CN108646032A - Top2a自身抗体作为肺癌诊断标志物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TOP2A自身抗体作为肺癌诊断标志物的用途,还公开了一种TOP2A自身抗体作为肺癌诊断标志物的筛选和鉴定方法。本发明提供一种操作简单、成本低、准确性高、无创伤的应用于临床的肺癌诊断的血清生物标志物。本发明研究发现应用ELISA方法进行血清TOP2A自身抗体的检测,可以较准确地将肺癌患者和正常人,以及肺病慢性疾病患者鉴别开来,并可以用于肺癌的早期诊断。在此背景下提供此方便、快捷、有效的检测肺癌患者,可用于临床的肺癌早期诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,涉及TOP2A自身抗体作为肺癌诊断标志物的用途,用于肺癌早期诊断。
背景技术
肺癌是中国,以及全球发病率及死亡率第一的恶性肿瘤。肺癌的临床表现复杂多样,且早期肺癌表现隐匿且多样化,临床特征及体征不明显,仅表现为咳嗽、咯痰、胸痛、发热、体力下降等非特异性症状,未进行及时的治疗。因此,大部分肺癌患者发现时已经处于晚期。有临床数据显示,有近60%的患者就诊时已经处于肺癌晚期。肺癌晚期的5年生存率仅为16%左右,而肺癌早期(Ⅰ期)的五年生存率可以高达70%。可见肺癌的早期发现、早期诊断是降低肺癌发病率和死亡率的关键环节。
目前临床上有多种用于肺癌的检测手段,主要包括无创检查(CT,X线胸片等)和一些有创检查(纤维支气管镜、脱落细胞学检查、经CT定位穿刺活检等)。X线胸片方便、快速、无创等优势,对肺癌诊断有重要意义。美国国家肺癌筛查试验的随机对照研究结果显示,通过采用LDCT对肺癌高危人群进行筛查,可使肺癌病死率下降20%,提高12%早期肺癌的检出率。国际早期肺癌行动计划I期肺癌的检出率达85%,预期10年生存率可以达到88%。虽然LDCT在一些地区进行的筛查研究取得了一定的研究进展,但有一定的不足之处。首先,LDCT能在25%的高危人群中发现结节,经过进一步的检查和追踪,其中只有4%最终被诊断为肺癌。另一方面,所有的肺癌患者中只有30%符合LDCT的高危人群筛查标准,说明大部分肺癌患者也无法通过LDCT筛查被发现。近年来,血清生物学标志物由于开发创伤性小,操作简单,筛查范围广,检测效率高等优点而受到关注。目前临床上用的血清生物学标志物有糖链抗原(CA125、CA199),细胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1),癌胚抗原(CEA)等,但是尚未发现一种灵敏度及特异度均很高的肿瘤标志物,因此单项检测对肺癌有一定的局限性。
肿瘤的发生可归结为一系列肿瘤相关基因结构或者功能的异常,肿瘤抗原(tumor-associated antigens,TAAs)就是这些异常基因所表达的一些在质或者量上异常的蛋白质或者多肽,其产生的抗体称为抗TAA自身抗体。由于肿瘤抗原主要分布在肿瘤细胞内、膜表面或者血清中,不同程度地激活机体特异性或非特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。抗TAAs自身抗体在正常人和非肿瘤患者血清中不存在或滴度很低,患者血清中自身抗体水平的升高往往早于肿瘤症状的出现,并且它能够在血清中持续稳定存在,而其它的标志物,包括TAA本身,在其被肿瘤细胞释放后被快速降解或者在其进入血液循环后的很短时间内就能够被机体清除。因此检测抗-TAAs的自身抗体可以作为早期肿瘤诊断的血清标志物。
