KR20190029679A - 인간 샘플에서의 단백질 검출 방법 및 그 방법의 용도 - Google Patents

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Abstract

개체의 혈청, 혈장 또는 혈액에서, CTSD, OLFM4, ICAM1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도를 비롯하여, THBS1의 농도, 유리 PSA의 비율 (%fPSA)을 정량적으로 검출하는 단계를 포함하는 개체의 건강 상태에 대한 정보를 수집하는 방법을 개시한다.

Description

인간 샘플에서의 단백질 검출 방법 및 그 방법의 용도
본 발명은 인간 샘플에서, 특히 인간 혈청, 혈장 또는 혈액에서 단백질을 측정하는 분야에 관한 것이며, 또한 분석 및 특히 위험도 평가를 위한 분석의 용도에 관한 것이다.
인간의 샘플에서 단백질 측정은, 특히, 인간의 영양 상태 및 건강 상태와 관련하여 전반적인 상태를 감독하고, 위험도를 평가하기 위한 강력한 도구이다.
전립선 암 (PCa)은 남성에서 가장 흔히 진단되는 암으로서, 미국에서 암 관련 사망 원인의 2위를 차지하고 있다.
10년간의 연구 노력에도 불구하고, 전립선 암의 진단 및 치료는 임상에서 여전히 주요 도전 과제로 남아 있다. PCa의 진행은 불행히도 증상이 없고, 질환의 완전한 관해 및 치유가 질환의 초기 단계에만 가능하기 때문에 빠른 진행과 잠재적으로 위험한 병변을 조기 발견하는 것이 환자의 건강에 결정적이다.
PCa에서 이용가능한 최상의 비-침습적인 진단 검사는 디지털 직장 검사 (DRE)와 더불어 혈액에서 전립선 특이 항원 (PSA)을 검출하는 방법이다. PSA는 칼리크레인 III, 세미닌 (seminin), 세메노겔라제 (semenogelase), γ-세미노단백질 및 P-30 항원으로도 알려져 있으며, 정상 남성의 혈청에 소량 존재하는 34 kD 당단백질로서, PCa 및 기타 전립선 장애 발병시 흔히 증가한다. DRE와 더불어 PSA를 측정하는 혈액 검사가 PCa를 조기 검출하기 위해 현재 이용할 수 있는 가장 효과적인 검사이다. 정상 보다 높은 PSA 수준은 국소 및 전이성 PCa 둘다와 연관되어 있다.
PSA 단독으로는 진단 정확성이 약 60%에 불과하며, 이 방법은 특이도가 매우 좋지 않다 (전립선 생검 또는 수술이 필요없는 위 양성 빈도가 매우 높음). 실제, PSA 농도는, 전립선 감염, 자극, 양성 전립선 비대증 (확대) 또는 과형성증 (BPH) 및 사정 직후 (recent ejaculation)에도 증가할 수 있어, 위 양성 결과가 발생한다.
따라서, PCa 진단은 현재 PSA의 높은 위 양성률로 인해 타격을 받고 있으며, 결과적으로 부정적인 진단 소견으로 높은 빈도로 전립선 생검을 야기할 수 있다. 또한, 이러한 불필요한 생검은 잠재적인 부작용을 유발할 수 있다. PSA를 이용한 광범위한 남성 PCa 스크리닝에 반하는 최근 권고로, PCa 진단을 위해 스크리닝을 받는 남성의 수가 적어졌으며, 초기 단계에서 검출되는 경우가 줄어들었다.
다양한 파라미터들 (예, 유리 PSA 및 총 PSA)에 대한 동시 측정에 기반한 새로운 방법들이 전체 진단 정확성을 높이기 위한 도구로서 부상하고 있지만, 위 양성 및 위 음성 결과를 방지하는 신뢰할 수 있는 비-침습적인 진단/예후 예측 절차는 여전히 부족한 실정이다. 대부분의 혈중 PSA는 혈청 단백질에 결합되어 있다. 소량만 단백질에 결합하지 않은 형태이며, 이를 유리 PSA라 한다. 전립선 암에 걸린 남성에서는, 유리 (비-결합된) PSA / 총 PSA의 비율이 낮다. 만일, 유리 PSA/총 PSA 비율 (%fPSA)이 25% 미만이라면, 암 위험도가 높다. 이 비율이 낮을수록, PCa일 가능성이 높아진다. 그러나, 총 PSA와 유리 PSA 둘다 사정 직후에 증가하고, 24시간내에 기저 수준으로 서서히 회복되며, 또한 PCa와 관련없는 기타 기전들도 유리 PSA/총 PSA 비율에 영향을 미칠 수 있다.
PCa 진단을 향상시키고 불필요한 생검 및 과잉 치료를 줄이기 위해, 새로운 진단 도구, 이상적으로는 비-침습적인 도구가 시급하게 요구되고 있다. 혈액과 같이 쉽게 접근할 수 있는 샘플에 대한 보다 정확한 진단은 의사 및 환자가 잠재적인 PCa 사례와 전립선 생검의 필요성 여부에 대하여 충분한 정보를 토대로 결정할 수 있게 해줄 것이다.
진단과 마찬가지로, PCa의 치료 및/또는 예후 역시 질환의 이질성 (heterogeneity)으로 인해 주요한 도전 과제로 남아 있다. 여러가지 PCa 기전들이 제안되어 있지만, 치료학적 개입 치유를 위해 환자 및 주요 타겟 단백질을 계층화할 수 있는 적절한 시그니처의 부족은 여전히 해결되지 않고 있다.
전립선 암에 대한 적합한 진단 시스템을 발굴하기 위한 한가지 방법이 WO 2009/138392에서 제안되었는데, 인간 혈액에 존재하는 것으로 알려져 있으며 해당 환자의 건강 상태에 따라 하향 조절 또는 상향 조절될 것으로 예상되는 24개의 단백질 리스트 중 2개 이상을 측정하는 방법이 제시되어 있다.
기존 방법의 문제점은, 낮은 민감도, 특히 암이 실제 존재하는 경우를 고려할 때 특이도 불량, 그리고 위 양성 및 위 음성 결과를 방지해야 한다는 점에서 진단 신뢰성 불량 문제를 여전히 가지고 있다는 것이다. 또 다른 문제는, 항체-기반 검출이든 또는 임의의 다른 유형의 검출이든, 학술적 목적으로 적합할 뿐만 아니라 광범위한 적용에도 적합할 수 있는, 해당 검출 프로브의 실제 이용가능성이다. 또 다른 문제는, 해당 검출 시스템이 단순해야 하며, 개개 측정 단계가 많지 않아야 한다는 것이다.
이에, 본 발명의 과제는 인간 샘플, 특히 인간 혈청, 혈장 또는 혈액에서 개체의 건강 상태에 대한 정보를 수집하는, 특히 단백질을 검출하는 새로운 방법을 제안하는 것이며, 또한 이는 분석, 이러한 분석의 특히 위험도 평가, 특히 PCa 관련 위험도 평가를 위한 용도에 관한 것이다.
인간 카텝신 D (CTSD), 인간 세포간 부착 분자 (ICAM1), 인간 오팍토메딘 4 (human olfactomedin 4,OLFM4) 및 인간 트롬보스포딘 1(thrombospondin 1, THBS1)에 대한 각각의 면역분석법 4가지를 개발하였으며, 기술적으로도 검증하였다. 이들 당단백질의 마우스 상동체 역시 Pten 컨디셔닝화 넉-아웃 마우스 모델 (Pten conditional knock-out mouse model)을 이용한 질량 분광측정을 통해 이미 동정하였다. 인간 상동체를, 그 자체만으로 또는 PSA 값과의 조합에 의해, 특히 %fPSA 값과의 조합에 의해, 양성 전립선 병태를 PCa로부터 구별할 수 있는 능력을 검사하기 위해, 임상 혈청 샘플에서 측정하였다. 그 결과, 이러한 조합이 전술한 종래 방법의 문제점들을 해결하는데 최적이라는 것을 알게 되었다.
보다 구체적으로, 본 발명은 개체의 건강 상태에 대한 정보를 수집하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 개체의 혈청, 혈액 또는 혈장 내에서 특정 단백질을 정량적으로 검출하는 것을 포함한다. 또한, 개체의 혈청, 혈액 또는 혈장은, 개체로부터 채취된 후, 본 발명을 수행하기 전에, 보관되거나, 및/또는 전처리, 예를 들어 희석될 수 있다. 특히, 본 방법은 THBS1의 농도 측정 뿐만 아니라 유리 PSA의 비율 측정/결정 (%fPSA, [유리 PSA] / [총 PSA]로 제시됨, 이는 0-1의 숫자 범위로 표시됨)을 포함한다. 바람직하게는, 이는, CTSD, OLFM4, ICAM1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도 측정을 추가로 포함한다. 다시 말해, 2 이상 또는 바람직하게는 3 이상의 단백질의 함량을 정보 수집을 위해 샘플에서 측정/결정한다. THBS1, CTSD, OLFM4 및/또는 ICAM1의 경우, 농도는 직접 또는 간접 측정되며, 전형적으로 ng/ml로 표시되며, PSA의 경우에는, 총 PSA 및 유리 PSA의 농도를 정량함으로써 (또는 다른 예로 총 PSA 및 복합 PSA의 농도를 정량하고, 이로부터 유리 PSA의 비율을 계산함으로써) 유리 PSA의 비율을 결정하며, 이를 분석에 이용한다. 이러한 분석에서는, 바람직하게는 오리지날 샘플, 즉 오리지날 혈청, 혈액 또는 혈장 내 농도 값이 사용되며, 오리지날 혈청, 혈액 또는 혈장을 측정 전 희석 또는 변형시키는 단계가 존재할 경우, 오리지날 샘플 내 농도를 역으로 계산한다.
예상치 못하게도, THBS1의 농도가, 유리 PSA의 비율 (%fPSA)과 조합하여, 양성의 전립선 생검을, 즉 PCa를 강하게 시사한다는 것을, 발견하였다. 예상치 못하게도, THBS1이, 총 PSA와의 조합없이, 특히 %fPSA와 조합하여, 해당 개체의 건강 상태에 대한 유용한 정보를 결정할 수 있게 한다는 것도 발견하였다. 대규모 코호트를 대상으로 수행된 분석에서, 최적화된 로지스틱 회귀 모델을 이용해, 모수화 (parameterization)가, 수신자 작동 특징 (receiver operating characteristic, ROC) 곡선에서 상당히 넓은 곡선 하 면적 (AUC) 및 90% 민감도에서 특히 높은 특이도로 확인될 수 있는 것으로, 나타났다. 아울러, 부가적인 시스템 CTSD, OLFM4, ICAM1 중 임의 시스템은, 이러한 코호트에서 단독으로 평가 및 최적화하고 %fPSA 비율과 함께 다시 평가 및 최적화할 경우, 높은 AUC를 수득할 수 없다는 것을 확인하였다. 그러나, 특히 그룹 CTSD, OLFM4, ICAM1 중 다른 하나, 특히 CTSD를 THBS1과 함께, 그리고 %fPSA와 조합하여 측정할 경우, 90% 민감도 수준에서 유의한 부가적인 특이도를 달성할 수 있다.
