BR112015013004B1 - Molécula de ácido nucleico isolada, proteína e seus usos, bem como composição e vacina - Google Patents
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Abstract
MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, COMPOSIÇÃO, VACINA, MÉTODOS DE TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO E DE PREVENÇÃO DE UM TUMOR, PROTEÍNA, E, PEPTÍDEO. Neste documentos são divulgadas as moléculas de ácido nucleico caracterizadas por compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codifica um antígeno de WTI mutante. Os vetores, composições e vacinas compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam uma antígeno WTI mutante são divulgados. Os métodos para tratamento de um indivíduo que possui um tumor que expressa WTI e métodos de prevenção de um tumor que expressa WTI são divulgado. O antígeno de WTI mutante é divulgado.
Description
[001] O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido U.S. Prov. App. N° 61/737.094 depositado em 13 de dezembro de 2012, a qual é incorporada no presente documento por referência.
[002] A presente invenção diz respeito a imunógenos e moléculas de ácido nucleico do tumor de Wilm (WT1) que codificam o mesmo. A presente invenção também diz respeito a imunógenos e/ou moléculas de ácido nucleico de WT1. A presente invenção ainda diz respeito aos métodos de uso de vacinas para indução de respostas imunes e prevenção e/ou tratamento de indivíduos tendo tumores que expressam WT1.
[003] O câncer permanece como a maior causa de mortes nos E.U.A. e em todo o mundo. O mercado de vacinas contra o câncer está crescendo rapidamente. Vacinas contra linfomas contabilizam cerca de 0,5% do mercado. Vacinas eficazes contra tumores podem ser úteis para prevenir crescimento de tumores e/ou podem ser úteis como sendo uma alternativa mais eficaz e menos tóxica para tratamentos padronizados para pacientes com câncer avançado. Um antígeno associado com câncer e, portanto, um alvo para vacinas contra tumores é WT1.
[004] O gene supressor do tumor de Wilm 1 (WT1) foi identificado como uma causa de malignidade embriônica dos rins, afetando cerca de 1 em 10.000 recém-nascidos. Ele ocorre tanto nas formas esporádica como hereditária. A inativação do WT1 leva ao desenvolvimento do tumor de Wilms e síndrome de Denys-Drash (DDS). O resultado é tanto uma nefropatia bem como possíveis anormalidades genitais. Descobriu-se que a proteína do WT1 pode interagir com um hospedeiro de fatores celulares, incluindo o gene maior regulador de tumor p53 que também é um fator de transcrição de supressor de tumor.
[005] O WT1 é expresso em muitos tipos de tumores e foi mais amplamente implicado em muitos tipos de câncer. Por exemplo, a proteína do WT1 está localizada no núcleo da célula de 75% dos mesoteliomas (14.200 casos anualmente em todo o mundo, com a incidência mais alta nos E.U.A) e em 93% de carinomas céricos ovarianos (190.000 casos de câncer ovariano no mundo em 2010). Adicionalmente, o WT1 foi implicado em câncer pancreático, leucemia, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de cólon, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço bem como mesotélio benigno e câncer cervical e ovariano entre outros. O WT1 é um alvo para terapia de genes ou terapia imune como uma abordagem para tratamento de câncer.
[006] WT1 é um fator de transcrição que contém quatro motivos de dedos de zinco no C-terminal e domínio de ligação a DNA rico em prolina/glutamina no N-terminal. Possui um papel essencial no desenvolvimento normal do sistema urogenital. Este é, portanto, mais dispensável em adultos, sendo assim, sugerindo este como um alvo para terapia imune. Variantes múltiplas de transcrição resultantes de splicing alternativo em dois éxons de codificação foram bem caracterizadas. Uso da estrutura de leitura completa para maximizar a cobertura de CTL seria considerada uma vantagem.
[007] Devido à conservação do antígeno WT1 a maioria das tentativas para gerar imunidade forte contra este gene alvo não foi bem- sucedida. As vacinas foram investigadas anteriormente usando tecnologia de vacina de DNA, tecnologia de vacina de poxvírus, tecnologia de vacina de adenovírus, tecnologia de vacina de peptídeos e tecnologia de vacina com base em proteínas. As vacinas foram que foram investigadas usaram a estrutura de gene certa, por exemplo, o gene "normal", nativo. Apenas a imunidade com nível baixo ou não funcional de células T foi alcançada nestas investigações.
[008] Existem algumas questões maiores com o desenvolvimento de um imunógeno de WT1 mais eficaz. Devido à similaridade do antígeno de WT1 para hospedar o WT1, uma resposta de célula T de supressor forte é gerada, bloqueando com isso a indução imune. Além disso, o próprio gene é significativamente processado no nível de RNA de forma que as transcrições clivadas múltiplas são geradas de valores desconhecidos e possivelmente concorrentes. Além disso, a expressão do WT1 entregue é lenta, resultando em imunidade insuficiente.
[009] As vacinas para o tratamento e prevenção de câncer são de grande interesse. As vacinas existentes que direcionam o WT1 são limitadas por expressão insuficiente de antígenos IN VIVO. Consequentemente, permanece uma necessidade na técnica para o desenvolvimento de vacinas seguras e eficazes que são aplicáveis a tumores que expressam WT1, fornecendo com isso tratamento e estimulando a sobrevivências destes tipos de câncer.
[0010] A presente invenção é direcionada a uma molécula de ácido nucleico isolada caracterizada por compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionados do grupo que consiste de: uma sequência de ácido nucleico que codifica a SEQ ID NO:2, uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento que compreende pelo menos 90% de um comprimento da SED ID NO:2, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:2, uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento de uma proteína que é pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO:2, uma sequência de ácido nucleico que codifica a SED ID NO:4, uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento de SEQ ID NO:4, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:4, e uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento de uma proteína que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:4.
[0011] A presente invenção também é orientada para uma molécula de ádico nucleico isolada compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 1, um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento da SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:1, um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:1, SED ID NO: 3, um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento da SEQ ID NO:3, uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:3, e um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:3.
[0012] A molécula de ácido nucleico acima pode ser incorporada em um plasmídeo ou em um fator viral. A presente invenção é ainda orientada para uma composição compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico acima. A presente invenção é ainda orientada para uma vacina compreendendo uma ou mais das moléculas de ácido nucleico supracitadas.
[0013] A presente invenção é ainda orientada para um método de tratamento de um indivíduo que possui um tumor que expressa WT1 compreendendo a administração de uma quantidade de vacinas acima eficazes para retardar o crescimento, reduzir ou elimitar os tumores que expressam o WT1.
[0014] A presente invenção também é orientada para um método de prevenção de um tumor que expressa WT1 em um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade de vacinas acima eficazes para inibir a formação ou crescimento de tumores que expressam o WT1.
[0015] A presente invenção é ainda orientada para um proteína compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de um grupo consistindo de: SEQ ID NO:2, um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento da SED ID NO:2, uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:2, um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:2, SED ID NO:4, um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento de SED ID NO:4, uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:4, e um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica a SED ID NO:4.
[0016] A presente invenção também é direcionada a uma vacina compreendendo uma molécula de ácido nucleico. A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 90% de identidade acima de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico definida na SED ID NO:1. A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 90% de identidade acima de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico definida na SED ID NO:3. A vacina pode ainda compreender um peptídeo. O peptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90% de identidade acima de um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:2. O peptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90% de identidade sobre um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:4.
[0017] A molécula de ácido nucleico pode compreender um vetor de expressão. A vacina pode adicionalmente compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. A vacina pode compreender ainda um adjuvante.
[0018] A presente invenção também é direcionada a uma vacina compreendendo uma molécula de ácido nucleico. A molécula de ácido nucleico pode codificar um peptídeo compreendendo um sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90% de identidade acima de um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:2. A molécula de ácido nucleico pode codificar um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 90% de identidade acima de um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO:4. A vacina pode ainda compreender um peptídeo. O peptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90% de identidade acima de um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:2. O peptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90% de identidade sobre um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:4.
[0019] A molécula de ácido nucleico pode compreender um vetor de expressão. A vacina pode adicionalmente compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. A vacina pode compreender ainda um adjuvante.
[0020] A presente invenção é ainda orientada para uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO:1.
[0021] A presente invenção é ainda orientada para uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO:3.
[0022] A presente invenção é ainda orientada para um peptídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO:2.
[0023] A presente invenção é ainda orientada para um peptídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO:4.
[0024] A presente invenção é ainda orientada para uma vacina compreendendo um antígeno, em que o antígeno é codificado pela SED ID NO:1 ou SED ID NO:3. O antígeno pode ser codificado pela SED ID NO:1. O antígeno pode ser codificado pela SED ID NO:3. O antígeno pode compreender a sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:2 ou SEQ ID NO:4. O antígeno pode compreender a sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:2. O antígeno pode compreender a sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:4.
[0025] A presente invenção também é direcionada a uma vacina compreendendo um peptídeo. O peptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90% de identidade acima de um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:2. O peptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90% de identidade sobre um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:4. O peptídeo pode compreender a sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:2. O peptídeo pode compreender a sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:4.
[0026] FIG. 1 mostra um gráfico representando o grupo de imunização versus a unidade de formação de ponto (SFU) por 106 esplenócitos
[0027] FIG. 2 mostra um gráfico representando o grupo de imunização versus a SFU por 106esplenócitos.
[0028] FIG. 3 mostra um método "immunoblot".
[0029] FIG. 4 mostra um esquema de ConWT1-L e ConWT1-S.
[0030] FIG. 5 mostra um alinhamento das respectivas sequências de aminoácidos de ConWT1-L e ConWT1.
[0031] FIG. 6 mostra em (A) a sequência de nucleotídeos que codifica ConWT1-L; e (B) a sequência de aminoácidos de ConWT1-L.
[0032] FIG. 7 mostra em (A) a sequência de nucleotídeos que codifica ConWT1-L; e (B) a sequência de aminoácidos de ConWT1-S.
[0033] FIG. 8 mostra a coloração de células transfectadas.
[0034] FIG. 9 mostra o método de immunoblots.
[0035] FIG. 10 mostra um esquema ilustrando um regime de imunização.
[0036] FIG. 11 mostra um gráfico representando o grupo de imunização versus a SFU por 106esplenócitos.
[0037] FIG. 12 mostra um gráfico representando o grupo de imunização versus a SFU por 106esplenócitos.
[0038] FIG. 13 mostra a coloração de células transfectadas.
[0039] FIG. 14 mostra um método "immunoblot".
[0040] A presente invenção diz respeito a uma vacina compreendendo um antígeno de WT1. O WT1 é expresso em muitos tumores. Consequentemente, a vacina fornece um tratamento para o câncer ou tumores com base em câncer que expressam o WT1.
[0041] O antígeno de WT1 pode ser um antígeno WT1 consenso derivado das sequências de WT1 de espécies diferentes e, sendo assim, o antígeno consenso WT1 é único. O antígeno WT1 consenso é também único pelo fato de que os dedos de zinco são modificados ou removidos completamente. A modificação pode incluir a substituição dos resíduos de cisteína e histidina que coordenam a estrutura do zinco.
[0042] De maneira surpreendente, quando o antígeno WT1 consenso possui ou não dedos de zinco modificados, uma resposta imune significativa é induzida que é reativa ao WT1. A resposta imune induzida inclui tanto as respostas imunes humorais e celulares, nas quais a resposta imune celular é induzida por cerca de aumento em 400-vezes ou conforme comparado a resposta imune celular induzida por uma vacina compreendendo WT1 nativo ou WT1 otimizado por expressão.
[0043] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa ordinariamente versada na técnica. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo as definições, irá prevalecer. Métodos e materiais exemplares são descritos abaixo, embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento podem ser usados na prática ou no teste da presente invenção. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas por referência em suas totalidades. Os materiais, métodos e exemplos divulgados neste documento são ilustrativos apenas e não se destinam a ser um fator limitante.
[0044] Os termos "compreende(m)", "inclui(em)", "ter", "tem", "pode", "contém(êm)", e as variantes destes, conforme usado neste documento, destinam-se a ser frases de transição em aberto, termos ou palavras que não excluem a possibilidade de atos ou estruturas adicionais. As formas singulares "uma", "um" e "a/o" incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. A presente divulgação também contempla outras modalidades "compreendendo", "consistindo nas" e "consistindo essencialmente nas" modalidades ou elementos apresentados neste documento, se explicitamente estabelecido ou não.
[0045] "Adjuvante", como usado aqui, pode significar qualquer molécula adicionada às vacinas de DNA de plasmídeo descritas neste documento para aumentar a antigenicidade de um ou mais antígenos codificados pelos plasmídeos de DNA e codificando as sequências de ácido nucleico descritas neste documento.
[0046] Anticorpos podem significar um anticorpo das classes IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, ou fragmentos, fragmentos ou derivativos respectivos, includindo Fab, F(ab')2, Fd, e anticorpos de cadeia única, bivalentes, anticorpos biespecíficos, anticorpos bifuncionais e respectivos derivativos. O anticorpo pode ser um anticorpo isolado da amostra de soro de mamífero, um anticorpo policlonal, anticorpo purificado por afinidade ou misturas destes que exibe especificidade de ligação suficiente a um epítopo desejado ou a uma sequência derivada daí.
[0047] "Antígeno" se refere a: proteínas tendo sequências de aminoácidos de WT1 Mutante incluindo SEQ ID NO:2; fragmentos destes de comprimentos definidos neste documento, variantes, por exemplo, proteínas com sequências tendo identidade de SEQ ID NO:2 conforme definidas nestes documento, fragmentos de variantes tendo comprimentos definidos neste documento, SED ID NO:4; fragmentos destes dos comprimentos definidos neste documento, variantes, por exemplo, proteínas com sequências tendo identidade para SED ID NO:4, conforme definidas neste documento, fragmentos de variantes tendo comprimentos definidos neste documento, e combinações destes. Os antígenos podem opcionalmente incluir peptídeos de sinais tais como aqueles de outras proteínas.
[0048] "Sequência de codificação" ou "ácido nucleico de codificação", conforme usado neste documento, pode se referir ao ácido nucleico (molécula de RNA ou DNA) que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um antígeno conforme estabelecido neste documento. A sequência de codificação pode incluir, adicionalmente, os sinais de iniciação e terminação ligados de forma operável a elementos regulatórios incluindo um promotor e sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células de um indivíduo ou mamífero a quem o ácido nucleico é administrado. A sequência de codificação pode, adicionalmente, incluir sequências que codificam peptídeos sinal.
[0049] "Complemento" ou "complementar", da forma como utilizado aqui, pode significar que um ácido nucleico, uma base de Watson-Crick (por exemplo, A-T/U e C-G) ou base de Hoogsteen emparelhando entre nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo de moléculas de ácido nucleico.
[0050] "Consenso" ou "Sequência de Consenso" conforme usada neste documento pode significar uma sequência de ácido nucleico sintética ou sequência de polipeptídeos correspondentes, construídas com base na análise de um alinhamento de múltiplos subtipos de um antígeno específico. A sequência pode ser usada para induzir ampla imunogenicidade contra múltiplos subtipos, sorotipos ou cepas de um antígeno específico. Também, os antígenos sintéticos tais como proteínas de fusão podem ser manipulados para incluir sequências de consenso (ou antígenos de consenso).
