CN114354933A - 一种胃癌筛查血清生物标志物群及其应用 - Google Patents
一种胃癌筛查血清生物标志物群及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种胃癌筛查血清生物标志物群及其应用。本发明采用t检验和SVM built‑in算法筛选蛋白质质谱定量的胃癌相关的蛋白质组合,结合机器学习中的线性支持向量机(Linear SVM)模型利用所选的蛋白组合对胃癌患者和正常人进行精准分类,可弥补临床上胃癌筛查方法灵敏度和特异性不足的缺点。同时可以作为辅助手段结合临床其他检查结果进行进一步临床决策,实现胃癌早发现、早诊断和早治疗,大大改善患者的预后。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学技术领域,尤其是涉及一种胃癌筛查血清生物标志物群及其应用。
背景技术
胃癌(Gastric cancer,GC)是世界上第三大癌症死亡原因,尤其是在东亚,占全球病例的一半以上。尽管近年来死亡率有所下降,但由于其恶性程度高,预后差,严重威胁了人类健康。早期胃癌5年生存率可以达到90%,而中晚期胃癌术后5年生存率仅为30%左右。因此,对胃癌进行早发现、早诊断和早治疗是有效改善胃癌预后、降低死亡率的关键。
糖类抗原72-4(CA72-4)是目前诊断胃癌的最佳肿瘤标志物之一,在胃癌患者中的阳性率为65%-75%,若与糖类抗原19-9(CA19-9)及癌胚抗原(CEA)联合检测可以监测70%以上的胃癌。然而,CA72-4水平与胃癌的分期有明显的相关性,一般在晚期(III-IV期)才会增高,且其在结/直肠癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌也有一定的阳性率。因此,寻找灵敏度和特异性均高的胃癌筛查方法成为临床研究的重点和难点。
蛋白质组学是近年来兴起的一种新的生物研究手段,是在大规模水平上研究蛋白质的特征,包括蛋白质表达水平,翻译后修饰,蛋白与蛋白相互作用等,由此获得蛋白质水平上正常与疾病状态下的差异,从而进行疾病的早期诊断及鉴别。蛋白质质谱是一种通过鉴定、定量蛋白质来寻找生物标志物的有效手段,具有同时检测数千种蛋白质和翻译后修饰的能力,因此从根本上改变了对生物系统的研究方式。几十年来,质谱在测量速度、灵敏度和准确性方面都得到了极大的提高,再次推动了定量蛋白质组学的发展。然而如何利用蛋白质质谱精准对胃癌进行筛查依旧是行业亟待解决的一大难题。
发明内容
基于现有技术中缺乏利用蛋白质质谱对胃癌进行精准筛查的现状,本发明提供一种胃癌筛查血清生物标志物群及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
本发明首先提供一种胃癌筛查血清生物标志物群,选自以下蛋白中的2种或2种以上的组合:
COMP,HBB,PON1,APOC1,AFM,MPO,APOA4,APOB,C9,APOH,F2,APOA2,LRG1,PTGDS,IGFBP2,TF,CDH13,FN1,A2M,CFH,APOF,ALB,ALAD,CLU,FGB,F10,VWF,MAN1A1,MST1,SPP2,CA1,C1RL,IGKV3-11,HP,SERPIND1,IGLV3-21,FGG,IGKV1-39,F13A1,HBD,AGT,APOL1,C4BPA,HBA1;HBA2,FGA,CPB2,HPR,SERPINC1,IL1RAP,C5,CFD,COLEC10,CST3,IGLV1-47,IGKV2-30,PLG,APOC3,IGHG2,APOM,IGKC,KNG1,A1BG,IGFALS,SAA4,IGHM,F13B;
每一种蛋白具体的信息如下:
在本发明的一个实施方式中,所述胃癌筛查血清生物标志物群选择为以下所有蛋白的组合:
COMP,HBB,PON1,APOC1,AFM,MPO,APOA4,APOB,C9,APOH,F2,APOA2,LRG1,PTGDS,IGFBP2,TF,CDH13,FN1,A2M,CFH,APOF,ALB,ALAD,CLU,FGB,F10,VWF,MAN1A1,MST1,SPP2,CA1,C1RL,IGKV3-11,HP,SERPIND1,IGLV3-21,FGG,IGKV1-39,F13A1,HBD,AGT,APOL1,C4BPA,HBA1;HBA2,FGA,CPB2,HPR,SERPINC1,IL1RAP,C5,CFD,COLEC10,CST3,IGLV1-47,IGKV2-30,PLG,APOC3,IGHG2,APOM,IGKC,KNG1,A1BG,IGFALS,SAA4,IGHM,F13B。
在本发明的一个实施方式中,所述胃癌筛查血清生物标志物群选择为以下所有蛋白的组合:
COMP,HBB,PON1,APOC1,AFM,MPO,APOA4,APOB,C9,APOH,F2,APOA2,LRG1,PTGDS,CA1,IGKV1-39,F13A1,HBD,FGB,FGG,FGA,MAN1A1,KNG1,CPB2,A1BG,IGFALS,CST3。
本发明提供的胃癌筛查血清生物标志物群可用于反映胃癌患者和正常人差异。
本发明还提供所述胃癌筛查血清生物标志物群的确定方法,包括如下步骤:
(1)在血清样本中对潜在生物标志物群进行靶向质谱定量数据采集;
(2)对质谱数据进行预处理,获得蛋白定量矩阵;
(3)特征蛋白选择,特征蛋白构成所述胃癌筛查血清生物标志物群。
在本发明的一个实施方式中,在血清样本中对潜在生物标志物群进行靶向质谱定量数据采集的方法包括以下步骤:
(1)血清样本前处理:对血清样本进行酶解,得到多肽溶液,干燥后,用质谱纯的甲酸水溶液重溶,将多肽溶液稀释,等待质谱检测;
(2)潜在生物标志物群的选择:挖掘文献筛选胃癌患者癌组织与癌旁组织差异表达蛋白,通过生物信息学分析预测可能分泌的蛋白,形成潜在生物标志物列表;
(3)蛋白定量数据采集:多肽溶液通过timTOF pro质谱仪的LC-prmPASEF模式进行数据采集得到蛋白质矩阵结果,其中蛋白质矩阵结果是对样本中检测到的蛋白进行相对定量,每个蛋白得到相应的检测强度值。
在本发明的一个实施方式中,步骤(3)中,LC-prmPASEF的色谱条件为60min梯度,质谱条件为:扫描范围:300-1400,离子淌度范围:0.65-1.35Vs/cm2,TIMS管的累积时间和分离时间均为50ms。
在本发明的一个实施方式中,对质谱数据进行预处理,获得蛋白定量矩阵的方法为:
所有的prmPASEF质谱数据均使用Skyline软件进行处理,并结合标准肽段的保留时间和离子对信息,手动检查血清样本中每个肽段的提取时间和离子对,以确保正确的峰检测和准确的积分面积,每种蛋白的定量值以峰面积进行测定。
在本发明的一个实施方式中,特征蛋白选择方法为:
以t检验比较胃癌患者与正常人的血清蛋白质组定量矩阵,初步筛选两组间存在显著差异的特征蛋白,作为新的矩阵,再利用SVM built-in算法进行进一步的特征筛选,特征蛋白构成所述胃癌筛查血清生物标志物群。
本发明还提供所述胃癌筛查血清生物标志物群在建立胃癌筛查方法或胃癌筛查模型中的应用。
本发明还提供一种胃癌筛查试剂盒,所述胃癌筛查试剂盒对血清中所述胃癌筛查血清生物标志物群进行靶向质谱定量数据采集,代入胃癌筛查模型,得出受检者患胃癌的风险程度;
所述胃癌筛查模型,采用如下方法建立:
使用所述胃癌筛查血清生物标志物群的定量矩阵作为特征属性,用于基于线性支持向量机算法的胃癌筛查模型建立。
在本发明的一个实施方式中,所述胃癌筛查模型用ROC曲线评估模型效果,具体的,ROC曲线由蒙特卡洛交叉验证产生,在每个MCCV中,2/3的样本作为训练集,1/3的样本作为验证集。
以上本发明提供的胃癌筛查试剂盒或胃癌筛查血清生物标志物群在建立胃癌筛查方法中的应用,或胃癌筛查方法不用于诊断目的,可作为辅助手段结合临床其他检查结果进行进一步临床决策。