또한, 해당 환자의 나이와 같은 정보를 분석에 추가로 포함시키는 것도 가능하며, 나이와 같은 부가적인 정보는 또한 아래 식 (1)에서 추가의 파라미터로서 사용될 수도 있다.
전형적으로, 본 방법은 증가된 PSA (2.0 및 10 ng/ml) 값을 가진, 바람직하게는 추가적으로 네거티브 DRE 및/또는 전립선 비대 (enlarged prostate) (≥35 ml) 개체를 대상으로 수행된다.
제안된 방법에 대한 제1 바람직한 구현예에서, 본 방법은,
개체의 혈청, 혈장 또는 혈액을, 바람직하게는 이의 희석 후, 하나 이상의, 바람직하게는 각 단백질에 대한 2개 이상의 친화성 물질 (affinity reagent)(들)과 접촉시키고, 해당 단백질과 하나 이상의 (또는 2 이상의) 친화성 물질(들) 간에 결합이 이루어졌는 지를 검출하고, 해당 단백질의 농도에 대한 정량적인 데이터 (quantitative readout)를 이용하여, 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액에서 해당 농도 또는 유리 PSA의 경우 이의 비율을 계산함으로써, 수행되는 제1 단계;
제1 단계에서 결정된 단백질의 농도 및 유리 PSA의 비율을 기초로, 조합된 스코어 수치 (combined score value)를 계산하는 제2 단계를 포함한다.
단백질 농도 뿐만 아니라 유리 PSA 비율은 전형적으로 각각, 예를 들어 각각 면역분석으로 측정하며, 이후 결정된 농도/비율은 조합된 스코어 수치를 계산하기 위해 조합된 방식으로 사용된다. 그래서, 측정된 정보는 개별적으로 사용되지 않고, 조합된 스코어 수치를 결정하고 정보에 대한 추가적인 분석을 위해 조합된 방식으로 사용된다.
더 바람직하게는, 제2 단계 후, 제3 단계에서, 개체가 양성 전립선 생검, 즉 PCa일 위험성은 제2 단계에서 결정된 조합된 스코어 수치를 기초로 결정될 수 있으며, 이때 조합된 스코어 수치가 해당 역치 값 보다 클 경우, 이는 양성 생검의 예측 (질병의 존재 또는 정도를 결정하기 위한 검사용 샘플 조직 추출을 의미함, 이때 조직은 예를 들어 병리학자에 의해 현미경 검경하며, 양성은 검사 대상자에 암이 존재한다는 결론으로 이어짐)으로서 간주되며, 따라서 확증 생검 (confirmatory biopsy)이 필요한 PCa 양성 정보로서 간주된다.
조합된 스코어 수치는 바람직하게는 하기 식으로 계산된다:
Figure pct00001
상기 식에서, βi는, 실험 데이타를 이용하여, ROC 방식에서, AUC의 최적화, 전형적으로 최대화 (maximization)를 통해 미리 결정된 회귀 계수이고, β0는 절편 (intercept)이고, x i는 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액에서 해당 단백질의 측정 농도 (ng/ml)이고, %fPSA의 경우 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액에서의 유리 PSA/총 PSA의 비율 (0-1로 표시됨)이다. 따라서, 이때 지수 i는, 오직 THB1 및 %fPSA 값만 사용하는 경우에는 0 내지 적어도 2이고, 상기한 군으로부터 유래된 추가의 단백질 농도 값을 측정할 경우에는 0 내지 적어도 3이다.
예를 들어, 조합된 스코어 수치를 계산하기 위해 THBS1, CTSD 및 %fPSA를 측정하는 경우, i는 최대 3이고, β1은 βCTSD이고, x 1은 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액 내 CTSD의 농도이고, β2는 βTHBS1이고, x 2는 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액 내 THBS1의 농도이고, β3는 β%fPSA이고, x 3는 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액 내 유리 PSA 비율이다.
해당되는 로지스틱 회귀 (logistic regression)의 최적화는, 건강 상태에 대한 더욱 상세한 정보를 가지고 있는 개체와 전립선 생검 음성 또는 양성, 즉 PCa 여부를 알고 있는 개체인, 개체들로부터 유래된 혈청, 혈장 또는 혈액에서의 측정값을 이용해 수행된다. 이러한 코호트는, 따라서, ROC 그래프 (ROC representation)에서 최적의 모델을 구하는데 사용되며, 고 민감도에서 가능한 최대 특이도를 달성하기 위해, 최대 AUC를 수득하기 위해 사용된다. 대응되는 파라미터 βi, 즉 회귀 계수는, 이후, 개체의 건강 상태에 대한 확률 명제 (probability statement)를 설정하여 전립선 생검 결과를 예측하기 위해, 건강 상태에 대한 정보가 없는, 임의의 개체에 적용할 수 있다.
단백질의 농도/비율을 측정하고, 이를 상기 식에 대입하여, 조합된 스코어 수치를 구한다. 계산된 조합된 스코어 수치는 이후 역치 값과 비교한다. 역치 값은 원하는 민감도/특이도에 따라 선택될 수 있다. 만일 이 역치 값을 초과한다면, 양성 전립선 생검, 즉 PCa로 진단되며, 생검 진행을 위한 제안서가 함께 제공된다. 원하는 민감도에 대응하는 역치 값은, ROC 그래프에서, 원하는 민감도에 해당하는 곡선 상의 해당 포인트를 선택하고 그 포인트에 대해 조합된 스코어 수치를 취하여, 결정된다. 구체적인 모수화에 대해 하기 제시된 역치 값은 항상 90% 민감도를 제공한다. 제공된 역치 값을 초과할 경우, 이는 전립선 생검 가능성이 높으며, 즉 PCa일 가능성이 높다는 것을 의미하며, 상세히 알아보기 위해 생검이 제안된다.
전립선 생검이 진행 중인 환자 혈청 샘플 474개에 대한 대규모 코호트를 이용해, 최적의 민감도 및 특이도에 대해 다음과 같은 바람직한 모수화를 결정하였으며, 이때 각 사례별로 단백질, 즉 THBS1, CTSD, ICAM1 및 OLFM4 각각의 농도는 ng/ml로서, 오리지날 혈액, 혈청 또는 혈장에서 결정/역-계산된 값으로서 식에 대입되며, 유리 PSA의 비율 (%fPSA)은 0-1 범위의 숫자로 사용된다:
제1 단계에서, 바람직하게는 조합된 스코어 수치를 계산하기 위해, THBS1의 농도 뿐만 아니라 유리 PSA의 비율 (%fPSA)을 측정하는 경우, 회귀 계수는 다음과 같이 선택된다:
β0 4.0-5.5 또는 4.5-5.0, 바람직하게는 4.5-5.0 또는 4.7-4.8 범위;
βTHBS1 (-0.00012) - (-0.00003) 또는 (-0.00009) - (-0.00003), 바람직하게는 (-0.000094) - (-0.000046) 또는 (-0.00006) - (-0.00004) 범위;
β%fPSA (-7.5) - (-2.5), 바람직하게는 (-5.5) - (-5.0) 범위.
상기 경우에 90% 민감도를 달성하기 위해, 바람직하게는 조합된 스코어 수치에 대한 역치는 0.28-0.35, 바람직하게는 0.30-0.34 또는 0.30-0.33로 선택된다.
THBS1의 농도, 유리 PSA의 비율 (%fPSA), 뿐만 아니라 CTSD의 농도를 제1 단계에서, 바람직하게는 조합된 스코어 수치를 계산하기 위해 측정할 경우, 회귀 계수는 다음과 같이 선택된다:
β0 3-4.2 또는 3-3.4, 바람직하게는 3.8 - 4.0 또는 3.1-3.3의 범위;
βCTSD 0.003 - 0.05 또는 0.005-0.05, 바람직하게는 0.004 - 0.006 또는 0.008-0.012의 범위;
βTHBS1 (-0.0002) - (-0.00005) 또는 (-0.00009) - (-0.00003), 바람직하게는 (-0.00012) - (-0.00008) 또는 (-0.00007) - (-0.00006) 범위;
β%fPSA (-7.5) - (-2.5), 바람직하게는 (-5.2) - (-5.0) 또는 (-5.2) - (-4.5) 범위.
상기 경우에 90% 민감도를 달성하기 위해, 바람직하게는 조합된 스코어 수치에 대한 역치는 0.28-0.40 또는 0.28-0.35, 바람직하게는 0.35-0.37, 또는 0.33-0.34로 선택된다.
THBS1의 농도, 유리 PSA의 비율 (%fPSA) 뿐만 아니라 OLFM4의 농도를 제1 단계에서, 바람직하게는 조합된 스코어 수치를 계산하기 위해 측정할 경우, 회귀 계수는 다음과 같이 선택된다:
β0 4.0-5.2, 바람직하게는 4.4-4.8의 범위;
βOLFM4 0.001-0.01, 바람직하게는 0.002-0.004의 범위;
βTHBS1 (-0.00009) - (-0.00002), 바람직하게는 (-0.00006) - (-0.00004)의 범위;
β%fPSA (-7.5) - (-2.5), 바람직하게는 (-5.9) - (-4.8)의 범위.
상기 경우에 90% 민감도를 달성하기 위해, 바람직하게는 조합된 스코어 수치에 대한 역치는 0.27-0.35, 바람직하게는 0.3-0.34로 선택된다.
THBS1의 농도, 유리 PSA의 비율 (%fPSA) 뿐만 아니라 ICAM1의 농도를 제1 단계에서, 바람직하게는 조합된 스코어 수치를 계산하기 위해 측정할 경우, 회귀 계수는 다음과 같이 선택된다:
β0 4.0-5.2, 바람직하게는 4.6 - 4.9의 범위;
βICAM1 (-0.002) - (-0.0001), 바람직하게는 (-0.0010) - (-0.0005)의 범위;
βTHBS1 (-0.0001) - (-0.00001), 바람직하게는 (-0.00008) - (-0.00004)의 범위;
β%fPSA (-7.5) - (-2.5), 바람직하게는 (-5.8) - (-4.9)의 범위.
상기 경우에 90% 민감도를 달성하기 위해, 바람직하게는 조합된 스코어 수치에 대한 역치는 0.25-0.35, 바람직하게는 0.3-0.33로 선택된다.
THBS1의 농도, 유리 PSA의 비율 (%fPSA), 뿐만 아니라 OLFM4, ICAM1 및 CTSD의 농도를 제1 단계에서, 조합된 스코어 수치를 계산하기 위해 측정할 경우, 회귀 계수는 다음과 같이 선택된다::
β0 3-3.8, 바람직하게는 3.5-3.6의 범위;
βOLFM4 0.001-0.003, 바람직하게는 0.0015-0.0025의 범위;
βICAM1 (-0.004) - (-0.002), 바람직하게는 (-0.0035) - (-0.00025)의 범위;
βCTSD 0.005-0.05, 바람직하게는 0.008-0.012의 범위;
βTHBS1 (-0.00009) - (-0.00003), 바람직하게는 (-0.00007) - (-0.00006)의 범위;
β%fPSA (-7.5) - (-2.5), 바람직하게는 (-5.2) - (-4.8)의 범위.