[0051] "Corrente constante" conforme usado neste documento para definir uma corrente que é recebida ou experimentada por um tecido, ou células definindo dito tecido, ao longo da duração de um pulso elétrico entregue ao mesmo tecido. O pulso elétrico é entregue a partir dos dispositivos de eletroporação descritos neste documento. Esta corrente permanece em uma amperagem constante em dito tecido ao longo da vida de um pulso elétrico em função de o dispositivo de eletroporação provido neste documento ter um elemento de resposta, preferivelmente tendo resposta instantânea. O elemento de feedback pode medir a resistência do tecido (ou células) durante todo a duração do pulso e fazer com que o dispositivo de eletroporação altere sua saída de energia elétrica (por exemplo, aumento de voltagem) de modo que a corrente no mesmo tecido permaneça constante durante todo o pulso elétrico (na ordem dos microssegundos), e do pulso ao pulso. Em algumas modalidades, o elemento de resposta compreende um controlador.
[0052] "Resposta de corrente" ou "resposta", conforme usado neste documento, pode ser usado de forma permutável e pode significar a resposta ativa dos dispositivos de eletroporação providos, que compreendem medir a corrente no tecido entre os eletrodos e alterar a saída da energia entregue pelo dispositivo de EP, por conseguinte, a fim de manter a corrente em um nível constante. Este nível constante é predeterminado por um usuário antes da iniciação de uma sequência de pulso ou de um tratamento elétrico. O feedback pode ser realizado pelo componente de eletroporação, por exemplo, o controlador, do dispositivo de eletroporação, enquanto circuito elétrico pode continuamente monitorar a corrente no tecido entre os eletrodos e comparar a corrente monitorada (ou a corrente dentro do tecido) a uma corrente predeterminada e continuamente fazer ajustes de saída de energia para manter a corrente monitorada em níveis predeterminados. O circuito de resposta pode ser instantâneo, conforme é uma resposta de circuito fechado análogo.
[0053] "Corrente descentralizada", conforme usado neste documento, pode significar o padrão de correntes elétricas entregues a partir das várias matrizes de eletrodo de agulha dos dispositivos de eletroporação descritos neste documento, em que os padrões minimizam, ou preferencialmente eliminam, a ocorrência do estresse calórico relacionado à eletroporação em qualquer área de tecido sendo eletroporado.
[0054] "Eletroporação", "eletropermeabilização" ou "potenciamento eletrocinético" ("EP"), conforme usado de forma permutável neste documento, pode se referir ao uso de um pulso de campo elétrico de transmembrana para induzir caminhos microscópicos (poros) em uma biomembrana; sua presença permite que biomoléculas, tais como plasmídeos, oligonucleotídeos, siRNA, medicamentos, íons e água passem de um lado da membrana celular para o outro.
[0055] "Mecanismo de resposta", conforme usado neste documento, pode se referir a um processo executado ou pelo software ou pelo hardware (ou firmware), que o processo recebe e compara a impedância do tecido desejado (antes, durante, e/ou após a entrega do pulso de energia) com um valor atual, preferencialmente corrente, e ajusta o pulso de energia entregue para conseguir o valor predeterminado. Um mecanismo de resposta pode ser executado por um circuito fechado análogo.
[0056] "Fragmento" pode significar um fragmento de polipeptídeo de um antígeno que é capaz de desencadear uma resposta imune em um mamífero. Um fragmento de um antígeno pode ser 100% idêntico ao comprimento total exceto por faltar pelo menos um aminoácido do N- e/ou C- terminal, em cada caso, com ou sem peptídeos sinal e/ou uma metionina na posição 1. Fragmentos podem compreender 20% ou mais, 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais, 50% ou mais, 55% ou mais, 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais do comprimento do antígeno de comprimento total particular, excluindo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender um fragmento de um polipeptídeo que é 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntico ao antígeno e adicionalmente compreende uma metionina N terminal ou peptídeo sinal heterólogo que não está incluído ao calcular a identidade percentual. Os fragmentos podem compreender, adicionalmente, uma metionina N terminal e/ou um peptídeo sinal, tal como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal de IgE ou de IgG. A metionina N terminal e/ou peptídeo sinal podem estar ligados a um fragmento de um antígeno.
[0057] Um fragmento de uma sequência de ácido nucleico que codifica um antígeno pode ser 100% idêntico ao comprimento total exceto por faltar pelo menos um nucleotídeo da extremidade 5' e/ou 3', em cada caso, com ou sem sequências codificando peptídeos sinal e/ou uma metionina na posição 1. Fragmentos podem compreender 20% ou mais, 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais, 50% ou mais, 55% ou mais, 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais do comprimento da sequência de codificação de comprimento total particular, excluindo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender um fragmento que codifica um polipeptídeo que é 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntico ao antígeno e adicionalmente compreende, opcionalmente, sequência que codifica uma metionina N terminal ou peptídeo sinal heterólogo que não está incluído ao calcular a identidade percentual. Os fragmentos podem compreender, adicionalmente, sequências de codificação para uma metionina N terminal e/ou um peptídeo sinal, tal como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal de IgE ou de IgG. A sequência de codificação codificando a metionina N terminal e/ou peptídeo sinal podem estar ligados a um fragmento de sequência de codificação.
[0058] Como usado neste documento, o termo "construto genético" refere-se às moléculas de DNA ou RNA que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína. A sequência de codificação inclui sinais de iniciação e de terminação ligados de forma operável a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células do indivíduo ao qual a molécula de ácido nucleico é administrada. Conforme usado neste documento, o termo "forma exprimível" se refere aos construtos de gene que contêm os elementos regulatórios necessários operáveis ligados a uma sequência de codificação que codifica uma proteína, de tal modo que quando presente na célula do indivíduo, a sequência de codificação será expressa.
[0059] "Idêntico" ou "identidade", conforme usado neste documento no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeo, podem significar que as sequências têm uma porcentagem especificada de resíduos que são as mesmas ao longo de uma região especificada. A porcentagem pode ser calculada ao alinhar, opcionalmente, as duas sequências, comparando as duas sequências ao longo da região especificada, determinar o número de posições em que os resíduos idênticos ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições compensadas, dividir o número de posições compensadas pelo número total de posições na região especificada e multiplicar o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Em casos onde as duas sequências são de comprimentos diferentes ou o alinhamento produz uma ou mais extremidades escalonadas e a região especificada de comparação inclui apenas uma sequência única, os resíduos da sequência única são incluídos no denominador, mas não no numerador do cálculo. Ao comparar DNA e RNA, timina (T) e uracila (U) podem ser consideradas equivalentes. A identidade pode ser executada manualmente ou ao se usar um algoritmo de sequência de computador, tal como BLAST ou BLAST 2.0.
[0060] "Impedância", conforme usado neste documento, pode ser usada ao discutir o mecanismo de resposta e pode ser convertida a um valor de corrente, de acordo com a lei de Ohm permitindo, desse modo, com a corrente predeterminada.
[0061] A "resposta imune", da forma como utilizado aqui, pode significar a ativação de um sistema imune de um hospedeiro, por exemplo, de um mamífero, em resposta à introdução de um ou mais antígenos neste documento através das vacinas aqui descritas. A resposta imune pode estar na forma de uma resposta celular ou humoral, ou ambas.
[0062] "Ácido nucleico" ou "oligonucleotídeo" ou "polinucleotídeo", conforme usado neste documento, pode significar pelo menos dois nucleotídeos ligados juntos de forma covalente. A representação de um filamento único também define a sequência do filamento complementar. Deste modo, um ácido nucleico também engloba o filamento complementar de um filamento único representado. Muitas variantes de um ácido nucleico podem ser usadas para o mesmo propósito como um dado ácido nucleico. Deste modo, um ácido nucleico também engloba substancialmente ácidos nucleicos idênticos e complementos destes. Um filamento único provê uma sonda que pode hibridizar uma sequência alvo sob condições de hibridização estritas. Deste modo, um ácido nucleico também engloba uma sonda que hibridiza sob condições de hibridização estritas.
[0063] Os ácidos nucleicos podem ser de filamento único ou filamento duplo, ou podem conter porções tanto de sequência de filamento duplo quanto filamento único. O ácido nucleico pode ser DNA, tanto genômico quanto cDNA, RNA ou um híbrido, onde o ácido nucleico pode conter combinações de desoxirribo e ribonucleotídeos, e combinações das bases incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Os ácidos nucleicos podem ser obtidos por métodos de síntese química ou por métodos recombinantes.
[0064] "Ligado de forma operável", conforme usado neste documento, pode significar que a expressão de um gene está sob o controle de um promotor com o qual é espacialmente conectado. Um promotor pode ser posicionado 5' (a montante) ou 3' (a jusante) de um gene sob seu controle. A distância entre o promotor e um gene pode ser aproximadamente a mesma que a distância entre esse promotor e o gene ele que controla no gene a partir do qual o promotor é derivado. Conforme é conhecido na técnica, a variação nesta distância pode ser acomodada sem perda da função de promotor.
[0065] Um "peptídeo", uma "proteína" ou um "polipeptídeo", conforme usado neste documento, pode significar uma sequência de aminoácidos ligados e pode ser natural, sintética ou uma modificação ou combinação de natural e sintética.
[0066] "Promotor", conforme usado neste documento, pode significar uma molécula sintética ou naturalmente derivada que é capaz de conferir, ativar ou intensificar a expressão de um ácido nucleico em uma célula. Um promotor pode compreender uma ou mais sequências regulatórias transcricionais específicas para realçar, adicionalmente, a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou a expressão temporal do mesmo. Um promotor também pode compreender os elementos intensificadores ou repressores distais, que podem ser localizados tanto como vários milhares de pares de base a partir do local de início de transcrição. Um promotor pode ser derivado de fontes incluindo viral, bacteriana, fúngica, de plantas, de insetos e animais. Um promotor pode regular a expressão de um componente de gene constitutivamente, ou diferencialmente com relação à célula, ao tecido ou ao órgão em que a expressão ocorre ou, com relação ao estágio de desenvolvimento em que a expressão ocorre, ou em resposta aos estímulos externos, tais como estresses fisiológicos, patogênicos, íons de metal, ou agentes de indução. Os exemplos representativos dos promotores incluem o promotor bacteriófago T7, promotor bacteriófago T3, promotor SP6, promotor operador lac, promotor tac, promotor tardio SV40, promotor precoce SV40, promotor RSV-LTR, promotor CMV IE, promotor precoce SV40 ou promotor tardio SV40 e o promotor CMV IE,
[0067] "Peptídeo sinal" e "sequência principal" são usados de forma permutável neste documento e se referem a uma sequência de aminoácido que pode ser ligada no amino terminal de uma proteína estabelecida neste documento. Peptídeos sinal/sequências principais normalmente direcionam a localização de uma proteína. Peptídeos sinal/sequências principais usados neste documento preferencialmente facilitam a secreção da proteína a partir da célula em que são produzidos. Peptídeos sinal/sequências principais são frequentemente clivados a partir do restante da proteína, frequentemente referidos como a proteína madura, mediante a secreção da célula. Peptídeos sinal/sequências principais são ligados no N terminal da proteína.
[0068] "Objeto" conforme usado neste documento pode significar um mamífero que deseja ou que possui necessidade de ser imunizado com a vacina descrita neste documento. O mamífero pode ser um humano, chipanzé, cão, gato, cavalo, vaca, camundongo ou rato.
[0069] "Condições estritas de hibridização", como usado aqui, significa que as condições sob as quais uma primeira sequência de ácido nucleico (por exemplo, sonda) irá hibridizar para uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, alvo), tal como em uma mistura complexa de ácidos nucleicos. Condições estritas são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. As condições estritas podem ser selecionadas para ser cerca de 5-10°C menor do que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica a uma força iônica definida de pH. O Tm pode ser a temperatura (sob força iônica definida, pH, e concentração nucleica) em que 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam à sequência do alvo em equilíbrio (conforme as sequências alvo estão presentes em excesso, em Tm, 50% das sondas são ocupadas em equilíbrio). As condições rigorosas podem ser aquelas em que a concentração de sal é menos do que o 1,0 M de íon de sódio, tal como aproximadamente 0,01-1,0 M de concentração de íon de sódio (ou outros sais) em um pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, aproximadamente 10-50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior do que cerca de 50 nucleotídeos). As condições estritas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores, tais como formamida. Para a hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo pode ser de pelo menos 2 a 10 vezes a hibridização de fundo (background). As condições de hibridização estritas exemplares incluem o seguinte: 50% de formamida, 5x SSC, e 1% de SDS incubando em 42°C ou 5x SSC, 1% de SDS incubando em 65°C, com lavagem em 0,2x SSC e 0,1% de SDS em 65°C.
[0070] "Substancialmente complementar", conforme usado neste documento, pode significar que a primeira sequência é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao complemento de uma segunda sequência ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou que as duas sequências hibridizam sob condições de hibridação estritas.
[0071] "Substancialmente idêntico(a)", conforme usado neste documento, significa que uma primeira e uma segunda sequências são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a uma região de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,1000, 1100 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou com relação a ácidos nucleicos, se a primeira sequência for substancialmente complementar ao complemento da segunda sequência.
[0072] "Tratamento" ou "tratar", conforme usado neste documento, pode significar proteger um animal de uma doença através de meios de prevenir, suprimir, reprimir ou eliminar completamente a doença. Prevenir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um animal antes da aparição da doença. Suprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um sujeito após a indução da doença, mas antes de seu aparecimento clínico. Reprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um animal após aparecimento clínico da doença.
[0073] "Variante", usado neste documento com relação a um ácido nucleico, pode significar (i) uma porção ou um fragmento de uma sequência de nucleotídeo referenciada; (ii) o complemento de uma sequência de nucleotídeo referenciada ou uma porção desta; (iii) um ácido nucleico que é substancialmente idêntico a um ácido nucleico referenciado ou o complemento deste; ou (iv) um ácido nucleico que hibridiza sob condições estritas ao ácido nucleico referenciado, complemento deste ou sequências substancialmente idênticas deste.
[0074] "Variante" com relação a um peptídeo ou polipeptídio que difere na sequência de aminoácido pela inserção, deleção ou substituição conservativa de aminoácidos, mas retém pelo menos uma atividade biológica. Variante também pode significar uma proteína com uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica a uma proteína referenciada com uma sequência de aminoácido que retem pelo menos uma atividade biológica. Uma substituição conservativa de um aminoácido, ou seja, a substituição de um aminoácido com um aminoácido diferente de propriedades semelhantes (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição das regiões carregadas) é reconhecida na técnica como tipicamente envolvendo uma pequena alteração. Estas pequenas mudanças podem ser identificadas, em parte, ao se considerar o índice hidropático de aminoácidos, conforme compreendido na técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é baseado em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga. É conhecido na técnica que os aminoácidos de índices hidropáticos similares podem ser substituídos e ainda reter a função de proteína. Em um aspecto, os aminoácidos tendo índices hidropáticos de ±2 são substituídos. A hidrofilicidade de aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas retendo a função biológica. Uma consideração da hidrofilicidade de aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior hidrofilicidade média local daquele peptídeo, uma medida útil que foi relatada para correlacionar bem com a antigenicidade e a imunogenicidade. A Patente U.S. N° 4.554.101 incorporada em sua totalidade neste documento por referência. Substituição de aminoácidos tendo valores de hidrofilicidade similares podem resultar em peptídeos retendo a atividade biológica, por exemplo, a imunogenicidade, como é conhecido na técnica. Substituições podem ser executadas com aminoácidos tendo valores de hidrofilicidade dentro de ±2 entre si. Tanto o índice do hidrofobicidade e o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral particular desse aminoácido. Consistente com essa observação, substituições de aminoácidos que são compatíveis com a função biológica são entendidas como dependentes da semelhança relativa dos aminoácidos e, particularmente, das cadeias laterais de tais aminoácidos, conforme revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras propriedades.
[0075] Uma variante pode ser uma sequência de ácido nucleico que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene total ou um fragmento deste. A sequência de ácido nucleico pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene ou um fragmento deste. Uma variante pode ser uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento deste. A sequência de ácido nucleico pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento deste.