目前筛选生物学标志物的技术主要有重组cDNA表达文库血清学分析(Serological analysis of expression cDNA libraries,简称SEREX)、噬菌体展示技术、蛋白质微阵列、血清蛋白质组学技术(Serological proteome analysis,简称SERPA)等。SEREX方法是目前国际上普遍使用的一种发现和鉴定肿瘤相关抗原的血清学技术。本实验室前期采用SEREX技术,用5例肺癌患者首先进行异体血清的预吸收,对所构建的cDNA文库进行免疫筛选,阳性克隆做DNA测序,结果在NCBI网站上用BLAST软件搜索Genbank,使用Blastn和Blastp进行同源比对分析,从而判断该基因序列是已知还是未知。结果显示70个阳性克隆过代表63个不同的基因其中有35个已知的基因,与细胞的分化、代谢及信号转导有关系,还有26个功能未知的基因。
Oncomine数据库(http://www.oncomine.org)是一个基于基因芯片的数据库和整合数据挖掘平台,提供肿瘤转录组数据。Oncomine可以分析某个靶基因在肿瘤组织及正常组织的差异表达,并且可以获得基因与肿瘤大小、转移、生存时间等一些重要的临床信息。本研究将TOP2A基因结合Oncomine数据库进行深度的挖掘,并对TOP2A是否可以作为诊断肺癌特异性指标进行了大样本量的血清学验证。
综上所述,为了最终实现降低肺癌的死亡率,提高生存率,本领域迫切需要筛选和鉴定更加敏感、特异血清学自身抗体标志物,并开发操作简单、成本低、适用范围广泛的检测肺癌自身抗体的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服肺癌现有肿瘤标志物不理想的问题,提供TOP2A的新用途,提高肺癌早期诊断的灵敏度、特异度和准确性。利用一种特异性高、敏感度强的诊断标志物,制备稳定性好、检测方便的用于肺癌早期诊断的试剂。本发明具体提供一种肺癌血清诊断标志物,具体设计一种能区分肺癌和正常人的抗肿瘤相关抗原TOP2A(Topoisomerase(DNA)II Alpha)自身抗体。
其具体技术方案为:
TOP2A自身抗体作为肺癌诊断标志物在制备肺癌诊断试剂或试剂盒中的用途。
TOP2A自身抗体作为一种肺癌检测的新型血清学免疫标志物在制备肺癌诊断试剂或试剂盒中的用途。
TOP2A自身抗体在制备鉴别肺癌与正常人和肺部良性疾病的诊断试剂或试剂盒中的用途。
一种肺癌肿瘤标志物诊断试剂,包括TOP2A蛋白。
一种肺癌肿瘤标志物诊断试剂盒,包括TOP2A蛋白。
一种TOP2A自身抗体作为肺癌诊断标志物的筛选和鉴定方法,采用前期重组cDNA表达文库血清学分析技术(SEREX)筛选可能与肺癌相关的抗原,利用Oncomine数据库的三个独立队列研究进行进一步的挖掘,应用ELISA方法检测肺癌患者血清中TOP2A抗体水平。包括以下步骤:
1)对前期SEREX方法筛选出的可能与肺癌相关的抗原TOP2A,利用Oncomine数据库的三个独立队列研究(包括375例非小细胞肺癌和134例正常组织)进行进一步的挖掘,分析TOP2A在肺癌和正常组织中mRNA的表达。
2)为了验证TOP2A自身抗体能否作为肺癌诊断标志物,应用ELISA检测方法,对184例肺癌患者血清以及184例正常人血清进行TOP2A自身抗体水平的检测,其步骤包括:用抗原稀释液将购买的TOP2A蛋白稀释至1ug/ml,包被96孔板,血清样本1:100稀释,与抗原作用后,与辣根过氧化物酶标记的重组蛋白A(HRP-rec-Protein A)抗体反应,最终加入ABTS底物液进行显色,在酶标仪(405nm吸光度)下读取OD值,以反应血清中TOP2A自身抗体的水平。结果显示,TOP2A自身抗体在肺癌患者血清中的表达水平高于正常人血清,具有统计学意义(P<0.001)。为了进一步验证TOP2A是否可以用于肺癌的筛查指标,在446例肺癌、446例正常对照和119例肺部良性疾病中进行ELISA检测。结果显示TOP2A在肺癌患者血清中表达水平大于正常对照组和肺部良性疾病组,肺部良性疾病血清中的表达水平大于正常对照组(P<0.001,)
