JP6979712B2 - ヒトサンプル中のタンパク質を検出する方法及びその方法の使用 - Google Patents
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Description
被験者の血清、血漿、又は血液、好ましくは血清を、好ましくは被験者の血清、血漿、又は血液の希釈後に、それぞれのタンパク質についての少なくとも1つ、好ましくは2つの(好ましくはサンドイッチアプローチを使用する)親和性試薬に接触させ、それぞれのタンパク質と少なくとも1つ(又は、2つ)の親和性試薬との間で結合が起こるかどうかを検出し、それぞれのタンパク質の濃度の定量的読出し、又は遊離型PSAの場合にはその割合%fPSA値を使用し、元の血清、血漿、又は血液中のそれぞれの濃度の計算を可能にすることによって実施される、第1のステップと、
上記第1のステップにて決定された全てのタンパク質の濃度及び遊離型PSA割合に基づいて、組合せ式スコア値を計算する第2のステップと、
を含む。
β0、4.0〜5.5又は4.5〜5.0の範囲内、好ましくは、4.5〜5.0又は4.7〜4.8の範囲内;
βTHBS1、(−0.00012)〜(−0.00003)又は(−0.00009)〜(−0.00003)の範囲内、好ましくは、(−0.00009)〜(−0.00004)又は(−0.00006)〜(−0.00004)の範囲内;
β%fPSA、(−7.5)〜(−2.5)の範囲内、好ましくは、(−5.5)〜(−5.0)の範囲内。
β0、3〜4.2又は3〜3.4の範囲内、好ましくは、3.8〜4.0又は3.1〜3.3の範囲内;
βCTSD、0.003〜0.05又は0.005〜0.05の範囲内、好ましくは、0.004〜0.006又は0.008〜0.012の範囲内;
βTHBS1、(−0.0002)〜(−0.00005)又は(−0.00009)〜(−0.00003)の範囲内、好ましくは、(−0.00012)〜(−0.00008)又は(−0.00007)〜(−0.00006)の範囲内;
β%fPSA、(−7.5)〜(−2.5)の範囲内、好ましくは、(−5.2)〜(−5.0)又は(−5.2)〜(−4.5)の範囲内。
β0、4.0〜5.2の範囲内、好ましくは、4.4〜4.8の範囲内;
βOLFM4、0.001〜0.01の範囲内、好ましくは、0.002〜0.004の範囲内;
βTHBS1、(−0.00009)〜(−0.00002)の範囲内、好ましくは、(−0.00006)〜(−0.00004)の範囲内;
β%fPSA、(−7.5)〜(−2.5)の範囲内、好ましくは、(−5.9)〜(−4.8)の範囲内。
β0、4.0〜5.2の範囲内、好ましくは、4.6〜4.9の範囲内;
βICAM1、(−0.002)〜(−0.0001)の範囲内、好ましくは、(−0.0010)〜(−0.0005)の範囲内;
βTHBS1、(−0.0001)〜(−0.00001)の範囲内、好ましくは、(−0.00008)〜(−0.00004)の範囲内;
β%fPSA、(−7.5)〜(−2.5)の範囲内、好ましくは、(−5.8)〜(−4.9)の範囲内。
β0、3〜3.8の範囲内、好ましくは、3.5〜3.6の範囲内;
βOLFM4、0.001〜0.003の範囲内、好ましくは、0.0015〜0.0025の範囲内;
βICAM1、(−0.004)〜(−0.002)の範囲内、好ましくは、(−0.0035)〜(−0.00025)の範囲内;
βCTSD、0.005〜0.05の範囲内、好ましくは、0.008〜0.012の範囲内;
βTHBS1、(−0.00009)〜(−0.00003)の範囲内、好ましくは、(−0.00007)〜(−0.00006)の範囲内;
β%fPSA、(−7.5)〜(−2.5)の範囲内、好ましくは、(−5.2)〜(−4.8)の範囲内。
本明細書で一般に使用される遺伝子名、エントリー名、タンパク質名(短縮名)、及び受託番号は、UniProtコンソーシアム(www.uniprot.org)に従って規定される。UniProtコンソーシアムは、欧州バイオインフォマティクス研究所(EBI:European Bioinformatics Institute)、スイスバイオインフォマティクス研究所(SIB:Swiss Institute of Bioinformatics)、及びタンパク質情報リソース(PIR:Protein Information Resource)からなる。注記される又は予測される細胞局在化は、Emanuelsson O, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H. (2007) Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nat Protoc. 2, 953-71による。
