CN110716041A - 一种用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，属于生物医学技术领域，血清蛋白标志物为TP53、GNAS、PBRM1、SRSF2、SMARCB1、GNA11、ACVR1B、PIK3CA或COPB1编码的蛋白中的任意一种或两种以上的联合。同时提供上述血清蛋白标志物的试剂盒及检测方法。本发明基于癌症驱动基因在肿瘤发生和发展中所起的作用，定制138个癌症驱动基因编码的人类蛋白质芯片，共包含180个人源重组蛋白质，先通过蛋白质芯片初步筛选出胃癌的早期检测血清标志物，再经过ELISA间接法实验进行验证，筛选出可用于胃癌早期筛查和诊断的一组胃癌联合检测血清标志物，其为TP53、SRSF2、SMARCB1和GNA11基因编码的蛋白的联合，其联合诊断胃癌ROC曲线下面积达0.950，95％CI为0.925‑0.976，保证特异度90.70％时，灵敏度为86.83％，一致率达到80.3％。

Description

一种用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及 检测方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域。

背景技术

胃癌是一种常见的高致死性恶性肿瘤，其死亡率位居癌症中的第二，晚期胃癌的早期诊断率和5年生存率均<20％。当前胃癌中广泛运用的检测手段包括无创检查(如B超、CT等)和有创检查(胃镜、钡餐等)，但缺乏依从性和普及运用的可能。因此，需要新的生物标记物及时发现胃癌，尤其是血清分子标志物，让胃癌患者能够及时有效的早查、早诊、早治，是提高胃癌患者生存率、降低死亡率的关键所在。尽管目前有一些肿瘤标志物，如CA125(癌抗原125)、CA19-9(癌抗原19-9)、CEA(癌胚抗原)、CA724(癌抗原724)等可用于胃癌的辅助检测，但其敏感性和特异性均不高，因此，到目前为止尚没有理想的可供临床使用的胃癌早期筛查和诊断的标志物。

近年来，在人类肿瘤学的研究领域内，许多研究已经发现癌症患者血清中含有一组独特的诱发自身抗体反应的细胞蛋白，被称为肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)，其诱导产生的抗体称为抗TAA-抗体(autoantibody)。这一概念的提出对胃癌早期诊断研究指引了一个新的方向。肿瘤相关抗原(tumor-associate antigens，TAAs)的自身抗体在正常人和非肿瘤患者血清中不存在或滴度很低，而且患者血清中自身抗体水平的升高往往早于肿瘤症状的出现。再者，抗-TAA抗体具有其它肿瘤标志物不具备的优势，一方面是它能够在血清中持续稳定存在，而其它的标志物，包括TAA本身，在其被肿瘤细胞释放后就被快速降解或者在其进入血液循环后的很短时间内就被机体清除。而且，检测自身抗体的方法和试剂的普及性也有助于研究癌症患者体内抗-TAA抗体的产生规律和功能。因此，检测抗-TAAs的自身抗体可以作为早期肿瘤辅助筛查和诊断的血清标志物。与其他潜在标志物相比，抗TAAS自身抗体在癌症患者血清样品中具有高度稳定性和持久性，并且可以在疾病症状开始之前被检测到。近年来，抗TAAS自身抗体作为早期肿瘤生物标志物，在检测各种类型的肿瘤或作为肿瘤预后指标方面得到了广泛的探索。总的来说，由于肿瘤的异源性，单抗TAA自身抗体的敏感性和特异性较低，对特定肿瘤的诊断缺乏鉴别能力。

多年来的后续研究一直试图寻找诊断胃癌更加敏感特异的抗TAA自身抗体，优化诊断胃癌的组合。寻找有价值的TAA自身抗体，常用的方法有两种：一是重组cDNA表达文库血清学筛选(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries，SEREX)；另一种是蛋白质组学技术。与SEREX相比，蛋白组学技术能够对多个肿瘤血清进行筛选，并且能够筛选出具有翻译后修饰的TAA。在肿瘤的发生发展过程中，涉及到几十万个基因的突变，但仅有某些关键基因突变才可引起肿瘤的发生发展，这些关键基因被称为癌症驱动基因。研究认为不同类型的肿瘤发生时，一般都包含2-8个驱动基因，正是因为这些基因的突变才可导致肿瘤的优势生长，这些基因可以通过调节细胞周期、细胞生存和基因组维持3个细胞核心过程，被分为12个信号通路。目前在多种肿瘤的全基因组测序研究中共发现138个癌症驱动基因(参见Vogelstein B.Science.(2013)339(6127):1546-1558)，包括74个抑癌基因和64个癌症基因。这些基于癌症驱动基因编码的蛋白亦可诱发机体在其循环血液中产生相应的自身抗体，通过对癌症驱动基因编码蛋白及其诱发的血清中的自身抗体的研究可在一定程度上揭示肿瘤的发生发展或预后等。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，同时提供上述血清蛋白标志物的试剂盒及检测方法是本发明的另一发明目的。

基于上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，血清蛋白标志物为TP53、GNAS、PBRM1、SRSF2、SMARCB1、GNA11、ACVR1B、PIK3CA或COPB1编码的蛋白中的任意一种或两种以上的联合。

