KR20210062748A - Ｗｔ１ 백신 - Google Patents

Abstract

돌연변이 WT1 항원을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 본원에 개시된다. 돌연변이 WT1 항원을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터, 조성물, 및 백신이 개시된다. WT1-발현 종양을 갖는 개체를 치료하는 방법 및 WT1-발현 종양을 예방하는 방법이 개시된다. 돌연변이 WT1 항원이 개시된다.

Description

ＷＴ１ 백신{WT1 VACCINE}

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 2012년 12월 13일 출원된 미국 임시출원 번호 61/737,094에 우선권을 청구하며, 이는 모두가 참고로 본원에 통합되어 있다.

기술 분야

본 발명은 빌름스 종양(Wilm’s tumor; WT1) 면역원 및 그를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 WT1 면역원 및/또는 핵산 분자를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 추가적으로, 면역 반응을 유도하고, WT1를 발현하는 종양을 예방하고/하거나 이를 갖는 대상체를 치료하기 위한 백신의 사용 방법에 관한 것이다.

암은 미국 및 전 세계에서 주요한 사망 원인으로 남아있다. 암 백신 시장은 빠르게 성장하고 있다. 림프종 백신은 시장의 약 0.5%를 차지한다. 효과적인 종양 백신은 종양 성장을 예방하는데 유용할 수 있고/있거나 진행된 암이 있는 환자들을 위한 표준 치료에 대안으로 더욱 효과적이고, 독성이 덜하므로 유용할 수 있다. 암과 연관되며, 그러므로 항-종양 백신을 위한 표적과 연관된 항원은 WT1이다.

빌름스 종양 억제 유전자 1 (WT1)은 약 10,000 명 중 1명의 유아에게 영향을 미치는 신장(kidney)의 초기 악성 종양의 원인으로서 식별되었다. 이는 산발적이고 유전적인, 둘 다의 형태에서 발생한다. WT1의 비활성화는 빌름스 종양 및 데니스 드래쉬(Denys-Drash) 증후군 (DDS)의 발병을 야기한다. 결과는 신장병증 뿐만 아니라 가능한 생식기 이상증상 둘 다이다. WT1 단백질은 또한 종양 억제 전사 인자인 주요 종양 조절 유전자 p53을 포함하는 세포 인자의 숙주와 상호작용하는 것으로 알려졌다.

WT1은 많은 종양 유형에 발현되며, 많은 암에서 더욱 광범위하게 연루되어 왔다. 예를 들어, WT1 단백질은 75%의 중피종 (전세계에서 연간 14,200 건, 미국에서 빈도가 가장 높음)의 세포 핵, 및 93%의 난소 장액성 암종 (2010년 전세계에서 난소암 190,000건)에서 국지화된다. 추가적으로, WT1는 췌장암, 백혈병, 폐암, 유방암, 대장암, 교모세포종, 및 두경부암 뿐만 아니라 다른 것들 중 양성 메소텔린 및 자궁경부 및 난소암에도 연루되어 왔다. WT1는 암 치료에 대한 접근으로서 유전자 요법 또는 면역 요법을 위한 표적이다.

WT1은 C-말단에 4개의 아연 핑거 모티프 및 N-말단에 프롤린/글루타민-풍부 DNA-결합 도메인을 함유하는 전사 인자를 인코딩한다. 이는 비뇨생식계의 정상 발달에 필수적인 역할을 한다. 이는, 그러나, 성인에서는 더욱 불필요하며, 따라서 면역 요법을 위한 표적으로서 제시된다. 2개의 코딩 엑손에서 대안적 스플라이싱에 기인한 다수의 전사 변이체는 잘 특성화되어 왔다. CTL 커버리지를 최대화할 수 있는 전체 리딩 프레임의 사용은 장점으로 고려될 것이다.

WT1 항원의 보존으로 인하여, 이러한 유전자 표적에 대한 강한 면역을 생성하기 위한 대부분의 시도는 성공적이지 못했다. 백신은 DNA 백신 기술, 폭스-바이러스 백신 기술, 아데노바이러스 백신 기술, 펩티드 백신 기술, 및 단백질 기반의 백신 기술을 사용하여 이전에 조사되어 왔다. 조사되었던 백신은 사실의 유전자 구조, 즉 천연의,“정상” 유전자를 사용하였다. 오직 낮은 수준 또는 비기능적인 T 세포 면역만이 이러한 조사에서 달성되었다.

더욱 효과적인 WT1 면역원의 발달과 함께 몇몇의 주요 사안이 있다. WT1 항원의 숙주 WT1에 대한 유사성으로 인하여, 강한 억제 T 세포 반응이 생성되며, 이로써 면역 유도를 차단한다. 또한, 유전자 그 자체는 RNA 수준에서 뚜렷하게 처리되어 알려지지 않은, 그리고 가능하게는 경합성인 값의 다수의 절단된 전사물이 생성된다. 더욱이, 전달된 WT1의 발현은 낮으며, 이로써 불량한 면역성을 초래한다.

암을 치료 및 예방하기 위한 백신은 큰 관심의 대상이다. WT1를 표적화하는 기존의 백신은 체내 불량한 항원 발현에 의하여 제한된다. 따라서, WT1를 발현하는 종양에 적용 가능하고, 이로써 그러한 암의 치료를 제공하고 그에 대해 생존을 촉진할 수 있는, 본 분야에서 안전하고 효과적인 백신의 발전을 위한 필요성이 남아 있다.

요약

본 발명은 서열 식별 번호: 2를 인코딩하는 핵산 서열, 서열 식별 번호: 2의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 인코딩하는 핵산 서열, 서열 식별 번호: 2와 적어도 98% 상동한 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 서열 식별 번호: 2와 적어도 98% 상동한 단백질 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 인코딩하는 핵산 서열, 서열 식별 번호: 4를 인코딩하는 핵산 서열, 서열 식별 번호: 4의 적어도 90%를 포함하는 단편을 인코딩하는 핵산 서열, 서열 식별 번호: 4와 적어도 98% 상동한 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 및 서열 식별 번호: 4와 적어도 98% 상동한 단백질 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 인코딩하는 핵산 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 1의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편, 서열 식별 번호: 1과 적어도 98% 상동한 핵산 서열, 서열 식별 번호: 1과 적어도 98% 상동한 핵산 서열의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편, 서열 식별 번호: 3, 서열 식별 번호: 3의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편, 서열 식별 번호: 3과 적어도 98% 상동한 핵산 서열, 및 서열 식별 번호: 3과 적어도 98% 상동한 핵산 서열의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.

상기 핵산 분자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 포함될 수 있다. 본 발명은 추가적으로, 상기 핵산 분자 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 핵산 분자 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명은 추가적으로, WT1-발현 종양의 성장을 지연시키거나, 이를 감소 또는 제거하는데 효과적인 상기 백신의 양을 투여하는 단계를 포함하는, WT1-발현 종양을 갖는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, WT1-발현 종양의 형성 또는 성장을 억제하는데 효과적인 상기 백신의 양을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 WT1-발현 종양을 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가적으로, 서열 식별 번호: 2, 서열 식별 번호: 2의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편, 서열 식별 번호: 2와 적어도 98% 상동한 아미노산 서열, 서열 식별 번호: 2와 적어도 98% 상동한 아미노산 서열의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편, 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 4의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편, 서열 식별 번호: 4와 적어도 98% 상동한 아미노산 서열, 및 서열 식별 번호: 4와 적어도 98% 상동한 아미노산 서열 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 또한 핵산 분자를 포함하는 백신에 관한 것이다. 상기 핵산 분자는 서열 식별 번호: 1에 개시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자는 서열 식별 번호: 3에 개시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 백신은 추가로 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 핵산 분자는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 상기 백신은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 백신은 추가적으로 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 핵산 분자를 포함하는 백신에 관한 것이다. 상기 핵산 분자는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩할 수 있다. 상기 핵산 분자는 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩할 수 있다. 상기 백신은 추가적으로 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 핵산 분자는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 상기 백신은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 백신은 추가로 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명은 추가적으로, 서열 식별 번호: 1에 개시된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열 식별 번호: 3에 개시된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 추가적으로, 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 추가적으로, 서열 식별 번호: 1 또는 서열 식별 번호: 3에 의하여 인코딩된 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. 항원은 서열 식별 번호: 1에 의하여 인코딩될 수 있다. 항원은 서열 식별 번호: 3에 의하여 인코딩될 수 있다. 항원은 서열 식별 번호: 2 또는 서열 식별 번호:4에 개시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항원은 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항원은 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 펩티드를 포함하는 백신에 관한 것이다. 상기 펩티드는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 펩티드는 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

도 1은 10⁶ 비장세포 당 면역 그룹 대 스팟 형성 단위 (SFU)를 도시하는 그래프를 나타낸다
도 2는 10⁶ 비장세포 당 면역 그룹 대 SFU를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 3은 면역블롯(immunoblot)을 나타낸다.
도 4는 ConWT1-L 및 ConWT1-S의 도식을 나타낸다.
도 5는 ConWT1-L 및 ConWT1의 각각의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다.
도 6은 (A) ConWT1-L을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (B) ConWT1-L의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 7은 (A) ConWT1-S를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (B) ConWT1-S의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8은 형질감염된 세포의 염색을 나타낸다.
도 9는 면역블롯(immunoblot)을 나타낸다.
도 10은 면역 요법을 예시하는 도식을 나타낸다.
도 11은 10⁶ 비장세포 당 면역 그룹 대 SFU를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 12는 10⁶ 비장세포 당 면역 그룹 대 SFU를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 13은 형질감염된 세포의 염색을 나타낸다.
도 14는 면역블롯(immunoblot)을 나타낸다.

본 발명은 또한 WT1 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. WT1는 많은 종양에서 발현된다. 따라서, 상기 백신은 WT1을 발현하는 암 또는 암-기반의 종양에 대한 치료를 제공한다.

WT1 항원은 상이한 종으로부터 WT1의 서열로부터 유래된 공통 WT1 항원일 수 있으며, 따라서 상기 공통 WT1 항원은 특별하다. 상기 공통 WT1 항원은 또한, 아연 핑거가 함께 개질 또는 제거된다는 점에서 특별하다. 개질은 아연 구조를 조정하는 시스테인 및 히스티딘 잔기의 치환을 포함할 수 있다.

놀랍게도, 상기 공통 WT1 항원은 아연 핑거를 개질하였거나 아연 핑거가 없을 때, WT1에 반응하는 뚜렷한 면역 반응이 유도된다. 유도된 면역 반응은 체액성 및 세포성 면역 반응을 모두 포함하며, 이중 상기 세포성 면역 반응은 발현에 최적화된 천연 WT1 또는 WT1를 포함하는 백신에 의하여 유도된 세포성 면역 반응보다, 또는 그와 비교하여 약 400배 증가로 유도된다.

1. 정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 분야에서 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 상동한 의미를 갖는다. 상충 시, 정의를 포함하여 본 문서가 우선이 될 것이다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 물질이 아래 기재된다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그의 전문이 참조로 도입된다. 본원에 개시된 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한적인 것으로 의도되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "포함한다", "포함된다", "갖는", "갖는다", "수 있다", "함유한다" 및 그의 변형은 추가적인 행위 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 전이 어구, 용어 또는 단어로 의도된다. 문맥 상 뚜렷이 달리 나타내지 않는 한, 단수 형태에는 복수 참조물이 포함된다. 본 개시사항은 또한 명시적으로 나타내건 나타내지 않건, 본원에 제시된 구현예 또는 요소를 "포함하는", "이로 구성된" 및 "본질적으로 이로 구성된" 다른 구현예를 고려한다.

본원에서 사용된 “보조제"는 DNA 플라스미드에 의하여 인코딩되고 이후 기술된 핵산 서열을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 항원의 항원성을 개선하기 위하여 본원에 기술된 DNA 플라스미드 백신에 부가된 임의의 분자를 의미할 수 있다.

"항체"는 Fab, F(ab')2, Fd, 및 단쇄 항체, 디아바디, 이중특이적 항체, 이작용기 항체 및 그의 유도체를 포함하는, 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 또는 단편의 항체, 그의 단편 또는 유도체를 의미할 수 있다. 항체는 원하는 에피토프 또는 이로부터 유래된 서열에 충분한 결합 특이성을 나타내는 포유동물 혈청 표본에서 단리된 항체, 폴리클로날 항체, 친화도 정제된 항체, 또는 그의 혼합물일 수 있다.

“항원”은: 서열 식별 번호: 2를 포함하는 변이 WT1 아미노산 서열을 갖는 단백질; 본원에 개시된 길이의 그의 단편, 변이체, 즉, 본원에 개시된 바와 같은 서열 식별 번호: 2에 상동성을 갖는 서열을 갖는 단백질, 본원에 개시된 길이를 갖는 변이체의 단편, 서열 식별 번호: 4; 본원에 개시된 길이의 그의 단편, 변이체, 즉 본원에 개시된 바와 같은 서열 식별 번호: 4에 상동성을 갖는 서열을 갖는 단백질, 본원에 개시된 길이를 갖는 변이체의 단편, 및 그의 조합을 의미한다. 항원은 임의로 다른 단백질로부터의 것들과 같은 신호 펩티드를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "코딩 서열" 또는 "인코딩 핵산"은 본원에 개시된 항원을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 (RNA 또는 DNA 분자)을 의미할 수 있다. 코딩 서열은 핵산이 투여되는 개체 또는 포유동물의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다. 코딩 서열은 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함될 수 있다.

본원에서 사용되는 "상보체" 또는 "상보적인"은 핵산이 핵산 분자의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 간 왓슨-크릭(예로, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기쌍 형성을 의미할 수 있음을 의미할 수 있다.

본원에 사용된 “공통” 또는 “공통 서열”은 특정 항원의 다수의 하위유형의 배열의 분석에 기반하여 구성된, 합성 핵산 서열 또는 상응하는 폴리펩티드 서열을 의미할 수 있다. 서열은 특정 항원의 다수의 하위유형, 혈청형, 또는 균주에 대하여 광범위한 면역성을 유도하는데 사용될 수 있다. 합성 항원, 예컨대 융합 단백질은, 공통 서열 (또는 공통 항원)로 조작될 수 있다.