상기 경우에 90% 민감도를 달성하기 위해, 바람직하게는 조합된 스코어 수치에 대한 역치는 0.3-0.35, 바람직하게는 0.32-0.335로 선택된다.
측정되는, THBS1, 및/또는 CTSD, OLFM4, ICAM1 중 하나 이상은 당화, 인산화, 지질화 등의 번역 후 수정을 포함할 수 있다.
THBS1, CTSD, OLFM4, ICAM1 중 하나 이상의 농도를 측정하기 위해, 개체의 혈청, 혈장 또는 혈액을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 통상적으로 완충제를 이용해 희석한다.
완충제는, 바람직하게는, pH 7-7.4이고, 바람직하게는 pH 값을 조절하는 물질을 더 포함한다. 이러한 pH 조절제는 다음과 같은 시스템들 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다: Tris (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄), Pipes (피페라진-1,4-비스-2-에탄 설폰산), Mes (4-모르폴리노 에탄 설폰산), Hepes (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진-에탄 설폰산), 포스페이트 완충화된 염수 (PBS).
나아가, 완충제는 부가적인 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 완충제는 하나 이상의 비-이온성 디터전트를, 바람직하게는, 0.01 내지 0.1 % (v/v), 바람직하게는 0.025 내지 0.05% (v/v)의 농도로 포함할 수 있다. 이 비-이온성 디터전트는 다음의 성분들로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다: m이 5-40의 정수인 도데실폴리(에틸렌글리콜에테르)m; 1-O-n-옥틸-β-D-글루코피라노시드 (n-옥틸글루코시드); m이 5-40의 정수, 바람직하게는 m=11인 알킬페놀폴리(에틸렌글리콜-에테르)m; 1-O-n-도데실-β-D-글루코피라노실 (1-4)alpha-D-글루코피라노시드; m이 5-40의 정수, 바람직하게는 m=23인 도데실폴리-(에틸렌글리콜에테르)m; 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노 지방산 에스테르, 바람직하게는 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노올리에이트, 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노라우레이트, 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노팔미테이트, 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노스테아레이트)로부터 선택되는, 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노 지방산 에스테르; m이 5-40의 정수, 바람직하게는 m=10인 옥틸페놀폴리(에틸렌글리콜에테르)m.
추가적으로, 완충제는 소 혈청 알부민, 트레할로스, 슈크로스, 소태아 혈청, 말 혈청, 마우스 IgG, 보바인 감마 글로불린 중 하나 이상 등의 성분을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 완충제는 다이티오트레이톨 (DTT) 또는 임의의 다른 환원제를 포함하지 않지만, 특정 단백질의 경우에는 DTT가 특이적으로 첨가될 수 있다 (하기 내용 참조).
바람직하게는, 완충제는 50-850 mM, 바람직하게는 200-400 mM 또는 250 - 370 mM의 이온 강도를 가진다.
THBS1을 측정하기 위해 희석하는 경우, 효소 연결된 면역흡착 분석 (ELISA)에서의 희석 배수는 1:1,000-1:20,000, 바람직하게는 1:1,000-1:3,000 또는 1:2,000-1:3,000가 선택되고, 비드를 이용한 분석에서의 희석 배수는 1:5,000-1:15,000가 선택될 수 있다.
단백질 CTSD를 측정하기 위해 희석하는 경우, 효소 연결된 면역흡착 분석에서의 희석 배수는 1:5-1:70 또는 1:5-1:30이, 바람직하게는 1:10-1:50 또는 1:10-1:30이 선택되고, 비드를 이용한 분석에서의 희석 배수는 1:10-1:20이 선택될 수 있다. 바람직하게는, 전술한 사용되는 완충제에는, 바람직하게는, 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노라우레이트로서 선택된 비-이온성 디터전트가 추가적인 농도 (additional concentration) 0.05% (v/v)로 추가적으로, 부가적으로, 구체적으로 첨가된다.
ICAM1을 측정하기 위해 희석하는 경우, 희석 배수는 1:50-1:200, 바람직하게는 1:80-1:150이 선택될 수 있다. 바람직하게는, 이온 강도를 높이기 위해, 소듐 클로라이드가 추가적인 함량 250 mM로 사용되는 완충제에 추가적으로 첨가된다.
OLFM4를 측정하기 위해 희석하는 경우, 희석 배수는 1:5-1:30, 바람직하게는 1:5-1:20이 선택될 수 있다. 바람직하게는, 소듐 클로라이드가 추가적인 함량 250 mM로, 그리고 환원제, 바람직하게는 다이티오트레이톨 (DTT)로서 선택되는 환원제가 5 mM 농도로, 사용되는 완충제에 추가적으로 첨가된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 방법은,
개체의 혈청, 혈장 또는 혈액을, 바람직하게는 이의 희석 후, 각 단백질에 대한 하나 이상의, 바람직하게는 샌드위치로 2개의 친화성 물질(들)과 접촉시키고,
해당 단백질과 하나 이상의 (또는 2) 친화성 물질(들) 간에 결합이 이루어졌는 지를 검출하고,
해당 단백질의 농도 또는 유리 PSA의 경우 이의 비율에 대한 정량적인 데이터 (quantitative readout)를 이용하여, 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액에서 해당 농도/비율을 계산함으로써, 수행되는 제1 단계를 포함하며,
이 단계에서는, 바람직하게는 가시적인 판독을 이용한 해당 단백질에 특이적인 샌드위치 ELISA, 및/또는 바람직하게는 형광 판독을 이용한 해당 단백질에 대한 샌드위치 비드 항체 분석이 사용된다.
바람직하게는 가시적인 판독을 이용한 해당 단백질에 특이적인 샌드위치 ELISA 및/또는 바람직하게는 형광 판독을 이용한 해당 단백질에 대한 샌드위치 비드 항체 분석은, 인간 THBS1, CTSD, ICAM1 및 OLFM4의 각각의 재조합 단백질과, 이것으로 마우스를 면역화하여 제조한 마우스 단일클론 항체를 이용하여 수행되는 분석으로 달성될 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 해당 단백질의 농도의 정량적인 검출은 외부 단백질 표준물질에 대한 바이오마커의 농도를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 결정 단계는 동일한 세트의 측정 샘플에서 측정될 단백질 희석에 대해 사용할 완충제와 동일한 완충제에 희석한 기지 농도의 수종의, 바람직하게는 5-7개의 단백질 표준물질들을, 지정된 농도들에서 측정하여, 기준 표준 곡선을 작성하는 단계를 수반한다.
본 방법은 암, 특히 국소화된 전립선 암을 포함하여 전립선 암의 모니터링, 진단, 예후 예측, 위험도 평가, 치료법 선택, 치료 모니터링 중 하나 이상과 관련된 단계를 추가로 수반할 수 있거나 또는 이와 관련하여 추가적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 구현예들은 중속항에서 기술된다.
본 발명의 바람직한 구현예는 이하 도면을 참조하여 기술되며, 도면은 본 발명의 바람직한 구현예를 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 도면에서,
도 1은 2-단계 샌드위치 면역분석을 개략적으로 도시한 것으로, 루미넥스 시스템에서는, 검출 항체의 바이오틴 (B)에 부착하는 형광 스트렙타비딘-피코에리트린 접합체 (Strep-PE)를 이용한 형광으로 검출하고, ELISA에서는, Strep-PE 및 HRP 발색 기질 TMB 대신 스트렙타비딘-효소 접합체 및 이 효소에 대한 발색 기질을 이용해 수득한 가시 범위에서의 색 변화를 이용해 검출하며,
도 2는, 조합된 스코어 수치를 평가하기 위해, THBS1 단독 측정, 총 PSA 단독 측정, %fPSA 단독 측정 및 THBS1의 농도를 %fPSA 비율과 함께 사용하는 경우에, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 도시한 것이고;
도 3은, 조합된 스코어 수치를 평가하기 위해, CTSD 단독 측정, %fPSA 단독 측정 및 CTSD의 농도를 %fPSA 비율과 함께 사용하는 경우에, 최적화된 ROC 곡선을 도시한 것이고;
도 4는, 조합된 스코어 수치를 평가하기 위해, ICAM1 단독 측정, %fPSA 단독 측정 및 ICAM1의 농도를 %fPSA 비율과 함께 사용하는 경우에, 최적화된 ROC 곡선을 도시한 것이고;
도 5는, 조합된 스코어 수치를 평가하기 위해, OLFM4 단독 측정, %fPSA 단독 측정 및 OLFM4의 농도를 %fPSA 비율과 함께 사용하는 경우에, 최적화된 ROC 곡선을 도시한 것이고;
도 6은, %fPSA 단독, CTSD + THBS1, 및 %fPSA + CTSD + THBS1 조합에 따른, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 도시한 것으로, 최적화된 모델의 ROC 곡선을 도시하며;
도 7은, fPSA 단독, ICAM1 + THBS1, 및 %fPSA +ICAM1 + THBS1 조합에 따른, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 나타낸 것으로; %; 최적화된 모델의 ROC 곡선을 도시하며;
도 8은, %fPSA 단독, OLFM4 + THBS1, 및 %fPSA + OLFM4 + THBS1 조합에 따른, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 나타낸 것으로, 최적화된 모델의 ROC 곡선을 도시하며;
도 9는, %fPSA 단독, ICAM1 + CTSD, 및 %fPSA + ICAM1 + CTSD의 조합에 따른, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 나타낸 것으로, 최적화된 모델의 ROC 곡선을 도시하며;
도 10은, %fPSA 단독, OLFM4 + CTSD, 및 %fPSA + OLFM4 + CTSD의 조합에 따른, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 나타낸 것으로, 최적화된 모델의 ROC 곡선을 도시하며;
도 11 은, %fPSA 단독, ICAM1 + OLFM4, 및 %fPSA + ICAM1 + OLFM4의 조합에 따른, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 나타낸 것으로, 최적화된 모델의 ROC 곡선을 도시하며;
도 12 는, %fPSA 단독, CTSD + THBS1, 및 %fPSA + CTSD + THBS1의 조합에 따라 %로 제시된, 90% 민감도에서의 음성 생검의 감소율을 나타낸 것이고;
도 13은, %fPSA 단독, CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1, 및 %fPSA + CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1의 조합에 따른, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 나타낸 것으로, 최적화된 모델의 ROC 곡선을 도시하며; 및
도 14는 %fPSA 단독, CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1, 및 %fPSA + CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1의 조합에 따라 %로 제시된, 90% 민감도에서의 음성 생검의 감소율을 나타낸 것이고;
도 15 는, 조합된 스코어 수치를 평가하기 위해, ELISA을 이용한 THBS1 단독 측정, 총 PSA 단독 측정, %fPSA 단독 측정 및 ELISA를 이용한 THBS1 농도 측정을 %fPSA 비율과 함께 이용한 경우에, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 도시한 것이고;
도 16은, 조합된 스코어 수치를 평가하기 위해, ELISA을 이용한 CTSD 단독 측정, %fPSA 단독 측정 및 ELISA를 이용한 CTSD 농도 측정을 %fPSA 비율과 함께 이용한 경우에, 최적화된 ROC 곡선을 도시한 것이고;
도 17은, %fPSA 단독, 모두 ELISA를 이용한 CTSD + THBS1 측정, 및 모두 ELISA를 이용한 %fPSA + CTSD + THBS1 조합 측정시, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 나타낸 것으로, 최적화된 모델의 ROC 곡선을 도시하며;
도 18은, %fPSA 단독, 모두 ELISA를 이용한 CTSD + THBS1 측정, 및 모두 ELISA를 이용한 %fPSA + CTSD + THBS1 조합 측정에 따라 %로 제시된, 90% 민감도에서의 음성 생검의 감소율을 나타낸 것이다.
