CN109030834A - 一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法 - Google Patents

一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法 Download PDF

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徐诚
徐阳
束亚琴
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Abstract

本发明公开了一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，属于蛋白检测技术领域，包括如下步骤：样品蛋白提取、蛋白定量、蛋白酶解、iTRAQ标记、进行蛋白质分析、检测结果、后续验证。本发明明确主动脉缩窄患儿血清特异性差异蛋白，制备临床主动脉缩窄实验室检查中灵敏度好、特异性较高的蛋白标志物，从而达到降低主动脉缩窄的患儿病程早期的误诊率的目的，可以结合现阶段常规超声心动图检查进而降低主动脉缩窄患儿的病程早期误诊率，在临床实际应用中具有重要的意义。

Description

一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法
技术领域
本发明涉及一种皮层肌动蛋白CTTN检测方法，特别是涉及一种基于血液蛋白质组学的主动脉缩窄生物学标志物检测的方法，属于蛋白检测技术领域。
背景技术
主动脉缩窄是指在动脉导管或动脉韧带临近区域的主动脉狭窄。当主动脉横截面积缩小超过50％时会出现明显压力阶差。如何诊断主动脉缩窄,并进行早期干预是临床上亟需解决的问题。临床上超声心动图可以实现先天性心脏病的早期诊断。目前，主动脉缩窄主要以超声心动图检查为主。但目前超声心动图仍然存在不足，无法百分百检出，并且对超声科医师要求高，主观性强，需要寻找更易判断的方法。寻找主动脉弓缩窄特异性生物标志物，能够方便早期筛查，意义重大。在新生儿血液样本中寻找主动脉缩窄的生物标志物，有可能实现主动脉弓缩窄的早期诊断，以及对主动脉缩窄患儿的预后评估有促进作用。
随着人类基因组计划的完成，人们逐渐将研究靶向转变对蛋白质组的研究。蛋白质组一词是在1994年由Williams和Wilkins提出，指基因组编码的所有蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质，强调基因组对应的所有蛋白质构成的整体。2001年，Nature和Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了Abbott和Fields的评述与展望。随之，蛋白质组学的地位提升到了前所未有的高度，被认为是功能基因组学前沿研究战略的制高点、决胜点。蛋白质组学是一种新兴的科学研究技术，其有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式，而是从整体水平分析机体或细胞全部蛋白质组成成分、表达、修饰、结构功能和相互作用，以及蛋白质和核酸之间的相互作用，对生命的复杂活动有全面和本质的认识，从整体层次上对蛋白质进行动态研究。
蛋白质是生命活动的执行者，是基因表达的产物，其表达、修饰、功能以及彼此相互作用均受到遗传及环境因素的影响，于是机体出现疾病状态必然会引起蛋白质含量或者存在形式的变化，这些变化的蛋白质分子可以为临床疾病诊断的物质基础提供依据。蛋白质组学主要是运用现代先进的检测技术，检测机体从小到一个细胞到大至整个机体的全部基因所表达的蛋白质的特性，比较分析生理或病理状态、用药及不用药状态下的差异表达蛋白质，找出不同状态下个体表达差异的蛋白质，从而为生命的物质基础、疾病的早期检测与诊断等研究寻找分子诊断标志物提供依据。
血清或血浆中去发现生物标志物却存在很多困难。虽然成人血清蛋白质的浓度相对恒定(65-85mg/mL)，但是血清蛋白质的动态范围却非常大，通常横跨10到12个数量级。随着科学技术的发展，蛋白质组学的应用越来越广泛。目前，同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)对处理过的蛋白和多肽进行同位素标记，是一种可靠的绝对定量蛋白质的方法。对疾病具有诊断或鉴别意义的标记物通常都是一些组织细胞的分泌蛋白或者细胞破碎后的某些溢出蛋白等，这些蛋白质的含量通常都非常低。
因此，开发能够识别新的血清生物标记物的蛋白质组学方法非常重要，但是不管采用哪种识别策略，对血清样品进行合理的前处理以及质谱对血清蛋白质组的鉴定深度都是成功发现生物标志物的先决条件新近研究证实，大通量、大精度的蛋白组学技术的应用，使血清蛋白质生物标记用于疾病的早期诊断预防、生物蛋白质靶向治疗、预后监测判断等均成为可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全可靠、有效率高的基于血液蛋白质组学的先天性主动脉缩窄生物标志物检测的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，包括如下步骤：
步骤1：样品蛋白提取
用采血管抽取iTRAQ实验血清标本静脉血，收集上层血清，低温保存；
步骤2：蛋白定量
将稀释的样本和标准品分别和蛋白定量染料避光反应，同时测定标准品和样本的吸光值，计算各样品蛋白浓度；
步骤3：蛋白酶解
通过还原剂、半胱氨酸阻断剂、缓冲液、胰蛋白酶反应，收集酶解后的样品；
步骤4：iTRAQ标记
取出iTRAQ试剂，加入异丙醇，将iTRAQ试剂添加到步骤3得到的样品中反应，确认标记后将样品保存待用；
步骤5：高pH条件下的反相色谱分离
