CN111465405A - 靶向prame的癌症疫苗和其用途 - Google Patents

Abstract

本文公开包含一个或多个编码突变型共有PRAME抗原的核酸序列的核酸分子。公开包含一个或多个编码突变型共有PRAME抗原的核酸序列的载体、组合物以及疫苗。公开治疗患有表达PRAME的肿瘤的个体的方法，和预防表达PRAME的肿瘤的方法。公开突变型共有PRAME抗原。

Description

靶向PRAME的癌症疫苗和其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年12月13日提交的美国临时专利申请第62/598,290号的优先权和权益，所述美国临时专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交并且以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII副本创建于2018年12月12日，命名为104409_000445_sequence_listing.txt并且大小为7,231个字节。

技术领域

本发明涉及黑色素瘤优先表达抗原(Preferentially Expressed Antigen inMelanoma；PRAME)及编码其的核酸分子。本发明还涉及包括此类PRAME免疫原和/或核酸分子的疫苗。本发明进一步涉及使用疫苗来诱导免疫反应和预防和/或治疗患有表达PRAME的癌细胞和肿瘤的个体的方法。

背景技术

癌症是世界范围内的主要死因之一，并且在美国是第二大最常见的死因，死亡的人中几乎每四个就有一个是死于癌症。癌症疫苗市场正在快速增长。有效的肿瘤疫苗可以适用于预防肿瘤生长和/或可以适用作晚期癌症患者的更有效、毒性更小的标准疗法替代方案。与癌症相关的抗原是PRAME，并且因此，抗肿瘤疫苗的靶标是PRAME。

PRAME最初被鉴别为编码人类黑色素瘤中HLA-A24限制性抗原肽的基因，触发自身细胞毒性T细胞药用免疫反应。人类PRAME基因位于22号染色体(HSA22)上，编码具有七个富亮氨酸(LXXLL)基元的蛋白质，PRAME通过所述基元干扰视黄酸受体(RAR)路径，并且引起对RA诱导的分化、生长停滞和细胞凋亡的抑制(Epping,M.T.等人《人类肿瘤抗原PRAME是视黄酸受体信号传导的显性阻遏子(The human tumor antigen PRAME is a dominantrepressor of retinoic acid receptor signaling)》.《细胞(Cell)》122,835-847,doi:10.1016/j.cell.2005.07.003(2005))。通过这种方式，PRAME充当信号传导路径的转录阻遏子，并且PRAME过表达导致肿瘤形成。

因为PRAME在除睾丸以外的几乎所有正常成人组织中低表达或缺乏表达，所以其被视为癌症睾丸抗原(CTA)。除黑色素瘤以外，PRAME在多种其它人类恶性疾病中过表达，包括急性和慢性白血病、多发性骨髓瘤、成神经管细胞瘤、肉瘤、头颈癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肾癌以及卵巢癌。在一项卵巢癌研究中，在100％的手术样品(n＝27)中鉴别出PRAME表达(Brenne,K.,Nymoen,D.A.,Reich,R.和Davidson,B.《黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)是用于区分浆液性癌与恶性间皮瘤的新颖标记物(PRAME(preferentially expressedantigen of melanoma)is a novel marker for differentiating serous carcinomafrom malignant mesothelioma)》.《美国临床病理学杂志(American journal ofclinical pathology)》137,240-247,doi:10.1309/AJCPGA95KVSAUDMF(2012))。

癌症的预防、诊断以及治疗可以采取许多不同形式。预防可以包括筛查易感因素(pre-disposing factor)(例如，特定遗传变异体)、改变行为(例如，吸烟、饮食以及身体活动量)以及接种抗病毒(例如，人类乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒)疫苗。治疗可以包括化疗、放疗以及手术去除肿瘤或癌组织。尽管有大量预防和治疗方法可供使用，但此类方法通常在有效预防和/或治疗癌症方面取得有限成功。

用于治疗和预防癌症的疫苗受到关注。然而，靶向肿瘤细胞抗原的现有疫苗受到体内不良抗原表达的限制。因此，所属领域中仍需要用于预防和/或治疗癌症和降低罹患癌症的个体的死亡率的安全且有效的疫苗和其使用方法。

发明内容

本公开涉及包含SEQ ID NO:1的核酸分子和编码SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列的核酸分子。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:1中所列的核酸序列。在另外的实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到1584中所列的核酸序列。在又另外的实施例中，核酸分子包含编码SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列的核酸序列。在另外的实施例中，核酸分子包含编码如SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列的核酸序列。在又另外的实施例中，载体包含根据权利要求1所述的核酸分子。

在又另外的实施例中，核酸分子编码PRAME抗原。在一些实施例中，所编码的PRAME抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列。在一些实施例中，所编码的PRAME抗原包含SEQ ID NO:2。

本文所描述的核酸分子可以并入到载体，如质粒或病毒载体中。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:1中所列的核酸序列。在某些实施例中，载体包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到1584中所列的核酸序列。在另外的实施例中，载体包含编码SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列的核酸序列。在又另外的实施例中，载体包含编码如SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列的核酸序列。在某些实施例中，载体包含根据权利要求1所述的核酸分子。

在一些实施例中，本文所描述的核酸可操作地连接到调控元件。在一些实施例中，调控元件是启动子和/或聚腺苷酸化信号。在另外的实施例中，启动子是人类巨细胞病毒即刻早期启动子(hCMV启动子)。在又另外的实施例中，聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH polyA)。

本文进一步提供PRAME抗原蛋白，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列。在一些实施例中，PRAME抗原包含SEQ ID NO:2。

还提供包含PRAME抗原的疫苗，其中抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列。在一些实施例中，PRAME抗原包含SEQ ID NO:2。在一些实施例中，PRAME抗原由SEQ ID NO:1的核苷酸55到1584编码。在一些实施例中，PRAME抗原由包含SEQID NO:1的核酸分子编码。

本文还提供包含编码所公开的PRAME抗原的核酸分子的疫苗。在一些实施例中，所编码的PRAME抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列。在一些实施例中，所编码的PRAME抗原包含SEQ ID NO:2。在一些实施例中，PRAME抗原由SEQ ID NO:1的核苷酸55到1584编码。在一些实施例中，PRAME抗原由包含SEQ ID NO:1的核酸分子编码。在一些实施例中，核酸分子并入到载体，包括(但不限于)质粒或病毒载体中。

所公开的疫苗可以进一步包含医药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，疫苗可以进一步包含佐剂。在某些实施例中，佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

本文进一步提供治疗具有特征为异常PRAME表达的细胞的个体的方法，所述方法包含施用治疗有效量的疫苗。在一些实施例中，施用包括电穿孔步骤。在其它实施例中，施用在个体上的一个或多个部位处进行。

本文还描述治疗个体的癌症的方法，所述方法包含向个体施用治疗有效量的疫苗。还提供用于针对特征为异常PRAME表达的细胞对个体进行疫苗接种的方法，所述方法包含以可有效诱发免疫反应的量施用疫苗。本公开中所教导的方法中施用的疫苗包含如上文所描述的核酸。在一些实施例中，施用包括电穿孔步骤。在其它实施例中，施用在个体上的一个或多个部位处进行。

在一些实施例中，本文所描述的核酸分子用作药剂。在一些实施例中，本文所描述的核酸分子用作治疗癌症的药剂。在一些实施例中，本文所描述的核酸分子用于制备药剂。在一些实施例中，本文所描述的核酸分子用于制备用于治疗癌症的药剂。

附图说明

图1A和图1B描绘PRAME的示意性表示。图1A提供PRAME蛋白中七个推定核受体(NR)盒(LXXLL基元)的氨基酸残基编号的位置的图形表示。图1B提供每个NR盒的氨基酸序列数据，包括相邻氨基酸残基。

图2提供经修饰的合成共有PRAME与人类PRAME序列的序列比对。

图3大体上描绘产生pGX1421的克隆反应。

图4示出经合成共有PRAME转染的细胞系中PRAME抗原表达通过蛋白质印迹分析的确认。

图5描绘将合成共有PRAME的表达与对照(pVAX)进行比较的免疫分析的结果。

图6描绘在C57Bl/6小鼠中进行的免疫原性研究的免疫接种和采血时程。

图7描绘小鼠中的pGX1411剂量反应。

图8A示出pGX1411在小鼠中具有免疫原性的确认。图8B以图形方式描绘施用pGX1411后的小鼠或未经处理的小鼠中的免疫反应。

图9A-9F以图形方式描绘确定小鼠中CD4+和CD8+T细胞反应的流式细胞术分析的结果。具体地说，图9A和9B分别显示与未经处理的对照相比，接受pGX1411的小鼠中用于产生IFNγ的CD4+和CD8+反应。图9C和9D分别显示与未经处理的对照相比，接受pGX1411的小鼠中用于产生CD107a+的CD4+和CD8+反应。图9E和9F分别显示与未经处理的对照相比，接受pGX1411的小鼠中用于产生TNFα的CD4+和CD8+反应。

图10以图形方式描绘与未经处理的对照相比，用5、25和50μg pGX1411处理后的终点滴度。

图11呈现癌组织的免疫组织化学染色。

图12以图形方式示出施用合成共有PRAME和经修饰的合成共有PRAME的小鼠中免疫反应的比较。

图13示出非人类灵长类动物(NHP)研究的免疫接种和采血时程。

图14A-14C描绘如通过IFNγELISpot测定的细胞免疫原性。图14A示出经免疫接种组随时间推移的均值IFNγ反应。图14B示出各个NHP的IFNγ反应。图14C示出组中的IFNγ反应以及组内的变化。施用pGX1421和pGX6006的时序由箭头1-4指示。

图15A-15D示出施用pGX1421和PGX6006的NHP中的CD4+和CD8+T细胞反应。图15A以图形方式显示CD4+T细胞反应。图15B以图形方式描绘CD8+反应。图15C以图形方式描绘CD8+GrB+T细胞反应。图15D示出免疫接种后的CD8+T细胞表型转变。

图16A-16C示出由pGX1421和pGX1421与pGX6006(IL-12)的组合诱导的细胞免疫反应。图16A描绘施用pGX1421的各个NHP中的IFNγ反应。图16B示出施用pGX1421和pGX6006两者的各个NHP中的IFNγ反应。图16C提供对图16A和16B中所描绘的反应的比较。施用pGX1421和pGX1421与pGX6006的组合的时序由箭头1-4指示。

图17A-17F示出如通过流式细胞术表征，由pGX1421和pGX1421与pGX6006的组合诱导的细胞免疫反应。图17A描绘任何单个接受者中的极小CD4+反应，并且图17B示出组之间INFγ和TNFα中的差异。图17C描绘pGX1421/pGX6006施用，而非单独的pGX1421施用引起更大的CD8+T细胞反应，并且图17D示出组之间INFγ和TNFα中的差异。图17E描绘施用单独或与pGX6006组合的pGX1421的NHP中的CD8+GrB+T细胞反应，并且图17F示出组之间INFγ和TNFα中的差异。

图18A-18C将通过施用pGX1421与pGX6006的组合诱导的IFNγ反应(图18A)与通过施用pGX1411与pGX6006的组合诱导的那些反应(图18B)进行比较。图18C合并图18A和18B的数据以便于比较。施用pGX1421与pGX6006的组合和pGX1411与pGX6006的组合的时序由箭头1-4指示。