発現
組換えヒトCTSD(残基1〜412、6Hisタグが続く)、ICAM1(残基1〜480、8Hisタグが続く)、THBS1(残基19から1170、シグナルペプチドが先行し、11Hisタグが続く)、及びOLFM4(残基1〜510)がそれぞれ発現され、トランスフェクションされたHEK293細胞の細胞培養上清から精製した。CTSD、ICAM1、THBS1は、His Trapカラム(GE Healthcare)を使用して精製された。
ICAM1の場合、硫酸アンモニウム沈殿を最初に実施した。35%でのタンパク質沈殿を、遠心分離によって除いた。上清を、清浄なチューブに移し、硫酸アンモニウムを、75%飽和に達するまで徐々に添加した。遠心分離後、上清を削除し、ペレットを、His Trapカラム上で精製するために緩衝液中に溶解した。
捕捉抗体及び検出抗体は、それぞれ、ヒトCTSD、ICAM1、OLFM4、及び天然のTHBS1の組換えタンパク質を用いたBALB/cマウスの免疫化によって生成されたマウスモノクロナール抗体であった。それぞれのタンパク質の異なるエピトープを認識する多数の抗体は、単離され、抗体対が、それぞれ、サンドイッチビーズベースイムノアッセイ及びELISAイムノアッセイのその後の開発及び最適化のために選択された。
ビーズベースサンドイッチイムノアッセイは、次の通りにLuminexシステム上で確立された。捕捉抗体は、カルボキシル化されたLuminexマイクロ粒子に共有結合され、検出抗体は、標準法に従ってビオチン(B)で標識された。96ウェルハーフエリアマイクロタイタープレート(Corning Inc.)は、ELISA用の1×ブロッキング剤(Roche Diagnostics)を用いて最低15分間、ブロッキングされた。捕捉抗体でコーティング済みのマイクロ粒子とビオチン化済みの検出抗体との適切な濃度の混合物が、調製され、96ウェルプレート中のアッセイ緩衝液にて希釈されたタンパク質(サンプル又は標準)に添加された。アッセイに依存するEppendorf ThermoMixer C中での21℃又は37℃での60分又は120分のインキュベーション及び650rpmでの振盪に続いて、プレートは、磁気プレートセパレーター(Luminex Corporation)を使用してPBS+0.05%Tween20を用いて洗浄された。アッセイ緩衝液にて希釈されたストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲート(Strep−PE、Moss Inc.)が添加され、Eppendorf ThermoMixer C中で、30分間、21℃で、650rpmでインキュベートされた。洗浄後、ビーズコンジュゲートは、ブロッキング剤中で再懸濁された。読出しは、4パラメーター曲線当てはめ(curve fit)を使用して濃度を計算するために同様に使用されたxPONENT4.1又は4.2ソフトウェアによって操作されるLuminex FlexMap3D又はLuminex MAGPIX機器を用いて実施された。全てのサンプルは、同じプレート上での独立した2重測定(duplicates)で測定された。規定されたタンパク質濃度を有する品質管理サンプルは、それぞれのプレート上に含まれた。
サンドイッチELISAは次の通りに確立された。上記章に記載されたビーズベースイムノアッセイを使用して決定され選択された捕捉抗体は、50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH8.0(代替法:50mM炭酸塩緩衝液、pH9.6)にて希釈され、4℃で一晩(代替法:30℃で75分間又は室温で1時間〜6時間の間)96ウェルMaxisorpプレート(Nunc)にコーティングされた。溶液を取除き、PBS/0.05% Tween20で一回洗浄した後、プレートは、1.5時間の間、BSAブロック(Candor Bioscience)(代替法:1%BSAを有するPBS)でブロッキングされた。プレートは、その後、3回洗浄された。標準又は血清サンプルは、Low Cross Buffer(LCB;Candor Bioscience)(代替法:PBSベース又は10mM Tris、0.9%塩化ナトリウムベース緩衝液、共に、1%BSA、0.1%ウシγグロブリン、0.1%マウスIgGが補われた)にて希釈され、LCB緩衝液にて希釈された上記章に記載されたビーズベースイムノアッセイを使用して決定され選択された等容積のビオチン化された検出抗体とウェル中で混合された。