본 발명자들은, 이전에, PI3K/PTEN 암 경로에 초점을 둔 2 단계 유전학-가이드 발견 방식을 이용해 PCa 진단을 위한 다수의 단백질 바이오마커들을 동정한 바 있다. 첫번째 단계로, 야생형 및 Pten-null 암 마우스 모델의 혈청과 전립선 조직에서 당단백질을 동정하였다. 단백질에 우선 순위를 매긴 후, 두번째 검증 단계로 PCa 환자와 대조군 개체의 혈청에서 프로테오믹 프로파일 (proteomic profile)을 동정하였다. 목적은, 개개 단백질 바이오마커에 대한 민감도와 특이도가 높은 면역분석법을 동정 및 개발하고, 검증하고자 하는 것이었다. 질량 분광측정에서 면역분석 기술로의 전환은, 대규모 샘플 코호트에서 고-성능의 임상 검증을 수행할 수 있기 위한 매우 중요한 단계이다. 또한, 통상적인 진단 실험실에서의 검사에 임상적인 활용을 용이하게 해준다. 마이크로타이터 플레이트 또는 튜브와 비교해 미세입자의 더 큰 표면적으로 인한 카이네틱스 향상을 고려하여, 먼저 미세입자-기반의 루미넥스 플랫폼을 선택하였다. 또한, 자기 미세입자-기반의 분석은 튜브- 또는 마이크로타이터 플레이트-기반의 분석 보다 자동화가 보다 용이하므로, 따라서 랜덤-어세스 면역분석 시스템 (random-access immunoassay system)에 널리 사용된다. 마지막으로, 루미넥스 시스템의 멀티플렉싱 능력은, 면역분석법 개발에서, 특히 보다 일반적이고 단순하며 보다 사용자 친화적인 ELISA를 향후 개발하는데 있어서도, 항체 선택 공정을 용이하게 만들어준다.
본 섹션에서, CDER (Center for Drug Evaluation and Research)에 따른 개발 및 기술 검증은 인간 카텝신 D (CTSD), 인간 세포간 부착착 분자 1 (ICAM1), 인간 올팍토메딘 4 (OLFM4) 및 인간 트롬보스폰딘 1 (THBS1)에 대한 4가지 개별 면역분석에서 기술된다. 이들 인간 당단백질의 마우스 상동체를, 기존에 Pten 컨디셔닝화된 넉-아웃 마우스 모델을 이용하여 질량 분광측정에 의해 동정하였다. 인간 상동체를 대상으로 양성 전립선 병태를 PCa와 구별할 수 있는 능력을 검사하기 위해 임상 혈청 샘플에서 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 조합이 전술한 종래 방법의 문제점들을 해결하는데 최적이며, 가장 높은 민감도와 특이도를 나타내었다.
이러한 개발을 통해, 분석 내 및 분석 간 편차 (CV)가 <15%이고, 분석물의 희석에 선형성 (linearity)이 존재하는, 몇가지 개별 면역분석법이 수득되었다. 혈청에서, 생체외 단백질 안정성 (분석물의 손실율 <15%)은 실온에서 적어도 24시간, 4℃에서 3일간 달성되었다.
재료 및 방법
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 유전자 명, 엔트리 명, 단백질 명 (단축명) 및 접근 번호는, 유럽 생물정보 위원회 (EBI), 스위스 생물정보 위원회 (SIB) 및 단백질 정보 자원 (PIR)으로 구성되는 UniProt Consortium (www.uniprot.org)에 따라 규정된다. 주석으로 첨부되거나 또는 예상되는 세포내 위치는 Emanuelsson O, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H. (2007) Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nat Protoc. 2, 953-71에 따른다.
유전자 명 엔트리 명 단백질 명 접근 번호 주석 첨부된 또는 예상되는 세포내 위치
THBS1 TSP1_HUMAN 트롬보스폰딘 1 P07996 분비됨
OLFM4 OLFM4_HUMAN 올팍토메딘-4 Q6UX06 분비됨
CTSD CATD_HUMAN 카텝신 D P07339 라이소좀
ICAM1 ICAM1_HUMAN 세포간 부착 분자 1 P05362 원형질막
KLK3 KLK3_HUMAN 전립선 특이 항원 (PSA) P07288 분비됨
단백질 표준물질/보정 장치
발현
재조합 인간 CTSD (잔기 1-412, 뒤에 6His tag가 존재함), ICAM1 (잔기 1-480, 뒤에 8His tag가 존재함), THBS1 (잔기 19 - 1170, 앞에 신호 펩타이드가, 뒤에 11His tag가 존재함) 및 OLFM4 (잔기 1-510)를 각각 발현시켰으며, 형질감염된 HEK293 세포의 세포 배양 상층액으로부터 정제하였다. CTSD, ICAM1, THBS1을 His Trap 컬럼 (GE Healthcare)으로 정제하였다.
정제
ICAM1의 경우, 먼저 암모늄 설페이트 침강을 수행하였다. 35%에 침강된 단백질을 원심분리에 의해 제거하였다. 상층액을 깨끗한 튜브로 옮기고, 암모늄 설페이트를 75% 포화에 도달할 때까지 서서히 첨가하였다. 이를 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 펠릿을 완충제에 용해하여 His Trap 컬럼에서 정제하였다.
OLFM4는 30%에서 암모늄 설페이트 침강에 의해 정제하였다.
인간 혈소판으로부터 정제한 천연 THBS1은 Creative Biomart 사에서 구입하였으며, 면역화에 사용하였다. 재조합 THBS1 단백질은 처음에는 R&D Systems 사에서 구입하였으며, 이후에 형질감염된 HEK293 세포에서 사내에서 발현시키고 세포 배양 상층액으로부터 정제하였다.
항체
포획 항체 및 검출 항체는, BALB/c 마우스를 인간 CTSD, ICAM1, OLFM4 재조합 단백질 및 천연 THBS1 각각으로 면역화하여 제조한, 마우스 단일클론이다. 해당 단백질의 서로 다른 에피토프를 인지하는 복수의 항체를 분리하고, 이후 샌드위치 비드 기반의 면역분석 및 ELISA 면역분석 각각을 개발 및 최적화하기 위해 항체 쌍들을 선별하였다.
사용한 미세입자-기반의 루미넥스 기법은 신규 개발 중인 면역분석용 항체를 선별하는 다목적의 플랫폼을 제공해준다. 멀티플렉싱 기법은, 수종의 후보 포획 항체를 여러가지 미소구 세트에 커플링함으로써, 항체 샌드위치 쌍들을 쉽게 동정할 수 있게 해주었다. 이들 세트는, 함께 혼합하여, 별개의 검출 항체를 동시에 검사할 수 있으며, 시약, 샘플 및 시간을 절약할 수 있다 (예, Baker HN, Murphy R, Lopez E, Garcia C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. 2012). 적합한 항체 쌍들을 선별한 후, 각각의 면역분석에 대한 가장 최적의 조건을 확립하기 위해 그에 따른 완충제 조성물 및 항체 농도를 최적화하였다 (신호 대 백그라운드 비율, 희석 선형성 (dilutional linearity), 표준 곡선의 다이나믹 범위, 분석 민감도).
비드 기반의 면역분석
루미넥스 시스템에서 다음과 같이 비드 기반의 샌드위치 면역분석을 확립하였다. 포획 항체를 카르복시화된 루미넥스 미세입자에 공유 결합시키고, 검출 항체를 표준 절차에 따라 바이오틴 (B)으로 표지하였다. 96웰 1/2 면적 마이크로타이터 플레이트 (Corning Inc.)를 15분간 ELISA용 1x 차단 시약 (Roche Diagnostics)으로 블록킹하였다. 포획-항체 코팅된 미세입자와 적정 농도의 바이오틴화된 검출 항체의 혼합물을 준비하여, 96웰 플레이트 내 분석 완충제에 희석한 단백질 (샘플 또는 표준물질)에 첨가하였다. 분석에 따라 21℃ 또는 37℃에서 60분 또는 120분간, 에펜도르프 서모믹서 C (Eppendorf ThermoMixer C)에서 650 rpm으로 교반하면서 인큐베이션한 후, 플레이트를 자기 플레이트 분리기 (Luminex Corporation)를 사용해 PBS + 0.05% Tween20로 헹구었다. 분석 완충제에 희석한 스트렙타비딘-피코에리트린 접합체 (Strep-PE, Moss Inc.)를 첨가하여 30분간 둔 후 에펜도르프 서모믹서 C에서 21℃에서 650 rpm으로 교반하면서 인큐베이션하였다. 비드 접합체를 세척한 후, 차단 시약에 재현탁하였다. xPONENT 4.1 또는 4.2 소프트웨어로 작동되는 Luminex FlexMap3D 또는 Luminex MAGPIX 장치로 판독을 수행하였으며, 이 소프트웨어를 사용해 4-파라미터 커브 피트 (4-parameter curve fit)로 농도를 계산하였다. 샘플들 모두 동일 플레이트에서 독립적인 두플리케이트로 측정하였다. 단백질 농도가 지정된 품질 관리 샘플을 각 플레이트에 포함시켰다.
항체의 다양한 에피토프들에 대해, 대응되는 포획 항체 비드 및 바이오틴화된 검출 항체를 제작 및 검사하였으며, 최적의 판독 강도 (optimum readout intensity)를 기초로 포획 항체와 검출 항체의 최적의 쌍을 실험적으로 결정하였다 (도 1 참조).
