CN105181971A - 一种用于肝癌血清学预测的结合珠蛋白试剂盒 - Google Patents

一种用于肝癌血清学预测的结合珠蛋白试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，包含Fuc-Hp半定量检测ELISA板，所述的Fuc-Hp半定量检测ELISA板包括反相AAL-ELISA板和Protein-ELISA板。本发明通过反相AAL-ELISA和Protein-ELISA的制备与检测，分别形成AAL-抗原-Hp抗体复合物和Hp抗体-抗原-酶标抗体复合物，以AAL结合Hp的吸光度(OD值)与Hp蛋白的吸光度比值作为衡量单位Hp蛋白中结合岩藻糖的含量(Fuc-Hp)，通过对临床资料进行回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数，获得受试者工作曲线(ROC)以及判别(Cut？off)值，该函数对于HCC的诊断灵敏度和特异度分别为68.36％和95.92％，AUC为0.836。本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性，高特异性，检测快速准确等突出优点，对肝癌的诊断具有重要的临床价值。

Description

一种用于肝癌血清学预测的结合珠蛋白试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学领域，与应用性基础医学研究和临床研究相联系；涵盖肿瘤学、诊断学，糖生物学。
背景技术
肝癌(HCC)是一种多基因参与，多因素介导，发病机制复杂的常见恶性肿瘤。肝癌发病率世界第六，致死率世界第二，约50％的肝癌发生在我国。绝大多数患者发病隐匿，出现临床症状后就医时已属晚期，丧失了治疗的良机，因此早期诊断对于提高患者的生存率至关重要。目前，肝癌的主要的临床检测为超声成像检测和肝癌血清标志物AFP的检测。超声成像因操作者的不同而容易产生误差，而AFP作为诊断标志物检测和诊断准确率会比超声成像更低。因此，很多研究仍在致力于寻找新的肝癌诊断标志物。
在蛋白质不同的翻译后修饰中，糖基化最为常见，几乎50％的蛋白质都被认为具有糖基化修饰。糖链结构在众多病理过程中产生特异性的改变，如类风湿性关节炎、囊肿性纤维化、动脉粥样硬化以及多种肿瘤。因此蛋白质分子的聚糖结构改变可以作为肿瘤的分子诊断标志物，亦可成为潜在的肿瘤治疗靶点。例如，已被FDA批准作为HCC的诊断标志物的L3型甲胎蛋白(AFP-L3)是岩藻糖基化的AFP。岩藻糖修饰能赋予聚糖很多独特的功能特性，其在输血反应、凝集素介导的白细胞和内皮的粘附、宿主和微生物相互作用和个体发育等方面发挥重要作用。此外，岩藻糖还参与构成某些重要粘附分子的聚糖结构，与肿瘤转移关系密切。在癌症中发现sialylLewisx和sialylLewisa含量增多，许多肿瘤中A和B型血型抗原丢失伴随着H血型抗原和Lewisy表达升高。
目前检测糖蛋白聚糖结构变化的技术方法有生物质谱、液相色谱和植物凝集素亲和印迹等，其中植物凝集素是一类存在于多数植物中的糖蛋白，其最大特点是能够识别糖蛋白和糖脂中的聚糖，特别是细胞膜中复杂结构的聚糖即细胞膜表面决定簇，它们与聚糖的结合是非共价且可逆的。AAL是一种亲和α连接岩藻糖(TerminalαFuc和±Sia-Lex)的植物凝集素，结合珠蛋白(Hp)是一种急性反应性蛋白，能与血红蛋白结合，防止体内铁的丢失和减少肾损害。其分子量为90kDa，是由两个α和两个β亚基组成的四聚体，亚基间通过二硫键相连。结合珠蛋白在体内合成初期是一条分子量为38kDa的多肽，由三部分组成，即α、β亚基区域及N-末端的信号肽序列，在翻译后修饰过程中，信号肽被水解掉，同时通过膜相关的酶体系将核心寡糖合并入β区域。结合珠蛋白β亚基含有4个潜在的N-糖基化位点，分别为Asn184、Asn207、Asn211和Asn241。在前期工作中，发现相比于健康正常人，肝癌患者血清单位Hp亲和杨树茹凝集素(AAL)能力显著升高，说明肝癌患者的单位Hp岩藻糖基化聚糖含量升高。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较高准确率的用于肝癌血清学预测的试剂盒。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，包含Fuc-Hp半定量检测ELISA板，所述的Fuc-Hp半定量检测ELISA板包括反相AAL-ELISA板和Protein-ELISA板。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的结合珠蛋白试剂盒还包含一个HCC预测模型：
P＝exp(-1.109+3.928*Fuc-Hp)/[1+exp(-1.109+3.928*Fuc-Hp)]
其中，所述的Fuc-Hp值的计算方法为：每个血清样品中AAL结合Hp的实际OD值与相同血清样品中Hp蛋白的实际OD值的比值，所述的血清样品中AAL结合Hp的实际OD值通过反相AAL-ELISA板检测得到，血清样品中Hp蛋白的实际OD值通过Protein-ELISA板检测得到，该模型区分肝癌和健康正常人的Cutoff值为0.6100。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的结合珠蛋白试剂盒还包含AAL，其浓度为5μg/mL。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的结合珠蛋白试剂盒还包含用于封闭反相AAL-ELISA板的封闭剂，为3％BSA溶液。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的结合珠蛋白试剂盒还包含血清稀释液，所述的血清稀释液含有0.1MTris-HCl、0.15MNaCl、1mMCaCl2和1mMMgCl2，pH为7.5。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的试剂盒还包含用于Protein-ELISA板的捕获抗体。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的试剂盒还包含用于反相AAL-ELISA板和Protein-ELISA板的酶标Hp抗体。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的试剂盒还包含底物溶液。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的试剂盒还包含终止液。
优选地，所述的用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒还包含采集血样装置及操作说明书。
本发明中提及的Hp蛋白由前期糖蛋白质组学工作确定单位Hp亲和AAL能力显著增强，说明肝癌患者的单位Hp岩藻糖基化聚糖含量增多。
本发明主要是建立并优化反相AAL-ELISA和Protein-ELISA方法，确定最优的捕获AAL浓度、血清样品的上样量、血清稀释液及选择酶标抗体；并选择合适的反相AAL-ELISA封闭剂。排除Hp抗体与其它抗原的交叉反应，确立反相AAL-ELISA和Protein-ELISA对Hp的检测范围和重复性，构建可用于临床血清样品筛查的Fuc-Hp半定量检测系统。
