CN104812401A - Wt1疫苗 - Google Patents

Abstract

本文中公开了包含一种或多种编码突变的WT1抗原的核酸序列的核酸分子。公开了包含一种或多种编码突变的WT1抗原的核酸序列的载体、组合物和疫苗。公开了治疗具有表达WT1的肿瘤的个体的方法和预防表达WT1的肿瘤的方法。公开了突变的WT1抗原。

Description

WT1疫苗

相关申请的交叉参考

本申请要求2012年12月13日提交的美国临时申请No.61/737,094的优先权，其全部内容在此通过引用并入。

技术领域

本发明涉及维尔姆斯肿瘤(Wilm’s tumor)(WT1)免疫原和编码所述免疫原的核酸分子。本发明还涉及包含此类WT1免疫原和/或核酸分子的疫苗。本发明还涉及使用所述疫苗诱发免疫应答以及预防和/或治疗具有表达WT1的肿瘤的受试者的方法。

背景技术

癌症仍然是美国和世界范围内死亡的主要原因。癌症疫苗市场正在迅速增长。淋巴瘤疫苗占约0.5％的市场份额。有效的肿瘤疫苗可用于以阻止肿瘤生长和/或可用作对晚期癌症患者的标准治疗的更有效的、毒性更低的替代治疗。与癌症相关的抗原并因此为抗肿瘤疫苗的靶是WT1。

维尔姆斯肿瘤抑制基因1(WT1)被确定为肾脏胚胎恶性肿瘤的原因，影响约1/10,000的婴儿。其以散发性和遗传性形式发生。WT1的失活导致维尔姆斯肿瘤和Denys-Drash综合征(DDS)的发生。结果是肾病以及可能的生殖器异常。已发现WT1蛋白与许多细胞因子(包括主要肿瘤调控基因p53)相互作用，所述p53也是肿瘤抑制转录因子。

WT1基因在许多肿瘤类型中表达并且已经更广泛地参与许多癌症。例如，WT1蛋白被定位在75％的间皮瘤的细胞核(全世界每年14,200例病例，在美国发病率最高)中和93％的卵巢浆液性癌(2010年全世界190,000例卵巢癌病例)中。此外，WT1已参与胰腺癌、白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胶质母细胞瘤、头颈癌以及良性间皮癌和宫颈癌及卵巢癌等。WT1是作为癌症治疗的方法的基因疗法或免疫疗法的靶。

WT1编码在C末端上含有4个锌指基序并且在N末端上含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结合结构域的转录因子。其在泌尿生殖系统的正常发育中起到不可或缺的作用。然而，其在成人中是不太必需的，从而表明其作为免疫疗法的靶。因在两个编码外显子上的选择性剪接而产生的多个转录变体已得到很好地表征。利用整个阅读框架最大化CTL覆盖将被认为是有利的。

由于WT1抗原的保守性，因此大多数产生针对该基因靶的强免疫的努力未获成功。先前已使用DAN疫苗技术、痘病毒疫苗技术、腺病毒疫苗技术、肽疫苗技术和基于蛋白质的疫苗技术研究了疫苗。被研究的疫苗使用真实的基因结构，即天然的“正常”基因。在这些研究中仅实现低水平或无功能的T细胞免疫。

对于更有效的WT1免疫原的开发存在几个主要问题。由于WT1抗原与宿主WT1的相似性，因此产生强抑制子T细胞应答，从而阻断免疫诱导。此外，该基因本身在RNA水平被显著加工，以便产生多个具有未知值和可能竞争值的经切割的转录物。此外，被递送的WT1的表达很低，从而导致较差的免疫。

用于治疗和预防癌症的疫苗受到极大的关注。现有靶向WT1的疫苗受到体内很差的抗原表达限制。因此，在本领域仍然需要开发适用于表达WT1的肿瘤的安全有效的疫苗，从而提供此类癌症的治疗和提高所述癌症的存活率。

发明内容

概述

本发明涉及包含一种或多种核酸序列的经分离的核酸分子，所述核酸序列选自由以下组成的组：编码SEQ ID NO:2的核酸序列、编码包含SEQID NO:2的长度的至少90％的片段的核酸序列、编码与SEQ ID NO:2具有至少98％的同一性的蛋白质的核酸序列、编码包含与SEQ ID NO:2具有至少98％的同一性的蛋白质的长度的至少90％的片段的核酸序列、编码SEQID NO:4的核酸序列、编码包含SEQ ID NO:4的长度的至少90％的片段的核酸序列、编码与SEQ ID NO:4具有至少98％的同一性的蛋白质的核酸序列，以及编码包含与SEQ ID NO:4具有至少98％的同一性的蛋白质的长度的至少90％的片段的核酸序列。

本发明还涉及包含一种或多种核酸序列的经分离的核酸分子，所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、包含SEQ ID NO:1的长度的至少90％的片段、与SEQ ID NO:1具有至少98％的同一性的核酸序列、包含与SEQ ID NO:1具有至少98％的同一性的核酸序列的长度的至少90％的片段、SEQ ID NO:3、包含SEQ ID NO:3的长度的至少90％的片段、与SEQ ID NO:3具有至少98％的同一性的核酸序列，以及包含与SEQ IDNO:3具有至少98％的同一性的核酸序列的长度的至少90％的片段。

可将上述核酸分子掺入进质粒或病毒载体中。本发明还涉及包含一种或多种上述核酸分子的组合物。本发明还涉及包含一种或多种上述核酸分子的疫苗。

本发明还涉及治疗具有表达WT1的肿瘤的个体的方法，所述方法包括施用有效地减缓表达WT1的肿瘤的生长、减小或消除所述肿瘤的量的上述疫苗。

本发明还涉及预防个体的表达WT1的肿瘤的方法，所述方法包括施用有效地抑制表达WT1的肿瘤的形成或生长的量的上述疫苗。

本发明还涉及包含氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、包含SEQ ID NO:2的长度的至少90％的片段、与SEQ ID NO:2具有至少98％的同一性的氨基酸序列、包含与SEQ IDNO:2具有至少98％的同一性的氨基酸序列的长度的至少90％的片段、SEQID NO:4、包含SEQ ID NO:4的长度的至少90％的片段、与SEQ ID NO:4具有至少98％的同一性的氨基酸序列，以及包含与SEQ ID NO:4具有至少98％的同一性的氨基酸序列的长度的至少90％的片段。

本发明还涉及包含核酸分子的疫苗。所述核酸分子可包含在SEQ IDNO:1中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的核酸序列。所述核酸分子可包含在SEQ ID NO:3中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的核酸序列。所述疫苗还可包含肽。所述肽可包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列。

所述核酸分子可包含表达载体。所述疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。所述疫苗还可包含佐剂。

本发明还涉及包含核酸分子的疫苗。所述核酸分子可编码包含在SEQID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列的肽。所述核酸分子可编码包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列的肽。所述疫苗还可包含肽。所述肽可包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含在SEQ IDNO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列。

所述核酸分子可包含表达载体。所述疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。所述疫苗还可包含佐剂。

本发明还涉及包含SEQ ID NO:1中所示的核酸序列的核酸分子。

本发明还涉及包含SEQ ID NO:3中所示的核酸序列的核酸分子。

本发明还涉及包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的肽。

本发明还涉及包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的肽。

本发明还涉及包含抗原的疫苗，其中所述抗原可由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3编码。所述抗原可由SEQ ID NO:1编码。所述抗原可由SEQID NO:3编码。所述抗原可包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。所述抗原可包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。所述抗原可包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。

本发明还涉及包含肽的疫苗。所述肽可包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。所述肽可包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。

附图说明

图1显示标绘免疫组对比每10⁶个脾细胞的斑形成单位(SFU)的图。

图2显示标绘免疫组对比每10⁶个脾细胞的SFU的图。

图3显示免疫印迹。

图4显示ConWT1-L和ConWT1-S的示意图。

图5显示ConWT1-L与ConWT1的各自氨基酸序列的比对。

图6在(A)中显示编码ConWT1-L的核苷酸序列；和(B)ConWT1-L的氨基酸序列。

图7在(A)中显示编码ConWT1-S的核苷酸序列；和(B)ConWT1-S的氨基酸序列。

图8显示转染的细胞的染色。

图9显示免疫印迹。

图10显示说明免疫方案的示意图。

图11显示标绘免疫组对比每10⁶个脾细胞的SFU的图。

图12显示标绘免疫组对比每10⁶个脾细胞的SFU的图。

图13显示经转染的细胞的染色。

图14显示免疫印迹。

具体实施方式

本发明涉及包含WT1抗原的疫苗。WT1在许多肿瘤中表达。因此，所述疫苗提供对癌症或基于癌症的表达WT1的肿瘤的治疗。

WT1抗原可以是从来自不同物种的WT1的序列衍生的共有WT1抗原，从而，所述共有WT1抗原是独特的。所述共有WT1抗原也是独特的，因为所述锌指被修饰或被一起去除。修饰可包括配位锌结构的半胱氨酸和组氨酸残基的取代。

令人惊讶地，当所述共有WT1抗原具有经修饰的锌指或无锌指时，诱发与WT1反应的显著的免疫应答。诱发的免疫应答包括体液和细胞免疫应答，其中相对于或相较于被包含天然WT1或针对表达优化的WT1的疫苗诱发的细胞免疫应答，所述细胞免疫应答被诱发增强约400倍。

1.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。下文中描述了优选的方法和材料，尽管可在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。本文中公开的材料、方法以及实施例仅仅是说明性的并非意在限制。

如本文中所用，术语“包含/包括”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”及其变型意欲为不排除另外的行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“和(and)”以及“该(the)”包括复数参考物。本公开还涵盖“包含/包括”本文中提出的实施方案或组件、“由所述实施方案或组件组成”和“基本上由所述实施方案或组件组成”的其它实施方案，无论是否明确地显示。