混合步骤4中保存的样品，用试剂溶解，使用酶解好的BSA进行分离，得到分离梯度数据；
步骤6：蛋白质分析
将反相分离得到的组份用试剂复溶，吸取上清上样，得到分离梯度数据，选择数据库进行质谱分析得到差异表达蛋白；
步骤7：检测分析
经iTRAQ检出蛋白的数据，通过主动脉缩窄的疾病组与对照组对比，对比值小于特定值，认为是蛋白表达下调，对比值大于特定值，认为是蛋白表达上调；
步骤8：验证
后续对所筛选出来的CTTN蛋白进行大样本的验证。
进一步的，所述步骤1具体包括如下步骤：iTRAQ实验血清标本用无添加剂的干燥真空采血管抽取静脉血5-6ml，常温下静置1h，3000r/min离心10min，收集上层血清，置于冻存管液氮保存后转至-80℃冰箱保存待用，采用多重亲和去除系统去除血清中的高丰度蛋白。
进一步的，所述步骤2具体包括如下步骤：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别与300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度。
进一步的，所述步骤3具体包括如下步骤：
蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；
加入4μl还原剂，60℃反应1h；
加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；
将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；
加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；
换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；
次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；
在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品。
进一步的，所述步骤4具体包括如下步骤：
从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心管底；
向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；
取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；
将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；
从4组样品中各取出1μl混合，脱盐后进行飞行质谱鉴定，确认标记反应良好；
混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；
真空冷冻离心干燥，抽干后的样品冷冻保存待用。
进一步的，所述步骤5中高pH条件下的反相色谱分离，具体包括如下步骤：
调配流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH＝10；
调配流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH＝10；
ddH2O用氨水调pH值到10；
混合上步骤保存的样品用100μl流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；
使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100μl准备好的样本上样；
流速0.7ml/min，得到分离梯度数据。
进一步的，所述步骤6具体包括如下步骤：
所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；
将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇和0.1％甲酸复溶；
12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；
装载泵流速50nl/min，15min，分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；
对质谱数据分析，在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库；
若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；
采用质谱仪进行iTRAQ的质谱分析得到差异表达蛋白。
进一步的，所述步骤7具体包括如下步骤：
经iTRAQ检出蛋白的数据，通过主动脉缩窄的疾病组与对照组对比，对比值<0.5，认为是蛋白表达下调，对比值>2.0，认为是蛋白表达上调。
进一步的所述步骤8具体包括如下步骤：
基于主动脉缩窄的分子机制和临床意义，后续通过Western blot和ELISA实验，对所筛选出来的CTTN蛋白进行大样本的验证。
进一步的，该方法还可以应用于血浆、血清、体液的检测。
本发明的有益技术效果：本发明提供的基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，可以结合现阶段常规超声心动图检查进而降低主动脉缩窄患儿的病程早期误诊率，在临床实际应用中具有重要的意义；通过如下步骤：样品蛋白提取、蛋白定量、蛋白酶解、iTRAQ标记、ABI-5600进行蛋白质分析、检测结果、后续验证，从而达到明确主动脉缩窄患儿血清特异性差异蛋白，制备临床主动脉缩窄实验室检查中灵敏度好，特异性较高的蛋白标志物，降低主动脉缩窄的患儿病程早期的误诊率的目的。
