型的肿瘤中被激活，所述全基因组去甲基化过程通常伴随肿瘤发生。具体地，在致瘤性转化中，这些基因被激活，表达，并且可成为被免疫系统识别和攻击的抗原性靶。因此，MAGE基因通过靶向一些早期肿瘤细胞以进行免疫破坏来参与免疫过程。MAGE A1可在许多种癌症(包括，但不限于黑色素瘤、肺癌和食管鳞状细胞癌)中表达。
MAGE A1抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
(16)WT1
本发明的疫苗可包含癌抗原维尔姆斯肿瘤1(WT1)、其片段或其变体。WT1是在N末端上含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结合结构域和在C末端上含有4个锌指基序的转录因子。WT1在泌尿生殖系统的正常发育中起着作用，并且与许多因子例如，p53(一种已知的肿瘤抑制子)和丝氨酸蛋白酶HtrA2(其可在用细胞毒性药物处理后在多个位点上切割WT1)相互作用。
WT1的突变可导致肿瘤或癌症例如维尔姆斯肿瘤或表达WT1的肿瘤的形成。维尔姆斯肿瘤通常在转移至其它组织例如但不限于肝组织、尿道系统组织、淋巴组织和肺组织之前在一个或两个肾中形成。因此，维尔姆斯肿瘤可被认为是转移性肿瘤。维尔姆斯肿瘤通常发生在年幼儿童(例如，小于5岁)中并以散发性和遗传性形式发生。WT1癌抗原可进一步由2013年12月23日提交的PCT/US13/75141(其在此通过引用以其整体并入)定义。
WT-1抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
因此，所述疫苗可用于治疗患有维尔姆斯肿瘤的受试者。所述疫苗可用于治疗患有许多种癌症(包括但不限于黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病(RRP)、肛门癌、头颈癌和血癌)的受试者。所述疫苗还可用于治疗具有表达WT1的癌症或肿瘤的受试者以预防此类肿瘤在受试者中发展。WT1抗原可与天然的“正常”WT1基因不同，从而提供针对表达WT1抗原的肿瘤的治疗或预防。因此，本文中提供了与天然WT1基因不同的WT1抗原序列(即，突变的WT1基因或序列)。
可将天然WT1基因的转录物加工成多种mRNA，并且所得的蛋白质对诱发免疫应答不是完全等值的。本文中描述的突变的WT1基因避免选择性加工，从而产生一种完全长度转录物并且导致对效应T细胞和B细胞应答更强的诱发。第一突变的WTI序列被称为具有经修饰的锌指或ConWT1-L的CON WT1。SEQ ID NO:19为编码具有经修饰的锌指的WT1抗原CON WT1的核酸序列。SEQ ID NO:20为具有经修饰的锌指的WT1抗原CON WT1的氨基酸序列。第二突变的WT1序列被称为不具有锌指或ConWT1-S的CON WT1。SEQ IDNO:21为编码不具有锌指的WTI抗原CON WT1的核酸序列。SEQ IDNO:22为不具有经修饰的锌指的WT1抗原CON WT1的氨基酸序列。
WT1抗原可以是来源于两个或更多个物种的共有抗原(或免疫原)序列。WT1抗原可包含用于提高的表达的共有序列和/或修饰。修饰可包括密码子优化、RNA优化、kozak序列(例如，GCC ACC)的添加(以增加翻译起始)和/或免疫球蛋白前导序列的添加(以增加WT1抗原的免疫原性)。WT1抗原可包含信号肽诸如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。在一些实施方案中，WT1共有抗原可包含血凝素(HA)标签。WT1共有抗原可被设计来引发比对应的密码子优化的WT1抗原更强和更广的细胞和/或体液免疫应答。
WT1共有抗原在一个或多个锌指中可包含一个或多个突变，从而引发比对应的密码子优化的WT1抗原更强和更广的细胞和/或体液免疫应答。一个或多个突变可以是在一个或多个锌指中配位锌离子的一个或多个氨基酸的取代。配位锌离子的一个或多个氨基酸可以是CCHH基序。因此，在一些实施方案中，所述一个或多个突变可替代CCHH基序的1、2、3或所有4个氨基酸。
在其它实施方案中，所述一个或多个突变是SEQ ID NO:20的残基312、317、342和347是除半胱氨酸(C)外的任何残基以及SEQ IDNO:20的残基330、334、360和364是除组氨酸(H)外的任何残基的突变。具体地，所述一个或多个突变是SEQ ID NO:20的残基312、317、330、334、342、347、360和364为甘氨酸(G)的突变。
在其它实施方案中，可从WT1共有抗原去除一个或多个锌指。可从WT1共有抗原除去1、2、3或所有4个锌指。
WT1共有抗原可以是编码SEQ ID NO:20的核酸SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:19中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。
在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列，只要SEQ ID NO:20的残基312、317、342和347是除半胱氨酸(C)外的任何残基以及SEQ ID NO:20的残基330、334、360和364是除组氨酸(H)外的任何残基。在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列，只要SEQ ID NO:20的残基312、317、330、334、342、347、360和364为甘氨酸(G)。
WT1共有抗原可以是氨基酸序列SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。所述WT1共有抗原可以是在SEQID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，只要SEQ ID NO:20的残基312、317、342和347是除半胱氨酸(C)外的任何残基以及SEQ ID NO:20的残基330、334、360和364是除组氨酸(H)外的任何残基。在一些实施方案中，WT1共有序列可以是在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，只要SEQ ID NO:20的残基312、317、330、334、342、347、360和364是甘氨酸(G)。
WT1共有抗原可以是核酸SEQ ID NO:21，其编码SEQ IDNO:22。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:21中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。
WT1共有抗原可以是氨基酸序列SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
可以提供SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:20和/或SEQ ID NO:22的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，免疫原性片段可包含SEQ ID NO:20的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，只要如果SEQID NO:20的残基312、317、342和347存在于免疫原性片段中，则这些残基是除半胱氨酸(C)外的任何残基，以及只要如果SEQ IDNO:20的残基330、334、360和364存在于免疫原性片段中，则这些残基是除组氨酸(H)外的任何残基。在其它实施方案中，免疫原性片段可包含SEQ ID NO:20的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，只要如果SEQ ID NO:20的残基312、317、330、334、342、347、360和364存在于免疫原性片段中，则这些残基是甘氨酸(G)。
在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如免疫球蛋白E(IgE)前导序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。
可提供含与SEQ ID NO:20和22的免疫原性片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类片段可包含与SEQ IDNO:20和/或SEQ ID NO:22具有95％或更大的同一性的蛋白质的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有96％或更大的同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有97％或更大的同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有98％或更大的同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有99％或更大的同一性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包含前导序列，例如免疫球蛋白前导序列诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，所述免疫源性片段不含前导序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的免疫源性片段。免疫源性片段可包含SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:21的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列例如免疫球蛋白的前导序列诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供具有与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的免疫原性片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的免疫原性片段。此类片段可包含与SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:21具有95％或更高同一性的核酸的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有96％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有97％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有98％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有99％或更高同一性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列，例如免疫球蛋白前导序列诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含编码前导序列的编码序列。
(17)gp100
本发明的疫苗可包含癌抗原糖蛋白100(gp100；也称为Trp2和前黑素小体蛋白(PMEL))、其片段或其变体。gp100由PMEL基因编码。其为由661个氨基酸组成的70kDa 1型跨膜糖蛋白，其在黑色素小体的生物发生中起着重要作用，因为其参与黑色素小体从I期至II期的成熟。gp100驱动条纹从多泡体内形成，并且直接参与前黑素小体的生物发生。相对于成熟黑素小体，gp100被富集在前黑素小体中，但由增殖性新生黑素细胞在肿瘤生长过程中过表达。gp100蛋白包括被来自黑色素瘤患者的外周血和来自肿瘤浸润淋巴细胞的细胞毒性T淋巴细胞识别的多种免疫原性表位。
gp100抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
(18)病毒抗原
癌抗原可以是病毒抗原、其片段或其变体。病毒抗原可以是来自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人乳头状瘤病毒(HPV)的抗原。HPV可以是如下论述的HPV 6、HPV 11、HPV 16或HPV 18。