如本文中所用的“佐剂”可意指添加至本文中描述的DNA质粒疫苗以增强一种或多种由DNA质粒和下文中描述的编码核酸序列编码的抗原的抗原性的任何分子。

“抗体”可意指种类IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段的抗体、其片段或其衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，所述抗体展现足够的对期望的表位或来源于其的序列的结合特异性。

“抗原”是指：具有包括SEQ ID NO:2的突变的WT1氨基酸序列的蛋白质；具有本文中所示的长度的其片段、变体，即具有与如本文中所示的SEQ ID NO:2具有同一性的序列的蛋白质、具有本文中所示的长度的变体的片段、SEQ ID NO:4；具有本文中所示的长度的其片段、变体，即具有与如本文中所示的SEQ ID NO:4具有同一性的序列的蛋白质、具有本文中所示的长度的变体的片段及其组合。抗原可任选地包含信号肽诸如来自其它蛋白质的那些信号肽。

如本文中所用，“编码序列”或“编码核酸”可指包含编码本文中所示的抗原的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可包括有效地连接于能够在施用了核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。编码序列还可包括编码信号肽的序列。

如本文中所用，“互补”或“互补的”可意指可核酸，可意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

如本文中所用，“共有”或“共有序列”可意指基于多个亚型的特定抗原的比对的分析构建的合成核酸序列或对应的多肽序列。所述序列可用于诱发针对多个亚型、血清型或株系的特定抗原的广泛免疫。合成抗原诸如融合蛋白可经操作成为共有序列(或共有抗原)。

如本文中所用，“恒定电流”定义由组织或限定所述组织的细胞在整个递送至相同组织的电脉冲的持续过程中接收或经历的电流。从本文中描述的电穿孔装置递送电脉冲。该电流在电脉冲的整个过程中在所述组织中维持恒定的安培度，因为本文中提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。反馈元件可测量整个脉冲持续过程中组织(或细胞)的电阻(resistance)，并使电穿孔装置改变其电能输出(例如，提高电压)，这样相同组织中的电流在整个电脉冲(大约数微秒)中以及在脉冲间维持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。

如本文中所用，“电流反馈”或“反馈”可互换使用，并且可意指提供的电穿孔装置的主动响应，其包括测量组织中电极之间的电流和相应地改变由EP装置递送的能量输出，以将电流维持在恒定水平。该恒定水平由用户在开始脉冲序列或电处理之前预先设定。反馈可由电穿孔组件例如电穿孔装置的控制器来实现，因为其中的电路能够连续监测组织中电极之间的电流并将该监测的电流(或组织内的电流)与预设电流相比较，以及连续进行能量输出调整以将监测的电流维持在预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为其为模拟闭环反馈。

如本文中所用的“分散电流”可意指从本文中描述的电穿孔装置的各种针电极阵列递送的电流的模式，其中所述模式使待电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关热应激的发生降至最低或优选消除。

如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电-透化”或“电动增强”(“EP”)可指使用跨膜电场脉冲来诱发生物膜中的微观通路(孔)；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过进入另一侧。

如本文中所用，“反馈机制”可指通过软件或硬件(或固件)进行的过程，该过程接收期望的组织的阻抗(在递送能量脉冲之前，期间和/或之后)并将其与现有值(优选地当前)相比较，随后调整被递送的能量的脉冲以达到预设值。可通过模拟闭环电路进行反馈机制。

“片段”可意指能够引发哺乳动物的免疫应答的抗原的多肽片段。在具有或不具有信号肽和/或位置1上的甲硫氨酸的每一种情况下，抗原的片段可与全长100％相同，除从N和/或C末端失去至少一个氨基酸外。片段可包含20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比的特定全长抗原的长度，不包括任何添加的异源信号肽。片段可包含多肽的片段，所述多肽的片段与抗原具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高同一性，并且额外地包含当计算百分比同一性时未被包括的N末端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。可将N末端甲硫氨酸和/或信号肽连接于抗原的片段。

在具有或不具有编码信号肽和/或位置1上的甲硫氨酸的序列的每一种情况下，编码抗原的核酸序列的片段可与全长100％相同，除从5'和/或3'末端失去至少一个核苷酸外。片段可包含20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比的特定全长编码序列的长度，不包括任何添加的异源信号肽。片段可包含编码多肽的片段，所述多肽与抗原具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高的同一性，并且额外地任选地包含当计算百分比同一性时未包括的编码N末端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。可将编码N末端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列连接于编码序列的片段。

如本文中所用的“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包括有效地连接于能够在施用了核酸分子的个体的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。如本文中所用，术语“可表达的形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有有效地连接于编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，以便当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。

如在本文中在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所用，“相同的”或“同一性”可意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可通过如下步骤计算百分比：将两条序列最佳地比对，在指定的区域上比较两条序列，测定在两条序列中存在相同残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数，及将结果乘以100来得到序列同一性的百分比。在两条序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及指定的比较区域仅包括单条序列的情况下，将单条序列的残基包括在计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可将胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)认为是等同的。人工或通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST 2.0来获得同一性。

当讨论反馈机制时可使用如本文中所用的“阻抗”，并且可按照欧姆定律将其转换成电流值，从而使得能够与预设电流比较。

如本文中所用的“免疫应答”可意指宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统，响应一种或多种本文中描述的抗原(经由本文中描述的疫苗)的引入的激活。免疫应答可以以细胞应答或体液应答的形式或这两种形式存在。

如本文中所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸还包括描述的单链的互补链。核酸的许多变体可出于相同的目的作为给定的核酸使用。因此，核酸还包括基本上相同的核酸和其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。核酸可以通过化学合成法或通过重组法获得。

如本文中所用的“有效连接的”可意指基因的表达在与其空间上连接的启动子的控制下。启动子可位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与在所述启动子来源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如在本领域中是已知的，在不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。

如本文中所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可意指氨基酸的连接的序列，并且可以是天然的、合成的或者经修饰的或者天然和合成的组合。

如本文中所用的“启动子”可意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以进一步增强所述序列的表达和/或改变其的空间表达和/或时间表达。启动子还可包含与转录起始位点相距多达数千碱基对的远端增强子或阻遏子元件。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可针对表达发生的细胞、组织或器官或针对表达发生所处的发育阶段，或响应外部刺激(诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地，或差异地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV 40晚期启动子和CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用，并且是指可被连接在本文中所示的蛋白质的氨基末端上的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文中使用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞分泌。在从细胞分泌后，通常从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白)切割信号肽/前导序列。信号肽/前导序列连接在蛋白质的N末端上。

如本文中所用，“受试者”可意指想要或需要利用本文中描述的疫苗免疫的哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。

如本文中所用的“严格杂交条件”可意指第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶)(诸如在核酸的复杂混合物中)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下是不同的。可选择比特定序列在限定的离子强度、pH下的热熔点(T_m)低约5-10℃作为严格条件。T_m可以是50％的与靶互补的探针在平衡(由于靶序列过量存在，因此在T_m下，50％的探针在平衡时被占据)时与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件可以是在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，诸如约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)以及温度为至少约30℃(对于短探针(例如，约10-50个核苷酸))和至少约60℃(对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以为至少2至10倍本底杂交。示例性严格杂交条件包括下列条件：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS在65℃下孵育，在65℃于0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤。

如本文中所用的“基本上互补的”可意指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或两条序列在严格杂交条件下杂交。

如本文中所用的“基本上相同的”可意指如果第一序列与第二序列的补体基本上互补的话则第一与第二序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上或就核酸而言至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

如本文中所用的“治疗”或“处理”可意指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病的方式来保护动物免受疾病侵害。预防疾病包括在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。抑制疾病包括在疾病引发后但在其临床表现之前向动物施用本发明的疫苗。压制疾病包括在疾病临床表现后向动物施用本发明的疫苗。

本文中针对核酸所用的“变体”可意指(i)参考的核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考的核苷酸序列或其部分的补体；(iii)与参考核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

对于肽或多肽，“变体”是指通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上相异的，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可意指具有与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的的蛋白质。氨基酸的保守取代，即利用具有相似性质(例如，疏水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域中被认为通常包括较小变化。如本领域中所理解的，这些较小变化可部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathic index)来鉴定。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于显示可导致保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一种已被报导与抗原性和免疫原性密切相关的有用的度量。美国专利No.4,554,101，通过引用完全并入本文。如本领域中所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可导致保留生物活性例如免疫原性的肽。可利用彼此亲水性值在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，与生物功能相容的氨基酸取代被认为取决于氨基酸，并且具体地那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质显示的。

变体可以是在全长的全基因序列或其片段上基本上相同的核酸序列。核酸序列可在全长的基因序列或其片段上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。变体可以是在全长的氨基酸序列或其片段上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在全长的所述氨基酸序列或其片段上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

如本文中所用的“载体”可意指含有复制起始点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主复制的染色体外载体或整合进宿主基因组的载体。

对于本文中数值范围的引述，明确地以相同的精度包括其间的每一个中介数。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还包括数值7和8，而对于范围6.0-7.0，明确地包括数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

2.疫苗

本文中提供了包含抗原、其片段、其变体或其组合的疫苗。所述疫苗可以能够在哺乳动物中产生针对所述抗原的免疫应答。所述疫苗可包含如在下文中更详细描述的质粒或多种质粒。所述疫苗可诱发治疗性或预防性免疫应答。

所述疫苗可用于抵抗癌症例如表达维尔姆斯肿瘤抑制基因1(WT1)的癌症或肿瘤。所述疫苗可用于预防和/或治疗有此需要的受试者的表达WT1的肿瘤。所述疫苗可诱发针对WT1和表达WT1的肿瘤的细胞和/或抗体应答。

所述疫苗可诱发或引发施以所述疫苗的受试者的免疫应答。施以所述疫苗的受试者的免疫应答可被诱发至少约40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、225倍、250倍、275倍、300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425倍、450倍、475倍、500倍、525倍、550倍、575倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、3500倍或4000倍。在一些实施方案中，施以所述疫苗的受试者的免疫应答可被诱发至少约300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425倍、450倍、475倍或500倍。