Eppendorf ThermoMixer C中での37℃での60分のインキュベーション及び650rpmでの振盪に続いて、プレートは、PBS/0.05%Tween20を用いて3回洗浄された。ストレプトアビジン−HRPコンジュゲート(Jackson ImmuneResearch)は、LCB(代替法:等容積のPBSにて希釈されたBSAブロック)にて希釈され、Eppendorf ThermoMixer C中に添加され、37℃で30分間インキュベートし、650rpmで振盪した。PBS/0.05%Tween20を用いて3回洗浄した後、TMB基質(Sigma)溶液(30mMクエン酸、pH4.1中で、H2O2を用いて希釈された)(代替法:TMB、すぐに使用できるEnhanced K−Blue TMB基質、Neogen)を添加し、Eppendorf ThermoMixer C中で、37℃で30分間インキュベートし、650rpmで振盪した。反応を、等容積の0.25M H2SO4(代替法:1.0M HCl)の添加によってブロッキングした。吸光度は、450nmで読取り、620nmの読みを減算するFLUOStart Optima ELISAリーダー(BMG LabTech)で測定した。濃度は、FLUOstar OPTIMAソフトウェア又はTecanからのMagellanを用いて5パラメーター曲線当てはめ(代替法:4パラメーター曲線当てはめを使用する)を使用して計算した。
血清総PSA(tPSA)及び遊離型PSA(fPSA)は、ADVIA Centaurイムノアッセイシステム(Siemens Healthcare)を使用して分析された。遊離型PSAのパーセント(%fPSA)は、下記式%fPSA=fPSA/tPSAを用いて、tPSA及びfPSAの測定値を使用して計算された。代替的に、総PSA(tPSA)及び複合型PSA(cPSA)が測定され、遊離型PSAの割合は、次の通りに計算することができる。%fPSA=(tPSA−cPSA)/tPSA。割合fPSA/tPSAは評価のために使用した。
THBS1アッセイの場合、サンプル血清(1:10000の最終希釈の)又は組換え標準は、37℃で60分間、Low Cross Buffer(Candor Bioscience)(LCB、pH7.2)中で捕捉抗体コーティング済みマイクロ粒子及びビオチン化済み検出抗体と共にインキュベートした。全てのサンプルは、アッセイのリニアな検出範囲内で定量したところ、測定された濃度(それぞれのサンプルについてCV<20%、5.1%の1つのプレート上のサンプルについての平均CV)は14.2μg/mLと209μg/mLとの間の範囲であった。
タンパク質バイオマーカーの測定は、外部タンパク質標準に対する当該バイオマーカーの濃度の定量を意味する。即ち、参照標準曲線は、同じサンプルの測定セット中で、アッセイ緩衝液にて希釈された5〜7のタンパク質標準の規定された濃度を測定することによって作成される。
・THBS1(ng/mL):50.00、20.00、8.00、3.20、1.28、0.51、0.20
・CTSD(ng/mL):75.0、2.0、8.33、2.78、0.93、0.31、0.10
・ICAM1(ng/mL):12.6、5.04、2.02、0.81、0.32、0.13、0.05
・OLFM4(ng/mL):120、34.29、9.79、2.79、0.80、0.23、0.07
・THBS1(ng/mL):200又は250,100,50又は40, 25又は16,12.50又は6.4,6.25又は2.6,3.125又は1.0
・CTSD(ng/mL):15.00,10.00,6.25又は6.7, 3.91又は4.4,2.44又は3.0,1.53又は2.0,0.95又は1.3
サンプル血清を、THBS1アッセイについては1:2500の最終希釈で、CTSDアッセイについては1:20の最終希釈で測定した。同様に、CTSDについては1:50の希釈を用いた測定が可能である。