3)为检测TOP2A自身抗体对于肺癌患者的鉴别能力,通过对肺癌组与正常对照组,肺癌组与肺部良性疾病组以及肺癌组与正常对照组+肺部良性疾病组进行ROC曲线分析,结果显示,肺癌组与正常对照组的曲线下面积为0.668(95%CI:0.636-0.699),肺癌组与肺部良性疾病组的曲线下面积为0.402(95%CI:0.359-0.446),肺癌组与正常对照组+肺部良性疾病组的曲线下面积为0.612(95%CI:0.582-0.643)。TOP2A虽然不能区分肺癌和良性疾病但是可以将肺癌与非肺癌对照区分。
4)为进一步了解TOP2A自身抗体在肺癌早期诊断中的应用价值,对TOP2A在22例早期(Ⅰ/Ⅱ)和138例晚期(Ⅲ/Ⅳ)肺癌患者血清中进行阳性率分析,结果显示TOP2A在早期肺癌中的阳性率为36.4%,在晚期肺癌中的阳性率为16.7%,在早期肺癌中的阳性率明显高于晚期肺癌(P<0.05)。与446例正常对照组进行ROC分析,结果显示早期肺癌与正常对照组的AUC值0.705(95%CI:0.661-0.746),晚期肺癌与正常对照组的AUC值0.627(95%CI:0.587-0.666)
5)TOP2A与传统肿瘤标志物结合是否可以提高肺癌早期的检出率,117例CA125(Ⅰ/Ⅱ期20例,Ⅲ/Ⅳ期97例),132例CEA(Ⅰ/Ⅱ期21例,Ⅲ/Ⅳ期111例),115例CYFRA21-1(Ⅰ/Ⅱ期17例,Ⅲ/Ⅳ期98例)。CA125、CEA和CYFRA21-1在早期肺癌中的阳性率分别为20%、28.6%和23.5%。当TOP2A与CA125、CEA和CYFRA21-1分别结合时可明显提高早期的检出率。TOP2A与CA125,TOP2A与CEA,TOP2A与CYFRA21-1联合检测在早期肺癌中的阳性率分别为55%,61.9%和58.8%,其中TOP2A与CEA联合检测的阳性率最高。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明提供一种操作简单、成本低、准确性高、无创伤的应用于临床的肺癌诊断的血清生物标志物。本发明研究发现应用ELISA方法进行血清TOP2A自身抗体的检测,可以较准确地将肺癌患者和正常人,以及肺病慢性疾病患者鉴别开来,并可以用于肺癌的早期诊断。在此背景下提供此方便、快捷、有效的检测肺癌患者,可用于临床的肺癌早期诊断。
附图说明
图1为筛选和鉴定肺癌TOP2A自身抗体的技术路线;
图2为测试组中TOP2A在肺癌组和正常对照组中自身抗体的分布及ROC曲线分析,其中,图2A为自身抗体的分布,图2B为ROC曲线分析;
图3为验证组中TOP2A在肺癌组、正常对照组和肺部良性疾病组中自身抗体水平的分布;
图4为ROC曲线分析验证组中TOP2A自身抗体对肺癌的诊断效能,其中图4A为肺癌组与正常对照组,图4B为肺癌组与肺部良性疾病组,图4C为肺癌组与正常对照组+肺部良性疾病组;
图5为ROC曲线分析验证组中TOP2A自身抗体在早晚期肺癌中的诊断效能,其中,图5A为正常对照组与早期肺癌组,图5B为正常对照组与晚期肺癌组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明采用前期重组cDNA表达文库血清学分析技术(SEREX)筛选可能与肺癌相关的抗原,利用Oncomine数据库的三个独立队列研究进行进一步的挖掘,应用ELISA方法检测肺癌患者血清中TOP2A抗体水平(见图1)。
1)对前期SEREX方法筛选出的可能与肺癌相关的抗原TOP2A,利用Oncomine数据库的三个独立队列研究(包括375例非小细胞肺癌和134例正常组织)进行进一步的挖掘,分析TOP2A在肺癌和正常组织中mRNA的表达。
2)为了验证TOP2A自身抗体能否作为肺癌诊断标志物,应用ELISA检测方法,对184例肺癌患者血清以及184例正常人血清进行TOP2A自身抗体水平的检测,其步骤包括:用抗原稀释液将购买的TOP2A蛋白稀释至1ug/ml,包被96孔板,血清样本1:100稀释,与抗原作用后,与辣根过氧化物酶标记的重组蛋白A(HRP-rec-Protein A)抗体反应,最终加入ABTS底物液进行显色,在酶标仪(405nm吸光度)下读取OD值,以反应血清中TOP2A自身抗体的水平。结果显示,TOP2A自身抗体在肺癌患者血清中的表达水平高于正常人血清,具有统计学意义(P<0.001,如图2所示)。为了进一步验证TOP2A是否可以用于肺癌的筛查指标,在446例肺癌、446例正常对照和119例肺部良性疾病中进行ELISA检测。结果显示TOP2A在肺癌患者血清中表达水平大于正常对照组和肺部良性疾病组,肺部良性疾病血清中的表达水平大于正常对照组(P<0.001,如图3所示)