所述血清蛋白标志物为TP53、SRSF2、SMARCB1或GNA11基因编码的蛋白中的任意一种或两种以上的联合。

所述血清蛋白标志物为TP53、SRSF2、SMARCB1和GNA11基因编码的蛋白的联合。

所述TP53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述GNA11基因编码的蛋白具有如SEQID NO.5所示的氨基酸序列；所述SMARCB1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

一种试剂盒，包括所述的用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物。

所述血清蛋白标志物被包被于固相载体上。

所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺或纤维素。

所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、血清稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液或终止液中的任意一种或两种以上的组合。

使用用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物的检测方法，包括以下步骤：

1)对每种血清蛋白标志物分别进行包被、封闭后，清洗；

2)再与稀释后的待测血清进行一抗孵育，清洗，再进行二抗孵育，清洗；

3)显色系统显色后终止反应，测定吸光度值；

4)以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，将血清蛋白标志物的吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值，

P＝1/(1+Exp(-(-7.118+9.545×OD_TP53+6.183×OD_SRSF2+8.237×OD_SMARCB1+3.514×OD_GNA11)))；

式中OD_TP53、OD_SRSF2、OD_SMARCB1、OD_GNA11分别为每种血清蛋白标志物的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；

当P值≥0.5时，初步判定为胃癌样品；

当P值＜0.5时，初步判定为正常样品。

还包括步骤5)计算出每种血清蛋白标志物的阳性率、灵敏度特异度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比；

步骤6)并联联合检测：利用logistics回归模型构建上述血清蛋白标志物的并联联合检测模型，计算联合诊断结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明基于癌症驱动基因在肿瘤发生和发展中所起的作用，定制138个癌症驱动基因编码的人类蛋白质芯片，共包含180个人源重组蛋白质，先通过蛋白质芯片初步筛选出胃癌的早期检测血清标志物，再经过ELISA间接法实验进行验证，筛选出可用于胃癌早期筛查和诊断的一组胃癌联合检测血清标志物，其为TP53、SRSF2、SMARCB1和GNA11基因编码的蛋白的联合，其联合诊断胃癌ROC曲线下面积达0.885，95％CI为0.852-0.919，保证特异度90.3％时，灵敏度为70.8％，一致率达到80.3％，可辅助胃癌的临床诊断，具有较好的参考价值。

2)本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低等特点，且操作简单、快捷，可为胃癌的早期诊断提供依据。

附图说明

图1为实验例中基于focused array人蛋白质芯片检测原理图；

图2为实验例中蛋白质芯片筛选出的9个TAA单独诊断胃癌ROC曲线分析图；

图3为实验例中蛋白质芯片筛选出的9个TAA的SNR值散点图；

图4为实验例中ELISA间接法检测原理图；

图5为实验例中ELISA验证9个TAA单独诊断胃癌ROC曲线分析图；

图6为实验例中ELISA验证9个TAA的OD值散点分布图；

图7为实验例中ELISA验证4个TAAs联合诊断胃癌在训练集数据中的ROC曲线图；

图8为实验例中ELISA验证4个TAAs联合诊断胃癌在验证集数据中的ROC曲线图。

具体实施方式

实验例

1血清样本的准备

1.1用于进行蛋白芯片实验的血清样本

收集在北京佑安医院和郑州大学第一附属医院原发性胃癌病人(胃癌经病理诊断)，病人同意以及机构审查委员会和医院伦理委员会批准。所有标本均用红头采血管采集研究对象全血5-10mL，在室温放置2小时后，1000g离心15分钟，取上清液，每个样本分装若干份贴好标签，于-80℃低温冰箱保存，避免反复冻融。

根据流行病学分析，最终收集100例原发性胃癌血清以及同时期体检的50例佑安医院正常对照血清进行初步芯片筛选。100例原发性胃癌患者中，共有男性74(74％)例，女性26(26％)例，平均年龄为60.0±10.5岁，年龄范围为27-86岁；50例正常血清中，有男性23(46.0％)例，女性27(54.0％)例，平均年龄为40±13岁，年龄范围为20-71岁。所有胃癌患者血清都是在患者最初诊断为胃癌，尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的。正常人血清来自参加年度健康体检，无任何恶性肿瘤症状的体检人群。

1.2用于进行ELISA间接法实验验证的血清样本

(1)收集自北京佑安医院和郑州大学第一附属医院的血清样本(详见上述1.1部分)。

(2)来自郑州大学第一附属医院检验科(242例原发性胃癌)和郑州市金水区心血管调查项目(192例正常人)，242例原发性胃癌患者中，共有男性111例(78.2％)，女性31例(21.8％)，平均年龄为58.4±11.4岁，年龄范围为23-94岁；192例正常血清中，有男性150例(78.1％)，女性42例(21.9％)，平均年龄为59.4±11.7岁，年龄范围为23-89岁。所有胃癌患者血清都是在患者最初诊断为胃癌，尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的。