图19A-19F示出通过施用pGX1421与pGX6006的组合诱导的细胞免疫反应，和通过施用pGX1411与pGX6006的组合诱导的那些相同反应。具体地说，图19A示出通过施用pGX1421与pGX6006的组合诱导的CD4+T细胞反应和通过施用pGX1411与pGX6006的组合诱导的CD4+T细胞反应，并且图19D示出这两组之间的INFγ和TNFα。图19B示出通过施用pGX1421与pGX6006的组合诱导的CD8+T细胞反应和通过施用pGX1411与pGX6006的组合诱导的CD8+T细胞反应，并且图19E示出这两组之间的INFγ和TNFα。图19C示出通过施用pGX1421与pGX6006的组合诱导的CD8+GrB+T细胞反应和通过施用pGX1411与pGX6006的组合诱导的CD8+GrB+T细胞反应，并且图19D示出组之间的INFγ和TNFα。

具体实施方式

本发明涉及包含PRAME抗原的疫苗。疫苗提供对表达PRAME的癌症的治疗和/或预防。本发明的疫苗可以针对需要治疗的个体的癌症的特定预防或治疗来提供特定癌症抗原的任何组合。

一种用于设计重组癌症抗原的核酸和其编码的氨基酸序列的方式是引入突变，所述突变改变原生癌症抗原的整体氨基酸序列中的特定氨基酸。突变的引入不是使癌症抗原发生太多的改变以致其无法普遍地在哺乳动物个体(并且优选人类或犬个体)中施加，而是其变化足以使得所得氨基酸序列破坏耐受性或被视为外来抗原以便产生免疫反应。另一种方式可以是产生一种共有重组癌症抗原，其与其对应的原生癌症抗原具有至少85％并且至多99％氨基酸序列一致性；优选至少90％并且至多98％序列一致性；更优选至少93％并且至多98％序列一致性；或甚至更优选至少95％并且至多98％序列一致性。在一些情况下，重组癌症抗原与其对应的原生癌症抗原具有95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性。原生癌症抗原是通常与特定癌症或癌症肿瘤相关的抗原。视癌症抗原而定，癌症抗原的共有序列可以是跨哺乳动物物种的或属于物种亚型内或是跨病毒株或血清型的。一些癌症抗原相对于癌症抗原的野生型氨基酸序列并无太大变化。一些癌症抗原的核酸/氨基酸序列跨物种如此趋异，以致无法产生共有序列。在这些情况下，产生了将破坏耐受性并且产生免疫反应的重组癌症抗原，所述重组癌症抗原与其对应的原生癌症抗原具有至少85％并且至多99％氨基酸序列一致性；优选至少90％并且至多98％序列一致性；更优选至少93％并且至多98％序列一致性；或甚至更优选至少95％并且至多98％序列一致性。在一些情况下，重组癌症抗原与其对应的原生癌症抗原具有95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性。前述方法可以组合，使得最终重组癌症抗原与原生癌症抗原氨基酸序列具有一定百分比的相似性，如上文所论述。

本公开的PRAME抗原可以是来源于来自不同物种或来自物种内的不同同工型的PRAME的氨基酸或核酸序列的合成共有PRAME抗原，并且因此合成共有PRAME抗原是非原生的。合成共有PRAME抗原还包含与视黄酸受体(RAR)相互作用或介导与视黄酸受体相互作用的蛋白域中的氨基酸取代。具体地说，氨基酸残基487和488处的亮氨酸氨基酸残基可以由缬氨酸残基取代。另外，PRAME抗原可以包含克扎克(Kozak)调控序列和/或IgE前导序列以分别增强表达和免疫原性。

重组PRAME可以诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体反应，从而诱导或诱发针对表达所述抗原的癌症或肿瘤或对表达所述抗原的癌症或肿瘤具有反应性的免疫反应。在一些实施例中，诱导或诱发的免疫反应可以是细胞、体液免疫反应，或细胞与体液免疫反应两者。在一些实施例中，诱导或诱发的细胞免疫反应可以包括诱导或分泌干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。在其它实施例中，诱导或诱发的免疫反应可以减少或抑制一种或多种促进表达所述抗原的肿瘤或癌生长的免疫遏制因子，例如(但不限于)下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调控T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子(如IL-10和TFG-β)、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫遏制细胞产生的可溶因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1以及免疫检查点分子。

疫苗可以进一步与检查点抑制(如PD-1和PDL-1)抗体组合，以增加对细胞与体液免疫反应两者的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体阻止PD-1或PDL-1遏制T细胞和/或B细胞反应。总的来说，设计被免疫系统识别的癌症抗原有助于克服肿瘤细胞的其它免疫遏制形式，并且这些疫苗可以与遏制或抑制疗法(如抗PD-1和抗PDL-1抗体疗法)组合使用以进一步增加T细胞和/或B细胞反应。

定义

除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在有冲突的情况下，将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选方法和材料，但与本文所描述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文所提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献以全文引用的方式并入。本文所公开的材料、方法和实例仅为说明性的且不意图为限制性的。本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不意图为限制性的。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有(having/has)”、“可以”、“含有”以及其变化形式意图是开放性过渡短语、术语或措辞，其不排除额外动作或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一”、“和”以及“所述”包括多个参考物。本公开还涵盖“包含本文提出的实施例或要素”、“由本文提出的实施例或要素组成”和“大体上由本文提出的实施例或要素组成”的其它实施例，而不管是否明确阐述。

本文中叙述数值范围时，明确涵盖每个中间值，所述中间值的精确度与所述范围最小值和最大值相同。举例来说，对于范围6-9，除了6和9之外涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。

如本文所用，“佐剂”意指添加到本文所描述的疫苗中以增强本文所描述的PRAME抗原抗原和/或编码如本文所描述的抗原的核酸分子的免疫原性的任何分子。

如本文所用，“抗体”意指如下类别的抗体：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，或其片段，或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体以及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物血清样品中分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体，或其任何混合物，其对所期望的表位或由所述表位衍生的序列展现充分的结合特异性。

“PRAME抗原”是指：具有包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526的突变型PRAME氨基酸序列的蛋白质。PRAME抗原可以任选地包括信号肽，如来自其它蛋白质的那些肽。举例来说，包含信号肽的PRAME抗原可以包括SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列。

如本文所用，“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号，能够引导核酸所施用的个体或哺乳动物的细胞中的表达。

如本文所用，“互补序列(Complement)”或“互补(complementary)”意指核酸可以指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对(例如，A-T/U和C-G)或胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对。

如本文所用，“共有”或“共有序列”意指一种多肽序列，其基于来自不同生物体的相同基因的多个序列的比对分析。可以制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含含有共有序列的蛋白质和/或编码此类蛋白质的核酸分子的疫苗可以用于诱导针对抗原的广泛免疫性。

如本文所用，“恒定电流”描述组织或界定所述组织的细胞在电脉冲持续递送到相同组织期间所接收或经历的电流。电脉冲是从本文所描述的电穿孔装置中递送。由于本文提供的电穿孔装置具有反馈元件(优选具有瞬时反馈)，因此这种电流在所述组织中以恒定安培数在电脉冲的寿命期保持。反馈元件可以测量在整个脉冲持续时间中组织(或细胞)的电阻并且使电穿孔装置改变其电能输出(例如，提高电压)，因此相同组织中的电流在整个电脉冲(约几微秒)中和脉冲与脉冲之间保持恒定。在一些实施例中，反馈元件包含控制器。

如本文所用，“电流反馈”或“反馈”可互换使用并且可以意指所提供的电穿孔装置的主动响应，包含测量电极之间的组织中的电流和相应地改变EP装置所递送的能量输出以便将电流维持在恒定水平。这种恒定水平是由用户在起始脉冲序列或电处理之前预设。反馈可以通过电穿孔装置的电穿孔组件(例如，控制器)实现，因为其中的电路能够连续地监测电极之间的组织中的电流并且将监测到的那个电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较，并且连续地进行能量输出调节以将所监测的电流维持在预设水平。反馈环路因其是模拟闭环反馈而可以是瞬时的。

如本文所用，“分散电流”可以意指本文所描述的电穿孔装置的多个针电极阵列所递送的电流模式，其中所述模式使正被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关热应激的发生最小化或优选消除。

如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲诱导生物膜中产生微观路径(孔隙)；其存在允许生物分子(如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水)从细胞膜的一侧通过到达另一侧。

如本文关于核酸序列所用的“片段”意指编码多肽的核酸序列或其一部分，所述多肽能够在哺乳动物中诱发与本文所公开的抗原交叉反应的免疫反应。片段可以是DNA片段，其选自以下所列编码蛋白质片段的多种核苷酸序列中的至少一种。片段可以包含以下所列核酸序列中的一种或多种的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，不包括所添加的异源信号肽。片段可以包含以下所列核酸序列中的一种或多种的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％并且另外任选地包含编码异源信号肽的序列，当计算一致性百分比时，编码异源信号肽的序列不包括在内。片段可以进一步包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽)的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以连接到编码序列的片段。

在一些实施例中，片段可以包含以下所列核酸序列中的至少一种的至少20个核苷酸或更多、至少30个核苷酸或更多、至少40个核苷酸或更多、至少50个核苷酸或更多、至少60个核苷酸或更多、至少70个核苷酸或更多、至少80个核苷酸或更多、至少90个核苷酸或更多、至少100个核苷酸或更多、至少150个核苷酸或更多、至少200个核苷酸或更多、至少250个核苷酸或更多、至少300个核苷酸或更多、至少350个核苷酸或更多、至少400个核苷酸或更多、至少450个核苷酸或更多、至少500个核苷酸或更多、至少550个核苷酸或更多、至少600个核苷酸或更多、至少650个核苷酸或更多、至少700个核苷酸或更多、至少750个核苷酸或更多、至少800个核苷酸或更多、至少850个核苷酸或更多、至少900个核苷酸或更多、至少950个核苷酸或更多或至少1000个核苷酸或更多。

关于多肽序列的“片段”或“免疫原性片段”意指一种多肽，其能够在哺乳动物中诱发与本文所公开的抗原交叉反应的免疫反应。片段可以是选自以下多种氨基酸序列中的至少一种的多肽片段。共有蛋白质的片段可以包含共有蛋白质的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，不包括所添加的任何异源信号肽。片段可以包含以下所列氨基序列中的一种或多种的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％并且另外任选地包含异源信号肽，当计算一致性百分比时，异源信号肽不包括在内。片段可以进一步包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。

在一些实施例中，共有蛋白质的片段可以包含本文所公开的蛋白质序列的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多。

如本文所用，术语“基因构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号，能够引导核酸分子所施用的个体的细胞中的表达。如本文所用，术语“可表达形式”是指一种基因构建体，其含有可操作地连接到编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，使得当存在于个体的细胞时，编码序列将被表达。

如本文所用，术语“同源性”是指互补程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即，一致性)。使用功能术语“大体上同源”提及部分互补序列，其至少部分地抑制完全互补序列与靶核酸杂交。在关于双链核酸序列(如cDNA或基因组克隆)使用时，如本文所用的术语“大体上同源”是指能够与双链核酸序列的链在低严格度的条件下杂交的探针。在关于单链核酸序列使用时，如本文所用的术语“大体上同源”是指能够与单链核酸模板序列在低严格度的条件下杂交(即，是单链核酸模板序列的互补序列)的探针。