附图说明
图1为本发明的样品检测示意图；
图2为iTRAQ筛选出来的差异上调和下调的蛋白；
图3为Western Blot检测正常儿童血清和单纯性主动脉缩窄患儿中CTTN蛋白的表达变化；
图4为ELISA法对扩大样本人群进行验证；
图5为使用皮层肌动蛋白CTTN的接收者操作特征(ROC)曲线。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
如图1所示，本实施例提供的基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，包括如下步骤：
步骤1：样品蛋白提取
用采血管抽取iTRAQ实验血清标本静脉血，收集上层血清，低温保存；
步骤2：蛋白定量
将稀释的样本和标准品分别和蛋白定量染料避光反应，同时测定标准品和样本的吸光值，计算各样品蛋白浓度；
步骤3：蛋白酶解
通过还原剂、半胱氨酸阻断剂、缓冲液、胰蛋白酶反应，收集酶解后的样品；
步骤4：iTRAQ标记
取出iTRAQ试剂，加入异丙醇，将iTRAQ试剂添加到步骤3得到的样品中反应，确认标记后将样品保存待用；
步骤5：高pH条件下的反相色谱分离
混合步骤4中保存的样品，用试剂溶解，使用酶解好的BSA进行分离，得到分离梯度数据；
步骤6：蛋白质分析
将反相分离得到的组份用试剂复溶，吸取上清上样，得到分离梯度数据，选择数据库进行质谱分析得到差异表达蛋白；
步骤7：检测分析
经iTRAQ检出蛋白的数据，通过主动脉缩窄的疾病组与对照组对比，对比值小于特定值，认为是蛋白表达下调，对比值大于特定值，认为是蛋白表达上调；
步骤8：验证
后续对所筛选出来的CTTN蛋白进行大样本的验证。
为实现上述目的，本实施例提供的基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，具体步骤如下：
步骤1：样品蛋白提取：行iTRAQ实验血清标本用无添加剂的干燥真空采血管抽取静脉血5-6ml，常温下静置1h，3000r/min离心10min，收集上层血清，置于冻存管液氮保存后转至-80℃冰箱保存待用。采用Agilent公司多重亲和去除系统去除血清中的高丰度蛋白(纤维蛋白原，白蛋白，触珠蛋白，转铁蛋白，免疫球蛋白A，免疫球蛋白G，抗胰蛋白酶)，操作流程参考说明书；
步骤2：蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；
步骤3：蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；
步骤4：iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1μl混合，脱盐后进行飞行质谱鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；
步骤5：高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH＝10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100μl流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100μl准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；
步骤6：ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速50nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析得到差异表达蛋白；
步骤7：检测结果：对主动脉缩窄和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定553个蛋白；与正常对照组相比，主动脉缩窄中鉴定到的2倍以上表达差异的显著差异蛋白共7个，其中上调蛋白3个，下调蛋白4个；
步骤8：基于主动脉缩窄的分子机制和临床意义，后续我们对所筛选出来的CTTN蛋白进行大样本的验证，验证方法通过Western blot和ELISA实验。
在本实施例中，样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；5000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；
在本实施例中，蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；
在本实施例中，蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；
在本实施例中，iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用。
在本实施例中，高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；
在本实施例中，ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；
在本实施例中，质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析得到差异表达蛋白。进一步的，差异表达蛋白通过GeneOntology程序分析，具有显著的聚类的1种或多种组合，为主动脉缩窄的生物标志物。进一步的，差异表达蛋白通过STRING程序进行相关性网络分析，提示相关性强的蛋白，为主动脉缩窄的生物标志物。进一步的，差异表达蛋白通过KEGG进行途径分析，提示参与相关代谢途径的蛋白为主动脉缩窄的生物标志物。