2用于筛选胃癌诊断标志物的蛋白芯片定制

将138个癌症驱动基因(参见Vogelstein B.Science.(2013)339(6127):1546-1558)编码的154种蛋白和本实验室提供的26种蛋白(共180个人源重组蛋白质)固定于蛋白芯片上，用于肿瘤标志物的筛选。用于筛选肿瘤标志物的蛋白芯片为在广州博翀生物科技有限公司定制的HuProtTM人类蛋白质芯片。所述癌症驱动基因为ABL1、ACVR1B、AKT1、ALK、APC、AR、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATM、ATRX、AXIN1、B2M、BAP1、BCL2、BCOR、BRAF、BRCA1、BRCA2、CARD11、CASP8、CBL、CDC73、CDH1、CDKN2A、CEBPA、CIC、CREBBP、CRLF2、CSF1R、CTNNB1、CYLD、DAXX、DNMT1、EGFR、DNMT3A、EP300、ERBB2、EZH2、FAM123B、FBXW7、FGFR2、FGFR3、FLT3、FOXL2、FUBP1、GATA1、GATA2、GATA3、GNA11、GNAQ、GNAS、HNF1A、H3F3A、HIST1H3B、HRAS、IDH1、IDH2、JAK1、JAK2、JAK3、KDM5C、KDM6A、KIT、KLF4、KRAS、MAP2K1、MAP3K1、MED12、MEN1、MET、MLH1、MLL2、MLL3、MPL、MSH2、MSH6、MYD88、NCOR1、NF1、NF2、NFE2L2、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NRAS、PAX5、PBRM1、PDGFRA、PHF6、PIK3CA、PIK3R1、PPP2R1A、PRDM1、PTCH1、PTEN、PTPN11、RB1、RET、RNF43、RUNX1、SETD2、SETBP1、SF3B1、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SOCS1、SOX9、SPOP、SRSF2、STAG2、STK11、TET2、TNFAIP3、TRAF7、TP53、TSC1、TSHR、U2AF1、VHL、WT1、CCND1、CDKN2C、IKZF1、LMO1、MAP2K4、MDM2、MDM4、MYC、MYCL1、MYCN、NCOA3、NKX2-1、SKP2、IMP1、P62、IMP3、CIP2A、RalA、c-Myc、Survivin、CyclinB1、14-3-3ζ、MDM2、p53、p16、NPM1和CAPERα蛋白芯片实验

实验原理参见图1。

3.1实验所需试剂：

1)封闭液：3mL 10％BSA，加入7mL 1×PBS溶液，混匀，置于冰上。

2)血清孵育液：1mL 10％BSA，加入9mL 1×PBST溶液，混匀，置于冰上。

3)清洗液：1×PBST溶液，存放于4℃冰箱。

4)二抗孵育液：包括荧光标记抗人IgM二抗(cy5标记，呈现红色)和荧光标记抗人IgG二抗(cy3标记，呈现绿色)。

3.2蛋白芯片具体实验步骤

(a)复温：将芯片从-80℃冰箱取出，于4℃冰箱复温半小时，然后于室温复温15min。

(b)封闭：复温后的芯片，14blocks围栏固定，向每个block中加入封闭液，并放置在侧摆摇床上，室温封闭3小时。

(c)血清样本孵育：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，每张芯片孵育14个样本(血清样本先放在4℃层析柜冻融，与含1％BSA的1×PBST溶液(血清稀释液)以1:50体积比例稀释)，每个血清样本的上样体积为200μL，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育。

(d)清洗：将芯片及芯片夹一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的1×PBST溶液，如此循环数次，保证在拆除芯片夹时血清样本间无交叉污染。拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。

(e)二抗孵育：将芯片转移到加入了3mL二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。

(f)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，80rpm清洗3次，每次10min。完成后用ddH₂O清洗2次，每次10min。

(g)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥。

(h)扫描：按照扫描仪的操作规范和使用说明操作。

(i)数据提取：将芯片图像和结果每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存。

(j)进行数据预处理。

(k)进行数据分析，首先根据AUC>0.5，P<0.05筛选，并根据Logistic回归分析获得最终的胃癌血清标志物，该蛋白质芯片实验筛选出以下血清蛋白标志物：癌症驱动基因TP53、GNAS、PBRM1、SRSF2、SMARCB1、GNA11、ACVR1B、PIK3CA和COPB1编码的蛋白(图2为上述蛋白芯片筛选出的9个TAA单独诊断胃癌的ROC曲线分析图，图2中(1)-(9)依次为TP53、GNAS、PBRM1、SRSF2、SMARCB1、GNA11、ACVR1B、PIK3CA和COPB1编码的蛋白单独诊断胃癌的ROC曲线；图3为上述9个TAA的SNR值散点图，图3中NC表示Normal Controls，即健康正常血清，GC表示Gastric Cancers，即胃癌病例)。其中，TP53、GNAS、PBRM1、SRSF2、SMARCB1、GNA11、ACVR1B、PIK3CA和COPB1基因编码的蛋白依次具有如SEQ ID NO.1-9所示的氨基酸序列。