如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的情形下所用，“一致(Identical)”或“一致性(identity)”是指序列的指定区域内指定百分比的残基相同。百分比可以如下计算：将两个序列最优地比对，在指定区域内比较两个序列，测定两个序列中存在相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中的位置总数，并且将结果乘以100产生序列一致性百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错端并且指定比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)与尿嘧啶(U)可以视为等效的。一致性可以人工方式或通过使用计算机序列算法(如BLAST或BLAST2.0)执行。

当论述反馈机理时，可以使用如本文所用的“阻抗”并且其可以根据欧姆定律(Ohm's law)换算成电流值，从而能够与预设电流比较。

如本文所用，“免疫反应”意指宿主免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)响应于抗原的引入而激活。免疫反应可以呈细胞反应或体液反应的形式，或两者。

如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“聚核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描绘还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘单链的互补链。核酸的许多变异体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖大体上一致的核酸和其互补序列。单链提供了可以与靶序列在严格杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或可以含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA两者)、RNA或杂合体，在杂合体中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤。核酸可以通过化学合成方法或重组方法获得。

如本文所用，“可操作地连接”意指基因在与其空间连接的启动子控制下表达。启动子可以位于处于其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离可以与产生启动子的基因中所述启动子和其控制的基因之间的距离大致相同。如所属领域中已知，可以适应这一距离的变化而不损失启动子功能。

如本文所用，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指所连接的氨基酸序列并且可以是天然的、合成的，或天然的与合成的修改或组合。

如本文所用，“启动子”意指一种合成或天然来源的分子，其能够赋予、激活或增强细胞中的核酸表达。启动子可以包含一个或多个特定转录调控序列以进一步增强表达和/或改变核酸在细胞中的空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强或阻遏元件，其可以位于离转录起始位点多达数千个碱基对处。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的源。启动子可以组成性调控基因组件的表达，或根据发生表达的细胞、组织或器官，或根据发生表达的发育阶段，或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)差异性调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括细菌噬菌体T7启动子、细菌噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子以及CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用并且是指能够在本文所列蛋白质的氨基端连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列典型地引导蛋白质定位。本文所用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞中分泌出来。从细胞中分泌出来后，信号肽/前导序列通常从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)裂解。信号肽/前导序列连接于蛋白质的氨基端(即，N端)。

如本文所用，“严格杂交条件”意指如在核酸的复杂混合物中，第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)杂交的条件。严格条件是序列相关的并且会随情况不同而不同。可以选择严格条件比特定序列在所限定的离子强度pH下的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm可以是50％的与靶标互补的探针与靶序列在平衡(由于靶序列过量存在，在Tm下，在平衡下占据50％探针)下杂交的温度(在限定的离子强度、pH和核浓度下)。严格条件可以是在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，如约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)温度至少约30℃且对于长探针(例如，超过约50个核苷酸)温度至少约60℃的条件。严格条件也可以通过添加去稳定化剂(如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号可以是背景杂交的至少2到10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下培育，或5×SSC、1％SDS，在65℃下培育，在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃下洗涤。

如本文所用，“个体”可以意指想要或需要用本文所描述的疫苗免疫接种的哺乳动物。哺乳动物可以是人类、黑猩猩、犬、猫、马、奶牛、小鼠或大鼠。

如本文所用，“大体上互补”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540个或更多核苷酸或氨基酸的区域内，第一序列与第二序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或两个序列在严格杂交条件下杂交。

如本文所用，“大体上一致”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540个或更多核苷酸或氨基酸的区域内，第一序列与第二序列至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或就核酸来说，第一序列与第二序列的互补序列大体上互补的情况。

如本文所用，“治疗(treat/treatment/treating)”可以意指通过预防、遏制、阻遏或完全消除疾病的方式保护动物以免患病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。遏制疾病涉及在诱导疾病之后但在其临床表现之前向动物施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病存在临床表现后向动物施用本发明的疫苗。

如本文关于核酸使用的“变异体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其一部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列大体上一致的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其大体上一致的序列杂交的核酸。

如本文关于肽或多肽所用的“变异体”意指氨基酸序列因氨基酸的插入、缺失或保守取代而不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变异体也可以意指氨基酸序列与参考蛋白质大体上一致并且氨基酸序列保留至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守取代，即，用具有相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸在所属领域中被认为是典型地涉及次要改变。这些次要改变可以如所属领域中所理解通过考虑氨基酸的亲水指数来部分地鉴别。Kyte等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。所属领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍保留蛋白质功能。在一个方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可以用于揭示使蛋白质保留生物功能的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性可以计算所述肽的最大局部平均亲水性，这是一种有用的量度，据报道与抗原性和免疫原性很好地相关。美国专利4,554,101，以引用的方式完全并入本文中。如所属领域所理解，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以使肽保留生物活性，例如免疫原性。取代可以用亲水性值在彼此±2内的氨基酸进行。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受所述氨基酸的特定侧链影响。与观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代应理解为依赖于氨基酸，并且尤其那些氨基酸的侧链的相对相似性，如由疏水性、亲水性、电荷、尺寸和其它特性所揭示。

变异体可以是在全基因序列或其片段的全长上大体上一致的核酸序列。核酸序列在基因序列或其片段的全长上可以80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。变异体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大体上一致的氨基酸序列。氨基酸序列在氨基酸序列或其片段的全长上可以80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。

如本文所用，“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自复制染色体外载体，并且优选DNA质粒。载体可以含有或包括一种或多种异源核酸序列。

疫苗

本文提供了包含本文所描述的PRAME抗原或编码此类抗原的核酸分子的疫苗。在一些实施例中，PRAME抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列的PRAME抗原。在一些实施例中，PRAME抗原包含SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子编码具有SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列的PRAME抗原。在一些实施例中，编码PRAME抗原的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到1584中所列的核酸序列。在一些实施例中，编码PRAME抗原的核酸分子包含SEQ ID NO:1中所列的核酸序列。疫苗可能能够在个体中产生针对抗原的免疫反应。免疫反应可以是治疗性或预防性免疫反应。如下文更详细地描述，疫苗可包含载体或多种载体。

疫苗可以用于防止癌症，例如表达PRAME的癌症或肿瘤。疫苗可以用于预防和/或治疗有需要的个体的表达PRAME的卵巢癌。疫苗可以诱导有需要的个体的针对PRAME和针对表达PRAME的癌症的细胞和/或抗体反应。在本公开的一些实施例中，疫苗可以用于防止、预防、治疗特征为异常PRAME表达的细胞和/或诱导针对所述细胞的细胞和/或抗体反应。在本公开的一些实施例中，疫苗可以用于防止、预防、治疗特征为异常PRAME表达的卵巢癌细胞，具体地说上皮卵巢癌细胞，并且更具体地说浆液性卵巢癌细胞，和/或诱导针对所述细胞的细胞和/或抗体反应。

如本文所描述的癌症疫苗的开发包含鉴别未由免疫系统识别并且为自身抗原的癌症抗原，例如PRAME。为了被免疫系统识别，将所鉴别的癌症抗原从自身抗原变为外来抗原。将重组癌症抗原的核酸和氨基酸序列从自身抗原再设计为外来抗原破坏了免疫系统对抗原的耐受性。为了破坏耐受性，可以利用数种再设计措施来产生癌症抗原，如下文所描述。

破坏耐受性可以诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体反应，从而诱导或诱发针对表达抗原的癌症或肿瘤或对表达抗原的癌症或肿瘤具有反应性的免疫反应。在一些实施例中，诱导或诱发的免疫反应可以是细胞、体液免疫反应，或细胞与体液免疫反应两者。在一些实施例中，诱导或诱发的细胞免疫反应可以包括诱导或分泌干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。在其它实施例中，诱导或诱发的免疫反应可以减少或抑制一种或多种促进表达所述抗原的肿瘤或癌生长的免疫遏制因子，例如(但不限于)下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调控T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子(如IL-10和TFG-β)、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫遏制细胞产生的可溶因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1以及免疫检查点分子。

在一特定实施例中，疫苗可以通过以下介导肿瘤细胞的清除或阻止肿瘤细胞生长：(1)增加细胞毒性T淋巴细胞，如CD8⁺(CTL)以攻击并且杀死肿瘤细胞；(2)增加T辅助细胞反应；和/或(3)通过IFN-γ和TFN-α增加炎性反应，或优选所有前述内容。疫苗可以使无肿瘤生存率提高30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％以及45％。在免疫接种之后，疫苗可以使肿瘤质量减少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％以及60％。疫苗可以阻止并且阻断单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的增加，所述蛋白为由骨髓来源的遏制细胞分泌的细胞因子。疫苗可以使肿瘤生存率提高30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％以及60％。

相比于未施用疫苗的个体的细胞免疫反应，疫苗可以使施用疫苗的个体的细胞免疫反应提高约50倍到约6000倍、约50倍到约5500倍、约50倍到约5000倍、约50倍到约4500倍、约100倍到约6000倍、约150倍到约6000倍、约200倍到约6000倍、约250倍到约6000倍，或约300倍到约6000倍。在一些实施例中，相比于未施用疫苗的个体的细胞免疫反应，疫苗可以使施用疫苗的个体的细胞免疫反应提高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

相比于未施用疫苗的个体的干扰素γ(IFN-γ)水平，疫苗可以使施用疫苗的个体的IFN-γ水平提高约50倍到约6000倍、约50倍到约5500倍、约50倍到约5000倍、约50倍到约4500倍、约100倍到约6000倍、约150倍到约6000倍、约200倍到约6000倍、约250倍到约6000倍，或约300倍到约6000倍。在一些实施例中，相比于未施用疫苗的个体的IFN-γ水平，疫苗可以使施用疫苗的个体的IFN-γ水平提高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

疫苗可以是DNA疫苗。DNA疫苗公开于美国专利第5,593,972号；第5,739,118号；第5,817,637号；第5,830,876号；第5,962,428号；第5,981,505号；第5,580,859号；第5,703,055号；以及第5,676,594号中，所述美国专利以引用的方式完全并入本文中。DNA疫苗可以进一步包含抑制其整合到染色体中的元件或试剂。

疫苗可以包括编码癌症抗原的RNA。RNA疫苗可以引入到细胞中。

疫苗可以是减毒活疫苗、使用重组载体递送抗原的疫苗、亚单位疫苗以及糖蛋白疫苗，例如(但不限于)以下美国专利中所描述的疫苗：4,510,245号；第4,797,368号；第4,722,848号；第4,790,987号；第4,920,209号；第5,017,487号；第5,077,044号；第5,110,587号；第5,112,749号；第5,174,993号；第5,223,424号；第5,225,336号；第5,240,703号；第5,242,829号；第5,294,441号；第5,294,548号；第5,310,668号；第5,387,744号；第5,389,368号；第5,424,065号；第5,451,499号；第5,453,3 64号；第5,462,734号；第5,470,734号；第5,474,935号；第5,482,713号；第5,591,439号；第5,643,579号；第5,650,309号；第5,698,202号；第5,955,088号；第6,034,298号；第6,042,836号；第6,156,319号以及第6,589,529号，所述美国专利各自以引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，核酸疫苗可以进一步包含分子佐剂的编码序列，在一些情况下，分子佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES，并且在一些情况下，分子佐剂是检查点抑制剂，包括抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、抗程序性死亡受体-1(PD-1)以及抗淋巴细胞激活基因(LAG-3)。IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码序列可以包括于包含一种或多种抗原的编码序列的一种或多种核酸分子上。IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码序列可以包括于单独的核酸分子，如单独的质粒上。