[0076] "Vetor", conforme usado neste documento, pode significar uma seqüência de ácido nucleico contendo uma origem de replicação. Um vetor pode ser um plasmídeo, um bacteriófago, um cromossomo artificial bacteriano ou um cromossomo artificial de levedura. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou de RNA. Um vetor pode ser ou um vetor extracromossômico auto replicante ou um vetor que integre em um genoma de hospedeiro.
[0077] Para a recitação de intervalos numéricos neste documento, cada número de intervenção entre o mesmo grau de precisão é contemplado explicitamente. Por exemplo, para o intervalo de 6 a 9, os números 7 e 8 são contemplados além de 6 e 9, e para o intervalo de 6,0 a 7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 e 7.0 são contemplados explicitamente.
[0078] No presente documento são fornecidas as vacinas compreendendo um antígeno, um fragmento deste, um variante destes ou uma combinação deste. As vacinas podem ser capazes de gerar no mamífero uma resposta imune contra o antígeno. As vacinas podem compreender um plasmídeo ou uma pluralidade de plasmídeos conforme descritos em mais detalhes abaixo. As vacinas podem induzir uma resposta imune terapêutica ou profilática.
[0079] As vacinas podem ser usadas para proteger contra o câncer, por exemplo, um câncer ou tumor que expressa o gene 1 supressor do tumor de Wilm (WT1). As vacinas pode ser usadas para prevenir e/ou tratar um tumor que expressa WT1 em um sujeito em necessidade destas. As vacinas podem induzir respostas celulares e/ou de anticorpos contra o WT1 e contra tumores que expressam WT1.
[0080] As vacinas podem induzir ou provocar uma resposta imune no objeto que foi administrado a vacina. A resposta imune em um objeto que foi administrada a vacina pode ser induzida por pelo menos cerca de 40-vezes, 50-vezes, 60-vezes, 70-vezes, 80-vezes, 90-vezes, 100-vezes, 150-vezes, 200- vezes, 225-vezes, 250-vezes, 275-vezes, 300-vezes, 325-vezes, 350-vezes, 375-vezes, 400-vezes, 425-vezes, 450-vezes, 475-vezes, 500-vezes, 525- vezes, 550-vezes, 575-vezes, 600-vezes, 650-vezes, 700-vezes, 750-vezes, 800-vezes, 850-vezes, 900-vezes, 950-vezes, 1000-vezes, 1500-vezes, 2000- vezes, 2500-vezes, 3000-vezes, 3500-vezes, ou 4000-vezes. Em algumas modalidades, a resposta imune no objeto em que foi administrada a vacina pode ser induzida por pelo menos cerca de 300-vezes, 325-vezes, 350-vezes, 375-vezes, 400-vezes, 425-vezes, 450-vezes, 475-vezes, ou 500-vezes.
[0081] As vacinas podem induzir uma resposta imune humoral e/ou celular no objeto em que foi administrada a vacina. A resposta imune humoral induzida pode incluir anticorpos que são imunorreativos ao antígeno. A resposta imune celular induzida pode incluir células T que produzem interferon-gama (IFN-y) e são imunorreativas com o antígeno. A resposta imune celular em um objeto que foi administrada a vacina pode ser induzida por pelo menos cerca de 40-vezes, 50-vezes, 60-vezes, 70-vezes, 80-vezes, 90-vezes, 100-vezes, 150-vezes, 200-vezes, 225-vezes, 250-vezes, 275-vezes, 300-vezes, 325-vezes, 350-vezes, 375-vezes, 400-vezes, 425-vezes, 450- vezes, 475-vezes, 500-vezes, 525-vezes, 550-vezes, 575-vezes, 600-vezes, 650-vezes, 700-vezes, 750-vezes, 800-vezes, 850-vezes, 900-vezes, 950- vezes, 1000-vezes, 1500-vezes, 2000-vezes, 2500-vezes, 3000-vezes, 3500- vezes, ou 4000-vezes. Em algumas modalidades, a resposta imune celular no objeto em que foi administrada a vacina pode ser induzida por pelo menos cerca de 300-vezes, 325-vezes, 350-vezes, 375-vezes, 400-vezes, 425-vezes, 450-vezes, 475-vezes, ou 500-vezes.
[0082] As vacinas podem ser usadas para entregar um ou mais antígenos selecionados do grupo consistindo de: antígenos, fragmentos de tais antígenos, variantes de tais antígenos, e fragmentos das variantes. Em caso de entrega de antígenos múltiplos, a vacina pode incluir composições múltiplas ou uma única composição. A entrega pode incluir um único plasmídeo que pode ser usado para codificar múltiplos antígenos diferentes ou partes diferentes do mesmo antígeno. Em outras modalidades, a entrega pode incluir plasmídeos diferentes que codificam antígenos diferentes ou partes diferentes do mesmo antígeno.
[0083] As vacinas podem ser uma vacina de ácido nucleico, uma vacina de peptídeo ou uma combinação de vacina de ácido nucleico e peptídeo. A vacina de ácido nucleico pode compreender moléculas de ácido nucleico. A vacina de ácido nucleico pode compreender uma pluralidade das cópias de uma molécula única de ácido nucleico, tal como um plasmídeo único, uma pluralidade de cópias de uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos diferentes tais como dois ou mais plasmídeos diferentes.
[0084] A vacina de ácido nucleico pode compreender moléculas de ácido nucleico, tal como plasmídeos que contém coletivamente a sequência para um antígeno único, sequência de codificação heteróloga para dois antígenos ou mais. A vacina de ácido nucleico compreendendo sequência de codificação heteróloga de dois antígenos pode estar em uma única molécula de ácido nucleico tal como um plasmídeo único ou a vacina de ácido nucleico pode compreender duas moléculas de ácido nucleico diferentes tal como dois plasmídeos diferentes, em que uma molécula de ácido nucleico compreende a sequência de codificação heteróloga de um antígeno e outra molécula de ácido nucleico compreende a sequência de codificação heteróloga de um antígeno diferente. A vacina do ácido nucleico pode compreender duas moléculas de ácido nucleico diferentes tais como dois plasmídeos diferentes, em que uma molécula de ácido nucleico compreende a sequência de codificação heteróloga de uma primeira parte do antígeno e outra molécula de ácido nucleico compreende a sequência de codificação heteróloga de uma segunda parte do antígeno.
[0085] Semelhantemente, a vacina de ácido nucleico compreendendo a sequência de codificação heteróloga de três antígenos pode compreender uma única molécula de ácido nucleico tal como um único plasmídeo, duas moléculas de ácido nucleico diferentes ou três moléculas de ácido nucleico diferentes. Da mesma forma, a vacina de ácido nucleico compreendendo a sequência de codificação heteróloga de quatro antígenos pode compreender uma única molécula de ácido nucleico tal como um único plasmídeo, duas moléculas de ácido nucleico diferentes, três moléculas de ácido nucleico diferentes ou quatro moléculas de ácido nucleico diferentes.
[0086] A vacina de ácido nucleico pode incluir uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam o antígeno. A sequência de ácido nucleico pode ser DNA, RNA, cDNA, uma variante destes, um fragmento destes ou uma combinação destes. A sequência de ácido nucleico também pode incluir sequências adicionais que codificam o ligador, líder e/ou sequências de sinalização que são ligadas aos antígenos por uma ligação de peptídeos.
[0087] Em algumas modalidades, a vacina de ácido nucleico pode ainda compreender a sequência de codificação para um adjuvante molecular, em alguns casos, o adjuvante molecular pode ser IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33, e/ou RANTES, e em alguns casos, o adjuvante molecular é um inibidor de ponto de verificação, incluindo antígeno 4 de linfócito T anti-citotóxico (CTLA-4), receptor-1 anti-morte programada (PD-1) e gene anti-ativação de linfócito (LAG-3). A sequência de codificação para IL-12, IL-15, IL-28, IL- 31, IL-33 e/ou RANTES pode ser incluída em uma ou mais moléculas de ácido nucleico que compreende a sequência de codificação para um ou mais antígenos. A sequência de codificação para IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 e/ou RANTES pode ser incluída em moléculas de ácido nucleico individuais tais como um plasmídeo individual.
[0088] A vacina de peptídeo pode incluir um peptídeo antigênico, uma proteína antigênica, uma variante destes, um fragmento destes ou uma combinação destes. O DNA de combinação e vacina de peptídeo pode incluir uma ou mais sequências de ácido nucleico supracitadas que codificam o antígeno e o peptídeo antigênico ou proteína antigênica.
[0089] A vacina da presente invenção pode ter características requeridas das vacinas eficazes tais como sendo seguras, de forma que a própria vacina não causa doença ou morte; sendo protetora contra doença; induzindo o anticorpo de neutralização; induzindo a célula T de proteção; e fornecendo facilitação da administração, poucos efeitos colaterais, estabilidade biológica e baixo custo por dose.
[0090] Conforme descrito acima, a vacina pode compreender um antígeno. O antígeno pode ser gene 1 de supressor de tumor de Wilm (WT1), um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. WT1 é um fator de transcrição contendo no N-terminal, um domínio de ligação a DNA rico em prolina/glutamina e o C-terminal, quatro motivos de dedo de zinco. WT1 desempenha um papel no desenvolvimento normal do sistema urogenital e interage com inúmeros fatores, por exemplo, p53, um supressor de tumor conhecido e a serino-protease HtrA2, que cliva WT1 em múltiplos locais após o tratamento com um medicamento citotóxico.
[0091] Mutação de WT1 pode levar à formação de tumor ou câncer, por exemplo, tumor de Wilm ou tumores expressando WT1. O tumor de Wilm geralmente se forma em um ou ambos os rins antes de formar metástase para outros tecidos, por exemplo, porém não limitado a, tecido hepático, tecido do sistema do trato urinário, tecido da linfa ou tecido pulmonar. Consequentemente, o tumor de Wilm pode ser considerado um tumor metastático. O tumor de Wilm geralmente ocorre em crianças mais jovens (por exemplo, menores que 5 anos de idade) tanto nas formas esporádica como hereditária.
[0092] Consequentemente, a vacina pode ser usada para tratamento de objetos que sofrem de tumor de Wilm. A vacina também pode ser usada para tratamento de sujeito com tipos de câncer ou tumores que expressam o WT1 para prevenção do desenvolvimento de tais tumores nos objetos. O antígeno do WT1 pode diferir do tipo nativo, gene de TW1 "normal", e portanto, fornecer terapia ou profilaxia contra um tumor de expressa antígeno de WT1. Consequentemente, as sequências de antígeno de WT1 que diferem do gene WT1 nativo (por exemplo, genes ou sequências de WT1 mutante) são apresentadas neste documento.
[0093] As transcrições do gene de WT1 nativo são processadas em uma variedade de mRNAs e as proteínas resultantes não são todas de valor igual para indução de uma resposta imune. Os genes de WT1 mutantes descritos neste documento previnem o processamento alternativo, produzindo uma transcrição comprimento total e resultando em uma indução mais forte as respostas de células T e B efetoras. A primeira sequência de WT1 mutante é mencionada como CON WT1 com Dedos de Zinco modificados ou ConWT1- L. SED ID NO: 1 é uma sequência de ácido nucleico que codifica o antígeno WT1 CON WT1 com Dedos de Zinco modificados. SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácidos do antígeno de WT1 CON WT1 com Dedos de Zinco modificados. A segunda sequência de WT1 mutante é mencionada como CON WT1 sem Dedos de Zinco ou ConWT1-S. SED ID NO:3 é uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o antígeno de WTI CON WT1 sem Dedos de Zinco. SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácidos do antígeno de WT1 CON WT1 sem Dedos de Zinco modificados.
[0094] As moléculas de ácidos nucleicos isolados compreendendo as sequências heterólogas supracitadas são apresentadas. As moléculas de ácidos nucleicos isolados consistindo das sequências heterólogas supracitadas são apresentadas. As moléculas de ácidos nucleicos isolados compreendendo as sequências heterólogas supracitadas podem ser incorporadas em vetores tais como plasmídeos, vetores virais e outras formas de moléculas de ácidos nucleicos conforme descritas abaixo. As sequências de ácidos nucleicos que codificam os antígenos de WT1 são apresentadas neste documento. As sequências de codificação que codificam os antígenos de WT1 possuem sequências conforme descritas acima.
[0095] As moléculas de proteínas compreendendo as sequências de aminoácidos heterólogos são apresentadas. As moléculas de proteínas consistindo das sequências de aminoácidos heterólogos supracitadas são apresentadas. As proteínas e polipeptídeos tendo as sequências supracitadas são apresentadas neste documento. As proteínas e polipeptídeos pode ser mencionados como antígenos de WT1 e imunógenos de WT1. Os antígenos de WT1 são capazes de provocar uma resposta imune contra o tumor que expressa um antígeno de WT1.
[0096] Em um aspecto da invenção, deseja-se que o antígeno de consenso provenha para a transcrição e a tradução melhoradas, incluindo ter um ou mais do seguinte: seqüência de líder de conteúdo de GC baixa para aumentar a transcrição; estabilidade de mRNA e otimização do códon; eliminar os motivos de sequência tanto quanto possível de atuação de cis (isto é, caixas TAT A internas).
[0097] Em alguns aspectos da invenção, deseja-se gerar um antígeno de consenso que gere uma ampla resposta imune através de cepas múltiplas, incluindo ter um ou mais do seguinte: incorporar todas as sequências de comprimento inteiro disponíveis; gerar pelo computador as sequências que utilizam o amino-ácido de ocorrência mais comum em cada posição; e aumentar a reatividade cruzada entre cepas.
[0098] O antígeno de WT1 pode ser uma sequência de antígeno consenso (ou imunógeno) derivada de duas ou mais espécies. O antígeno de WT1 pode compreender uma sequência consenso e/ou modificações para a expressão melhorada. A modificação pode incluir otimização de códon, otimização de RNA, adicional de uma sequência de kozak (por exemplo, GCC ACC) para iniciação de tradução aumentada e/ou a adição de uma sequência líder de imunoglobulina para aumentar a imunogenicidade do antígeno WT1. O antígeno de WT1 pode compreender um peptídeo de sinal tal como um peptídeo de sinal de imunoglobulina, por exemplo, não limitado a uma peptídeo de sinal de imunoglobulina E (IgE) ou imunoglobulinda G (IgG). Em algumas modalidades, o antígeno consenso WT1 pode compreender um marcador de hemaglutinina (HA). O antígeno consenso de WT1 pode ser designado para desencadear respostas imunes celulares e/ou humorais mais fortes e mais amplas do que um antígeno de WT1 otimizado de códon correspondente.
[0099] O antígeno consenso de WT1 pode compreender uma ou mais mutações em um ou mais dedos de zinco, desencadeando com isso respostas imunes celulares e/ou humorais mais fortes e mais amplas do que um antígeno de WT1 otimizado de códon correspondente. Uma ou mais mutações pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos que coordenam o íon de zinco em um ou mais dedos de zinco. Um ou mais aminoácidos que coordenam o íon de zinco pode ser um motivo de CCHH. Consequentemente, em algumas modalidades, uma ou mais mutações podem substituir 1, 2, 3 ou todos os 4 aminoácidos do motivo CCHH.
[00100] Em outra modalidade, uma ou mais mutações são de uma forma em que os resíduos 312, 317, 342 e 347 da SEQ ID NO:2 são quaisquer resíduos, exceto cisteína (C) e resíduos 330, 334, 360 e 364 da SED ID NO:2 são quaisquer resíduos, exceto histidina (H). Em especial, uma ou mais mutações são de uma forma em que os resíduos 312, 317, 330, 334, 342,347, 360 e 364 da SEQ ID NO:2 são glicina (G).
