KR20080048200A

KR20080048200A - 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 비율을 이용한 간질환 진단킷트

Info

Publication number: KR20080048200A
Application number: KR1020060118248A
Authority: KR
Inventors: 송은영; 김대광; 박미영; 이희구; 김재화; 최인성; 정태화; 서현효; 박주웅; 이정일
Original assignee: 한국생명공학연구원; 주식회사 한립생명공학
Priority date: 2006-11-28
Filing date: 2006-11-28
Publication date: 2008-06-02
Also published as: KR100834932B1

Abstract

본 발명은 경쟁반응에 의한 알파1산 당단백질측정방법과 측정용 킷트 및 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도의 비율을 측정하여 간질환을 진단하는 방법으로, 본 발명의 측정방법과 측정용 킷트는 간경화, 간암 등 간 질환의 조기진단과 치료성과의 평가에 유용하게 사용할 수 있으며, 다량의 시료를 동시에 재현성 있고 정확하게 측정할 수 있는 장점이 있다.

아시알로 알파1산 당단백질, 알파1산 당단백질, 간질환, 진단, 킷트

Description

알파1산 당단백질 측정방법 및 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 비율을 이용한 간질환 진단방법 및 킷트{Method for measuring ratio serum asialo-α1-acid glycoprotein concentration and α1-acid glycoprotein concentration for diagnosis of hepatic disease and a kit therefor}

도 1은 사람혈액으로부터 분리된 아사이알로 알파1산을 SDS-PAGE (A) 및 웨스턴 블럿 (B)에 의해 확인한 사진이다.

도 2는 항체를 정제한 후 SDS 전기영동한 결과를 보여주는 사진이다.

도 3은 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도에 따른 반응성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 알파1산 당단백질에 대한 표준곡선을 나타낸 그래프이다.

도 5는 정상인과 간 질환 환자의 혈청의 희석 정도에 따른 알파1산 당단백질의 농도 측정 결과를 각각 나타낸 곡선이다.

도 6은 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질을 동시에 측정 그 비율에 따른 간질환을 진단하는 예로서, 정상인, 만성간염환자, 간경변환자, 간암환자의 혈청시료에 각각 함유된 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 비율을 표시한 도표이다.

본 발명은 간편하고 정확한 간질환 진단방법 및 그를 위한 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈액내 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 비율을 이용하여 간질환을 진단하는 방법과 측정용 킷트(kit)에 관한 것이다. 즉, 당단백질 가운데 알파1산 당단백질(α1-acid glycoprotein, AGP)의 아사이알로 형이 차지하는 비율을 이용하여 간질환을 진단하는 방법이다.

알파1산 당단백질을 측정하기 위하여 이 당단백질에 대한 항체( PCT/KR2003/002860, US 0514 (10/540,848), 일본 2004-563022, 중국 200380107725.0, 유럽 03779033.4, 인도 1296/KOLNP/2005, 인도네시아 W002005 01959)를 이용하여 경쟁반응을 일으켜 혈액내 알파1산 당단백질(AGP)양을 측정하였고 아사이알로 형의 알파1산 당단백질은 선행특허 (PCT/KR00/00840, US pendinding # 09/662,363)에 따라 항체-렉틴 샌드위치 법에 의해 아사이알로 형의 알파1산 당단백질을 측정하였다. 전체 알파1산 당단백질 중 아사이알로 알파1산 당단백질이 차지하는 비율을 계산, 간질환 진단에 이용하였다. 본 특허는 이에 대한 각각의 방법과 측정용 킷트에 관한 것이다.