本发明的疫苗可以具有有效疫苗所需的特征，如安全，使得疫苗自身不引起疾病或死亡；防止疾病；诱导中和抗体；诱导保护性T细胞反应；以及易施用、几乎没有副作用、生物学稳定性和每剂量成本低。疫苗通过含有如下文所论述的癌症抗原而可以实现这些特征中的一些或全部。

疫苗可以进一步包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子更详细地描述于下文。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分(如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、任何细胞因子、趋化因子或用于免疫细胞增殖和/或分化的信号传导)被遏制的任何核酸或蛋白质。还如下文更详细地描述，疫苗可以进一步与检查点抑制(如PD-1和PDL-1)抗体组合，以增加对细胞与体液免疫反应两者的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体阻止PD-1或PDL-1遏制T细胞和/或B细胞反应。

抗原

如上文所描述，疫苗可以包含抗原或编码抗原的核酸分子。抗原可以是PRAME、其片段、其变异体或其组合。PRAME在睾丸中表达，但典型地不在正常、非癌组织中表达，或以相对小量在正常、非癌组织中表达。PRAME蛋白是视黄酸受体的阻遏子，并且在不受理论束缚的情况下，认为这种阻遏通过阻遏视黄酸诱导的细胞增殖停滞和细胞凋亡赋予癌细胞生长优势。举例来说，PRAME与数种形式的癌症相关并且是已知的癌症抗原。PRAME表达在子宫内膜癌、睾丸癌、黑色素瘤以及卵巢癌中提高。

因此，疫苗可以用于治疗罹患表达PRAME的癌症的个体。疫苗还可以用于治疗患有表达PRAME的癌症或肿瘤的个体或用于预防个体中此类肿瘤的发展。本公开的PRAME抗原不同于原生、“普通”PRAME抗原，并且因此提供针对表达PRAME抗原的肿瘤的疗法或预防。相应地，本文提供了不同于原生PRAME基因的PRAME抗原序列(即，变异PRAME基因或序列)。本发明的一些方面提供包含含有SEQ ID NO:1中所列的核酸序列的核酸分子的疫苗，并且一些方面提供包含含有编码SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列的核酸序列的核酸分子的疫苗。

提供了经分离的核酸分子，其包含上述异源序列。提供了经分离的核酸分子，其由上述异源序列组成。可以将包含上述异源序列的经分离的核酸分子并入到载体中，如质粒、病毒载体和如下文所描述的其它形式的核酸分子中。因此，在本公开的一些实施例中，核酸分子并入到质粒中。在其它实施例中，核酸分子并入到载体中。本公开的一些方面提供组合物，其包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:1或具有编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。

本文提供了具有编码PRAME抗原的序列的核酸分子。在一些实施例中，核酸分子并入到载体，包括(但不限于)质粒或病毒载体中。编码PRAME抗原的编码序列具有如上文所描述的序列。

提供了包含上述异源氨基酸序列的蛋白质分子。提供了由上述异源氨基酸序列组成的蛋白质分子。本文提供了具有上述序列的蛋白质和多肽。本公开的蛋白质和多肽可以被称作PRAME抗原和PRAME免疫原。PRAME抗原能够诱发针对表达PRAME抗原的癌症和/或肿瘤的免疫反应。

在一个方面，期望共有抗原提供改良的转录与翻译，包括具有以下中的一种或多种：低GC含量前导序列以增加转录；mRNA稳定性和密码子优化；以及尽可能地消除顺式作用序列基元(即，内部TATA盒)。

在一些方面，期望产生共有抗原，所述共有抗原产生跨多个株系的广泛免疫反应，具有以下中的一种或多种：并入所有可获得的全长序列；计算机产生的序列，其利用在每个位置最常出现的氨基酸；以及提高株系之间的交叉反应性。

PRAME抗原可以是来源于两种或更多种物种的共有抗原(或免疫原)序列。PRAME抗原可以包含用于改良表达的共有序列和/或修饰。修饰可以包括密码子优化、RNA优化、添加克扎克序列(例如，GCC ACC)以便增加翻译起始，和/或添加免疫球蛋白前导序列以提高PRAME抗原的免疫原性。PRAME抗原可以包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，例如(但不限于)免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。在一些实施例中，PRAME共有抗原可以包含血凝素(HA)标签。PRAME共有抗原可以设计成与对应密码子优化PRAME抗原相比，诱发更强并且更广泛的细胞和/或体液免疫反应。

PRAME共有抗原可以在蛋白质的一个或多个功能域中包含一种或多种变异体，从而与对应密码子优化PRAME抗原相比，诱发更强并且更广泛的细胞和/或体液免疫反应。一种或多种突变可以是对介导与RAR相互作用的PRAME蛋白的域中氨基酸中的一个或多个的取代。

疫苗与免疫检查点抑制剂的组合

疫苗可以进一步包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子更详细地描述于下文。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分(如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、任何细胞因子、趋化因子或用于免疫细胞增殖和/或分化的信号传导)被遏制的任何核酸或蛋白质。

此类抑制剂可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变异体、其片段或其组合。核酸还可以包括编码接头或标签序列的额外序列，所述接头或标签序列通过肽键连接到免疫检查点抑制剂。小分子可以是低分子量(例如小于800道尔顿)有机或无机化合物，其可以充当酶底物、蛋白质或核酸所结合的配体(或其类似物)，或生物过程的调控子。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变异体、其片段或其组合。

在一些实施例中，免疫检查点抑制剂可以是一种或多种核酸序列，其编码抗体、其变异体、其片段或其组合。在其它实施例中，免疫检查点抑制剂可以是抗体、其变异体、其片段或其组合。

1.免疫检查点分子

免疫检查点分子可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变异体、其片段或其组合。核酸还可以包括编码接头或标签序列的额外序列，所述接头或标签序列通过肽键连接到免疫检查点抑制剂。小分子可以是低分子量(例如小于800道尔顿)有机或无机化合物，其可以充当酶底物、蛋白质或核酸所结合的配体(或其类似物)，或生物过程的调控子。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变异体、其片段或其组合。

a.PD-1和PD-L1

免疫检查点分子可以程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)、其片段、其变异体或其组合。PD-1是由PDCD1基因编码的细胞表面蛋白。PD-1是免疫球蛋白超家族的成员并且在T细胞和原B细胞(pro-B cell)上表达，并且因此影响这些细胞的命运和/或分化。确切地说，PD-1是T细胞调控子CD28/CTLA-4家族的1型膜蛋白并且负向调控T细胞受体(TCR)信号，从而负向调控免疫反应。PD-1可以负向调控CD8+T细胞反应，并且因此抑制CD8介导的细胞毒性且增强肿瘤生长。

PD-1具有两种配体：PD-L1和PD-L2，其是B7家族成员。PD-L1响应于LPS和GM-CSF处理，在巨噬细胞和树突状细胞(DC)上得到上调，并且在TCR和B细胞受体信号传导后，在T细胞和B细胞上得到上调。PD-L1由许多肿瘤细胞系表达，包括骨髓瘤、肥大细胞瘤以及黑色素瘤。

2.抗免疫检查点分子抗体

如上文所描述，免疫检查点抑制剂可以是抗体。抗体可以结合抗原(即，上文所描述的免疫检查点分子)或与抗原反应。因此，抗体可以被视为抗免疫检查点分子抗体或免疫检查点分子抗体。抗体可以由所含的核酸序列编码。

抗体可以包括重链多肽和轻链多肽。重链多肽可以包括重链可变(VH)区和/或至少一个重链恒定(CH)区。至少一个重链恒定区可以包括重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)和/或铰链区。

在一些实施例中，重链多肽可以包括VH区和CH1区。在其它实施例中，重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区以及CH3区。

重链多肽可以包括互补决定区(“CDR”)集合。CDR集合可以含有VH区的三个高变区。从重链多肽的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以促成抗原的结合或识别。

轻链多肽可以包括轻链可变(VL)区和/或轻链恒定(CL)区。轻链多肽可以包括互补决定区(“CDR”)集合。CDR集合可以含有VL区的三个高变区。从轻链多肽的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以促成抗原的结合或识别。

抗体可以包含分别插入于重链与轻链框架(“FR”)集合之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)集合，所述框架集合为CDR提供支撑并且限定CDR相对于彼此的空间关系。CDR集合可以含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N端开始，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可以包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR集合。

抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE以及IgG。免疫球蛋白可以包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区以及CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包括VL区和CL区。

另外，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先使IgG分子裂解以产生数个片段，其中两者(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。酶胃蛋白酶能够使IgG分子裂解以提供数个片段，包括F(ab')₂片段，其包含两个抗原结合位点。因此，抗体可以是Fab或F(ab')2。Fab可以包括重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可以包括VH区和CH1区。Fab的轻链可以包括VL区和CL区。

抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人类抗体、人源化抗体或完全人类抗体。人源化抗体可以是来自非人类物种的抗体，其结合所期望抗原，具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区。

a.PD-1抗体

抗免疫检查点分子抗体可以是抗PD-1抗体(在本文中也称为“PD-1抗体”)、其变异体、其片段或其组合。PD-1抗体可以是纳武单抗(Nivolumab)。抗PD-1抗体可以抑制PD-1活性，从而诱导、诱发或增加针对肿瘤或癌症的免疫反应并且减少肿瘤生长。

b.PD-L1抗体

抗免疫检查点分子抗体可以是抗PD-L1抗体(在本文中也称为“PD-L1抗体”)、其变异体、其片段或其组合。抗PD-L1抗体可以抑制PD-L1活性，从而诱导、诱发或增加针对肿瘤或癌症的免疫反应并且减少肿瘤生长。

载体

疫苗可以包含一种或多种载体，所述载体包括编码PRAME抗原的异源核酸。一种或多种载体可能能够以可有效诱发哺乳动物的免疫反应的数量表达抗原。载体可以包含编码抗原的异源核酸。载体可以具有含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是自复制染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。

一种或多种载体可以是表达构建体，其一般是用于将特定基因引入到靶细胞中的质粒。一旦表达载体到达细胞内部，则通过细胞转录与翻译机制产生由基因编码的蛋白质。质粒常常被工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区并且使表达载体上所携带的基因有效转录。本发明的载体表达大量的稳定信使RNA，并且因此表达大量的蛋白质。

载体可以具有表达增强子，如强启动子、强终止密码子，启动子与克隆基因之间的距离调整，以及插入转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列)。

载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒或线性核酸能够引导特定核苷酸序列在适当的个体细胞中的表达。载体可以具有可操作地连接到编码抗原的核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接到终止信号。载体还可以含有核苷酸序列正确翻译所需的序列。载体可以包含将所期望片段克隆到载体中所需或提高克隆所期望片段到载体中的效率的序列，包括(但不限于)PRAME抗原或其它编码序列、调控序列以及选择和/或筛选标记物编码序列。包含所关注核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着载体组分中的至少一种相对于载体其它组分中的至少一种是异源的。核苷酸序列在表达盒中的表达可以处于组成型启动子或诱导型启动子的控制下，诱导型启动子仅当宿主细胞暴露于某一特定外部刺激时才起始转录。在多细胞生物体的情况下，启动子还可以对特定组织或器官或发育阶段具有特异性。