所述疫苗可诱发施以所述疫苗的受试者的体液和/或细胞免疫免疫应答。所述诱发的体液免疫免疫应答可包括与所述抗原免疫免疫应答的抗体。所述诱发的免疫应答可包括产生干扰素-γ(IFN-γ)并且与所述抗原免疫免疫应答的T细胞。施以所述疫苗的受试者的细胞免疫免疫应答可被诱发至少约40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、225倍、250倍、275倍、300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425倍、450倍、475倍、500倍、525倍、550倍、575倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、3500倍或4000倍。在一些实施方案中，施以疫苗的受试者的细胞免疫应答可被诱发至少约300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425倍、450倍、475倍或500倍。

所述疫苗可用于递送一种或多种选自由抗原、此类抗原的片段、此类抗原的变体和变体的片段组成的组成的抗原。在多种抗原的递送的情况下，所述疫苗可包括多种组合物或单一组合物。递送可包括可用于编码多种不同的抗原或相同抗原的不同部分的单一质粒。在其它实施方案中，递送可包括编码不同抗原或相同抗原的不同部分的不同质粒。

所述疫苗可以是核酸疫苗、肽疫苗或核酸和肽的组合疫苗。所述核酸疫苗可包含核酸分子。所述核酸疫苗可包含多个拷贝的单一核酸分子诸如单一质粒、多个拷贝的两种或更多种不同的核酸分子诸如两种或更多种不同的质粒。

所述核酸疫苗可包含核酸分子诸如质粒，其可共同地含有单一抗原的编码序列、两种或更多种抗原的异源编码序列。包含两种抗原的异源编码序列的核酸疫苗可在单一核酸分子诸如单一质粒上，或所述核酸疫苗可包含两种不同的核酸分子诸如两种不同的质粒，其中一种核酸分子包含一种抗原的异源编码序列并且另一种核酸分子包含不同抗原的异源编码序列。所述核酸疫苗可包含两种不同的核酸分子诸如两种不同的质粒，其中一种核酸分子包含所述抗原的第一部分的异源编码序列并且另一种核酸分子包含所述抗原的第二部分的异源编码序列。

类似地，包含3种抗原的异源编码序列的核酸疫苗可包含单一核酸分子诸如单一质粒、2种不同的核酸分子或3种不同的核酸分子。同样地，包含4种抗原的异源编码序列的核酸疫苗可包含单一核酸分子诸如单一质粒、2种不同的核酸分子、3种不同的核酸分子或4种不同的核酸分子。

所述核酸疫苗可包含一种或多种编码抗原的核苷酸序列。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核酸序列还可包含编码通过肽键连接于所述抗原的接头、前导序列和/或标签序列的额外序列。

在一些实施方案中，所述核酸疫苗还可包含分子佐剂的编码序列，在一些情况下所述分子佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES，以及在一些情况下所述分子佐剂为检查点抑制剂，包括抗细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、抗-程序化死亡受体-1(PD-1)和抗-淋巴细胞-活化基因(LAG-3)。可在一种或多种包含一种或多种抗原的编码序列的核酸分子上包含IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码序列。可在单独的核酸分子诸如单独的质粒上包含IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码序列。

所述肽疫苗可包括抗原性肽、抗原性蛋白质、其变体、其片段或其组合。组合DNA和肽疫苗可包含上述一种或多种编码抗原和抗原性肽或抗原性蛋白质的核酸序列。

本发明的疫苗可具有有效疫苗的期望特性，诸如是安全的以便所述疫苗本身不引起疾病或死亡；具有抵抗疾病的保护作用；诱导中和抗体；诱导保护性T细胞；以及提供施用的容易性、几乎无副作用、生物稳定性和每剂量的低成本。

a.抗原

如本文中所描述的，所述疫苗可包含抗原。抗原可以是维尔姆斯肿瘤抑制基因1(WT1)、其片段、其变体或其组合。WT1是在N末端上含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结合结构域和在C末端上含有4个锌指基序的转录因子。WT1在泌尿生殖系统的正常发育中起着作用，并且与许多因子例如，p53(一种已知的肿瘤抑制子)和丝氨酸蛋白酶HtrA2(其可在用细胞毒性药物处理后在多个位点上切割WT1)相互作用。

WT1的突变可导致肿瘤或癌症例如维尔姆斯肿瘤或表达WT1的肿瘤的形成。维尔姆斯肿瘤通常在转移至其它组织例如但不限于肝组织、尿道系统组织、淋巴组织和肺组织之前在一个或两个肾中形成。因此，维尔姆斯肿瘤可被认为是转移性肿瘤。维尔姆斯肿瘤通常发生在年幼儿童(例如，小于5岁)中并以散发性和遗传性形式发生。

因此，所述疫苗可用于治疗患有维尔姆斯肿瘤的受试者。所述疫苗还可用于治疗具有表达WT1的癌症或肿瘤的受试者以预防此类肿瘤在受试者中发展。WT1抗原可与天然的“正常”WT1基因不同，从而提供针对表达WT1抗原的肿瘤的治疗或预防。因此，本文中提供了与天然WT1基因不同的WT1抗原序列(即，突变的WT1基因或序列)。

可将天然WT1基因的转录物加工成多种mRNA，并且所得的蛋白质对诱发免疫应答不是完全等值的。本文中描述的突变的WT1基因避免选择性加工，从而产生一种完全长度转录物并且导致对效应T细胞和B细胞应答更强的诱发。第一突变的WTI序列被称为具有经修饰的锌指或ConWT1-L的CON WT1。SEQ ID NO:1为编码具有经修饰的锌指的WT1抗原CON WT1的核酸序列。SEQ ID NO:2为具有经修饰的锌指的WT1抗原CON WT1的氨基酸序列。第二突变的WT1序列被称为不具有锌指或ConWT1-S的CON WT1。SEQ ID NO:3为编码不具有锌指的WTI抗原CON WT1的核酸序列。SEQ ID NO:4为不具有经修饰的锌指的WT1抗原CON WT1的氨基酸序列。

提供了包含上述异源序列的经分离的核酸分子。提供了由上述异源序列组成的经分离的核酸分子。可将包含上述异源序列的经分离的核酸分子整合进载体诸如质粒、病毒载体和如下文中描述的其它形式的核酸分子中。本文中提供编码WT1抗原的核酸序列。编码WT1抗原的编码序列具有如上所述的序列。

提供了包含上述异源氨基酸序列的蛋白质分子。提供了由上述异源氨基酸序列组成的蛋白质分子。本文中提供了具有上述序列的蛋白质和多肽。所述蛋白质和多肽可被称为WT1抗原和WT1免疫原。WT1抗原能够诱发针对表达WT1抗原的肿瘤的免疫应答。

在本发明的一个方面，期望所述共有抗原提供提高的转录和翻译，包括下列的一个或多个：增加转录的低GC含量前导序列；mRNA稳定性和密码子优化以及尽可能消除顺式作用序列基序(即，内部TAT A盒)。

在本发明的一些方面，期望产生共有抗原，所述共有抗原产生跨多个菌株的广泛免疫应答，包括下列的一个或多个：整合所有可获得的全长序列；在每一个位置上利用最常存在的氨基酸的计算产生的序列；和增强菌株之间的交叉反应性。

WT1抗原可以是来源于两个或更多个物种的共有抗原(或免疫原)序列。WT1抗原可包含用于提高的表达的共有序列和/或修饰。修饰可包括密码子优化、RNA优化、kozak序列(例如，GCC ACC)的添加(以增加翻译起始)和/或免疫球蛋白前导序列的添加(以增加WT1抗原的免疫原性)。WT1抗原可包含信号肽诸如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。在一些实施方案中，WT1共有抗原可包含血凝素(HA)标签。WT1共有抗原可被设计来引发比对应的密码子优化的WT1抗原更强和更广的细胞和/或体液免疫应答。

WT1共有抗原在一个或多个锌指中可包含一个或多个突变，从而引发比对应的密码子优化的WT1抗原更强和更广的细胞和/或体液免疫应答。一个或多个突变可以是在一个或多个锌指中配位锌离子的一个或多个氨基酸的取代。配位锌离子的一个或多个氨基酸可以是CCHH基序。因此，在一些实施方案中，所述一个或多个突变可替代CCHH基序的1、2、3或所有4个氨基酸。

在其它实施方案中，所述一个或多个突变是SEQ ID NO:2的残基312、317、342和347是除半胱氨酸(C)外的任何残基以及SEQ ID NO:2的残基330、334、360和364是除组氨酸(H)外的任何残基的突变。具体地，所述一个或多个突变是SEQ ID NO:2的残基312、317、330、334、342、347、360和364为甘氨酸(G)的突变。

在其它实施方案中，可从WT1共有抗原去除一个或多个锌指。可从WT1共有抗原除去1、2、3或所有4个锌指。

WT1共有抗原可以是编码SEQ ID NO:2(图6A和6B)的核酸SEQ IDNO:1。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:1中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。

在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列，只要SEQ ID NO:2的残基312、317、342和347是除半胱氨酸(C)外的任何残基以及SEQ IDNO:2的残基330、334、360和364是除组氨酸(H)外的任何残基。在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列，只要SEQ ID NO:2的残基312、317、330、334、342、347、360和364为甘氨酸(G)。

WT1共有抗原可以是氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。所述WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，只要SEQ ID NO:2的残基312、317、342和347是除半胱氨酸(C)外的任何残基以及SEQ ID NO:2的残基330、334、360和364是除组氨酸(H)外的任何残基。在一些实施方案中，WT1共有序列可以是在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，只要SEQ ID NO:2的残基312、317、330、334、342、347、360和364是甘氨酸(G)。