효소-연결된 면역흡착 분석
샌드위치 ELISA를 다음과 같이 확립하였다. 이전 챕터에 기술된 비드 기반의 면역분석을 이용해 결정 및 선택된 포획 항체를 50 mM 소듐 포스페이트 완충제, pH 8.0 (대안: 50 mM 카보네이트 완충제, pH 9.6)에 희석하고, 밤새 4℃에서 96웰 Maxisorp 플레이트 (Nunc)에 코팅하였다 (대안: 30℃에서 75분, 또는 실온에서 1-6시간). 플레이트에서 용액을 제거하고, PBS/0.05% Tween20로 한번 헹군 다음, 플레이트를 1.5시간 동안 BSA-block (Candor Bioscience) (대안: PBS + 1% BSA)로 블록킹하였다. 그런 후, 플레이트를 3번 헹구었다. 표준물질 또는 혈청 샘플을 저 교차 완충제 (LCB; Candor Bioscience) (대안: PBS계 또는 10 mM Tris, 0.9% 소듐 클로라이드계 완충제, 둘다 1% BSA, 0.1% 보바인 감마 글로불린, 0.1% 마우스 IgG 첨가)에 희석한 다음, LCB 완충제에 희석한 이전 챕터에서 언급한 비드-기반의 면역분석을 이용해 결정 및 선택된 바이오틴화된 검출 항체와 웰에서 동일 부피로 혼합하였다. 37℃에서 60분간 에펜도르프 서모믹서 C에서 650 rpm으로 교반하면서 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS/0.05% Tween20으로 3번 헹구었다. 스트렙타비딘-HRP 접합체 (Jackson ImmuneResearch)를 LCB (대안: 동일 부피의 PBS로 희석한 BSA-block)에 희석하고, 첨가하여 30분간 에펜도르프 서모믹서 C에서 650 rpm으로 교반하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. PBS/0.05% Tween20으로 3번 헹군 다음, TMB 기질 (Sigma) 용액 (30 mM 시트르산, pH 4.1 + H2O2에 희석) (대안: TMB, Enhanced K-Blue TMB Substrate ready to use, Neogen)을 30분간 첨가하여, 에펜도르프 서모믹서 C에서 650 rpm으로 교반하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 동일 부피의 0.25 M H2SO4 (대안: 1.0 M HCl)를 첨가하여 반응을 블록킹하였다. 흡광을 FLUOStart Optima ELISA reader (BMG LabTech)에서 측정하였으며, 450 nm에서 판독하고, 620nm에서의 측정값을 제하였다. 농도는, FLUOstar OPTIMA 소프트웨어 또는 Tecan 사의 Magellan를 이용해, 5-파라미터 커브 피트 (대안: 4-파라미터 커브 피트)로 계산하였다.
PSA 측정
혈청 총 PSA (tPSA) 및 유리 PSA (fPSA)는 ADVIA Centaur 면역분석 시스템 (Siemens Healthcare)을 사용해 분석하였다. 유리 PSA의 % (%fPSA)는, tPSA 측정값과 fPSA 측정값을 이용해 식 %fPSA=fPSA/tPSA에 따라 계산하였다. 다른 예로, 총 PSA (tPSA) 및 복합체 형태의 (complexed) PSA (cPSA)를 측정할 수 있으며, 식 %fPSA= (tPSA-cPSA)/tPSA으로부터 유리 PSA의 비율을 계산할 수 있다. fPSA/tPSA 비를 평가에 이용하였다.
특이적인 비드 기반의 분석
THBS1 분석시, 샘플 혈청 (최종 희석율 1:10,000) 또는 재조합 표준물질을 포획 항체-코팅된 미세입자 및 바이오틴화된 검출 항체와 저 교차 완충액 (Candor Bioscience) (LCB, pH 7.2) 중에서 60분간 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플들 모두 분석의 선형적인 검출 범위에서 정량하였으며, 결정된 농도 (각 샘플 CV<20%, 하나의 플레이트에서 샘플의 평균 CV 5.1%)는 14.2 - 209 ㎍/ml 범위였다.
THBS1 분석에서 희석시 다음과 같은 시스템을 사용하였다: LCB, pH 7.2.
CTSD 분석의 경우, 샘플 혈청 (최종 희석 1:15) 또는 재조합 표준물질을, 포획 항체-코팅된 미세입자 및 바이오틴화된 검출 항체와 LCB (pH 7.2) + 0.05% Tween 중에 120분간 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플들 모두 분석의 선형적인 검출 범위에서 정량하였으며, 결정된 농도 (각 샘플 CV<20%, 하나의 플레이트에서 샘플의 평균 CV 2.8%)는 40 - 453 ng/ml 범위였다.
CTSD 분석에서 희석시 다음과 같은 시스템을 사용하였다: LCB (pH 7.2) + 0.05% Tween.
ICAM1 분석의 경우, 샘플 혈청 (최종 희석 1:100) 또는 재조합 표준물질을, 포획 항체-코팅된 미세입자 및 바이오틴화된 검출 항체와 LCB (pH 7.2) + 250 mM NaCl 중에 60분간 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플들 모두 분석의 선형적인 검출 범위에서 정량하였으며, 결정된 농도 (각 샘플 CV<15%, 하나의 플레이트에서 샘플의 평균 CV 2.2%)는 44 - 287 ng/ml 범위였다.
ICAM1 분석에서 희석시 다음과 같은 시스템을 사용하였다: LCB (pH 7.2) + 250 mM NaCl.
OLFM4 분석의 경우, 샘플 혈청 (최종 희석 1:10) 또는 재조합 표준물질을, 포획 항체-코팅된 미세입자 및 바이오틴화된 검출 항체와 LCB (pH 7.2) + 250 mM NaCl + 5 mM DTT 중에 60분간 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플 3개를 제외한 모든 샘플은 분석의 선형적인 검출 범위에서 정량하였으며, 결정된 농도 (각 샘플 CV<15%, 하나의 플레이트에서 샘플의 평균 CV 5.5%)는 1 - 291 ng/ml 범위였다.
OLFM4 분석에서 희석시 다음과 같은 시스템을 사용하였다: LCB (pH 7.2) + 250 mM NaCl + 5 mM DTT.
정량적인 판독이 가능하도록 농도를 캘리브레이션하기 위해, 해당 단백질의 표준물질 용액을 다음과 같은 절차로 사용하였다:
단백질 바이오마커의 측정은 외부 단백질 표준물질을 기준으로 각 바이오마커의 농도를 정량하는 것을 의미한다. 즉, 샘플 측정과 동일한 세트의 측정에서 분석 완충제에 희석한 5-7개의 단백질 표준물질들을 지정된 농도로 측정함으로써, 기준 표준물질 곡선을 작성한다.
개개 표준물질의 다음과 같은 농도를 비드-기반 분석에 이용하였다:
- THBS1 (ng/ml): 50.00, 20.00, 8.00, 3.20, 1.28, 0.51, 0.20
- CTSD (ng/ml): 75.0, 2.0, 8.33, 2.78, 0.93, 0.31, 0.10
- ICAM1 (ng/ml): 12.6, 5.04, 2.02, 0.81, 0.32, 0.13, 0.05
- OLFM4 (ng/ml): 120, 34.29, 9.79, 2.79, 0.80, 0.23, 0.07
개개 표준물질의 다음과 같은 농도를 ELISA 분석에 이용하였다:
- THBS1 (ng/ml): 200 또는 250, 100, 50 또는 40, 25 또는 16, 12.50 또는 6.4, 6.25 또는 2.6, 3.125 또는 1.0
- CTSD (ng/ml): 15.00, 10.00, 6.25 또는 6.7, 3.91 또는 4.4, 2.44 또는 3.0, 1.53 또는 2.0, 0.95 또는 1.3
고-차 다항 곡선 피트 (higher-grade polynomial curve fit)를 허용하는 컴퓨터 프로그램을 사용해 표준물질 곡선을 계산하였다. 혈청 샘플을 분석 완충제에 희석하여, 이의 측정값이 표준물질에 의해 커버링되는 범위 내에 포함되게 하였다. 이의 농도는 표준물질의 곡선을 기초로 계산하고, 희석 배수를 곱하여, 혈청 샘플 내 농도를 결정하였다.
특이적인 효소-연결된 면역흡착 분석
샘플 혈청은 THBS1 분석의 경우 최종 희석 배수 1:2,500에서, CTSD 분석의 경우 1:20에서 측정하였다. 또한, CTSD의 경우 1:50 희석 배수에서도 측정 가능하다.
결과
제안된 검사는 카텝신 D (CTSD), 트롬보스폰딘 1 (THBS1) 및 올팍토메딘 4 (OLFM4) 및 세포간 부착 분자 1 (ICAM1) 등의 복수의 암-특이적인 단백질을, 최저 측정 비용으로, 최대 민감도 및 특이도가 가능한 최적의 측정 전략을 결정하기 위해, 다양한 조합으로 측정한다. 검사 결과는, 부가적으로, %fPSA 비율 (fPSA/tPSA 비)을 포함한다. %fPSA와, 시스템 CTSD, THBS1, OLFM4 및 ICAM1 각각의 수학적 조합, %fPSA와 시스템 CTSD, THBS1, OLFM4 및 ICAM1의 쌍과의 모든 가능한 조합에 따른 조합된 스코어 수치를, 전술한 식 (1)을 이용하여 계산하였다. 또한, %fPSA를 CTSD 및 THBS1과, 선택적으로 OLFM4 및 ICAM1과 함께 사용한다. PCa 진단 개선을 위해 %fPSA와 같은 확립된 임상 파라미터에 추가되는 값을 확인하기 위해, 본 검사는 검증 실험으로 평가하였다.
목적 : 실험의 목적은, 제안된 단백질 바이오마커들의 조합이, tPSA가 높은 (2-10 ng/ml) 남성에서, 음성 생검의 수를 가장 효과적으로, 가장 신뢰성있게 줄일 수 있는 지를, 검사하기 위한 것이었다. 또한, 실험에 포함된 남성은 직장 수지 검사 (DRE) 결과가 음성 (암이 의심되지 않음)이며, 전립선이 비대화된 상태이다. 이러한 환자 서브그룹은, 다수의 남성들이 양성 병태 (benign condition)를 앓고 있어 범위 내에서 증가된 tPSA 수치를 나타내고, 그래서 위 양성 빈도가 많기 때문에, 전립선 생검의 수행 여부를 결정하기 가장 어려운 것으로 간주된다. 본 실험의 목표는 PCa에 대한 90% 이상의 민감도와 고-등급의 PCa (글리슨 점수 ≥7)에 대해 높은 (90-95%) 음성 예측도 (negative predictive value, NPV)를 가지면서, 음성 생검의 수를 적어도 50%까지 줄이고자 하는 것이었다. NPV는 비뇨기과 의사에게 중요한 척도로서, 음성 결과가 진 음성 (truly negative)일 확률이다.
설계, 설정 및 참가자 : 전립선 생검을 받은, tPSA 2-10 ng/ml, 암 음성 DRE 및 전립선 비대 (체적 ≥35 ml)를 보인, 남성을 대상으로, 후향성 연구 (retrospective study)를 수행하였다. 전립선 암-양성 및 음성인 남성의 전혈 샘플을, 북유럽의 주 암 센터에서 전립선 생검 수행 전에, 수집하였다. 샘플들 모두 환자 서면 동의를 구한 후 2011-2016에 채취하였다.
측정 : ADVIA Centaur 면역분석 시스템 (Siemens Healthcare)을 이용해, 전체 샘플들에서 혈청 tPSA 및 fPSA를 분석하였다. CTSD, THBS1, OLFM4 및 ICAM1의 농도 수준을 상기에 상세히 기술된 개발한 비드-기반의 면역분석으로 측정하였다. 또한, CTSD 및 THBS1의 농도 수준을 개발한 ELISA 면역분석으로 측정하였다.