本发明采用t检验和SVM built-in算法筛选蛋白质质谱定量的胃癌相关的蛋白质组合,结合机器学习中的线性支持向量机(Linear SVM)模型利用所选的蛋白组合对对胃癌患者和正常人进行精准分类,可弥补临床上胃癌筛查方法灵敏度和特异性不足的缺点。同时可以作为辅助手段结合临床其他检查结果进行进一步临床决策,实现胃癌早发现、早诊断和早治疗,大大改善患者的预后。
附图说明
图1:区分胃癌患者和正常人的最佳特征蛋白组合ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例利用蛋白质质谱结合机器学习模型,通过多种蛋白组合,完成对胃癌患者和正常人的分类,进而实现胃癌的筛查。该方案不用于诊断目的,可作为辅助手段结合临床其他检查结果进行进一步临床决策。该方案的非诊断目的用途比如:在体检过程中作为筛查工具,了解受检者健康状况,早期发现疾病线索和健康隐患。
本实施例首先提供一种胃癌筛查血清生物标志物群,选自以下蛋白中的2种或2种以上的组合:
COMP,HBB,PON1,APOC1,AFM,MPO,APOA4,APOB,C9,APOH,F2,APOA2,LRG1,PTGDS,IGFBP2,TF,CDH13,FN1,A2M,CFH,APOF,ALB,ALAD,CLU,FGB,F10,VWF,MAN1A1,MST1,SPP2,CA1,C1RL,IGKV3-11,HP,SERPIND1,IGLV3-21,FGG,IGKV1-39,F13A1,HBD,AGT,APOL1,C4BPA,HBA1;HBA2,FGA,CPB2,HPR,SERPINC1,IL1RAP,C5,CFD,COLEC10,CST3,IGLV1-47,IGKV2-30,PLG,APOC3,IGHG2,APOM,IGKC,KNG1,A1BG,IGFALS,SAA4,IGHM,F13B;
每一种蛋白具体的信息如下:
本实施例还提供上述血清生物标志物群在建立胃癌筛查方法中的应用,具体地,是建立一个基于蛋白质组学的胃癌筛查模型。
分析样本:57例胃癌患者、74例正常人的血清样本,样本取自复旦大学附属中山医院。
本实施例的技术方案在74例正常人,57例胃癌患者的临床队列中,受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC)下面积(AUC)达到0.97以上,具有特异性强,灵敏度高等特点,可以很好地弥补现有临床中胃癌筛查方法灵敏度和特异性不足的问题,为胃癌早期筛查提供新的方法和参考依据。
蛋白质质谱结合机器学习进行胃癌筛查的方法通过以下步骤实现:
(1)在血清样本中对潜在生物标志物群进行靶向质谱定量数据采集;
(2)对质谱数据进行预处理,获得蛋白定量矩阵;
(3)特征蛋白选择;
(4)机器学习模型构建及效果评估。
具体实验步骤如下:
1、在血清样本中对潜在生物标志物群进行靶向质谱定量数据采集;
(1)血清样本前处理:向5μg/μL血清稀释液中加入二硫苏糖醇(DTT)使其终浓度为10mM,置于56℃恒温震荡仪中还原30min,然后加入碘乙酰胺(IAA)使其终浓度为20mM,37℃下避光反应30min。将上述反应液用50mM碳酸氢铵(ABC)稀释至蛋白浓度为1μg/μL,随后按照1:50(酶:蛋白)的比例加入胰蛋白酶(Trypsin)在37℃恒温震荡仪上过夜酶解(12-14h)。次日,向反应液中加入三氟乙酸(TFA,终浓度0.1%)终止酶切反应,最终得到多肽溶液,然后在旋转真空浓缩器(Christ,德国)上干燥后,用质谱纯的甲酸水溶液(0.1%FA)重溶,使用市售的肽段定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)测定酶解后的多肽浓度,根据测试结果将多肽溶液稀释成400ng/μL,等待质谱检测。
(2)潜在生物标志物群的选择:挖掘文献筛选胃癌患者癌组织与癌旁组织差异表达蛋白,通过生物信息学分析(SignalP和GO-CC)预测可能分泌的蛋白,形成潜在生物标志物列表。