如图1所示，本发明通过反相AAL-ELISA和Protein-ELISA的制备，联合并行分析血清中Hp的岩藻糖(Fuc)和蛋白的表达水平，用于肝癌和健康正常人血清中单位Hp蛋白中结合岩藻糖的含量(Fuc-Hp)的定量检测。并根据Fuc-Hp的检测数据和临床资料的回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数可用于原发性肝细胞肝癌的早期筛查。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过反相AAL-ELISA和Protein-ELISA的制备与检测，分别形成AAL-抗原-Hp抗体复合物和Hp抗体-抗原-酶标抗体复合物，以AAL结合Hp的吸光度(OD值)与Hp蛋白的吸光度比值作为衡量单位Hp蛋白中结合岩藻糖的含量(Fuc-Hp)，通过对临床资料进行回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数，获得受试者工作曲线(ROC)以及判别(Cutoff)值，该函数对于HCC的诊断灵敏度和特异度分别为68.36％和95.92％，AUC为0.836。本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性，高特异性，检测快速准确等突出优点，对肝癌的诊断具有重要的临床价值。本发明适用于肝癌高发现场或者肝病人群大规模筛查，对于提高肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肝癌病死率具有非常重要的意义。
附图说明
图1为高通量Fuc-Hp检测系统原理示意图；
图2为反相AAL-ELISA和Protein-ELISA的线性检测范围图；
图3为Fuc-Hp检测系统构建的ROC曲线图；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例
一、一种用于肝癌血清学预测的结合珠蛋白试剂盒，包含如下组分：
1、Fuc-Hp半定量检测ELISA板，所述的Fuc-Hp半定量检测ELISA板包括反相AAL-ELISA板和Protein-ELISA板。
2、HCC预测模型：
P＝exp(-1.109+3.928*Fuc-Hp)/[1+exp(-1.109+3.928*Fuc-Hp)]
其中，所述的Fuc-Hp值的计算方法为：每个血清样品中AAL结合Hp的实际OD值与相同血清样品中Hp蛋白的实际OD值的比值，所述的血清样品中AAL结合Hp的实际OD值通过反相AAL-ELISA板检测得到，血清样品中Hp蛋白的实际OD值通过Protein-ELISA板检测得到，该模型区分肝癌和健康正常人的Cutoff值为0.6100。
3、AAL(Vector，L-1390)，其浓度为5μg/mL。
4、用于封闭反相AAL-ELISA板的封闭剂(3％BSAinPBS，pH7.2-7.4)。
5、血清稀释液(含有0.1MTris-HCl、0.15MNaCl、1mMCaCl2和1mMMgCl2，pH7.5)。
6、用于Protein-ELISA板的捕获抗体(R&Dsystem，CatalogNumberDHAPG0)。
7、用于反相AAL-ELISA板和Protein-ELISA板的酶标Hp抗体(R&Dsystem，CatalogNumberDHAPG0)。
8、底物溶液(ELISAStarterKit，K0331002)
9、终止液(ELISAStarterKit，K0331002)
10、采集血样装置及操作说明书。
二、检测方法：
(一)反相AAL-ELISA板的预处理方法：
1、取反相AAL-ELISA板；
2、捕获AAL：在反相AAL-ELISA板中加入AAL，浓度为5μg/mL，100μL/well，4℃孵育过夜。
3、洗板：采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
4、封闭：反相AAL-ELISA板采用封闭剂(3％BSAinPBS，pH7.2-7.4)；室温封闭1h，200μL/well。
5、洗板：采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。用于下述步骤。
(二)Fuc-Hp半定量检测ELISA检测方法：
1、加样：反相AAL-ELISA板加入采用血清稀释液(0.1MTris-HCl，0.15MNaCl，1mMCaCl2，1mMMgCl2，pH7.5)进行50倍稀释的血清原液，100μL/well，室温1h。
2、洗板：反相AAL-ELISA板采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
3、检测试剂：反相AAL-ELISA板中加入酶标Hp抗体，100μL/well，室温1h。
4、洗板：反相AAL-ELISA板采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
5、加底物溶液：反相AAL-ELISA板加入底物溶液(ELISAStarterKit，K0331002)按照TMB∶H2O2＝1∶2混合，100μL/well，室温20min。
6、加终止液(ELISAStarterKit，K0331002)：反相AAL-ELISA板中加入100μLStopSolution/well，终止液的加入顺序与底物溶液的加入顺序相同。
7、检测：立即用NanoQuantinfiniteM200(TECAN)酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
8、Protein-ELISA则采用常规检测方法：
1)加样：Protein-ELISA板加入采用CalibratorDiluentRD5-67(R&Dsystem，CatalogNumberDHAPG0)进行10000倍稀释的血清原液，室温2h。
2)洗板：采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
3)检测试剂：Protein-ELISA板中加入酶标Hp抗体，200μL/well，室温1h。
4)洗板：采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
5)加底物溶液：将底物溶液(ELISAStarterKit，K0331002)按照TMB∶H2O2＝1∶2混合，100μL/well，室温20min。
6)加终止液(ELISAStarterKit，K0331002)：100μLStopSolution/well，终止液的加入顺序与底物溶液的加入顺序相同。
(三)Fuc-Hp半定量检测ELISA分析方法：
1、数据：每个血清样品的OD值应减去空白孔的OD值为实际OD值。每个血清样品AAL结合Hp的实际OD值(反相AAL-ELISA)与此相同血清样品Hp蛋白的实际OD值(Protein-ELISA)比值即为Fuc-Hp值。
按照上述的HCC预测模型计算P值，将P值与Cutoff值比较，＞0.6100为肝癌，＜0.6100为正常人。
采用实施例中的试剂盒和检测方法，联合并行分析98例肝癌患者和98例正常人中Hp的岩藻糖和蛋白的表达水平，计算得到Fuc-Hp含量。采用SPSS软件logistic回归分析建立的上述HCC预测模型进行检测区分肝癌和正常人的Cutoff值为0.6100。结果如图3所示，本发明试剂盒的灵敏度为68.36％，特异度95.92％，AUC为0.836。因此，本发明具有高特异性，对肝癌的预测具有重要临床价值。
采用Hp标准品进行倍比稀释，确定反相AAL-ELISA线性检测范围。结果如图2所示，反相AAL-ELISA的定量线性检测范围为0～2μg/mL。