본원에서 사용되는 "정전류"는 조직 또는 상기 조직을 정의하는 세포가 상동한 조직에 전달되는 전기 자극 기간에 걸쳐 수신하거나 경험하는 전류를 정의하기 위한 것이다. 상기 전기적 펄스는 본원에서 기재된 전기천공 장치로부터 전달된다. 이 전류는 전기적 펄스의 수명 동안 상기 조직에서 일정한 암페어수를 유지하며, 이는 본원에 제공된 전기천공 장치가 바람직하게는 즉각적인 피드백을 갖는 피드백 요소를 갖기 때문이다. 상기 피드백 요소는 펄스의 지속시간 내내 조직(또는 세포)의 내성을 측정할 수 있고 전기천공 장치가 그의 전기적 에너지 출력을 변경하도록 야기할 수 있으며 (예를 들면, 전압 증가), 그러므로 상동한 조직 내의 전류는 전기 펄스 내내 (마이크로초에 따름), 및 펄스와 펄스 사이에서 일정하게 유지된다. 일부 구현예에서, 상기 피드백 요소는 컨트롤러를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이 “전류 피드백” 또는 “피드백”은 상호교환적으로 사용될 수 있고 제공된 전기천공 장치의 활성 반응을 의미할 수 있으며, 이는 전극 사이의 조직 내 전류를 측정하고, 전류를 일정한 수준으로 유지하기 위해 그에 따라 EP 장치에 의해 전달된 에너지 출력을 변경하는 것을 포함한다. 이 일정한 수준은 펄스 시퀀스 또는 전기적 처리의 개시 전에 사용자에 의해 사전 조정된다. 상기 피드백은 상기 전기천공 장치의 전기천공 성분, 예컨대 컨트롤러에 의해 달성될 수 있는데, 이는 그 내부의 전기적 회로가 전극 사이의 조직 내 전류를 지속적으로 모니터링하고, 상기 모니터링된 전류 (또는 조직 내의 전류)를 사전 조정된 전류와 비교하고, 그리고 상기 모니터링된 전류를 사전 조정된 수준으로 유지시키기 위해 에너지-출력을 지속적으로 조절할 수 있기 때문이다. 상기 피드백 루프는, 아날로그(analog) 닫힌-루프(closed-loop) 피드백이므로, 즉각적일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이 “분산된 전류”는 본원에서 기재된 전기천공 장치의 다양한 니들 전극 어레이로부터 전달된 전기적 전류의 패턴을 의미할 수 있으며, 여기서 상기 패턴은 전기천공될 조직의 임의의 영역 상에서 전기천공 관련된 열 스트레스의 발생을 최소화하거나 바람직하게는 제거한다.

본원에서 상호 교환적으로 사용되는 "전기천공", "전기-투과화", 또는 "전기-역학 증강"("EP")은 생체막에서 미시적 경로(공극)을 유도하기 위한 막통과 전기장 펄스의 이용을 나타낼 수 있다; 그의 존재는 생체분자, 예컨대 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 약물, 이온, 및 물이 세포막의 한 쪽에서 다른 쪽으로 이동할 수 있게 한다.

본원에서 사용되는 "피드백 기전"은 소프트웨어 또는 하드웨어(또는 펌웨어)에 의해 수행되는 절차를 지칭하는 것일 수 있으며, 이 절차는 현재 값, 바람직하게는 전류로 원하는 조직의 임피던스 (에너지 펄스 전달 이전, 동안, 및/또는 이후)를 수신하고 비교하며, 그리고 사전 설정된 값을 달성하기 위해 전달된 에너지 펄스를 조정한다. 피드백 기전은 아날로그 닫힌 루프 회로에 의해 수행될 수 있다.

“단편”은 포유동물에서 면역 반응을 야기할 수 있는 항원의 폴리펩티드 단편을 의미할 수 있다. 항원의 단편은 N 및/또는 C 말단에서 적어도 하나의 아미노산이 없는 것을 제외하고는 전장과 100% 상동할 수 있고, 각각의 경우 위치 1에 신호 펩티드 및/또는 메티오닌을 갖거나 갖지 않는다. 단편은, 부가된 임의의 이종성 신호 펩티드를 제외하고, 특정한 전장 항원 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 퍼센트를 포함할 수 있다. 단편은 항원과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동한 폴리펩티드의 단편을 포함할 수 있으며, 추가적으로 퍼센트 상동성 계산 시 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종성 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 단편은 추가로 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩티드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩티드, 예를 들어 IgE 또는 IgG 신호 펩티드를 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩티드는 항원의 단편에 연결될 수 있다.

항원을 인코딩하는 핵산 서열의 단편은 5' 및/또는 3' 말단에서 적어도 하나의 뉴클레오티드가 없는 것을 제외하고는 전장과 100% 상동할 수 있고, 각각의 경우 위치 1에 신호 펩티드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 갖거나 갖지 않는다. 단편은 부가된 임의의 이종성 신호 펩티드를 제외하고, 특정한 전장 코딩 서열 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 퍼센트를 포함할 수 있다. 단편은 항원과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동한 폴리펩티드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고, 임의로 퍼센트 상동성 계산 시 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종성 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 단편은 추가로 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩티드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩티드, 예를 들어 IgE 또는 IgG 신호 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩티드를 인코딩하는 코딩 서열은 코딩 서열의 단편에 연결될 수 있다.

본원에서 사용되는 "유전적 작제물"은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 나타낸다. 상기 코딩 서열은 핵산 분자가 투여될 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종료 신호를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 가능한 형태"는 개체의 세포에 존재하는 경우, 코딩 서열이 발현되도록 단백질을 인코딩하는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 작제물을 나타낸다.

둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 본원에서 사용되는 "상동한" 또는 "상동성"은 서열이 명시된 영역에 걸쳐 상동한 명시된 잔기의 백분율을 가짐을 의미할 수 있다. 상기 백분율은 두 서열을 최적으로 정렬하고, 지정된 영역에 대해 두 서열을 비교하고, 두 서열에서 상동한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 상기 일치된 위치의 수를 명시된 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 상기 결과에 100을 곱하여 서열 상동성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 두 서열이 상이한 길이이거나 상기 정렬이 하나 이상의 어긋난(staggered) 말단을 생성하고, 비교된 상기 명시된 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우, 단일 서열의 상기 잔기들은 상기 계산의 분모에 포함되지만 분자에 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교할 때, 티민 (T) 및 우라실 (U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 상동성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.

본원에서 사용되는 "임피던스"는 피드백 기전을 논의할 때 사용될 수 있고, 옴의 법칙에 따라 전류값으로 전환되어 사전 설정된 전류와의 비교를 가능케 할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이 “면역 반응”은 본원에 기술된 백신을 통하여 본원에 기술된 하나 또는 그 이상의 항원의 도입에 반응하여, 숙주의 면역계의 활성화, 예컨대 포유동물의 면역계의 활성화를 의미할 수 있다.

면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응, 또는 둘 다의 형태일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이“핵산” 또는 “올리고뉴클레오티드” 또는 “폴리뉴클레오티드”는 함께 공유결합된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포괄한다. 핵산의 많은 변이체들이 주어진 핵산과 상동한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 상동한 핵산 및 이의 보체를 포괄한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 프로브를 포괄한다.

핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있거나, 이중가닥 및 단일가닥 서열 둘다의 부분을 함유할 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘다, RNA, 또는 하이브리드일 수 있으며, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기들의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.

본원에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 이것이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있음을 의미할 수 있다. 프로모터는 그의 제어 하에서 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 배치될 수 있다. 프로모터와 유전자 간의 거리는 프로모터가 유도된 유전자 내에서 그것이 제어하는 프로모터와 유전자 간의 거리와 대략 상동할 수 있다. 당분야에 알려진 바와 같이, 상기 거리의 변동은 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

본원에서 사용되는 "펩티드", "단백질", 또는 "폴리펩티드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있고, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 개질 또는 조합일 수 있다.

본원에서 사용되는 "프로모터"는 세포 내 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화하거나, 개선할 수 있는 합성 또는 천연-유래 분자를 의미할 수 있다. 프로모터는 발현을 더 개선하고/하거나 상동한 것의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변경하는 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 말단(distal) 인핸서 또는 억제자 요소를 포함할 수 있고, 이는 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍 정도에 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 발현이 일어나는 발달 단계에 대해, 또는 외부 자극, 예컨대 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제에 반응하여 구성적으로 또는 별도로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표예에는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동유전자-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV 40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터가 포함된다.

"신호 펩티드" 및 "리더 서열"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 본원에 나타낸 단백질의 아미노 말단에 연결될 수 있는 아미노산 서열을 나타낸다. 신호 펩티드/리더 서열은 전형적으로 단백질의 국지화를 지시한다. 본원에서 이용된 신호 펩티드/리더 서열은 바람직하게는 이것이 생산되는 세포로부터 단백질의 분비를 촉진한다. 신호 펩티드/리더 서열은 종종 세포로부터의 분비 시, 종종 성숙 단백질로 불리는 단백질의 나머지로부터 절단된다. 신호 펩티드/리더 서열은 단백질의 N 말단에 연결된다.

본원에 사용된 "대상체"는 본원에 기술된 백신으로 면역화를 원하거나, 이를 필요로 하는 포유 동물을 지칭한다. 상기 포유동물은 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 마우스 또는 래트일 수 있다.

본원에서 사용되는 "엄격한 혼성화 조건"은 제1 핵산 서열(예로, 탐침)이 제2 핵산 서열(예로, 표적)에, 예컨대 핵산의 복합 혼합물로 혼성화할 조건을 의미할 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점(T_m)보다 약 5-10℃ 더 낮게 선택될 수 있다. T_m은 표적에 상보적인 탐침의 50%가 평형 시(표적 서열이 과량으로 존재하므로, T_m에서 탐침의 50%가 평형 시 점유됨) 표적 서열에 혼성화하는 온도(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에)일 수 있다. 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 예컨대 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01-1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도가 짧은 프로브(예로 약 10-50개 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예로 약 50개 초과 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 60℃인 것들일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화 제제, 예컨대 포름아미드의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건에는 하기가 포함된다: 50% 포름아미드, 5xSSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션하거나, 또는 5xSSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션하고, 65℃에서 0.2xSSC, 및 0.1% SDS 중에 세척.

본원에서 사용되는 "실질적으로 상보적인"은 제1 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 제2 서열의 상보체에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동함을, 또는 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화함을 의미할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이 “실질적으로 상동한”은, 만약 제1 서열이 제2 서열의 보체에 실질적으로 상보적이면, 제1 및 제2 서열이1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 또는 핵산에 대해, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,또는 99% 상동하다는 것을 의미할 수 있다.

본원에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 예방, 억제, 진압 또는 완전 제거 수단을 통한 질병으로부터의 동물의 보호를 의미할 수 있다. 질환의 예방은 질환의 개시 전에 동물에 대한 본 발명의 백신 투여를 포함한다. 질환의 억제는 질환의 유도 후 그러나 그 임상적 출현 전에 동물에 대한 본 발명의 백신 투여를 포함한다. 질환의 진압은 질환의 임상적 출현 후 동물에 대한 본 발명의 백신 투여를 포함한다.

핵산에 대해 본원에서 사용되는 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분의 상보체; (iii) 참조된 핵산 또는 그의 상보체와 실질적으로 상동한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 그의 상보체, 또는 이들과 실질적으로 상동한 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.

펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 “변이체”는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 상동한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성 (예로, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 아미노산을 대체하는 것은 당분야에서 전형적으로 작은 변화를 포함하는 것으로 인식된다. 이들 사소한 변화는 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)를 고려함으로써, 부분적으로 식별될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). 아미노산의 수치요법 지수는 그 소수성 및 전하의 고려에 기반한다. 유사한 수치요법 지수의 아미노산이 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유한다는 것이 당해기술분야에 공지되어 있다. 일 측면에서, ±2의 수치요법 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 야기할 치환을 밝히는데 사용될 수 있다. 펩티드의 문맥에서 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 상관관련이 있다고 보고된 유용한 수단인 상기 펩티드의 가장 큰 국소적 평균 친수성의 계산을 가능하게 한다. 완전히 참고로 본원에 통합된, 미국 특허 번호 4,554,101. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은, 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들면 면역원성을 보유하는 펩티드를 야기할 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산을 이용하여 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성값은 모두 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 그 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 호환성인 아미노산 치환은 아미노산, 및 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성으로 드러나는 바와 같은 이들 아미노산의 측쇄의 상대적 유사성에 따라 달라지는 것으로 이해된다.

변이체는 전체 유전자 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 실질적으로 상동한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 실질적으로 상동한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동할 수 있다.

본원에서 사용되는 "벡터"는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다.

본원에서 수치 범위의 언급에 있어서, 상동한 정도의 정밀도를 갖는 그 사이의 각각의 개입 숫자가 명백하게 고려된다. 예를 들어, 6-9의 범위에 있어서, 숫자 7 및 8은 6 및 9에 부가하여 고려되며, 범위 6.0-7.0에 있어서, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 및 7.0이 명백하게 고려된다.

2. 백신

항원, 그의 단편, 그의 변이체, 또는 그의 조합을 포함하는 백신이 본원에 제공된다. 백신은 포유동물에서 항원에 대한 면역 반응을 생성할 수 있다. 백신은 아래 더욱 자세히 기술된 플라스미드, 또는 다수의 플라스미드를 포함할 수 있다. 백신은 치료적 또는 예방적 면역 반응을 유도할 수 있다.

백신은 암, 예를 들어, 빌름스 종양 억제 유전자 1 (WT1)을 발현하는 암 또는 종양에 대하여 보호하기 위하여 사용될 수 있다. 백신은 치료를 필요로하는 대상체에서 WT1를 발현하는 종양을 예방 및/또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 백신은 WT1 및 WT1를 발현하는 종양에 대하여 세포성 및/또는 항체 반응을 유도할 수 있다.

백신은 백신을 투여한 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 유발할 수 있다.백신을 투여한 대상체에서의 면역 반응은 적어도 약 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 150배, 200배, 225배, 250배, 275배, 300배, 325배, 350배, 375배, 400배, 425배, 450배, 475배, 500배, 525배, 550배, 575배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 1000배, 1500배, 2000배, 2500배, 3000배, 3500배, 또는 4000배로 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신을 투여한 대상체에서의 면역 반응은 적어도 약 300배, 325배, 350배, 375배, 400배, 425배, 450배, 475배, 또는 500배로 유도될 수 있다.

백신은 백신을 투여한 대상체에서 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 체액성 면역 반응은 항원에 면역반응성인 항체를 포함할 수 있다. 유도된 세포성 면역 반응은 인터페론-감마 (IFN-γ)를 생성하고 항원에 면역반응성인 T 세포를 포함할 수 있다. 백신을 투여한 대상체에서의 세포성 면역 반응은 적어도 약 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 150배, 200배, 225배, 250배, 275배, 300배, 325배, 350배, 375배, 400배, 425배, 450배, 475배, 500배, 525배, 550배, 575배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 1000배, 1500배, 2000배, 2500배, 3000배, 3500배, 또는 4000배로 유도될 수 있다.일부 구현예에서, 백신을 투여한 대상체에서의 세포성 면역 반응은 적어도 약 300배, 325배, 350배, 375배, 400배, 425배, 450배, 475배, 또는 500배로 유도될 수 있다.

백신은 항원, 그러한 항원의 단편, 그러한 항원의 변이체, 및 변이체의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 항원을 전달하는데 사용될 수 있다. 다수의 항원을 전달하는 경우, 백신은 다수의 조성물 또는 단일의 조성물을 포함할 수 있다. 전달은 다수의 상이한 항원 또는 상동한 항원의 상이한 부분을 인코딩하는데 사용될 수 있는 단일 플라스미드를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 전달은 상이한 항원 또는 상동한 항원의 상이한 부분을 인코딩하는 상이한 플라스미드를 포함할 수 있다.

백신은 핵산 백신, 펩티드 백신, 또는 핵산 및 펩티드 조합 백신일 수 있다. 상기 핵산 백신은 핵산 분자를 포함할 수 있다. 핵산 백신은 단일 핵산 분자, 예컨대 단일 플라스미드의 복수개의 카피, 2 이상의 상이한 핵산 분자, 예컨대 2 이상의 상이한 플라스미드의 복수개의 카피를 포함할 수 있다.