4 ELISA间接法实验验证

实验原理参见图4。

具体实验步骤如下：

a)包被：按照表1中浓度进行包被，100μL/孔，4℃过夜；

b)封闭：2％BSA(索莱宝，北京，分析纯)的1×PBST(PBS，Tween20索莱宝，北京)溶液，200μL/孔，4℃过夜；

c)清洗：350μL/孔，1×PBST溶液清洗3次；

d)一抗孵育：血清与含1％BSA的1×PBST溶液1:100体积比例稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h；

e)清洗：350μL/孔，1×PBST溶液清洗5次；

f)二抗孵育：HRP标记的鼠抗人IgG(奥科，武汉)与含1％BSA的1×PBST溶液1:10000体积比例稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h；

g)清洗：350μL/孔，1×PBST溶液清洗5次。

h)显色：TMB显色系统，A液(200mgTMB·2HCl溶于1L去离子水，索莱宝，北京，分析纯)与B液(9.2g柠檬酸，37gNa₂HPO₄·12H₂O和8ml0.75％H₂O₂溶于1L去离子水)1:1体积比例混合后，100μL/孔，室温避光，达到预期颜色(约需5-15min)。

i)终止：10％的浓硫酸，50μL/孔后10min内测吸光度。

j)测吸光度：以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，调整IgG做归一化处理，然后进行后续数据处理(数据处理方法详见下述“5数据处理”部分b)-d)所示)。

其中，上述经蛋白芯片实验筛选出的9个TAA进行ELISA实验验证时各自的包被浓度如下表1所示，ELISA实验的96孔板排布表如下表2所示。表2中阳性质控为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性质控为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经Western Blot验证为阴性的血清，空白为血清稀释液，人IgG-1-人IgG-8为梯度稀释的人IgG抗体，浓度依次为10、20、50、100、150、200、250、300ng/ml。

表1筛选出的9个TAA各自的包被浓度

表2 ELISA实验的96孔板排布

实验结果：采用ELISA间接法对9个TAA进行检测，结果见图5和图6。图5为ELISA验证实验中9个TAA单独诊断胃癌的ROC曲线分析图，图5中(1)-(9)依次为TP53、GNAS、PBRM1、SRSF2、SMARCB1、COPB1、PIK3CA、ACVR1B和GNA11编码的蛋白单独诊断胃癌的ROC曲线；图6为ELISA验证实验中9个TAA的OD值散点分布图，图6中NC表示Normal Controls，即健康正常血清，GC表示Gastric Cancers，即胃癌病例。

从图5可以看出，单个指标诊断胃癌ROC曲线下面积为0.560-0.759，保证特异度最低90％时，灵敏度范围为17.86％-47.27％。其中SMARCB1的曲线下面积最大，为0.759，灵敏度达到47.27％，特异度为90.4％；ACVR1B的ROC曲线下面积次之，为0.702，灵敏度达42.26％，特异度为90.00％；GNAS的ROC曲线下面积最小，为0.560，灵敏度为217.86％，特异度为90.14％。从图6可以看出，9个指标OD值分布于0-1之间，中位OD值基本上均分布于0.2-0.4之间，健康对照与胃癌病例之间除GNAS和PIK3CA之外，差异均有统计学意义。

5数据处理

通过使用focused array人蛋白质芯片在胃癌组和NS正常对照组，通过统计学数据分析筛选出差异表达蛋白，具体方法如下：

(1)通过Focused Array蛋白质芯片实验获得芯片初筛结果。

(2)稳定性分析：在实验过程中，根据不同时间、不同芯片、不同位置，将测试样本test进行重复，用以评价不同芯片在不同时间的稳定性。

(3)数据分析及结果：剔除高背景、极端样本干扰后的样本，将IgG和IgM响应类型的各180个蛋白进行一致的统计学分析，分析逻辑如下：

a)为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理，实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值，进行后续统计学分析。

b)假设需要比对的样本分别来自完全相同的两个总体，并通过F检验确定所需比对两组方差是否齐性，然后把F检验结果选择对应t检验，并且t检验结果以P-value进行表征。定义，当p-value<0.05时，拒绝原假设，即两者存在显著性差异。

c)对于任一蛋白，计算癌症组与正常组的组间的差异倍数，即fold change，用以表示两组间差异。

d)对于任一蛋白，根据所比对两组的诊断意义，首先，定义cutoff＝1.5为阳性判断阈值，即样本在蛋白上的SNR≥1.5时，该蛋白为阳性蛋白；然后，以对照组为基础，设置合适的cutoff阈值，在此cutoff阈值下计算癌症组与对照组阳性率之差，并且以最大的差值作为该蛋白在所比较的癌症组中的阳性率，用以寻找癌症组针对对照组特异的高响应蛋白，最后，定义阳性率不得低于15％。

e)基于以上逻辑，进行胃癌组(收集自北京佑安医院和郑州大学第一附属医院的100例原发性胃癌患者血清)和佑安对照组(50例佑安医院正常血清)比对，筛选出胃癌组明显高于对照组的差异蛋白作为胃癌候选标志物，最终经芯片选定了9种血清蛋白标志物(TP53、GNAS、PBRM1、SRSF2、SMARCB1、GNA11、ACVR1B、PIK3CA和COPB1)来评价胃癌的诊断价值。