WT1共有抗原可以是核酸SEQ ID NO:3，其编码SEQ ID NO:4(图7A和7B)。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:3中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。

WT1共有抗原可以是氨基酸序列SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。

提供了SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQID NO:2，只要如果SEQ ID NO:2的残基312、317、342和347存在于免疫原性片段中，则这些残基是除半胱氨酸(C)外的任何残基，以及只要如果SEQ ID NO:2的残基330、334、360和364存在于免疫原性片段中，则这些残基是除组氨酸(H)外的任何残基。在其它实施方案中，免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2，只要如果SEQ ID NO:2的残基312、317、330、334、342、347、360和364存在于免疫原性片段中，则这些残基是甘氨酸(G)。

在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如免疫球蛋白E(IgE)前导序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。

可提供含与SEQ ID NO:2和4的免疫原性片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:2和/或SEQID NO:4具有95％或更大的同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有96％或更大的同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有97％或更大的同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有98％或更大的同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有99％或更大的同一性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包含前导序列，例如免疫球蛋白前导序列诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，所述免疫源性片段不含前导序列。

一些实施方案涉及SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的免疫源性片段。免疫源性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列例如免疫球蛋白的前导序列诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含编码前导序列的编码序列。可提供具有与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的免疫原性片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的免疫原性片段。此类片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:3具有95％或更高同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有96％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有97％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有98％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有99％或更高同一性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列，例如免疫球蛋白前导序列诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含编码前导序列的编码序列。

b.载体

所述疫苗可包含一种或多种包含编码所述抗原的异源核酸的载体。所述一种或多种载体可以能够以有效地引发哺乳动物的免疫应答的量表达抗原。所述载体可包含编码所述抗原的异源核酸。所述载体可具有含有复制起始点的核酸序列。所述载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。所述载体可以是自主复制的染色体外载体或整合进宿主基因组的载体。

所述一个或多个载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因引入靶细胞的质粒。一旦表达载体在细胞内，由所述基因编码的蛋白质由细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生。所述质粒通常被工程化以含有充当增强子和启动子区域调控序列并导致表达载体上携带的基因的高效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，从而表达蛋白质。

所述载体可具有表达信号诸如强启动子、强终止密码子、启动子与克隆的基因之间的距离的调整以及转录终止序列和PTIS(可携带的翻译起始序列)的插入。

(1)表达载体

所述载体可以是环状质粒或线性核酸。所述环状质粒和线性核酸能够在适当的主题细胞中指导特定核苷酸序列的表达。所述载体可具有有效地连接于编码抗原的核苷酸序列的启动子，所述编码抗原的核苷酸序列可有效地连接于终止信号。所述载体还可含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其组件的至少一个对于其至少一个其它组件是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，仅当将宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时所述诱导型启动子才启动转录。在多细胞生物体的情况下，所述启动子还可于对特定的组织或器官或发育阶段是特异性的。

(2)质粒

所述载体可以是质粒。所述质粒可用于用编码抗原的核酸转染细胞，将该转化的宿主细胞培养并在所述抗原的表达发生的条件下维持。

所述质粒可包含编码一种或多种上文中公开的各种抗原的核酸序列，包括编码能够引发针对抗原、此类蛋白质的片段、此类蛋白质的变体、变体的片段或融合蛋白(其由共有蛋白和/或共有蛋白的片段和/或共有蛋白的变体和/或共有蛋白的变体的片段的组合构成)的免疫应答的合成、共有抗原的编码序列。

单一质粒可含有单一抗原的编码序列、两种抗原的编码序列、三种抗原的编码序列或四种抗原的编码序列。

在一些实施方案中，质粒还可包含单独的或作为一个这类质粒的一部分的编码CCR20的编码序列。类似地，质粒还可包含IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列。

质粒还可包含可在编码序列的上游的起始密码子，和可在编码序列的下游的终止密码子。所述起始和终止密码子可在具有编码序列的框内。

所述质粒还可包含有效地连接于编码序列的启动子。有效地连接于编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子诸如CMV立即早期启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus,EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus,RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。所述启动子还可以是组织特异性启动子，诸如肌肉或皮肤特异性启动子(天然或合成的)。此类启动子的实例描述于美国专利申请公开no.US20040175727中，其内容以其整体并入本文。

所述质粒还可包含多腺苷酸化信号，其可位于编码序列的下游。所述多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(Invitrogen,San Diego,CA)的多聚腺苷酸化信号。

所述质粒还可包含在编码序列的上游增强子。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，诸如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。多核苷酸功能增强子描述于美国专利No.5,593,972、5,962,428和W094/016737中，其各自的内容通过引用完全并入。

所述质粒还可包含哺乳动物复制起始点以在染色体外维持质粒并在细胞中产生多个拷贝的质粒。所述质粒可以是来自Invitrogen(San Diego,CA)的pVAXI、pCEP4或pREP4，所述质粒可包含爱泼斯坦-巴尔病毒复制起始点和细胞核抗原EBNA-1编码区，其可产生高拷贝附加型复制而无需整合。质粒的主链可以是pA V0242。所述质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)质粒。

所述质粒还可包含调控序列，其可非常适合用于在施用了质粒的细胞中进行基因表达。所述编码序列可包含可允许编码序列在宿主细胞中更高效转录的密码子。

所述编码序列还可包含Ig前导序列。所述前导序列可以是编码序列的5’'。由该序列编码的共有抗原可包含N末端Ig前导序列和随后的共有抗原蛋白。所述N末端Ig前导序列可以是IgE或IgG。

所述质粒可以是pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中产生蛋白质。所述质粒还可以是pYES2(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中产生蛋白质。所述质粒还可以是MAXBAC^TM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen,San Diego,Calif.)的质粒，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。所述质粒还可以是pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白质。

(3)环状和线性载体

所述载体可以是环状质粒，其可通过整合进细胞基因组转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起始点的自主复制质粒)。

所述载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并使得细胞能够将所述序列翻译成被免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。

本文中还提供了能够经由电穿孔被有效地递送至受试者，并且表达一种或多种期望的抗原的线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)。所述LEC可以是不存在任何磷酸主链的任何线性DNA。所述DNA可编码一种或多种抗原。所述LEC可含有启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。所述抗原的表达可受启动子控制。所述LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。所述LEC可以不含与期望的抗原基因表达无关的其它核酸序列。

所述LEC可来源于任何能够被线性化的质粒。所述质粒可以能够表达抗原。所述质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。所述质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或任何其它能够表达编码所述抗原的DNA并使得细胞能够将所述序列翻译成被免疫系统识别的抗原的表达载体。

所述LEC可以是pcrM2。所述LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别来源于pNP(Puerto Rico/34)和pM2(New Caledonia/99)。

(4)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号

所述载体可具有启动子。所述启动子可以是能够驱动基因表达和调控分离的核酸表达的任何启动子。此类启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶的转录所需的顺式作用序列元件，所述RNA聚合酶转录本文中描述的抗原序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于特定应用。可将启动子在载体中置于离转录起始位点与其在天然背景中离转录起始位点的距离大约相同的距离。然而，再不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。

所述启动子可有效地连接于编码所述抗原和转录物的高效多腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止的核酸序列。

所述启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或显示对于在真核细胞中的表达是有效的另一种启动子。

所述载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。所述载体可含有在结构基因下游的转录终止区以提供高效终止。所述终止区可获自与启动子序列相同的基因或可获自不同的基因。

(5)制备载体的方法

本文中提供了用于制备包含本文中论述的DNA疫苗的载体的方法。在通过最终的亚克隆步骤克隆进哺乳动物的表达质粒后，可使用本领域已知的方法将所述载体用在大规模发酵罐中接种细胞培养物。

可使用已知的装置和技术的组合配制或制造在下文中更详细描述的与EP装置一起使用的载体，但优选使用2007年5月23日提交的批准的、共同未决的美国临时申请美国序列No.60/939,792中描述的优化的质粒制造技术来制造它们。在一些实例中，可以大于或等于10mg/mL的浓度配制用于这些研究的DNA质粒。所述制造技术除了美国序列No.60/939792中描述的那些装置和方案(包括2007年7月3日授予的批准的专利、美国专利No.7,238,522中描述的那些装置和方案)之外，还包括或包含对于本领域普通技术人员来说是公知的各种装置和方案。以上提及的申请和专利(分别为美国序列No.60/939,792和美国专利No.7,238,522)在此整体并入。

c.赋形剂和疫苗的其它组分

疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子诸如媒介物、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant)，LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂是多聚阴离子、多聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且所述聚-L-谷氨酸可以以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包括表面活性剂诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂，LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯，并且还可将透明质酸与基因构建体结合施用。所述DNA质粒疫苗还可包括转染促进剂，诸如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。疫苗中的转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。

所述药学上可接受的赋形剂可以是一种或多种佐剂。所述佐剂可以是在可选择的质粒中表达的其它基因或作为疫苗中与上述质粒组合的蛋白质被递送。所述一种或多种佐剂可选自由以下组成的组：CCL20、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、胸腺上皮细胞表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-l、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-1a、MIP-1～、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2、IL-15(具有信号序列或编码缺失的信号序列的编码序列和任选地包含不同的信号肽诸如来自IgE的信号肽或编码不同的信号肽诸如来自IgE的信号肽的编码序列)，以及其功能性片段或其组合。所述佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

在一些实施方案中，佐剂可以是一种或多种蛋白质和/或编码选自由CCL-20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC或RANTES组成的组的蛋白质的核酸分子。IL-12构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US1997/019502以及对应的美国申请序列No.08/956,865和2011年12月12日提交的美国临时申请序列No 61/569600中，其各自通过引用并入本文。IL-15构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US04/18962和对应的美国申请序列No.10/560,650中，以及PCT申请no.PCT/US07/00886和对应的美国申请序列No.12/160,766中和PCT申请no.PCT/USI0/048827中，其各自通过引用并入本文。iL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US09/039648和对应的美国申请序列No.12/936,192中，其各自通过引用并入本文。RANTES以及其它构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US1999/004332和对应的美国申请序列No.09/622452中，其各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请no.PCT/US11/024098中，其通过引用并入本文。RANTES以及其它构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US1999/004332和对应的美国申请序列No.09/622452中，其各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请no.PCT/US11/024098中，其通过引用并入本文。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体及序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US2005/042231和对应的美国申请序列No.11/719,646中，其各自通过引用并入本文。OX40和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请序列No.10/560,653中，其通过引用并入本文。DR5和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请序列No.09/622452中，其通过引用并入本文。