3)为检测TOP2A自身抗体对于肺癌患者的鉴别能力,本发明通过对肺癌组与正常对照组,肺癌组与肺部良性疾病组以及肺癌组与正常对照组+肺部良性疾病组进行ROC曲线分析,结果显示,肺癌组与正常对照组的曲线下面积为0.668(95%CI:0.636-0.699),肺癌组与肺部良性疾病组的曲线下面积为0.402(95%CI:0.359-0.446),肺癌组与正常对照组+肺部良性疾病组的曲线下面积为0.612(95%CI:0.582-0.643)(如图4所示)。TOP2A虽然不能区分肺癌和良性疾病但是可以将肺癌与非肺癌对照区分。
4)为进一步了解TOP2A自身抗体在肺癌早期诊断中的应用价值,本发明对TOP2A在22例早期(Ⅰ/Ⅱ)和138例晚期(Ⅲ/Ⅳ)肺癌患者血清中进行阳性率分析,结果显示TOP2A在早期肺癌中的阳性率为36.4%,在晚期肺癌中的阳性率为16.7%,在早期肺癌中的阳性率明显高于晚期肺癌(P<0.05)。与446例正常对照组进行ROC分析,结果显示早期肺癌与正常对照组的AUC值0.705(95%CI:0.661-0.746),晚期肺癌与正常对照组的AUC值0.627(95%CI:0.587-0.666)(如图5所示)。
5)TOP2A与传统肿瘤标志物结合是否可以提高肺癌早期的检出率,117例CA125(Ⅰ/Ⅱ期20例,Ⅲ/Ⅳ期97例),132例CEA(Ⅰ/Ⅱ期21例,Ⅲ/Ⅳ期111例),115例CYFRA21-1(Ⅰ/Ⅱ期17例,Ⅲ/Ⅳ期98例)。CA125、CEA和CYFRA21-1在早期肺癌中的阳性率分别为20%、28.6%和23.5%。当TOP2A与CA125、CEA和CYFRA21-1分别结合时可明显提高早期的检出率。TOP2A与CA125,TOP2A与CEA,TOP2A与CYFRA21-1联合检测在早期肺癌中的阳性率分别为55%,61.9%和58.8%,其中TOP2A与CEA联合检测的阳性率最高。
结果表明,本发明提供的TOP2A自身抗体可作为早期肺癌的诊断标志物。具体研究过程如下:
1、血清标本收集
本研究共纳入研究对象1379例,分为测试组和验证组,测试组用于筛选对肺癌诊断价值较高的指标,验证组对这几个指标进行大批量血清学验证。测试组纳入的184例肺癌患者血清来自于2016-2017郑州大学第一附属医院的肺癌患者。验证组纳入的446例肺癌患者血清来自于2013年-2014年就诊于郑州大学第一附属医院的肺癌患者。所有病例均经过组织病理学确诊,未经过任何手术和放化疗。测试组184例正常对照与验证组446例正常对照均来自于郑州大学第一附属医院健康体检者,按照年龄性别与病例进行匹配,并且均未患肿瘤相关疾病和呼吸系统疾病。119例良性肺部疾病血清来自于2016-2017郑州大学第一附属医院,包括慢性阻塞性肺气肿患者和慢性肺炎患者。所有研究对象均排除自身免疫性疾病及急慢性感染等影响蛋白表达的疾病。
所有研究对象采血5ml,静止30min后,3000rpm5分钟离心后取上清液至Eppendorf管中留样,分别给予编号后纳入标本库,短期使用分装后保存于-20℃冰箱,长期保存的分装后冻存于-80℃冰箱备用,避免反复冻融。
2、重组cDNA表达文库的血清学分析法(SEREX)筛选鉴定候选TAAs
SEREX建库所用的载体为表达型载体,探针为抗体,筛选的方式是将硝酸纤维素滤膜加在培养皿上,经处理后,所有细胞释放的蛋白质均结合于膜上,将膜置于抗血清或IgG中培养,抗体则只结合在其特异性抗原上(即所筛选cDNA克隆处),再用抗此种IgG标记的抗体示踪。王鹏等人使用SEREX方法以肺癌患者血清筛选肺癌组织cDNA表达文库,鉴定出35个肺癌表达的肿瘤抗原,其中包括TOP2A。