其中，TP53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，GNAS基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，PBRM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，SMARCB1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，GNA11基因编码的蛋白具有如SEQID NO.6所示的氨基酸序列，ACVR1B基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，PIK3CA基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，COPB1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。上述9种基因的信息来源见下表3。

表3上述12种基因的信息来源

(4)对经蛋白质芯片筛选出的9种血清蛋白标志物进行ELISA实验验证：包括对送检芯片样本验证以及送检芯片之外重新收集的样本进行验证，既实现了蛋白芯片的验证又保证了推广性。

(5)实验结果：经蛋白质芯片筛选出的9种血清蛋白标志物进行ELISA实验验证，对所有验证人群利用随机抽样的方法，抽取总人群的70％作为训练集，利用二元logistics回归构建疾病预测模型，分别用逐步向前(Forward：conditional)、逐步向后(Backward：conditional)以及直接输入法(Enter)三种方法筛选指标，分别有9种、4种、4种蛋白进入模型，其所对应的ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度(Se)、特异度(Sp)如下表4所示。

表4不同筛选方法筛选出的模型指标

对以上所构建的模型的诊断价值以及经济效益分析，含有4个指标(TP53、SRSF2、SMARCB1、GNA11)的模型效果最佳，在剩余的30％人群(验证集)中进行验证，如图7、8所示，其联合诊断胃癌ROC曲线下面积达0.950，95％CI为0.925-0.976，保证特异度90.70％时，灵敏度为86.83％，一致率达到80.3％。

实施例

一种用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，所述血清蛋白标志物为TP53、SRSF2、SMARCB1和GNA11基因编码的蛋白的联合。所述TP53基因编码的蛋白具有如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列；所述SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述GNA11基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述SMARCB1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

一种试剂盒，包括所述的用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，所述血清蛋白标志物被包被于固相载体上，所述固相载体为聚氯乙烯制成的凹孔平板。所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、血清稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

阳性对照血清为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性对照血清为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经WesternBlot验证为阴性的血清，封闭液为2％BSA的1×PBST溶液，血清稀释液和第二抗体稀释液均为含1％BSA的1×PBST溶液，第二抗体为HRP标记的鼠抗人IgG，洗涤液为1×PBST溶液，显色液为A液(200mgTMB·2HCl溶于1L去离子水，索莱宝，北京，分析纯)与B液(9.2g柠檬酸，37gNa₂HPO₄·12H₂O和8ml0.75％H₂O₂溶于1L去离子水)1:1体积比例混合的溶液，终止液为10％的浓硫酸。

使用用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物的检测方法，包括以下步骤：

1)对每种血清蛋白标志物分别进行包被(包被浓度见上表1，100μL/孔，4℃过夜)、封闭(采用封闭液200μL/孔，4℃过夜)后，350μL/孔洗涤液清洗3次；

2)再与稀释后的待测血清(待测血清与血清稀释液以1:100体积比例稀释)进行一抗孵育，100μL/孔，37℃半水浴1h，350μL/孔洗涤液清洗5次，再进行二抗孵育(第二抗体与第二抗体稀释液以1:10000体积比例稀释)，100μL/孔，37℃半水浴1h，350μL/孔洗涤液清洗5次；

3)显色：TMB显色系统，显色液100μL/孔，室温避光，达到预期颜色；终止：终止液50μL/孔终止后，10min内测定吸光度值；

4)以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，将血清蛋白标志物的吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值，

P＝1/(1+Exp(-(-7.118+9.545×OD_TP53+6.183×OD_SRSF2+8.237×OD_SMARCB1+3.514×OD_GNA11)))；

式中OD_TP53、OD_SRSF2、OD_SMARCB1、OD_GNA11分别为每种血清蛋白标志物的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；

当P值≥0.5时，初步判定为胃癌样品；

当P值＜0.5时，初步判定为正常样品；

步骤5)计算出每种血清蛋白标志物的阳性率、灵敏度特异度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比；

步骤6)并联联合检测：利用logistics回归模型构建上述血清蛋白标志物的并联联合检测模型，计算联合诊断结果。

结果显示，待测血清的P值大于0.5，初步判定为疑似胃癌样品。

由于本实施例的方法测定的结果只能作为中间结果的信息，不能直接判定患者是否患有胃癌，因此后续还需要结合临床症状、影像学及组织病理学等信息，最终判定患者的患病情况。

<110> 郑州大学

<120>一种用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及检测方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 393