핵산 백신은 단일 항원에 대한 코딩 서열, 2개 또는 그 이상의 항원에 대한 이종 코딩 서열을 집합적으로 함유하는 핵산 분자, 예컨대 플라스미드를 포함할 수 있다. 2개 항원의 이종 코딩 서열을 포함하는 핵산 백신은 단일 핵산 분자, 예컨대 단일 플라스미드 상에 있을 수 있으며, 또는 핵산 백신은 2개 상이한 핵산 분자, 예컨대 2개 상이한 플라스미드를 포함할 수 있으며, 여기서 하나의 핵산 분자는 1개의 항원의 이종 코딩 서열을 포함하며, 다른 하나의 핵산 분자는 상이한 항원의 이종 코딩 서열을 포함한다. 핵산 백신은 2개 상이한 핵산 분자, 예컨대 2개 상이한 플라스미드를 포함할 수 있으며, 여기서 하나의 핵산 분자는 상기 항원의 제1 부분의 이종 코딩 서열을 포함하며, 다른 하나의 핵산 분자는 상기 항원의 제2 부분의 이종 코딩 서열을 포함한다.

유사하게, 3개 항원의 이종 코딩 서열을 포함하는 핵산 백신은 단일 핵산 분자, 예컨대 단일 플라스미드, 2개의 상이한 핵산 분자 또는 3개의 상이한 핵산 분자를 포함할 수 있다. 그와 같이, 4개 항원의 이종 코딩 서열을 포함하는 핵산 백신은 단일 핵산 분자, 예컨대 단일 플라스미드, 2개의 상이한 핵산 분자, 3개의 상이한 핵산 분자, 또는 4개의 상이한 핵산 분자를 포함할 수 있다.

핵산 백신은 항원을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 그의 변이체, 그의 단편, 또는 그의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 항원과 펩티드 결합으로 연결된 링커, 리더, 및/또는 태그 서열을 인코딩하는 추가 서열을 또한 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 핵산 백신은 분자 보조제에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 일부 사례에서, 분자 보조제는 IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 및/또는 RANTES일 수 있으며, 그리고 일부 사례에서, 상기 분자 보조제는 항-세포독성 T-림프구 항원 (CTLA-4), 항-프로그램된 사멸 수용체-1 (PD-1) 및 항-림프구-활성 유전자 (LAG-3)를 포함하는 체크포인트 억제제이다. IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 및/또는 RANTES에 대한 코딩 서열은 하나 또는 그 이상의 항원에 대한 코딩 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자 상에 포함될 수 있다. IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 및/또는 RANTES에 대한 코딩 서열은 개별 핵산 분자, 예컨대 개별 플라스미드 상에 포함될 수 있다.

펩티드 백신은 항원성 펩티드, 항원성 단백질, 그의 변이체, 그의 단편, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 조합 DNA 및 펩티드 백신은 항원 및 항원성 펩티드 또는 항원성 단백질을 인코딩하는 상기 기술된 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은, 백신 그 자체가 질병 또는 사망을 유도하지 않으므로 안전하고; 질병에 대해 보호적이고; 항체 중화를 유도하고; 보호 T 세포를 유도하고; 투여 용이성, 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 용량 당 낮은 비용을 제공하는 것과 같이 효과적인 백신에 요구되는 특징을 가질 수 있다.

a. 항원

상기 기술된 바와 같이, 백신은 항원을 포함할 수 있다. 항원은 빌름스 종양 억제인자 유전자 1(WT1), 그의 단편, 그의 변이체, 또는 그의 조합일 수 있다. WT1은 N-말단에 프롤린/글루타민-풍부 DNA-결합 도메인을, 그리고 C-말단에 4개의 아연 핑거 모티프를 함유하는 전사 인자이다. WT1은 비뇨생식계의 정상 발달에서 역할을 수행하며, 여러 인자, 예를 들어 알려진 종양 억제인자인 p53 및 세포독성 약물의 처리 후 여러 부위에서 WT1을 절단하는 세린 프로테아제 HtrA2와 상호작용한다.

WT1의 돌연변이는 종양 또는 암 형성, 예를 들어 빌름스 종양 또는 WT1을 발현하는 종양을 야기할 수 있다. 빌름스 종양은 예컨대 비제한적으로 간조직, 비뇨기계 조직, 림프 조직, 및 폐 조직인 다른 조직으로 전이되기 이전에, 종종 1개 또는 두개 다의 신장에서 형성된다. 따라서, 빌름스 종양은 전이성 종양으로 고려될 수 있다. 빌름스 종양은 보통 비교적 어린 아이들(예를 들어, 5세 미만) 및 산발적이고 유전적인, 둘 다의 형태에서 발생한다.

따라서, 상기 백신은 빌름스 종양으로 고통받는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 백신은 대상체에서 그러한 종양의 발달을 예방하기 위하여, WT1를 발현하는 암 또는 종양을 같는 대상체를 치료하는데 또한 사용될 수 있다. WT1 항원은 천연의, “정상” WT1 유전자와 다를 수 있으며, 그리고 그러므로, WT1 항원-발현 종양에 대한 요법 또는 예방을 제공할 수 있다. 따라서, 천연 WT1 유전자와 다른 WT1 항원 서열 (즉, 돌연변이 WT1 유전자 또는 서열)이 본원에 제공된다.

천연 WT1 유전자의 전사물은 다양한 mRNA로 처리되며, 수득한 단백질은 면역 반응을 유도하는데 있어서 모두 같은 값인 것은 아니다. 본원에 기술된 돌연변이 WT1 유전자는 하나의 전장 전사물의 대안적 처리, 생성을 피하며, 결과로 효과기 T 및 B 세포 반응의 더욱 강한 유도를 초래한다. 제1 돌연변이 WT1 서열은 개질된 아연 핑거 또는 ConWT1-L을 갖는 CON WT1로 지칭된다. 서열 식별 번호: 1은 개질된 아연 핑거를 갖는 WT1 항원 CON WT1를 인코딩하는 핵산 서열이다. 서열 식별 번호: 2는 개질된 아연 핑거를 갖는 WT1 항원 CON WT1의 핵산 서열이다. 제2 돌연변이 WT1 서열은 아연 핑거 또는 ConWT1-S가 없는 CON WT1로 지칭된다. 서열 식별 번호: 3은 아연 핑거 없이 WT1 항원 CON WT1를 인코딩하는 핵산 서열이다. 서열 식별 번호: 4는 개질된 아연 핑거가 없는 WT1 항원 CON WT1의 핵산 서열이다.

상기 기술된 이종 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 상기 기술된 이종 서열로 구성된 단리된 핵산 분자가 제공된다. 상기 기술된 이종 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자는 벡터 예컨대 플라스미드, 바이러스 벡터 및 아래 기술된 핵산 분자의 다른 형태에 포함될 수 있다. WT1 항원을 인코딩하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. WT1 항원을 인코딩하는 코딩 서열은 상기 기술된 바와 같은 서열을 갖는다.

상기 기술된 이종 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분자가 제공된다. 상기 기술된 이종 아미노산 서열로 구성된 단백질 분자가 제공된다. 상기 기술된 서열을 갖는 단백질 및 폴리펩티드가 제공된다. 단백질 및 폴리펩티드는 WT1 항원 또는 WT1 면역원으로 지칭될 수 있다. WT1 항원은 WT1 항원을 발현하는 종양에 대한 면역 반응을 야기할 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 공통 항원은 하기 중 하나 이상을 갖는 것을 포함하는, 개선된 전사 및 번역을 제공하는 것이 바람직하다: 전사를 증가시키는 낮은 GC 함량 리더 서열; mRNA 안정성 및 코돈 최적화; 시스-작용 서열 모티프 (즉, 내부 TAT A-박스)를 가능한 정도까지 제거하는 것.

본 발명의 일부 측면에서, 하기 중 하나 이상을 갖는 것을 포함하는, 다수의 균주에 걸쳐 광범위한 면역 반응을 생성하는 공통 항원을 생성하는 것이 바람직하다: 모든 이용가능한 전장 서열을 포함하는 것; 각 위치에서 가장 흔하게 발생하는 아미노산을 이용한 발생된 서열을 계산는 것; 및 균주 사이에서 교차-반응성을 증가시키는 것.

WT1 항원은 2 또는 그 이상의 종으로부터 유래된 공통 항원 (또는 면역원) 서열일 수 있다. WT1 항원은 개선된 발현을 위한 공통 서열 및/또는 개질(들)을 포함할 수 있다. 개질은 코돈 최적화, RNA 최적화, 증가된 번역 개시를 위한 코작 서열 (예를 들어, GCC ACC)의 부가, 및/또는 WT1 항원의 면역원성을 증가시키는 면역글로불린 리더 서열의 부가를 포함할 수 있다. WT1 항원은 신호 펩티드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩티드, 예를 들어 비제한적으로 면역글로불린 E (IgG) 또는 면역글로불린 G (IgG) 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, WT1 공통 항원은 헤마글루티닌 (HA) 태그를 포함할 수 있다. WT1 공통 항원은 상응하는 코돈 최적화된 WT1 항원보다 더 강하고 광범위한 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 야기하도록 셜계될 수 있다.

WT1 공통 항원은 하나 또는 그 이상의 아연 핑거에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 이로써 상응하는 코돈 최적화된 WT1 항원보다 더 강하고 더 광범위한 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 야기할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 하나 또는 그 이상의 아연 핑거에서 아연 이온을 조정하는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환일 수 있다. 아연 이온을 조정하는 하나 또는 그 이상의 아미노산은 CCHH 모티프일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 CCHH 모티프의 1개, 2개, 3개, 또는 4개 모두의 아미노산을 교체할 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 서열 식별 번호: 2의 잔기 312, 317, 342, 및 347이 시스테인 (C)을 제외한 임의의 잔기이며, 서열 식별 번호: 2의 잔기 330, 334, 360, 및 364가 히스티딘 (H)을 제외한 임의의 잔기이도록 한다. 특히, 하나 이상의 돌연변이는 서열 식별 번호: 2의 잔기 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360, 및 364가 글리신 (G)이도록 한다.

다른 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 아연 핑거는 WT1 공통 항원으로부터 제거될 수 있다. 1개, 2개, 3개, 또는 4개 모두의 아연 핑거는 WT1 공통 항원으로부터 제거될 수 있다.

WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 2를 인코딩하는 핵산 서열 식별 번호: 1일 수 있다 (도 6a 및 6b). 일부 구현예에서, WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 1에 개시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구현예에서, WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다.

또 다른 구현예에서, WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있으며, 단, 서열 식별 번호: 2의 잔기 312, 317, 342, 및 347은 시스테인 (C)을 제외한 임의의 잔기이며, 서열 식별 번호: 2의 잔기 330, 334, 360, 및 364는 히스티딘 (H)을 제외한 임의의 잔기이다.다른 구현예에서, WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있으며, 단, 서열 식별 번호: 2의 잔기 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360, 및 364는 글리신 (G)이다.

WT1 공통 항원은 아미노산 서열 서열 식별 번호: 2일 수 있다. 일부 구현예에서, WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있으며, 단, 서열 식별 번호: 2의 잔기 312, 317, 342, 및 347은 시스테인 (C)을 제외한 임의의 잔기이며, 서열 식별 번호: 2의 잔기 330, 334, 360, 및 364은 히스티딘 (H)을 제외한 임의의 잔기이다. 일부 구현예에서, WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있으며, 단, 서열 식별 번호: 2의 잔기 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360, 및 364는 글리신 (G)이다.

WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 4를 인코딩하는 핵산 서열 식별 번호: 3일 수 있다 (도 7a 및 7b). 일부 구현예에서, WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 3에 개시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구현예에서, WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다.

WT1 공통 항원은 아미노산 서열 서열 식별 번호: 4일 수 있다. 일부 구현예에서, WT1 공통 항원은 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.

서열 식별 번호: 2 및 서열 식별 번호: 4의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 면역원성 단편은 서열 식별 번호: 2 및/또는 서열 식별 번호: 4에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은 서열 식별 번호: 2의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있으며, 단, 서열 식별 번호: 2의 잔기 312, 317, 342, 및 347이 면역원성 단편에 존재하면, 이러한 잔기는 시스테인 (C)를 제외한 임의의 잔기이고, 서열 식별 번호: 2의 잔기 330, 334, 360, 및 364가 면역원성 단편에 존재하면, 이러한 잔기는 히스티딘 (H)을 제외한 임의의 잔기이다. 다른 구현예에서, 면역원성 단편은 서열 식별 번호: 2의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있으며, 단, 서열 식별 번호: 2의 잔기 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360, 및 364가 면역원성 단편에 존재하면, 이러한 잔기는 글리신 (G)이다.

일부 구현예에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 면역글로불린 E (IgE) 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은 리더 서열이 없다.

서열 식별 번호 2 및 4의 면역원성 단편과 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 그러한 단편은 서열 식별 번호: 2 및/또는 서열 식별 번호: 4에 대해 적어도 60%, 한 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상의 상동성을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원에서의 WT1 단백질 서열의 면역원성 단편과 96% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원에서의 WT1 단백질 서열의 면역원성 단편과 97% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원에서의 WT1 단백질 서열의 면역원성 단편과 98% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원에서의 WT1 단백질 서열의 면역원성 단편과 99% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은 리더 서열이 없다.

일부 구현예는 서열 식별 번호: 1 및 서열 식별 번호: 3의 면역원성 단편에 관한 것이다. 면역원성 단편은 서열 식별 번호: 1 및/또는 서열 식별 번호: 3의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다. 서열 식별 번호 1 및 3의 면역원성 단편과 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 그러한 면역원성 단편은 서열 식별 번호: 1 및/또는 서열 식별 번호: 3에 대해 95% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 핵산의 적어도 60%, 한 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원에서의 WT1 핵산 서열의 면역원성 단편과 96% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원에서의 WT1 단백질 서열의 면역원성 단편과 97% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원에서의 WT1 단백질 서열의 면역원성 단편과 98% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원에서의 WT1 단백질 서열의 면역원성 단편과 99% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어, 면역글로불린 리더 서열, 예컨대 IgE 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열이 없다.

b. 벡터

백신은 항원을 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 벡터는 포유동물에서 면역 반응을 야기하기에 효과적인 양으로 항원을 발현할 수 있다. 백터는 항원을 인코딩하는 이종 핵산을 포함할 수 있다. 벡터는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가 복제 염색체외 벡터, 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다.

하나 이상의 벡터는 발현 작제물일 수 있고, 이는 일반적으로 표적 세포 내로 특정 유전자를 도입하기 위해 사용되는 플라스미드이다. 일단 발현 벡터가 세포 내로 들어가면, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 세포성-전사 및 번역 기전 리보솜 복합체에 의해 생성된다. 플라스미드는 종종 인헨서 및 프로모터 영역으로 작용하고 발현 벡터 상에 운반된 유전자의 효과적인 전사를 야기하는 조절 서열을 함유하도록 조작된다. 본 발명의 벡터는 다량의 안정한 메신저 RNA, 그리고 이에 따른 단백질을 발현한다.

벡터는 발현 신호, 예컨대 강한 프로모터, 강한 종결 코돈, 프로모터 및 클로닝된 유전자 사이의 거리 조정, 및 전자 종결 서열 및 PTIS (이동가능한 번역 개시 서열)의 삽입을 가질 수 있다.

(1) 발현 벡터

벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 벡터는 종결 신호와 작동적으로 연결될 수 있는, 항원-인코딩 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연결된 프로모터를 가질 수 있다. 벡터는 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역을 위하여 요구되는 서열을 또한 함유할 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 키메라일 수 있으며, 이는 그 성분의 적어도 하나가 그 다른 성분의 적어도 하나에 대해 이종성이라는 것을 의미한다. 발현 카세트 내의 뉴클레오티드 서열을 발현은 구성적 프로모터 또는 숙주 세포가 부분 특정 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도 가능한 프로모터의 통제 하에 있을 수 있다. 다세포 개체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다.