결과 : 본 실험에 포함된 남성 474명 중, 236명은 생검 음성이었으며, 238명은 생검 결과를 토대로 PCa로 진단되었다. 이들 중, 전립선 생검에 따르면, 130명은 저-등급 (글리슨 점수 ≤6)이고, 106명은 고-등급 PCa (글리슨 점수 ≥7)이었다. 조합된 스코어 수치에 대한 상기한 식을 이용해, 샘플의 측정된 농도/비율 수치를 본 실험에 포함된 남성의 실제 생검 결과와 최적으로 연관시켜, 곡선 하 최대 면적에 대한 로지스틱 회귀 식을 최적화하여, 최적의 민감도 및 특이도를 결정하였다.
도 2-11, 13 및 15-17에 예시된 ROC 곡선들은 훈련 곡선 (training curve)이며, 즉 최적화된 방식으로 %fPSA의 측정 비율과 단백질의 해당 농도를 전립선 생검에 기반한 올바른 진단 (true diagnosis)과 연관시키는 모델의 최적화를 통해 수득한 곡선이다.
CTSD, THBS1, OLFM4 및 ICAM1 각각에 대한 모델
제1 단계로, 분석할 단백질 4종을 각각 살펴보고, 해당 단백질 단독 및 %fPSA와 조합한 경우에 최적화된 조합된 스코어 수치를 구하였다.
도 2-5는, 조합된 스코어 수치를 평가하기 위해, 그룹 THBS1, CTSD, ICAM1 및 OLFM4의 각 단백질 단독 측정, %fPSA 단독 측정 및 해당 단백질의 농도를 %fPSA 비율과 함께 사용한 경우에 따른, 양성 전립선 생검, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 도시한 것이다.
도 15 및 16은, 조합된 스코어 수치를 평가하기 위해, ELISA을 이용한 THBS1 및 CTSD 단독 측정, %fPSA 단독 측정 및 ELISA를 이용한 해당 단백질의 농도 측정을 %fPSA 비율과 함께 이용한 경우에, 전립선 생검 양성, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 ROC 훈련 곡선을 도시한 것이다.
ROC 곡선에서 알 수 있는 바와 같이, 지금까지 일부 지표 가치 (indicative value)를 가진 것으로 알려져 있지만 강력하고 신뢰성있는 상관자 (correlator)인 것으로 동정된 바 없는, THBS1을 이용함으로써 가장 최상의 민감도 및 특이도를 이용할 수 있다. 알 수 있는 바는, 개별적으로 살펴본 CTSD, ICAM1 및 OLFM4가 %fPSA 단독과 비교해 거의 유익하지 않다는 것이다. 특히, CTSD는 본질적으로 상관성이 없으며, 개별적으로 또는 %fPSA와 조합하여 보았을 때 진단적 가치가 없는 것으로 보인다.
총 PSA 농도 값은, 총 PSA의 높은 민감도 때문에, PCa의 음성 예측에 편리하게 사용된다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 총 PSA 농도 값은, 총 PSA에 대한 낮은 특이도로 인해, 양성 예측에는 전혀 도움이 되지 않는다. 실제, %fPSA 값을 이용하는 경우에만, 합리적인 AUC 값을 수득할 수 있으며, 또한 %fPSA 값을 THBS1과 조합하여 이용하는 경우에만 높은 민감도를 달성할 수 있다. 또한, 총 PSA 값을 THBS1과 조합하여 평가할 경우, 90% 민감도 수준에서 50% 보다 현저하게 낮은 특이도만 수득되며, AUC 값은 0.83 보다 현저하게 낮다.
CTSD, THBS1, OLFM4 및 ICAM1으로부터 선택된 쌍과, %fPSA의 조합 모델
제2 단계에서, 분석 단백질 4종을 쌍으로 살펴보았으며, 최적화된 조합된 스코어 수치를 해당 단백질 쌍에 대해서 뿐만 아니라 %fPSA와의 조합한 경우에 대해 구하였다.
도 6-11은, 조합된 스코어 수치를 평가하기 위해, THBS1, CTSD, ICAM1 및 OLFM4 단백질 그룹들의 가능한 모든 쌍들의 단독 측정, %fPSA 단독 측정 및 해당 단백질 상들의 농도를 %fPSA 비율과 함께 사용하는 경우에 따른, 전립선 생검 양성, 즉, PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸, 최적화된 수신자 조작 특성 (ROC) 훈련 곡선을 도시한 것이다.
ROC 곡선에서 알 수 있는 바와 같이, THBS1을 CSTD와 조합하면 지금까지 최상의 민감도 및 특이도가 이용가능해지는데, 이는 CTSD 단독으로는 어떠한 식별을 제공하지 않는다는 점에서 (도 3 참조), 매우 놀라운 일이다. 이는, THBS1 및 CTSD를 ELISA로 측정하여 검증하였다 (도 17 참조). 또한, THBS1을 ICAM1 및 OLFM4와 함께 사용한 경우에, 일부 부가적인 이점은 있지만, THBS1을 CTSD와 조합한 경우와 동일한 수준까지는 아니며, 이는 CTSD 단독 (도 3)과 비교해 ICAM1 및 OLFM4 단독의 우수한 거동 (도 4 및 5 참조)을 고려하면 전혀 예상하지 못한 결과이다. 지금까지 알려지지 않은, 혈액, 혈청 및 혈장에서의 THBS1과 CTSD 수치 간에, 높은 상관성이 있는 것으로 보인다.
반면, 도 9-11에서 알 수 있는 바와 같이, THBS1이 포함되지 않은 쌍들은 어떠한 부가적인 이점을 제공하지 않는다. 또한, 이러한 경우들에서 ROC 분석에서 부가적인 이점으로 이어지는 높은 상관성이 존재할 수 있었기에, 이 역시 예상되지 못한 일이다. 그러나, 이러한 이점은 테스트한 코호트에서 확인할 수 없었다.
특이 모델: %fPSA, CTSD, THBS1
도 6은 이러한 방식의 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선을 도시한 것이다. %fPSA의 AUC 결과 = 0.6498 (P <0.001; 95% CI = 0.6004-0.6992). CTSD 및 THBS1 조합이 전립선 생검 음성 남성과 전립선 생검 양성 남성을 구분하였으며, AUC는 0.8343이다 (P <0.001; 95% CI = 0.7974-0.8712). %fPSA, CTSD THBS1 조합의 경우, AUC는 0.8448이다 (P <0.001; 95% CI = 0.8097-0.8798). 이러한 결과들은, ELISA에 의한 THBS1 및 CTSD 측정에서 검증되었다 (도 17 참조). CTSD 및 THBS1의 조합은 전립선 생검 음성 남성과 전립선 생검 양성 남성을 구분하였으며, AUC는 0.8376이었다 (P <0.001; 95% CI = 0.8010-0.8742). %fPSA, CTSD THBS1 조합의 경우, AUC는 0.8508이었다 (P <0.001; 95% CI = 0.8161-0.8855).
전립선 생검 양성, 즉 PCa에 대한 ≥90% 민감도에서, %fPSA, CTSD 및 THBS1의 조합의 특이도는 60%였다. 이와 비교해, 임상 실무에서 일반적으로 사용되는 %fPSA 검사는 동일한 민감도 수준에서 특이도가 21%이다. 이는, CTSD 및 THBS1을 %fPSA와 조합할 경우, 생검 음성 236건 중 141건 (60%)이 감소되고, PCa 진단이 10% 줄어든다는 것을, 보여준다 (도 12). 또한, 고 등급 PCa (글리슨 점수≥7)에 대해 94%의 높은 NPV가 달성되었다. 이러한 결과는, %fPSA, CTSD 및 THBS1의 조합이 상당한 개선을 달성한다는 것을, 의미한다.
도 12는 90% 민감도 수준에서 전립선 생검 양성, 즉 PCa 생검 양성의 감소율을 도시한다. %fPSA 단독, CTSD + THBS1, 및 %fPSA + CTSD + THBS1 조합 각각에 대한 백분율이 제공된다. 이러한 결과는, THBS1 및 CTSD에 대한 ELISA으로 검증되었다 (도 18 참조).
이 모델에서 다른 경우와 비슷하게, %fPSA 단독, CTSD + THBS1, 및 %fPSA + CTSD + THBS1 조합 각각에서 측정된 농도에 기초하여, 각 사례에서, 조합된 스코어 수치를 최적화 후 수득한 상수를 사용해 전술한 식 (1)로 계산한다:
로지스틱 회귀 식:
이들 결과들에 사용된 로지스틱 회귀 모델은 등식 (1)에 사용될 계수의 추정치를 제공해준다:
Figure pct00002
상기 등식에서, βs는 회귀 계수이고, β0는 절편이고, x i은 매칭되는 독립 변수 값이다. 결과 (pi)는 독립 변수 값들의 소정의 패턴을 가진 관측치가 이벤트를 발생시킬 확률이다.
이러한 pi는 ROC 곡선을 작성하는데 사용되는 점수이다.
특정 모델 상황: %fPSA, THBS1에서 상기 등식의 변수는 다음과 같다:
파라미터 DF B 표준오차 월드 카이 자승 검증 Pr > ChiSq Exp(B)
절편 1 4.663205 0.486095 92.029501 8.54E-22 105.975153
THBS1 1 -0.000053 0.000005 95.644963 1.37E-22 0.999947
%fPSA 1 -5.381332 1.372877 15.364416 0.000089 0.004602
제1 단계에서 THBS1의 농도 및 %fPSA 비율을 측정할 경우, 조합된 스코어 수치 계산에서 회귀 계수는 다음과 같다:
β0 = 4.663; βTHBS1 = -0.000053; β%fPSA = -5.381.
90% 민감도에서, 조합된 스코어 수치의 역치 값은 0.316 보다 높다.
특이 모델 상황: %fPSA, THBS1 (ELISA로 측정)에서 상기 등식의 변수는 다음과 같다:
파라미터 DF B 표준오차 월드 카이 자승 검증 Pr > ChiSq Exp(B)
절편 1 4.902422 0.504822 94.307202 2.70E-22 134.615457
THBS1 1 -0.000086 0.000009 96.648592 8.28E-23 0.999914
%fPSA 1 -5.145655 1.410257 13.313279 0.000264 0.005825
제1 단계에서 THBS1의 농도 (ELISA) 및 %fPSA 비율을 측정할 경우, 조합된 스코어 수치 계산에서 회귀 계수는 다음과 같다:
β0 = 4.902; βTHBS1 = -0.000086; β%fPSA = -5.146.
90% 민감도에서, 조합된 스코어 수치의 역치 값은 0.335 보다 높다.
특이 모델 상황: %fPSA, CTSD, THBS1에서 상기 등식의 변수는 다음과 같다:
파라미터 DF B 표준오차 월드 카이 자승 검증 Pr > ChiSq Exp(B)
절편 1 3.233 0.561 33.248 8.113E-9 25.367
CTSD 1 0.010 0.002 19.340 0.000011 1.010
THBS1 1 -0.000063 0.000006 102.843 3.6272E-24 1.000
%fPSA 1 -4.946 1.393 12.612 0.00383 0.007
90% 민감도에서, 조합된 스코어 수치의 역치 값은 0.330 보다 높다.