病毒抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
(a)乙型肝炎病毒抗原
病毒抗原可以是来自乙型肝炎病毒(HBV)的抗原、其片段或其变体。HBV抗原可与肝癌相关或引起肝癌。在一些实施方案中，HBV抗原可以是编码一种或多种来自HBV的抗原的异源核酸分子，诸如质粒。HBV抗原可以是全长蛋白的全长或免疫原性片段。
HBV抗原可包含共有序列和/或一个或多个修饰以改善表达。遗传修饰(包括密码子最优化、RNA最优化和高效免疫球蛋白前导序列的添加(以增强构建体的免疫原性))可被包含在经修饰的共有序列中。共有HBV抗原可包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽，和在一些实施方案中，可包含HA标签。免疫原可被设计来引发比相应的密码子最优化的免疫原更强和更广的细胞免疫应答。
HBV抗原可以是HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV DNA聚合酶、由基因X编码的HBV蛋白、其片段、其变体或其组合。HBV抗原可以是HBV基因型A核心蛋白、HBV基因型B核心蛋白、HBV基因型C核心蛋白、HBV基因型D核心蛋白、HBV基因型E核心蛋白、HBV基因型F核心蛋白、HBV基因型G核心蛋白、HBV基因型H核心蛋白、HBV基因型A表面蛋白、HBV基因型B表面蛋白、HBV基因型C表面蛋白、HBV基因型D表面蛋白、HBV基因型E表面蛋白、HBV基因型F表面蛋白、HBV基因型G表面蛋白、HBV基因型H表面蛋白、其片段、其变体或其组合。HBV抗原可以是共有HBV核心蛋白或共有HBV表面蛋白。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型A共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型A核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型A共有核心蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型B共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型B核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型B共有核心蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型C共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型C核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型C共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型D共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型D核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型D共有核心蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型E共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型E核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型E共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型F共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型F核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型F共有核心蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型G共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型G核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型G共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型H共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型H核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型H共有核心蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型A共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型A表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型A共有表面蛋白序列。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型B共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型B表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型B共有表面蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型C共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型C表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型C共有表面蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型D共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型D表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型D共有表面蛋白序列。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型E共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型E表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型E共有表面蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型F共有表面DNA序列构建体,、连接于HBV基因型F表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型F共有表面蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型G共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型G表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型G共有表面蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型H共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型H表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型H共有表面蛋白序列。
(b)丙型肝炎病毒抗原
病毒抗原可以是来自丙型肝炎病毒(HCV)的抗原、其片段或其变体。HCV抗原可与肝癌相关或引起肝癌。在一些实施方案中，HCV抗原可以是编码一个或多个来自HCV的抗原的异源核酸分子，诸如质粒。HCV抗原可以是全长蛋白的全长或免疫原性片段。
HCV抗原可包含共有序列和/或一个或多个修饰以改善表达。遗传修饰(包括密码子最优化、RNA最优化和高效免疫球蛋白前导序列的添加(以增强构建体的免疫原性))可被包含在经修饰的共有序列中。共有HCV抗原可包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽，和在一些实施方案中，可包含HA标签。免疫原可被设计来引发比相应的密码子最优化的免疫原更强和更广的细胞免疫应答。
HCV抗原可以是HCV核衣壳蛋白(即，核心蛋白)、HCV包膜蛋白(例如，E1和E2)、HCV非结构蛋白(例如，NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)、其片段、其变体或其组合。
(c)人乳头状瘤病毒
病毒抗原可以是来自HPV的抗原、其片段或其变体。HPV抗原可来自HPV 16、18、31、33、35、45、52和58型，其可引起子宫颈癌、直肠癌和/或其它癌症。HPV抗原可来自HPV 6型和/或11型，其引起生殖器疣，并且已知是头颈癌的病因。HPV抗原可来自HPV 16和/或18型，其引起子宫颈癌。HPV抗原可来自HPV 6、11和/或16型，其引起RRP和肛门癌。HPV癌抗原可由2007年7月30日提交的美国专利No.8,168,769、2010年1月21日提交的美国专利No.8,389,706、2011年10月21日提交的美国专利申请No.13/271,576和2013年3月12日提交的美国专利申请No.61/777,198(所述每一个申请通过引用以其整体并入)定进一步义。
HPV抗原可以是来自每一个HPV型的HPV E6或E7结构域。例如，对HPV 16型(HPV16)，HPV16抗原可包括HPV16 E6抗原、HPV16 E7抗原、其片段、变体或组合。类似地，HPV抗原可以是HPV 6 E6和/或E7、HPV 11 E6和/或E7、HPV 16 E6和/或E7、HPV18 E6和/或E7、HPV 31 E6和/或E7、HPV 33 E6和/或E7、HPV 52 E6和/或E7或HPV 58 E6和/或E7、其片段、变体或组合。
(d)疱疹病毒
病毒抗原可以是疱疹病毒抗原。疱疹病毒抗原可以是选自由以下组成的组的抗原：CMV、HSV1、HSV2、VZV、CeHV1、EBV、玫瑰疹病毒属、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒或MuHV，和优选地CMV、HSV1、HSV2、CeHV1和VZV。
共有蛋白HCMV-gB(SEQ ID NO:26)、共有蛋白HCMV-gM(SEQID NO:28)、共有蛋白HCMV-gN(SEQ ID NO:30)、共有蛋白HCMV-gH(SEQ ID NO:32)、共有蛋白HCMV-gL(SEQ ID NO:34)、共有蛋白HCMV-gO(SEQ ID NO:36)、共有蛋白HCMV-UL128(SEQ IDNO:38)、共有蛋白HCMV-UL130(SEQ ID NO:40)、共有蛋白HCMV-UL-131A(SEQ ID NO:42)、共有蛋白HCMV-UL-83(pp65)(SEQID NO:44)。
核酸序列包括编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44的序列。产生编码共有氨基酸序列的核酸分子。疫苗可包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列编码选自该组的被产生来优化在人中的稳定性和表达的序列的免疫原性蛋白的一个或多个共有形式。编码共有蛋白HCMV-gB的核酸序列(SEQ ID NO:25)、编码共有蛋白HCMV-gM的核酸序列(SEQ ID NO:27)、编码共有蛋白HCMV-gN的核酸序列(SEQ IDNO:29)、编码共有蛋白HCMV-gH的核酸序列(SEQ ID NO:31)、编码共有蛋白HCMV-gL的核酸序列(SEQ ID NO:33)、编码共有蛋白HCMV-gO的核酸序列(SEQ ID NO:35)、编码共有蛋白HCMV-UL128的核酸序列(SEQ ID NO:37)、编码共有蛋白的核酸序列HCMV-UL130(SEQ ID NO:39)、编码共有蛋白HCMV-UL-131A的核酸序列(SEQ ID NO:41)、编码共有蛋白HCMV-UL-83(pp65)的核酸序列(SEQ ID NO:43)。核酸序列可额外地具有连接于5’末端的IgE前导序列。