(2) 플라스미드

벡터는 플라스미드일 수 있다. 상기 플라스미드는 항원을 인코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염시키는데 유용할 수 있으며, 상기 형질전환된 숙주세포는 항원의 발현이 일어나는 조건 하에서 배양되고 유지된다.

플라스미드는 공통 단백질 및/또는 공통 단백질의 단편 및/또는 공통 단백질의 변이체 및/또는 변이체 공통 단백질의 단편의 조합으로 구성된 항원, 그러한 단백질의 단편, 그러한 단백질의 변이체, 변이체 또는 융합 단백질의 단편에 대해 면역 반응을 야기할 수 있는 합성, 공통 항원을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 상기 개시된 다양한 항원 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

단일 플라스미드는 단일 항원에 대한 코딩 서열, 2개 항원에 대한 코딩 서열, 3개 항원에 대한 코딩 서열, 또는 4개 항원에 대한 코딩 서열을 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 플라스미드는 CCR20 단독 또는 이러한 플라스미드의 부분으로서 인코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 플라스미드는 IL-12, IL-15 및/또는 IL-28에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다.

상기 플라스미드는 코딩 서열의 상류에 있을 수 있는 개시 코돈, 및 코딩 서열의 하류에 있을 수 있는 정지 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 상기 개시 및 종료 코돈은 코딩 서열과 틀이 맞을 수 있다.

상기 플라스미드는 코딩 서열과 작동적으로 연결된 프로모터를 또한 포함할 수 있다. 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 원숭이 바이러스 40(SV40)으로부터의 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 예컨대 소 면역결핍 바이러스(BIV) 긴 말단 반복서열(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 조류 백혈증 바이러스(ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 최조기(immediate early) 프로모터, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스(EBV) 프로모터, 또는 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 인간 유전자, 예컨대 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 인간 메탈로티오네인으로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 천연 또는 합성의 조직 특이적 프로모터, 예컨대 근육 또는 피부 특이적 프로모터일 수 있다. 그러한 프로모터의 예는 미국 특허 출원 공보 번호 US20040175727에 기재되며, 그 내용은 전문이 본원에 포함된다.

상기 플라스미드는 또한 코딩 서열의 하류에 있을 수 있는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 신호, 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 플라스미드(Invitrogen, San Diego, CA)로부터의 폴리아데닐화 신호일 수 있다.

상기 플라스미드는 또한 코딩 서열의 상류에 인핸서를 포함할 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 바이러스 인핸서, 예컨대 CMV, FMDV, RSV 또는 EBV으로부터의 인핸서일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서는, 각각의 내용이 전체가 참조로써 본원에 통합되어 있는, 미국 특허 번호 5,593,972, 5,962,428, 및 WO94/016737에 기술되며, 이들 각각의 내용은 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.

상기 플라스미드는 또한 염색체외로 플라스미드를 유지하고 세포에서 복수의 플라스미드 카피를 생산하기 위해 포유동물 복제 기원을 포함할 수 있다. 플라스미드는 Invitrogen(San Diego, CA)의 p V AXI, pCEP4 또는 pREP4일 수 있고, 이는 엡스타인 바 바이러스 복제 기원 및 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 포함할 수 있고, 이는 통합 없이 고사본(high copy) 에피솜 복제를 생산할 수 있다. 플라스미드의 뼈대는 pA V0242일 수 있다. 플라스미드는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5(Ad5) 플라스미드일 수 있다.

상기 플라스미드는 또한 조절 서열을 포함할 수 있고, 이는 플라스미드가 투여되는 세포에서 유전자 발현에 매우 적합할 수 있다. 상기 코딩 서열은 숙주세포에서 코딩 서열의 보다 효율적인 전사를 가능하게 할 수 있는 코돈을 포함할 수 있다.

상기 코딩 서열은 또한 Ig 리더 서열을 포함할 수 있다. 상기 리더 서열은 코딩 서열의 5"일 수 있다. 이 서열에 의해 인코딩된 공통 항원은 N-말단 Ig 리더 다음으로 공통 항원 단백질을 포함할 수 있다. 상기 N-말단 Ig 리더는 IgE 또는 IgG일 수 있다.

상기 플라스미드는 pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 대장균(E.coli)에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 p YES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있으며, 이는 효모의 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 MAXBAC™ 완전 배큘로바이러스 발현 시스템(Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 곤충 세포에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 pcDNA I 또는 pcDNA3(Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다.

(3) 원형 및 선형 벡터

벡터는 원형 플라스미드일 수 있고, 이는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체외(예로 복제 기원이 있는 자가 복제 플라스미드)로 존재할 수 있다.

벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 항원을 인코딩하는 DNA를 발현할 수 있고, 세포로 하여금 면역계에 의하여 인식된 항원에 대한 서열을 번역하게 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.

또한 선형 핵산, 또는 선형 발현 카세트("LEC")가 본원에 제공되며, 이는 전기천공을 통해 대상체에 효율적으로 전달될 수 있고 하나 이상의 바람직한 항원을 발현할 수 있다. LEC는 임의의 인산염 골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. DNA는 하나 또는 그 이상의 항원을 인코딩할 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 항원의 발현은 프로모터에 의하여 제어될 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 인산염 골격을 함유하지 않을 수 있다. LEC는 원하는 항원 발현에 관련되지 않은 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수 있다.

LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 플라스미드는 항원을 발현할 수 있을 수 있다. 플라스미드는 pNP(Puerto Rico/34) 또는 pM2(New Caledonia/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 항원을 인코딩하는 DNA를 발현할 수 있고, 세포로 하여금 면역계에 의하여 인식된 항원에 대한 서열을 번역하게 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.

LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 각각 pNP(Puerto Rico/34) 및 pM2(New Caledonia/99)로부터 유래될 수 있다.

(4) 프로모터, 인트론, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호

벡터는 프로모터를 가질 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 구동할 수 있고 단리된 핵산의 유전자 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 그러한 프로모터는 DNA 의존적 RNA 폴리머라아제를 통해 본원에 기술된 항원 서열을 전사하기 위하여 요구되는 시스-작용 서열 요소이다. 이종 핵산의 직접적인 발현에 사용되는 프로모터의 선택은 구체적 적용에 따라 달라진다. 프로모터는 이것이 그 천연 설정에서 전사 개시 부위로부터 유래되므로, 벡터에서 전사 개시로부터 대략 상동한 거리에 배치될 수 있다. 그러나 상기 거리의 변동이 프로모터의 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

프로모터는 항원 및 전사물, 리보솜 결합 부위 및 번역 종결의 효과적인 폴리아데닐화를 위하여 요구되는 신호를 인코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.

프로모터는 CMV 프로모터, SV40 조기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 나타난 또 다른 프로모터일 수 있다.

벡터는 인헨서 및 기능적 스플라이스 공여체 및 수신체 부위를 갖는 인트론을 포함할 수 있다. 벡터는 효과적 종결을 제공하기 위하여 구조적 유전자의 하류에 전사 종결 영역을 함유할 수 있다. 종결 영역은 프로모터 서열과 상동한 유전자로부터 수득될 수 있거나, 상이한 유전자로부터 수득될 수 있다.

(5) 벡터의 제조 방법

본원에 논의된 DNA 백신을 포함하는 벡터를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 벡터는, 포유동물 발현 플라스미드 내로의 최종 서브클로닝 단계 후, 본 기술분야에 알려진 방법을 사용하여, 대규모 발효 탱크 내에서 세포 배양물을 접종하는데 사용될 수 있다.

아래에 더욱 자세하게 기술된 본 발명의 EP 장치를 사용하기 위한 벡터는 알려진 장치 및 기술의 조합을 이용하여 제형화되거나 제조될 수 있지만, 바람직하게는 이들은 라이센스된, 공동계류중인 미국 가출원 미국 시리즈 번호 60/939,792 (2007년 5월 23일 출원)에 기재된 최적화된 플라스미드 제조 기술을 이용하여 제조된다. 일부 예시에서, 이들 연구에 사용된 DNA 플라스미드는 10 mg/mL 이상의 농도로 제형화될 수 있다. 제조 기술은 또한 미국 시리즈 번호 60/939792에 기재된 것에 더하여, 2007. 7. 3.에 허여된 라이센스 받은 특허, 미국 특허 번호 7,238,522에 기재된 것들을 포함하는 당업자에게 일반적으로 알려진 다양한 장치 및 프로토콜이 포함되거나 혼입한다. 상기-참조된 출원 및 특허, 미국 시리즈 번호 60/939,792 및 미국 특허 번호 7,238,522는 그의 전문이 본원에 포함된다.

c. 백신의 부형제 및 다른 성분

상기 백신은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 기능적 분자, 예컨대 운반체, 담체, 또는 희석제일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 전달감염 촉진 제제일 수 있고, 이는 표면 활성 제제, 예컨대 면역 자극 복합체(ISCOMS), 프로인트(Freunds) 불완전 보조제, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체, 소포체, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 나노입자를 포함하는 LPS 유사체, 또는 다른 알려진 전달감염 촉진 제제일 수 있다.

전달감염 촉진 제제는 폴리-L-글루타메이트(LGS)를 포함하는, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 지질이다. 전달감염 촉진 제제는 폴리-L-글루타메이트이고, 폴리-L-글루타메이트는 6mg/ml 미만의 농도로 백신에 존재할 수 있다. 상기 형질감염 촉진제는 계면 활성제 예컨대 면역-자극 복합체 (ISCOMS), 프로인트 불완전 보조제, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩티드, 퀴논 유사체 및 소포, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 포함할 수 있고, 상기 히알루론산은 상기 유전적 작제물과 함께 투여되어 사용될 수 있다. DNA 플라스미드 백신은 또한 형질감염 촉진제, 예컨대 지질, DNA-리포좀 혼합물 (예를 들면 W09324640 참고)로서 레시틴 리포좀 또는 본 기술분야에 알려진 다른 리포좀을 포함하는 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중음이온, 다중양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 알려진 형질감염 촉진제를 포함할 수 있다. 전달감염 촉진 제제는 폴리-L-글루타메이트(LGS)를 포함하는, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 지질이다. 백신 중 전달감염 제제의 농도는 4mg/ml 미만, 2mg/ml 미만, 1mg/ml 미만, 0.750mg/ml 미만, 0.500mg/ml 미만, 0.250mg/ml 미만, 0.100mg/ml 미만, 0.050mg/ml 미만, 또는 0.010mg/ml 미만이다.

약제학적으로 허용가능한 부형제는 하나 또는 그 이상의 보조제일 수 있다.보조제는 대안적인 플라스미드에서 발현되거나, 상기 백신 내의 플라스미드와 조합된 단백질로서 전달되는 다른 유전자일 수 있다. 상기 하나 이상의 보조제는 하기로 이루어진 군으로 구성될 수 있다: CCL20, α-인터페론 (IFN-α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인 (CTACK), 상피 흉선-발현된 케모카인 (TECK), 점막-연관된 상피 케모카인 (MEC), IL-12, IL-15,, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1~, IL-8, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, 아포-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, 아포-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2, 예컨대 IgE로부터의 그것과 같은 상이한 신호 펩티드를 임의로 포함하는 결실된 신호 서열을 인코딩하는 신호 서열 또는 코딩 서열, 또는 예컨대 IgE로부터의 그것과 같은 상이한 신호 펩티드를 인코딩하는 코딩 서열을 갖는 IL-15 및 그의 단편, 또는 그의 조합. 보조제는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 그의 조합일 수 있다.

일부 구현예에서, 보조제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 단백질 및/또는 핵산 분자일 수 있다: CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC 또는 RANTES. IL-12 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US1997/019502 및 상응하는 미국 출원 시리즈 번호 08/956,865 및 2011년 12월 12일 출원된 미국 임시 출원 시리즈 번호 61/569600에 개시되며, 이들 각각은 참고로 본원에 포함되어 있다. IL-15 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US04/18962 및 상응하는 미국 출원 시리즈 번호 10/560,650 및 PCT 출원 번호 PCT/US07/00886 및 상응하는 미국 출원 시리즈 번호 12/160,766, 및 PCT 출원 번호 PCT/USI0/048827에 개시되며, 이들 각각은 참고로 본원에 포함되어 있다. iL-28 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US09/039648 및 상응하는 미국 출원 번호 12/936,192에 개시되며, 이들 각각은 참고로 본원에 포함되어 있다. RANTES 및 다른 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US1999/004332 및 상응하는 미국 출원 번호 09/622452에 개시되며, 이들 각각은 참고로 본원에 포함되어 있다. RANTES 작제물 및 서열의 다른 예시는 PCT 출원 PCT/US11/024098에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함되어 있다. RANTES 및 다른 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US1999/004332 및 상응하는 미국 출원 번호 09/622452에 개시되며, 이들 각각은 참고로 본원에 포함되어 있다. RANTES 작제물 및 서열의 다른 예시는 PCT 출원 PCT/US11/024098에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함되어 있다. 케모카인 CTACK, TECK 및 MEC 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US2005/042231 및 상응하는 미국 출원 시리즈 번호 11/719,646에 개시되며, 이들 각각은 참고로 본원에 포함되어 있다. OX40 및 다른 면역조절물질의 예시는 미국 출원 시리즈 번호 10/560,653에 개시되며, 이들은 참고로 본원에 포함되어 있다. DR5 및 다른 면역조절물질의 예시는 미국 출원 시리즈 번호 09/622452에 개시되며, 이들은 참고로 본원에 포함되어 있다.

보조제로서 유용할 수 있는 다른 유전자는 하기를 인코딩하는 것일 수 있다: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, IL-22, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, 아포-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, 아포-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 그의 기능성 단편.

상기 백신은 미국 출원 시리즈 번호 021,579 (1994년 4월 1일 출원)에 기재된 바와 같은 유전적 백신 촉진제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 완전히 참고로 통합되어 있다.

상기 백신은 약 1 나노그램 내지 100 밀리그램; 약 1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 또는 바람직하게는 약 0.1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 또는 더 바람직하게는 약 1 밀리그램 내지 약 2 밀리그램의 양의 항원 및 플라스미드를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 백신은 약 5나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 백신은 약 10나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 백신은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 백신은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 백신은 약 25 내지 약 250 마이크로그램, 약 100 내지 약 200 마이크로그램, 약 1 나노그램 내지 100 밀리그램; 약 1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 약 0.1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 약 1 밀리그램 내지 약 2 밀리그램, 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램, 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램, 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램, 약 1 내지 약 350 마이크로그램, 약 25 내지 약 250 마이크로그램, 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 그의 항원 또는 플라스미드를 함유할 수 있다.

상기 백신은 사용될 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사가능한 백신 약제학적 조성물은 멸균되고, 발열물질이 없고 미립자가 없을 수 있다. 등장성 제형물 또는 용액이 사용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제에는 나트륨 클로라이드, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토오스가 포함될 수 있다. 상기 백신은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 등장성 용액에는 인산염 완충 식염수가 포함될 수 있다.백신은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. LGS 또는 다중양이온 또는 다중음이온을 포함하는 안정화제는 제형이 연장된 시기 동안 실온 또는 상온에서 안정하도록 할 수 있다.