[00101] Em outras modalidades, um ou mais dedos de zinco podem ser removidos do antígeno consenso de WT1. Um, dois, três ou todos os quatro dos dedos de zinco podem ser removidos do antígeno consenso WT1.
[00102] O antígeno consenso de WT1 pode ser a SEQ ID NO:1 do ácido nucleico que codifica a SEQ ID NO:2 (FIGS. 6A e 6B). Em algumas modalidades, o antígeno consenso de WT1 pode ser a sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre o comprimento total da sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o antígeno consenso de WT1 pode ser a sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre o comprimento total da sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO:2.
[00103] Em ainda outras modalidades, o antígeno consenso de WT1 pode ser a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre o comprimento total da sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO:2, desde que os resíduos 312, 317, 342, e 347 da SEQ ID NO:2 sejam quaisquer resíduos, exceto cisteína (C) e resíduos 330, 334, 360, e 364 da SEQ ID NO:2 são quaisquer resíduos, exceto histidina (H). Em outras modaldiades, o antígeno consenso WT1 pode ser a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre um comprimento total de sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO:2, desde que os resíduos 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360, e 364 da SEQ ID NO:2 sejam glicina (G).
[00104] O antígeno consenso WT1 pode ser a sequência de aminoácido SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, o antígeno consenso de WT1 pode ser a sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre o comprimento total da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO:2. O antígeno consenso de WT1 pode ser a sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre o comprimento total da sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO:2, desde que os resíduos 312, 317, 342, e 347 da SEQ ID NO:2 sejam quaisquer resíduos, exceto cisteína (C) e resíduos 330, 334, 360, e 364 da SEQ ID NO:2 são quaisquer resíduos, exceto histidina (H). Em outras modalidades, o antígeno consenso de WT1 pode ser a sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre um comprimento total de sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO:2, desde que os resíduos 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360, e 364 da SEQ ID NO:2 sejam glicina (G).
[00105] O antígeno consenso de WT1 pode ser a SEQ ID NO:3 do ácido nucleico que codifica a SEQ ID NO:4 (FIGS. 7A e 7B). Em algumas modalidades, o antígeno consenso de WT1 pode ser a sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre um comprimento total da sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO:3. Em algumas modalidades, o antígeno consenso de WT1 pode ser a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre o comprimento total da sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO:4.
[00106] O antígeno consenso WT1 pode ser a sequência de aminoácido SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, o antígeno consenso de WT1 pode ser a sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre o comprimento total da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO:4.
[00107] Fragmentos imunogênicos de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4 podem ser fornecidos. Fragmentos imunogênicos podem compreender pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da SEQ ID NO:2 e/ou SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, os fragmentos imunogênicos podem compreender pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da SEQ ID NO:2, desde que os resíduos 312, 317, 342, e 347 da SEQ ID NO:2 estejam presentes no fragmento imunogênico, então estes resíduos são quaisquer resíduos, exceto cisteína (C), e desde que os resíduos 330, 334, 360, e 364 da SEQ ID NO:2 estejam presentes no fragmentos imunogênicos, então, estes resíduos são quaisquer resíduos, exceto histidina (H). Em outras modalidades, os fragmentos imunogênicos podem compreender pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da SEQ ID NO:2, desde que os resíduos 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360, e 364 da SEQ ID NO:2 estejam presentes no fragmento imunogênico, então, estes resíduos são glicina (G).
[00108] Em algumas modalidades, os fragmentos imunogênicos incluem uma sequência líder, por exemplo, uma sequência líder de imunoglobulina, tal como a sequência líder de imunoglobulina E (IgE). Em algumas modalidades, os fragmentos imunogênicos estão livres de uma sequência líder.
[00109] Os fragmentos imunogênicos de proteínas com sequências de aminoácidos tendo identidade para fragmentos imunogênicos da SED ID NO:2 e 4 podem ser fornecidos. Tais fragmentos podem compreender pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% das proteínas tendo 95% ou identidade maior para SEQ ID NO:2 e/ou SEQ ID NO:4. Algumas modalidades referem-se a fragmentos imunogênicos que tem 96% ou mais de identidade aos fragmentos imunogênicos das sequências de proteínas de WT1 neste documento. Algumas modalidades referem-se a fragmentos imunogênicos que tem 97% ou mais de identidade para os fragmentos imunogênicos das sequências de proteínas de WT1 no presente documento. Algumas modalidades referem-se a fragmentos imunogênicos que tem 98% ou mais de identidade aos fragmentos imunogênicos das sequências de proteínas de WT1 neste documento. Algumas modalidades referem-se a fragmentos imunogênicos que tem 99% ou mais de identidade aos fragmentos imunogênicos das sequências de proteínas de WT1 neste documento. Em algumas modalidades, os fragmentos imunogênicos incluem uma sequência líder, por exemplo, uma sequência líder de imunoglobulina, tal como a sequência líder de imunoglobulina de IgE. Em algumas modalidades, os fragmentos imunogênicos estão livres de uma sequência líder.
[00110] Algumas modalidades se referem aos fragmentos imunogênicos da SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3. Fragmentos imunogênicos podem compreender pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:3. Em algumas modalidades, os fragmentos imunogênicos incluem sequências que codificam uma sequência líder, por exemplo, uma sequência líder de imunoglobulina, tal como a sequência líder de IgE. Em algumas modalidades, os fragmentos imunogênicos são livres de sequências de codificação que codificam uma sequência líder. Os fragmentos imunogênicos de ácidos nucleicos com sequências de nucleotídeos tendo identidade para fragmentos imunogênicos da SED ID NO:1 e SEQ ID NO:3 podem ser fornecidos. Tais fragmentos podem compreender pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% dos ácidos nucleicos tendo 95% ou identidade maior para SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:3. Algumas modalidades referem-se a fragmentos imunogênicos que tem 96% ou mais de identidade aos fragmentos imunogênicos das sequências de ácidos nucleicos de WT1 neste documento. Algumas modalidades referem-se a fragmentos imunogênicos que tem 97% ou mais de identidade para os fragmentos imunogênicos das sequências de proteínas de WT1 no presente documento. Algumas modalidades referem-se a fragmentos imunogênicos que tem 98% ou mais de identidade aos fragmentos imunogênicos das sequências de ácidos nucleicos de WT1 neste documento. Algumas modalidades referem-se a fragmentos imunogênicos que tem 99% ou mais de identidade para os fragmentos imunogênicos das sequências de ácidos nucleicos de WT1 no presente documento. Em algumas modalidades, os fragmentos imunogênicos incluem sequências que codificam uma sequência líder, por exemplo, uma sequência líder de imunoglobulina, tal como a sequência líder de IgE. Em algumas modalidades, os fragmentos imunogênicos são livres de sequências de codificação que codificam uma sequência líder.
[00111] A vacina pode compreender um ou mais vetores que incluem um ácido nucleico heterólogo que codifica o antígeno. Um ou mais vetores podem ser capazes de expressar o antígeno em uma quantidade eficaz para desencadear uma resposta imune no mamífero. O vetor pode compreender um ácido nucleico heterólogo que codifica o antígeno. O vetor pode ter uma sequência de ácido nucleico que contém uma origem de replicação. O vetor pode ser um plasmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura. O vetor pode ser um vetor extracromossômico de auto-replicação ou um vetor que se integra em um genoma hospedeiro.
[00112] Um ou mais vetores podem ser um construto de expressão, que é geralmente um plasmídeo que é usado para introduzir um gene específico em uma célula-alvo. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula, a proteína que é codificada pelo gene é produzida pela transcrição celular e complexos ribossômicos de maquinário de translação. O plasmídeo é geralmente manipulado para conter sequências regulatórias que atuam como regiões de potencializador e promotor e que resultam em transcrição eficiente do gene transportado no vetor de expressão. Os vetores da presente invenção expressão grandes quantidades de RNA mensageiros estáveis e, portanto, proteínas.
[00113] Os vetores podem ter sinais de expressão tais como um promotor forte, um códon de terminação forte, ajuste da distância entre o promotor e o gene clonado e a inserção de uma sequência de terminação de transcrição e um PTIS (sequência de iniciação de tradução portátil). (1) Vetores de Expressão
[00114] O vetor pode ser um plasmídeo circular ou um ácido nucleico linear. O plasmídeo circular e ácido nucleico linear são capazes de direcionar a expressão de uma sequência de nucleotídeo particular em uma célula de sujeito apropriado. O vetor pode ter um promotor ligado de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos que codifica antígeno que pode estar ligada de forma operacional com sinais de terminação. O vetor também pode conter sequências requeridas para a tradução adequada da sequência de nucleotídeos. O vetor compreendendo a sequência de nucleotídeos de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um de seus componentes é heterólogo com relação a pelo menos um de seus outros componentes. A expressão da sequência de nucleotídeos no cassete de expressão pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível, que inicia a transcrição apenas quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externo específico. No caso de um organismo multicelular, o promotor também pode ser específico para um tecido ou órgão ou estágio de desenvolvimento particular. (2) Plasmídeo
[00115] O vetor pode ser um plasmídeo. O plasmídeo pode ser útil para transfecção de células com o ácido nucleico que codifica um antígeno, no qual as células hospedeiras transformadas são cultivadas e mantidas sob condições em que a expressão do antígeno ocorre.
[00116] O plasmídeo pode compreender uma seqüência do ácido nucleico que codifica um ou mais de vários antígenos supracitados incluindo as sequências de codificação que codificam o antígeno de consenso sintético capaz de desencadear uma resposta imune contra um antígeno, fragmentos de tais proteínas, variantes de tais proteínas, fragmentos dos variantes ou proteínas de fusão que são compostos de combinações de proteínas de consenso e/ou os fragmentos de proteína de consenso e/ou os variantes da proteína de consenso e/ou os fragmentos de proteínas de consenso de variantes.
[00117] Um único plasmídeo pode conter sequência de codificação para um único antígeno, sequência de codificação para dois antígenos, sequência de codificação para três antígenos ou sequência de codificação para quatro antígenos.
[00118] Em algumas modalidades, um plasmídeo pode compreender uma sequência de codificação que codifica CCR20 sozinho ou como parte de um destes plasmídeos. Similarmente, os plasmídeos podem adicionalmente compreender sequências de codificação para IL-12, IL-15 e/ou IL-28.
[00119] O plasmídeo pode adicionalmente compreender um códon de início, que possa ser a montante da sequência de codificação, e um códon de término, que possa ser a jusante da seqüência de codificação. O códon de iniciação e de terminação pode estar na estrutura com a sequência de codificação.
[00120] O plasmídeo pode também compreender um promotor que é ligado operacionalmente a sequência de codificação. O promotor operacionalmente ligado à sequência de codificação pode ser um promotor do vírus símio 40 (SV40), um promotor do vírus do tumor mamário murino (MMTV), um promotor do vírus de imunodeficiência humana (HIV), tais como promotor de extremidades em repetições longas (LTR) do vírus de imunodeficiência bovina (BIV), um promotor de vírus Moloney, um promotor do vírus da leucose aviária (ALV), um promotor de citomegalovírus (CMV), tal como o promotor precoce imediato de CMV, promotor do vírus Epstein- Barr (EBV), ou um promotor de vírus do sarcoma de Rous (RSV). O promotor pode ser um promotor de um gene humano tal como a actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina humana de músculo, ou metalotioneína humana. O promotor também pode ser um promotor específico de tecido, tal como um promotor específico de músculo ou pele natural ou sintético. Exemplos de tais promotores são descritos na publicação de pedido de patente U.S. N° US20040175727, cujos conteúdos são incorporados neste documento em sua totalidade.
[00121] O plasmídeo também pode compreender um sinal de poliadenilação, o qual pode ser a jusante da sequência de codificação. O sinal de poliadenilação pode ser um sinal de poliadenilação de SV40, sinal de poliadenilação de LTR, sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento de bovinos (bGH), sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento humano (hGH), ou sinal de poliadenilação de β-globin humano(hgH). O sinal de poliadenilação de SV40 pode ser um sinal de poliadenilação de um plasmídeo pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).
[00122] O plasmídeo também pode compreender um potenciador a montante da seqüência de codificação. O potencializador pode ser actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano ou um potencializador viral, tal como um de CMV, FMDV, RSV ou EBV. Potencializadores de função de polinucleotídeo são descritos nas Patentes U.S. N° 5.593.972, 5.962.428, e W094/016737, os conteúdos de cada uma são incorporados inteiramente por referência.
[00123] O plasmídeo também pode compreender uma origem mamífera de replicação a fim de manter o plasmídeo de forma extracromossômica e produzir cópias múltiplas do plasmídeo em uma célula. O plasmídeo pode ser pVAXI, pCEP4 ou pREP4 da Invitrogen (San Diego, CA), que pode compreender a origem de replicação do vírus Epstein-Barr e da região de codificação EBNA-1 do antígeno nuclear, que pode produzir replicação epissomal de alta cópia sem integração. A cadeia principal do plasmídeo pode ser pA V0242. O plasmídeo pode ser um plasmídeo de adenovírus defeituoso de replicação de tipo 5 (Ad5).
[00124] O plasmídeo também pode compreender uma sequência regulatória, que possa bem ser servida para a expressão de gene em uma célula em que o plasmídeo é administrado. A sequência de codificação pode compreender um códon que pode permitir uma transcrição mais eficiente da seqüência de codificação na célula de hospedeiro.
[00125] A sequência de codificação também pode compreender uma seqüência de líder de Ig. A seqüência de líder pode ser 5 '' da seqüência de codificação. Os antígenos de consenso codificados por esta seqüência podem compreender um líder de Ig de terminal N seguido por uma proteína de antígeno de consenso. O líder de Ig de terminal N pode ser IgE ou IgG.
[00126] O plasmídeo pode ser pSE420 (Invitrogen, São Diego, Calif.), o qual pode ser usado para a produção de proteína em ESCHERICHIA COLI (E.coli). O plasmídeo também pode ser pYES2 (Invitrogen, São Diego, Calif.), o qual pode ser usado para a produção de proteína em cepas de Saccharomyces cerevisiae de levedura. O plasmídeo também pode ser do sistema de expressão de baculovírus completo de MAXBAC™ (Invitrogen, São Diego, Calif.), o qual pode ser usado para a produção de proteína em células de inseto. O plasmídeo também pode ser pcDNA I ou o pcDNA3 (Invitrogen, São Diego, Calif), os quais podem ser usados para a produção de proteína em células de mamíferos, tais como as células de ovário de hamster chinês (CHO). (3) Vetores Circulares e Lineares
[00127] O vetor pode ser plasmídeo circular, que pode transformar uma célula-alvo por integração no genoma celular ou existir de forma extracromossômica (por exemplo, plasmídeo replicação autônoma com uma origem de replicação).
[00128] O vetor pode ser pVAX, pcDNA3.0 ou provax, ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar DNA que codifica o antígeno e permite que uma célula traduza a sequência para um antígeno que é reconhecido pelo sistema imune.
[00129] Também fornecido no presente documento está uma vacina de ácido nucleico ou cassete de expressão linear ("LEC") que é capaz de ser entregue de forma eficiente para um objeto através de eletroporação e expressão de um ou mais antígenos desejados. O LEC pode ser qualquer DNA linear desprovido de qualquer cadeia principal de fosfato. O DNA pode codificar um ou mais antígenos. O LEC pode conter um promotor, um íntron, um códon de terminação e/ou um sinal de poliadenilação. A expressão do antígeno pode ser controlada pelo promotor. O LEC pode não conter quaisquer genes de resistência ao antibiótico e/ou uma cadeia principal de fosfato. O LEC pode não conter outras sequências de ácido nucleico não relacionadas à expressão de gene do antígeno desejado.