载体可以是质粒。质粒可以适用于用编码PRAME抗原的核酸转染细胞，并且转化宿主细胞在发生抗原表达的条件下培养并且维持。

质粒可以包含编码本文所公开的PRAME抗原中的一种或多种的核酸序列，包括编码能够诱发针对抗原的免疫反应的合成共有抗原、此类蛋白质的片段、此类蛋白质的变异体、变异体片段或融合蛋白的编码序列，所述融合蛋白由共有蛋白和/或共有蛋白的片段和/或共有蛋白的变异体和/或变异共有蛋白的片段的组合构成。

单一质粒可以含有单一抗原的编码序列、两种抗原的编码序列、三种抗原的编码序列或四种抗原的编码序列。

在一些实施例中，质粒可以进一步包含单独或作为这些质粒之一的一部分的编码CCR20的编码序列。类似地，质粒可以进一步包含IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列。

质粒可以进一步包含可以位于编码序列上游的起始密码子，和可以位于编码序列下游的终止密码子。起始和终止密码子可以与编码序列同框。

质粒还可以包含可操作地连接到编码序列的启动子。可操作地连接到编码序列的启动子可以是猴病毒40(SV40)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子(如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(如CMV即刻早期启动子)、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus；EBV)启动子，或劳氏肉瘤病毒(Roussarcoma virus；RSV)启动子。启动子还可以是来自人类基因(如人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸或人类金属硫蛋白)的启动子。启动子还可以是天然或合成的组织特异性启动子，如肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例描述于美国公开第2004/0175727号中，其内容全文并入本文中。

质粒还可以包含可以位于编码序列下游的聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人类生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号，或人类β-球蛋白聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司(Invitrogen,San Diego,CA))的聚腺苷酸化信号。

质粒还可以包含编码序列上游的增强子。增强子可以是人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。聚核苷酸功能增强子描述于美国专利第5,593,972号；第5,962,428号；和W094/016737中，其各自的内容以引用的方式完全并入。

质粒还可以包含哺乳动物复制起点，以便在染色体外维持质粒并且在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是pVAXI、pCEP4或pREP4(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)。质粒可以包含埃-巴二氏病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其可在不整合的情况下产生高拷贝游离型复制。质粒的骨架可以是pAV0242。质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)质粒。

质粒还可以包含调控序列，其可能较适合于在含有质粒的细胞中的基因表达。编码序列可以包含可以使得编码序列在宿主细胞中更有效转录的密码子。

编码序列还可以包含免疫球蛋白(Ig)前导序列。前导序列可以位于编码序列的5'。由这个序列编码的共有抗原可以包含N端Ig前导序列，继之为共有抗原蛋白。N端Ig前导序列可以是IgE或IgG。

质粒可以是pSE420(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)，其可以用于在大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)中产生蛋白质。质粒还可以是pYES2(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)，其可以用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中产生蛋白质。质粒还可以是MAXBAC^TM完整杆状病毒表达系统(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)的质粒，其可以用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒还可以是pcDNA I或pcDNA3(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)，其可以用于在哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞)中产生蛋白质。

载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中来转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。

载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。

本文还提供了一种线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效递送到个体中并且表达一种或多种所期望抗原。LEC可以是不含任何磷酸骨架的任何线性DNA。DNA可以编码一种或多种抗原。LEC可以含有启动子、内含子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。抗原表达可以通过启动子控制。LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可以不含有与所期望的抗原基因表达无关的其它核酸序列。

LEC可以来源于能够线性化的任何质粒。质粒可能能够表达抗原。质粒可以是pNP(波多黎各(Puerto Rico)/34)或pM2(新喀里多尼亚(New Caledonia)/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别来源于pNP(波多黎各/34)或pM2(新喀里多尼亚/99)。

载体可以具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达和调控分离的核酸表达的任何启动子。此类启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件，所述RNA聚合酶转录本文所描述的抗原序列。用于引导异源核酸表达的启动子的选择视具体应用而定。启动子在载体中的位置距转录起始的距离可以与其在自然环境中距转录起始位点的距离大致相同。然而，可以适应这一距离的变化而不损失启动子功能。

启动子可以可操作地连接到编码抗原的核酸序列以及转录物有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。

启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或显示对真核细胞中的表达有效的另一启动子。

载体可以包括增强子和具有功能剪接供体和受体位点的内含子。载体可以含有结构基因下游的转录终止区以实现有效终止。终止区可以获自与启动子序列相同的基因或可以获自不同基因。

制备载体的方法

本文提供了制备载体的方法，所述载体包含编码本文所论述的PRAME抗原的核酸分子。可以使用所属领域中已知的方法，使用最终亚克隆到哺乳动物表达质粒的步骤之后的载体接种大型发酵罐中的细胞培养物。

供与下文更详细地描述的EP装置一起使用的载体可以使用已知装置和技术的组合配制或制造，但其优选使用优化质粒制造技术制造，所述技术描述于经许可、同在申请中的2008年5月23日提交的美国申请第12/126,611号中。在一些实例中，这些研究中所使用的编码PRAME抗原的核酸分子可以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除美国申请第60/939,792号中所描述的装置和方案以外，制造技术还包括或并入有所属领域的技术人员通常已知的各种装置和方案，包括2007年7月3日颁发的经许可专利美国专利7,238,522中所描述的装置和方案。以上提及的申请和专利、美国申请第60/939,792号以及美国专利7,238,522分别全文并入本文中。

疫苗的赋形剂和其它组分

疫苗可以进一步包含医药学上可接受的赋形剂。医药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，如媒剂、载剂或稀释剂。医药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freunds incompleteadjuvant)、LPS类似物(包括单磷酰脂质A、胞壁酰基肽)、醌类似物、囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且所述聚-L-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A、胞壁酰基肽)、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸也可以结合基因构建体施用。DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂，如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或所属领域中已知的其它脂质体作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)；钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。转染剂在疫苗中的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

医药学上可接受的赋形剂可以是一种或多种佐剂。佐剂可以是替代质粒中表达或作为蛋白质与上述质粒的组合在疫苗中递送的其它基因。一种或多种佐剂可以选自由以下组成的组：CCL20、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、胸腺上皮表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、MHC、CD80、CD86、IL-l、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-28、IL-33、MCP-1、MIP-la、MIP-1～、IL-8、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱氨酸蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2、IL-15，其已缺失信号序列或编码信号序列的编码序列并且任选地包括不同信号肽(如来自IgE的信号肽)，或编码不同信号肽(如来自IgE的信号肽)的编码序列，和其功能片段，或其组合。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、IL-33、CTACK、TECK、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

在一些实施例中，佐剂可以是一种或多种蛋白质和/或编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质选自由以下组成的组：CCL-20、IL-12、IL-15、IL-28、IL-33、CTACK、TECK、MEC或RANTES。IL-12构建体和序列的实例在以下中公开：PCT申请第PCT/US1997/019502号和对应的美国申请第08/956,865号；和2012年12月11日提交的PCT申请第PCT/US2012/069017号，和对应的2014年6月12日提交、2011年12月12日提交的美国申请第14/365,086号，以及2016年2月26日提交的美国申请第15/055,002号，所述申请各自以引用的方式并入本文中。IL-15构建体和序列的实例在以下中公开：PCT申请第PCT/US04/18962号和对应的美国申请第10/560,650号；和PCT申请第PCT/US07/00886号和对应的美国申请第12/160,766号；以及PCT申请第PCT/US10/048827号，所述申请各自以引用的方式并入本文中。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US09/039648号和对应的美国申请第12/936,192号中，所述申请各自以引用的方式并入本文中。RANTES和其它构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1999/004332和对应的美国申请第09/622,452号中，所述申请各自以引用的方式并入本文中。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请第PCT/US11/024098号中，所述申请以引用的方式并入本文中。RANTES和其它构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1999/004332和对应的美国申请第09/622,452号中，所述申请各自以引用的方式并入本文中。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请第PCT/US11/024098号中，所述申请以引用的方式并入本文中。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US2005/042231号和对应的美国申请第11/719,646号中，所述申请各自以引用的方式并入本文中。OX40和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请第10/560,653号中，所述申请以引用的方式并入本文中。DR5和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请第09/622,452号中，所述申请以引用的方式并入本文中。

可以适用作佐剂的其它基因包括编码以下的基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱氨酸蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能片段。

疫苗可以进一步包含如1994年4月1日提交的美国申请第021,579号中所描述的基因疫苗促进剂，所述申请以引用的方式完全并入。

疫苗可以约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；或优选约0.1微克到约10毫克；或更优选约1毫克到约2毫克的数量包含抗原和质粒。在一些优选实施例中，根据本发明的疫苗包含约5纳克到约1000微克的核酸分子。在一些优选实施例中，疫苗可以含有约10纳克到约800微克的核酸分子。在一些优选实施例中，疫苗可以含有约0.1微克到约500微克的核酸分子。在一些优选实施例中，疫苗可以含有约1微克到约350微克的核酸分子。在一些优选实施例中，疫苗可以含有约25微克到约250微克、约100微克到约200微克、约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；约0.1微克到约10毫克；约1毫克到约2毫克、约5纳克到约1000微克、约10纳克到约800微克、约0.1微克到约500微克、约1微克到约350微克、约25微克到约250微克、约100微克到约200微克的抗原或其质粒。

疫苗可以根据待使用的施用模式配制。可注射的疫苗医药组合物可以是无菌的、不含热原质的以及不含微粒的。可以使用等渗配制物或溶液。等渗性添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。疫苗可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗可以进一步包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可以使配制物在室温或环境温度下稳定延长的时间段，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

疫苗的医药组合物

疫苗可以呈医药组合物的形式。医药组合物可以包含疫苗。医药组合物可以包含约5纳克(ng)到约10毫克(mg)的疫苗核酸分子。在一些实施例中，根据本发明的医药组合物包含约25ng到约5mg的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约50ng到约1mg的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约0.1微克到约500微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约1微克到约350微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约5微克到约250微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约10微克到约200微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约15微克到约150微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约20微克到约100微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约25微克到约75微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约30微克到约50微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约35微克到约40微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约100微克到约200微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约10微克到约100微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约20微克到约80微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约25微克到约60微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约30ng到约50微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约35ng到约45微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约0.1微克到约500微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约1微克到约350微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约25微克到约250微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约100微克到约200微克的疫苗核酸分子。

在一些实施例中，根据本发明的医药组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物可以包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗DNA。在一些实施例中，医药组合物可以包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗核酸分子。

在其它实施例中，医药组合物可以包含至多并且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物可以包含至多并且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物可以包含至多并且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg的疫苗核酸分子。

根据待使用的施用模式，医药组合物可以进一步包含用于配制目的的其它试剂。在医药组合物是可注射医药组合物的情况下，其为无菌的、不含热原质的以及不含微粒的。优选使用等渗配制物。一般来说，等渗性添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。在一些情况下，优选等渗溶液，如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施例中，将血管收缩剂添加到配制物中。