3. 백신을 전달하는 방법

본원에 유전 작제물 및 항원을 제공하기 위하여 백신을 전달하는 방법이 제공되며, 이는 이들을, 면역반응이 유도될 수 있는 표적 면역원에 대해 특별하게 효과적으로 만드는 에피토프를 포함한다. 백신 전달 또는 백신접종의 방법이 치료적 및 예방적 면역 반응을 유도하기 위해 제공될 수 있다. 백신접종 공정은 포유동물에서 항원에 대한 면역 반응을 생성할 수 있다. 상기 백신은 포유동물의 면역계의 활성을 조절하고 면역 반응을 개선하기 위해 개체에게 전달될 수 있다. 백신의 전달은 세포에서 발현되고 면역계가 인식하는 세포의 표면으로 전달되어 세포성, 체액성, 또는 세포성 및 체액성 반응을 유도하는 핵산 분자로서 항원의 형질감염일 수 있다. 백신의 전달은 상기에서 논의된 바와 같은 백신을 포유동물에게 투여함으로써 항원에 대해 포유동물에서 면역 반응을 유도하거나 유발하는데 사용될 수 있다.

백신 및 플라스미드를 포유동물의 세포 내로 전달할 때, 형질감염된 세포는 백신으로부터 주입된 플라스미드 각각에 대해 항원을 발현하고 분비할 것이다. 이들 항원은 면역계에 의해 외래의 것으로 인식될 것이고, 항체가 이들에 대해 만들어질 것이다. 이들 항체는 면역계에 의해 유지될 것이고 항원에 대해 효과적인 반응을 허용할 것이다.

상기 백신은 포유동물에게 투여되어 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 상기 포유동물은 인간, 영장류, 비-인간 영장류, 젖소, 소, 양, 염소, 영양, 들소, 물소, 들소, 소과, 사슴, 헤지혹(hedgehog), 코끼리, 라마, 알파카, 마우스, 래트, 및 닭일 수 있다.

a. 병용 치료

상기 백신은 CCL20, a-인터페론, y-인터페론, 혈청 유래 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인 (CTACK), 상피 흉선-발현된 케모카인 (TECK), 점막-연관된 상피 케모카인 (MEC), IL-12, IL-15 (신호 서열이 결실되고 선택적으로 IgE 유래의 신호 펩티드를 포함하는 IL-15를 포함함), MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-28, MCP-1, MIP-lα, MIP-1β, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, 아포-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, 아포-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 그의 기능적 단편 또는 그의 조합을 인코딩하는 다른 단백질 및/또는 유전자와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신은 하기 핵산 분자 및/또는 단백질 중 하나 또는 그 이상과 조합하여 투여된다: CCL20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC 및 RANTES 또는 그의 기능적 단편 중 하나 이상을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자, CCL20, IL-12 단백질, IL-15 단백질, IL-28 단백질, CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 또는 RANTES 단백질 또는 그의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질.

상기 백신은 경구로, 비경구로, 설하로, 경피로, 직장으로, 점막관통으로, 국소로, 흡입을 통해, 구강 투여를 통해, 늑막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내 척추강내, 및 관절내 또는 그의 조합을 포함하는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 수의학적 용도를 위해, 백신은 정상적인 수의학적 관례에 따라 적합하게 허용 가능한 제형으로 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 가장 적절한 복용 요법 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다.. 백신은 전통적 주사기, 무침 주사 장치, "미세투사 충격 곤 건(microprojectile bombardment gone guns)", 또는 전기천공 (“EP”), “유체역학적 방법”, 또는 초음파와 같은 다른 물리적 방법에 의해 투여될 수 있다.

백신의 플라스미드는 생체내 전기천공을 이용 및 이용하지 않은 DNA 주사 (또한 DNA 백신접종으로도 불림), 리포좀 매개된, 나노입자 촉진된, 재조합 벡터, 예컨대 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관된 바이러스 및 재조합 백시니아를 포함하는 널리 알려진 몇 가지 기술에 의해 포유동물에게 전달될 수 있다. 항원 또는 면역원은 DNA 주사를 통해 그리고 생체내 전기천공과 함께 전달될 수 있다.

b. 전기천공

백신은 제약 분야의 숙련가들에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 제형화될 수 있다. 그러한 조성물은 용량으로, 그리고 의학 분야에서 숙련가들에게 잘 알려진 r기술에 의하여, 나이, 성별, 체중, 및 특정 개체의 병태 및 투여 경로과 같은 그러한 인자를 고려하여 투여될 수 있다. 대상체는 포유동물, 예컨대, 인간, 말, 소, 돼지, 양, 고양이, 개, 래트, 또는 마우스일 수 있다.

백신은 방지적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 방지적 투여에서, 백신은 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료적 투여에서, 백신은 치료를 필요로하는 대상체에서 치료성 효과를 야기하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 이를 달성하기 위한 적당한 양은“치료적으로 효과적인 용량”으로 정의될 수 있다. 이러한 용도를 위한 효과적인 양은 예를 들어, 투여된 백신 복용법의 특정 조성물, 투여 방법, 질병의 단계 및 중증도, 환자 건강의 일반적 상태, 및 처방 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.

백신은 Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)); Felgner et al. (미국 특허 번호 5,580,859, 1996년 12월 3일 발행됨); Felgner (미국 특허 번호 5,703,055, 1997년 12월 30일 발행됨); 및 Carson et al. (미국 특허 번호 5,679,647, 1997년 10월 21일 발행됨)에 기술된 바와 같이 본 분야에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있으며, 이들 모두의 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다. 백신의 DNA는 개체에게, 예를 들어 백신 건을 사용하여 투여될 수 있는 입자 또는 비드로 복합체화될 수 있다. 본 분야의 숙련가는 생리학적으로 수용 가능한 화합물을 포함하는 제약학적으로 수용가능한 담체의 선택은 예를 들어 발현 벡터의 투여 경로에 따라 달라질 수 있다는 것을 알 것이다.

백신은 다양한 경로를 통하여 전달될 수 있다. 전형적인 전달 경로는 비경구 투여, 예를 들어, 피내, 근육내, 또는 피하 전달을 포함한다. 다른 경로는 경구 투여, 비강내, 질내 경로를 포함한다. 특히 백신의 DNA에 대하여, 백신은 개체의 조직의 틈새 공간으로 전달될 수 있다 (Felgner et al., 미국 특허 번호 5,580,859 및 5,703,055, 이들 모두의 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다). 백신은 또한 근육에 투여될 수 있거나, 피내 또는 피하 주사를 통하여, 또는 예컨대 이온도입법과 같은 경피형태로 투여될 수 있다. 백신의 표피 투여 또한 채용될 수 있다. 표피 투여는 자극물에 대해 면역 반응을 촉발하는 표피 최외층을 기계적 또는 화학적으로 자극하는 것을 포함한다 (Carson et al., 미국 특허번호 5,679,647, 이들 모두의 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다).

백신은 비강 통로를 통한 투여를 위하여 또한 제형화될 수 있다. 비강 투여에 적절한 제형은, 스너프(snuff)가 행해지는, 즉, 코 가까이에서 홀딩된 파우더의 콘테이너로부터 비강 통로를 통한 빠른 흡입에 의한 방법으로 투여되는, 예를 들어 약 10 내지 약 500 마이크론의 범위의 입자 크기를 갖는 조분말을 포함할 수 있으며, 여기서 담체는 고형이다. 상기 제형은 비강 스프레이, 비강 액적, 또는 분무기에 의한 에어로졸 투여에 의한 것일 수 있다. 상기 제형은 백신의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.

백신은 현탁액, 시럽, 또는 엘릭시르와 같은 액상 조제물일 수 있다. 백신은 비경구, 피하, 피내, 근육내, 또는 정맥내 투여 (예를 들어, 주사 가능한 투여)를 위한 조제물, 예컨대 무균성 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다.

백신은 리포좀, 마이크로스피어, 또는 다른 폴리머 매트리스로 포함될 수 있다 (Felgner et al., 미국 특허번호 5,703,055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. Ito III (2nd ed. 1993), 이들 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함됨). 리포좀은 인지질 또는 다른 지질로 구성될 수 있으며, 제조 및 투여하기에 비교적 단순한 비독성이고, 생리학적으로 수용 가능하고, 그리고 대사가능한 담체일 수 있다.

백신의 플라스미드의 전기천공을 통한 백신의 투여는 가역적 기공이 세포막에 형성되게 하는데 효과적인 에너지의 펄스를 포유동물의 원하는 조직에 전달하도록 구성될 수 있는 전기천공 장치를 이용하여 달성될 수 있고, 바람직한 에너지의 펄스는 사용자에 의해 입력된 사전 조정된 전류와 유사한 정전류다. 전기천공 장치는 전기천공 성분 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함할 수 있다. 전기천공 성분은 하기를 포함하는 전기천공 장치의 다양한 요소의 하나 또는 그 이상을 포함 및 혼입할 수 있다: 컨트롤러, 전류 파형 생성기, 임피던스 시험기, 파형 로거(logger), 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 성분, 전원 공급원 및 전원 스위치. 전기천공은 생체내 전기천공 장치를 사용하여 달성될 수 있으며, 예를 들어

플라스미드에 의한 세포의 전달감염을 촉진하기 위하여 CELLECTRA EP 시스템 (VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, P A) 또는 Elgen 전기천공기(Genetronics, San Diego, CA).

전기천공 성분은 전기천공 장치의 하나의 요소로 기능할 수 있고, 다른 요소는 전기천공 성분과 통신하는 별도의 요소(또는 성분)이다. 상기 전기천공 성분은 전기천공 장치의 1 초과의 요소로서 기능할 수 있고, 이는 상기 전기천공 성분과 구별되는 전기천공 장치의 또 다른 요소와 여전히 통신할 수 있다. 하나의 전기기계적 또는 기계적 장치의 부분로서 존재하는 전기천공 장치의 요소들은, 상기 요소들이 하나의 장치로서 또는 서로 통신하는 별개의 요소로서 기능할 수 있으므로 제한되지 않을 수 있다. 상기 전기천공 성분은 원하는 조직에서 정전류를 생산하는 에너지의 펄스를 전달할 수 있으며, 피드백 기전을 포함한다. 전극 어셈블리는 공간 배열 내에 복수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 전극 어셈블리는 전기천공 성분으로부터 에너지의 펄스를 수신하고 전극을 통해 원하는 조직에 상동한 것을 전달한다. 복수의 전극 중 적어도 하나는 에너지의 펄스가 전달되는 동안 중성이고, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 임피던스를 전기천공 성분에 교신한다. 상기 피드백 기전은 측정된 임피던스를 수신할 수 있고 전기천공 성분에 의해 전달된 에너지의 펄스가 정전류를 유지하도록 조절할 수 있다.

복수의 전극은 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있다. 복수의 전극은 프로그램된 서열 하에 전극의 제어를 통해 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있고, 상기 프로그램된 서열은 사용자에 의해 전기천공 성분에 입력된다. 상기 프로그램된 서열은 서열로 전달된 복수의 펄스를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 복수의 펄스 중 각각의 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해 전달되고, 여기서 상기 복수의 펄스 중 차후의 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중 상이한 하나에 의해 전달된다.

상기 피드백 기전은 하드웨어 또는 소프트웨어 중 하나에 의해 수행될 수 있다. 피드백 기전은 아날로그 닫힌-루프 회로에 의해 수행될 수 있다. 피드백은 50 μs, 20 μs, 10 μs 또는 1 μs 마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백이거나 순간적이다(즉, 반응 시간을 측정하기 위해 이용 가능한 기법에 의해 측정되는 바에 따라 실질적으로 순간적임). 중성 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 임피던스를 피드백 기전으로 교신할 수 있고, 상기 피드백 기전은 상기 임피던스에 반응하여 정전류가 사전 설정된 전류와 유사한 값으로 유지되도록 에너지 펄스를 조정한다. 피드백 기전은 에너지의 펄스의 전달 동안 연속적으로 및 순간적으로 정전류를 유지할 수 있다.

본 발명의 DNA 백신의 전달을 촉진할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예시는, 미국 특허 번호 7,245,963 (Draghia-Akli, et al.,), 미국 특허 공보 2005/0052630 (Smith, 등에 의해 제출됨)에 기술된 것을 포함하며, 그의 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다. DNA 백신의 전달을 촉진하는데 사용될 수 있는 다른 전기천공 장치 및 전기천공 방법은, 미국 임시 출원 시리즈 번호 60/852,149 (2006년 10월 17일 출원), 및 60/978,982 (2007년 10월 10일 출원)에 대해 35 USC 119(e) 하에 우선권을 주장하는, 공동-계류중이고 공동-소유인 미국 특허 출원 시리즈 번호11/874072 (2007년 10월 17일 출원)에 제공된 것을 포함하며, 이들 모두는 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다.

미국 특허 번호 7,245,963 (Draghia-Akli, et al.)는 몸 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로 생체분자의 도입을 용이하게 하기 위한 모듈식 전극 시스템 및 그의 용도를 기술하고 있다. 상기 모듈식 전극 시스템은 복수의 니들 전극; 피하 주사침; 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 니들 전극까지 전도성 링크를 제공하는 전기적 커넥터; 및 전원 공급원을 포함할 수 있다. 작업자는 지지 구조 상에 올려진 복수의 니들 전극을 붙잡아 몸 또는 식물에서 선택된 조직 내로 이들을 단단하게 삽입할 수 있다. 생체분자는 이후 선택된 조직 내로 피하 주사침을 통해 전달된다. 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고 정전류 전기 펄스가 복수의 니들 전극에 적용된다. 상기 적용된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이에 있는 세포 내로 생체분자의 도입을 촉진한다. 미국 특허 번호7,245,963의 전체 내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.

미국 특허 공보 2005/0052630 (Smith, 등에 의해 출원됨)는 몸 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로 생체분자의 도입을 효과적으로 촉진하는데 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기술한다. 상기 전기천공 장치는 작업이 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 지정되는 전기-동력학 장치 ("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 사용자 제어 및 펄스 파라미터의 입력에 기초한 어레이 내의 전극 사이에 일련의 프로그램가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하고, 전류 파형 데이터의 저장 및 취득을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 니들 전극, 주사 니들용 중앙 주사 채널, 및 제거가능한 가이드 디스크의 어레이를 갖는 교체가능한 전극 디스크를 포함한다. 미국 특허 공보 2005/0052630호의 내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.

미국 특허 번호 7,245,963 및 미국 특허 공보 2005/0052630에 기재된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직 뿐만 아니라 다른 조직 또는 기관 내로 깊이 침투하기 위하여 조정될 수 있다. 전극 어레이의 배치 때문에, 주사 니들 (선택한 생체분자를 전달함)은 또한 표적 장기 내로 완전히 삽입되며, 주사는 전극에 의해 미리 기술된 영역 내에서, 표적 조직에 수직으로 투여된다. 미국 특허 번호 7,245,963 및 미국 특허 공보 2005/005263에 기술된 전극은 바람직하게는 20 mm 길이 및 21 게이지이다.