可用作佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

所述疫苗还可包含如1994年4月1日提交的美国序列No.021,579(其通过引用整体并入)中描述的基因疫苗促进剂。

疫苗可以以约1纳克至100毫克、约1微克至约10毫克，或优选地约0.1微克至约10毫克，或更优选约1毫克至约2毫克的量包含抗原和质粒。在一些优选实施方案中，根据本发明的疫苗包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选实施方案中，疫苗可含有约10纳克至约800微克DNA。在一些优选实施方案中，疫苗可含有约0.1至约500微克的DNA。在一些优选实施方案中，疫苗可含有约1至约350微克的DNA。在一些优选实施方案中，疫苗可含有约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克、约1微克至约10毫克、约0.1微克至约10毫克、约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0.1至约500微克、约1至约350微克、约25至约250微克、约100至约200微克的抗原或其质粒。

可按照待使用的施用模式配制疫苗。可注射疫苗药物组合物可以是无菌、无热原和无颗粒的。可使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。所述疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗还可包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使得制剂在室温或环境温度长时间稳定，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

3.疫苗的递送方法

本文中提供了用于递送疫苗以提供遗传构建体和抗原的方法，所述抗原包含使得它们特别有效地抗可诱发针对其的免疫应答的靶免疫原的表位。可提供递送疫苗或接种的方法以诱发治疗性和预防性免疫应答。接种方法可在哺乳动物中产生针对所述抗原的免疫应答。所述疫苗可被递送至个体以调节哺乳动物的免疫系统的活性和增强免疫应答。疫苗的递送可以是将抗原作为在细胞中表达并被递送至细胞的表面上的核酸分子进行的转染，免疫系统识别细胞表面上的所述抗原并诱发细胞、体液或细胞和体液应答。疫苗的递送可用于通过向哺乳动物施用如上所述的疫苗以诱发或引发哺乳动物的针对所述抗原的免疫应答。

当将所述疫苗和质粒递送进哺乳动物的细胞时，所述转染的细胞将表达并分泌从疫苗注射的每一种质粒的抗原。该抗原将被免疫系统识别为外来物，并且将针对它们产生抗体。这些抗体将由免疫系统维持，并且允许针对所述抗原的有效应答。

可向哺乳动物施用所述疫苗以引发哺乳动物的免疫应答。所述哺乳动物可以是人、灵长类动物、非人灵长类动物、母牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、骆驼、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。

a.组合治疗

可将所述疫苗与其它蛋白质和/或编码如下蛋白的基因组合施用：CCL20、a-干扰素、y-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、胸腺上皮细胞表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15包括具有缺失的信号序列和任选地包含不同的信号肽诸如IgE信号肽的IL-15、MHC、CD80、CD86、IL-28、IL-l、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2及其功能性片段或其组合。在一些实施方案中，将所述疫苗与一种或多种下列核酸分子和/或蛋白质组合施用：选自由包含编码CCL20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC和RANTES或其功能性片段的一种或多种的编码序列的核酸分子组成的组的核酸分子，和选自由CCL20、IL-12蛋白、IL-15蛋白、IL-28蛋白、CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白或RANTES蛋白或其功能性片段组成的组的蛋白。

疫苗可以通过不同的途径(包括口服、胃肠外、舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内鞘内和关节内或其组合)施用。对于兽医学用途，可按照正常兽医实践作为适当地可接受的制剂施用疫苗。兽医可以容易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。疫苗可通过常规注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其它物理方法诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力法”或超声波进行施用。

可利用几种公知的技术将疫苗的质粒递送至哺乳动物，所述技术包括利用和不利用体内电穿孔的DNA注射(也称为DNA接种)、脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体诸如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组痘苗病毒。可经由DNA注射并连同体内电穿孔递送抗原或免疫原。

b.电穿孔

可按照制药领域内的技术人员公知的标准技术配制疫苗。可通过考虑诸如特定受试者的年龄、性别、体重和状况以及施用途径的因素，利用医学领域内的技术人员公知的技术按剂量施用此类组合物。所述受试者可以是哺乳动物，诸如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。

可预防性或治疗性施用所述疫苗。在预防性施用中，可以足以诱发免疫应答的量施用所述疫苗。在治疗性应用中，以足以引发治疗作用的量向有此需要的受试者施用所述疫苗。足以实现该作用的量被定义为"治疗有效剂量"。对该用途有效的量将取决于例如所施用的疫苗方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的一般健康状态以及处方医生的判断。

所述疫苗可通过如Donnelly等人(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等人(美国专利No.5,580,859，1996年12月3日授予的)；Felgner(美国专利No.5,703,055，1997年12月30日授予的)；和Carson等人(美国专利No.5,679,647，1997年10月21日授予的)(所有文献和美国专利的内容通过引用以其整体并入本文)中描述的本领域公知的方法来施用。可将所述疫苗的DNA复合成可以例如使用疫苗枪向个体施用的颗粒或珠粒。本领域技术人员将了解药学上可接受的载体，包括生理上可接受的化合物的选择取决于例如表达载体的施用途径。

可经由多种途径施用所述疫苗。典型的递送途径包括胃肠外施用，例如真皮内、肌内或皮下递送。其它途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。具体地对于疫苗的DNA，可将所述疫苗递送至个体的组织的间隙空间(Felgner等人，美国专利No.5,580,859和5,703,055，将所有所述美国专利的内容通过引用以其整体并入本文)。所述疫苗还可被施用至肌肉，或经由真皮内或皮下注射，或经皮肤(诸如通过离子电渗疗法)进行施用。还可应用所述疫苗的表皮施用。表皮施用可包括机械或化学刺激表皮的最外层以刺激针对所述刺激物的免疫应答(Carson等人，美国专利No.5,679,647，其内容通过引用以其整体并入本文)。

还可将所述疫苗配制用以经由鼻道施用。适用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可包括具有例如在约10至约500微粒范围内的粒度的粗粉，以其中采用从鼻中吸入，即，通过从拿至靠近鼻的粉剂的容器经鼻道快速吸入的方式来施用所述粗粉。所述制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或利用喷雾器的气溶胶施用。所述制剂可包含所述疫苗的水性或油性溶液。

所述疫苗可以是液体制剂诸如悬浮剂、糖浆剂或酏剂。所述疫苗还可以是用于胃肠外、皮下、真皮内、肌内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，诸如无菌悬浮剂或乳剂。

可将所述疫苗掺入脂质体、微球或其它聚合物基质(Felgner等人，美国专利No.5,703,055；Gregoriadis,Liposome Technology，第I至III卷(第2版，1993)，其内容通过引用以其整体并入本文)。脂质体可由磷脂或其它脂质组成，并且可以是被相对简单地产生和施用的无毒、生理上可接受和可代谢的载体。

可使用电穿孔装置来实现经由本发明的质粒的电穿孔的疫苗的施用，所述电穿孔装置被构造来向哺乳动物的期望的组织递送有效地在细胞膜中引起可逆孔形成的能量的脉冲，并且优选的能量脉冲是与由用户预设的电流输入相似的恒定电流。电穿孔装置可包括电穿孔组件和电极部件或操作部件。电穿孔组件可包括和包含电穿孔装置的各种元件的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆组件、电源和电源开关。可使用例如体内电穿孔装置例如

CELLECTRA EP系统(VGX Pharmaceuticals,Blue Bell,PA)或Elgen电穿孔器(Genetronics,San Diego,CA)促进质粒对细胞的转染来实现电穿孔。

电穿孔组件可作为电穿孔装置的一个元件起作用，并且其它元件是与所述电穿孔组件通信的分开的元件(或组件)。电穿孔组件可作为电穿孔装置的多于一个元件起作用，其可以与同所述电穿孔组件分开的所述电穿孔设备的另外的其它元件通信。作为机电装置或机械装置的一部分存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为所述元件可作为一个装置或作为彼此相互通信的分开的元件起作用。电穿孔组件可以能够递送在期望的组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极部件可包括在空间排列上具有多个电极的电极阵列，其中所述电极组件接收来自电穿孔组件的能量脉冲并将其通过电极递送至期望的组织。多个电极的至少一个在能量脉冲的递送过程中是中性的，并且测量期望的组织的阻抗，以及与将所述阻抗传达给电穿孔组件。反馈机制可接收测量的阻抗，并可调整由电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。

多个电极可以分散模式递送能量脉冲。多个的电极可通过在程序化顺序下控制电极以分散模式递送能量脉冲，并且所述程序化顺序由用户输入至电穿孔组件中。程序化顺序可包含多个按顺序递送的脉冲，其中多个脉冲的每一个脉冲通过至少两个有源电极(其中一个中性电极测量阻抗)来递送，并且其中多个脉冲的随后脉冲通过至少两个有源电极(一个中性电极测量阻抗)的不同的一个电极来递送。

可通过硬件或软件来进行反馈机制。可通过模拟闭环电路来进行反馈机制。反馈每50μs、20μs、10μs或1μs产生一次，但优选地是实时反馈或瞬时反馈(即，基本上同时的，如通过可获得的测定响应时间的技术测定)。中性电极可测量期望的组织中的阻抗，并将所述阻抗传达到反馈机制，并且所述反馈机制响应所述阻抗并调整能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的值上。反馈机制可在能量脉冲递送过程中连续和瞬时地维持恒定电流。