<212> PRT

<213> 人

<221> TP53基因编码的蛋白

<400> 1

MEEPQSDPSV EPPLSQETFS DLWKLLPENN VLSPLPSQAM DDLMLSPDDI EQWFTEDPGP 60

DEAPRMPEAA PPVAPAPAAP TPAAPAPAPS WPLSSSVPSQ KTYQGSYGFR LGFLHSGTAK 120

SVTCTYSPAL NKMFCQLAKT CPVQLWVDST PPPGTRVRAM AIYKQSQHMT EVVRRCPHHE 180

RCSDSDGLAP PQHLIRVEGN LRVEYLDDRN TFRHSVVVPY EPPEVGSDCT TIHYNYMCNS 240

SCMGGMNRRP ILTIITLEDS SGNLLGRNSF EVRVCACPGR DRRTEEENLR KKGEPHHELP 300

PGSTKRALPN NTSSSPQPKK KPLDGEYFTL QIRGRERFEM FRELNEALEL KDAQAGKEPG 360

GSRAHSSHLK SKKGQSTSRH KKLMFKTEGP DSD 393

<211> 1037

<212> PRT

<213> 人

<221> GNAS基因编码的蛋白

<400> 2

MGVRNCLYGN NMSGQRDIPP EIGEQPEQPP LEAPGAAAPG AGPSPAEEME TEPPHNEPIP 60

VENDGEACGP PEVSRPNFQV LNPAFREAGA HGSYSPPPEE AMPFEAEQPS LGGFWPTLEQ 120

PGFPSGVHAG LEAFGPALME PGAFSGARPG LGGYSPPPEE AMPFEFDQPA QRGCSQLLLQ 180

VPDLAPGGPG AAGVPGAPPE EPQALRPAKA GSRGGYSPPP EETMPFELDG EGFGDDSPPP 240

GLSRVIAQVD GSSQFAAVAA SSAVRLTPAA NAPPLWVPGA IGSPSQEAVR PPSNFTGSSP 300

WMEISGPPFE IGSAPAGVDD TPVNMDSPPI ALDGPPIKVS GAPDKRERAE RPPVEEEAAE 360

MEGAADAAEG GKVPSPGYGS PAAGAASADT AARAAPAAPA DPDSGATPED PDSGTAPADP 420

DSGAFAADPD SGAAPAAPAD PDSGAAPDAP ADPDSGAAPD APADPDAGAA PEAPAAPAAA 480

ETRAAHVAPA APDAGAPTAP AASATRAAQV RRAASAAPAS GARRKIHLRP PSPEIQAADP 540

PTPRPTRASA WRGKSESSRG RRVYYDEGVA SSDDDSSGDE SDDGTSGCLR WFQHRRNRRR 600

RKPQRNLLRN FLVQAFGGCF GRSESPQPKA SRSLKVKKVP LAEKRRQMRK EALEKRAQKR 660

AEKKRSKLID KQLQDEKMGY MCTHRLLLLG AGESGKSTIV KQMRILHVNG FNGEGGEEDP 720

QAARSNSDGE KATKVQDIKN NLKEAIETIV AAMSNLVPPV ELANPENQFR VDYILSVMNV 780

PDFDFPPEFY EHAKALWEDE GVRACYERSN EYQLIDCAQY FLDKIDVIKQ ADYVPSDQDL 840

LRCRVLTSGI FETKFQVDKV NFHMFDVGGQ RDERRKWIQC FNDVTAIIFV VASSSYNMVI 900

REDNQTNRLQ EALNLFKSIW NNRWLRTISV ILFLNKQDLL AEKVLAGKSK IEDYFPEFAR 960

YTTPEDATPE PGEDPRVTRA KYFIRDEFLR ISTASGDGRH YCYPHFTCAV DTENIRRVFN 1020

DCRDIIQRMH LRQYELL 1037

<211> 306

<212> PRT

<213> 人

<221> PBRM1基因编码的蛋白

<400> 3

MGEEDSEVIE PPSLPQLQTP LASELDLMPY TPPQSTPKSA KGSAKKEGSK RKINMSGYIL 60

FSSEMRAVIK AQHPDYSFGE LSRLVGTEWR NLETAKKAEY EGMMGGYPPG LPPLQGPVDG 120

LVSMGSMQPL HPGGPPPHHL PPGVPGLPGI PPPGVMNQGV APMVGTPAPG GSPYGQQVGV 180

LGPPGQQAPP PYPGPHPAGP PVIQQPTTPM FVAPPPKTQR LLHSEAYLKY IEGLSAESNS 240

ISKWDQTLAA RRRDVHLSKE QESRLPSHWL KSKGAHTTMA DALWRLRDLM LRDTLNIRQA 300

YNLENV 306

<211> 221

<212> PRT

<213> 人

<221> SRSF2基因编码的蛋白

<400> 4

MSYGRPPPDV EGMTSLKVDN LTYRTSPDTL RRVFEKYGRV GDVYIPRDRY TKESRGFAFV 60

RFHDKRDAED AMDAMDGAVL DGRELRVQMA RYGRPPDSHH SRRGPPPRRY GGGGYGRRSR 120

SPRRRRRSRS RSRSRSRSRS RSRYSRSKSR SRTRSRSRST SKSRSARRSK SKSSSVSRSR 180

SRSRSRSRSR SPPPVSKRES KSRSRSKSPP KSPEEEGAVS S 221

<211> 385

<212> PRT

<213> 人

<221> SMARCB1基因编码的蛋白

<400> 5

MMMMALSKTF GQKPVKFQLE DDGEFYMIGS EVGNYLRMFR GSLYKRYPSL WRRLATVEER 60

KKIVASSHGK KTKPNTKDHG YTTLATSVTL LKASEVEEIL DGNDEKYKAV SISTEPPTYL 120

REQKAKRNSQ WVPTLPNSSH HLDAVPCSTT INRNRMGRDK KRTFPLCFDD HDPAVIHENA 180