또한, 전기천공 장치 및 이의 사용을 포함하는 고려된 일부 구현예에서, 하기 특허들에 기재된 것들인 전기천공 장치가 고려된다: 미국 특허 5,273,525호(1993년 12월 28일 발행), 미국 특허 6,110,161호(2000년 8월 29일 발행), 6,261,281 (2001년 7월 17일 발행), 및 6,958,060 (2005년 10월 25일 발행), 및 미국 특허 6,939,862호(2005년 9월 6일 발행). 더욱이, 본 주제를 포괄하는 특허는 다양한 장치의 임의의 것을 사용하여 DNA 전달을 개시하는 미국 특허 6,697,669 (2004년 2월 24일 발행), 및 DNA 주입 방법과 관련된 미국 특허 7,328,064 (2008년 2월 5일 발행)에 제공되어 있으며, 이는 본원에 고려된다. 상기 특허는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

백신은 전기천공을 통하여, 예컨대 미국 특허 번호 7,664,545에 기술된 방법에 의하여 투여될 수 있으며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다. 전기천공은 미국 특허 번호 6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359에 기술된 방법 및/또는 장치에 의하여 투여될 수 있으며, 이의 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다. 전기천공은 최소 침습성 장치를 통해 수행될 수 있다.

상기 최소 침습 전기천공 장치 (“MID”)는 상기 기술된 백신 및 관련 유체를 신체 조직에 주입하기 위한 장치일 수 있다. 상기 장치는 속이 빈 니들, DNA 카세트, 유체 전달 수단을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 장치는 상기 유체 전달 수단을 체조직에 니들을 삽입하는 동안 동시에 (예를 들어, 자동적으로) DNA를 체조직에 주입하기 위하여 유체 전달 수단을 사용되도록 구동하기 위하여 조정될 수 있다. 이는 DNA 및 관련 유체를, 상기 니들이 삽입되는 동안 서서히 주입하여 체조직을 통하여 유체가 더욱 골고루 분배되도록 하는 장점을 갖는다. 주입 동안 경험된 고통은 더욱 큰 영역에 걸쳐 주사된 DNA의 분배로 인하여 감소할 수 있다.

MID는 니들의 사용 없이 조직에 백신을 주입할 수 있다. MID는 백신이 조직 표면을 관통하고 그 밑의 조직 및/또는 근육에 진입하는 그러한 힘으로 작은 스트림 또는 제트(jet)로서 백신을 주입할 수 있다. 작은 스트림 또는 제트(jet) 뒤의 그 힘은 가압 기체, 예컨대 1초 분획내 미세-구멍을 통한 이산화탄소의 확장을 통하여 제공될 수 있다. 최소 침습 전기 천공의 예시, 및 그들을 사용하는 방법은 공표된 미국 특허 출원 번호 20080234655; 미국 특허 번호 6,520,950; 미국 특허 번호 7,171,264; 미국 특허 번호 6,208,893; 미국 특허 번호 6,009,347; 미국 특허 번호 6,120,493; 미국 특허 번호 7,245,963; 미국 특허 번호 7,328,064; 및 미국 특허 번호 6,763,264에 기술되며, 이들 각각의 내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.

MID는 조직을 고통없이 관통하는 액상의 고속 제트를 생성하는 주입기를 포함할 수 있다. 그러한 무침 주입기는 상업적으로 이용가능하다. 본원에서 사용될 수 있는 무침 주입기의 예시는 미국 특허 번호3,805,783; 4,447,223; 5,505,697; 및 4,342,310에 기술된 것들을 포함하며, 이들 각각의 내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.

직접 또는 간접 전기운반에 적합한 형태로의 바람직한 백신은 무침 주입기를 사용하여 처리될 조직내로 도입 (예를 들어, 주입)될 수 있으며, 이는 보통 제제의 제트의 전달을 구동하기 위하여 조직에 백신의 관통을 야기할 충분한 힘으로 조직 표면을 주입기에 접촉함으로써 행해진다. 예를 들어, 만약 처리될 조직이, 점막, 피부, 또는 근육일 경우, 상기 제제는 상기 제제가 각질층을 통하여 그리고 피부 층으로, 또는 그 밑의 조직 및 근육으로 각각 관통하는 것을 야기하기에 충분한 힘으로 상기 점막 또는 피부 표면에 투사된다.

무침 주입기는 조직의 모든 유형, 특히 피부 또는 점막에 백신을 전달하도록 잘 맞춰져 있다. 일부 구현예에서, 무침 주입기는 백신을 함유하는 액상을 표면으로 그리고 대상체의 피부 또는 점막으로 나아가게 하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 조직의 다양한 유형의 대표 예시는 췌장, 후두, 비인두, 아랫 인두, 인두 중앙부, 입술, 목구멍, 폐, 심장, 신장, 근육, 유방, 결장, 전립선, 흉선, 고환, 피부, 점액성 조직, 난소, 혈관 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.

MID는 조직을 전기천공하는 니들 전극을 가질 수 있다. 다중 전극 어레이, 예를 들어 직사각 또는 사각 패턴으로의 설정 내에서 전극의 다중 쌍 사이에서 펄싱(pulsing)함으로써, 전극 쌍 사이의 펄싱에 대한 개선된 결과가 제공된다. 예를 들어“약물 및 유전자의 매개된 전달을 위한 니들 전극”을 표제로 한 미국 특허 번호 5,702,359에서와 같이, 니들의 어레이가 개시되며, 여기서 니들의 다수의 쌍은 치료적 치료 동안 펄싱될 수 있다. 그 전체가 참고로 개시되어 본원의 포함된 출원에서, 니들은 원형 어레이에 배치되었으나, 니들 전극의 반대 쌍 사이에서 펄싱을 가능하게 하는 커넥터 및 스위칭 장치를 갖는다. 재조합 발현 벡터를 세포로 전달하기 위한 니들 전극 쌍이 사용될 수 있다. 그러한 장치 및 시스템은, 미국 특허 번호 6,763,264에 기술되며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다. 대안적으로, DNA의 주입 및 정상 주입 니들과 유사한 단일 니들로의 전기 천공을 허용하고 현재 사용되는 장치에 의하여 전달되는 것들보다 더 낮은 펄스를 적용하여, 이로써 환자에 의하여 경혐되는 전기적 느낌이 감소하는 단일 니들 장치가 사용될 수 있다.

MID는 하나 또는 그 이상의 전극 어레이를 포함할 수 있다. 어레이는 상동한 직경 또는 상이한 직경의 2개 이상의 니들을 포함할 수 있다. 니들은 고르게 또는 고르지 않게 떨어져 있을 수 있다. 니들은 0.005 인치 및 0.03 인치 사이, 0.01 인치 및 0.025 인치 사이; 또는 0.015 인치 및 0.020 인치 사이일 수 있다. 니들은 직경이 0.0175 인치일 수 있다. 니들은 0.5 mm, 1.0 mm, 1.5 mm, 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm, 또는 그 이상 떨어져 있을 수 있다.

MID는 펄스 생성기 및 단일 단계에서 백신 및 전기천공 펄스를 전달하는 2 이상의 니들 백신 주입기로 구성될 수 있다. 펄스 생성기는 플래시 카드 작동된 퍼스널 컴퓨터를 통하여 펄스 및 주입 파라미터의 유연한 프로그래밍 뿐만 아니라, 전기천공 및 환자 데이터의 전체적인 기록 및 저장을 가능케할 수 있다. 펄스 생성기는 짧은 기간의 시간 동안 다양한 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 예를 들어, 펄스 생성기는 100 ms의 기간 동안 15 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 그러한 MID의 예시는 Inovio Biomedical Corporation에 의한 엘젠(Elgen) 1000 시스템이며, 이는 미국 특허 번호 7,328,064에 기술되며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다.

MID는 CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell PA) 장치 및 시스템일 수 있으며, 이는 거대분자, 예컨대 DNA를 인체 또는 식물 내의 선택된 조직의 세포로 도입을 촉진하는 모듈식 전극 시스템이다. 상기 모듈식 전극 시스템은 복수의 니들 전극; 피하 주사침; 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 니들 전극까지 전도성 링크를 제공하는 전기적 커넥터; 및 전원 공급원을 포함할 수 있다. 작업자는 지지 구조 상에 올려진 복수의 니들 전극을 붙잡아 몸 또는 식물에서 선택된 조직 내로 이들을 단단하게 삽입할 수 있다. 거대분자는 이후 선택된 조직 내로 피하 주사침을 통해 전달된다. 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고 정전류 전기 펄스가 복수의 니들 전극에 적용된다. 상기 적용된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이에 있는 세포 내로 거대분자의 도입을 촉진한다. 세포 과열에 의한 세포 사멸은 일정-전류 펄스 덕분에 조직에서의 전력 소실을 제한함으로써 최소화된다. 셀렉트라(Cellectra) 장치 및 시스템은, 미국 특허 번호 7,245,963에 기술되며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다.

MID는 Elgen 1000 시스템 (Inovio Pharmaceuticals)일 수 있다. Elgen 1000 시스템은 속이 빈 니들, 카세트, 유체 전달 수단을 제공하는 장치를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 장치는 상기 유체 전달 수단을 체조직에 니들을 삽입하는 동안 동시에 (예를 들어, 자동적으로) 체조직에 주입하기 위하여 유체 전달 수단을 사용되도록 구동하기 위하여 조정될 수 있다. 이는 상기 유체를, 상기 니들이 삽입되는 동안 서서히 주입하여 체조직을 통하여 유체가 더욱 골고루 분배되도록 하는 장점을 갖는다. 주입 동안 경험된 고통은 더욱 큰 영역에 걸쳐 주사된 유체의 용적의 분배로 인하여 감소할 수 있다고 또한 알려져 있다.

또한, 유체의 자동 주입은 주입된 유체의 실제적 용량의 자동 모니터링 및 기록을 촉진한다. 이러한 데이터는 원한다면 기록 목적을 위한 제어 유닛에 의하여 저장될 수 있다.

주입의 비율은 선형 또는 비선형일 수 있으며, 주입은 니들이 치료받을 대상체의 피부를 통해 주입된 후, 그리고 그것이 추가로 체조직에 삽입되는 동안 수행될 수 있다는 것이 인지될 것이다.

유체가 본 발명의 장치에 의하여 주입될 수 있는 적절한 조직은 종양 조직, 피부, 또는 폐 조직을 포함할 수 있으나, 근육 조직일 수 있다.

상기 장치는 추가로 체조직으로 니들을 삽입 인도하기 위한 니들 삽입 수단을 포함한다. 유체 주입 비율은 니들 삽입의 비율에 의하여 제어된다. 이는 유체의 니들 삽입 및 주입 둘 다가 삽입의 비율이 주입 비율에 원하는 바와 같이 매칭될 수 있도록 제어될 수 있다는 장점을 갖는다. 이는 또한 상기 장치를 사용자로 하여금 작동하기 더욱 쉽게 만든다. 원할 경우, 체조직으로 니들을 자동 삽입하기 위한 수단이 제공될 수 있다.

사용자는 언제 유체의 주입이 발생할지 선택할 수 있다. 이상적으로는 그러나, 주입은 니들의 끝이 근육 조직에 도달할 때 발생하고, 상기 장치는 상기 니들이 상기 유체의 주입이 발생하기에 충분한 깊이로 삽입될 때를 감지하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이는 유체의 주입이 니들이 원하는 깊이 (이는 보통 근육 조직이 시작되는 깊이일 것이다)에 도달할 때 자동적으로 발생하도록 촉진될 수 있다는 것을 의미한다. 근육 조직이 시작되는 깊이는 예를 들어 미리 설정된 니들 삽입 깊이, 예컨대 피부 층을 통하여 니들이 들어갈 수 있기에 충분하게 여겨질 깊이인 4 mm의 값으로 여겨질 수 있다.

감지 수단은 초음파 프로브를 포함할 수 있다. 상기 감지 수단은 임피던스와 내성의 변화를 감지하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이 경우에서 상기 수단은 체조직에서 니들의 깊이를 기록하는 그러한 것을 하지 않을 수 있지만, 그 대신 니들이 상이한 유형의 체조직으로부터 근육으로 이동할 때 임피던스 또는 내성의 변화를 감지하도록 조정될 수 있다. 이러한 대안들 중 어느 하나는 주입이 발생할 수 있는 상대적으로 정확하고 간결하게 작동하는 감지 수단을 제공할 수 있다. 니들 삽입의 깊이는 원하다면 추가로 기록될 수 있으며, 주입될 유체의 부피가 니들 삽입의 깊이가 기록되는 바와 같이 결정되도록 유체의 주입을 제어하는데 사용될 수 있다.

상기 장치는 추가로: 니들을 지지하기 위한 베이스, 그 안에 베이스를 수용하기 위한 하우징을 포함하며, 여기서 상기 베이스는 상기 하우징에 대해 이동가능하여 상기 베이스가 상기 하우징에 대해 제1 후면 위치에 있을 때 상기 니들이 상기 하우징 내에서 후퇴하며, 상기 베이스가 하우징 내에서 제2 정면 위치에 있을 때 상기 하우징 밖으로 연장하도록 한다. 이는 상기 하우징이 환자의 피부 상에서 정렬될 수 있고, 상기 니들이 이후 상기 베이스에 대해 상기 하우징을 이동시킴으로써 상기 환자의 피부로 삽입될 수 있으므로 사용자에게 이롭다.

상기 기술한 바와 같이, 상기 유체가 피부에 삽입될 때 니들 길에에 걸쳐 고루 분배되로록 유체 주입의 제어된 비율을 달성하는 것이 바람직하다. 유체 전달 수단은 제어된 비율에서 유체를 주입하도록 조절된 피스톤 구동 수단을 포함할 수 있다. 피스톤 구동 수단은 예를 들어 서보 모터에 의하여 활성화될 수 있다. 그러나, 피스톤 구동 수단은 하우징에 대해 축방향으로 이동하는 베이스에 의하여 구동될 수 있다. 유체 전달을 위한 대안적인 수단이 제공될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 그러므로, 예를 들어, 제어된 또는 비-제어된 비율로의 유체 전달을 위하여 스퀴징되는 밀폐 콘테이너가 주사기 및 피스톤 시스템의 위치에서 제공될 수 있다.

상기 기술된 장치는 주입의 임의의 유형을 위하여 사용될 수 있다. 이는 그러나 전기천공 분야에서 특이 유용한 것으로 구상될 것이며, 그러므로 이는 니들에 전압을 적용하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 이는 상기 니들이 주입만을 위하여 사용되는 것이 아니라 또한 전기천공동안 전극으로서도 사용될 수 있도록 허용한다. 이는 전장이 주입된 유체와 같은 영역에 적용된다는 것을 의미하므로 특히 이롭다. 전통적으로 전기천공에 대해서 이것이 전극을 이전에 주입된 유체와 정확하게 배치하는 것이 매우 어렵다는 점과, 그러므로 사용자가 요구된 양에 비하여 더 많은 용적의 유체를 더욱 큰 영역에 걸쳐 주입하고 더욱 높은 영역에 걸쳐 전장을 적용하여 주입된 물질 및 전장 사이의 겹침을 보장하도록 하는 경향이 있다는 문제가 있어 왔다. 본 발명을 사용하면서, 전장 및 유체 사이에 적합성을 달성하면서도 주입된 유체의 용적 및 적용된 전장의 크기 둘 다가 감소될 수 있다.

4. 치료 및/또는 예방의 방법

그를 필요로 하는 대상체에 백신을 투여함으로써 그를 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료, 이에 대해 보호, 및/또는 예방하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 상기 질병은 암, 예를 들어 빌름스 종양, 빌름스 종양에서 야기된 전이성 암, 및 WT1-발현 암 또는 종양일 수 있다. 백신은 전달의 방법으로 상기 기술된 대상체에 투여될 수 있다. 대상체로의 백신의 투여는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 유발할 수 있다.