在本实施例中，iTRAQ技术是一种同位素标记相对和绝对定量(isobaric tagsfor relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术，可用于蛋白质的相对和绝对定量研究。本研究是基于iTRAQ技术，联合串联质谱蛋白质组学方法(liquid chromatographycoupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)，主要目的是通过主动脉缩窄与正常健康人群对照，定量检测患儿血清中的差异蛋白表达情况，同时为进一步筛选与主动脉缩窄相关的蛋白质或蛋白质组提供研究参考，从蛋白水平研究主动脉缩窄本质。
在本实施例中，实验参数数据如下：
实验材料与方法
病例选择
1、诊断标准
疾病诊断标准
主动脉缩窄的诊断根据院内超声心动图检查确诊为单纯性主动脉缩窄的患儿。
2、病例资料
本研究自2015年12月-2017年12月共收集符合纳入标准的主动脉缩窄患者50例，全部病例来源于南京市儿童医院心胸外科，均经病理检查确诊。患者年龄1-3岁，中位年龄13月。正常对照组50例，年龄1-3岁，中位年龄12月，均来自于南京医科大学大学附属南京市儿童医院儿保科健康自愿者。该研究方案符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准，受试者在受试前已知情，且获得书面同意。
3、分组设计
主动脉缩窄组VS正常对照组，为减少实验误差，主动脉缩窄组和正常对照组各进行2组技术重复。
4、主要仪器及试剂耗材
主要仪器
全温振荡器-常州菲普ZD-88A；
电泳仪-美国Bio-Rad公司Mini-Protean Ⅰ型；
全波长酶标仪-美国MD公司SpectraMaxM2；
电子天平-上海天平仪器厂FA1104；
纯水系统-北京历元电子仪器公司UPW-10N；
自动双重纯水蒸馏器-上海亚荣生化仪器厂SZ-93；
恒温磁力搅拌器-天津市华北实验仪器有限公司85-2型；
超低温冰箱日本SANYO公司MDF-382E；
小型台式离心机-美国Sigma公司1-14；
酸度计-美国OAKTON公司PH1100；
1μL、10μL、100μL、1000μL、移液器，德国Eppendorf公司；
凝胶电泳电源-美国Bio-Rad公司A007；
1200HPLCsystem-美国Agilent；
高分辨率质谱仪-美国ThermoFisherScientific公司LTQ-OrbitrapVelos；
超高压液相色谱仪-美国Waters公司NanoAcquity；
隔水式恒温培养箱-上海博讯GSP-9160MBE；
鼓风干燥箱-中国陆希科技DHG-9075A；
主要试剂与耗材
低分子量标准蛋白Marker-美国Bio-Rad公司；
Bradford蛋白浓度测定试剂盒-美国Bio-Rad公司；
十二烷基磺酸钠-美国Sigma公司；
丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TritonX-100-美国Genview公司质；
谱级蛋白质酶Lys-C、胰蛋白酶-日本Wako公司121-05063；
色谱级乙腈、甲醇-美国Sigma公司；
二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺(Iodacetamide,IAA)-美国Amresco公司；
考马斯亮兰R-250、Tris、Tris-HCl、碳酸氢铵-国产试剂；
蛋白酶抑制剂Cocktail-瑞士罗氏公司；
iTRAQ试剂盒-美国ABSCIEX公司。
5、实验方法与技术
取材
按照本课题专用临床观察表进行临床观察记录。主动脉缩窄患儿入院后，晨起后空腹取材。由经过培训的课题组专人取血样，5-6ml，常温下静置1h，3000r/min离心10min，收集上层血清，置于冻存管液氮保存后转至-80℃冰箱保存待用。实验时取出样本，冰上解冻，所有检测血液样本均1次冻融。
iTRAQ工作流程
样本处理及iTRAQ定量实验流程
如图1所示：(1)样品蛋白提取；(2)蛋白定量；(3)蛋白酶解；(4)iTRAQ标记；(5)高pH条件下的反相色谱分离；(6)ABI-5600进行蛋白质分析。
样品蛋白提取过程
①样本中加入适量裂解缓冲液(7M尿素，2M硫脲，0.1％CHAPS)，涡旋混匀；
②超声60s，0.2son、2soff，振幅22％；
③室温提取30min；
④15000r/min、4℃离心20min，小心取出上清；
⑤收集上清，分装分装后冻存于-80℃。
蛋白定量
采用Bradford法测定提取的蛋白浓度。先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品(将BSA用裂解缓冲液溶解成系列浓度的标准蛋白)各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线。根据曲线公式计算各样品蛋白浓度。
蛋白酶解
①蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；
②加入4μl还原剂，60℃反应1h；
③加入2μl半胱氨酸阻断剂，室温10min；
④将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；
⑤加入iTRAQ试剂盒中的溶解缓冲液100μl，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次(为节省试剂，这步可以将溶解缓冲液用水稀释5倍后使用)；