(3)蛋白定量数据采集:多肽溶液通过timTOF pro质谱仪(Bruker)的LC-prmPASEF模式进行数据采集得到蛋白质矩阵结果,其中蛋白质矩阵结果是对样本中检测到的蛋白进行相对定量,每个蛋白得到相应的检测强度值。具体的,LC-prmPASEF的色谱条件为60min梯度,质谱条件为:扫描范围(m/z):300-1400,离子淌度范围(1/K0):0.65-1.35Vs/cm2,TIMS管的累积时间和分离时间均为50ms。
2、对质谱数据进行预处理,获得蛋白定量矩阵
所有的prmPASEF质谱数据均使用Skyline软件(v20.1)进行处理,并结合标准肽段的保留时间和离子对信息,手动检查血清样本中每个肽段的提取时间和离子对,以确保正确的峰检测和准确的积分面积,每种蛋白(肽段)的定量值以峰面积进行测定。
3、特征蛋白选择
以t检验比较胃癌患者与正常人(GC vs.C)的血清蛋白质组定量矩阵,初步筛选两组间存在显著差异的特征蛋白,作为新的矩阵,再利用SVM built-in算法进行进一步的特征筛选。
优选的蛋白组合举例:
组合一:上述所列所有蛋白组合;
组合二:COMP,HBB,PON1,APOC1,AFM,MPO,APOA4,APOB,C9,APOH,F2,APOA2,LRG1,PTGDS,CA1,IGKV1-39,F13A1,HBD,FGB,FGG,FGA,MAN1A1,KNG1,CPB2,A1BG,IGFALS,CST3.
组合三:APOB,FGG;
4、机器学习模型构建及效果评估
使用步骤3中选择的蛋白组合的定量矩阵作为特征属性,采用线性支持向量机(Linear SVM)算法建立机器学习模型,然后用ROC曲线评估模型效果。具体的,ROC曲线由蒙特卡洛交叉验证(Monte-Carlo cross validation,MCCV)产生,区分胃癌患者和正常人的最佳特征蛋白组合ROC曲线如图1所示。在每个MCCV中,2/3的样本作为训练集,通过SVMbuilt-in算法来评估特征的重要性(https://www.metaboanalyst.ca/)。然后选取前2、27、66的重要特征建立分类模型,并在剩余的1/3的样本集中进行验证。列举的每个优选特征蛋白组合的AUC均能达到0.96以上,随着模型所用特征数目增多,AUC会相应增高,直至使用上述所有蛋白组合,AUC趋于恒定,达到0.978。
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可以得出其他各种形式的产品,但不论在其结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案用于胃癌筛查,亦或是采用本发明列出的蛋白组合或包含其中任意2种以上蛋白用于胃癌检测/诊断/筛查,均落在本发明的保护范围之内。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种胃癌筛查血清生物标志物群,其特征在于,选自以下蛋白中的2种或2种以上的组合:
COMP,HBB,PON1,APOC1,AFM,MPO,APOA4,APOB,C9,APOH,F2,APOA2,LRG1,PTGDS,IGFBP2,TF,CDH13,FN1,A2M,CFH,APOF,ALB,ALAD,CLU,FGB,F10,VWF,MAN1A1,MST1,SPP2,CA1,C1RL,IGKV3-11,HP,SERPIND1,IGLV3-21,FGG,IGKV1-39,F13A1,HBD,AGT,APOL1,C4BPA,HBA1;HBA2,FGA,CPB2,HPR,SERPINC1,IL1RAP,C5,CFD,COLEC10,CST3,IGLV1-47,IGKV2-30,PLG,APOC3,IGHG2,APOM,IGKC,KNG1,A1BG,IGFALS,SAA4,IGHM,F13B;
每一种蛋白具体的信息如下:
2.根据权利要求1所述的一种胃癌筛查血清生物标志物群,其特征在于,所述胃癌筛查血清生物标志物群选择为以下所有蛋白的组合:
COMP,HBB,PON1,APOC1,AFM,MPO,APOA4,APOB,C9,APOH,F2,APOA2,LRG1,PTGDS,IGFBP2,TF,CDH13,FN1,A2M,CFH,APOF,ALB,ALAD,CLU,FGB,F10,VWF,MAN1A1,MST1,SPP2,CA1,C1RL,IGKV3-11,HP,SERPIND1,IGLV3-21,FGG,IGKV1-39,F13A1,HBD,AGT,APOL1,C4BPA,HBA1;HBA2,FGA,CPB2,HPR,SERPINC1,IL1RAP,C5,CFD,COLEC10,CST3,IGLV1-47,IGKV2-30,PLG,APOC3,IGHG2,APOM,IGKC,KNG1,A1BG,IGFALS,SAA4,IGHM,F13B。
3.根据权利要求1所述的一种胃癌筛查血清生物标志物群,其特征在于,所述胃癌筛查血清生物标志物群选择为以下所有蛋白的组合:
COMP,HBB,PON1,APOC1,AFM,MPO,APOA4,APOB,C9,APOH,F2,APOA2,LRG1,PTGDS,CA1,IGKV1-39,F13A1,HBD,FGB,FGG,FGA,MAN1A1,KNG1,CPB2,A1BG,IGFALS,CST3。
4.权利要求1-3中任一项所述的胃癌筛查血清生物标志物群的确定方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)在血清样本中对潜在生物标志物群进行靶向质谱定量数据采集;
(2)对质谱数据进行预处理,获得蛋白定量矩阵;
(3)特征蛋白选择,特征蛋白构成所述胃癌筛查血清生物标志物群。
5.根据权利要求4所述的胃癌筛查血清生物标志物群的确定方法,其特征在于,在血清样本中对潜在生物标志物群进行靶向质谱定量数据采集的方法包括以下步骤:
(1)血清样本前处理:对血清样本进行酶解,得到多肽溶液,干燥后,用质谱纯的甲酸水溶液重溶,将多肽溶液稀释,等待质谱检测;
(2)潜在生物标志物群的选择:挖掘文献筛选胃癌患者癌组织与癌旁组织差异表达蛋白,通过生物信息学分析预测可能分泌的蛋白,形成潜在生物标志物列表;
(3)蛋白定量数据采集:多肽溶液通过timTOF pro质谱仪的LC-prmPASEF模式进行数据采集得到蛋白质矩阵结果,其中蛋白质矩阵结果是对样本中检测到的蛋白进行相对定量,每个蛋白得到相应的检测强度值。
6.根据权利要求5所述的胃癌筛查血清生物标志物群的确定方法,其特征在于,步骤(3)中,LC-prmPASEF的色谱条件为60min梯度,质谱条件为:扫描范围:300-1400,离子淌度范围:0.65-1.35Vs/cm2,TIMS管的累积时间和分离时间均为50ms。
7.根据权利要求4所述的胃癌筛查血清生物标志物群的确定方法,其特征在于,对质谱数据进行预处理,获得蛋白定量矩阵的方法为:
所有的prmPASEF质谱数据均使用Skyline软件进行处理,并结合标准肽段的保留时间和离子对信息,手动检查血清样本中每个肽段的提取时间和离子对,以确保正确的峰检测和准确的积分面积,每种蛋白的定量值以峰面积进行测定。
8.根据权利要求4所述的胃癌筛查血清生物标志物群的确定方法,其特征在于,特征蛋白选择方法为:
以t检验比较胃癌患者与正常人的血清蛋白质组定量矩阵,初步筛选两组间存在显著差异的特征蛋白,作为新的矩阵,再利用SVM built-in算法进行进一步的特征筛选,特征蛋白构成所述胃癌筛查血清生物标志物群。
9.权利要求1-3中任一项所述的胃癌筛查血清生物标志物群在建立胃癌筛查方法或胃癌筛查模型中的应用。
10.一种胃癌筛查试剂盒,其特征在于,所述胃癌筛查试剂盒对血清中权利要求1-3中任一项所述胃癌筛查血清生物标志物群进行靶向质谱定量数据采集,代入胃癌筛查模型,得出受检者患胃癌的风险程度;
所述胃癌筛查模型,采用如下方法建立:
使用所述胃癌筛查血清生物标志物群的定量矩阵作为特征属性,用于基于线性支持向量机算法的胃癌筛查模型建立。
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