간염, 간경변, 간암 등을 포함한 간 질환은 한국, 일본, 대만, 중국, 대부분의 동남아 국가에서 단일 질병으로는 가장 많은 환자가 발생하고 있으며, 현재는 간 질환 진단시 뇨 중 빌리루빈(bilirubin)이나 우로빌리노겐(urobilinogen)의 검출정도를 보거나, 혈액 중 GOT(glutamic-oxaloacetic transaminase), GPT(glutamic pyruvic transaminase), 총 빌리루빈, 알부민, 단백질, 유산 탈수소효소 등의 양을 측정하여 생화학적 성분 변화를 보거나, B형 간염 바이러스(HBV) 또는 C형 간염 바이러스(HCV)의 항원 또는 항체를 탐지하여 간 질환을 진단하고 있다. 그 외에도 간암 진단에는 알파-페토 단백질(alpha-feto protein, AFP) 및 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen; CEA) 검사가 이용되고 있다. 그러나 간장은 복잡한 여러 기능을 지니고 있으며, 간장의 이상을 쉽게 감지하지 못하는 생체적인 특이성이 존재하고, 간 질환 조기진단기술 미비로 인하여 간 질환이 크게 악화된 후 진단되는 경우가 많아서 간 질환 치료에 어려움이 있다. 간 질환이 급성 간염에서 만성 간염, 간경변, 간암으로 또는 간염에서 간암으로 진전되어 가는 경우에 그 과정을 추적/진단하기 위해서는 효과적인 진단체제가 필요하며, 간 질환의 조기 진단은 질병의 효과적인 치료를 위해 그리고 치명적인 간경변이나 간암으로 진전되는 것을 방지하는데 반드시 필요하다. 그러므로 간 질환의 조기 임상진단과 간 질환 환자에 대한 질병의 진행 상황을 정확하게 반영해 주는 간 질환의 표식자(marker)를 예민하고 특이하게 분석해 낼 수 있는 진단방법이 필요하다.

아사이알로당단백질과 아사이알로당단백질 수용체에 대한 연구는 1970년대 초부터 주로 동물모델을 대상으로 연구가 시작되어 1990년대 초부터 인간의 아사이알로당단백질 및 아사이알로당단백질 수용체에 대한 연구가 본격적으로 진행되었다. 여러 논문을 통해 아사이알로당단백질과 그의 수용체가 간의 정상 기능과 특 이적인 관계를 가지고 있으며 이들의 혈 중 또는 간 조직 내에서의 농도는 정상적인 간 기능 또는 환자의 임상적인 상태를 반영하는 것으로 보고되었다(T.Sawamura, et al, Gastrologia Japonica, 1985:20;201∼208., T.Sawamura, et al. Gastroenterology, 1981;81:527∼533., T.Sawamura, et al, Gastroenterology, 1984:87;1217∼1221). 이를 기반으로 본 발명자들에 의해 asialoglycoprotein 중 아사이알로 알파1산 당단백질을 측정하는 진단 방법 및 킷트를 개발, 간질환 환자 혈청 중 아사이알로 알파1산 당단백질의 양을 측정 간질환 진단에 이용한 바 있다(PCT/KR00/00840, US pendinding # 09/662,363).

혈청중 아사이알로 알파1산 당단백질은 간염, 간경변, 간암으로 진행될수록 혈중 농도가 높아지므로 간질환 특히 간경변 이상의 간질환에서 진단으로서의 가치가 높으며 간질환 발전 단계를 잘 반영시켜주고 있다. 이와 같이 아사이알로 알파 1산 당단백질에 의한 간질환 진단은 기존의 간 질환 진단 마커보다도 간장의 기능에 직접 관계가 되는 물질을 간 질환 발생 또는 진전의 표식으로 이용하려는 시도로서 간 질환 진단 기술의 새로운 방향을 제시하였을 뿐 아니라 간 질환의 조기진단으로 조기치료의 길을 열게 하였다.

현재까지 간질환시 아사이알로 당단백질의 과잉분비 원인은 알려져 있지 않으나 간질환시 간세포의 기능상실로 인한 아사이알로 당단백질 수용체의 기능 부진과 간질환시 당단백질의 말단기에 있는 사이일산의 제거 증가로 인한 아사이알로 당단백질 분비 증대의 두가지 원인으로 보고 있다.