鉴于与临床分离株的进化趋异和流行循环人株系间的广泛遗传差异，已产生了每一种免疫原性蛋白的共有氨基酸序列。gB、gM、gH、gL、gE、gI、gK、gC、gD、UL128、UL130、UL-131A和UL-83(pp65)的共有氨基酸序列基于来自人临床分离株的序列。由于gN蛋白的巨大进化趋异，从代表最血清流行(gN-4)的7个血清型中的仅一个(gN-4c)产生共有序列。类似地，在gO的情况下，从8个血清型的一个(gO-5)(因该特定血清型据报导与gN-4c血清型相关)产生共有氨基酸序列。
如上所述，疱疹病毒抗原可以是共有疱疹病毒。共有疱疹病毒抗原可被提供以信号肽。在一些实施方案中，IgE前导序列连接于N末端。如本文中所述，当指连接于共有序列的N末端的信号肽时，意欲明确地包括其中共有序列的N末端Xaa残基被信号肽替代的实施方案。即，如本文中所用，Xaa意欲指任意氨基酸或无氨基酸。包含本文中SEQ ID NO:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44所示的共有序列的蛋白质可包含不含N末端Xaa的那些序列。
产生在每一个特定情况下在疱疹病毒免疫原性蛋白的共有序列的N末端包含IgE前导序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了其中两个或更多个疱疹病毒抗原被表达为彼此通过蛋白水解切割位点连接的融合蛋白的核酸构建体。弗林蛋白酶蛋白水解切割位点是可在通过构建体表达的融合蛋白中连接疱疹病毒抗原的蛋白水解切割位点的实例。疱疹家族的病毒癌抗原还可以是美国专利申请No.13/982,457(其内容通过引用以其整体并入)中公开的任何抗原。
3.与免疫检查点抑制剂组合的疫苗
疫苗还可包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子在下文中进行了更详细地描述。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分诸如MHC类呈递、T细胞内呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、用于免疫细胞增殖和/或分化的任何细胞因子、趋化因子或信号转导的抑制的任何核酸或蛋白。
此类抑制剂可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸还可包括编码通过肽键连接于免疫检查点抑制剂的接头或标签序列的另外序列。小分子可低分子量，例如少于800道尔顿的有机或无机化合物，其可用作酶底物、被蛋白质或核酸结合的配体(其类似物)受或生物过程的调节剂。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂可以是一个或多个编码抗体、其变体、其片段或其组合的核酸序列。在其它实施方案中，免疫检查点抑制剂可以是抗体、其变体、其片段或其组合。
a.免疫检查点分子
免疫检查点分子可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸还可包括编码通过肽键连接于免疫检查点抑制剂的接头或标签序列的另外序列。小分子可低分子量，例如少于800道尔顿的有机或无机化合物，其可用作酶底物、被蛋白质或核酸结合的配体(其类似物)受或生物过程的调节剂。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。
(1)PD-1和PD-L1
免疫检查点分子可以是程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序化细胞死亡配体1(PD-L1)、其片段、其变体或其组合。PD-1是由PDCD1基因编码的细胞表面蛋白。PD-1是免疫球蛋白超家族的成员，并且在T细胞和原B细胞上表达，并因此促成这些细胞的命运和/或分化。特别地，PD-1是T细胞调节剂的CD28/CTLA-4家族的1型膜蛋白和负调节T细胞受体(TCR)信号，从而负调节免疫应答。PD-1可负调节CD8+T细胞应答，并从而抑制CD8-介导的细胞毒性和增强肿瘤生长。
PD-1具有两个配体PD-L1和PD-L2，所述配体为B7家族的成员。PD-L1在响应LPS和GM-CSF处理的巨噬细胞和树突细胞(DC)上被上调以及在TCR和B细胞受体信号转导时在T细胞和B细胞上被上调。PD-L1由许多肿瘤细胞系，包括骨髓瘤、肥大细胞瘤和黑色素瘤表达。
b.抗-免疫检查点分子抗体
如上所述，免疫检查点抑制剂可以是抗体。所述抗体可结合抗原(即，上文所述的免疫检查点分子)或与其反应。因此，所述抗体可被认为是抗-免疫检查点分子抗体或免疫检查点分子抗体。抗体可由中包含的核酸序列编码
抗体可包括重链多肽和轻链多肽。重链多肽可包括可变重链(VH)区和/或至少一个恒定重链(CH)区。至少一个恒定重链区可包括恒定重链区1(CH1)、恒定重链区2(CH2)和恒定重链区3(CH3)和/或铰链区。
在一些实施方案中，重链多肽可包括VH区和CH1区。在其它实施方案中，重链多肽可包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。
重链多肽可包括互补决定区(“CDR”)组。CDR组可含有VH区的3个高变区。从重链多肽的N末端开始，这些CDR分别被指定为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可促成抗原的结合或识别。
轻链多肽可包括可变轻链(VL)区和/或恒定轻链(CL)区。轻链多肽可包括互补决定区(“CDR”)组。CDR组可含有VL区的3个高变区。从轻链多肽的N末端开始，这些CDR分别被指定为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可促成抗原的结合或识别。
抗体可包含分别间插在重链与轻链框架(“FR”)组之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)组，所述框架组为CDR提供支持并界定CDR彼此之间的空间关系。CDR组可含有重链或轻链V区的3个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区域分别被指定为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。抗原-结合位点从而可包括6个CDR，包含来自重链和轻链V区的每一个的CDR组。
抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可包括VL区和CL区。
此外，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，所述片段中的两个片段(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供几个片段，包括F(ab’)2片段，所述片段包含两个抗原-结合位点。因此，所述抗体可以是Fab或F(ab’)2。Fab可包括重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可包括VH区和CH1区。Fab的轻链可包括VL区和CL区。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲合力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的抗体，其结合具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的期望的抗原。
(1)PD-1抗体
抗-免疫检查点分子抗体可以是抗-PD-1抗体(在本文中也称为“PD-1抗体”)、其变体、其片段或其组合。PD-1抗体可以是纳武单抗(Nivolumab)。抗-PD-1抗体可抑制PD-1活性，从而诱导、引发或增强针对肿瘤或癌症的免疫应答和减少肿瘤生长。
(2)PD-L1抗体
抗-免疫检查点分子抗体可以是抗-PD-L1抗体(在本文中也称为“PD-L1抗体”)、其变体、其片段或其组合。抗-PD-L1抗体可抑制PD-L1活性，从而诱导、引发或增强针对肿瘤或癌症的免疫应答或减少肿瘤生长。
4.疫苗构建体和质粒
疫苗可包含编码上述抗原和/或抗体的核酸构建体或质粒。核酸构建体或质粒可包括或含有一个或多个异源核酸序列。本文提供了可包含编码上述抗原和/或抗体的核酸序列的遗传构建体。遗传构建体可作为功能性染色体外分子存在于细胞中。遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒的线性微型染色体或质粒或粘粒。遗传构建体可包括或含有一个或多个异源核酸序列。
遗传构建体可以呈以任意次序表达上述抗原和/或抗体的质粒的形式。
遗传构建体还可以是重组病毒载体(包括重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘)的基因组的部分。遗传构建体可以是减毒活微生物或生活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。
遗传构建体可包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多腺苷酸化信号。
核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。载体可以能够以有效地引发哺乳动物的免疫应答的量在哺乳动物的细胞中表达上述抗原和/或抗体。载体可以是重组体。载体可包含编码上述抗原和/或抗体的异源核酸。载体可以是质粒。载体可用于利用编码上述抗原和/或抗体的核酸转染细胞，将所述转化的细胞培养和维持在其中上述抗原和/或抗体的表达可发生的条件下。
可针对表达的稳定性和高水平优化编码序列。在某些情况下，密码子被选择来减少RNA的二级结构诸如因分子内键合而形成的二级结构的形成。
载体可包含编码上述抗原和/或抗体的异源核酸编码并且可还可包含起始密码子(其可在一个或多个癌抗原编码序列的上游)和终止密码子(其可在上述抗原和/或抗体的编码序列的下游)。所述起始和终止密码子可与上述抗原和/或抗体的编码序列在框内。载体还可包含有效地连接于上述的抗原和/或抗体的编码序列的启动子。有效地连接于上述抗原和/或抗体的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽造白细胞组织增生病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子诸如CMV立即早期启动子、埃-巴二氏病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因诸如诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子还可以是组织特异性启动子，诸如肌肉或皮肤特异性启动子(天然或合成的)。此类启动子的实例在美国专利申请公布no.US20040175727(其内容以其整体并入本文)中进行了描述。
载体还可包含多腺苷酸化信号，其可在上述抗原和/或抗体的编码序列的下游。多腺苷酸化信号可以是SV40多腺苷酸化信号、LTR多腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多腺苷酸化信号。SV40多腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen,San Diego,CA)的多腺苷酸化信号。
载体还可在上述抗原和/或抗体的上游包含增强子。增强子可以是DNA表达所必需的。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，诸如来自CMV、HA、RSV或EBV的增强子。多核苷酸功能增强子描述于美国专利No.5,593,972、5,962,428和WO94/016737中，其各自的内容通过引用完全并入。