最も低い測定費用で最も高い感度と最も高い特異度を可能にする最適測定戦略を決定するために、カテプシンD(CTSD)、トロンボスポンジン1(THBS1)、オルファクトメジン4(OLFM4)、及び細胞間接着分子1(ICAM1)を含む複数の癌特異的タンパク質を個々に及び種々の組合せで測定する試験が提案される。試験結果は、%fPSA割合(fPSAとtPSAとの比)をさらに含む。組合せ式スコアは、上記で述べた式(1)を使用して計算され、式(1)は、%fPSAと、CTSD、THBS1、OLFM4、及びICAM1のそれぞれの系との数学的組合せ、並びに、%fPSAと、CTSD、THBS1、OLFM4、及びICAM1の対の系との考えられる全ての組合せから得られる。同様に、%fPSAは、CTSD及びTHBS1、オプションで、OLFM4及びICAM1を用いて見られる。試験は、PCa診断の改善における、%fPSA等の確立された臨床パラメーターに対してその付加価値を示す検証研究において評価した。
第1のステップにて、分析される4つのタンパク質が、個々に調査され、最適化された組合せ式スコア値が、それぞれのタンパク質について単独及び%fPSAとの組合せで決定された。
第2のステップにて、分析される4つのタンパク質が、対で調査され、最適化された組合せ式スコア値が、それぞれのタンパク質対について単独で及び%fPSAと組合せて決定された。
図6は、このアプローチについての受信者動作特性(ROC)曲線を示す。%fPSAはAUC=0.6498(P<0.001;95%CI=0.6004〜0.6992)をもたらした。CTSD及びTHBS1は共に、前立腺生検陰性の男性と前立腺生検陽性陽性の男性とを識別し、AUC=0.8343(P<0.001;95%CI=0.7974〜0.8712)であった。%fPSA、CTSD、THBS1の組合せは、AUC=0.8448(P<0.001;95%CI=0.8097〜0.8798)をもたらした。これらの結果は、ELISAを使用してTHBS1及びCTSDを測定することで確認された(図17参照)。CTSD及びTHBS1は共に、前立腺生検陰性の男性と前立腺生検陽性陽性の男性とを識別し、AUC=0.8376(P<0.001;95%CI=0.8010〜0.8742)であった。%fPSA、CTSD、THBS1の組合せは、AUC=0.8508(P<0.001;95%CI=0.8161〜0.8855)をもたらした。前立腺生検陽性、従って、PCaについての90%以上の感度において、%fPSA、CTSD、及びTHBS1の組合せの特異度は60%であった。比較すると、臨床診療において一般に使用される%fPSA試験は、同じ感度において21%の特異度を有していた。これは、%fPSAと組合せたCTSD及びTHBS1が、236名のうちの141名(60%)の生検陰性を回避し、PCaの10%の診断を遅延させたであろうことを示す(図12)。さらに、高悪性度PCa(グリーソンスコア≧7)について94%の高いNPVが達成された。これらの結果は、%fPSA、CTSD、及びTHBS1の組合せが有意の改善をもたらすことを示す。
これら全ての結果において使用されるロジスティック回帰モデルは、式(1)において使用される係数の推定値を提供する:
β0=4.663;βTHBS1=−0.000053;β%fPSA=−5.381。
β0=4.902;βTHBS1=−0.000086;β%fPSA=−5.146。
β0=4.606;βOLFM4=0.00271;βTHBS1=−0.000054;β%fPSA=−5.423。
β0=4.769;βICAM1=−0.00084;βTHBS1=−0.000053;β%fPSA=−5.395。
図13は、このアプローチについての受信者動作特性(ROC)曲線を示す。%fPSAはAUC=0.6498(P<0.001;95%CI=0.6004〜0.6992)をもたらした。CTSD、THBS1、OLFM4、及びICAM1は共に、前立腺生検陰性の男性と前立腺生検陽性陽性の男性を識別し、AUC=0.8345(P<0.001;95%CI=0.7978〜0.8713)であった。%fPSA、CTSD、THBS1、OLFM4、及びICAM1の組合せは、AUC=0.8463(P<0.001;95%CI=0.8122〜0.8817)をもたらした。
β0=3.567;βOLFM4=0.002;βTHBS1=−0.000063;βCTSD=0.01;βICAM1=−0.003;β%fPSA=−5.033。
予想外に、THBS1及び%fPSAの組合せ、さらに、CTSD、THBS1、及び%fPSAの組合せが、高いtPSA(2ng/mL〜10ng/mL)、増大した前立腺(≧35ml)、及び陰性DREを有する男性におけるPCaの非存在を判定するときに、tPSA又は%fPSA単独より有意に正確である。臨床診療におけるこれらの3つのパラメーターを含む試験の実施は、不必要な生検率を最大60%だけ大幅に下げる可能性を有する。