Claims (10)

1.一种用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，包含Fuc-Hp半定量检测ELISA板，所述的Fuc-Hp半定量检测ELISA板包括反相AAL-ELISA板和Protein-ELISA板。
2.如权利要求1所述的用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，还包含一个HCC预测模型：
P＝exp(-1.109+3.928*Fuc-Hp)/[1+exp(-1.109+3.928*Fuc-Hp)]
其中，所述的Fuc-Hp值的计算方法为：每个血清样品中AAL结合Hp的实际OD值与相同血清样品中Hp蛋白的实际OD值的比值，所述的血清样品中AAL结合Hp的实际OD值通过反相AAL-ELISA板检测得到，血清样品中Hp蛋白的实际OD值通过Protein-ELISA板检测得到，该模型区分肝癌和健康正常人的Cutoff值为0.6100。
3.如权利要求1所述的用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，还包含AAL，其浓度为5μg/mL。
4.如权利要求1所述的用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，还包含用于封闭反相AAL-ELISA板的封闭剂，为3％BSA溶液。
5.如权利要求1所述的用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，还包含血清稀释液，所述的血清稀释液含有0.1MTris-HCl、0.15MNaCl、1mMCaCl2和1mMMgCl2，pH为7.5。
6.如权利要求1所述的用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，还包含用于Protein-ELISA板的捕获抗体。
7.如权利要求1所述的用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，还包含用于反相AAL-ELISA板和Protein-ELISA板的酶标Hp抗体。
8.如权利要求1所述的用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，还包含底物溶液。
9.如权利要求1所述的用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，还包含终止液。
10.如权利要求1所述的用于诊断肝癌的结合珠蛋白试剂盒，其特征在于，还包含采集血样装置及操作说明书。
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