疫苗可以进一步包含医药学上可接受的赋形剂。医药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，如载剂、佐剂、载剂或稀释剂。医药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂。

在一些实施例中，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。在一个实施例中，转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且更优选地，所述聚-L-谷氨酸盐以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A、胞壁酰基肽)、醌类似物以及囊泡(角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸也可以结合基因构建体施用。在一些实施例中，转染促进剂可以包含脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或所属领域中已知的其它脂质体作为DNA-脂质体混合物(参见例如WO/9324640)；钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。转染剂在疫苗中的浓度可以小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

疫苗接种的方法

本文提供了使用上文所描述的医药配制物治疗和/或预防表达PRAME的癌症的方法。本文还描述了使用上文所描述的医药配制物治疗和/或预防个体的表达PRAME的癌症的方法。本文还描述了对个体进行疫苗接种的方法。本文还描述了向有需要的个体施用本文所描述的医药配制物的方法。本文所描述的方法(统称为使用本文所描述的医药配制物治疗的方法)可以包含向有需要的个体施用一种或多种如本文所描述的疫苗以诱导治疗性和/或预防性免疫反应。可以向个体施用疫苗以调节个体的免疫系统的活性并且增强免疫反应。疫苗的施用可以是将如本文所公开的癌症抗原以核酸分子的形式转染，所述核酸分子在经转染细胞中表达并且递送到细胞表面，随即免疫系统识别抗原并且诱导细胞、体液反应或细胞与体液反应。疫苗的施用通过向个体施用如本文所论述的疫苗而可以用于诱导或诱发个体产生针对如本文所公开的癌症抗原中的一种或多种的免疫反应。

可以向个体施用疫苗以调节个体的免疫系统的活性，从而增强免疫反应。在一些实施例中，个体是哺乳动物。向哺乳动物施用疫苗并且从而将载体引入到哺乳动物细胞中之后，经转染的细胞将表达并且分泌如本文所公开的癌症抗原中的一种或多种。这些分泌蛋白或合成抗原将被免疫系统识别为外来物质，这将建立免疫反应，其可以包括：针对一种或多种癌症抗原产生的抗体，和特异性针对一种或多种癌症抗原的T细胞反应。在一些实例中，接种本文所论述的疫苗的哺乳动物将具有预致敏的免疫系统并且当用一种或多种如本文所公开的癌症抗原攻击时，预致敏的免疫系统将使得可快速清除后续的如本文所公开的癌症抗原，不论通过体液、细胞免疫反应，还是细胞与体液免疫反应两者。

施用疫苗核酸分子的方法描述于美国专利第4,945,050号和第5,036,006号中，所述专利均以全文引用的方式并入本文中。

可以向哺乳动物施用疫苗以诱发哺乳动物的免疫反应。哺乳动物可以是人类、非类人灵长类动物、奶牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科动物、鹿、刺猬、象、大羊驼(llama)、羊驼(alpaca)、小鼠、大鼠，并且优选人类、奶牛或猪。可以同样地向非哺乳动物个体(例如，鸡)施用疫苗，以诱发免疫反应。

疫苗剂量可以在1微克与10mg活性组分/千克(kg)体重/时间(组分/kg体重/时间)之间，并且可以是20微克到10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次剂量。

利用疫苗产生免疫反应的方法

疫苗可以用于在哺乳动物或非哺乳动物个体中产生免疫反应，包括治疗性或预防性免疫反应。免疫反应可以产生针对一种或多种如本文所公开的癌症抗原的抗体和/或杀手T细胞。此类抗体和T细胞可以经分离。

一些实施例提供了产生针对如本文所公开的癌症抗原中的一种或多种的免疫反应的方法，所述实施例包含向个体施用疫苗。一些实施例提供了针对癌症或肿瘤对个体进行预防性疫苗接种的方法，所述癌症或肿瘤表达如上文所描述的癌症抗原中的一种或多种，所述实施例包含施用疫苗。一些实施例提供了对个体进行治疗性疫苗接种的方法，所述个体已罹患表达癌症抗原中的一种或多种的癌症或肿瘤，所述实施例包含施用疫苗。在施用疫苗之前，可以常规地诊断表达一种或多种如本文所公开的癌症抗原的癌症或肿瘤。

利用疫苗进行癌症治疗的方法

疫苗可以用于在有需要的哺乳动物或个体中产生或诱发免疫反应，所述免疫反应对HPV介导的表达PRAME的癌症(如(但不限于)卵巢癌，并且尤其上皮卵巢癌)具有反应性，或针对所述癌症。所诱发的免疫反应可以阻止癌症或肿瘤生长。所诱发的免疫反应可以阻止和/或减少癌细胞或肿瘤细胞转移。因此，疫苗可以用于治疗和/或预防施用疫苗的哺乳动物或个体的癌症或肿瘤的方法。

在一些实施例中，所施用的疫苗可以如下介导肿瘤细胞的清除或阻止肿瘤细胞生长：(1)通过B细胞反应来诱导体液免疫以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生的抗体，从而阻滞骨髓源遏制细胞(MDSC)并且遏制肿瘤生长；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞，如CD8⁺(CTL)以攻击并且杀死肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞反应；以及(4)通过IFN-γ和TFN-α增加炎性反应，或优选所有前述内容。

在一些实施例中，免疫反应可以产生体液免疫反应和/或抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，所述反应对施用疫苗的个体的各种组织或系统(例如，脑或神经系统等)不产生损伤或使其发炎。

在一些实施例中，所施用的疫苗可以提高个体的无肿瘤生存率，减少个体的肿瘤质量，或其组合。所施用的疫苗可以使个体的无肿瘤生存率提高20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％以及60％。在免疫接种之后，所施用的疫苗可以使个体的肿瘤质量减少20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％以及70％。所施用的疫苗可以阻止并且阻断PRAME介导对视黄酸受体的抑制。

在一些实施例中，可以将疫苗施用于外周(如下文更详细地描述)以建立靶向癌或肿瘤细胞或组织的抗原特异性免疫反应，从而清除或消除表达一种或多种癌症抗原的癌症或肿瘤而不损伤施用疫苗的个体或导致施用疫苗的个体患病或死亡。

所施用的疫苗可以使个体的细胞免疫反应提高约50倍到约6000倍、约50倍到约5500倍、约50倍到约5000倍、约50倍到约4500倍、约100倍到约6000倍、约150倍到约6000倍、约200倍到约6000倍、约250倍到约6000倍或约300倍到约6000倍。在一些实施例中，所施用的疫苗可以使个体的细胞免疫反应提高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

所施用的疫苗可以使个体的干扰素γ(IFN-γ)水平提高约50倍到约6000倍、约50倍到约5500倍、约50倍到约5000倍、约50倍到约4500倍、约100倍到约6000倍、约150倍到约6000倍、约200倍到约6000倍、约250倍到约6000倍或约300倍到约6000倍。在一些实施例中，所施用的疫苗可以使个体的IFN-γ水平提高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

疫苗剂量可以在1微克与10mg活性组分/千克(kg)体重/时间(组分/kg体重/时间)之间，并且可以是20微克到10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次剂量。

施用途径

疫苗或医药组合物可以通过不同途径施用，包括口服、肠胃外、舌下、透皮、直肠、经粘膜、体表、经由吸入、经由颊内施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内和/或关节内，或其组合。对于兽用，组合物可以根据普通兽医学实践作为可合适接受的配制物施用。兽医可容易地确定最适于特定动物的给药方案和施用途径。可以通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪(microprojectile bombardment gene gun)”或其它物理方法(如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波)施用疫苗。

疫苗的载体可以通过数种众所周知的技术向哺乳动物施用，包括DNA注射(也称为DNA疫苗接种)伴随和不伴随体内电穿孔、脂质体介导的转染、纳米粒子促进的转染，以及使用重组载体，如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。疫苗的一种或多种癌症抗原可以通过DNA注射连同体内电穿孔施用。

电穿孔

疫苗或医药组合物可以通过电穿孔施用。通过电穿孔施用疫苗可以使用电穿孔装置实现，所述电穿孔装置可以被配置成向所期望的哺乳动物组织递送可在细胞膜中有效引起可逆孔隙形成的能量脉冲，并且优选地，所述能量脉冲是类似于用户输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置可以包含电穿孔组件和电极组合件或手柄组合件。电穿孔组件可以包括并且并入有电穿孔装置的多个元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器组件、电源以及电源开关。电穿孔可以使用体内电穿孔装置实现，例如

EP系统(宾夕法尼亚州蓝铃市(Blue Bell,PA)Inovio制药公司(Inovio Pharmaceuticals,Inc.))或Elgen电穿孔器(Inovio制药公司)，以促进质粒转染细胞。

可以使本发明的DNA疫苗的施用便利的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括美国专利7,245,963；美国公开第2005/0052630号中所描述的那些，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。可以用于使DNA疫苗的施用便利的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括以下中所提供的那些：同在申请中并且共同拥有的2007年10月17日提交的美国专利申请第11/874,072号、2006年10月17日提交的美国申请第60/852,149号以及2007年10月10日提交的美国申请第60/978,982号，所述申请均全文并入本文中。

美国专利7,245,963描述模块化电极系统和其用途，其用于使得便于将生物分子引入到身体或植物中选定组织的细胞中。模块化电极系统可以包含多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；以及电源。操作人员可以握住安装在支撑结构上的多个针电极并且将其牢固地插入身体或植物中的选定组织中。随后通过皮下注射针将生物分子施用于选定组织中。将可编程恒流脉冲控制器激活并且将恒流电脉冲施加到多个针电极。施加的恒流电脉冲便于将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利7,245,963的完整内容以全文引用的方式并入本文中。

美国公开第2005/0052630号描述电穿孔装置，其可以用于有效便于将生物分子引入到身体或植物中选定组织的细胞中。所述电穿孔装置包含电动装置(“EKD装置”)，其操作通过软件或固件来指定。所述EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输入，在阵列中的电极之间产生一系列可编程恒流脉冲图案，并且使得能够存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包含具有针电极阵列的可更换电极盘、用于注射针的中心注射通道，以及可拆卸式导引盘。美国公开第2005/0052630号的完整内容以引用的方式完全并入本文中。

美国专利7,245,963和美国公开第2005/0052630号中所描述的电极阵列和方法可以适用于不仅深穿透到如肌肉的组织中，而且深穿透到其它组织或器官中。归因于电极阵列的配置，注射针还完全插入到靶器官中，并且在由电极预先划定的区域中，注射垂直于靶对象施用。美国专利第7,245,963号和美国公开第2005/005263号中所描述的电极优选是20mm长和21号规格。

另外，并入有电穿孔装置和其用途的一些实施例中涵盖电穿孔装置，其为以下专利中所描述的电穿孔装置：1993年12月28日颁发的美国专利5,273,525；2000年8月29日颁发的美国专利6,110,161；2001年7月17日颁发的美国专利6,261,281；2005年10月25日颁发的美国专利6,958,060；以及2005年9月6日颁发的美国专利6,939,862。此外，本文所涵盖的专利涵盖2004年2月24日颁发的美国专利6,697,669中所提供的主题，其涉及使用多种装置中的任一种施用DNA；和2008年2月5日颁发的美国专利7,328,064，其涉及注射DNA的方法。以上专利以全文引用的方式并入。