[00130] O LEC pode ser derivado a partir de qualquer plasmídeo capaz de ser linearizado. O plasmídeo pode ser capaz de expressar o antígeno. O plasmídeo pode ser pNP (Porto Rico/34) ou pM2 (Nova Caledônia/99). O plasmídeo pode ser WLV009, pVAX, pcDNA3.0 ou provax, ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar DNA que codifica o antígeno e permite que uma célula traduza a sequência para um antígeno que é reconhecido pelo sistema imune.
[00131] O LEC pode ser pcrM2. O LEC pode ser pcrNP. pcrNP e pcrMR podem ser derivados de pNP (Porto Rico/34) e pM2 (Nova Caledônia/99), respectivamente. (4) Promotor, Íntron, Códon de Terminação e Sinal de Poliadenilação.
[00132] O vetor pode ser um promotor. Um promotor pode ser qualquer promotor que é capaz de acionar expressão de gene e regular a expressão do ácido nucleico isolado. Tal promotor é um elemento de sequência de atuação de cis requerido pela transcrição através de uma polimerase de RNA dependente de RNA que transcreve a sequência de antígeno descrita neste documento. A seleção do promotor usado para direciona a expressão de um ácido nucleico heterólogo depende da aplicação específica. O promotor pode ser posicionado sobre a mesma distância a partir do início de transcrição no vetor conforme é a partir do local de início de transcrição em seu ajuste natural. Entretanto, a variação nesta distância pode ser acomodada sem perda da função de promotor.
[00133] O promotor pode ser ligado de forma operacional a sequência de ácido nucleico que codifica o antígeno e sinais requeridos para a poliadenilação eficiente da transcrição, locais de ligação de ribossomo e terminação de tradução.
[00134] O promotor pode ser um promotor de CMV, promotor precoce de SV40, promotor tardio de SV40, promotor de metalotionina, promotor de vírus de tumor mamário murino, promotor de vírus de sarcoma de Rous, promotor de poliedrina ou outra eficácia demonstrada pelo promotor para expressão em células eucarióticas.
[00135] O vetor pode incluir um potencializador e um íntron com doador de splice funcional e locais de aceptores. O vetor pode conter uma região de terminação de transcrição a jusante do gene estrutural para fornecer uma terminação eficiente. A região de terminação pode ser obtida pelo mesmo gene conforme a sequência do promotor ou pode ser obtido a partir de genes diferentes. (5) Método para Preparar o Vetor
[00136] Os métodos para preparar o vetor que compõe as vacinas de DNA discutidas neste documento são apresentadas. O vetor, após a etapa final de subclonagem no plasmídeo de expressão dos mamíferos, pode ser usado para inocular uma cultura de células em um tanque de fermentação em larga escala, usando métodos conhecidos na técnica.
[00137] O vetor para uso com dispositivos de EP que são descritos abaixo em mais detalhes podem ser formulados ou fabricados usando uma combinação de dispositivos e técnicas conhecidos, mas preferencialmente são fabricados usando uma técnica otimizada de fabricação de plasmídeo que é descrita em um pedido provisório licenciado e co-pendente U.S. N° de Série 60/939.792, o qual foi depositado em 23 de maio de 2007. Em alguns exemplos, o plasmídeo de DNA utilizado nesses estudos pode ser formulado em concentrações maiores que ou iguais a 10 mg/mL. As técnicas de fabricação também incluem ou incorporam vários dispositivos e protocolos que são comumente conhecidos por aqueles ordinariamente versados na técnica, além daqueles descritos em U.S. N° de Série 60/939792 incluindo aqueles descritos em uma patente licenciada, Patente U.S. N° 7.238.522, a qual foi expedida em 3 de julho de 2007. A aplicação referida acima, a Patente U.S. N° de Série 60/939.792 e a Patente U.S. N° 7.238.522, respectivamente, são incorporadas por meio deste documento em sua totalidade. c. Excipientes e outros Componentes da Vacina
[00138] A vacina pode adicionalmente compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser moléculas funcionais, tais como veículos, transportadores ou diluentes. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um agente facilitador de transfecção, que pode incluir agentes ativos de superfície, tais como complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freund, análogo de LPS incluindo lipídio monofosforila A, peptídeos muramila, análogos de quinona, vesículas, tais como esqualeno e esqualeno, ácido hialurônico, lipídios, lipossomas, íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nanopartículas, ou outros agentes facilitadores de transfecção conhecidos.
[00139] O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion, incluindo poli-L-glutamato (LGS) ou lipídio. O agente facilitador de transfecção é poli-L-glutamato, e o poli-L-glutamato pode estar presente na vacina em uma concentração menor do que 6 mg/ml. O agente facilitador de transfecção também pode incluir agentes ativos de superfície, tais como complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freund, análogo do LPS incluindo lipídio monofosforila A, peptídeos muramila, análogos de quinona e vesículas, tais como esqualeno e esqualeno e ácido hialurônico também pode ser usado administrado em conjunto com o construto genético. As vacinas de plasmídeo de DNA podem também incluir um agente facilitador de transfecção tal como os lipídios, lipossomas, incluindo os lipossomas de lecitina ou outros lipossomas conhecidos na técnica, como uma mistura de lipossoma de DNA (veja por exemplo W09324640), íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nanopartículas, ou outros agentes facilitadores de transfecção conhecidos. O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion, incluindo poli-L- glutamato (LGS) ou lipídio. A concentração do agente de transfecção na vacina é menor que 4 mg/ml, menor que 2 mg/ml, menor que 1 mg/ml, menor que 0,750 mg/ml, menor que 0,500 mg/ml, menor que 0,250 mg/ml, menor que 0,100 mg/ml, menor que 0,050 mg/ml, ou menor que 0,010 mg/ml.
[00140] O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes podem ser outros genes que são expressos em plasmídeo alternativo ou são distribuídos como proteínas em combinação com o plasmídeo acima na vacina. Um ou mais adjuvantes pode ser selecionados do grupo consistindo de: CCL20, α-interferon (IFN- α), β-interferon (IFN-β), Y-interferon, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, fator de crescimento epidermal (EGF), quimiocina de atração da célula T cutânea (CTACK), quimiocina expressada por timo epitelial (TECK), quimiocina epitelial associada à mucosa (MEC), o IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1~, IL-8, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM- 1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, formas mutantes de IL- 18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator decrescimento de fibroblastos, IL-7, fator do crescimento de nervo, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, ICE de Caspase, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inativo, SAP K, SAP-I, JNK, genes de resposta de interferon, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, IL-15 tendo a sequência de sinal ou sequência de codificação que codifica a sequência de sinal apagada e, opcionalmente, incluindo um peptídeo de sinal de diferença tal como do IgE ou sequência de codificação que codifica um peptídeo de sinal diferente tal como do IgE e fragmentos funcionais deste ou uma combinação destes. O adjuvante pode ser IL-12, IL- 15, IL-28, CTACK, TECK, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 ou uma combinação dos mesmos.
[00141] Em algumas modalidades, adjuvantes podem um ou mais proteínas e/ou moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas selecionadas a partir do grupo que consiste de: CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC ou RANTES. Os exemplos das construções de IL-12 e sequências são divulgados no pedido PCT No. PCT/US 1997/019502 e o Pedido No. U.S.08/956.865 correspondente, o Pedido Provisório No. U.S.61/569600 depositado em 12 de Dezembro de 2011, os quais são cada um incorporados aqui por referência. Os exemplos das construções de IL-15 e sequências são divulgados no pedido PCT No. PCT/US04/18962 e o Pedido No. U.S.10/560.650 correspondente, e no pedido PCT No. PCT/US07/00886 e o Pedido No. U.S.12/160.766, e no pedido PCT No. PCT/US I0/048827, os quais são cada um incorporados aqui por referência. Os exemplos dos construtos e sequências de IL-28 são divulgados no pedido PCT No. PCT/US 09/039648 e o Pedido No. U.S.12/936.192 correspondente, os quais são cada um incorporados aqui por referência. Os exemplos de RANTES e outras construções e sequências são divulgados no pedido PCT No. PCT/US 1999/004332 e o Pedido U.S. No. 09/622452 correspondente, os quais são cada um incorporados aqui por referência. Outros exemplos de RANTES e outras construções e sequências são divulgados no pedido PCT No. PCT/US11/024098, que é incorporado aqui por referência. Os exemplos de RANTES e outras construções e sequências são divulgados no pedido PCT No. PCT/US1999/004332 e o Pedido U.S N° de Série 09/622452 correspondente, os quais são cada um incorporados aqui por referência. Outros exemplos de RANTES e outras construções e sequências são divulgados no pedido PCT No. PCT/US11/024098, que é incorporado aqui por referência. Os exemplos de quimiocinas CTACK, TECK e construções e sequências de MEC são divulgados no pedido PCT no. PCT/US2005/042231 e o Pedido U.S. N° de Série U.S.11/719.646 correspondente, os quais são cada um incorporados aqui por referência. Os exemplos de OX40 e de outros imunomoduladores são divulgados na Patente No. U.S.10/560.653, que é incorporada aqui por referência. Os exemplos de DR5 e de outros imunomoduladores são divulgados no Pedido U.S. N° de Série U.S.09/622452, que é incorporado aqui por referência.
[00142] Outros genes que podem ser adjuvantes úteis incluem aqueles que codificam: MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectina, P- selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac- 1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G- CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento do fibroblasto, IL- 7, IL-22, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor do TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inativa, SAP K, SAP-1, JNK, genes de resposta interferon, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC 5 , TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, Ligante RANK, Ox40, Ligante Ox40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 e fragmentos funcionais dos mesmos.
[00143] A vacina pode compreender adicionalmente um agente facilitador de vacina genético como descrito na U.S. N° de Série 021.579, depositada em 1° de Abril de 1994, a qual é incorporada inteiramente por referência.
[00144] A vacina pode compreender os antígenos e os plasmídeos em quantidades de aproximadamente 1 nanograma a 100 milligramas; aproximadamente 1 micrograma a aproximadamente 10 milligramas; ou preferivelmente aproximadamente 0,1 microgramas a aproximadamente 10 milligramas; ou mais preferivelmente aproximadamente 1 milligrama a aproximadamente 2 milligramas. Em algumas modalidades preferenciais, a vacina de acordo com a presente invenção compreende cerca de 5 nanogramas a cerca de 1000 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, a vacina pode conter cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, a vacina pode conter cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, a vacina pode conter cerca 1 a cerca de 350 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, a vacina pode conter aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramas, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 microgramas, de aproximadamente 1 nanograma a 100 milligramas; de aproximadamente 1 micrograma a aproximadamente 10 milligramas; de aproximadamente 0,1 microgramas a aproximadamente 10 milligramas; de aproximadamente 1 milligrama a aproximadamente 2 milligramas, de aproximadamente 5 nanogramas a aproximadamente 1000 microgramas, de aproximadamente 10 nanogramas a aproximadamente 800 microgramas, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 500 microgramas, de aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramas, de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramas, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 microgramas do antígeno ou plasmídeo dos mesmos.
[00145] A vacina pode ser formulada de acordo com a modalidade da administração a ser usada. Uma composição farmacêutica vacinal injetável pode ser estéril, livre de pyrogen e livre de partículas. Uma formulação ou solução isotônica pode ser usada. Os aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. A vacina pode compreender um agente de vasoconstrição. As soluções isotônicas podem incluir tampão fosfato-salino. A vacina pode compreender adicionalmente estabilizadores incluindo gelatina e albumina. Os estabilizadores podem permitir que a formulação seja estável em temperatura ambiente ou por períodos de tempo prolongados, incluindo LGS ou policátions ou poliânions. 3. Métodos de Entrega da Vacina
[00146] Provê-se aqui um método para a entrega de vacina para proporcionar construtos genéticos e antígenos, que compreendem epítopos que os tornam eficazes particularmente contra imunógenos alvo contra o qual uma resposta imune pode ser induzida. O método de entrega da vacina ou vacinação pode ser provido para induzir uma resposta imune terapêutica e profilática. O processo de vacinação pode gerar no mamífero uma resposta imune contra o antígeno. A vacina pode ser entregue a um indivíduo para modular a atividade do sistema imune de mamíferos e aprimorar a resposta imune. A entrega da vacina pode ser a transfecção do antígeno como uma molécula de ácido nucleico que é expressada na célula e entregue à superfície da célula sob a qual o sistema imune reconhece e induz uma resposta celular, humoral, ou resposta celular e humoral. A entrega da vacina pode ser usada para induzir ou desencadear uma resposta imune nos mamíferos contra o antígeno, administrando aos mamíferos a vacina como discutido acima.
[00147] Após a entrega da vacina e do plasmídeo dentro das células do mamífero, as células transfectadas expressarão e secretarão o antígeno para cada um dos plasmídeos injetados da vacina. Este antígeno será reconhecido como corpo estranho pelo sistema imune e os anticorpos atuaram contra ele. Estes anticorpos serão mantidos pelo sistema imune e permitirão uma resposta eficaz contra o antígeno.
[00148] A vacina pode ser administrada a um mamífero para eliciar uma resposta imune em um mamífero. O mamífero pode ser humano, primata, primata não humano, vaca, gado, carneiro, cabra, antílope, bisão, búfalo de água, bisonte, bovídeos, cervo, procos-espinho, elefantes, lhama, alpaca, camundongos, ratos e galinhas.
[00149] A vacina pode ser administrada em combinação com outras proteínas e/ou genes que codificam CCL20, a-interferon, y-interferon, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, fator de crescimento epidermal (EGF), quimiocina de atração de célula T cutânea (CTACK), quimiocina expressada por timo epitelial (TECK), quimiocina epitelial associada à mucosa (MEC), o IL-12, IL-15 incluindo IL-15 que tem a seqüência de sinal excluída e opcionalmente inclui o peptídeo sinal diferente tal como o peptídeo sinal de IgE, MHC, CD80, CD86, IL-28, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-lα, MIP-lβ, IL-8, RANTES, L- selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento de fibroblastos, IL-7, fator do crescimento de nervo, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, ICE de Caspase, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inativo, SAP K, SAP-I, JNK, genes de resposta de interferon, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, ligante de RANK, Ox40, ligante de Ox40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2 e fragmentos funcionais destes ou combinações destes. Em algumas modalidades, a vacina é administrada em combinação com uma ou mais das seguintes moléculas e/ou das proteínas de ácido nucleico: as moléculas de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste de moléculas de ácido nucleico que compreendem uma seqüência de codificação que codifica um ou mais de CCL20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC e RANTES ou respectivos fragmentos funcionais, e proteínas selecionadas do grupo que consiste de: CCL20, proteína IL-12, proteína IL-15, proteína IL-28, proteína de CTACK, proteína TECK, proteína MEC ou proteína RANTES ou respectivos fragmentos funcionais.
[00150] A vacina pode ser administrada por rotas diferentes, incluindo oral, parenteral, sublingual, transdermal, retal, transmucosal, tòpica, através de inalação, através de administração oral, intrapleural, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intranasal, intratecal e intraarticular ou respectivas combinações. Para uso veterinário, a vacina pode ser administrada como uma formulação adequadamente aceitável de acordo com a prática veterinária normal. O veterinário pode prontamente determinar o regime de dosagem e a rota de administração que é a mais apropriada para um animal particular. A vacina pode ser administrada por seringas tradicionais, por dispositivos de injeção sem agulha, "pistola de gene de bombardeamento de microprojécteis", ou outros métodos físicos tais como eletroporação ("EP"), "método hidrodinâmico", ou ultrassom.
[00151] O plasmídeo da vacina pode ser entregado ao mamífero por diversas tecnologias bem conhecidas, incluindo injeção de DNA (também chamada de vacinação de DNA) com e sem eletroporação in vivo, mediada por ipossoma, facilitada por nanopartículas, vetores recombinantes tais como o adenovírus recombinante, adenovírus recombinante associado ao vírus e vacina recombinante. O antígeno ou imunógeno pode ser entregue através de injeção de DNA e junto com eletroporação in vivo.