载体还可包含哺乳动物的复制起始点，以在染色体外维持载体和在细胞中产生多个拷贝的载体。载体可以是来自Invitrogen(San Diego,CA)的pVAX1、pCEP4或pREP4，所述载体可包含埃-巴二氏病毒复制起始点和和细胞核抗原EBNA-1编码区，其可产生高拷贝附加型复制而无需整合。载体可以是pVAX1或具有改变的pVax1变体诸如本文中所述的变体质粒。变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen,Carlsbad CA)的2998个碱基对的变体。CMV启动子位于碱基137-724。T7启动子/引发位点位于碱基664-683。多克隆位点位于碱基696-811。牛GH多腺苷酸化信号位于碱基829-1053。卡那霉素抗性基因位于碱基1226-2020。pUC复制起始点位于碱基2320-2993。
基于可获自Invitrogen的pVAX1的序列，在用作本文中所示的质粒1-6的主链的pVAX1的序列中发现下列突变：
将主链中位于CMV启动子的上游的碱基对2、3和4从ACT改变成CTG。
载体的主链可以是pAV0242。载体可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)载体。
载体还可包含调控序列，其可以非常适合用于在施用了所述载体的哺乳动物或人细胞中进行基因表达。一个或多个本文中公开的癌抗原序列可包含可允许编码序列在宿主细胞中更高效转录的密码子。
载体可以是pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白质。载体还可以是pYES2(Invitrogen,SanDiego,Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株中产生蛋白质。载体还可具有MAXBACTM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。载体还可以是pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白质。载体可以是通过常规技术和可容易获得的起始材料(包括Sambrook等，Molecular Cloning andLaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor(1989)，其通过引用完整并入)产生蛋白质的表达载体或系统，。
在一些实施方案中，载体可包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的核酸序列的一个或多个。
5.疫苗的药物组合物
疫苗可以呈药物组合物的形式。药物组合物可包含疫苗。药物组合物可包含约5纳克至约10mg的疫苗的DNA。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约25纳克至约5mg的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约50纳克至约1mg的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约5至约250微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约10至约200微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约15至约150微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约20至约100微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约25至约75微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约30至约50微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约35至约40微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约10微克至约100微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约20微克至约80微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约25微克至约60微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约30纳克至约50微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约35纳克至约45微克的疫苗的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克的疫苗的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克的疫苗的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克的疫苗的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克疫苗的DNA。
在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗的DNA。
在其它实施方案中，药物组合物可包含高达(并且包括)15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含高达(并且包括)1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含高达(并且包括)1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg的疫苗的DNA。
药物组合物还可包含其它试剂用于待使用的施用模式的配制目的。在其中药物组合物是可注射药物组合物的情况下，它们是无菌、无热源和无颗粒的。优选使用等渗制剂。一般地，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液诸如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂添加至制剂中。
疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能性分子。所述药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂，诸如免疫-刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物、小囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。
所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。所述转染促进剂是多聚-L-谷氨酸，更优选地，聚-L-谷氨酸以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。所述转染促进剂还可包括表面活性剂诸如免疫-刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物以及小囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯，并且还可将透明质酸与遗传构建体结合施用。在一些实施方案中，所述DNA载体疫苗还可包括转染促进剂(诸如脂质、脂质体,包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体),作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640))、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。优选地，所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。疫苗中的转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。
所述药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。所述佐剂可以是在可选择的质粒中表达的其它基因或作为疫苗中与上述质粒组合的蛋白质被递送。所述佐剂可选自由以下组成的组的物质：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、胸腺上皮细胞表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括IL-15(缺失信号序列和任选地包含来自IgE的信号肽)。所述佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。在示例性实施方案，所述佐剂是IL-12。
可以是有用的佐剂的其它基因包括编码以下物质的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。
6.用于治疗特定癌症的组合疫苗
疫苗可呈如上所述癌抗原的各种组合的形式以治疗癌症或肿瘤。取决于一种或多种癌抗原的组合，可用疫苗靶向各种癌症或其它肿瘤类型。这些癌症可包括黑色素瘤、血癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肺癌、食管鳞状细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、头颈癌、脑癌、肛门癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、滑液癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌和胃癌。图15提供可用于治疗特定癌症的抗原的特定组合的实例。
a.黑色素瘤
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如酪氨酸酶、PRAME或GP100-Trp2以治疗或预防黑色素瘤(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原酪氨酸酶、PRAME或GP100-Trp2与任意一种或多种癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI组合以治疗或预防黑色素瘤。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防黑色素瘤。
b.头颈癌
疫苗可包含癌抗原HPV 16 E6/E7以治疗或预防头颈癌(参见图15)。疫苗可进一步将癌抗原HPV 16 E6/E7与任意一种或多种癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI组合以用于治疗或预防头颈癌。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防头颈癌。
c.复发性呼吸道乳头状瘤病/肛门癌
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如HPV 6、HPV11或HPV 16以治疗或预防复发性呼吸道乳头状瘤病或肛门癌(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原HPV 6、HPV11或HPV16与一种或多种癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI组合以治疗或预防复发性呼吸道乳头状瘤病或肛门癌。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防复发性呼吸道乳头状瘤病或肛门癌。
d.子宫颈癌
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如HPV 16 E6/E7或HPV 18E6/E7以治疗或预防子宫颈癌(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原HPV 16 E6/E7或HPV 18 E6/E7与一种或多种癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI组合以治疗或预防子宫颈癌。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防子宫颈癌。