3、Oncomine数据库对TOP2A进行mRNA表达分析
由于SEREX技术是利用个别肺癌血清筛选得到肺癌TAAs,结果不具有普遍性,因此,需要更加高通量的方法对TOP2A进行进一步分析。利用Oncomine数据库对SEREX方法筛选出来的TOP2A进一步分析mRNA的表达水平。Oncomine(www.oncomine.org)数据库收集分析肿瘤样本的基因表达谱芯片数据,同时提供转录组数据。目前,Oncomine包括65个基因表达数据集,通过4700多个微阵列实验包含了了48,000,000基因表达结果,主要是对大多数癌症类型和相应的正常组织及各种癌症亚型进行的差异表达分析。可用于分析多个研究的差异表达分析,给出比较全面的结论。在本研究中,选择3个不同的数据集Hou LungDataset(45例肺癌组织和65例正常组织),Okayama Lung Dataset(226例肺癌组织和20例正常组织),Landi Lung Dataset(58例肺癌组织和49例正常组织)。比较TOP2A在非小细胞肺癌与正常组织的差异表达。在Oncomine数据库中设定检索条件1、Gene:TOP2A;2、Analysis Type:Cancer vs.Normal Analysis;3、Cancer Type:Non-small Cell LungCancer;4、Sample Type:Clinical Specimen;5、Data Type:mRNA。临界值设定条件为校正后P-value(0.05/基因数):Hou Lung Dataset≤2.55E-6,O;kayama Lung≤2.55E-6;LandiLung≤3.96E-6,差异倍数(FC≥2)。研究结果显示TOP2A在三个研究中均显示高表达,结果分别是P=1.13E-19,FC=11.812;P=4.04E-15FC=5.489;P=1.27E-25FC=5.492。
4.ELISA法检测TOP2A自身抗体的血清表达水平
4.1所需试剂
通用抗体稀释液、包被缓冲液(20x)、封闭缓冲液、ABTS-显色试剂盒均购于上海生工生物工程有限公司。
通用抗体稀释液:成分为BSA(牛血清白蛋白)和PBS缓冲液。
包被缓冲液(20x):成分为碳酸盐缓冲液,使用时用去离子水按1:20稀释。
10×ELISA PBST洗液(1L):称取NaCl 81.8g,Na2HPO4·12H2O 28.8g,NaH2PO4·2H2O 3.1g,Tween20 5ml,硫柳汞钠0.1g,Proclin300 200μl,加去离子水至1L。
1×ELISA PBST洗液(1L):取10×ELISA PBST洗液100ml,加去离子水至1L。
4.2TOP2A自身抗体检测方法
1)包被抗原蛋白:从生物公司购买的纯化TOP2A蛋白,用抗原蛋白包被液稀释至1ug/ml终浓度,包被于96孔板,加样50μl/孔,保鲜膜封闭防止挥发,置于4℃冰箱包被过夜。
2)封闭:弃去孔中包被液,于96孔酶标板中每孔加入100μl的含有2%BSA的封闭液,置于37℃恒温水浴锅封闭2小时,充分甩出封闭液。将酶标板置于自动洗板机中,按照所设定的程序(200μl洗涤缓冲液/孔,20秒/次,重复3次)洗涤,拍干。
3)一抗血清孵育:使用含有1%BSA的PBST血清稀释液对待测血清进行稀释,稀释的比例为1:100。于封闭后的96孔酶标板分别加入50μl稀释后的待测血清以及稀释后的阴阳对照血清,空白对照孔只加入血清稀释液,置于37℃水浴锅孵育1小时。充分甩出孔中液体,置于洗板机中进行洗涤,洗涤结束后拍干。
4)二抗孵育:将辣根过氧化物酶标记的重组蛋白A(HRP-rec-Protein A)作为二抗,使用含有1%BSA按照1:3000比例稀释充分混匀后,分别加入96孔酶标板每孔50μl,置于37℃水浴锅孵育1小时,后弃去孔中液体,PBST洗液洗板3次,拍干。