可促进本发明的DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在Draghia-Akli等人的美国专利No.7,245,963、Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630(其内容在此通过引用整体并入)中描述的那些电穿孔装置和方法。可用于促进DNA疫苗的递送的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列No.11/874072中提供的那些电穿孔装置和方法，所述专利申请序列根据35USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列No.60/852,149和2007年10月10日提交的60/978,982(其全都在此整体并入)的权益。

Draghia-Akli等人的美国专利No.7,245,963描述了标准电极系统及它们用于促进将生物分子引入至身体或植物的选择的组织的细胞中的用途。标准电极系统可包含多种针电极；皮下针头；提供从可编程恒定电流脉冲控制器至多个针电极的导电连接的电连接器；和电源。操作者可抓住多个安装在支持结构上的针电极，并将它们牢固地插入身体或植物的选择的组织中。随后经由皮下针头将生物分子递送至选择的组织。激活可编程恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电极脉冲施加于多个针电极。施加的恒定电流电脉冲促进将生物分子引入至多个电极之间的细胞中。美国专利No.7,245,963的整个内容在此通过引用并入。

由Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630描述了可用于有效地促进将生物分子引入至身体或植物的选择的组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括其操作通过软件或固件来指定的电动力学装置("EKD装置")。EKD装置基于脉冲参数的用户控制和输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒定电流脉冲波形，并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包含具有一个阵列的针电极的可替换电极盘、用于注射针的中央注射通道和可移去的引导盘。美国专利公开2005/0052630的整个内容在此通过引用并入。

美国专利No.7,245,963和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法可适用于不仅至组织诸如肌肉，而且还至其它组织或器官内的深度穿透。由于电极阵列的配置，还可将注射针(以递送选择的生物分子)完全插入靶器官中，并且在利用电极预先描绘的区域中垂直于靶组织施用注射剂。美国专利No.7,245,963和美国专利公开2005/005263中描述的电极优选为20mm长和21规格。

此外，在一些包括电穿孔装置及其用途的实施方案中，设想存在电穿孔装置，其为在下列专利：1993年12月28日授予的美国专利5,273,525、2000年8月29日授予的美国专利6,110,161、2001年7月17日授予的6,261,281和2005年10月25日授予的6,958,060，以及2005年9月6日授予的美国专利6,939,862中描述的那些电穿孔装置。此外，本文设想了针对注射DNA的方法设计的涵盖2004年2月24日授予的美国专利6,697,669(其涉及使用各种装置的任一种递送DNA)和2008年2月5日授予的美国专利7,328,064中提供的主题的专利。上述专利通过引用整体并入。

所述疫苗可经由电穿孔，诸如通过美国专利No.7,664,545(其内容通过引用并入本文)中描述的方法来施用。所述电穿孔可以是利用美国专利No.6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359(其内容通过引用以其整体并入本文)中描述的方法和/或设备来进行。所述电穿孔可经由微创装置来进行。

微创电穿孔装置(“MID”)可以是用于将上述疫苗和相关流体注射进身体组织的设备。所述装置可包括空心针、DNA盒和流体递送装置，其中所述装置适合用于驱动使用的流体递送装置，以在将针插入所述身体组织过程中同时(例如，自动地)将DNA注射进身体组织。这具有在针被插入的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致流体在整个身体组织中的更均匀分布的有利方面。在注射过程中经历的疼痛可因被注射的DNA在更大面积上的分布而减弱。

MID可将疫苗注射进组织而无需使用针。MID可以以使疫苗穿透组织的表面并进入下面的组织和/或肌肉的力，以小流或射流的形式注射疫苗。小流或射流后方的力可通过膨胀压缩的气体(诸如二氧化碳)使其在几分之一秒内通过微孔来提供。微创电穿孔装置以及使用它们的方法的实例描述于公开的美国专利申请No.20080234655、美国专利No.6,520,950、美国专利No.7,171,264、美国专利No.6,208,893、美国专利No.6,009,347、美国专利No.6,120,493、美国专利No.7,245,963、美国专利No.7,328,064和美国专利No.6,763,264中，其每一个的内容通过引用并入本文。

MID可包含产生无痛穿透组织的高速液体射流的注射器。此类无针注射器是商购可得的。可在本文中使用的无针注射器的实例包括美国专利No.3,805,783、4,447,223、5,505,697和4,342,310(其每一个的内容通过引用并入本文)中描述的那些注射器。

适用于直接或间接电转运的期望的疫苗可使用无针注射器(通常通过使组织表面与注射器接触以以足以使疫苗穿透进组织的力驱动试剂射流的递送)来引入(例如，注射)待治疗的组织中。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，则以足以使试剂穿透通过解质层和分别进入真皮层，或进入下面的组织和肌肉的力来朝向粘膜或皮肤表面注射所述试剂。

无针注射器特别适合用于将疫苗递送至所有类型的组织，特别地皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可用于将含有疫苗的液体推进至表面并进入受试者的皮肤或粘膜。可使用本发明的方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽部、下喉咽部、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾脏、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任意组合。

MID可具有使组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如以矩形或正方形模式建立的)中的多对电极之间脉冲，提供了优于在一对电极之间脉冲的结果的改善的结果。例如在标题为"Needle Electrodes for MediatedDelivery of Drugs and Genes"的美国专利No.5,702,359中公开了其中可在治疗性治疗过程中对多对针对进行脉冲的针的阵列。在该申请(其通过引用并入本文，就如同充分列出一样)中，将针置于环状阵列中，但具有连接器和使得能够在相对的针电极对之间产生脉冲的转换设备。可使用一对用于将重组表达载体递送至细胞的针电极。这样的装置和系统在美国专利No.6,763,264(其内容通过引用并入本文)中进行了描述。或者，可使用单针装置，所述装置允许注射DNA和利用与常规注射针相似的单针进行电穿孔，和施加具有比通过目前使用的装置递送的脉冲的电压更低的电压的脉冲，从而减轻患者经历的触电感。

MID可包含一个或多个电极阵列。所述阵列可包含两个或更多个具有相同直径或不同直径的针。可均匀或不均匀地间隔针。针可以为0.005英寸至0.03英寸、0.01英寸至0.025英寸、或0.015英寸至0.020英寸。针的直径可为0.0175英寸。针可相隔0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

MID可由脉冲发生器和两个或更多个-针式疫苗注射器组成，所述注射器在单个步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲。脉冲发生器可允许经由闪存卡操作的个人计算机对脉冲和注射参数进行灵活编程，以及全面记录和存储电穿孔及患者的数据。脉冲发生器可在很短的时间中递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送在100ms持续时间中递送3个15伏的脉冲。这种MID的实例是由Inovio Biomedical Corporation提供的Elgen 1000系统，其在美国专利No.7,328,064(其内容通过引用并入本文)中进行了描述。

MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals,Blue Bell PA)装置和系统，其为标准电极系统，帮助将大分子诸如DNA引入体内或植物的选定组织的细胞内。标准电极系统可包含多个针电极；皮下针；提供从可编程恒定电流脉冲控制器至多个针电极的传导连接的电连接器；和电源。操作员可握住固定在承载结构上的多个针电极并牢固地将其插入至体内或植物的选定组织。随后经由皮下针将大分子递送入选定组织。激活可编程恒定电流脉冲控制器并将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。施加的恒定电流电脉冲帮助将生物分子引入多个电极之间的细胞。通过借由恒定电流脉冲限制组织中的功耗来使因细胞的过热而引起的细胞死亡降至最低。Cellectra装置和系统在美国专利No.7,245,963(其内容通过引用并入本文)中进行了描述。

MID可以是Elgen 1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系统可包括提供空心针的装置；和流体递送装置，其中所述设备被适配成驱动使用的流体递送装置，以在将针插入所述身体组织的过程中同时(例如自动地)将流体(本文中描述的疫苗)注射至身体组织中。有利方面是在将针插入的同时逐渐注射流体的能力导致流体在整个身体组织中的更均匀分布。还相信在注射过程中经历的疼痛因被注射的流体的体积在更大区域中的分布而减轻。

此外，流体的自动注射帮助自动监测和记录注射的流体的实际剂量。如果需要，该数据可由控制单元存储以用于存档。

应理解，注射速率可以是线性的或非线性的，并且可在已将针插入通过待治疗的受试者的皮肤后以及当它们被进一步插入进身体组织时进行注射。

可利用本发明的设备向其中注射流体的适当的组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，还可以是肌肉组织。

所述设备还包含用于将针引导插入身体组织的针插入装置。流体注射速率受针插入的速率控制。这具有可控制针插入和流体注射以便插入的速率可匹配所需注射速率的有利方面。其还使得所述设备更容易被用户操作。如果需要，可提供用于自动地将针插入身体组织的装置。

用户可选择开始注射流体的时间。然而，理想地，当针尖已到达肌肉组织时开始注射，并且所述设备可包括用于感应针已插入对于开始流体的注射是足够的深度的装置。这意味着当针已到达所需深度(该深度通常为肌肉组织开始时的深度)时可提醒自动地开始注射流体。肌肉开始时的深度可以例如被采用来作为预设针插入深度，诸如被认为对于针穿过皮肤层是足够的4mm的值。

所述传感装置可包含超声探针。所述传感装置可包含用于感应阻抗或电阻的变化的装置。在该情况下，所述装置可能不这样记录针在身体组织中的深度，而是被适配成感应当针从不同类型的体身组织移动至肌肉中时阻抗或电阻的变化。这些备选装置的任一种提供了感应注射可开始的相对准确和简单的操作装置。如果需要，还可记录针插入的深度，并且可将所述深度用于控制流体的注射以便在记录针插入的深度的同时，确定待注射的流体的体积。

所述装置还可包含：用于支持针的基座；和用于在其中接受基座的壳体，其中所述基座相对于壳体是可移动的，以便当基座相对于壳体位于第一向后位置时将针在壳体内收回，以及当基座位于壳体内的第二向前位置时针伸出壳体。这对于用户是有利的，因为可将所述壳体在患者的皮肤上排成一列，随后可通过相对于基座移动壳体将针插入患者的皮肤。