e.肝癌
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCVNS34A、HCVNS5A、HCV NS5B或HCVNS4B以治疗或预防肝癌(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCVNS34A、HCVNS5A、HCV NS5B或HCVNS4B与一种或多种癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI组合以治疗或预防肝癌。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防肝癌。
f.成胶质细胞瘤
疫苗可包含CMV以治疗或预防成胶质细胞瘤(参见图15)。疫苗可进一步将CMV与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI的一种或多种组合以用于治疗或预防成胶质细胞瘤。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防成胶质细胞瘤。
g.前列腺
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如PSA、PSMA或STEAP以治疗或预防前列腺癌(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原PSA、PSMA或STEAP与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI的一种或多种组合以治疗或预防前列腺癌。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防前列腺癌。
h.血癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如PRAME、WT-1、hTERT以治疗或预防血癌诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤(参见图51)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原PRAME、WT-1、hTERT与癌抗原NY-ESO-1或MAGE-A1的一种或多种组合以治疗或预防血癌诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防血癌诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
7.接种的方法
本文中提供了使用药物制剂(以提供如上所述的一种或多种癌抗原的遗传构建体和蛋白质)治疗或预防癌症的方法，所述抗原包含使得它们成为特别有效的可针对其诱发针对一种或多种癌抗原的免疫应答的免疫原的表位。可提供施用疫苗或接种的方法以诱导治疗性和/或预防性免疫应答。接种方法可在哺乳动物中产生针对如上所述的癌抗原的一种或多种的免疫应答。可向个体施用所述疫苗以调节哺乳动物的免疫系统的活性和增强免疫应答。疫苗的施用可以是将如本文中公开的一种或多种癌抗原作为在细胞中表达并从而被递送至细胞表面上的核酸分子进行的转染，免疫系统识别细胞表面上的所述抗原并诱发细胞应答、体液应答或细胞和体液应答。疫苗的施用可用于通过向哺乳动物施用如本文中所述的疫苗来诱导或引发哺乳动物的针对如本文中所述的癌抗原的一种或多种癌抗原的免疫应答。
当向哺乳动物施用疫苗并因此面将载体施用至哺乳动物的细胞中时，所述转染的细胞将表达并分泌如本文中公开的癌抗原的一种或多种癌抗原。这些分泌的蛋白或合成抗原将被免疫系统识别为外来物，其将激发可包括如下应答的免疫应答：针对所述一种或多种癌抗原产生的抗体，和特异性针对所述一种或多种癌抗原的T细胞应答。在一些实例中，利用本文中论述的疫苗接种的哺乳动物将具有激活的免疫系统，并且当用一种或多种如本文中公开的癌抗原攻击时，所述激活的免疫系统将允许快速清除随后的如本文中公开的癌抗原，无论是通过体液免疫应答、细胞免疫应答还是通过细胞和体液免疫应答。可向个体施用疫苗以调节个体的免疫系统的活性，从而增强免疫应答。
施用疫苗的DNA的方法在美国专利No.4,945,050和5,036,006(所述两个专利通过引用以其整体并入本文)中进行了描述。
可向哺乳动物施用所述疫苗以引发哺乳动物的免疫应答。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、母牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、骆驼、羊驼、小鼠、大鼠或鸡，并且优选地是人、母牛、猪或鸡。
疫苗剂量可为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间，并且可为20μg至10mg组分/kg体重/时间。可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗一次。用于有效治疗的疫苗的剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量。
a.利用疫苗产生免疫应答的方法
疫苗可用于产生哺乳动物的免疫应答，包括治疗性或防治性免疫应答。免疫应答可产生针对如本文中公开的一种或多种癌抗原的抗体和/或杀伤T细胞。可分离此类抗体和T细胞。
一些实施方案提供产生针对本文中公开的癌抗原的一种或多种的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用疫苗。一些实施方案提供预防性地接种个体以抗表达如上所述的癌抗原的一种或多种的癌症或肿瘤方法，所述方法包括施用疫苗。一些实施方案提供治疗性地接种患有表达所述癌抗原的一种或多种的癌症或肿瘤的个体的方法，所述方法包括包括施用疫苗。在施用疫苗之前，可常规地进行表达本文中公开的一种或多种癌抗原的癌症或肿瘤的诊断。
b.利用疫苗的癌症治疗的方法
疫苗可用于产生或引发哺乳动物的免疫应答，所述免疫应答与有此需要的哺乳动物或受试者的癌症或肿瘤(例如，黑色素瘤、头颈癌、子宫颈癌、肝癌、前列腺癌、血癌、食管磷状细胞癌、胃癌)反应或针对所述癌症或肿瘤。引发的免疫应答可阻止癌症或肿瘤生长。
引发的免疫应答可阻止和/或减少癌细胞或肿瘤细胞的转移。因此，疫苗可用于治疗和/或预防被施予疫苗的哺乳动物或受试者的癌症或肿瘤。取决于疫苗中使用的抗原，基于被治疗的癌症或肿瘤的生长可以是任何类型的癌症诸如，但不限于黑色素瘤、血癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肺癌、食管鳞状细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、头颈癌、脑癌、肛门癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、滑液癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌和胃癌。
在一些实施方案中，施用疫苗可通过诱导如下应答来介导肿瘤细胞的清除或阻止其生长：(1)经由B细胞应答(以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生，从而延缓髓源抑制性细胞(MDSC)和抑制肿瘤生长的抗体)的体液免疫；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞诸如CD8+(CTL)以攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增强T辅助细胞应答；(4)和增强经由IFN-γ和TFN-α的炎症应答或优选所有前述应答。
在一些实施方案中，免疫应答可产生对被施以疫苗的受试者的各种组织或系统(例如，脑或神经系统等)不造成损伤或不引起所述组织或系统的炎症的体液免疫应答和/或抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
在一些实施方案中，施用疫苗可增加受试者的无肿瘤存活率、减小肿瘤质量、增加肿瘤存活率或其组合。施用疫苗可使受试者的无肿瘤存活率增加20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。施用疫苗可使免疫后受试者的肿瘤质量减少20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％。施用疫苗可防止和阻止受试者的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(一种由髓源抑制性细胞分泌的细胞因子)的增加。在一些实施方案中，施用疫苗可防止和阻止受试者的癌组织或肿瘤组织中的MCP-1的增加，从而减少受试者的癌组织或肿瘤组织的血管形成。
施用疫苗可使受试者的肿瘤存活率增加20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％。在一些实施方案中，可向外周(如在下文中更详细地描述的)施用疫苗以建立靶向癌性或肿瘤细胞或组织以清除或消除表达一种或多种癌抗原的癌症或肿瘤而不损伤或引起被施予所述疫苗的受试者的疾病或死亡的抗原特异性免疫应答。
施用疫苗可使受试者的细胞免疫应答增强约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，施用疫苗可使受试者的细胞免疫应答增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
施用疫苗可使受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平升高约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，施用疫苗可使受试者的IFN-γ水平升高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
疫苗剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间并且可以为20μg至10mg组分/kg体重/时间。可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗一次。用于有效治疗的疫苗的剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量。
(1)利用PD-1和/或PD-L1抗体的联合治疗
本发明还涉及使用如上所述的疫苗增强哺乳动物的免疫应答的方法。如上所述的疫苗可包含如上所述的癌抗原和PD1抗体和/或PDL1抗体。组合可存在于单一制剂中或可被分开并依次施用(首先癌抗原，随后PD1抗体或PDL1抗体，或首先PD1抗体或PDL1抗体，随后癌抗原)。在一些实施方案中，在向所述受试者施用PD-1抗体或PD-L1抗体之前约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周，可向所述受试者施用癌抗原。在其它实施方案中，在向受试者施用癌抗原之前约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周，可向所述受试者施用PD-1抗体或PD-L1抗体。
癌抗原与PD1抗体或PDL1抗体的组合比包含单独的癌抗原的疫苗更高效地诱导免疫系统。该更高效的免疫应答在特定癌症的治疗和/或预防中提供增强的效率。取决于与PDL1抗体或PD1抗体组合的疫苗中使用的抗原，基于被治疗的癌症或肿瘤的生长可以是任何类型的癌症诸如，但不限于黑色素瘤、血癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肺癌、食管鳞状细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、头颈癌、脑癌、肛门癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、滑液癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌和胃癌。