[00152] A vacina pode ser formulada de acordo com as técnicas padronizadas bem conhecidas para os versados na técnica farmacêutica. Tais composições podem ser administradas em dosagens e por técnicas bem conhecidas para os versados nas técnicas médicas levando em consideração tais fatores como idade, sexo, peso e condição do objeto em especial, e a via de administração. O objeto pode ser um mamífero, tal como um humano, um cavalo, uma vaca, um porco, uma ovelha, um gato, um cão, um rato ou um camundongo.
[00153] A vacina pode ser administrada profilaticamente ou terapeuticamente. Na administração profilática, as vacinas podem ser administradas em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imune. Em aplicações terapêuticas, as vacinas são administradas a um sujeito em necessidade destas, em uma quantidade suficiente para desencadear um efeito terapêutico. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como "dose terapeuticamente eficaz." Quantidades eficazes para este uso dependerão de, por exemplo, a composição específica do regime da vacina administrada, a maneira de administração, o estágio e gravidade da doença, o estado geral de saúde do paciente e o julgamento do médico que prescreve a vacina.
[00154] A vacina pode ser administrada por método bem conhecido na técnica, conforme descrito em Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 15:617648 (1997)); Felgner et al. (Pat. U.S. No. 5,580,859, emitida em 3 de dezembro de 1996); Felgner (U.S. Pat. No. 5,703,055, emitida em 30 de dezembro de 1997); eCarson et al. (U.S. Pat. No. 5,679,647, emitida em 21 de outubro de 1997), os conteúdos de todas foram incorporados neste documento por referências em suas inteirezas. O DNA da vacina pode ser complexado para partículas ou contas que podem ser administradas a um indivíduo, por exemplo, usando uma pistola de vacinação. Alguém versado na técnica teria conhecimento que a escolha de um transportador farmaceuticamente aceitável, incluindo um composto fisiologicamente aceitável, depende de, por exemplo, da via de administração do vetor de expressão.
[00155] A vacina pode ser entregue através de uma variedade de vias. Vias de entrega típicas incluem administração parenteral, por exemplo, entrega intradérmica, intramuscular ou subcutânea. Outras vias incluem administração oral, vias intranasal e intravaginal. Para o DNA da vacina em especial, a vacina pode ser entregue para os espaços intersticiais de tecidos de um indivíduo (Felgner et al., U.S. Pat. Nos. 5.580.859 e 5.703.055, cujos conteúdos de todos são incorporados neste documento por referência em sua totalidade). A vacina também pode ser administrada no músculo ou pode ser administrada através de injeções intradérmicas ou subcutâneas, ou transdermalmente, tal como por iontoforese. A administração epidérmica da vacina também pode ser empregada. A administração epidérmica pode envolver a irritação de forma mecânica ou química da camada mais externa da epiderme para estimular uma resposta imune para o irritante (Carson et al, U.S. Pat. N° 5.679.647, os conteúdos que estão incorporados neste documento por referência em sua totalidade).
[00156] A vacina também pode ser formulada para administração através de passagens nasais. As formulações adequadas para a administração nasal, em que o transportador é um sólido, pode incluir um pó grosso tendo um tamanho de partícula, por exemplo, na faixa de cerca de 10 a cerca de 500 mícrons que é administrado na maneira em que a inalação é feita, por exemplo, por inalação rápida através da passagem nasal de um recipiente do pó mantido próximo ao nariz. A formulação pode ser um spray nasal, gotas nasais ou por administração em aerosol pelo nebulizador. A formulação pode incluir soluções aquosas ou oleosas da vacina.
[00157] A vacina pode ser uma preparação de líquido tal como uma suspensão, xarope ou elixir. A vacina também pode ser uma preparação para administração parenteral, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), tal como uma suspensão ou emulsão estéril.
[00158] A vacina pode ser incorporada em liposomas, microesferas ou outras matrizes de polímeros (Felgner et al, U.S. Pat. No. 5.703.055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. Ito III (2nd ed. 1993), os conteúdos estão incorporados neste documento por referência em sua totalidade). Os lipossomas podem consistir de fosfolipídios ou outros lipídios e podem ser transportadores não tóxicos, fisiologicamente aceitáveis e metabolizáveis que são relativamente simples de criar e administrar.
[00159] A administração da vacina através de eletroporação dos plasmídeos da vacina pode ser realizada usando os dispositivos de eletroporação que podem ser configurados para entregar a um tecido desejado de um mamífero um pulso de energia eficaz para fazer com que poros reversíveis se tornem em membranas de célula, e preferivelmente o pulso de energia é um similar atual constante a uma entrada corrente predeterminada por um usuário. O dispositivo de eletroporação pode compreender um componente de eletroporação e um conjunto de eletrodo ou conjunto de manuseio. O componente de eletroporação pode incluir e incorporar um ou mais dos vários elementos dos dispositivos de eletroporação, incluindo: controlador, gerador corrente de forma de onda, verificador de impedância, dispositivo de registro de forma de onda, elemento de entrada, elemento de relatório de status, porta de comunicação, componente de memória, fonte de energia e interruptor de energia. A eletroporação pode ser conseguida usando um dispositivo de eletroporação in vivo, por exemplo
[00160] Sistema CELLECTRA EP (VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, P A) ou eletroporador da Elgen (Genetronics, San Diego, CA) para facilitar a transfecção de células pelo plasmídeo.
[00161] O componente de eletroporação pode funcionar como um elemento dos dispositivos de eletroporação, e os outros elementos são elementos separados (ou componentes) em comunicação com o componente de eletroporação. O componente de eletroporação pode funcionar como mais de um elemento dos dispositivos de eletroporação, os quais podem estar em comunicação com ainda outros elementos dos dispositivos de eletroporação separados do componente de eletroporação. Os elementos dos dispositivos de eletroporação existentes como partes de um dispositivo eletromecânico ou mecânico podem não ser limitados conforme os elementos podem funcionar como um dispositivo ou como elementos separados em comunicação entre si. O componente de eletroporação pode ser capaz de entregar o pulso de energia que produz a corrente constante no tecido desejado, e inclui um mecanismo de resposta. O conjunto do eletrodo pode incluir uma disposição de eletrodo tendo uma pluralidade de eletrodos em um arranjo espacial, em que o conjunto de eletrodo recebe o pulso de energia do componente de eletroporação e entrega o mesmo ao tecido desejado através dos eletrodos. Pelo menos uma das pluralidades de elétrodos é neutra durante a entrega do pulso de energia e mede a impedância no tecido desejado e comunica a impedância ao componente de eletroporação. O mecanismo de resposta pode receber a impedância medida e pode ajustar o pulso de energia entregue pelo componente de eletroporação para manter a corrente constante.
[00162] A pluralidade de elétrodos pode entregar o pulso de energia em um padrão descentralizado. A pluralidade de eletrodos pode entregar o pulso de energia no padrão descentralizado através do controle dos eletrodos sob uma sequência programada, e a sequência programada é introduzida por um usuário ao componente de eletroporação. A sequência programada pode compreender uma pluralidade de pulsos entregues em sequência, em que cada pulso da pluralidade de pulsos é entregue por pelo menos dois eletrodos ativos com um eletrodo neutro que mede a impedância, e em que um pulso subsequente da pluralidade de pulsos é entregue por um diferente de pelo menos dois eletrodos ativos com um eletrodo neutro que mede a impedância.
[00163] O mecanismo de resposta pode ser executado por ou hardware ou software. Um mecanismo de resposta pode ser executado por um circuito análogo de circuito fechado. A resposta ocorre a cada 50 μs, 20 μs, 10 μs ou 1 μs, mas é preferencialmente uma resposta em tempo real ou instantâneo (isto é, substancialmente instantânea conforme determinado por técnicas disponíveis para determinar o tempo de resposta). O elétrodo neutro pode medir a impedância no tecido desejado e comunicar a impedância ao mecanismo de resposta, e o mecanismo de resposta responde à impedância e ajusta o pulso de energia para manter a corrente constante em um valor similar à corrente predeterminada. O mecanismo da resposta pode manter a corrente constante de forma contínua e instantânea durante a entrega do pulso da energia.
[00164] Os exemplos dos dispositivos e métodos de eletroporação que podem facilitar a entrega das vacinas do DNA da presente invenção, incluem aqueles descritos na Patente No. U.S.7.245.963 por Draghia-Akli, et al, U.S. Patent Pub. 2005/0052630 submetida por Smith, et al., cujos conteúdos são incorporados por meio deste documento por referência em sua totalidade. Outros dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem ser usados para facilitar a entrega das vacinas de DNA incluem aqueles fornecidos no Pedido de Patente US de copropriedade e copendente, N° de Série 11/874072, depositado em 17 de outubro de 2007, que reivindica o benefício sob 35 USC 119(e) para os Pedidos Provisórios U.S. N° de Série 60/852.149, depositado em 17 de outubro de 2006 e 60/978.982, depositado em 10 de outubro de 2007, todos os quais são incorporados por meio deste documento em sua totalidade.
[00165] A patente U.S. N° 7.245.963, por Draghia-Akli, et al., descreve sistemas de eletrodo modulares e seu uso para facilitar a introdução de uma biomolécula em células de um tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Os sistemas modulares de eletrodo podem compreender uma pluralidade de eletrodos de agulha; uma agulha hipodérmica; um conector elétrico que provê uma ligação condutora de um controlador de pulso de corrente constante programável para a pluralidade de eletrodos de agulha; e uma fonte de energia. Um operador pode segurar a pluralidade de eletrodos de agulha que são montados em uma estrutura de suporte e firmemente inseri-los no tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Em seguida, as biomoléculas são entregues por meio de agulha hipodérmica no tecido selecionado. O controlador de pulso de corrente constante programável é ativado e pulso elétrico de corrente constante é aplicada à pluralidade de eletrodos de agulha. O pulso elétrico de corrente constante aplicado facilita a introdução da biomolécula na célula, entre a pluralidade de eletrodos. O conteúdo completo da Patente No. U.S.7.245.963, é incorporada por referência neste documento.
[00166] Pub. de Patente U.S. 2005/0052630 submetido por Smith, et al., descreve um dispositivo de eletroporação que pode ser usado para efetivamente facilitar a introdução de uma biomolécula em células de um tecido selecionado em um corpo ou uma planta. O aparelho de eletroporação compreende um dispositivo eletro-cinético ("dispositivo EKD"), cuja operação é especificada pelo software ou firmware. O dispositivo EKD produz uma série de padrões de pulso de corrente constante programáveis entre eletrodos em uma disposição com base no controle de usuário e na entrada dos parâmetros de pulso e permite o armazenamento e a aquisição de dados de forma de onda corrente. O aparelho de eletroporação também compreende um disco de eletrodo substituível tendo uma disposição de eletrodos de agulha, um canal de injeção central para uma agulha de injeção e um disco de guia removível. O conteúdo completo da Publicação de Patente U.S. 2005/0052630 é incorporado por meio deste documento por referência.
[00167] As matrizes de eletrodos e métodos descritos na Patente U.S. N° 7.245.963 e a Publicação de Patente U.S 2005/0052630 pode ser adaptada para penetração profunda não apenas em tecidos, tais como músculos, mas também outros tecidos ou órgãos. Em função da configuração da matriz de eletrodo, a agulha de injeção (para entregar a biomolécula de escolha) também é inserida completamente no órgão alvo e a injeção é administrada perpendicular ao fator alvo, na área que é previamente delineada pelos eletrodos. Os eletrodos descritos na Patente U.S. N° 7.245.963 e na Publicação de Patente U.S. N° 2005/005263 são preferencialmente 20 mm de comprimento e 21 de bitola.
[00168] Adicionalmente, contemplado em algumas modalidades que incorporam dispositivos de eletroporação e usos deste, há dispositivos de eletroporação que são descritos nas seguintes patentes: Patente U.S. 5.273.525 emitida em 28 de dezembro de 1993, Patentes U.S. 6.110.161 emitida em 29 de agosto de 2000, 6.261.281 emitida em 17 de julho de 2001 e 6.958.060 emitida em 25 de outubro de 2005 e Patente U.S. 6.939.862 emitida em 6 de setembro de 2005. Adicionalmente, patentes cobrindo assuntos providos na Patente U.S. 6.697.669 emitida em 24 de fevereiro de 2004, a qual diz respeito à entrega de DNA usando qualquer um dentre uma variedade de dispositivos e Patente U.S. 7.328.064, emitida em 5 de fevereiro de 2008, desenhados para o método de injetar DNA são contempladas neste documento. As patentes acima são incorporadas por referência em sua totalidade.
[00169] A vacina pode ser administrada através de eletroporação, tal como por um método descrito na Patente U.S. N° 7.664.545, os conteúdos foram incorporados neste documento por referência. A eletroporação pode ser por um método e/ou aparelho descrito na Patente U.S. N° 6.302.874; 5.676.646; 6.241.701; 6.233.482; 6.216.034; 6.208.893; 6.192.270; 6.181.964; 6.150.148; 6.120.493; 6.096.020; 6.068.650; e 5.702.359, os conteúdos foram incorporados neste documento por referência em suas inteirezas. A eletroporação pode ser realizada através de um dispositivo minimamente invasivo.
[00170] O dispositivo de eletroporação minimamente invasivo ("MID") pode ser um aparelho para injeção da vacina descrita acima e associado com o fluído no tecido do corpo. A dispositivo pode compreender uma agulha oca, cassete de DNA um meio de entrega fluído, em que o dispositivo é adaptado para atuar os meios de entrega do fluído em uso de forma a injetar simultaneamente (por exemplo, automaticamente) o DNA no tecido do corpo durante a inserção da agulha no referido tecido do corpo. Isto possui a vantagem que a capacidade de injetar o DNA e fluído associado gradualmente enquanto a agulha está sendo inserida resulta em uma distribuição mais uniforme do fluído através do tecido do corpo. A dor sentida durante a injeção pode ser reduzida devido à distribuição do DNA sendo injetado acima de uma área maior.
[00171] O MID pode injetar a vacina no tecido sem o uso de uma agulha. O MID pode injetar a vacina como um fluxo ou jato pequeno com uma determinada força que a vacina penetra a superfície do tecido e entra no tecido e/ou músculo adjacente. A força por detrás do fluxo ou jato pequeno pode ser fornecida por expansão de um gás comprimido, tal como dióxido de carbono través de um micro-orifício dentro de uma fração de um segundo. Exemplos de dispositivos de eletroporação minimamente invasiva e os métodos para usá-los são descritos o Pedido de Patente Publicado N° 20080234655; Patente U.S N° 6.520.950; Patente U.S N° 7.171.264; Patente U.S N° 6.208.893; Patente U.S N° 6.009.347; Patente U.S N° 6.120.493; U.S. Patente U.S N° 7.245.963; Patente U.S N° 7.328.064; e Patente U.S N° 6.763.264, os conteúdos de cada uma estão incorporados neste documento por referência.
[00172] O MID pode compreender um injetor que criar um jato em alta velocidade do líquido que penetra o tecido sem provocar dor. Tais injetores sem agulhas são disponibilizados comercialmente. Exemplos de injetores sem agulhas que podem ser usados neste documento incluem aqueles descritos na Patente U.S. No° 3.805.783; 4.447.223; 5.505.697; e 4.342.310, os conteúdos de cada uma estão incorporados neste documento por referência.