如上所述，期望实现速率受控的流体注射，以便当将针插入皮肤时，流体在针的长度上均匀分布。所述流体递送装置可包含被适配成以受控速率注射流体的活塞驱动装置。活塞驱动装置可以例如通过伺服马达来驱动。然而，活塞驱动装置可通过相对于壳体在轴向方向上移动的基座来驱动。应理解，可提供用于流体递送的备选装置。因此，例如，可提供可被挤压以以受控或非受控速率进行流体递送的封闭容器来替代注射器和活塞系统。

上述设备可用于任何类型的注射。然而设想其在电穿孔领域中是特别有用的，因此其还可包含用于对针施加电压的装置。这使得针不仅能用于注射而且还可在电穿孔过程中用作电极。这是特别有利的，因为这意味着电场被施加至与注射流体相同的区域。历来存在关于电穿孔的问题，因为极难精确地将电极与先前注射的流体对齐，所以用户意欲在更大面积上注射比所需的体积更大的体积的流体，和在更高的区域上施加电场以试图保证注射物质与电场之间的重叠。通过使用本发明，可减小注射的流体体积和施用的电场的尺寸，同时实现电场与流体之间的良好拟合。

4.治疗和/或预防的方法

本文中还提供了通过对有此需要的受试者施用疫苗来治疗有此需要的受试者的的疾病、保护其免受疾病侵害和/或预防所述疾病的方法。所述疾病可以是癌症，例如，维尔姆斯肿瘤、从维尔姆斯肿瘤产生的转移癌，以及表达WT1的癌症或肿瘤。可如上在递送方法中所述的受试者施用疫苗。向受试者施用疫苗可诱发或引发受试者的免疫应答。具体地，向受试者施用疫苗可诱发或引发受试者的体液和/或细胞免疫应答。

具体地，所述方法可治疗具有维尔姆斯肿瘤、从维尔姆斯肿瘤产生的转移癌和/或表达WT1的肿瘤或癌症的受试者，因为所述疫苗减缓维尔姆斯肿瘤、从维尔姆斯肿瘤产生的转移癌和/或表达WT1的肿瘤或癌症的生长、减少和消除所述癌症。所述方法还可预防受试者的维尔姆斯肿瘤、从维尔姆斯肿瘤产生的转移癌和/或表达WT1的肿瘤或癌症，因为所述疫苗抑制维尔姆斯肿瘤、从维尔姆斯肿瘤产生的转移癌和/或表达WT1的肿瘤或癌症的形成和生长。如上所述，所述疫苗诱发或引发体液和/或细胞免疫应答。该诱发的体液和/或细胞免疫应答可靶向维尔姆斯肿瘤、从维尔姆斯肿瘤产生的转移癌和/或表达WT1的肿瘤或癌症，从而减缓被施以所述疫苗的受试者的任何维尔姆斯肿瘤、从维尔姆斯肿瘤产生的转移癌和/或表达WT1的肿瘤或癌症的生长，减少和消除所述癌症。由所述疫苗诱发的该体液和/或细胞免疫应答还可抑制被施以疫苗的受试者的任何维尔姆斯肿瘤、从维尔姆斯肿瘤产生的转移癌和/或表达WT1的肿瘤或癌症的形成和生长。

疫苗剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间，以及可以为20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗一次。用于有效治疗的疫苗的剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

本发明具有通过下列非限定性实施例说明的多个方面。

5.实施例

本发明将在下面的实施例中进一步说明。应理解，这些实施例，虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅是以说明性方式给出的。根据上面的讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和改进，以使其适应各种用途和条件。因此，根据前述描述，除了本文中显示和描述的那些改进之外的本发明的各种改进对于本领域技术人员来说将显而易见。此类改进也意欲落入所附权利要求的范围内。

如本文实施例中所述采用逐步法来产生WT1免疫原。通过几个逐步修饰来修饰WT1基因。首先，修饰WT1RNA结构以便其产生单一全长转录物。其次，修饰密码子使用以改变5’末端上的RNA结构，从而提高体内表达。最后，将基因的锌指结构域突变以修饰WT1活性和删除锌指结合位点的部分。

实施例1

优化的WT-1

开发产生WT1免疫原的逐步法。设计对RNA结构的第一变化，所述变化导致仅单一全长长转录物产生，从而产生具有更加可控的表型的免疫原。序列还含有经修饰的密码子使用选择和在5’末端经改变的RNA结构以提高体内表达。因此，WT1免疫原被优化用于表达。产生编码该改进的免疫原的表达盒的质粒，并在动物中测试所述质粒的免疫潜能及产生T细胞和B细胞应答的能力。该质粒疫苗被配制来用于通过电穿孔进行增强的体内递送，并且特定条件被用于体内递送。

将编码该免疫原的质粒(被称为WT1-pVAX1、WT1-pVAX2、WT1-pVAX3、WT1-pVAX4和WT1-pVAX5)与代表由本领域研究的标准疫苗的WT1疫苗(也称为WT1-pCDNA1、WT1-pCDNA2、WT1-pCDNA3、WT1-pCDNA4和WT1-pCDNA5)相比较。

进行小鼠研究。用经修饰的WT1疫苗(即，载体WT1-pVAX1、WT1-pVAX2、WT1-pVAX3、WT1-pVAX4和WT1-pVAX5)接种小鼠，并且所述小鼠经历比用包含天然WT1的标准WT1疫苗(即，WT1-pCDNA1、WT1-pCDNA2、WT1-pCDNA3、WT1-pCDNA4和WT1-pCDNA5)接种的小鼠产生的抗-WT1T细胞和B细胞应答更佳的抗-WT1T细胞和B细胞应答。

用相同量的WT-1质粒，即新型WT1-pVax疫苗(即，载体WT1-pVAX1、WT1-pVAX2、WT1-pVAX3、WT1-pVAX4和WT1-pVAX5)或原始WT-1质粒疫苗(即，WT1-pCDNA1、WT1-pCDNA2、WT1-pCDNA3、WT1-pCDNA4和WT1-pCDNA5)免疫动物(即，BalB/C小鼠)3次。T细胞测定(即，干扰素-γ(IFN-γELISpot测定)的结果示于图1和2中。很清楚，新型设计的WT-1疫苗(即，载体WT1-pVAX1、WT1-pVAX2、WT1-pVAX3、WT1-pVAX4和WT1-pVAX5)在产生T细胞应答上约为WT-1原始疫苗(即，WT1-pCDNA1、WT1-pCDNA2、WT1-pCDNA3、WT1-pCDNA4和WT1-pCDNA5)的4倍。如图1和2中显示的，对于标准疫苗仅观察到低水平的T细胞免疫或无功能的T细胞免疫，这与先前已获得的数据相符。

还检查了该新型DNA疫苗诱发抗体应答的能力。通过从在WT1-pCDNA或WT1-pVAX疫苗中免疫的动物收集血清进行这些研究。使用WT1-pCDNA疫苗未观察到血清转换或抗体应答的诱发(数据未显示)。相反地，WT1-pVAX免疫原诱导具有正确特异性和分子量的强蛋白质印迹反应性，从而显示强劲的WT1血清转换和强抗体应答(图3)。这些数据共同地强有力支持该疫苗免疫基因通过WT1免疫原的递送变化和改进的设计产生的改善。

这些数据还显示免疫原的构象性质得以维持，因为这些含有优化的WT1免疫原的疫苗明确地与肿瘤细胞中的天然基因序列反应。

通过修饰编码序列以通过两种方式破坏其天然结构来进一步靶向免疫原序列，(1)靶向锌指区域和诱导修饰WT1活性的突变，以及(2)从重要的Zn指结合位点删除序列。这些变化在下文中概述于实施例2和3中。

实施例2

共有WT1

如上所述，优化的WT1免疫原(即，如实施例1中所述优化WT1基因)诱发体液和细胞免疫应答。为了进一步靶向或修饰WT1免疫原序列，产生共有WT1免疫原。

具体地，将来自多个物种的WT1序列彼此比较。如下面表1中所示，WT1是高度保守的。因此，将来自多个物种的WT1序列用于产生WT1共有序列，其中WT1共有序列与人WT1共享约95％的同一性。所得的共有WT1免疫原(也被称为ConWT1)与人WT1共享95.9％的同一性，并且具有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列(图5)。

表1：物种之间的WT1的同一性。

实施例3

锌指修饰和去除

进一步修饰在上文实施例2中描述的共有WT1免疫原以增强WT1免疫原的免疫原性。具体地，修饰共有WT1免疫原以破坏位于WT1免疫原的羧基末端(C末端)的锌指。这些修饰包括将锌离子配位在两个氨基末端(N-末端)锌指中以产生具有经修饰的锌指的共有WT1免疫原(在本文中也被称为具有经修饰的锌指的CON WT1或ConWT1-L)的残基(即，CCHH基序)的取代(图4和5)。CCHH基序的C和H残基被甘氨酸(G)替换。免疫球蛋白E(IgE)前导序列被置于ConWT1-L肽的N-末端。ConWT1-L由SEQ ID NO:1编码和具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列(分别为图6A和6B)。

图5显示共有WT1免疫原(ConWT1)与具有经修饰的锌指的共有WT1免疫原(ConWT1-L)的氨基酸序列的比对。图5中的阴影部分表示ConWT1与ConWT1-L之间不同的残基。除了将IgE前导序列添加至ConWT1-L以外，ConWT1-L中的残基312、317、330、334、342、347、360和364还与ConWT1中的对应残基(即，残基295、300、313、317、325、330、343和347)不同。这些差异反映了上述两个N末端锌指中的CCHH基序的修饰。