在一些实施方案中，免疫应答可被增强约0.5倍至约15倍、约0.5倍至约10倍或约0.5倍至约8倍。可选地，被施予疫苗的受试者的免疫应答可被增强至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍或至少约15.0倍。
在其它替代实施方案中，被施予疫苗的受试者的免疫应答可被增强约50％至约1500％、约50％至约1000％或约50％至约800％。在其它实施方案中，被施予疫苗的受试者的免疫应答可被增强至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％、至少约1050％、至少约1100％、至少约1150％、至少约1200％、至少约1250％、至少约1300％、至少约1350％、至少约1450％或至少约1500％。
疫苗剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间并且可以为20μg至10mg组分/kg体重/时间。可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗一次。用于有效治疗的疫苗的剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量。
(2)黑色素瘤
疫苗可用于产生或引发哺乳动物的免疫应答，所述免疫应答与有此需要的哺乳动物或受试者的黑色素瘤反应或针对所述黑色素瘤。引发的免疫应答可阻止黑色素瘤生长。引发的免疫应答可减缓黑色素瘤生长。引发的免疫应答可预防和/或减少癌细胞或肿瘤细胞从黑色素瘤的转移。因此，疫苗可用于治疗和/或预防被施予所述疫苗的哺乳动物或受试者的黑色素瘤的方法。
在一些实施方案中，施用疫苗可通过诱导如下应答来介导黑色素瘤细胞的清除或阻止其生长：(1)经由B细胞应答(以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生，从而延缓髓源抑制性细胞(MDSC)和抑制肿瘤生长的抗体)的体液免疫；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞诸如CD8+(CTL)以攻击和杀死黑色素瘤细胞；(3)增强T辅助细胞应答；(4)和增强经由IFN-γ和TFN-α的炎症应答或优选所有前述应答。
在一些实施方案中，施用疫苗可增加受试者的无黑色素瘤存活率，减少黑色素瘤质量，增加黑色素瘤存活率或其组合。施用疫苗可使受试者的无黑色素瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％和45％。施用疫苗可使免疫后受试者的黑色素瘤质量减少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。施用疫苗可预防和阻止受试者的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(由髓源抑制性细胞分泌的细胞因子)的增加。在一些实施方案中，施用疫苗可防止或阻止受试者的黑色素瘤内的MCP-1增加，从而减少受试者的黑色素瘤组织的血管形成。施用疫苗可使受试者的黑色素瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。
8.施用途径
疫苗或药物组合物可以通过不同的途径(包括口服、胃肠外、舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内鞘内和关节内或其组合)施用。对于兽医学用途，可按照正常兽医实践作为适当地可接受的制剂施用组合物。兽医可以容易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。疫苗可通过常规注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其它物理方法诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力法”或超声波进行施用。
可利用几种公知的技术将疫苗的载体施用至哺乳动物，所述技术包括利用和不利用体内电穿孔的DNA注射(也称为DNA接种)、脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体诸如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组痘苗病毒。可经由DNA注射并连同体内电穿孔施用本发明的疫苗的一种或多种癌抗原。
a.电穿孔
可通过电穿孔施用疫苗或药物组合物。可使用电穿孔装置来实现经由本发明的质粒的电穿孔的疫苗的施用，所述电穿孔装置被构造来向哺乳动物的期望的组织递送有效地在细胞膜中引起可逆孔形成的能量的脉冲，并且优选的能量脉冲是与由用户预设的电流输入相似的恒定电流。电穿孔装置可包括电穿孔组件和电极部件或操作部件。电穿孔组件可包括和包含电穿孔装置的各种元件的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆组件、电源和电源开关。可使用例如体内电穿孔装置例如EP系统(Inovio Pharmaceuticals,Inc.,Blue Bell,PA)或Elgen电穿孔器(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)促进质粒对细胞的转染来实现电穿孔。
可促进本发明的DNA疫苗的施用的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在Draghia-Akli等人的美国专利No.7,245,963、Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630(其内容在此通过引用整体并入)中描述的那些电穿孔装置和方法。可用于促进DNA疫苗的施用的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列No.11/874072中提供的那些电穿孔装置和方法，所述专利申请序列根据35USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列No.60/852,149和2007年10月10日提交的60/978,982(其全都在此整体并入)的权益。
Draghia-Akli等人的美国专利No.7,245,963描述了标准电极系统及它们用于促进将生物分子引入至身体或植物的选择的组织的细胞中的用途。标准电极系统可包含多种针电极；皮下针头；提供从可编程恒定电流脉冲控制器至多个针电极的导电连接的电连接器；和电源。操作者可抓住多个安装在支持结构上的针电极，并将它们牢固地插入身体或植物的选择的组织中。随后经由皮下针头将生物分子施用至选择的组织。激活可编程恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电极脉冲施加于多个针电极。施加的恒定电流电脉冲促进将生物分子引入至多个电极之间的细胞中。美国专利No.7,245,963的整个内容在此通过引用以其整体并入。
由Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630描述了可用于有效地促进将生物分子引入至身体或植物的选择的组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括其操作通过软件或固件来指定的电动力学装置("EKD装置")。EKD装置基于脉冲参数的用户控制和输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒定电流脉冲波形，并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包含具有一个阵列的针电极的可替换电极盘、用于注射针的中央注射通道和可移去的引导盘。美国专利公开2005/0052630的整个内容在此通过引用完全并入。
美国专利No.7,245,963和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法可适用于不仅至组织诸如肌肉，而且还至其它组织或器官内的深度穿透。由于电极阵列的配置，还可将注射针(以deneurological系统选择的生物分子)完全插入靶器官中，并且在利用电极预先描绘的区域中垂直于靶组织施用注射剂。美国专利No.7,245,963和美国专利公开2005/005263中描述的电极优选为20mm长和21规格。
此外，在一些包括电穿孔装置及其用途的实施方案中，设想存在电穿孔装置，其为在下列专利：1993年12月28日授予的美国专利5,273,525、2000年8月29日授予的美国专利6,110,161、2001年7月17日授予的6,261,281和2005年10月25日授予的6,958,060，以及2005年9月6日授予的美国专利6,939,862中描述的那些电穿孔装置。此外，本文设想了针对注射DNA的方法设计的涵盖2004年2月24日授予的美国专利6,697,669(其涉及使用各种装置的任一种施用DNA)和2008年2月5日授予的美国专利7,328,064中提供的主题的专利。上述专利通过引用整体并入。
9.制备疫苗的方法
本文提供了用于制备包含本文中论述的疫苗的DNA质粒的方法。所述DNA质粒，在通过最终的亚克隆步骤克隆进哺乳动物的表达质粒后，可使用本领域已知的方法将所述载体用在大规模发酵罐中接种细胞培养物。
可使用已知的装置和技术的组合配制或制造与本发明的EP装置一起使用的DNA质粒，但优选使用2007年5月23日提交的美国公开申请no.20090004716中描述的优化的质粒制造技术来制造它们。在一些实例中，可以大于或等于10mg/mL的浓度配制用于这些研究的DNA质粒。所述制造技术除了美国序列No.60/939792中描述的那些装置和方案(包括2007年7月3日授予的批准的专利、美国专利No.7,238,522中描述的那些装置和方案)之外，还包括或包含对于本领域普通技术人员来说是公知的各种装置和方案。以上提及的申请和专利(分别为美国序列No.60/939,792和美国专利No.7,238,522)在此整体并入。
本发明具有多个方面，通过下列非限定性实例来举例说明。
10.实施例
实施例1
pTyr的构建
如图1A和9中显示的，可在许多不同的生物体中发现酪氨酸酶(Tyr)。因此，通过比对对应于来自图1A中显示的生物体的Tyr的序列，和选择共有Tyr的最常见的氨基酸和/或核苷酸来产生共有Tyr。每一个生物体的对应的Tyr序列获自GenBank(NCBI)。因此，共有Tyr反映跨物种的Tyr序列的保守元件。
编码共有Tyr的核酸序列可被改造来包括IgE前导序列。具体地，将IgE前导序列在框内融合于共有Tyr核酸序列的上游(图1B)。随后将所得的序列插入pVax1表达载体中以产生酪氨酸酶构建或质粒(pTyr)，从而使得Kozak序列存在于编码IgE前导序列和共有Tyr的核苷酸序列之前。
共有Tyr核酸序列至pVax1的插入通过限制酶分析来确认。如图1C中显示的，在DNA琼脂糖凝胶上将共有Tyr核酸序列与pVax1质粒分离(即，标记有BamH1/Xho1的泳道)，从而确认pVax1载体含有共有Tyr核酸序列。
共有Tyr的表达通过用pTyr转染HeLa细胞来确认。利用人抗-Tyr抗体的免疫印迹确认了共有Tyr蛋白在HeLa细胞中的表达(图1D)。GPF染色进一步显示共有Tyr蛋白在转染的HeLa细胞中的表达(图1E)。在免疫印迹和染色实验中。
实施例2
利用pTyr的接种诱导细胞介导的免疫应答
上述pTyr用于接种小鼠以评价细胞免疫应答是否由pTyr诱导。使用图2A中显示的免疫策略免疫C57/B6小鼠。一些小鼠用pVax1进行免疫，而其它小鼠用pTyr进行免疫。将用pTyr免疫的小鼠进一步分成下列组：(1)5μg剂量的pTyr；(2)20μg剂量的pTyr；(3)30μg剂量的pTyr；和(4)60μg剂量的pTyr。
在免疫策略的第35天，从C57B/6小鼠分离脾细胞，并通过IFN-γELISpot分析评价其的干扰素-γ(IFN-γ)的诱导。如图2B中显示的，20μg剂量的pTyr诱导最高水平的IFN-γ。