[00173] Uma vacina desejada em uma forma adequada para eletrotransporte direto ou indireto pode ser introduzida (por exemplo, injetada) usando um injetor livre de agulha dentro do tecido a ser tratado, geralmente por fazer contato da superfície do tecido com o injetor de forma a atuar a entrega de um jato do agente, com força suficiente para causar penetração da vacina dentro do tecido. Por exemplo, se o tecido a ser tratado é uma mucosa, pele ou músculo, o agente é protegido em relação a superfície da mucosa ou pele com força suficiente para fazer com que o agente penetre através de estrato córneo e dentro das camadas dérmicas ou dentro do tecido subjacente e músculo, respectivamente.
[00174] Os injetores sem agulha são bem adequados para entregar vacinas para todos os tipos de tecidos, especialmente para pele e mucosa. Em algumas modalidades, um injetor sem agulha pode ser usado para propelir um líquido que contém a vacina para a superfície e para dentro da pele ou mucosa do objeto. Exemplos representativos de vários tipos de tecidos que podem ser tratados usando os métodos da invenção incluem pâncreas, laringe, nasofaringe, hipofaringe, orofaringe, lábios, garganta, pulmão, coração, rins, músculo, mamas, cólon, próstata, timo, testículos, pele, tecido de mucosa, ovário, vasos sanguíneos ou qualquer combinação destes.
[00175] O MID pode ter eletrodos de agulha que realizam eletroporação do tecido. Por realizar pulsação entre pares múltiplos de eletrodos em um arranjo de eletrodos múltiplos, por exemplo configuração em retângulo ou padrões quadrados, obtêm-se resultados melhorados sobre as pulsações entre um par de eletrodos. Por exemplo, divulgado na Patente U.S. N° 5.702.359 entitulada "Eletrodos de Agulha para Entrega Mediada de Medicamentos e Genes" é um arranjo de agulhas em que uma pluralidade de pares de agulhas podem ser pulsadas durante o tratamento terapêutico. Nesta aplicação, que é incorporada neste documento por referência, ainda que completamente definida, as agulhas foram dispostas em um arranjo circular, mas possuem conectores e aparelhos de comando que permitem uma pulsação entre pares opostos de eletrodos de agulhas. Um par de eletrodos de agulhas para entrega de vetores de expressão recombinantes para células pode ser usado. Tal dispositivo e sistema é descrito na Patente U.S. N° 6.763.264, os conteúdos estão incorporados neste documento por referência. Alternativamente, um único dispositivo de agulha pode ser usado que permite a injeção do DNA e eletroporação com uma única agulha que se assemelha a uma agulha de injeção normal e aplica pulsos de voltagem baixa em relação aquelas entregues por dispositivos usados atualmente, sendo assim, reduzindo a sensação elétrica experimentada pelo paciente.
[00176] O MID pode compreender um ou mais arranjos de eletrodos. Os arranjos podem compreendem duas ou mais agulhas de mesmo diâmetro ou diâmetros diferentes. As agulhas podem estar uniformemente ou disformemente espaçadas. As agulhas podem ser de diâmetro entre 0,005 polegadas e 0,03 polegadas, entre 0,01 polegadas e 0,025 polegadas; ou entre 0,015 polegadas e 0,020 polegadas. A agulha pode ser de 0,0175 diâmetros de polegada. As agulhas podem ser de 0,5 mm, 1,0 mm, 1,5 mm, 2,0 mm, 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm, ou mais espaçadas umas das outras.
[00177] O MID pode consistir de um gerador de impulsos e de injetores de vacina de duas ou mais agulhas que entregam a vacina e pulsos de eletroporação em uma única etapa. O gerador de impulsos pode permitir a programação flexível do pulso e parâmetros de injeção através de um cartão didático operado por computador pessoal, bem com registro e armazenamento abrangente de dados de eletroporação e do paciente. O gerador de impulsos pode entregar uma variedade de pulsos de voltagem durante períodos de tempo curto. Por exemplo, o gerador de impulsos pode entregar três pulsos de 15 volts de 100 ms em duração. Um exemplo do referido MID é o sistema Elgen 1000 pela Inovio Biomedical Corporation que é descrito na Patente U.S. N° 7.328.064, os conteúdos estão incorporados neste documento por referência.
[00178] O MID pode ser um dispositivo e sistema CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell PA), que é um sistema de eletrodos modular que facilita a introdução de uma macromolécula, tal como um DNA, dentro das células de um tecido selecionado em um corpo ou planta. O sistema modular de eletrodo pode compreender uma pluralidade de eletrodos de agulha; uma agulha hipodérmica; um conector elétrico que provê uma ligação condutora de um controlador de pulso de corrente constante programável para a pluralidade de eletrodos de agulha; e uma fonte de energia. Um operador pode segurar a pluralidade de eletrodos de agulha que são montados em uma estrutura de suporte e firmemente inseri-los no tecido selecionado em um corpo ou uma planta. As macromoléculas são então entregues através de uma agulha hipodérmica dentro do tecido selecionado. O controlador de pulso de corrente constante programável é ativado e pulso elétrico de corrente constante é aplicada à pluralidade de eletrodos de agulha. O pulso elétrico de corrente constante aplicado facilita a introdução da macromolécula dentro da célula, entre a pluralidade de eletrodos. A morte celular devido ao superaquecimento das células é minimizado por limitar a energia de dissipação no tecido por virtude de pulsos de corrente constante. O dispostivo e sistema Cellectra é descrito na Patente U.S. N° 7.245.963, os conteúdos estão incorporados neste documento por referência.
[00179] O MID pode ser um sistema Elgen 1000 (Inovio Pharmaceuticals). O sistema Elgen 1000 pode compreender dispositivo que fornece uma agulha oca; um meio de entrega fluído, em que o aparelho é adaptado para atuar o meio de entrega fluído em uso de forma a injetar fluído simultaneamente (por exemplo, automaticamente), a vacina descrita neste documento, para dentro do tecido do corpo durante a inserção da agulha dentro do referido tecido do corpo. A vantagem é a capacidade de injetar o fluído gradualmente enquanto a agulha está sendo inserida resulta em uma distribuição mais uniforme do fluído através do tecido do corpo. Acredita-se também que a dor sentida durante a injeção seja reduzida devido à distribuição do volume do fluído sendo injetado sobre uma área maior.
[00180] Além disso, a injeção automática do fluído facilita a monitoramento e registro automático de uma dose real de fluído injetado. Estes dados podem ser armazenados por uma unidade de controle para fins de documentação, se desejado.
[00181] Será contemplado que a taxa de injeção poderia ser linear ou não-linear e que a injeção pode ser realizada após as agulhas terem sido inseridas através da pele do objeto a ser tratado e enquanto elas são inseridas no tecido do corpo.
[00182] Os tecidos adequados para os quais o fluído pode ser injetado pelo aparelho da presente invenção inclui tecido tumoral, pele ou tecido hepático, porém, pode ser tecido muscular.
[00183] O aparelho compreende também os meios de inserção de agulha para orientar a inserção da agulha dentro do tecido do corpo. A taxa de injeção do fluído é controlada pela taxa de inserção da agulha. A vantagem é que tanto a inserção da agulha como a inserção do fluído podem ser controladas de forma que a taxa de inserção possa ser equiparada com a taxa de injeção conforme desejada. Isto também torna o aparelho mais fácil de usar. Se for desejado, os meios para inserir automaticamente a agulha dentro do tecido do corpo poderiam ser fornecidos.
[00184] Um usuário poderia escolher quando iniciar a injeção do fluído. Contudo, de maneira ideal, a injeção é iniciado quando a ponta da agulha tiver atingido o tecido muscular e o aparelho pode incluir os meios sensoriais, quando a agulha tiver sido inserida em uma profundidade suficiente para que a injeção do fluído seja iniciada. Isto quer dizer que a injeção do fluído pode estar pronta para começar automaticamente quando a agulhar tiver atingido uma profundidade desejada (que será normalmente a profundidade na qual o tecido muscular se inicia). A profundidade na qual o tecido muscular se inicia poderia, por exemplo, ser considerada como uma profundidade de inserção de agulha pré-definida tal como um valor de 4 mm que seria considerado suficiente para que a agulhar passe através da camada da pele.
[00185] Os meios de sensoriais podem compreender uma sonda de ultrassom. Os meios sensoriais podem compreender os meios para percepção de uma alteração em impedância ou resistência. Neste caso, os meios podem não registrar a profundidade da agulha no tecido do corpo, no entanto, serão adaptados a perceber uma alteração na impedância ou resistência conforme a agulha se move de um tipo diferente de tecido do corpo dentro do músculo. Quaisquer destas alternativas fornecem meios de operação relativamente precisos e simples para perceber que a injeção pode ser iniciada. A profundidade da inserção da agulha pode ainda ser registrada se desejado e poderia ser usada para controlar a injeção de fluído de forma que o volume do fluído a ser injetado é determinado como a profundidade da inserção da agulha que está sendo registrada.
[00186] O aparelho pode ainda compreender: uma base para suportar a agulha; e um compartimento para receber a base neste respeito, em que a base é móvel em relação ao compartimento de forma que a agulha é retraída dentro do compartimento quando a base se encontra em uma primeira posição de retaguarda em relação ao compartimento e a agulha se estende para fora do compartimento quando a base se encontra em uma segunda posição á frente dentro do compartimento. Isto é vantajoso para o usuário pois o compartimento pode ser alinhado sobre a pele de um paciente e as agulhas podem então ser inseridas dentro da pele do paciente por mover o compartimento em relação a base.
[00187] Conforme declarado acima, é desejável atingir uma taxa controlada de injeção de fluído de forma que o fluído seja distribuído uniformemente sobre o comprimento da agulha conforme esta é inserida dentro da pele. Os meios de entrega de fluído podem compreender meios de acionamento de pisão adaptados para injetar fluído em uma taxa controlada. Os meios de acionamento de pistão, por exemplo, poderiam ser ativados por um servo motor. Contudo, os meios de acionamento de pistão podem ser atuados pela base sendo movimentada na direção axial em relação ao compartimento. Será contemplado que os meios alternativos para entrega de fluído poderiam ser fornecidos. Sendo assim, por exemplo, um compartimento fechado pode ser comprimido para a entrega do fluído em uma taxa controlada ou não controlada que poderia ser fornecida no lugar de uma seringa e sistema de pistão.
[00188] O aparelho descrito acima poderia ser usado para qualquer tipo de injeção. Contudo, é contemplado como sendo especialmente útil no campo de eletroporação e, desta forma, pode ainda compreender meios para aplicação de uma voltada para a agulha. Isto permite que a agulha seja usada não apena para injeção, mas também como um eletrodo durante a eletroporação. Isto é especialmente vantajoso, pois significa que o campo elétrico é aplicado para a mesma área do fluído injetado. Tradicionalmente, havia um problema com a eletroporação pois está é muito difícil de se alinhar de forma precisa com o eletrodo e com o fluído injetado anteriormente e, portanto, os usuários tendem a injetar um volume maior de fluído do que é exigido sobre uma área maior e para aplicar um campo elétrico sobre uma área maior para tentar garantir uma sobreposição entre a substância injetada e o campo elétrico. Usando a presente invenção, tanto o volume do fluído injetado e o tamanho do campo elétrico aplicado podem ser reduzidos enquanto se atinge uma adequação entre o campo elétrico e o fluído.
[00189] Também é provido neste documento um método para tratar, proteger contra, e/ou prevenir doença em um objeto que necessite deste administrando a vacina para um objeto em necessidade deste. A doença pode ser um câncer, por exemplo, tumor de Wilm, câncer metastático derivado de tumor de Wilm e um câncer ou tumor que expressa WT1. A vacina pode ser administrada a um objeto conforme descrito acima no método de entrega. A administração da vacina ao objeto pode induzir ou desencadear uma resposta imune no objeto. Em especial, a administração da vacina ao objeto pode induzir ou desencadear uma resposta humoral e/ou celular no objeto.
[00190] Em especial, o método pode tratar um objeto tendo um tumor de Wilm, câncer metastático decorrente de tumor de Wilm, e/ou um tumor ou câncer que expressa WT1, pois a vacina retarda o crescimento, reduz e elimina o tumor de Wilm, câncer metastático decorrente de um tumor de Wilm e/ou tumor ou câncer que expressa WT1. O método também pode prevenir o tumor de Wilm, câncer metastático decorrente de tumor de Wilm, e/ou um tumor que expressa WT1 ou câncer no objeto devido a vacina inibir a formação e crescimento do tumor de Wilm, câncer metastático decorrente de tumor de Wilm, e/ou tumor ou câncer que expressa WT1. Conforme descrito acima, a vacina induz ou desencadeia uma resposta imune humoral e/ou celular. Esta resposta imune humoral e/ou celular pode direcionar o tumor de Wilm, câncer metastático decorrente de tumor de Wilm, e/ou tumor ou câncer que expressa WT1, diminuindo com isso o crescimento, redução ou eliminação de qualquer tumor de Wilm, câncer metastático decorrente de tumor de Wilm, e/ou tumores ou câncer que expressam WT1 no objeto que foi administrada a vacina. Esta resposta imune humoral e/ou celular induzida pela vacina também pode inibir a formação e crescimento de qualquer tumor de Wilm, câncer metastático decorrente de tumor de Wilm, e/ou tumores ou câncer que expressam WT-1 no objeto que foi administrada a vacina.
[00191] A dose de vacina pode estar entre 1 μg a 10 mg do componente ativo/kg peso corporal/tempo, e pode estar entre 20 μg a 10 mg do componente/kg peso corporal/tempo. A vacina pode ser administrada a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou 31 dias. O número de doses da vacina para tratamento eficaz pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
[00192] A presente invenção tem múltiplos aspectos, ilustrados pelos seguintes exemplos não limitantes.
[00193] A presente invenção é ilustrada, adicionalmente, pelos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que estes Exemplos, ao indicar modalidades preferenciais da invenção, são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e destes Exemplos, um versado na técnica pode determinar as características essenciais desta invenção e sem se afastar do espírito e escopo desta, pode fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-la para vários usos e condições. Deste modo, as várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, serão aparentes para àqueles versados na técnica a partir da descrição citada acima. Essas modificações também são destinadas a estar dentro do escopo das reivindicações anexas.
[00194] Uma abordagem gradual foi realizada conforme descrita aqui nos Exemplos para gerar um imunógeno de WT1. O gene de WT1 foi modificado através de várias modificações graduais. Primeiro, a estrutura de do RNA do WT1 foi modificada de forma a produzir uma transcrição única de comprimento total. Segundo, o uso do códon foi modificado a fim de alterar a estrutura do RNA na extremidade 5' e melhorando com isso a expressão in vivo. Finalmente, o domínio do dedo de zinco do gene sofreu mutação de forma a modificar a atividade do WT1 e para apagar a partes do sítio de ligação do dedo de zinco.
[00195] Uma abordagem gradual para gerar um imunógeno de WT1 foi gerada. As primeiras alterações na estrutura de RNA foram criadas de forma a resultar em apenas uma transcrição de comprimento total único sendo produzida, com isso, criando um imunógeno com um fenótipo muito mais controlado. As sequências também continham seleção de uso de códon modificado e estrutura de RNA alterada na extremidade 5' para melhorar a expressão in vivo. Consequentemente, o imunógeno do WT1 foi otimizado para a expressão. Um plasmídeo foi gerado que codificou um cassete de expressão para este imunógeno melhorado e foi testado em animais para potencial de imunização e a capacidade para gerar respostas de células T e B. Esta vacina de plasmídeo foi formulada para aumentar a entrega in vivo pela eletroporação e condições específicas foram usadas para entrega in vivo.
[00196] Plasmídeos que codificam este imunógeno (mencionados como WT1-pVAX1, WT1-pVAX2, WT1-pVAX3, WT1-pVAX4 e WT1- pVAX5) foram comparados a vacina de WT1 que representou a vacina padrão sendo estudada pelo campo (mencionada como WT1-pCDNA1, WT1- pCDNA2, WT1-pCDNA3, WT1-pCDNA4 e WT1-pCDNA5).