此外，修饰共有WT1免疫原以除去锌指，从而产生不具有锌指的共有WT1免疫原(在本文中也被称为不具有锌指的CON WT1或CONWT1-S)(图4)。ConWT1-S由SEQ ID NO:3编码并且具有SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列(分别为图7A和7B)。

实施例4

编码ConWT1-L和ConWT1-S的构建体的表达分析

将编码ConWT1-L和ConWT1-S的核酸序列分别置于pVAX1载体(Life Technologies,Carlsbad,CA)中。所得的载体分别被命名为WT1-pVAX-L和WT1-pVAX-S。将WT1-pVAX-L和WT1-pVAX-S连同pVAX1一起转染进细胞以分别确认来自这些载体的ConWT1-L和ConWT1-S的表达。pVAX1用作阴性对照。

转染后，用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞进行染色以标记细胞核并且对WT1具有特异性的的抗体。图8显示该染色的结果。在图8中，左栏和中栏显示DAPI和WT1染色，而右栏显示DAPI和WT1染色的合并。在用pVAX1转染的细胞中对于WT1抗体未检测到染色。这些数据表明ConWT1-L和ConWT1-S从它们各自的载体表达。

ConWT1-L和ConWT1-S的表达通过来源于转染的细胞的裂解物的免疫印迹来进一步确认。具体地，利用抗WT1抗体探测免疫印迹。如图9中所示，对于ConWT1-L和ConWT1-S检测到预期的大小(分别参见标记有WT1-pVAX-L和WT1-pVAX-S的泳道)。在获自用pVAX1转染的细胞的裂解物中未检测到信号。因此，这些数据进一步表明ConWT1-L和ConWT1-S在转染的细胞中表达。

实施例5

由编码ConWT1-L和ConWT1-S的构建体诱发的免疫应答

为了确定编码ConWT1-L和ConWT1-S的构建体是否诱发免疫应答，分别用25μg WT1-pVAX-L或WT1-pVAX-S免疫C57BL/6小鼠。还用25μgWT1-pVAX(其为实施例1中描述的编码WT1的优化的构建体)或25μgWT1-pCDNA(其为编码WT1的非优化的构建体)免疫C57BL/6小鼠。将首次接触实验的小鼠用作对照。

具体地，免疫方案包括在第0周、第2周、第3周和第5周用25μg的各疫苗接种每一组小鼠(图10)。在于第0周接种之前从每一只小鼠取血，从而该第0周的取血用作抗体诱发的对照。在第5周(此时处死小鼠)进行第二次取血。还从处死的小鼠分离脾细胞，将其在下文中描述的ELISpot测定中用于检查T细胞应答。

使用ELISpot测定(其中测量由T细胞进行的干扰素-γ(IFN-γ)产生)检查对ConWT1-L和ConWT1-S的细胞免疫应答(即，T细胞应答)。如图11和12中所示，利用WT1-pVAX和WT1-pCDNA构建体的免疫产生与在首次接触实验的小鼠中观察到的T细胞应答相似的T细胞应答。相反地，分别表达ConWT1-L和ConWT-S的WT1-pVAX-L和WT1-pVAX-S构建体产生相较于优化和非优化的构建体(即，分别为WT1-pVAX和WT1-pCDNA)显著更高的T细胞应答。在图11和12中，误差条反映平均值的标准误差(SEM)。

具体地，ConWT1-L和ConWT-S抗原诱发为比由优化的和非优化的构建体诱发的T细胞应答高约400倍的T细胞应答。因此，这些数据表明WT1中锌指的修饰和去除显著增强WT1免疫原的免疫原性，从而提供针对WT1免疫原的显著的T细胞应答。

通过确定来自第5周取血的血清是否含对于抗原是特异性的抗体来检查对ConWT1-L和ConWT1-S抗原的体液免疫应答。具体地，用载体WT1-pVAX-L和WT1-pVAX-S转染293T细胞。转染后，用DAPI对用WT1-pVAX-L或WT1-pVAX-S转染的细胞进行染色以标记细胞核以及来自用WT1-pVAX-L或WT-pVAX-S免疫的小鼠的第5周取血的血清。如图13中所示，用WT1-pVAX-L或WT1-pVAX-S免疫的小鼠的血清分别在转染的细胞中检测到ConWT1-L或ConWT1-S抗原。因此，这些数据表明利用表达ConWT1-L和ConWT1-S抗原的构建体进行的免疫导致与ConWT1-L和ConWT1-S抗原免疫反应的抗体产生。

表达ConWT1-L和ConWT1-S的构建体对体液免疫应答的诱发进一步通过免疫印迹来检查。具体地，从上述转染的细胞获得裂解物，并将其用来自用WT1-pVAX-L或WT1-pVAX-S免疫的小鼠的血清探测。图14显示代表性免疫印迹，其中获自未转染的293T细胞的裂解物用作本底的对照。图14中的免疫印迹也用抗肌动蛋白抗体(其显示3个泳道之间加载了等量的裂解物)来探测。这些数据表明经免疫的小鼠的血清含有与ConWT1-L和ConWT1-S抗原免疫反应的抗体，从而进一步确认了上述细胞染色结果。

总之，表达ConWT1-L或ConWT1-S抗原的构建体诱发产生IFN-γ和与ConWT1-S和ConWT-L抗原免疫反应的抗体的显著的T细胞应答。

应理解，前文详述和所附实施例仅是例举性的并且无意被视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由所附权利要求和它们的等同物确定。

对公开的实施方案的各种改变和改进对于本领域技术人员来说是显而易见的。可在不背离其精神和范围的情况下进行这样的改变和改进，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的那些改变和改进。

Claims (33)

1.一种包含一种或多种核酸序列的经分离的核酸分子，所述核酸序列选自由以下组成的组：编码SEQ ID NO:2的核酸序列、编码包含SEQID NO:2的长度的至少90％的片段的核酸序列、编码与SEQ ID NO:2具有至少98％的同一性的蛋白质的核酸序列、编码包含与SEQ IDNO:2具有至少98％的同一性的蛋白质的长度的至少90％的片段的核酸序列、编码SEQ ID NO:4的核酸序列、编码包含SEQ ID NO:4的长度的至少90％的片段的核酸序列、编码与SEQ ID NO:4具有至少98％的同一性的蛋白质的核酸序列，以及编码包含与SEQ IDNO:4具有至少98％的同一性的蛋白质的长度的至少90％的片段的核酸序列。

2.一种包含一种或多种核酸序列的经分离的核酸分子，所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、包含SEQ ID NO:1的长度的至少90％的片段、与SEQ ID NO:1具有至少98％的同一性的核酸序列、包含与SEQ ID NO:1具有至少98％的同一性的核酸序列的长度的至少90％的片段、SEQ ID NO:3、包含SEQ ID NO:3的长度的至少90％的片段、与SEQ ID NO:3具有至少98％的同一性的核酸序列，以及包含与SEQ ID NO:3具有至少98％的同一性的核酸序列的长度的至少90％的片段。

3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其中将所述分子掺入进质粒或病毒载体中。

4.一种包含权利要求1中所示的一种或多种核酸分子的组合物。

5.一种包含权利要求2中所示的一种或多种核酸分子的组合物。

6.一种包含权利要求1中所示的一种或多种核酸分子的疫苗。

7.一种包含权利要求2中所示的一种或多种核酸分子的疫苗。

8.一种治疗具有表达WT1的肿瘤的个体的方法，其包括施用有效地减缓表达WT1的肿瘤的生长、减小或消除所述肿瘤的量的根据权利要求6或7所述的疫苗。

9.一种预防个体的表达WT1的肿瘤的方法，其包括施用有效地抑制表达WT1的肿瘤的形成或生长的量的据权利要求6或7所述的疫苗。

10.一种包含氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、包含SEQ ID NO:2的长度的至少90％的片段、与SEQ ID NO:2具有至少98％的同一性的氨基酸序列、包含与SEQID NO:2具有至少98％的同一性的氨基酸序列的长度的至少90％的片段、SEQ ID NO:4、包含SEQ ID NO:4的长度的至少90％的片段、与SEQ ID NO:4具有至少98％的同一性的氨基酸序列，以及包含与SEQ ID NO:4具有至少98％的同一性的氨基酸序列的长度的至少90％的片段。

11.一种包含核酸分子的疫苗，其中：

(a)所述核酸分子包含在SEQ ID NO:1中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的核酸序列；或

(b)所述核酸分子包含在SEQ ID NO:3中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的核酸序列。

12.根据权利要求11所述的疫苗，其还包含：

(a)包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列的肽；或

(b)包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列的肽。

13.根据权利要求11所述的疫苗，其中所述核酸分子包含表达载体。

14.根据权利要求11所述的疫苗，其还包含药学上可接受的赋形剂。

15.根据权利要求11所述的疫苗，其还包含佐剂。

16.一种包含核酸分子的疫苗，其中：

(a)所述核酸分子编码包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列的肽；或

(b)所述核酸分子编码包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列的肽。

17.根据权利要求17所述的疫苗，其还包含：

(a)包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列的肽；或

(b)包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列的肽。

18.根据权利要求16所述的疫苗，其中所述核酸分子包含表达载体。

19.根据权利要求16所述的疫苗，其还包含药学上可接受的赋形剂。

20.根据权利要求16所述的疫苗，其还包含佐剂。

21.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1中所示的核酸序列。

22.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:3中所示的核酸序列。

23.一种肽，其包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

24.一种肽，其包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。

25.一种包含抗原的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3编码。

26.根据权利要求25所述的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO:1编码。

27.根据权利要求25所述的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO:3编码。

28.根据权利要求25所述的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。

29.根据权利要求28所述的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

30.根据权利要求28所述的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。

31.一种包含肽的疫苗，其中：

(a)所述肽包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列；或

(b)所述肽包含在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90％的同一性的氨基酸序列。

32.根据权利要求31所述的疫苗，其中所述肽包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

33.根据权利要求31所述的疫苗，其中所述肽包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。