在被免疫的Balb/c和C57B/6小鼠中进一步评价至pTyr的细胞免疫应答。用pVax1或pTyr免疫小鼠。第三免疫后2周分离脾细胞，并用共有Tyr肽进行刺激。刺激后，将分泌IFN-γ的脾细胞计算为一式三份刺激孔中的点的平均数目。该测定表明C57/B6小鼠适用于pTyr接种(数据未显示)。
实施例3
pTyr接种增加细胞因子IFN-γ和TNF-α
检查利用pTyr和pVax1免疫的小鼠的细胞因子产生。使用图2A中显示的策略免疫小鼠。在免疫策略的第35天，用Tyr肽刺激从免疫的小鼠分离的细胞，进行过夜。刺激后，通过FACS测量多功能应答的分析。具体地，分析检查CD8+和CD4+T细胞。FACS允许鉴定对于细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ是阳性的T细胞。在CD44hi细胞中，显著百分比的CD8+T细胞在用pTyr免疫的小鼠中相较于用pVax1免疫的小鼠产生IFN-γ(图3)。
实施例4
响应pTyr接种产生Tyr特异性抗体
检查用pTyr接种的小鼠的体液免疫应答。具体地，用pTyr或pVax1以2周的间隔免疫C57BI/6小鼠(n＝4)3次。每一次免疫由20μg/肌内注射和随后利用MID-EP的电穿孔组成。在第三免疫(即，第35天)后，从小鼠采集血清，使用总的IgG特异性HRP标记的二抗通过ELISA测量抗体。如图4A中所指示的稀释血清。如图4A中显示的，针对Tyr的特异性抗体由用pTyr免疫的小鼠产生。用pTyr免疫的小鼠在图4A中用实心圆表示，而用pVax1免疫的小鼠在图4A中用空心三角形表示。
此外，以1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640系列稀释来自免疫的小鼠的血清。以一式三份向含有Tyr肽的单个孔(50μl/孔)中添加每一种血清稀释物。在第90和120再核对日检查所有免疫组的小鼠相较于免疫前血清的Tyr特异性滴度的峰值增加。每一个系列稀释点上的3个独立实验的代表性结果示于图4B中。这些数据进一步表明利用pTyr的免疫诱导利用pTyr免疫的小鼠的Tyr特异性抗体的产生。
实施例5
利用pTyr接种的小鼠对肿瘤攻击具有增加的存活率
进一步分析pTry以确定pTyr接种是否可提供免受肿瘤的保护作用。具体地，用pTyr或pVax1以2周的间隔免疫C57BI/6小鼠(10/组)。每一次免疫由20μg/肌内注射和随后利用MID-EP的电穿孔组成。第三免疫后1周(即，第35天)，利用B16黑色素瘤皮内攻击免疫的小鼠直至肿瘤直径超过200mm2。
随后，在小鼠的免疫组中评价无肿瘤存活率和肿瘤体积。如图5A(卡普兰-迈耶存活曲线)中显示的，利用pTyr免疫的小鼠相较于用pVax1接种的小鼠无肿瘤存活率得到提供(即，在第40天并且在肿瘤攻击后40％)(p＝0.05)，所述用pVax1接种的小鼠在肿瘤攻击后第20天全部死亡。利用pTyr免疫的小鼠相较于利用pVax1免疫的小鼠也具有减小的肿瘤体积(即，约50％)(图5B)。对于图5A和5B，用pVax1免疫的小鼠用实心方块来表示，而用pTyr免疫的小鼠用实心圆形来表示。因此，这些数据显示pTyr接种提供抗黑色素瘤的保护作，即增加的无肿瘤存活率和肿瘤体积的减小。
实施例6
MDSC群体在来自用pTyr接种的小鼠的肿瘤中减少
检查用pTyr免疫的小鼠和未免疫的小鼠的MDSC群体，以检查利用pTyr的接种是否改变来自各组的小鼠的肿瘤的MDSC的水平。具体地，检查免疫的和未免疫的小鼠的Gr-1+和CD11b+细胞的百分比。
如图6和7中显示的，MDSC水平在来自用pTyr免疫的小鼠的肿瘤内相较于未免疫的小鼠显著降低(p＝0.0004)。未免疫的小鼠中的MDSC群体的百分比为40.00±4.826。用pTyr免疫的小鼠的MDSC群体的百分比为5.103±0.7718。因此，这些数据显示利用pTyr的免疫减少用pTyr接种的小鼠的肿瘤内的MDSC群体。
实施例7
pTyr接种降低MCP-1水平
MDSC可分泌细胞因子MCP-1，所述细胞因子通过内皮细胞的迁移促进血管生成或血管形成。鉴于pTyr接种对肿瘤中的MDSC水平的上述作用，在用pTyr接种后检查MCP-1水平。
如图8A中显示的，B16黑色素瘤内的MDSC可分泌MCP-1。因此，用B16黑色素瘤攻击用pTyr免疫的小鼠和用pVax1免疫的小鼠以检查pTyr免疫是否改变MCP-1水平。首次接触实验的小鼠被包括作为另外的对照。攻击后，直接从肿瘤组织分离MDSC，并通过ELISA分析MCP-1细胞因子水平。以一式三份进行实验，并重复2次。
如图8B中显示的，B16黑色素瘤或肿瘤组织内的MDSC显著地分泌MCP-1(参见pVax1免疫的小鼠)。然而，用pTyr免疫的小鼠不具有MCP-1水平的显著升高。相反地，用pTyr免疫的小鼠中的MCP-1水平约为用pVax1免疫的小鼠的约1/3。因此，这些数据显示pTyr接种降低由用pTyr免疫的小鼠的肿瘤内的MDSC分泌的MCP-1的水平。
实施例8
pPRAME的构建
产生PRAME的共有序列，并将编码共有PRAME抗原的核苷酸序列插入表达载体或质粒pVAX(在本文中也称为pVAX1)的BamHI和XhoI限制酶位点以产生pGX1411(在本文中也称为pPRAME)(参见图10A)。
为了确认pPRAME导致共有PRAME抗原的表达，将pVAX和pPRAME转染进RD细胞和293T细胞。DAPI用于对细胞核染色，共有PRAME抗原也被荧光染色。该染色连同DAPI与共有PRAME抗原染色的合并一起示于图10B中。这些染色表明PRAME共有抗原从pPRAME表达并且在用pVAX(即，阴性对照)转染的细胞中未检测到共有PRAME抗原。
此外，来自转染的细胞的裂解物的免疫印迹分析用于确认共有PRAME抗原在转染的细胞中的表达(图10C)。非转染细胞和用pVAX转染的细胞用作阴性对照(参见图10C中分别标记有“对照”和“pVAX”的泳道)。在图10C中，β-肌动蛋白检测用作上样对照。总之，转染的细胞的染色和来自转染的细胞的裂解物的免疫印迹表明载体pPRAME在细胞内提供共有PRAME抗原的表达。
实施例9
针对利用pPRAME的接种的干扰素γ应答
上述pPRAME用于接种小鼠以评价细胞免疫应答是否被pPRAME诱导。将C57BL/6小鼠分组。第一组是首次接触实验的并且不接受pPRAME。第2、第3、第4、第5和第6组小鼠分别接受5μg、10μg、15μg、25μg和50μg的pPRAME。
免疫后，从C57BL/6小鼠分离脾细胞，并通过IFN-γELISpot分析评价干扰素γ(IFN-γ)的诱导。如图11A和11B中所示，每一个剂量的pPRAME诱导与阴性对照首次接触实验的小鼠不同的IFN-γ的产生或分泌。特别地，IFN-γ水平在接种的小鼠中相较于未接种的小鼠被增加约3000倍至约4500倍。因此，这些数据表明利用编码共有PRAME抗原的pPRAME的接种诱导细胞免疫应答，如相较于未接种升高的IFN-γ水平证明的。
实施例10
pNY-ESO-1的构建
产生NY-ESO-1的共有序列，并将编码共有NY-ESO-1抗原的核苷酸序列插入表达载体或质粒pVAX(在本文中也称为pVAX1)的BamHI和XhoI限制酶位点，以产生pGX1409(在本文中也称为pNY-ESO-1)(参见图12A)。
为了确认pNY-ESO-1导致共有NY-ESO-1抗原的表达，将pVAX和pNY-ESO-1转染进细胞中。DAPI用于对细胞核染色，共有NY-ESO-1抗原也被荧光染色。该染色连同DAPI与共有NY-ESO-1抗原染色的合并一起示于图12B中。这些染色表明NY-ESO-1共有抗原从pNY-ESO-1表达并且在用pVAX(即，阴性对照)转染的细胞中未检测到共有NY-ESO-1抗原。
此外，来自293T和RD转染的细胞的裂解物的免疫印迹分析用于确认共有NY-ESO-1抗原在转染的细胞中的表达(图12C)。非转染细胞和用pVAX转染的细胞用作阴性对照(参见图12C中分别标记有“对照”和“pVAX”的泳道)。在图12C中，α-肌动蛋白检测用作上样对照。总之，转染的细胞的染色和来自转染的细胞的裂解物的免疫印迹表明载体pNY-ESO-1在细胞内提供共有NY-ESO-1抗原的表达。
实施例11
针对利用pNY-ESO-1的接种的干扰素γ应答
上述pNY-ESO-1用于接种小鼠以评价细胞免疫应答是否由pNY-ESO-1诱导。将C57BL/6小鼠分组。第一组是首次接触实验的并且不接受pNY-ESO-1。第2和第3组的小鼠分别接受25μg和50μg的pNY-ESO-1。
免疫后，从C57BL/6小鼠分离脾细胞，并通过IFN-γELISpot分析评价干扰素γ(IFN-γ)的诱导。如图13中所示，每一个剂量的pPRAME诱导与阴性对照首次接触实验的小鼠不同的IFN-γ的产生或分泌。特别地，IFN-γ水平在接种的小鼠中相较于未接种的小鼠被增加约700倍至约1100倍。因此，这些数据表明利用编码共有NY-ESO-1抗原的pNY-ESO-1的接种诱导细胞免疫应答，如相较于未接种升高的IFN-γ水平证明的。
实施例12
针对利用pNY-ESO-2的接种的干扰素γ应答
产生NY-ESO-2的共有序列，并将编码共有NY-ESO-2抗原的核苷酸序列插入表达载体或质粒pVAX(在本文中也称为pVAX1)的多克隆位点，以产生pNY-ESO-2。
将该pNY-ESO-2用于接种小鼠以评价细胞免疫应答是否由pNY-ESO-2诱导。将C57BL/6小鼠分成组。第一组是首次接触实验的并且不接受pNY-ESO-2。第2和第3组小鼠分别接受25μg和50μg的pNY-ESO-2。
免疫后，从C57BL/6小鼠分离脾细胞，通过IFN-γELISpot分析评价干扰素γ(IFN-γ)的诱导。如图14中显示的，每一个剂量的pNY-ESO-2诱导与阴性对照首次接触实验的小鼠不同的IFN-γ的产生或分泌。特别地，IFN-γ水平在接种的小鼠中相较于未接种的小鼠被增加约400倍至约500倍。因此，这些数据表明利用编码共有NY-ESO-2抗原的pNY-ESO-2的接种诱导细胞免疫应答，如通过相较于未接种升高的IFN-γ水平所证明的。
应理解，前文详述和所附实施例仅是例举性的并且无意被视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由所附权利要求和它们的等同物确定。
对公开的实施方案的各种改变和改进对于本领域技术人员来说是显而易见的。可在不背离其精神和范围的情况下进行这样的改变和改进，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的那些改变和改进。

Claims (24)

1.一种疫苗，其包含
(a)编码一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：
(i)酪氨酸酶(Tyr)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)；
(ii)酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)；
(iii)酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)；
(iv)黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)的氨基酸序列(SEQ IDNO:8)；
(v)生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)；
(vi)MART-1/melan-A抗原(MART-1/Melan-A)的氨基酸序列(SEQID NO:12)；
(vii)癌睾丸抗原(NY-ESO-1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)；
(viii)癌睾丸抗原II(NY-ESO-2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)；
(ix)PRAME的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)
(x)WT1的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)；
(xi)WTI的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)；和
(xii)hTERT的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)；
(b)编码一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：