특히, 대상체로의 백신의 투여는 대상체에서 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도 또는 유발할 수 있다. 특히, 상기 방법은 빌름스 종양, 빌름스 종양에서 야기된 전이성 암, 및 WT1-발현 종양 또는 암을 갖는 대상체를 치료할 수 있는데, 이는 상기 백신이 빌름스 종양, 빌름스 종양에서 야기된 전이성 암, 및/또는 WT1-발현 종양 또는 암의 성장을 둔화시키고, 이를 감소 및 제거하기 때문이다. 상기 방법은 빌름스 종양, 빌름스 종양에서 야기된 전이성 암, 및 WT1-발현 종양 또는 암을 대상체에서 예방할 수 있는데, 이는 상기 백신이 빌름스 종양, 빌름스 종양에서 야기된 전이성 암, 및/또는 WT1-발현 종양 또는 암의 형성 및 성장을 억제하기 때문이다. 상기 기술된 바와 같이, 백신은 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도 또는 유발한다. 이러한 유도된 체액성 및/또는 세포성 면역 반응은 빌름스 종양, 빌름스 종양에서 야기된 전이성 암, 및/또는 WT1-발현 종양 또는 암을 표적화할 수 있으며, 이로써 상기 백신이 투여된 대상체에서 빌름스 종양, 빌름스 종양에서 야기된 전이성 암, 및/또는 WT1-발현 종양 또는 암의 성장을 둔화시키고, 이를 감소 및 제거할 수 있다. 상기 백신에 의하여 유도된 이러한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응은 상기 백신이 투여된 대상체에서 빌름스 종양, 빌름스 종양에서 야기된 전이성 암, 및/또는 WT1-발현 종양 또는 암의 발생 및 성장을 또한 억제할 수 있다.

백신 용량은 1㎍ 내지 10mg의 활성 성분/체중kg/시간일 수 있고, 20㎍ 내지 10mg 성분/체중kg/시간일 수 있다. 백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 백신 투여 횟수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다.

본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 예시되는 다수 측면을 갖는다.

5. 실시예

본 발명은 하기 실시예에 추가로 예시된다. 이들 실시예는, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내긴 하지만, 단지 예시를 위해 주어지는 것으로 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당해분야의 숙련가는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 이의 정신 및 범주로부터 벗어나지 않고, 그것을 다양한 용법 및 조건에 맞추기 위해 본 발명을 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다. 따라서 본원에 나타내고 기재된 것들에 부가하여 본 발명의 다양한 개질이 상기 기재로부터 당분야 숙련가에게 자명할 것이다. 이러한 개질은 또한 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 속하는 것이다.

WT1 면역원을 생성하기 위하여 단계적 접근을 실시예에서 기술된 바와 같이 취하였다. WT1 유전자를 몇몇의 단계적 개질을 통하여 개질하였다. 첫째로, WT1 RNA 구조를 그것이 단일의, 전장 전사물을 생성하도록 개질하였다. 둘째로, 5’ 말단에서 RNA 구조를 변경하기 위하여 코돈 사용을 개질하여 이로써 체내 발현을 개선하였다. 마지막으로, 유전자의 아연 핑거 도메인을 WT1 활성을 개질하고 아연 핑거 결합 부위의 부분을 삭제하기 위하여 변이시켰다.

실시예 1

최적화된 WT-1

WT1 면역원을 생성하기 위하여 단계적 접근을 개발하였다. 결과로 단일 전장 전사물 생성을 초래하여, 이로써 더욱 더 제어된 표현형을 갖는 면역원을 생성하는 RNA 구조에 대한 첫번째 변화를 설계하였다. 서열은 또한 체내 발현을 개선하기 위하여 개질된 코돈 사용 선택 및 5’말단에서 변경된 RNA 구조를 함유하였다. 따라서, WT1 면역원은 발현을 위하여 최적화되었다. 이러한 개선된 면역원을 위한 발현 카세트를 인코딩하였고 T 세포 및 B 세포 반응을 생성할 수 있는 면역화 잠재력 및 능력을 위하여 동물에서 시험하였던 플라스미드를 생성하였다. 이러한 플라스미드 백신을 개선된 체내 전달을 위하여 전기천공에 의하여 제형화였고, 특정 조건을 체내 전달을 위하여 사용하였다.

이러한 면역원을 인코딩하는 플라스미드 (WT1-pVAX1, WT1-pVAX2, WT1-pVAX3, WT1-pVAX4 및 WT1-pVAX5로 지칭됨)를 본 분야에 의하여 연구된 표준 백신을 제시하는 WT1 백신 (WT1-pCDNA1, WT1-pCDNA2, WT1-pCDNA3, WT1-pCDNA4 및 WT1-pCDNA5로 지칭됨)과 비교하였다.

마우스 연구를 수행하였다. 마우스를 개질된 WT1 백신 (즉, WT1-pVAX1, WT1-pVAX2, WT1-pVAX3, WT1-pVAX4 및 WT1-pVAX5벡터)로 백신접종하였고, 항-WT1 T 및 B 세포 반응은 천연 WT1 (즉, WT1-pCDNA1, WT1-pCDNA2, WT1-pCDNA3, WT1-pCDNA4 및 WT1-pCDNA5)를 포함하는 표준 WT1 백신으로 백신접종한 마우스의 그것보다 더 크게 경험되었다.

동물 (즉, BalB/C 마우스)을 WT-1 플라스미드, 새로운 WT1-pVax 백신 (즉, WT1-pVAX1, WT1-pVAX2, WT1-pVAX3, WT1-pVAX4 및 WT1-pVAX5 벡터), 아니면 원래의 WT-1 플라스미드 백신 (즉, WT1-pCDNA1, WT1-pCDNA2, WT1-pCDNA3, WT1-pCDNA4 및 WT1-pCDNA5)의 상동한 양으로 3x 면역화하였다. T 세포 검정을 위한 결과 (즉, 인터페론-감마 (IFN-γ ELISpot 검정))가 도 1 및 2에 나타난다. 새롭게 설계된 WT-1 백신 (즉, WT1-pVAX1, WT1-pVAX2, WT1-pVAX3, WT1-pVAX4 및 WT1-pVAX5 벡터)이 WT-1 원래의 백신 (즉, WT1-pCDNA1, WT1-pCDNA2, WT1-pCDNA3, WT1-pCDNA4 및 WT1-pCDNA5)에 비하여 T 세포 반응을 생성함에 있어 약 4배 우수함이 명백하였다. 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, 오직 낮은 수준 또는 비-기능적 T 세포 면역성이 표준 백신으로 관찰되었으며, 이는 이전에 달성된 데이터와 일관된 것이었다.

항체 반응을 유도하는 이러한 새로운 DNA 능력이 또한 관찰되었다. 이러한 연구를 WT1-pCDNA 또는 WT1-pVAX 백신으로 면역화된 동물로부터 혈청을 수집함으로써 수행하였다. 혈청변환 또는 WT1-pCDNA 백신을 사용한 항체 반응의 유도는 관찰되지 않았다 (데이터 도시되지 않음). 대조적으로, WT1-pVAX 면역원은 올바른 특이성 및 분자량을 갖는 강한 웨스턴 블랏(western blot) 반응성을 유도하였으며, 이는 WT1 혈청변환 및 강한 항체 반응을 나타냈다 (도 3). 이러한 데이터는 WT1 면역원의 전달 변화 및 개선된 설계를 통하여 이러한 백신 면역원에서 개선을 총괄적으로 강하게 지지하였다.

이러한 데이터는 또한, 종양 세포에서 최적화된 WT1 면역원을 함유하는 이러한 백신이 천연 유전자 서열과 분명하게 반응하면서 상기 면역원의 형태적 속성이 유지되는 것을 보여준다.

면역원 서열은 (1) 아연 핑거를 표적화하고 WT1 활성을 개질하는 돌연변이를 유도하고, 뿐만 아니라 (2) 중요한 아연 핑거 결합 부위로부터 서열을 삭제하는 두가지 수단을 통하여 천연 구조를 파괴하기 위하여 코딩 서열을 개질함으로써 추가로 표적화된다. 이러한 변화는 아래 실시예 2 및 3에서 개괄된다.

실시예 2

공통 WT1

상기 기술된 바와 같이, 최적화된 WT1 면역원 (즉, WT1 유전자는 실시예 1에 기술된 바와 같이 최적화된다)은 점액성 및 세포성 면역 반응을 유도하였다. WT1 면역원 서열을 추가로 표적화 또는 개질하기 위하여, 공통 WT1 면역원을 생성하였다.

특히, 다수의 종으로부터의 WT1 서열을 서로 비교하였다. 아래 표 1에 나타난 바와 같이, WT1는 높은 수준으로 보존되었다. 따라서, 다수의 종으로부터의 WT1 서열을, WT1 공통 서열이 인간 WT1와 약 95% 상동성을 공유하는 WT1 공통 서열을 생성하기 위하여 채용하였다. 수득된 공통 WT1 면역원 (또한 ConWT1로 지칭됨)은 인간 WT1와 약 95.9% 상동성을 공유하였고, 서열 식별 번호: 5에 개시된 아미노산 서열을 갖는다 (도 5).

표 1: 종 간의 WT1 상동성

실시예 3

아연 핑거 개질 및 제거

아래 실시예 2에 기술된 공통 WT1 면역원을 WT1 면역원의 면역원성을 개선하기 위하여 추가로 개질하였다. 특히, 공통 WT1 면역원을 WT1 면역원의 카복시-말단 (C-말단)에 위치한 아연 핑거를 손상시키기 위하여 개질하였다. 이러한 개질은 개질된 아연 핑거 (본원에서 또한 개질된 아연 핑거를 갖는 CON WT1 또는 ConWT1-L로 지칭됨)를 갖는 공통 WT1 면역원을 산출하기 위하여 2개의 아미노-말단 (N-말단) 아연 핑거에서의 아연 이온을 조정하는 잔기(즉, CCHH 모티프)의 치환을 포함하였다 (도 4 및 5). CCHH 모티프의 C 및 H 잔기를 글리신 (G)로 교체하였다. 면역글로불린 E (IgE) 리더 서열을 ConWT1-L 펩티드의 N-말단 상에 위치시켰다. ConWT1-L은 서열 식별 번호: 1에 의하여 인코딩되며, 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열을 갖는다 (도 6a 및 6b 각각).

도 5는 공통 WT1 면역원 (ConWT1) 및 개질된 아연 핑거를 갖는 공통 WT1 면역원(ConWT1-L)의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. 도 5에서의 음영은 ConWT1 및 ConWT1-L 사이에서 달라지는 잔기를 나타낸다. ConWT1-L에 IgE 리더 서열의 부가 외에, ConWT1-L에서의 잔기 312, 317, 330, 334, 342, 347, 360, 및 364는 ConWT1에서의 상응하는 잔기 (즉, 잔기 295, 300, 313, 317, 325, 330, 343, 및 347)와 다르다. 이러한 차이점은 상기 기술된 2개의 N-말단 아연 핑거에서 CCHH 모티프의 개질을 반영하였다.

추가적으로, 공통 WT1 면역원을 개질하여 아연 핑거를 제거하여 아연 핑거가 없는 공통 WT1 면역원을 산출하였다 (본원에서 또한 아연 핑거 또는 CONWT1-S 없는 CON WT1로 지칭됨) (도 4). ConWT1-S는 서열 식별 번호: 3에 의하여 인코딩되며, 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열을 갖는다 (도 7a 및 7b 각각).

실시예 4

ConWT1-L 및 ConWT1-S를 인코딩하는 작제물의 발현 분석

ConWT1-L 및 ConWT1-S를 인코딩하는 핵산 서열을 각각 pVAX1 벡터에 위치시켰다 (Life Technologies, Carlsbad, CA). 수득된 벡터는 각각 WT1-pVAX-L 및 WT1-pVAX-S이라고 명명하였다. pVAX1와 함께, WT1-pVAX-L 및 WT1-pVAX-S를 이러한 벡터로부터 각각 ConWT1-L 및 ConWT1-S의 발현을 확인하기 위하여 세포로 형질감염하였다. pVAX1는 음성 대조군으로서 작용하였다.

형질 감염 후, 세포를 WT1에 특이적인 핵 및 항체를 표시하기 위하여 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 염색하였다. 도 8은 이러한 염색의 결과를 나타낸다. 도 8에서, 좌측 및 중앙 컬럼은 DAPI 및 WT1 염색을 나타내며, 반면 우측 컬럼은 DAPI 및 WT1 염색의 병합을 나타낸다. pVAX1로 형질감염된 세포에서 염색된 WT1 항체가 검출되지 않았다. 이러한 데이터는 ConWT1-L 및 ConWT1-S 둘 다가 각각의 벡터로부터 발현되었다는 것을 나타내었다.

ConWT1-L 및 ConWT1-S의 발현은 형질감염된 세포로부터 유래된 용해물의 면역블롯에 의해 추가로 확인되었다. 구체적으로, 상기 면역블롯은 항-WT1 항체로 탐침되었다. 도 9에서 나타난 바와 같이, ConWT1-L 및 ConWT1-S에 대한 기대된 크기가 검출되었다 (각각WT1-pVAX-L 및 WT1-pVAX-S로 표지된 레인(lane) 참고). pVAX1로 형질감염된 세포에서 수득된 용해물에서 신호가 검출되지 않았다. 따라서, 이러한 데이터는 ConWT1-L 및 ConWT1-S가 형질감염된 세포 내에서 발현되었다는 것을 추가로 나타내었다.

실시예 5

ConWT1-L 및 ConWT1-S를 인코딩하는 작제물에 의하여 유도된 면역 반응

ConWT1-L 및 ConWT1-S을 인코딩하는 작제물이 면역 반응을 유도하였는지 여부를 결정하기 위하여, C57BL/6 마우스를 25 μg WT1-pVAX-L 또는 WT1-pVAX-S 각각으로 면역화하였다. C57BL/6 마우스를 또한 25 μg WT1-pVAX로 면역화하였고, 이는 실시예 1에서 기술된 WT1를 인코딩하는 최적화된 작제물이었고, 또는 25 μg WT1-pCDNA로 면역화하였고, 이는 WT1를 인코딩하는 비-최적화된 작제물이었다. 나이브(

)마우스는 대조군으로 작용하였다.

구체적으로, 면역화 요법은 마우스의 각 그룹을 각 백신의 25 μg로 0 주차, 2 주차, 3 주차, 5 주차로 백신접종하는 것을 포함하였다 (도 10). 0 주차에서 백신접종 전 각 마우스로부터 채혈하였고, 따라서 이러한 채혈은 0주차에서 항체 유도를 위한 대조군으로 작용하였다. 마우스가 희생되었을 때, 5주차에서 제2 채혈이 수행되었다. 비장세포는 또한 희생된 마우스로부터 고립되었고, 아래 기술된 ELISpot 검정에서 T 세포 반응을 관찰하기 위하여 사용되었다.