SQPEVLVPIR LDMEIDGQKL RDAFTWNMNE KLMTPEMFSE ILCDDLDLNP LTFVPAIASA 240

IRQQIESYPT DSILEDQSDQ RVIIKLNIHV GNISLVDQFE WDMSEKENSP EKFALKLCSE 300

LGLGGEFVTT IAYSIRGQLS WHQKTYAFSE NPLPTVEIAI RNTGDADQWC PLLETLTDAE 360

MEKKIRDQDR NTRRMRRLAN TAPAW 385

<211> 359

<212> PRT

<213> 人

<221> GNA11基因编码的蛋白

<400> 6

MTLESMMACC LSDEVKESKR INAEIEKQLR RDKRDARREL KLLLLGTGES GKSTFIKQMR 60

IIHGAGYSEE DKRGFTKLVY QNIFTAMQAM IRAMETLKIL YKYEQNKANA LLIREVDVEK 120

VTTFEHQYVS AIKTLWEDPG IQECYDRRRE YQLSDSAKYY LTDVDRIATL GYLPTQQDVL 180

RVRVPTTGII EYPFDLENII FRMVDVGGQR SERRKWIHCF ENVTSIMFLV ALSEYDQVLV 240

ESDNENRMEE SKALFRTIIT YPWFQNSSVI LFLNKKDLLE DKILYSHLVD YFPEFDGPQR 300

DAQAAREFIL KMFVDLNPDS DKIIYSHFTC ATDTENIRFV FAAVKDTILQ LNLKEYNLV 359

<211> 505

<212> PRT

<213> 人

<221> ACVR1B基因编码的蛋白

<400> 7

MAESAGASSF FPLVVLLLAG SGGSGPRGVQ ALLCACTSCL QANYTCETDG ACMVSIFNLD 60

GMEHHVRTCI PKVELVPAGK PFYCLSSEDL RNTHCCYTDY CNRIDLRVPS GHLKEPEHPS 120

MWGPVELVGI IAGPVFLLFL IIIIVFLVIN YHQRVYHNRQ RLDMEDPSCE MCLSKDKTLQ 180

DLVYDLSTSG SGSGLPLFVQ RTVARTIVLQ EIIGKGRFGE VWRGRWRGGD VAVKIFSSRE 240

ERSWFREAEI YQTVMLRHEN ILGFIAADNK DNGTWTQLWL VSDYHEHGSL FDYLNRYTVT 300

IEGMIKLALS AASGLAHLHM EIVGTQGKPG IAHRDLKSKN ILVKKNGMCA IADLGLAVRH 360

DAVTDTIDIA PNQRVGTKRY MAPEVLDETI NMKHFDSFKC ADIYALGLVY WEIARRCNSG 420

GVHEEYQLPY YDLVPSDPSI EEMRKVVCDQ KLRPNIPNWW QSYEALRVMG KMMRECWYAN 480

GAARLTALRI KKTLSQLSVQ EDVKI 505

<211> 1068

<212> PRT

<213> 人

<221> PIK3CA基因编码的蛋白

<400> 8

MPPRPSSGEL WGIHLMPPRI LVECLLPNGM IVTLECLREA TLITIKHELF KEARKYPLHQ 60

LLQDESSYIF VSVTQEAERE EFFDETRRLC DLRLFQPFLK VIEPVGNREE KILNREIGFA 120

IGMPVCEFDM VKDPEVQDFR RNILNVCKEA VDLRDLNSPH SRAMYVYPPN VESSPELPKH 180

IYNKLDKGQI IVVIWVIVSP NNDKQKYTLK INHDCVPEQV IAEAIRKKTR SMLLSSEQLK 240

LCVLEYQGKY ILKVCGCDEY FLEKYPLSQY KYIRSCIMLG RMPNLMLMAK ESLYSQLPMD 300

CFTMPSYSRR ISTATPYMNG ETSTKSLWVI NSALRIKILC ATYVNVNIRD IDKIYVRTGI 360

YHGGEPLCDN VNTQRVPCSN PRWNEWLNYD IYIPDLPRAA RLCLSICSVK GRKGAKEEHC 420

PLAWGNINLF DYTDTLVSGK MALNLWPVPH GLEDLLNPIG VTGSNPNKET PCLELEFDWF 480

SSVVKFPDMS VIEEHANWSV SREAGFSYSH AGLSNRLARD NELRENDKEQ LKAISTRDPL 540

SEITEQEKDF LWSHRHYCVT IPEILPKLLL SVKWNSRDEV AQMYCLVKDW PPIKPEQAME 600

LLDCNYPDPM VRGFAVRCLE KYLTDDKLSQ YLIQLVQVLK YEQYLDNLLV RFLLKKALTN 660

QRIGHFFFWH LKSEMHNKTV SQRFGLLLES YCRACGMYLK HLNRQVEAME KLINLTDILK 720

QEKKDETQKV QMKFLVEQMR RPDFMDALQG FLSPLNPAHQ LGNLRLEECR IMSSAKRPLW 780

LNWENPDIMS ELLFQNNEII FKNGDDLRQD MLTLQIIRIM ENIWQNQGLD LRMLPYGCLS 840

IGDCVGLIEV VRNSHTIMQI QCKGGLKGAL QFNSHTLHQW LKDKNKGEIY DAAIDLFTRS 900

CAGYCVATFI LGIGDRHNSN IMVKDDGQLF HIDFGHFLDH KKKKFGYKRE RVPFVLTQDF 960

LIVISKGAQE CTKTREFERF QEMCYKAYLA IRQHANLFIN LFSMMLGSGM PELQSFDDIA 1020

YIRKTLALDK TEQEALEYFM KQMNDAHHGG WTTKMDWIFH TIKQHALN 1068

<211> 953

<212> PRT

<213> 人

<221> COPB1基因编码的蛋白

<400> 9

MTAAENVCYT LINVPMDSEP PSEISLKNDL EKGDVKSKTE ALKKVIIMIL NGEKLPGLLM 60