본 발명에서는 보다 정확한 간질환 진단을 하기 위해 아사이알로 알파1산 당 단백질에 의한 간질환의 원인을 규명하고 이를 반영하기 위하여 아사이알로 알파1산 당단백질과 함께 알파1산 당단백질을 함께 측정하여 그 비율로서 간암을 비롯한 간질환을 진단하는 방법을 개발하였다. 이 방법은 기존의 아사이알로 알파1산 당단백질을 이용한 간질환 진단 보다 특이도와 민감도를 높일 수 있는 방법이다.

알파1산 당단백질(α1-acid glycoprotein, AGP)은 간에서 생성되고 대사작용하는 당단백질로 혈청 단백질의 일종이며 구조적으로 immunoglobulin과 비슷한 당단백질(분자량이 40,000-44,000)이다. 당함량이 45%인 α1-globulin 분획이 포함된 당 단백질로서 사이알산(sialic acid)이 차지하는 비율이 11%나 되므로 사이알산(sialic acid)이 제거된 당단백질과 간 질환과의 관련성 연구에 중요할 것으로 유추되고 있다. 생물학적으로 progesterone의 inactivation, influenza에 의한 적혈구 응집반응의 억제작용의 기능이 있으며 급성 상 반응 물질(Acute phase reactants)로서 정상범위는 남성의 경우 45-98 ㎎/㎗, 여성의 경우 39-86 ㎎/㎗이다. 염증이나 수술 후에 증가가 느리다가 4-7일에 최고치를 보이는 경우가 많고 악성 종양에서 현저히 증가한다는 보고가 있다. 종래에는 알파1산 당단백질의 농도를 측정하기 위해 immunoturbidimetry, chemiluminescence immunoassay, nephelometric assay, ELISA와 같은 방법을 사용하였다. 본 발명에서는 알파1산 당단백질에 대한 경쟁반응(competition) 방법에 의해 혈액 중 알파1산 당단백질의 양을 측정하고 렉틴(lectin)-항체 샌드위치법에 의해 아사이알로 알파1산 당단백질 양을 측정, 두 물질 간 비율로서 간질환을 진단하였다. 두 물질을 동시에 측정 간질환 진단에 이용하는 것은 새로운 시도이다.

본 발명자들에 의한 알파1산의 농도와 아사이알로 알파1산의 농도 비를 측정하는 간암을 비롯한 간질환을 진단하는 방법은 기존의 방법들보다 질환에 대한 민감도와 특이도가 높고 다수의 시료를 동시에 측정할 수 있는 측정 방법 및 킷트이다.

본 발명의 목적은 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 혈중 농도비를 이용하여 재현성 있고 정확하게 간질환을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 간질환 진단방법을 간편하고 신속하며 재현성있게 수행할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명에서는 간장이 정상에서 간염, 간경변 또는 간암으로 이행될 때 혈액 내에서 과량으로 나타나는 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도를 측정, 그 비율로서 간질환을 진단하는 방법이다.

이를 위한 본 발명은, (A) 혈청 시료의 알파1산 당단백질의 농도를 측정하는 단계; (B) 혈청 시료의 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도를 측정하는 단계; (C) [(알파1산 당단백질의 농도)/(아사이알로 알파1산 당단백질의 농도)]값이 10% 이상이면 간질환인 것으로 판단하는 단계;를 포함하여 이루어지는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별방법을 제공한다.