Claims (33)
- 被験者の前立腺癌を示す健康状態に関する情報を収集する方法であって、前記被験者の血清、血漿、又は血液におけるTHBS1(thrombospondin 1)の濃度及び遊離型PSAの割合(%fPSA)(PSA;前立腺特異抗原)の定量的検出を含む、方法。
- 前記被験者の血清、血漿、又は血液におけるTHBS1の濃度、遊離型PSAの割合(%fPSA)、及び、CTSD、OLFM4、ICAM1からなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質の濃度の定量的検出を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記被験者の血清、血漿、又は血液を、それぞれのタンパク質についての少なくとも1つ又は2つの親和性試薬に接触させること、及び、前記それぞれのタンパク質と前記少なくとも1つ又は2つの親和性試薬との間で結合が起こるかどうかを検出すること、及び、前記それぞれのタンパク質の濃度の定量的読出しを使用し、元の血清、血漿、若しくは血液中のそれぞれの濃度、又は、遊離型PSAの場合、遊離型PSAの割合の計算を可能にすることによって実施される、第1のステップと、
前記第1のステップにて決定された前記全てのタンパク質濃度及び前記遊離型PSA割合に基づいて、組合せ式スコア値を計算する第2のステップと、
を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記被験者の血清、血漿、又は血液を、前記被験者の血清、血漿、又は血液の希釈後に、それぞれのタンパク質についての少なくとも1つ又は2つの親和性試薬に接触させること、及び、前記それぞれのタンパク質と前記少なくとも1つ又は2つの親和性試薬との間で結合が起こるかどうかを検出すること、及び、前記それぞれのタンパク質の濃度の定量的読出しを使用し、元の血清、血漿、若しくは血液中のそれぞれの濃度、又は、遊離型PSAの場合、遊離型PSAの割合の計算を可能にすることによって実施される、第1のステップと、
前記第1のステップにて決定された前記全てのタンパク質濃度及び前記遊離型PSA割合に基づいて、組合せ式スコア値を計算する第2のステップと、
を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記第2のステップ後に、第3のステップにおいて、前記被験者の生検陽性及び/又は前立腺癌陽性のリスクは、前記第2のステップにて決定された前記組合せ式スコア値に基づいて判定され、前記組合せ式スコア値の対応する閾値を超えることは、前立腺癌陽性の情報として及び/又は生検が必要であると考えられる、請求項3又は4に記載の方法。
- THBS1の濃度(ng/mLで表される)並びに遊離型PSAの割合(0〜1の数値範囲内で表される)(%fPSA)は前記第1のステップで測定される、請求項6に記載の方法。
- THBS1の濃度(ng/mLで表される)並びに遊離型PSAの割合(0〜1の数値範囲内で表される)(%fPSA)及びさらにはCTSDの濃度(ng/mLで表される)は前記第1のステップで測定される、請求項6に記載の方法。
- 前記組合せ式スコア値の計算について、THBS1及び遊離型PSAの割合(%fPSA)を測定する場合、前記回帰係数は、次の通りに選択される、請求項7又は8に記載の方法:
β 0 、4.0〜5.5又は4.5〜5.0の範囲内、あるいは、4.5〜5.0又は4.7〜4.8の範囲内;
β THBS1 、(−0.00012)〜(−0.00003)又は(−0.00009)〜(−0.00003)の範囲内、あるいは、(−0.00009)〜(−0.00004)又は(−0.00006)〜(−0.00004)の範囲内;
β %fPSA 、(−7.5)〜(−2.5)の範囲内、又は、(−5.5)〜(−5.0)の範囲内。 - 90%感度で、0.28〜0.35、又は、0.30〜0.34又は0.30〜0.33の前記組合せ式スコア値の閾値が選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記組合せ式スコア値の計算について、THBS1、遊離型PSAの割合(%fPSA)、及びCTSDを測定する場合、前記回帰係数は、次の通りに選択される、請求項8に記載の方法:
β 0 、3〜4.2又は3〜3.4の範囲内、あるいは、3.8〜4.0又は3.1〜3.3の範囲内;
β CTSD 、0.003〜0.05又は0.005〜0.05の範囲内、あるいは、0.004〜0.006又は0.008〜0.012の範囲内;