TIIRFVLPLQ DHTIKKLLLV FWEIVPKTTP DGRLLHEMIL VCDAYRKDLQ HPNEFIRGST 120

LRFLCKLKEA ELLEPLMPAI RACLEHRHSY VRRNAVLAIY TIYRNFEHLI PDAPELIHDF 180

LVNEKDASCK RNAFMMLIHA DQDRALDYLS TCIDQVQTFG DILQLVIVEL IYKVCHANPS 240

ERARFIRCIY NLLQSSSPAV KYEAAGTLVT LSSAPTAIKA AAQCYIDLII KESDNNVKLI 300

VLDRLIELKE HPAHERVLQD LVMDILRVLS TPDLEVRKKT LQLALDLVSS RNVEELVIVL 360

KKEVIKTNNV SEHEDTDKYR QLLVRTLHSC SVRFPDMAAN VIPVLMEFLS DNNEAAAADV 420

LEFVREAIQR FDNLRMLIVE KMLEVFHAIK SVKIYRGALW ILGEYCSTKE DIQSVMTEIR 480

RSLGEIPIVE SEIKKEAGEL KPEEEITVGP VQKLVTEMGT YATQSALSSS RPTKKEEDRP 540

PLRGFLLDGD FFVAASLATT LTKIALRYVA LVQEKKKQNS FVAEAMLLMA TILHLGKSSL 600

PKKPITDDDV DRISLCLKVL SECSPLMNDI FNKECRQSLS HMLSAKLEEE KLSQKKESEK 660

RNVTVQPDDP ISFMQLTAKN EMNCKEDQFQ LSLLAAMGNT QRKEAADPLA SKLNKVTQLT 720

GFSDPVYAEA YVHVNQYDIV LDVLVVNQTS DTLQNCTLEL ATLGDLKLVE KPSPLTLAPH 780

DFANIKANVK VASTENGIIF GNIVYDVSGA ASDRNCVVLS DIHIDIMDYI QPATCTDAEF 840

RQMWAEFEWE NKVTVNTNMV DLNDYLQHIL KSTNMKCLTP EKALSGYCGF MAANLYARSI 900

FGEDALANVS IEKPIHQGPD AAVTGHIRIR AKSQGMALSL GDKINLSQKK TSI 953

Claims (10)

1.一种用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，其特征在于：血清蛋白标志物为TP53、GNAS、PBRM1、SRSF2、SMARCB1、GNA11、ACVR1B、PIK3CA或COPB1编码的蛋白中的任意一种或两种以上的联合。

2.如权利要求1所述的用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，其特征在于：所述血清蛋白标志物为TP53、SRSF2、SMARCB1或GNA11基因编码的蛋白中的任意一种或两种以上的联合。

3.如权利要求2所述的用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，其特征在于：所述血清蛋白标志物为TP53、SRSF2、SMARCB1和GNA11基因编码的蛋白的联合。

4.如权利要求3所述的用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，其特征在于：所述TP53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述GNA11基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述SMARCB1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

5.一种试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-4任一所述的用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述血清蛋白标志物被包被于固相载体上。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺或纤维素。

8.如权利要求5-7任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、血清稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液或终止液中的任意一种或两种以上的组合。

9.使用如权利要求3所述的用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)对每种血清蛋白标志物分别进行包被、封闭后，清洗；

2)再与稀释后的待测血清进行一抗孵育，清洗，再进行二抗孵育，清洗；

3)显色系统显色后终止反应，测定吸光度值；

4)以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，将血清蛋白标志物的吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值，

P＝1/(1+Exp(-(-7.118+9.545×OD_TP53+6.183×OD_SRSF2+8.237×OD_SMARCB1+3.514×OD_GNA11)))；

式中OD_TP53、OD_SRSF2、OD_SMARCB1、OD_GNA11分别为每种血清蛋白标志物的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；

当P值≥0.5时，初步判定为胃癌样品；

当P值＜0.5时，初步判定为正常样品。

10.如权利要求9所述的使用用于胃癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物的检测方法，其特征在于：还包括步骤5)计算出每种血清蛋白标志物的阳性率、灵敏度特异度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比；

步骤6)并联联合检测：利用logistics回归模型构建上述血清蛋白标志物的并联联合检测模型，计算联合诊断结果。

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