[00197] Foram conduzidos estudos com camundongos. Os camundongos foram vacinados com a vacina de WT1 modificada (por exemplo, os vetores WT1-pVAX1, WT1-pVAX2, WT1-pVAX3, WT1- pVAX4 e WT1-pVAX5) e sentiram maiores repostas de células T e B anti- WT1 do que os camundongos vacinados com vacinas WT1 padronizadas que compreenden WT1 nativo (por exemplo, WT1-pCDNA1, WT1-pCDNA2, WT1-pCDNA3, WT1-pCDNA4 e WT1-pCDNA5).
[00198] Os animais (por exemplo, camundongos BalB/C) foram imunizados 3x com quantidades idênticas de plasmídeo de WT-1, da nova vacina WT1-pVax (por exemplo, os vetores WT1-pVAX1, WT1-pVAX2, WT1-pVAX3, WT1-pVAX4 e WT1-pVAX5) ou a vacina do plasmídeo de WT-1 (por exemplo, WT1-pCDNA1, WT1-pCDNA2, WT1-pCDNA3, WT1- pCDNA4 e WT1-pCDNA5). Os resultados para os testes de células T (por exemplo, interferon-gamma (teste IFN-y ELISpot) são mostrados nas FIGS. 1 e 2. Ficou claro que a nova vacina de WT-1 criada (por exemplo, os vetores WT1-pVAX1, WT1-pVAX2, WT1-pVAX3, WT1-pVAX4 e WT1-pVAX5) foi aproximadamente 4 vezes superior na geração de respostas de células T do que a vacina WT-1 original (por exemplo, WT1-pCDNA1, WT1-pCDNA2, WT1-pCDNA3, WT1-pCDNA4 e WT1-pCDNA5). Como mostrado nas FIGS. 1 e 2, apenas a imunidade de células T não funcionais ou imunidade em baixo nível foi observada com a vacina padrão que foi consistente com os dados que foram alcançados anteriormente.
[00199] A capacidade desta nova vacina de DNA para induzir respostas de anticorpos também foi examinada. Estes estudos foram realizados pela coleta de soro de animais imunizados com vacina WT1- pCDNA ou WT1-pVAX. A soroconversão ou indução de respostas de anticorpos usando a vacina WT1-pCDNA não foi observada (dados não mostrados). Em contraste, o imunógeno de WT1-pVAX induziu forte reatividade de Western Blot com a especificidade correta e peso molecular, demonstrando soroconversão robusta da WT1 e fortes respostas de anticorpos (FIG. 3). Estes dados suportaram fortemente e coletivamente a melhoria neste imunógeno de vacina através de alterações na entrega e projeto melhorado do imunógeno de WT1.
[00200] Estes dados também mostraram que a natureza conformacional do imunógeno foi mantida, pois estas vacinas contendo o imunógeno de WT1 otimizado claramente reagiram com as sequências de genes nativos nas células tumorais.
[00201] A sequência do imunógeno também foi direcionada pela modificação da sequência de codificação para destruir sua estrutura nativa através de dois meios, (1) direcionamento da região do Dedo de Zinco e indução de mutações que modificaram a atividade de WT1 bem como (2) exclusão das sequências de sítio importante de ligação de dedo de zinco. Estas alterações são destacadas abaixo nos Exemplos 2 e 3.
[00202] Conforme descrito acima, o imunógeno de WT1 otimizado (por exemplo, o gene de WT1 que foi otimizado conforme descrito no Exemplo 1) induziu as respostas imunes humorais e celulares. Para direcionar ou modificar adicionalmente a sequência do imunógeno de WT1, um imunógeno de WT1 consenso foi gerado.
[00203] Especificamente, as sequências de WT1 de espécies múltiplas foram comparadas umas as outras. Conforme mostrado na Tabela 1 abaixo, WT1 é altamente conservado. Consequentemente, as sequências de WT1 de espécies mútiplas foram empregadas para gerar uma sequência consenso de WT1, na qual a sequência consenso de WT1 compartilhou cerca de 95% de identidade com o WT1 humano. O imunógeno de WT1 consenso resultante (também mencionado como ConWT1) compartilhou 95.9% de identidade com o WT1 humano e tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO:5 (FIG. 5). Tabela 1: Identidade de WT1 entre Espécies.
[00204] O imunógeno de WT1 consenso descrito acima no Exemplo 2 foi adicionalmente modificado para melhorar a imunogenicidade do imunógeno de WT1. Em especial, o imunógeno consenso de WT1 foi modificado para interromper os dedos de zinco no carboxi-terminal (C- terminal) do imunógeno de WT1. Estas modificações incluíram substituição de resíduos que coordenam o íon de zinco (por exemplo, motivo CCHH) no dois dedos de zinco do amino-terminal (N-terminal) para render um imunógeno de WT1 consenso com dedos de zinco modificados (também mencionados neste documento como CON WT1 com dedos de zinco modificados ou ConWT1-L) (FIGS. 4 e 5). Os resíduos de C e H do motivo CCHH foram substituídos com glicina (G). Uma sequência líder de imunoglobulina E (IgE) foi colocada no N-terminal do peptídeo ConWT1-L. ConWT1-L é codificado por SEQ ID NO:1 e possui a sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:2 (FIGS. 6A e 6B, respectivamente).
[00205] FIG. 5 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos do imunógeno WT1 consenso (ConWT1) e o imunógeno WT1 consenso com dedos de zinco modificados (ConWT1-L). O sombreamento na FIG. 5 indica resíduos que diferem entre ConWT1 e ConWT1-L. Além da adição da sequência líder de IgE para ConWT1-L, os resíduos 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360, e 364 em ConWT1-L diferiram dos resíduos correspondentes em ConWT1 (por exemplo, resíduos 295, 300, 313, 317, 325, 330, 343, e 347). Estas diferenças se refletiram nas modificações dos motivos CCHH nos dois dedos de zinco do N-terminal descritos acima.
[00206] Adicionalmente, o imunógeno WT1 consenso foi modificado para remover os dedos de zinco para render um imunógeno WT1 consenso sem dedos de zinco (também mencionados neste documento como CON WT1 sem dedos de zinco ou CONWT1-S) (FIG. 4). ConWT1-S é codificado por SEQ ID NO:3 e possui a sequência de aminoácidos definida na SED ID NO:4 (FIGS. 7A e 7B, respectivamente).
[00207] A sequência de ácidos nucleicos que codifica ConWT1-L e ConWT1-S foi colocada separadamente no vetor pVAX1 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Os vetores resultantes foram nomeados WT1-pVAX-L e WT1-pVAX-S, respectivamente. O WT1-pVAX-L e WT1-pVAX-S, juntamente com pVAX1 foram transferidos para dentro de células para confirmar a expressão de ConWT1-L e ConWT1-S, respectivamente, a partir destes vetores, pVAX1 serviu como um controle negativo.
[00208] Após a transfecção, as células foram coloradas com 4’,6- Diamidino-2-Fenilindol (DAPI) para marcar o núcleo e anticorpo específico para WT1. FIG. 8 mostra os resultados desta coloração. Na FIG. 8, as colunas da esquerda e do meio mostram a colocação de DAPI e WT1, enquanto que a coluna da direita mostra uma mescla da coloração de DAPI e WT1. Nenhuma coloração foi detectada com o anticorpo de WT1 em células transfectadas com pVAX1. Estes dados indicaram que tanto ConWT1-L como ConWT1-S foram expressos a partir de seus vetores respectivos.
[00209] A expressão de ConWT1-L e ConWT1-S foi confirmada adicionalmente pelo immunoblot de lisados derivados das células transfectadas. Especificamente, os immunoblots foram provados com anticorpo anti-WT1. Conforme mostrado na FIG. 9, os tamanhos esperados foram detectados por ConWT1-L e ConWT1-S (veja rotas marcadas WT1- pVAX-L e WT1-pVAX-S, respectivamente). Nenhum sinal foi detectado nos lisados obtidos de células transfectadas com pVAX1. Consequentemente, estes dados indicaram posteriormente que ConWT1-L e ConWT1-S foram expressos dentro das células transfectadas.
[00210] Para determinar se os construtos que codificam ConWT1-L e ConWT1-S induziram uma resposta imune, C57BL/6 camundongo imunizado com 25 μg WT1-pVAX-L ou WT1-pVAX-S, respectivamente. Camundongos C57BL/6 também foram imunizados com 25 μg WT1-pVAX, que foi o construto otimizado que codifica WT1 descrito no Exemplo 1, ou 25 μg WT1-pCDNA, que foi um construto não otimizado que codifica WT1. Camundongos Naive serviram como controle
[00211] Especificamente, o regime de imunicação incluiu vacinação de cada grupo de camundongos com 25 μg da respectiva vacina na semana 0, semana 2, semana 3, semana 4 e semana 5 (FIG.. 10. Foi obtida uma amostra de sangue de cada camundongo antes da vacinação na semana 0 e, sendo assim, esta amostra de sangue na semana 0 serviu como um controle para indução de anticorpo. Uma segunda amostra de sangue foi obtida na semana 5 quando o camundongo foi sacrificado. Os esplenócitos também foram isolados a partir de camundongos sacrificados e usados no teste ELISpot descrito abaixo para examinar a resposta da célula T.
[00212] A resposta imune celular (por exemplo, resposta de células T) para ConWT1-L e ConWT1-S foi examinada usando teste ELISpot, no qual a produção de interferon-gamma (IFN-y) pelas células T foi medida. Como mostrado nas FIGS. 11 e 12, imunização com construtos de WT1-pVAX e WT1-pCDNA renderam uma resposta de células T semelhante a observada em camundongos naive. Em constraste, os construtos de WT1-pVAX-L e WT1-pVAX-S, que expressam ConWT1-L e ConWT-S, respectivamente, renderam respostas de células T significativamente maiores em comparação com os construtos otimizados e não otimizados (por exemplo, WT1-pVAX e WT1-pCDNA, respectivamente). Nas FIGURAS 11 e 12, barras de erro refletiram o padrão de erro da média (SEM).
[00213] Em especial, os antígenos ConWT1-L e ConWT-S induziram uma resposta de células T que foi de cerca de 400 vezes maior que a resposta de células T induzida pelos construtos otimizados e não otimizados. Consequentemente, estes dados indicaram que a modificação e remoção dos dedos de zinco em WT1 aumentaram significativamente a imunogenicidade do imunógeno WT1, fornecendo com isso uma resposta de células T significativa direcionada para o imunógeno de WT1.
[00214] A resposta imune humoral para antígenos de ConWT1-L e ConWT1-S foi examinada por determinar se o soro a partir da amostra sanguínea da semana 5 continha anticorpos específicos para os antígenos. Em especial, as células 293T foram transfectadas com os vetores WT1- pVAX-L e WT1-pVAX-S. Após a transfecção, as células transfectadas com WT1-pVAX-L ou WT1-pVAX-S foram coloradas com DAPI para marcar o núcleo e soro a partir da amostra sanguínea da semana 5 do camundongo imunizado com WT1-pVAX-L ou WT-pVAX-S. Conforme mostrado na FIG. 13, o soro do camundongo imunizado com WT1-pVAX-L ou WT1- pVAX-S detectou o antígeno ConWT1-L ou ConWT1-S, respectivamente, nas células transfectadas. Consequentemente, estes dados indicaram que a imunização com construtos que expressam os antígenos ConWT1-L e ConWT1-S resultaram na produção de anticorpos que são imunorreativos com os antígenos ConWT1-L e ConWT1-S.
[00215] A indução da resposta imune humoral pelos construtos que expressam ConWT1-L e ConWT1-S foram examinadas adicionalmente pelo método immunoblotting. Em especial, os lisados foram obtidos das células transfectadas acima e foram provados com o soro dos camundongos imunizados com WT1-pVAX-L ou WT1-pVAX-S. FIG. 14 mostra uma método immunoblot representativo, no qual o lisado obtido das células 293T imunizadas serviram como um controle para a fundamentação. O método immunoblot na FIG. 14 também foi provada com um anticorpo anti-actina que demonstrou que as quantidades equivalentes de lisados foram carregadas entre as três faixas. Estes dados indicaram que o soro dos camundongos imunizados continha anticorpos que foram imunorreativos com antígenos ConWT1-L e ConWT1-S, confirmando adicionalmente os resultados de coloração de células descritas acima.
[00216] Em resumo, um construto que expressa o antígeno ConWT1-L ou ConWT1-S induziu uma resposta de células T significativa que produziu IFN-Y e anticorpos que são imunorreativos com antígenos ConWT1-S e ConWT-L.
[00217] Entende-se que a descrição detalhada citada acima e exemplos anexos são meramente ilustrativos e não devem ser considerados como limitações sobre o escopo da invenção, que é exclusivamente definida pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.
[00218] Várias mudanças e modificações nas modalidades divulgadas serão aparentes àqueles versados na técnica. Tais mudanças e modificações, incluindo sem limitação aquelas relativas às estruturas químicas, substituintes, derivativos, intermediários, sínteses, composições, formulações ou métodos de uso da invenção, podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo desta.
Claims (14)
1. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de compreender uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: uma sequência de ácido nucleico da SED ID NO:1 e suas sequências degeneradas que codificam a mesma sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, uma sequência de ácido nucleico da SED ID NO:3 e suas sequências degeneradas que codificam a mesma sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 4, em que a uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificam uma proteína WT1, em que a proteína WT1 compreende dedos de zinco modificados, ou em que a proteína WT1 não compreende dedos de zinco, e em que os dedos de zinco modificados compreendem as mutações compreendendo os resíduos 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360 e 364 da SEQ ID NO: 2 que são glicina (G).
2. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreende a sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO: 1 ou a sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO: 3.
3. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizada pelo fato que a referida molécula é incorporada em um plasmídeo ou vetor viral.
4. Composição, caracterizada pelo fato de compreender uma ou mais moléculas de ácido nucleico como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a proteína compreende dedos de zinco modificados, ou em que a proteína ou não compreende dedos de zinco, e em que os dedos de zinco modificados compreendem as mutações compreendendo os resíduos 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360 e 364 da SEQ ID NO: 2 que são glicina (G).
6. Proteína de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 4.
7. Vacina, caracterizada pelo fato de compreender uma ou mais moléculas de ácido nucleico como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
8. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a vacina compreende uma molécula de ácido nucleico, em que: (a) a molécula de ácido nucleico definida na SEQ ID NO: 1; ou (b) a molécula de ácido nucleico definida na SEQ ID NO: 3; e em que a vacina compreende ainda: (c) um peptídeo imunogênico definido na SEQ ID NO: 2; ou (d) um peptídeo imunogênico definido na SEQ ID NO: 4.
9. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a vacina compreende um antígeno que compreende a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que o antígeno é codificado pela SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.
10. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende um vetor de expressão, um excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou um adjuvante.
11. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo, em que (a) o peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos imunogênica definida na SEQ ID NO: 2; ou (b) o peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos imunogênica definida na SEQ ID NO: 4, em que o peptídeo compreende dedos de zinco modificados, ou em que o peptídeo não compreende dedos de zinco, e em que os dedos de zinco modificados compreendem as mutações compreendendo os resíduos 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360 e 364 da SEQ ID NO: 2 que são glicina (G).
12. Vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o peptídeo compreende a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
13. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de um indivíduo com um tumor que expressa WT1 ou para uso na prevenção de um tumor que expressa WT1.
14. Uso de uma molécula de ácido nucleico como definida em 1 a 3 e/ou da proteína como definida nas reivindicações 5 e 6, caracterizada pelo fato de ser na fabricação de uma vacina para tratar um indivíduo que tem um tumor que expressa WT1 ou para uso na prevenção de um tumor que expressa WT1.
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