즉, 예를 들어, 하기 농도/비율을 특정 샘플에서 측정/결정하는 경우:
UPN CTSD (ng/ml) THBS1 (ng/ml) %fPSA (0-1)
HH0106 227 78501 0.27
하기와 같이 계산한다:
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
양성 전립선 생검, 즉 PCa에 대한 민감도 90%에서, 조합된 스코어 수치 pi의 역치는 0.330이며, HH0106 샘플의 경우 해당 농도 값들이 전립선 생검 양성임을, 즉 PCa임을 나타내는 것이 아니므로, 전립선 생검은 권고되지 않는다.
특이 모델 상황: %fPSA, CTSD, THBS1 (CTSD 및 THBS1는 ELISA로 측정)에서 상기 등식의 변수는 다음과 같다:
파라미터 DF B 표준오차 월드 카이 자승 검증 Pr > ChiSq Exp(B)
절편 1 3.892 .567 47.116 6.69E-12 49.022
CTSD 1 0.004 0.001 11.997 .000533 1.004
THBS1 1 -0.000100 0.000010 99.352 2.11E-23 1.000
%fPSA 1 -4.843 1.435 11.391 .000738 0.008
90% 민감도의 경우, 조합된 스코어 수치의 역치는 0.362 보다 높다.
제1 단계에서 THBS1의 농도, 유리 PSA의 비율 (%fPSA) 및 OLFM4의 농도를 측정할 경우, 조합된 스코어 수치 계산에서 회귀 계수는 다음과 같다:
β0 = 4.606; βOLFM4 = 0.00271; βTHBS1 = -0.000054; β%fPSA = -5.423.
90% 민감도의 경우, 조합된 스코어 수치의 역치는 0.323 보다 높다.
THBS1의 농도, 유리 PSA의 비율 (%fPSA) 및 ICAM1의 농도를 제1 단계에서 측정할 경우, 조합된 스코어 수치 계산에서 회귀 계수는 다음과 같다:
β0 = 4.769; βICAM1 = -0.00084; βTHBS1 = -0.000053; β%fPSA = -5.395.
90% 민감도의 경우, 조합된 스코어 수치의 역치는 0.318 보다 높다.
모델: %fPSA, CTSD, THBS1, OLFM4, ICAM1
도 13은 이러한 방식을 위한 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선을 도시한다. %fPSA의 AUC 결과는 0.6498이다 (P <0.001; 95% CI = 0.6004-0.6992). CTSD, THBS1, OLFM4 및 ICAM1 조합이 남성의 전립선 생검 음성 및 양성을 구분하였으며, AUC는 0.8345이었다 (P <0.001; 95% CI = 0.7978-0.8713). %fPSA, CTSD, THBS1, OLFM4 및 ICAM1의 조합의 AUC 값은 0.8463이었다 (P <0.001; 95% CI = 0.8122-0.8817).
도 13은 전립성 생검 양성에 대한, 즉 PCa에 대한 개별 예측인자의 정확도를 나타낸 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선을 나타낸다. %fPSA 단독, CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1 조합, 및 %fPSA + CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1 조합의 ROC 곡선을 도시한다.
양성 전립선 생검, 즉 PCa에 대한 민감도 ≥90%에서, %fPSA + CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1 조합의 특이도는 58%이었다. 이와 비교해, 임상 실무에서 일반적으로 사용되는 %fPSA 검사는, 동일한 민감도에서 특이도는 21%이다. %fPSA가 조합된 제안된 마커 세트는 236건의 음성 생검 중 136건 (58%)을 방지하며 PCa 진단을 10% 줄이는 것으로, 보인다 (도 13). 또한, 고 등급 PCa (글리슨 점수 ≥7)에 대한 높은 NPV도 달성되었다. 이러한 결과들은, %fPSA + CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1 조합이 %fPSA 단독에 비해 현저한 개선을 달성하지만, %fPSA, CTSD, THBS1에 대비 현저한 추가적인 개선은 없음을, 의미한다.
도 14는 90% 민감도에서 생검 음성인 경우의 감소율을 나타낸 것이다. %fPSA 단독, CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1 조합 및 %fPSA + CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1 조합에 대한 백분율을 표시한다.
또한, 도 13에 도시된 ROC 곡선은 훈련 곡선이며, 즉, 측정한 농도를 생검에 기반한 정확한 진단과 최적화된 방식으로 연관시키는 모델을 최적화하여 수득한 곡선이다.
또한, 이 모델에서, %fPSA 단독, CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1 조합 및 %fPSA + CTSD + THBS1 + OLFM4 + ICAM1 조합에 대한 측정 농도에 기초하여, 각각의 경우에, 판별인자를 최적화하여 수득한 상수를 이용해 하기 등식으로 계산한다:
β0 = 3.567; βOLFM4 = 0.002; βTHBS1 = -0.000063; βCTSD = 0.01; βICAM1 = -0.003; β%fPSA = -5.033.
90% 민감도의 경우, 조합된 스코어 수치의 역치는 0.329 보다 높다.
p에 대한 등식은 다음과 같다:
Figure pct00007
Figure pct00008
결론:
예상치 못하게도, THBS1 + %fPSA 조합, 특히 CTSD + THBS1 + %fPSA 조합은, tPSA 증가 (2-10 ng/ml), 전립선 비대 (≥35 ml) 및 DRE 음성인 남성에서, PCa가 아님을 결정하는데 있어, tPSA 또는 %fPSA 단독과 비교해, 상당히 매우 정확하다. 임상 실무에서 이들 3개의 파라미터를 포함하는 검사는 불필요한 생검 비율을 최대 60%까지 크게 낮출 수 있다.

Claims (15)

  1. 개체의 혈청, 혈장 또는 혈액에서 THBS1의 농도 및 유리 PSA (free PSA)의 비율 (%fPSA)을 정량적으로 검출하는 단계를 포함하는,
    개체의 건강 상태에 대한 정보를 수집하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    개체의 혈청, 혈장 또는 혈액에서, THBS1의 농도, 유리 PSA의 비율 (%fPSA), 및 CTSD, OLFM4, ICAM1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도를 정량적으로 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 방법은,
    개체의 혈청, 혈장 또는 혈액을, 바람직하게는 희석한 후, 각 단백질에 대한 하나 이상의, 바람직하게는 2개의 친화성 물질 (affinity reagent)과 접촉시키고, 해당 단백질과 하나 이상의 친화성 물질 간에 결합이 이루어졌는 지를 검출하고, 해당 단백질의 농도에 대한 정량적인 데이터 (quantitative readout)를 이용하여, 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액에서 또는 유리 PSA의 경우 이의 비율을 계산하는 것으로, 수행되는 제1 단계;
    상기 제1 단계에서 결정된 모든 상기 단백질 농도, 제1 단계에서 결정된 단백질의 농도 및 유리 PSA의 비율을 토대로, 조합된 스코어 수치 (combined score value)를 계산하는 제2 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    제2 단계 다음에, 제3 단계에서, 제2 단계에서 구한 조합된 스코어 수치를 토대로 개체의 생검 양성 및/또는 전립선 암의 위험성을 결정하고, 상기 조합된 스코어 수치가 해당 역치 값 보다 높을 경우 전립선 암에 대한 양성 정보로 및/또는 생검 요청으로 간주하는, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 조합된 스코어 수치는 하기 식으로 계산되는, 방법:
    Figure pct00009

    상기 식에서, βi는 실험 데이타를 이용한 최적화를 통해 사전 결정된 회귀 계수이고, β0는 절편이고, x i는 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액에서 해당 단백질의 측정 농도이고, 유리 PSA (%fPSA)의 경우 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액에서의 비율임.
  6. 제5항에 있어서,
    제1 단계에서, THBS1 (ng/ml로 표시됨)의 농도 및 유리 PSA의 비율 (%fPSA) (0-1의 숫자 범위로 표시됨), 바람직하게는 CTSD (ng/ml로 표시됨)의 농도를 측정하고,
    바람직하게는,
    THBS1 및 유리 PSA의 비율 (%fPSA)을 측정하는 경우, 조합된 스코어 수치 계산에서, 회귀 계수는 다음과 같이 선정되며:
    β0 4.0 - 5.5 또는 4.5 - 5.0, 바람직하게는 4.5 - 5.0 또는 4.7 - 4.8 범위;
    βTHBS1 (-0.00012) - (-0.00003) 또는 (-0.00009) - (-0.00003), 바람직하게는 (-0.0000400009) - (-0.000046) 또는 (-0.00006) - (-0.00004) 범위;
    β%fPSA (-7.5) - (-2.5), 바람직하게는 (-5.5) - (-5.0) 범위,
    더 바람직하게는, 90% 민감도에서, 조합된 스코어 수치의 역치는 0.28 - 0.35, 바람직하게는 0.30 - 0.34 또는 0.30 - 0.33으로 선택되거나;
    또는, 바람직하게는,
    THBS1을 측정하는 경우, 조합된 스코어 수치, 유리 PSA의 비율 (%fPSA) 및 CTSD의 계산시, 회귀 계수는 다음과 같이 선정되며:
    β0 3 - 4.2 또는 3 - 3.4, 바람직하게는 3.8 - 4.0 또는 3.1 - 3.3 범위;
    βCTSD 0.003 - 0.05 또는 0.005 - 0.05, 바람직하게는 0.004 - 0.006 또는 0.008 - 0.012의 범위;
    βTHBS1 (-0.0002) - (-0.00005) 또는 (-0.00009) - (-0.00003), 바람직하게는 (-0.00012) - (-0.00008) 또는 (-0.00007) - (-0.00006)의 범위;
    β%fPSA (-7.5) - (-2.5), 바람직하게는 (-5.2) - (-5.0) 또는 (-5.2) - (-2.5)의 범위,
    더 바람직하게는, 90% 민감도에서, 조합된 스코어 수치의 역치는 0.28 - 0.40 또는 0.28 - 0.35, 바람직하게는 0.35 - 0.37 또는 0.33 - 0.34로 선택되는, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    제1 단계에서, THBS1 (ng/ml로 표시됨)의 농도, 유리 PSA의 비율 (%fPSA) (0-1의 숫자 범위로 표시됨) 및 OLFM4 (ng/ml로 표시됨)의 농도를 측정하고, 바람직하게는, 조합된 스코어 수치의 계산에서, 회귀 계수는 다음과 같이 선정되며:
    β0 4.0 - 5.2, 바람직하게는 4.4 - 4.8의 범위;
    βOLFM4 0.001 - 0.01, 바람직하게는 0.002 - 0.004의 범위;
    βTHBS1 (-0.00009) - (-0.00002), 바람직하게는 (-0.00006) - (-0.00004)의 범위;
    β%fPSA (-7.5) - (-2.5), 바람직하게는 (-5.9) - (-4.8)의 범위,
    더 바람직하게는, 90% 민감도에서, 조합된 스코어 수치의 역치는 0.27 - 0.35, 바람직하게는 0.3 - 0.34로 선택되거나, 및/또는
    THBS1의 농도 (ng/ml로 표시됨), 유리 PSA의 비율 (%fPSA) (0-1의 숫자 범위로 표시됨) (%fPSA) 및 ICAM1의 농도 (ng/ml로 표시됨)를 제1 단계에서 측정하고, 바람직하게는 조합된 스코어 수치의 계산에서, 회귀 계수는 다음과 같이 선정되며:
    β0 4.0 - 5.2, 바람직하게는 4.6 - 4.9의 범위;
    βICAM1 (-0.002) - (-0.0001), 바람직하게는 (-0.0010) - (-0.0005)의 범위;
    βTHBS1 (-0.0001) - (-0.00001), 바람직하게는 (-0.00008) - (-0.00004)의 범위;