制备疫苗的方法

本文提供了制备载体的方法，所述载体包括在本文所论述的疫苗中。可以使用所属领域中已知的方法，使用最终亚克隆步骤之后的载体接种大型发酵罐中的细胞培养物。

供与本发明的EP装置一起使用的DNA质粒可以使用已知装置和技术的组合配制或制造，但其优选使用优化质粒制造技术制造，所述技术描述于2007年5月23日提交的美国公开第2009/0004716号中。在一些实例中，这些研究中所使用的DNA质粒可以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除美国申请第60/939,792号中所描述的装置和方案以外，制造技术还包括或并入有所属领域的技术人员通常已知的各种装置和方案，包括2007年7月3日颁发的经许可专利美国专利7,238,522中所描述的装置和方案。以上提及的申请和专利、美国申请第60/939,792号以及美国专利7,238,522分别全文并入本文中。

本发明具有多个方面，其通过以下非限制性实例说明。

实例

本发明在以下实例中进一步说明。应理解，这些实例虽然指示本发明的优选实施例，但仅为了说明而给出。根据以上论述和这些实例，所属领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，所属领域的技术人员根据前文描述将显而易知除本文所示和所描述之外的本发明的各种修改。此类修改也意图在所附权利要求书的范围内。

实例1

合成共有PRAME

为了产生人类共有PRAME，从基因库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中收集10种PRAME序列。选定PRAME序列的基因库登录号是：

NP_006106.1、AFX65483.1、XP_001090516.1、AFI35054.1、AFJ71405.1、XP_003805956.1、XP_525643.2、BAK62424.1、XP_003919211.1以及XP_003919212.1。

共有序列使用

Lasergene软件包(13.0.0.357版)产生。将上文所列的序列导入MegAlign并且使用ClustalW多序列比对程序比对。所得PRAME序列与原生人类PRAME序列具有95.1％-95.5％同源性。

一旦获得合成共有PRAME DNA序列，则为了具有较高表达水平，将上游克扎克序列和IgE前导序列添加到N端。另外，这种基因的密码子使用适于智人基因的密码子偏倚(codon bias)。另外，进行RNA优化：避开具有极高(>80％)或极低(<30％)GC含量的区，和顺式作用序列基元，如内部TATA盒、chi位点以及核糖体进入位点。为了消除所表达的PRAME分子在视黄酸信号传导阻遏中的潜在功能，在PRAME的核受体盒LRELL中引入两个点突变(L487V和L488V)，产生经修饰的合成共有PRAME。这种经修饰的合成共有PRAME蛋白序列与人类原生PRAME蛋白具有94.7％-95.1％一致性。合成共有PRAME的特征提供于表1中。

表1：合成共有PRAME的特征

参看图2，经修饰的共有PRAME与五种人类PRAME序列的序列比对示出序列之间的氨基酸差异。经修饰的合成共有PRAME的氨基酸残基487和488处的亮氨酸被缬氨酸取代是突出的氨基酸残基差异之一。比对序列之间的一致性百分比呈现于表2中。

表2：经修饰的共有PRAME与人类PRAME的一致性百分比

	1	2	3	4	5
							1		95.1	94.7	94.9	94.9	PRAMEmut-GenScript.pro
2	5.1		99.6	99.8	99.8	huPRAME(AAH39731.pro)
							3	5.5	0.4		99.8	99.8	huPRAME(AFX65483).pro
4	5.3	0.2	0.2		100	huPRAME(NP_006106).pro
							5	5.3	0.2	0.2	0.0		huPRAME(78395).pro

未经修饰的合成共有PRAME与经修饰的共有PRAME的比较提供于表3中。

表3：经修饰的共有PRAME与未经修饰的共有PRAME的比较

参看图3，所合成的合成共有PRAME用BamHI和XhoI消化，并且克隆到Inovio的表达载体pGX0001中，其中表达盒置于巨细胞病毒即刻早期启动子的转录控制下。所得质粒被命名为pGX1421，并且进行全长测序以确认序列。

pGX1421是编码合成共有PRAME蛋白的DNA质粒。相关mRNA产生由人类CMV启动子(hCMV启动子)驱动并且通过牛生长激素3'端聚腺苷酸化信号(bGH polyA)终止。出于生产目的，pGX0001骨架(经修饰的pVAX1表达载体，初始pVAX1获自密苏里州圣路易斯赛默飞世尔(ThermoFisher,St.Louis,MO))包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUCori)。那些元件在真核细胞中不具有功能。

将修饰引入到pVAX1中以建立pGX0001并且基于可获自赛默飞世尔科学(ThermoFisher Scientific)的pVAX1的所报道序列进行鉴别。这些修饰列于以下，并且未检测到关于质粒扩增和抗原转录与翻译的问题。

C>G 241在CMV启动子中

C>T 1158骨架，在牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH polyA)下游

A>-2092骨架，在卡那霉素抗性基因下游

C>T 2493在pUC复制起点(pUC ori)中

G>C 2969在RNASeH位点上游的pUC Ori的最末端

在CMV启动子上游的骨架中，碱基对2、3和4从ACT改变为CTG。

实例2

PRAME表达

在经编码合成共有PRAME的质粒(pGX1411)或对照转染的细胞系中检查PRAME表达，以确定合成抗原是否表达。使用市售抗PRAME抗体和β-肌动蛋白对照抗体进行细胞系的蛋白质印迹分析，显示仅有用pGX1411转染的那些细胞展现以正确分子量迁移的PRAME蛋白的表达(图4)。间接免疫荧光分析比较横纹肌肉瘤细胞和Hek293细胞中的PRAME基因表达与pVAX表达。参看图5，合成共有PRAME在两个细胞系中表达，而pVAX阴性对照不表达。

实例3

小鼠中的免疫原性

根据图6中所描绘的免疫接种和采血时程，在C57Bl/6小鼠中进行免疫原性研究。简单来说，在时间点第0周(初始免疫接种)、第2周、第4周以及ELISpot向小鼠施用每次免疫接种5、10、15、25以及50μg pGX1411的剂量。在时间点第0周(基线测量)和第5周对小鼠进行采血。最初进行剂量反应研究以确定最有效的剂量，并且参看图7，与未经处理

相比，所有研究的剂量都引起更大的反应。存在响应于逐渐增加、最多15μgpGX1411DNA的剂量的轻微增加。在25和50μg pGX1411DNA的更高剂量下，反应到达平线区。

合成共有PRAME在小鼠中具有高免疫原性(图8A)，并且通过表位作图鉴别免疫显性表位(图8B和表4)。简单来说，产生跨越整个共有PRAME、各自含有15个氨基酸残基、有8个氨基酸的重叠的肽。将这些肽合并到3个肽池中(表4)。在小鼠IFNγELISpot分析中，将来自未经处理的小鼠和经pGX1411免疫接种的小鼠的脾细胞用3个肽池刺激。结果显示于图8A中。使用肽矩阵作图方法鉴别免疫显性表位(图8B)。表4中免疫显性表位带下划线。

表4.经pGX1411免疫接种的小鼠中所鉴别的免疫显性表位

(先前公开的HLA-A*02限制性PRAME肽：ALYVDSLFFL、VLDGLDVLL、SLYSFPEA、SLLQHILGL以及NLTHVLYPV(Quintarelli等人2011))。

通过对来自未经处理的小鼠和经pGX1411处理的小鼠的经肽刺激的脾细胞进行细胞内细胞因子染色，评定由pGX1411诱导的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞反应。来自经pGX1411处理的小鼠的CD4+细胞显示用pGX1411处理后较小、不过显著的IFN-γ增加(图9A)，而CD8+细胞引起超过几乎10倍的显著增加(图9B)。对于TNF-α和CD107a+，CD8+细胞在pGX1411处理的情况下引起显著更大增加(图9D和9F)，而对于CD4+细胞，未经处理与pGX1411处理之间无差异(图9C和9E)。总的来说，合成共有PRAME诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞两者，其中CD8+显示更高的细胞因子反应。

如图10中所显示，对pGX1411以剂量反应方式，即5、25以及50μg测定终点滴度。与未经处理相比，所检查的每个剂量提高终点滴度，不过增加剂量并不显著提高终点滴度反应。为了确定pGX1411诱导的抗体是否可识别人类癌症中表达的原生PRAME，通过免疫组织化学研究pGX1411在癌症中的反应性，如图11中所显示。将来自人类癌症活检的组织切片用来自未经处理的小鼠或经pGX1411处理的小鼠的血清染色。用生物素标记第二抗体处理后，将组织切片用二氨基联苯胺伴随过氧化氢染色，并且用苏木精复染。利用商业PRAME抗体进行的组织染色用作比较物。在经pGX1411疫苗接种的小鼠血清和商业PRAME抗体的情况下，在黑色素瘤癌症组织样品中检测到阳性染色，但在未经处理的小鼠血清的情况下未检测到阳性染色。因此，用pGX1411进行疫苗接种能够诱导PRAME特异性抗体。

pGX1421所编码的经修饰的合成共有PRAME诱导免疫反应，其类似于由pGX1411所编码的未经修饰的合成共有PRAME产生的免疫反应。参看图12，当在小鼠中通过ELISpot进行研究时，这种由pGX1421诱发的免疫反应与由pGX1411诱发的免疫反应相当。与未经处理的基线水平(0个斑点形成单位(SFU)/10⁶个外周血单核细胞(PBMC))相比，pGX1411和pGX1421在5μg的剂量下都产生大致900SFU/10⁶个PBMC。

实例4

非人类灵长类动物(NHP)中的免疫原性

根据图13中所描绘的免疫接种和采血时程，在非人类灵长类动物(NHP)中进行免疫原性研究。在第0周、第4周、第8周以及第12周在交替对侧肢体用5P

肌肉内(IM)递送pGX1421以及优化恒河猴IL-12(pGX6006)，在免疫接种之后每2周采血。参看图14A到14C，通过IFNγELISpot、ICS评估细胞免疫原性，并且测得的IFNγ反应展现伴随四次用pGX1421和pGX6006进行的免疫接种的整体提高。在第三次免疫接种之后，与基线水平相比，IFNγ增加到大致600SFU/10⁶个PBMC。与第三次免疫接种相比，第四次免疫接种略微增强反应，具有大致700SFU/10⁶个PBMC(图14A)。图14B和14C中显示个体反应，其中在第三次免疫接种之后，六只NHP中的两只具有超过平均的反应。在第四次免疫接种之后，这增加到六只NHP中的三只具有超过平均的反应。总的来说，如通过第三次免疫接种后两周(第10周)的IFNγELISpot所测定，与第0周相比，六只NHP中的六只起反应。

参看图15A-15D，与CD8⁺T细胞反应相比，pGX1421和pGX6006诱导极小CD4⁺T细胞反应。在任何NHP中未见CD4⁺T细胞反应，但通过ICS检测到NHP中的稳健CD8⁺T细胞反应，其中第四次免疫接种之后两周的最高IFNγELISpot反应出现在NHP 5840和5967中(图15C)。