또한 본 발명에서 상기 단계 (A)는 (a) 알파1산 당단백질의 1차 항체에 대한 2차 항체를 고상체에 흡착시키는 소단계; (b) 상기 고상체에 ① 1차 항체, ② 표지화된 알파1산 당단백질 및 ③ 알파1산 당단백질이 함유된 혈청 시료를 가하여 항체에 대해 경쟁반응을 시키는 소단계; (c) 상기 경쟁반응 이후에, 결합된 [(고상체)-(2차 항체)-(1차 항체)-(표지화된 또는 표지화되지 않은 알파1산 당단백질)] 복합체 이외의 물질을 세척하는 소단계; (d) 상기 고상체에 표지화된 알파1산 당단백질과 특이결합하는 제2표지물질을 가하여 충분히 반응시키는 소단계; 및 (e) 상기 제2표지물질을 검출하여 알파1산 당단백질의 상대적 농도를 측정하는 소단계;를 포함하여 이루어질 수도 있다. 이때 상기 표지화된 알파1산 당단백질은 바이오티닐회된 알파1산 당단백질이며, 상기 제2표지물질은 streptavidin-HRP인 것이 바람직하다. 이외에도 표지화된 알파1산 당단백질은 효소, 형광물질 또는 방사선 물질로 표지화된 것이 바람직하다

또한 본 발명에서 상기 단계 (B)는 (a) 아사이알로 알파1산 당단백질의 1차 항체를 고상체에 흡착시키는 소단계; (b) 상기 고상체에 아사이알로 알파1산 당단백질이 함유된 혈청 시료를 가하여 항체와 결합시키는 소단계; (c) 상기 결합 소단 계 이후에 아사이알로 알파1산 당단백질의 말단기에 노출된 당과 특이적으로 결합하는 표지물질을 가하여 반응시키는 소단계; 및 (d) 결합된 [(고상체)-(항체)-(아사이알로 알파1산 당단백질)-(표지물질)] 복합체 이외의 물질을 세척한 후 상기 표지물질을 검출하여 아사이알로 알파1산 당단백질의 (상대적) 농도를 측정하는 소단계;를 포함하여 구성될 수 있다. 이때 상기 표지물질은 효소, 형광물질 또는 방사선 물질로 표지된 렉틴인 것이 좋다.

본 발명에서는 상기단계 (A)와 (B)의 비율로서 간질환 여부를 판별한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서는, 알파1산 당단백질을 측정하기 위해 알파1산 당단백질을 인지하는 항체에 대한 경쟁반응법을 이용하였다. 즉, (a) 안정되고 많은 양의 항체가 반응하도록 항 마우스 IgG를 마이크로타이터 플레이트와 같은 고상체에 흡착시키고, (b) 고상체에 biotinylate로 접합시킨 알파1산 당단백질과 혈청 시료, 알파1산 당단백질에 대한 항체를 가하여 항체에 대해 혈청 중 알파1산 당단백질과 biotinylated 알파1산 당단백질이 경쟁하게 만들고 (c) 2차 표지물질이 결합된 스트렙타아비딘을 가하여 항체와 결합한 바이오티닐레이티드 알파1산 당단백질에 결합시키고, (d) 상기 표지물질을 검출하여 알파1산 당단백질의 농도를 측정하는 단계들을 포함한다.

또한 간이 정상에서 간염, 간경변 또는 간암으로 이행될 때 혈액내에서 과량 으로 형성되는 것으로 추정되는 아사이알로당단백질의 농도를 측정하기 위하여, 아사이알로당단백질에 대한 항체와 렉틴(lectin)을 이용하는 샌드위치 면역측정법을 제공한다. 즉, (a) 아사이알로당단백질에 대한 항체를 마이크로타이터 플레이트와 같은 고상체에 결합시키고, (b) 고상체에 혈청 시료를 가하여 혈중 아사이알로단백질을 항체에 결합시키고, (c) 표지물질이 접합된 렉틴을 가하여 항체에 결합한 아사이알로단백질에 결합시키고, (d) 상기 표지물질을 검출하여 아사이알로단백질의 농도를 측정하는 단계들을 포함한다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 방법은 예를 들어 다음과 같이 실시할 수 있다.