(i)与酪氨酸酶(Tyr)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(ii)与酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(iii)与酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(iv)与黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)的氨基酸序列(SEQID NO:8)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(v)与生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(vi)与MART-1/melan-A抗原(MART-1/Melan-A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(vii)与癌睾丸抗原(NY-ESO-1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(viii)与癌睾丸抗原II(NY-ESO-2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(ix)与PRAME的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(x)与WT1的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(xi)与WT1的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；和
(xii)与hTERT的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；或
(c)(a)和(b)的组合。
2.根据权利要求1所述的疫苗，还包含编码一种或多种选自由以下组成的组的抗原的核酸：PSA、PSMA、STEAP、PSCA、MAGEA1、gp100、病毒抗原及其组合。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其中所述病毒抗原是来自乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)或人乳头状瘤病毒(HPV)的抗原。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其中所述HBV抗原是HBV核心抗原或HBV表面抗原或其组合。
5.根据权利要求3所述的疫苗，其中所述HCV抗原是HCVNS34A抗原、HCV NS5A抗原、HCV NS5B抗原、HCV NS4B抗原或其组合。
6.根据权利要求3所述的疫苗，其中所述HPV抗原是HPV 6型E6抗原、HPV 6型E7抗原、HPV 11型E6抗原、HPV 11型E7抗原、HPV 16型E6抗原、HPV 16型E7抗原、HPV 18型E6抗原、HPV 18型E7抗原或其组合。
7.根据权利要求1所述的疫苗，还包含选自由以下组成的组的免疫检查点抑制剂：抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及其组合。
8.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述核酸分子包含一个或多个选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQID NO:21和SEQ ID NO:23。
9.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述核酸是质粒。
10.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述核酸是一个或多个质粒。
11.根据权利要求1所述的疫苗，还包含佐剂。
12.根据权利要求11所述的疫苗，其中所述佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。
13.一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的疫苗。
14.根据权利要求13所述的方法，其中施用包括电穿孔步骤。
15.根据权利要求13所述的方法，还包括向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及其组合。
17.根据权利要求15所述的方法，其中以单一制剂向所述受试者施用所述疫苗和免疫检查点抑制剂。
18.根据权利要求15所述的方法，其中分别向所述受试者施用所述疫苗和免疫检查点抑制剂。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病(RRP)、肛门癌、血癌及其组合。
20.一种核酸分子，其包含一个或多个选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、与SEQID NO:1具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:3具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:5具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:7具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:9具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:11具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:13具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ IDNO:15具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:17具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:19具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:21具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:23具有95％或更大的同一性的核苷酸序列及其组合。
21.根据权利要求20所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列是质粒。
22.根据权利要求21所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列是一个或多个质粒。
23.一种氨基酸分子，其包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、与SEQ ID NO:2具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ IDNO:4具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:6具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:8具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:10具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:12具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:14具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:16具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ IDNO:18具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:20具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:22具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:24具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、及其组合。
24.一种用于预防或治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)向有此需要的受试者施用包含CMV癌抗原的疫苗以治疗或预防成胶质细胞瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的CMV癌抗原的疫苗；
(b)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原PSA、PSMA或STEAP的疫苗以治疗或预防前列腺癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的PSA、PSMA或STEAP的疫苗以治疗或预防前列腺癌；
(c)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤；
(d)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV 16E6或HPV 16E7的疫苗以治疗或预防头颈癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HPV 16E6或HPV 16E7的疫苗以治疗或预防头颈癌；
(e)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤；
(f)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV 6、HPV 11或HPV 16的疫苗以治疗或预防肛门癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HPV 6、HPV 11或HPV 16的疫苗以治疗或预防肛门癌；
(g)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCV NS34A、HCV NS5A、HCV NS5B或HCVNS4B的疫苗以治疗或预防肝癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCV NS34A、HCV NS5A、HCVNS5B或HCV NS4B的疫苗以治疗或预防肝癌；
(h)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV 16E6/E7或HPV 18E6/E7的疫苗以治疗或预防子宫颈癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HPV 16E6/E7或HPV 18E6/E7的疫苗以治疗或预防子宫颈癌；或
(i)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原PRAME、WT-1或hTERT的疫苗以治疗或预防血癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原NY-ESO-1或MAGE-A1中的任一种或多种组合的PRAME、WT-1或hTERT的疫苗以治疗或预防血癌，
其中所述方法可进一步包括将(a)-(i)的施用步骤与选自由抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及其组合组成的组的免疫检查点抑制剂组合。
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