⑥更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg(与蛋白质量比1:50)，体积50μl，37℃反应过夜；
⑦次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；
⑧在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品。
iTRAQ标记
①从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将试剂离心至管底；
②向每管试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；
③取50μl样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中；
④将iTRAQ试剂填加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；
⑤加入100μl水终止反应；
⑥为了检测标记效率及定量准确性，从4组样品中各取出1μl混合，脱盐后进行飞行质谱鉴定，确认标记反应良好；
⑦混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；
⑧真空冷冻离心干燥；
⑨抽干后的样品冷冻保存待用。
酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析
高pH条件下的反相色谱分离
(1)所需试剂的调配
流动相A：98％ddH2O，2％乙腈(pH10)；
流动相B：98％乙腈，2％ddH2O(pH10)；
ddH2O用氨水调pH值到10。
(2)实验步骤
①混合标记后的样品用100μl流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；
②使用400μg酶解好的BSA进行分离(柱温45℃，检测波长214nm)，检测系统情况；
③取100μl准备好的样本上样；
④流速0.7ml/min。
ABI-5600质谱进行蛋白质分析
(1)所需试剂的调配
流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；
流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；
(2)实验步骤
①将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；
②12000r/min离心10min，吸取上清上样；
③上样体积10μl，采取夹心法上样；
④装载泵流速350nl/min，15min；
⑤分离流速350nl/min。
(3)质谱参数设置
a)离子源参数：喷涂电压：2.1kv；毛细管温度：250℃；离子源：简单喷雾源；DP：100；
b)FullMS：分辨率：70000FWHM；全扫描控制目标：1e6；全扫描Max.IT：60ms；扫描范围：350-1800m/z；
c)dd-MS2：分辨率：17500FWHM；AGC目标：5e6；最大IT：70ms；强度阈值：5.00E+03；破碎方法：HCD；NCE：29％；TopN：20。
质谱数据分析
(1)数据库
数据库的选择是以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据的。在选择数据库时，遵循如下原则，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库。本次使用UniProtKB/Swiss-Prot数据库。
(2)检索软件
iTRAQ的质谱分析是由ABI-5600型质谱完成，产生的质谱原始文件采用ABI公司的配套商用软件ProteinPilot处理。
如图2，基于iTRAQ检测正常儿童血清和单纯性主动脉缩窄患儿中所有蛋白和差异蛋白的结果，具体步骤如下：
经iTRAQ检出蛋白的数据，通过疾病组与对照组对比，对比值<0.5，认为是蛋白表达下调，对比值>2.0，认为是蛋白表达上调。经数据处理后结果显示，检测到主动脉缩窄的差异蛋白表达，共有4个蛋白下调，3个蛋白上调。
差异蛋白如下：
1)检索号为Q14247，蛋白注释为Src substrate cortactin；
2)检索号为P01861，蛋白注释为Immunoglobulinheavyconstantgamma4；
3)检索号为P02765，蛋白注释为Alpha-2-HS-glycoprotein；
4)检索号为P04040，蛋白注释为Catalase；
5)检索号为Q14623，蛋白注释为Indian hedgehog protein；
6)检索号为Q15084，蛋白注释为Proteindisulfide-isomeraseA6；
7)检索号为P55287，蛋白注释为Cadherin-11。
如图3，基于Western Blot检测正常儿童血清和单纯性主动脉缩窄患儿中CTTN蛋白的表达变化的方法，具体步骤如下：
一、实验材料
制备好的上样蛋白样品：
正常组：正常同龄儿童2个；
CoA患者组：单纯性主动脉缩窄患儿2个。
SDS-PAGE凝胶
PVDF膜
脱脂奶粉
一抗CTTN抗体(abcam，1：1000)、β-actin抗体(abcam，1：1000)
TBST
二抗(1：1000)
二、实验方法
取50μg总蛋白进行10％SDS-PAGE电泳，蛋白转印至PVDF膜上(100V，80min)，用5％脱脂奶粉室温封闭1h；一抗CTTN抗体(1：1000)、β-actin抗体(1：1000)分别4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；用红外荧光染料标记的二抗(1：5000)室温孵育1h，TBST洗膜3次，扫描成像。