    β%fPSA (-7.5) - (-2.5), 바람직하게는 (-5.8) - (-4.9)의 범위,
    더 바람직하게는, 90% 민감도에서, 조합된 스코어 수치의 역치는 0.25 - 0.35, 바람직하게는 0.3 - 0.33으로 선택되는, 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    THBS1의 농도 (ng/ml로 표시됨), 유리 PSA의 비율 (%fPSA) (0-1의 숫자 범위로 표시됨) (%fPSA) 및 OLFM4, ICAM1 및 CTSD의 농도 (각각 ng/ml로 표시됨)를 제1 단계에서 측정하고, 바람직하게는 조합된 스코어 수치의 계산에서, 회귀 계수는 다음과 같이 선정되며:
    β0 3 - 3.8, 바람직하게는 3.5 - 3.6의 범위;
    βOLFM4 0.001 - 0.003, 바람직하게는 0.0015 - 0.0025의 범위;
    βICAM1 (-0.004) - (-0.002), 바람직하게는 (-0.0035) - (-0.00025)의 범위;
    βCTSD 0.005 - 0.05, 바람직하게는 0.008 - 0.012의 범위;
    βTHBS1 (-0.00009) - (-0.00003), 바람직하게는 (-0.00007) - (-0.00006)의 범위;
    β%fPSA (-7.5) - (-2.5), 바람직하게는 (-5.2) - (-4.8)의 범위,
    더 바람직하게는, 90% 민감도에서, 조합된 스코어 수치의 역치는 0.3 - 0.35, 바람직하게는 0.32 - 0.335로 선택되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 THBS1 및/또는 CTSD, OLFM4, ICAM1 중 하나 이상의 측정은 당화, 인산화, 지질화 (lipidation)를 포함하는 번역 후 수정 (post-translational modification)을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    THBS1, CTSD, OLFM4, ICAM1 중 하나 이상의 농도 측정을 위해, 상기 개체의 혈청, 혈장 또는 혈액을, pH 조절제, 바람직하게는, Tris (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄), Pipes (피페라진-1,4-비스-2-에탄 설폰산), Mes (4-모르폴리노 에탄 설폰산), Hepes (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진-에탄 설폰산), 포스페이트 완충화된 염수 (PBS) 중 하나 이상의 시스템으로부터 선택되는 pH 조절제를 포함하는 pH 7-7.4의 완충제, 및 선택적으로, 0.01-0.1% (v/v), 바람직하게는 0.025-0.05% (v/v) 농도의 비-이온성 디터전트와 같은 하나 이상의 시스템으로부터 선택되는 부가적인 성분으로 희석하고,
    상기 비-이온성 디터전트는, m이 5-40의 정수인 도데실폴리(에틸렌글리콜에테르)m; 1-O-n-옥틸-β-D-글루코피라노시드 (n-옥틸글루코시드); m이 5-40의 정수, 바람직하게는 m=11인 알킬페놀폴리(에틸렌글리콜-에테르)m; 1-O-n-도데실-β-D-글루코피라노실 (1-4)alpha-D-글루코피라노시드; m이 5-40의 정수인, 바람직하게는 m=23인 도데실폴리-(에틸렌글리콜에테르)m; 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노 지방산 에스테르, 바람직하게는 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노올리에이트, 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노라우레이트, 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노팔미테이트, 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노스테아레이트)로부터 선택되는 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노 지방산 에스테르; m이 5-40의 정수, 바람직하게는 m=10인 옥틸페놀폴리(에틸렌글리콜에테르)m; 소 혈청 알부민; 마우스 IgG; 보바인 감마 글로불린; 소 태아 혈청; 말 혈청으로 이루어진 군으로부터 하나 이상으로 선택되고,
    바람직하게는, 상기 완충제는 50-850mM, 바람직하게는 200-400 mM 또는 250-370 mM의 이온 강도를 가지는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    THBS1을 측정하기 위해 희석하는 경우, 효소 연결된 면역흡착 분석에서의 희석 배수는 1:1,000-1:20,000, 바람직하게는 1:1,000-1:3,000 또는 1:2,000-1:3,000이고, 비드를 이용한 분석에서의 희석 배수는 1:5,000-1:15,000이거나, 및/또는
    단백질 CTSD를 측정하기 위해 희석하는 경우, 효소 연결된 면역흡착 분석에서의 희석 배수는 1:5-1:70 또는 1:5-1:30, 바람직하게는 1:10-1:50 또는 1:10-1:30이고, 비드를 이용한 분석에서의 희석 배수는 1:10-1:20이며, 바람직하게는, 사용되는 완충제에 폴리(옥시에틸렌)(20)-소르비탄 모노라우레이트로서 선택되는 비-이온성 디터전트가 추가적인 농도 0.05% (v/v)로 첨가되거나, 및/또는
    ICAM1을 측정하기 위해 희석하는 경우, 희석 배수는 1:50-1:200, 바람직하게는 1:80-1:150이고, 사용되는 완충제에 소듐 클로라이드가 추가적인 함량 250 mM로 첨가되거나, 및/또는
    OLFM4를 측정하기 위해 희석하는 경우, 희석 배수는 1:5-1:30, 바람직하게는 1:5-1:20이고, 바람직하게는 사용되는 완충제에 소듐 클로라이드가 추가적인 함량 250 mM로 첨가되고, 환원제, 바람직하게는 다이티오트레이톨로서 선택되는 환원제가 5 mM 농도로 첨가되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이,
    상기 개체의 혈청, 혈장 또는 혈액을, 바람직하게는 희석한 후, 각 단백질에 대한 하나 이상의 치환성 물질과 접촉시키고, 해당 단백질과 하나 이상의 친화성 물질 간의 결합 형성 유무를 검출하고, 해당 단백질의 농도 또는 유리 PSA의 경우 이의 비율에 대한 정량적인 데이터를 이용하여, 오리지날 혈청, 혈장 또는 혈액에서 각 농도를 계산함으로써 수행되는 제1 단계를 포함하고,
    제1 단계에서, 바람직하게는 가시적인 판독을 이용하여 해당 단백질에 특이적인 샌드위치 효소 연결된 면역흡착 분석이 사용되거나, 및/또는 바람직하게는 형광 판독을 이용하여 해당 단백질에 대한 샌드위치 비드 항체 분석이 사용되는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    바람직하게는 가시적인 판독을 이용한, 해당 단백질에 특이적인 샌드위치 효소 연결된 면역흡착 분석 및/또는 바람직하게는 형광 판독을 이용한, 해당 단백질에 대한 샌드위치 비드 항체 분석이, 인간 THBS1, CTSD, ICAM1 및 OLFM4의 각각의 재조합 단백질과, 이것으로 마우스를 면역화하여 제조한 마우스 단일클론 항체를 이용하여 수행되는 분석인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 단백질의 농도의 정량적인 검출은 외부 단백질 표준물질에 대한 바이오마커의 농도를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 결정 단계는 동일한 세트의 측정 샘플에서 측정될 단백질의 희석에 대해 사용할 완충제와 동일한 완충제에 희석한 단백질 표준물질에 대해 복수의, 바람직하게는 5-7가지의 지정된 농도에서 측정하여 기준 표준 곡선을 작성하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 암, 특히 국소화된 전립선 암을 포함하는 전립선 암의 모니터링, 진단, 전립선 생검 결과 예측, 예후, 위험 평가, 치료법 선택, 치료 모니터링 중 하나 이상을 수반하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는
    암, 특히 국소화된 전립선 암을 포함하는 전립선 암의 모니터링, 진단, 전립선 생검 결과 예측, 예후, 위험 평가, 치료법 선택, 치료 모니터링 중 하나 이상을 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111621561B (zh) * 2020-06-15 2021-12-21 浙江大学 Olfm4在非酒精性脂肪肝（nafld）中的应用
CN117546024A (zh) 2021-06-29 2024-02-09 普罗泰奥梅迪克斯公司 在人样品中检测蛋白质与mpmri数据的组合方法
WO2023274742A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Proteomedix Ag Method of detecting proteins in human samples and uses of such methods

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011521215A (ja) * 2008-05-14 2011-07-21 エーテーハー チューリヒ 前立腺癌の診断及び治療のためのバイオマーカー及び薬剤標的発見法、並びにそれを用いて決定されるバイオマーカーアッセイ
JP6351112B2 (ja) * 2012-01-31 2018-07-04 ジェノミック ヘルス， インコーポレイテッド 前立腺癌の予後を定量化するための遺伝子発現プロフィールアルゴリズムおよび試験

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698402A (en) * 1995-02-23 1997-12-16 Dianon Systems, Inc. Methods for diagnosing benign prostatic hyperplasia
US20100136584A1 (en) * 2008-09-22 2010-06-03 Icb International, Inc. Methods for using antibodies and analogs thereof
WO2014079865A1 (en) * 2012-11-20 2014-05-30 Phadia Ab Method for indicating a presence or non-presence of aggressive prostate cancer
DK3117216T3 (da) * 2014-03-11 2023-04-03 Phadia Ab Fremgangsmåde til detektering af en solid tumor-cancer
US9851421B2 (en) * 2015-01-05 2017-12-26 Case Western Reserve University Differential atlas for cancer assessment

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011521215A (ja) * 2008-05-14 2011-07-21 エーテーハー チューリヒ 前立腺癌の診断及び治療のためのバイオマーカー及び薬剤標的発見法、並びにそれを用いて決定されるバイオマーカーアッセイ
JP2013140170A (ja) * 2008-05-14 2013-07-18 Eth Zurich 前立腺癌の診断及び治療のためのバイオマーカー及びそれを用いて決定されるバイオマーカーアッセイ
JP6351112B2 (ja) * 2012-01-31 2018-07-04 ジェノミック ヘルス， インコーポレイテッド 前立腺癌の予後を定量化するための遺伝子発現プロフィールアルゴリズムおよび試験

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Brian M Nolen et al, PLOS ONE (2013), vol 8, issue 5, e63368. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019527840A (ja) 2019-10-03
EP3270163B1 (en) 2018-09-05
US11320435B2 (en) 2022-05-03
CN109477836B (zh) 2022-09-30
ES2688213T3 (es) 2018-10-31
AU2017294979A1 (en) 2019-01-17
DK3270163T3 (en) 2018-11-19
WO2018011212A1 (en) 2018-01-18
CA3028874A1 (en) 2018-01-18
JP6979712B2 (ja) 2021-12-15
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