实例5

表征pGX6006对PRAME诱导的免疫原性的佐剂效应

将十五只NHP分成如表5中所示的三组以测定pGX6006的佐剂效应。对于所有三组，免疫接种和采血时程相同，并且所述时程在图13中描绘。

表5.研究组

参看图16A-16C，PD3两周(第10周)和PD4两周(第14周)，IL-12显著提高对pGX1421所编码的PRAME的IFNγ反应。第三次免疫接种之后，由单独的pGX1421诱导的平均IFNγSFU(108±124)显著低于由pGX1421与pGX6006一起诱导的平均反应(609±597，p<0.08)。第四次免疫接种之后，第2组中的IFNγ反应增强(1636±999SFU，p<0.08，图16C)。

由pGX1421和pGX1421与pGX6006组合诱导的细胞免疫反应进一步通过流式细胞术在PD4两周(第14周)表征(图17A-17C)。如图17A中所显示，在任一组中，在CD4⁺T细胞隔室中检测到极小反应。当pGX1421不伴随pGX6006施用时，在CD8⁺T细胞隔室中检测到极小反应(图17B)。PD4两周在pGX1421与pGX6006组合组中检测到的PRAME特异性CD8+T细胞群的大部分产生IFNγ和TNFα两者。细胞群的其余部分主要对单独的IFNγ产生呈阳性。由pGX1421与pGX6006组合诱导的抗原特异性CD8+T细胞的大部分对CD107a和颗粒酶B两者呈阳性，表明对CTL和效应功能的潜能(图17C)。

将由pGX1411与pGX6006组合和pGX1421与pGX6006组合诱导的细胞免疫反应通过IFNγELISpot(图18A-18C)并且通过流式细胞术在PD4两周(第14周，图19A-19F)进行比较。PD3两周由PGX1411与pGX6006组合诱导的PRAME特异性IFNγ反应(666±597SFU)和PD4两周的反应(1931±2795SFU)与pGX1421与pGX6006组合(PD3：609±597；PD4：1636±999SFU)相当。在研究期间的任何时间点，由pGX1411与pGX6006组合和pGX1421与pGX6006组合诱导的IFNγELISpot反应之间不存在显著差异(图18C)。进一步通过流式细胞术表征，显示与pGX1421与pGX6006组合相比，在pGX1411与pGX6006组合的情况下，PD4两周朝更稳健的CD4⁺T细胞反应的趋势(图19A)。对于pGX1411与pGX6006组合和pGX1421与pGX6006组合，CD8⁺T细胞隔室中的表型和反应量值相当(图19B和19C)。

综上所述，对于pGX1411与pGX6006组合和pGX1421与pGX6006组合，针对PRAME的细胞免疫反应相当。包含pGX6006所编码的IL-12显著提高由pGX1421诱导的细胞免疫反应。

表6和表7中分别呈现合成共有Prame的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)和氨基酸(SEQID NO.2)。

应理解，前述具体实施方式和随附实例仅仅是说明性的并且不认为是对本发明范围的限制，本发明的范围仅由随附权利要求书以及其等效物限定。

对所公开的实施例的各种改变和修改对于所属领域的技术人员来说将是显而易见的。此类对所公开的实施例的改变和修改包括(但不限于)与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、配制或使用方法相关的改变和修改，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下作出。

表6：合成共有PRAME DNA编码序列pGX1421

表7：合成共有PRAME蛋白序列pGX1421

序列表

<110> 艾诺奥医药品有限公司

严健(YAN, Jian)

安娜·斯莱格(SLAGER, Anna)

布拉德利·加曼(GARMAN, Bradley)

尼尔·库奇(COOCH, Neil)

<120> 靶向PRAME的癌症疫苗和其用途

<130> INO-1003WO / 104409.000445

<150> US 62/598,290

<151> 2017-12-13

<160> 2

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共有PRAME DNA编码序列pGX1421

<400> 1

atggactgga catggattct gttcctggtc gctgctgcta cacgggtgca ttcagagaga 60

cgaagactgc ggggctcaat tcagagtagg tacatcagta tgtcagtctg gacctcacca 120

cggagactgg tggaactggc cgggcagagc ctgctgaagg atgaggccct ggctattgcc 180

gctctggaac tgctgccccg agagctgttc cctcccctgt tcatggcagc cttcgacgga 240

cgccacagcc agactctgaa ggctatggtc caggcatggc cctttacctg cctgcctctg 300

ggcgtgctga tgaaggggca gcagctgcat ctggagactt tcaaagcagt gctggatggc 360

ctggacgtgc tgctggccca ggaagtgagg cctaggcgct ggaagctgga ggtcctggat 420

ctgcgcaaaa acagccacca ggacttttgg accgtgtggt ccgggaatcg ggccagtctg 480

tactcattcc cagaacccga ggctgcacag ccaatgcgga agaaaagaaa ggtggatgga 540

ctgtccaccg aagctgagca gccttttaca ccaatcgaag tgctggtcga tctgtccctg 600

aaagaaggcg catgcgacga gctgttctct tatctgatgg agaaggtcaa aagacagaag 660

aacgtgctgc acctgtgctg taagaaactg aaaatctttg ctatgcccat gcaggacatc 720

aagatgattc tgaaaatggt ccagctggat tccattgaag acctggaggt cacttgtacc 780

tggaagctgc caacactggc caaattctct ccctacctgg gacagatgat caatctgcga 840

cggctgctgc tgtctcacat ccatgctagc tcctctatta gtcctgagaa ggaggaagag 900

tacattgcac agtttacttc tcagttcctg agtctgcagt gcctgcaggc cctgtatgtg 960

gatagcctgt tctttctgag aggcaggctg gaccagctgc tgcgacacgt catgaacccc 1020

ctggaaacac tgagtgtgac taattgtaga ctgtcagagg gcgatgtgat gcatctgagc 1080

cagtccccta acgtgagcca gctgtccgtc ctgtctctga gtggcgtgat gctgacagac 1140

gtgagccctg aaccactgca ggccctgctg gagcgagcat ctgccactct gcaggacctg 1200

gattttgacg agtgtgggat catggacgat cagctgctgg tgctgctgcc ttcactgagc 1260

cactgctccc agctgaccac actgtctttc tgtgggaacc caatctccat ttctgtgctg 1320

cagaatctgc tgcaccatct gattggactg agcaacctga cccatgtgct gtaccccgtc 1380

cctctggaaa gctatgagga tgtgcacgga acactgcatc tgggcaggct ggcctatctg 1440

cacgctcgcc tgcgagaagt ggtgtgcgag ctgggcagac cctcaatggt gtggctgagc 1500

gccaatccat gtccccattg cggcgaccgg acattctacg accccgaacc tattctgtgc 1560

ccctgcttca tgcctaactg ataa 1584

<210> 2

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共有PRAME蛋白编码序列pGX1421

<400> 2

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Glu Arg Arg Arg Leu Arg Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile

20 25 30

Ser Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly

35 40 45

Gln Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu

50 55 60

Leu Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly

65 70 75 80

Arg His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr

85 90 95

Cys Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln Gln Leu His Leu Glu

100 105 110

Thr Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu

115 120 125

Val Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Glu Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn

130 135 140

Ser His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu

145 150 155 160

Tyr Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Arg Lys Lys Arg

165 170 175

Lys Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Thr Pro Ile

180 185 190

Glu Val Leu Val Asp Leu Ser Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu

195 200 205

Phe Ser Tyr Leu Met Glu Lys Val Lys Arg Gln Lys Asn Val Leu His

210 215 220

Leu Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile

225 230 235 240

Lys Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu

245 250 255

Val Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr

260 265 270

Leu Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His

275 280 285

Ala Ser Ser Ser Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Glu Tyr Ile Ala Gln

290 295 300

Phe Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val

305 310 315 320

Asp Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His

325 330 335

Val Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Val Thr Asn Cys Arg Leu Ser

340 345 350

Glu Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Asn Val Ser Gln Leu

355 360 365

Ser Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu

370 375 380

Pro Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu

385 390 395 400

Asp Phe Asp Glu Cys Gly Ile Met Asp Asp Gln Leu Leu Val Leu Leu

405 410 415

Pro Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Cys Gly

420 425 430

Asn Pro Ile Ser Ile Ser Val Leu Gln Asn Leu Leu His His Leu Ile

435 440 445

Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser

450 455 460

Tyr Glu Asp Val His Gly Thr Leu His Leu Gly Arg Leu Ala Tyr Leu

465 470 475 480

His Ala Arg Leu Arg Glu Val Val Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met

485 490 495

Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe

500 505 510

Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn

515 520 525

Claims (37)

1.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1中所列的核酸序列。

2.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到1584中所列的核酸序列。

3.一种核酸分子，其包含编码SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列的核酸序列。

4.一种核酸分子，其包含编码如SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列的核酸序列。

5.一种载体，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子。

6.根据权利要求5所述的载体，其中所述载体是质粒或病毒载体。

7.一种组合物，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子。

8.一种组合物，其包含根据权利要求5或6所述的载体。

9.一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列。

10.一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列。

11.一种疫苗，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子或根据权利要求5或6所述的载体。

12.一种疫苗，其包含编码抗原的核酸分子，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

13.一种疫苗，其包含编码抗原的核酸分子，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的疫苗，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:1中所列的核酸序列，或SEQ ID NO:1的核苷酸55到1584中所列的序列。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的疫苗，其进一步包含医药学上可接受的赋形剂。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的疫苗，其进一步包含佐剂。

17.根据权利要求16所述的疫苗，其中所述佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

18.一种治疗个体的方法，所述个体具有特征为异常PRAME表达的细胞，所述方法包含施用治疗有效量的根据权利要求11至17中任一项所述的疫苗。

19.一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包含向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求11至17中任一项所述的疫苗。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述癌症是上皮卵巢癌。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述癌症是浆液性卵巢癌。

23.一种针对特征为异常PRAME表达的细胞对个体进行疫苗接种的方法，其包含施用会有效诱发免疫反应的量的根据11至17中任一项所述的疫苗。

24.一种诱发个体的免疫反应的方法，其包含向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求11至17中任一项所述的疫苗。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所诱发的免疫反应是细胞反应、体液免疫反应，或细胞免疫反应与体液免疫反应两者。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞免疫反应包含诱导或分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或两者。

27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所诱发的免疫反应包含抑制一种或多种免疫遏制因子，所述免疫遏制因子促进表达PRAME抗原的细胞、肿瘤或癌的生长。

28.根据权利要求18至27中任一项所述的方法，其中所述施用包含电穿孔。

29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中所述疫苗在所述个体上的一个或多个部位处施用。

30.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1中所列的核酸序列，所述核酸分子用作药剂。

31.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到1584中所列的核酸序列，所述核酸分子用作药剂。

32.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1中所列的核酸序列，所述核酸分子用作治疗癌症的药剂。

33.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸55到1584中所列的核酸序列，所述核酸分子用作治疗癌症的药剂。

34.一种核酸分子，其包含编码SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列的核酸序列，所述核酸分子用于制备药剂。

35.一种核酸分子，其包含编码SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列的核酸序列，所述核酸分子用于制备药剂。

36.一种核酸分子，其包含编码SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列的核酸序列，所述核酸分子用于制备用于治疗癌症的药剂。

37.一种核酸分子，其包含编码SEQ ID NO:2的氨基酸残基19到526中所列的氨基酸序列的核酸序列，所述核酸分子用于制备用于治疗癌症的药剂。

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