(二)结果
如图3，2个健康正常儿童血清和2个单纯性主动脉缩窄患儿标本，采用WesternBlot进一步验证CTTN蛋白的表达变化情况。结果证明5位单纯性主动脉缩窄患儿中CTTN的表达水平与其相应健康同龄儿童比较均显著下降。
如图4，基于血清中皮层肌动蛋白蛋白与COA病人的关系检测的方法，具体步骤如下：
一、实验材料
血清样本来自：
正常组：正常同龄儿童50例；
CoA患者组：单纯性主动脉缩窄患儿50例。
其中，正常组同龄儿童血清来自儿保科正常体检的儿童；本院住院病人中确诊为单纯性CoA患儿的血清样本。
二、实验方法
对上述一的血清样本中的皮层肌动蛋白蛋白水平进行ELISA检测，所用试剂盒为R&DSystems公司皮层肌动蛋白ELISA检测试剂盒，具体方法如下：
1、用稀释液(试剂盒中配备dilution buffer)1：40稀释血清样本，标准品稀释梯度50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.13ng/ml、1.56ng/ml、0ng/ml，血清样本和标准品各100μl加入到包有一抗的96孔板中，室温孵育3h；
2、用洗液洗6次，每孔350微升，每次1min；
3、每孔加入200微升皮层肌动蛋白二抗，4度孵育1h；
4、用洗液洗6次，每孔350微升，每次1min；
5、每孔加入200微升显示底物，室温避光孵育30min；
6、每孔加50微升终止液；
7、450nm波长读数；
8、通过皮层肌动蛋白标准蛋白浓度和其对应的OD值绘制标准曲线。通过各孔血清样本所测得的OD值，利用Excel软件对皮层肌动蛋白的标准曲线进行拟合，计算各血清样本中皮层肌动蛋白蛋白的含量；
9、用SPSS16.0软件对正常同龄儿童组(N)和单纯性主动脉缩窄(CoA)血清中皮层肌动蛋白蛋白水平进行ROC曲线分析。
皮层肌动蛋白蛋白表达水平在正常组、CoA患者组的血清样本中的ELISA检测结果：正常组皮层肌动蛋白蛋白的浓度平均值±标准差为1.44ng/ml，CoA患者组为0.85ng/ml。对各两组样本中皮层肌动蛋白蛋白含量进行统计学分析(Mann-Whitney test)，发现血清皮层肌动蛋白蛋白在正常组和CoA患者组(p<0.001)有显著性差异(图4)。
如图5，以正常组为对照组，CoA患者组为疾病组，对血清中皮层肌动蛋白蛋白水平进行ROC曲线分析，曲线下面积AUC＝0.8445(如图3所示)，灵敏度为68.00％、特异度为91.67％。
由上述结果可知，血清皮层肌动蛋白蛋白可用作正常儿童与CoA患者进行判别诊断的潜在标志物。进行正常儿童和CoA患者的判别诊断时，若待测人血清中皮层肌动蛋白蛋白浓度大于等于1.44ng/ml，则该待测人为或候选为CoA患者。
现阶段的主动脉缩窄的确诊手段主要有超声心动图、主动脉造影、心导管造影、数字减影血管造影、MRI等。其中超声心动图常可确定诊断，对年龄较大的患儿亦有很好的诊断价值，但常常不能最后确诊，存在一定误诊率。而通过实验室检查来确诊主动脉缩窄的方法尚未见报道。特异性好，灵敏度高的血清蛋白标志物的检测可以结合现阶段常规超声心动图检查进而降低主动脉缩窄患儿的病程早期误诊率。在临床实际应用中具有重要的意义。
在本实施例中，本实施例提供的基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，明确主动脉缩窄患儿血清特异性差异蛋白，制备临床主动脉缩窄实验室检查中灵敏度好，特异性较高的蛋白标志物，可以降低主动脉缩窄的患儿病程早期的误诊率的目的。
本发明可以用于血浆、血清、体液、组织液等的检测。
综上所述，在本实施例中，本实施例提供的基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，可以结合现阶段常规超声心动图检查进而降低主动脉缩窄患儿的病程早期误诊率，在临床实际应用中具有重要的意义；通过如下步骤：样品蛋白提取、蛋白定量、蛋白酶解、iTRAQ标记、ABI-5600进行蛋白质分析、检测结果、后续验证，从而达到明确主动脉缩窄患儿血清特异性差异蛋白，制备临床主动脉缩窄实验室检查中灵敏度好，特异性较高的蛋白标志物，降低主动脉缩窄的患儿病程早期的误诊率的目的。
以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：样品蛋白提取
用采血管抽取iTRAQ实验血清标本静脉血，收集上层血清，低温保存；
步骤2：蛋白定量
将稀释的样本和标准品分别和蛋白定量染料避光反应，同时测定标准品和样本的吸光值，计算各样品蛋白浓度；
步骤3：蛋白酶解
通过还原剂、半胱氨酸阻断剂、缓冲液、胰蛋白酶反应，收集酶解后的样品；
步骤4：iTRAQ标记
取出iTRAQ试剂，加入异丙醇，将iTRAQ试剂添加到步骤3得到的样品中反应，确认标记后将样品保存待用；
步骤5：高pH条件下的反相色谱分离
混合步骤4中保存的样品，用试剂溶解，使用酶解好的BSA进行分离，得到分离梯度数据；
步骤6：蛋白质分析
将反相分离得到的组份用试剂复溶，吸取上清上样，得到分离梯度数据，选择数据库进行质谱分析得到差异表达蛋白；
步骤7：检测分析
经iTRAQ检出蛋白的数据，通过主动脉缩窄的疾病组与对照组对比，对比值小于特定值，认为是蛋白表达下调，对比值大于特定值，认为是蛋白表达上调；
步骤8：验证
后续对所筛选出来的CTTN蛋白进行大样本的验证。