ConWT1-L 및 ConWT1-S에 대한 세포성 면역 반응 (즉, T 세포 반응)을 ELISpot 검정을 사용하여 관찰하였으며, 이 중 T 세포에 의한 인터페론-감마 (IFN-γ) 생성이 측정되었다. 도 11 및 12에서 나타난 바와 같이, WT1-pVAX 및 WT1-pCDNA 작제물로의 면역화는 나이브 마우스에서 관찰된 바와 같이 유사한 T 세포 반응을 산출하였다. 대조적으로, ConWT1-L 및 ConWT-S을 각각 발현하는 WT1-pVAX-L 및 WT1-pVAX-S 작제물은, 최적화 및 비-최적화 작제물 (즉, WT1-pVAX 및 WT1-pCDNA 각각)과 비교하여 뚜렷하게 높은 T 세포 반응을 산출하였다. 도 11 및 12에서, 에러 바는 평균 (SEM)의 표준 에러를 반영하였다.

특히, ConWT1-L 및 ConWT-S 항원은 최적화 및 비-최적화 작제물에 의하여 유도된 T 세포 반응보다 약 400배 더 높았던 T 세포 반응을 유도하였다. 따라서, 이러한 데이터는 WT1에서의 아연 핑거의 개질 및 제거는 WT1 면역원의 면역원성을 뚜렷하게 증가시켰으며, 이로써 WT1 면역원를 향한 뚜렷한 T 세포 반응을 제공한다는 것을 나타내었다.

ConWT1-L 및 ConWT-S 항원에 대한 체액성 면역 반응은 5주차 채혈로부터의 혈청에서 항원에 대해 특이적인 항체가 함유되었는지 여부를 결정함에 의하여 측정되었다. 특히, 293T 세포를 WT1-pVAX-L 및 WT1-pVAX-S 벡터로 형질감염하였다. 형질 감염 후, WT1-pVAX-L 또는 WT-pVAX-S로 형질감염된 세포를 WT1-pVAX-L 또는 WT-pVAX-S로 면역화된 마우스의 5주차 채혈로부터의 핵 및 혈청을 표시하기 위하여 DAPI로 염색하였다. 도 13에서 나타난 바와 같이, WT1-pVAX-L 또는 WT-pVAX-S로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 형질감염된 세포에서 ConWT1-L 또는 ConWT1-S 항원을 각각 검출하였다. 따라서, 이러한 데이터는 ConWT1-L 또는 ConWT1-S 항원을 발현하는 작제물로의 면역화가 ConWT1-L 또는 ConWT1-S 항원으로 면역 활성된 항체의 생성을 초래한다는 것을 나타내었다.

ConWT1-L 또는 ConWT1-S을 발현하는 작제물에 의한 체액성 면역 반응의 도입은 면역블롯에 의하여 추가로 관찰되었다. 특히, 용해물은 상기 형질감염된 세포로부터 수득되었으며, WT1-pVAX-L 또는 WT1-pVAX-S로 면역화된 마우스로부터의 혈청으로 탐침되었다. 도 14는 대표적인 면역블롯을 나타내며, 이 중 비형질감염된 293T 세포로부터 수득된 용해물은 배경을 위한 대조군으로 작용하였다. 도 14에서의 면역블롯은 또한 항-액틴 항체로 탐침되었고, 이는 용해물의 등가 분량이 3개 레인 사이에서 로딩되었다는 것을 입증하였다. 이러한 데이터는 면역화된 마우스로부터의 혈청이 ConWT1-L 및 ConWT1-S 항원으로 면역 활성된 항체를 함유하며, 추가로 상기 기술된 염색 결과를 확인한다는 것을 나타내었다.

요약하자면, ConWT1-L 또는 ConWT1-S 항원을 발현하는 작제물은 IFN-γ 및 ConWT1-L 또는 ConWT1-S 항원으로 면역 활성된 항체를 생성하였던 뚜렷한 T 세포 반응을 유도하였다.

상기 상세한 설명 및 동반 실시예는 단지 예시적인 것이며, 오로지 첨부된 특허청구범위 및 그의 균등부에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 됨이 이해된다.

개시된 구현예에 대한 다양한 변화 및 개질은 당분야 숙련가에게 자명할 것이다. 비제한적으로 본 발명의 화학적 구조, 치환체, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 제형 또는 이용 방법에 관한 것들을 포함하는 이러한 변화 및 개질이 발명의 요지 및 범위에서 벗어나지 않고 수행될 수 있다.

<110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA WEINER, David YAN, Jian WALTERS, Jewell <120> WT1 VACCINE <130> UPVG0046 <150> US 61/737,094 <151> 2012-12-13 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Con WT1-L with modified Zinc Fingers nucleic acid sequence <400> 1 ggatccgcca ccatggactg gacctggatt ctgttcctgg tcgccgccgc aacacgggtg 60 catagtggga gtgatgtgag agacctgaac gccctgctgc cagcagtgcc atccctgcct 120 ggcgggggag gctgcgctct gccagtctct ggagcagctc agtgggctcc cgtgctggac 180 tttgcacccc ctgcagcccc ttacggaagt ctgggcggcc cacactcatt catcaaacag 240 gagccaagct ggggcggggc agatcctcat gaggaacagt gcctgtcagc cttcacagtc 300 cactttagcg ggcagttcac tggaaccgca ggagcttgta gatacggacc ctttggagca 360 ccaccccctt cccaggcacc ttctggacag gcacgcatgt tcccaaacgc tccctatctg 420 cctaattgtc tggaaagcca gcccgctatt aggaaccagg gctactccac agtggcattt 480 gacgggactc ctagctatgg acatacccca tcccaccatg ctgcacagtt tcctaatcac 540 tccttcaagc atgaggaccc catgggacag caggggtccc tgggagaaca gcagtactct 600 gtgccccctc ccgtgtacgg atgccacaca ccaactgaca gttgtacagg ctcacaggcc 660 ctgctgctgc gaactccata caacagtgat aatctgtatc agatgacctc acagctggag 720 tgcatgacat ggaaccagat gaatctgggc agcacactga aaggccatgc cactgggtac 780 gaatctgaca accacaccac acctatgctg tacagttgtg gagcccagta tagaatccac 840 actcatggag tcttcagagg cattcaggat gtgcggagag tcccaggagt ggcaccaact 900 atcgtgcgga gcgcctccga gaccaacgaa aagcgcccct ttatgggcgc ctaccctgga 960 ggcaataagc ggtatttcaa actgtctcac ctgcagatgg ggagtagaaa ggggaccgga 1020 gagaaacctt atcagggcga ctttaaagat ggggaaaggc gcttctctcg cagtgaccag 1080 ctgaagcgag gacagcgacg aggaaccggg gtgaagccat ttcagtgcaa aacatgtcag 1140 agaaagttct caaggagcga tcacctgaag acccatacaa gaactcacac cggcaagacc 1200 agcgagaaac cattttcctg ccgatggccc tcttgtcaga agaaattcgc ccgctccgac 1260 gaactggtcc gacaccacaa tatgcatcag agaaatatga caaaactgca gctggctctg 1320 tgataactcg ag 1332 <210> 2 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Con WTl-L with modified Zinc Fingers protein sequence <400> 2 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val 20 25 30 Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala 35 40 45 Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Ala Ala Pro Tyr 50 55 60 Gly Ser Leu Gly Gly Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp 65 70 75 80 Gly Gly Ala Asp Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val 85 90 95 His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly 100 105 110 Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gln Ala Pro Ser Gly Gln Ala Arg 115 120 125 Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Asn Cys Leu Glu Ser Gln Pro 130 135 140 Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Ala Phe Asp Gly Thr Pro 145 150 155 160 Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His 165 170 175 Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu 180 185 190 Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr 195 200 205 Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Asn 210 215 220 Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp 225 230 235 240 Asn Gln Met Asn Leu Gly Ser Thr Leu Lys Gly His Ala Thr Gly Tyr 245 250 255 Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Met Leu Tyr Ser Cys Gly Ala Gln 260 265 270 Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg 275 280 285 Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Ile Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr 290 295 300 Asn Glu Lys Arg Pro Phe Met Gly Ala Tyr Pro Gly Gly Asn Lys Arg 305 310 315 320 Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met Gly Ser Arg Lys Gly Thr Gly 325 330 335 Glu Lys Pro Tyr Gln Gly Asp Phe Lys Asp Gly Glu Arg Arg Phe Ser 340 345 350 Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg Gly Gln Arg Arg Gly Thr Gly Val Lys 355 360 365 Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His 370 375 380 Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro 385 390 395 400 Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp 405 410 415 Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu 420 425 430 Gln Leu Ala Leu 435 <210> 3 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Con WTl-S without Zinc fingers nucleic acid sequence <400> 3 ggatccgcca ccatggactg gacctggatt ctgtttctgg tggctgctgc tacacgggtg 60 cattctggga gcgatgtgag agacctgaac gccctgctgc cagctgtgcc aagtctgcct 120 ggcgggggag gctgcgcact gccagtgagc ggagcagctc agtgggctcc cgtcctggac 180 tttgcacccc ctgcagcacc ttacggctca ctgggcggcc cacacagctt catcaagcag 240 gagccatctt ggggcggggc cgatcctcac gaggaacagt gcctgagtgc tttcacagtg 300 catttttcag gccagttcac tggaaccgca ggagcttgtc gatacggacc ctttggagcc 360 ccacccccta gccaggcacc ttccggacag gccagaatgt tcccaaacgc tccctatctg 420 cctaattgtc tggaatcaca gcctgcaatt cggaaccagg gctacagcac cgtcgccttt 480 gacgggacac catcctatgg acacactccc tctcaccatg ctgcacagtt tcctaatcac 540 agcttcaagc atgaggaccc catgggacag caggggagcc tgggagaaca gcagtactcc 600 gtgccacccc ctgtctatgg ctgccataca ccaactgact cttgtacagg gagtcaggcc 660 ctgctgctgc gaactccata caactctgat aatctgtatc agatgactag tcagctggag 720 tgcatgacct ggaaccagat gaatctgggg tccaccctga aaggccacgc cacagggtat 780 gaatccgaca accataccac acccatgctg tactcttgtg gcgcccagta tagaatccac 840 acccatggag tgttccgcgg cattcaggat gtgcggagag tcccaggagt cgctcccacc 900 atcgtgagat ccgccagtga gaccaatgaa aagagaccct tctgataact cgag 954 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Con WTl-S without Zinc fingers protein sequence <400> 4 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val 20 25 30 Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala 35 40 45 Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Ala Ala Pro Tyr 50 55 60 Gly Ser Leu Gly Gly Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp 65 70 75 80 Gly Gly Ala Asp Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val 85 90 95 His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly 100 105 110 Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gln Ala Pro Ser Gly Gln Ala Arg 115 120 125 Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Asn Cys Leu Glu Ser Gln Pro 130 135 140 Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Ala Phe Asp Gly Thr Pro 145 150 155 160 Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His 165 170 175 Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu 180 185 190 Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr 195 200 205 Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Asn 210 215 220 Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp 225 230 235 240 Asn Gln Met Asn Leu Gly Ser Thr Leu Lys Gly His Ala Thr Gly Tyr 245 250 255 Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Met Leu Tyr Ser Cys Gly Ala Gln 260 265 270 Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg 275 280 285 Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Ile Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr 290 295 300 Asn Glu Lys Arg Pro Phe 305 310 <210> 5 <211> 419 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Con WTl protein sequence <400> 5 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Ala Ala Pro Tyr Gly 35 40 45 Ser Leu Gly Gly Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly 50 55 60 Gly Ala Asp Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His 65 70 75 80 Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro 85 90 95 Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gln Ala Pro Ser Gly Gln Ala Arg Met 100 105 110 Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Asn Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala 115 120 125 Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Ala Phe Asp Gly Thr Pro Ser 130 135 140 Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser 145 150 155 160 Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln 165 170 175 Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp 180 185 190 Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Asn Ser 195 200 205 Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn 210 215 220 Gln Met Asn Leu Gly Ser Thr Leu Lys Gly His Ala Thr Gly Tyr Glu 225 230 235 240 Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Met Leu Tyr Ser Cys Gly Ala Gln Tyr 245 250 255 Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg 260 265 270 Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Ile Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Asn 275 280 285 Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr 290 295 300 Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu 305 310 315 320 Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg 325 330 335 Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro 340 345 350 Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 355 360 365 Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe 370 375 380 Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu 385 390 395 400 Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln 405 410 415 Leu Ala Leu

Claims (15)

1. 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2를 인코딩하는 핵산 서열,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 면역원성 단편을 인코딩하는 핵산 서열,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2와 적어도 98% 상동한 면역원성 단백질을 인코딩하는 핵산 서열,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4를 인코딩하는 핵산 서열,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 면역원성 단편을 인코딩하는 핵산 서열, 및
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4와 적어도 98% 상동한 면역원성 단백질을 인코딩하는 핵산 서열
   로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열; 또는,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 1,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 1의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는면역원성 단편,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 1과 적어도 98% 상동한 핵산 서열,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 1과 적어도 98% 상동한 핵산 서열의 면역원성 단편으로서, 상기 단편은 상기 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 1과 적어도 98% 상동한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 것인, 면역원성 단편,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 3,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 3의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는면역원성 단편,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 3과 적어도 98% 상동한 핵산 서열, 및
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 3과 적어도 98% 상동한 핵산 서열의 면역원성 단편으로서, 상기 단편은 상기 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 3과 적어도 98% 상동한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 것인, 면역원성 단편
   으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열
   을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 1 의 핵산 서열 또는 상기 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 3의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 분자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 포함되는, 핵산 분자.
4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 개시된 하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
5. 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 면역원성 단편,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2와 적어도 98% 상동한 면역원성 아미노산 서열,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2와 적어도 98% 상동한 단백질의 면역원성 단편으로서, 상기 단편은 상기 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 것인, 면역원성 단편,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 면역원성 단편,
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4와 적어도 98% 상동한 면역원성 아미노산 서열, 및
   리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4와 적어도 98% 상동한 단백질의 면역원성 단편으로서, 상기 단편은 상기 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 것인, 면역원성 단편
   으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열 또는 상기 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
7. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 개시된 하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 포함하는, 백신.
8. 청구항 7에 있어서,
   상기 백신은 하기 핵산 분자를 포함하는 것이고:
   (a) 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 1의 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%의 상동성을 갖는 면역원성 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자; 또는,
   (b) 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 3의 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%의 상동성을 갖는 면역원성 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자;
   상기 백신은 추가로,
   (c) 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 펩티드; 또는,
   (d) 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 펩티드
   를 포함하는 것인, 백신.
9. 청구항 7에 있어서,
   상기 백신은 하기를 포함하는 것이고:
   (a) 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2에 의해 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자; 또는,
   (d) 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자;
   상기 백신은 추가로,
   (c) 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 펩티드; 또는,
   (d) 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 펩티드
   를 포함하는 것인, 백신.
10. 청구항 7에 있어서, 리더 서열이 없는 서열 식별 번호:1 또는 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 3에 의하여 인코딩되는 항원을 포함하는, 백신.
11. 청구항 10 있어서, 상기 항원은 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열 또는 리더 서열이 없는 서열 식별 번호:4에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 백신.
12. 청구항 7에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 및 보조제 중 하나 이상을 추가 포함하는 것인, 백신.
13. 펩티드를 포함하는 백신으로서,
    (a) 상기 펩티드는 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%의 상동성을 갖는 면역원성 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (b) 상기 펩티드는 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%의 상동성을 갖는 면역원성 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    백신.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 펩티드는 리더 서열이 없는 서열 식별 번호: 2에 개시된 아미노산 서열 또는 리더 서열이 없는 식별 번호: 4에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 백신.
15. 청구항 7, 청구항 13 및 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, WT1(Wilm’s tumor)-발현 종양을 갖는 개체를 치료하거나 WT1-발현 종양을 예방하기 위한, 백신.
    
    
    
    

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