알파1산 당단백질의 양을 측정하기 위하여 알파1산 당단백질의 마우스 유래 1차 항체에 대한 2차 항체를 마이크로타이터 플레이트의 웰과 같은 고상체에 가하고 한시간 이상 방치하여 항체를 마이크로타이터 플레이트에 흡착시킨 다음, 소의 혈청 알부민 용액을 가하여 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시킨다. 세척액, 예를 들어, 트윈(Tween)계 계면활성제가 함유된 인산염 완충액(PBS)으로 웰을 세척한다. 한편 혈청자체가 지니고 있는 matrix effect를 최소화하고 측정하고자 하는 시료가 표준곡선 내에 들게 하기 위해 혈청시료를 혈청시료 희석 용액으로 미리 희석시켜 놓는다. 상기 세척액으로 웰을 세척한 후, 바이오틴이 결합된 알파1산 당단백질과 알파1산 당단백질이 들어있는 시료, 알파1산 당단백질에 대한 항체를 가해 항체에 대해 경쟁시키고 효소 또는 형광물질로 표지된 스트렙타아비딘(streptavidin), 예를 들어, 스트렙타아비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제 결합물을 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨다. 웰을 상기 세척액으로 세척한 후 효소의 발색기질, 예를 들어, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액을 각 웰에 가하여 발색시킨다. 일정시간 후 반응을 중지시키고 적절한 파장에서 흡광도를 측정한 후 알파1산 당단백질 표준액이 나타내는 흡광도와 비교하여 혈 중 알파1산 당단백질의 농도를 산출한다. 표지 물질이 형광 물질인 경우에는 형광 물질로 표지된 Streptavidine을 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨 다음 세척액으로 세척하고 형광 강도를 측정한다.

또한 아사이알로 알파1산 당단백질의 양을 측정하기 위하여 아사이알로 알파1산 당단백질에 대한 항체를 마이크로타이터 플레이트의 웰과 같은 고상체에 가하고 한 시간 이상 방치하여 항체를 마이크로타이터 플레이트에 흡착시킨 다음, 소의 혈청 알부민 용액을 가하여 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시킨다. 세척액, 예를 들어, 트윈(Tween)계 계면활성제가 함유된 인산염 완충액으로 웰을 세척한 후, 혈청시료 희석 용액을 각 웰에 가하고 실온에서 반응시킨다. 상기 세척액으로 웰을 세척한 후, 효소 또는 형광물질로 표지된 렉틴, 예를 들어, RCA-서양고추냉이 퍼옥시다제 결합물을 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨다. 웰을 상기 세척액으로 세척한 후 효소의 발색기질, 예를 들어, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액을 각 웰에 가하여 발색시킨다. 일정시간 후 반응을 중지시키고 적절한 파장에서 흡광도를 측정한 후 아사이알로 알파1산 당단백질 표준액이 나타내는 흡광도와 비교하여 혈 중 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도를 산출한다. 표지 물질이 형광 물질인 경우에는 형광 물질로 표지된 렉틴을 각 웰에 가하여 실온에서 반응시킨 다음 세척액으로 세척하고 형광 강도를 측정한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에서 당단백질에 대한 항체를 아사이알로당단백질을 인지하는 렉틴으로 대체하여, 렉틴을 마이크로타이터 플레이트에 흡착시키고 당단백질에 대한 항체를 표지물질로 표지하여 사용하는 변형된 방법도 포함한다.

본 발명의 측정방법에 의하여 아사이알로 알파1산 당단백질을 표준물질로 사용할 때 혈 중 아사이알로당단백질을 0.03 ㎍/㎖ ~ 10 ㎍/㎖의 농도 범위에서 검출할 수 있으며 알파1산 당단백질은 20 ㎍/㎖ ~ 1000 ㎍/㎖의 농도 범위에서 검출할 수 있다.