2.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，其特征在于，所述步骤1具体包括如下步骤：iTRAQ实验血清标本用无添加剂的干燥真空采血管抽取静脉血5-6ml，常温下静置1h，3000r/min离心10min，收集上层血清，置于冻存管液氮保存后转至-80℃冰箱保存待用，采用多重亲和去除系统去除血清中的高丰度蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，其特征在于，所述步骤2具体包括如下步骤：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别与300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度。
4.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，其特征在于，所述步骤3具体包括如下步骤：
蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；
加入4μl还原剂，60℃反应1h；
加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；
将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；
加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；
换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；
次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；
在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品。
5.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，其特征在于，所述步骤4具体包括如下步骤：
从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心管底；
向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；
取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；
将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；
从4组样品中各取出1μl混合，脱盐后进行飞行质谱鉴定，确认标记反应良好；
混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；
真空冷冻离心干燥，抽干后的样品冷冻保存待用。
6.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，其特征在于，所述步骤5中高pH条件下的反相色谱分离，具体包括如下步骤：
调配流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH＝10；
调配流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH＝10；
ddH2O用氨水调pH值到10；
混合上步骤保存的样品用100μl流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；
使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100μl准备好的样本上样；
流速0.7ml/min，得到分离梯度数据。
7.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，其特征在于，所述步骤6具体包括如下步骤：
所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；
将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇和0.1％甲酸复溶；
12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；
装载泵流速50nl/min，15min，分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；
对质谱数据分析，在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库；
若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；
采用质谱仪进行iTRAQ的质谱分析得到差异表达蛋白。
8.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，其特征在于，所述步骤7具体包括如下步骤：
经iTRAQ检出蛋白的数据，通过主动脉缩窄的疾病组与对照组对比，对比值<0.5，认为是蛋白表达下调，对比值>2.0，认为是蛋白表达上调。
9.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，其特征在于，所述步骤8具体包括如下步骤：
基于主动脉缩窄的分子机制和临床意义，后续通过Western blot和ELISA实验，对所筛选出来的CTTN蛋白进行大样本的验证。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的一种基于蛋白质组学的主动脉缩窄标志物检测的方法，其特征在于，该方法还可以应用于血浆、血清、体液的检测。
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