β THBS1 、(−0.0002)〜(−0.00005)又は(−0.00009)〜(−0.00003)の範囲内、あるいは、(−0.00012)〜(−0.00008)又は(−0.00007)〜(−0.00006)の範囲内;
β %fPSA 、(−7.5)〜(−2.5)の範囲内、又は、(−5.2)〜(−5.0)又は(−5.2)〜(−2.5)の範囲内。 - 90%感度で、0.28〜0.40又は0.28〜0.35、あるいは、0.35〜0.37又は0.33〜0.34の前記組合せ式スコア値の閾値が選択される、請求項11に記載の方法。
- THBS1の濃度(ng/mLで表される)、遊離型PSAの割合(0〜1の数値範囲内で表される)(%fPSA)、及びOLFM4の濃度(ng/mLで表される)は前記第1のステップで測定される、請求項6に記載の方法。
- THBS1の濃度(ng/mLで表される)、遊離型PSAの割合(0〜1の数値範囲内で表される)(%fPSA)、及びOLFM4の濃度(ng/mLで表される)は前記第1のステップで測定され、前記組合せ式スコア値の計算について、前記回帰係数は、次の通りに選択される、請求項6に記載の方法:
β 0 、4.0〜5.2の範囲内、又は、4.4〜4.8の範囲内;
β OLFM4 、0.001〜0.01の範囲内、又は、0.002〜0.004の範囲内;
β THBS1 、(−0.00009)〜(−0.00002)の範囲内、又は、(−0.00006)〜(−0.00004)の範囲内;
β %fPSA 、(−7.5)〜(−2.5)の範囲内、又は、(−5.9)〜(−4.8)の範囲内。 - 90%感度で、0.27〜0.35、又は、0.3〜0.34の前記組合せ式スコア値の閾値が選択される、請求項14に記載の方法。
- THBS1の濃度(ng/mLで表される)、遊離型PSAの割合(0〜1の数値範囲内で表される)(%fPSA)、及びICAM1の濃度(ng/mLで表される)は前記第1のステップで測定される、請求項6に記載の方法。
- 前記組合せ式スコア値の計算について、前記回帰係数は、次の通りに選択される、請求項16に記載の方法:
β 0 、4.0〜5.2の範囲内、又は、4.6〜4.9の範囲内;
β ICAM1 、(−0.002)〜(−0.0001)の範囲内、又は、(−0.0010)〜(−0.0005)の範囲内;
β THBS1 、(−0.0001)〜(−0.00001)の範囲内、又は、(−0.00008)〜(−0.00004)の範囲内;
β %fPSA 、(−7.5)〜(−2.5)の範囲内、又は、(−5.8)〜(−4.9)の範囲内。 - 90%感度で、0.25〜0.35、又は、0.3〜0.33の前記組合せ式スコア値の閾値が選択される、請求項17に記載の方法。
- THBS1の濃度(ng/mLで表される)、遊離型PSAの割合(0〜1の数値範囲内で表される)(%fPSA)、並びにOLFM4、ICAM1、及びCTSDの濃度(それぞれng/mLで表される)は前記第1のステップで測定される、請求項6に記載の方法。
- 前記組合せ式スコア値の計算について、前記回帰係数は、次の通りに選択される、請求項19に記載の方法:
β 0 、3〜3.8の範囲内、又は、3.5〜3.6の範囲内;
β OLFM4 、0.001〜0.003の範囲内、又は、0.0015〜0.0025の範囲内;
β ICAM1 、(−0.004)〜(−0.002)の範囲内、又は、(−0.0035)〜(−0.00025)の範囲内;
β CTSD 、0.005〜0.05の範囲内、又は、0.008〜0.012の範囲内;
β THBS1 、(−0.00009)〜(−0.00003)の範囲内、又は、(−0.00007)〜(−0.00006)の範囲内;
β %fPSA 、(−7.5)〜(−2.5)の範囲内、又は、(−5.2)〜(−4.8)の範囲内。 - 90%感度で、0.3〜0.35、又は、0.32〜0.335の前記組合せ式スコア値の閾値が選択される、請求項20に記載の方法。
- 測定されるTHBS1及び/又はCTSD、OLFM4、ICAM1の少なくとも1つは、グリコシル化、リン酸化、脂質化を含む翻訳後修飾を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- THBS1、CTSD、OLFM4、ICAM1の少なくとも1つの濃度の測定について、前記被験者の血清、血漿、又は血液は、7〜7.4の範囲内のpH値を有する緩衝液であって、pH値を制御する試薬を含む緩衝液を用いて希釈される、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- THBS1、CTSD、OLFM4、ICAM1の少なくとも1つの濃度の測定について、前記被験者の血清、血漿、又は血液は、7〜7.4の範囲内のpH値を有する緩衝液であって、以下の系の少なくとも1つから選択されるpH値を制御する試薬を含み、以下の少なくとも1つの系から選択される添加成分を含むか又は含まない緩衝液を用いて希釈され、