5)显色:分别向每孔加入50μl混合反应液,置于37℃水浴锅避光显色30min绿色产物出现。
6)终止反应:终止液每孔25ul,然后使用酶标仪测定其吸光度值OD405nm处,以空白对照孔调零后测各孔OD值。
5.统计分析方法
本发明使用Mann-Whitney U检验用于分析测试组两组间自身抗体含量水平的差异。采用非参数检验(Kruskal-wallis)比较验证组中三组自身抗体含量水平的差异。以正常对照组特异度高于90%时,灵敏度最高作为截断值,高于此值判定为阳性,低于此值判定为阴性。采用两个或者多个独立样本卡方检验对不同年龄组、肿瘤分期、有无转移、病理分型、肿瘤家族史等进行单个自身抗体阳性率比较。使用MedCalc12.0软件进行ROC曲线分析,根据曲线下面积(AUC)判断抗体对肺癌的鉴别能力。肿瘤标志物的参考范围分别为CEA(0-3.0ng/mL)、CA125(0.1-35U/mL)、CFY21-1(0-3.3ng/mL)。超过正常值上限判断为阳性。所有统计分析使用SPSS20.0软件进行,P<0.05为统计判断标准。
6.临床上检测TOP2A自身抗体在肺癌诊断中的应用
1)TOP2A自身抗体在肺癌中的诊断价值:
本发明用ELISA检测方法对测试组中184例肺癌患者血清和184例正常人血清进行TOP2A自身抗体水平的检测,结果显示,肺癌组TOP2A自身抗体水平显著高于正常对照组(P<0.001,如图2A所示)。通过对自身抗体阳性率的比较,肺癌组阳性率(28.8%)明显高于正常对照组(9.8%),两组间差异有统计学意义(P<0.001)。TOP2A自身抗体肺癌对于正常人的AUC及95%可信区间为0.758(0.711-0.801)(如图2B所示),灵敏度和特异度分别为28.8%和90.3%。
2)TOP2A自身抗体对肺癌组与正常对照组和肺部良性疾病组的鉴别能力
验证组中TOP2A自身抗体水平含量在肺癌组高于正常对照组,组间差异有统计学意义(P<0.001),肺部良性疾病组高于正常对照组和肺癌组,组间差异有统计学意义(P<0.001,如图3所示)。肺癌组对于正常对照组的AUC及95%可信区间为0.668(0.636-0.699),肺癌组对于肺部良性疾病组的AUC及95%可信区间为0.402(0.359-0.446)肺癌组对于正常对照组+肺部良性疾病组的AUC及95%可信区间为0.612(0.582-0.643)(如图4所示)。本发明提示,TOP2A自身抗体可以很好地将肺癌组与正常对照组和肺部良性疾病组区别开来。
3)TOP2A自身抗体对早期肺癌诊断价值
通过对TOP2A所有临床资料(年龄、性别、分期、病理类型、转移情况、肿瘤家族史、吸烟、饮酒)的阳性率进行分析,结果显示TOP2A在早期肺癌(Ⅰ期和Ⅱ期)中的阳性率(36.4%)明显高于晚期肺癌(Ⅲ期和Ⅳ)中的阳性率(16.7%),两组间差异有统计学意义(P<0.05)。其他结果显示在不同临床特征的自身抗体阳性率差异无统计学意义,说明这些因素对TOP2A自身抗体在肺癌患者中的阳性率并无影响。TOP2A在不同分期中的ROC结果显示,早期肺癌对正常人的曲线下面积AUC及95%可信区间是0.705(0.661-0.746),晚期肺癌对正常人的曲线下面积AUC及可信区间是0.627(0.587-0.666)(如图5所示)。通过Medcalc软件比较两组间的AUC,结果显示两组间差异无统计学意义。
4)TOP2A自身抗体与传统肿瘤标志物结合提高肺癌检出率
TOP2A与传统肿瘤标志物结合是否可以提高肺癌早期的检出率,分析了117例CA125(Ⅰ/Ⅱ期20例,Ⅲ/Ⅳ期97例),132例CEA(Ⅰ/Ⅱ期21例,Ⅲ/Ⅳ期111例),115例CYFRA21-1(Ⅰ/Ⅱ期17例,Ⅲ/Ⅳ期98例)与TOP2A自身抗体联合检测的结果。CA125、CEA和CYFRA21-1在早期肺癌中的阳性率分别为20%、28.6%和23.5%。当TOP2A与CA125、CEA和CYFRA21-1分别结合时可明显提高早期的检出率。TOP2A与CA125,TOP2A与CEA,TOP2A与CYFRA21-1联合检测在早期肺癌中的阳性率分别为55%,61.9%和58.8%,其中TOP2A与CEA联合检测的阳性率最高。