前記pHを制御する試薬の系が、
Tris(トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン)、
Pipes(ピペラジン−1,4−ビス−2−エタンスルホン酸)、
Mes(4−モルホリノエタンスルホン酸)、
Hepes(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジン−エタンスルホン酸)、
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)から選択され、
前記添加成分の系が、
0.01%(v/v)〜0.1%(v/v)、又は、0.025%(v/v)〜0.05%(v/v)の、ドデシルポリ(エチレングリコールエーテル) m (mは5〜40の整数);1−O−n−オクチル−β−D−グルコピラノシド(n−オクチルグリコシド);アルキルフェノールポリ(エチレングリコール−エーテル) m (mは5〜40の整数、又はm=11);1−O−n−ドデシル−β−D−グルコピラノシル(1−4)α−D−グルコピラノシド;ドデシルポリ−(エチレングリコールエーテル) m (mは5〜40の整数、又はm=23);ポリ(オキシエチレン)(20)−ソルビタンモノオレエート、ポリ(オキシエチレン)(20)−ソルビタンモノラウレート、ポリ(オキシエチレン)(20)−ソルビタンモノパルミテート、ポリ(オキシエチレン)(20)−ソルビタンモノステアレートから選択されるポリ(オキシエチレン)(20)−ソルビタンモノ脂肪酸エステル;オクチルフェノールポリ(エチレングリコールエーテル) m (mは5〜40の整数、又はm=10)からなる群の少なくとも1つから選択される非イオン性界面活性剤(non-ionic detergent);ウシ血清アルブミン;マウスIgG;ウシγグロブリン;ウシ胎児血清;ウマ血清から選択される、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。 - 前記緩衝液は、50mM〜850mMの範囲内、又は200mM〜400mMの範囲内又は250mM〜370mMの範囲内のイオン強度を有する、請求項23又は24に記載の方法。
- THBS1を測定するための希釈については、1:1000〜1:20000の範囲内の希釈係数が選択され、又は、酵素結合免疫吸着アッセイについては1:1000〜1:3000又は1:2000〜1:3000の範囲内の希釈係数が、また、ビーズベースアッセイについては1:5000〜1:15000の範囲内の希釈係数が選択され、
及び/又は、タンパク質CTSDを測定するための希釈については、1:5〜1:70又は1:5〜1:30の範囲内の希釈係数が選択され、又は、酵素結合免疫吸着アッセイについては1:10〜1:50又は1:10〜1:30の範囲内の希釈係数が、また、ビーズベースアッセイについては1:10〜1:20の範囲内の希釈係数が選択され、
使用される緩衝液に、ポリ(オキシエチレン)(20)−ソルビタンモノラウレートとして選択される非イオン性界面活性剤をさらに補い、0.05%(v/v)のポリ(オキシエチレン)(20)−ソルビタンモノラウレートの更なる濃度をもたらすか、又は、前記非イオン性界面活性剤を補わず、
及び/又は、ICAM1を測定するための希釈については、1:50〜1:200の範囲内、又は、1:80〜1:150の範囲内の希釈係数が選択され、使用される緩衝液に、250mMの更なる塩化ナトリウム含量になるように塩化ナトリウムをさらに補うか、又は、補わず、
及び/又は、OLFM4を測定するための希釈については、1:5〜1:30の範囲内、又は、1:5〜1:20の範囲内の希釈係数が選択され、使用される緩衝液に、250mMの更なる塩化ナトリウム含量になるように塩化ナトリウム及びジチオトレイトールとして選択される還元剤をさらに補い、ジチオトレイトールの5mMの濃度をもたらすか、又は、前記還元剤を補わない、請求項23〜25のいずれか1項に記載の方法。 - 前記方法は、前記被験者の血清、血漿、又は血液を、それぞれのタンパク質についての少なくとも1つの親和性試薬に接触させること、及び、前記それぞれのタンパク質と前記少なくとも1つの親和性試薬との間で結合が起こるかどうかを検出すること、及び、前記それぞれのタンパク質濃度又は遊離型PSAの場合にはその割合の定量的読出しを使用し、元の血清、血漿、又は血液中のそれぞれの濃度の計算を可能にすることによって実施される、第1のステップを含み、