本发明结果提示,TOP2A自身抗体可以作为早期肺癌的诊断生物标志物。
7.TOP2A蛋白在制备肺癌肿瘤标志物诊断试剂盒中的应用
该试剂盒成分包括酶标板、酶标试剂、洗涤缓冲液、样品稀释液、显色剂液、终止液、标准品和标准品稀释液。该试剂盒的制备方法同现有技术的常规方法。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.TOP2A自身抗体作为肺癌诊断标志物在制备肺癌诊断试剂或试剂盒中的用途。
2.TOP2A自身抗体作为一种肺癌检测的新型血清学免疫标志物在制备肺癌诊断试剂或试剂盒中的用途。
3.TOP2A自身抗体在制备鉴别肺癌与正常人和肺部良性疾病的诊断试剂或试剂盒中的用途。
4.一种肺癌肿瘤标志物诊断试剂,其特征在于,包括TOP2A蛋白。
5.一种肺癌肿瘤标志物诊断试剂盒,其特征在于,包括TOP2A蛋白。
6.一种TOP2A自身抗体作为肺癌诊断标志物的筛选和鉴定方法,其特征在于,
包括以下步骤:
1)对前期SEREX方法筛选出的可能与肺癌相关的抗原TOP2A,利用Oncomine数据库的三个独立队列研究,包括非小细胞肺癌和正常组织,进行进一步的挖掘,分析TOP2A在肺癌和正常组织中mRNA的表达;
2)为了验证TOP2A自身抗体能否作为肺癌诊断标志物,应用ELISA检测方法,肺癌患者血清以及正常人血清进行TOP2A自身抗体水平的检测,其步骤包括:用抗原稀释液将购买的TOP2A蛋白稀释至1ug/ml,包被96孔板,血清样本1:100稀释,与抗原作用后,与辣根过氧化物酶标记的重组蛋白A抗体反应,最终加入ABTS底物液进行显色,在酶标仪405nm吸光度下读取OD值,以反应血清中TOP2A自身抗体的水平;结果显示,TOP2A自身抗体在肺癌患者血清中的表达水平高于正常人血清,具有统计学意义,P<0.001;为了进一步验证TOP2A是否能用于肺癌的筛查指标,在肺癌、正常对照和肺部良性疾病中进行ELISA检测;结果显示TOP2A在肺癌患者血清中表达水平大于正常对照组和肺部良性疾病组,肺部良性疾病血清中的表达水平大于正常对照组P<0.001;
3)为检测TOP2A自身抗体对于肺癌患者的鉴别能力,通过对肺癌组与正常对照组,肺癌组与肺部良性疾病组以及肺癌组与正常对照组+肺部良性疾病组进行ROC曲线分析,结果显示,肺癌组与正常对照组的曲线下面积为0.668,肺癌组与肺部良性疾病组的曲线下面积为0.402,肺癌组与正常对照组+肺部良性疾病组的曲线下面积为0.612;TOP2A虽然不能区分肺癌和良性疾病但是能将肺癌与非肺癌对照区分;
4)为进一步了解TOP2A自身抗体在肺癌早期诊断中的应用价值,对TOP2A在早期Ⅰ/Ⅱ)和晚期Ⅲ/Ⅳ肺癌患者血清中进行阳性率分析,结果显示TOP2A在早期肺癌中的阳性率为36.4%,在晚期肺癌中的阳性率为16.7%,在早期肺癌中的阳性率明显高于晚期肺癌,P<0.05;与正常对照组进行ROC分析,结果显示早期肺癌与正常对照组的AUC值0.705,晚期肺癌与正常对照组的AUC值0.627;
5)TOP2A与传统肿瘤标志物结合是否能提高肺癌早期的检出率,CA125 Ⅰ/Ⅱ期,Ⅲ/Ⅳ期,CEA Ⅰ/Ⅱ期,Ⅲ/Ⅳ期,CYFRA21-1 Ⅰ/Ⅱ期,Ⅲ/Ⅳ期;CA125、CEA和CYFRA21-1在早期肺癌中的阳性率分别为20%、28.6%和23.5%;当TOP2A与CA125、CEA和CYFRA21-1分别结合时明显提高早期的检出率;TOP2A与CA125,TOP2A与CEA,TOP2A与CYFRA21-1联合检测在早期肺癌中的阳性率分别为55%,61.9%和58.8%,其中TOP2A与CEA联合检测的阳性率最高。
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