前記ステップにおいて、前記それぞれのタンパク質に特異的なサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ及び/又は前記それぞれのタンパク質に対するサンドイッチビーズベース抗体アッセイが使用される、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。 - 前記方法は、前記被験者の血清、血漿、又は血液を、前記被験者の血清、血漿、又は血液の希釈後に、それぞれのタンパク質についての少なくとも1つの親和性試薬に接触させること、及び、前記それぞれのタンパク質と前記少なくとも1つの親和性試薬との間で結合が起こるかどうかを検出すること、及び、前記それぞれのタンパク質濃度又は遊離型PSAの場合にはその割合の定量的読出しを使用し、元の血清、血漿、又は血液中のそれぞれの濃度の計算を可能にすることによって実施される、第1のステップを含み、
前記ステップにおいて、可視的読出しによる前記それぞれのタンパク質に特異的なサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ及び/又は蛍光読出しによる前記それぞれのタンパク質に対するサンドイッチビーズベース抗体アッセイが使用される、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。 - 前記それぞれのタンパク質に特異的な前記サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ及び/又は前記それぞれのタンパク質に対する前記サンドイッチビーズベース抗体アッセイは、それぞれ、ヒトのTHBS1、CTSD、ICAM1、及びOLFM4の組換えタンパク質、並びに、抗体によるマウスの免疫化によって産生されるマウスのモノクロナール抗体を使用することによって得られるアッセイである、請求項27又は28に記載の方法。
- 可視的読出しによる前記それぞれのタンパク質に特異的な前記サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ及び/又は蛍光読出しによる前記それぞれのタンパク質に対する前記サンドイッチビーズベース抗体アッセイは、それぞれ、ヒトのTHBS1、CTSD、ICAM1、及びOLFM4の組換えタンパク質、並びに、抗体によるマウスの免疫化によって産生されるマウスのモノクロナール抗体を使用することによって得られるアッセイである、請求項27又は28に記載の方法。
- 前記それぞれの濃度の定量的検出は、外部タンパク質標準に対するバイオマーカーの濃度の測定を含み、前記測定は、前記サンプルと同一の測定セットにおいて測定されるタンパク質希釈物に用いるのと同じ緩衝液にて希釈された幾つかのタンパク質標準の規定された濃度を測定することによる参照標準曲線の作成を含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記それぞれの濃度の定量的検出は、外部タンパク質標準に対するバイオマーカーの濃度の測定を含み、前記測定は、前記サンプルと同一の測定セットにおいて測定されるタンパク質希釈物に用いるのと同じ緩衝液にて希釈された5〜7のタンパク質標準の規定された濃度を測定することによる参照標準曲線の作成を含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 限局性前立腺癌を含む前立腺癌の、モニタリング、診断、前立腺生検結果の予測、予後診断、リスク評価、治療選択、治療モニタリングのうちの少なくとも1つのステップ、又は、限局性前立腺癌を含む前立腺癌の、モニタリング、診断、前立腺生検結果の予測、予後診断、リスク評価、治療選択、治療モニタリングのうちの少なくとも1つのための請求項1〜32のいずれか1項による方法の使用を含む、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
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