본 발명에서는, 또한 알파1산 당단백질 측정용 킷트로서, 마우스에 대한 항체가 흡착된 고상체 및 표지물질이 결합된 알파1산 당단백질, 알파1산 당단백질에 대한 항체, 표지물질이 포함한 효소 킷트를 제공한다. 즉 본 발명은, (A) 마우스에 대한 항체가 흡착된 고상체, 알파1산 당단백질에 대한 항체, 바이오티닐화된 알파1산 당단백질, 효소와 결합된 strepavidine 용액, 혈청시료 희석용액, 효소 기질용액, 세척액, 및 알파1산 당단백질 표준용액을 포함하는 제1킷트;와 (B) 아사이알로 알파1산 당단백질에 대한 항체가 흡착된 고상체, 서양고추냉이 퍼옥시다제-RCA 결합체 용액, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액, 혈청 희석용액 및 아사이알로당단백질 표준용액을 포함하는 제2킷트;를 포함하는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 측정용 킷트로 바람직하게는 고상체에 흡착된 마우스항체, 알파1 산 당단백질에 대한 항체, 바이오틴이 결합된 알파1산 당단백질, 스트렙타아비딘이 결합된 효소, 표지물질의 검출용액, 혈청 희석용액, 세척액, 및 아사이알로당단백질 표준용액을 포함한다. 표지물질이 효소인 경우, 표지물질의 검출용액은 효소의 기질 용액이고, 표지물질이 형광물질인 경우에는 표지 물질에서 방출되는 형광 강도를 직접 측정한다.

구체적으로 예를 들면, 본 발명의 측정용 킷트는 알파1산 당단백질 대한 항체 마우스항체가 흡착되어 있는 마이크로타이터 플레이트, 바이오틴이 결합된 알파1산 당단백질, 서양고추냉이 퍼옥시다제-스트렙타아비딘 결합체 용액, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액, 세척액으로서 트윈이 포함된 인산염 완충액 및 혈청 희석액, 알파1산 당단백질 표준용액을 포함한다.

또한 아사이알로당단백질 측정용 킷트로서, 당단백질에 대한 항체가 흡착된 고상체 및 표지물질이 결합된 렉틴을 포함한 킷트를 제공한다. 본 발명의 측정용 킷트로 바람직하게는 고상체에 흡착된 알파1산 당단백질에 대한 항체 또는 이 단백질을 인지하는 렉틴, 표지물질이 결합된 렉틴용액, 표지물질의 검출용액, 혈청 희석용액, 세척액 및 아사이알로당단백질 표준용액을 포함한다. 표지물질이 효소인 경우, 표지물질의 검출용액은 효소의 기질 용액이고, 표지물질이 형광물질인 경우에는 표지 물질에서 방출되는 형광 강도를 직접 측정한다.

구체적으로 예를 들면, 본 발명의 측정용 킷트는 알파1산 당단백질에 대한 항체 또는 렉틴이 흡착되어 있는 마이크로타이터 플레이트, 서양고추냉이 퍼옥시다제-RCA 결합체 용액, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액, 세척액으로서 트윈이 포함된 인산염 완충액 및 혈청 희석액, 아사이알로당단백질 표준용액을 포함한다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것에 불과할 뿐 본 발명의 권리가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 혈청에서 알파1산 당단백질 과 아사이알로 알파1산 당단백질의 분리 및 정제

사람 혈액으로부터의 알파1산 당단백질(AGP) 및 아사이알로 알파1산 당단백질(AsAGP)의 분리 및 정제는 트롬빈과 과산화수소처리, 황산을 통한 desialylation과 sephadex G-200 컬럼을 사용하였다.

알파1산 당단백질을 분리하기 위하여 200 ㎖의 사람혈액에 2.0 NIH 단위의 트롬빈을 첨가하여 37℃에서 밤새워 반응시킨 후 침전물을 제거하기 위하여 원심분리하였다. 침전물이 제거된 용액 50 ㎖에 1.2 M 과염소산 50 ㎖을 천천히 저어 주며 첨가한 후 30 분 동안 상온에서 반응시키고 원심분리를 통해 침전물을 제거하였다. 침전물이 제거된 용액을 4℃에서 PBS(Phosphate buffered saline)으로 투석시켜준 후 동결건조를 하였다.

아사이알로 알파1산 당단백질을 얻기 위하여 위에서 분리된 알파1산 당단백 질을 탈시아릴레이션(Desialylation)시켰다. Desialylation을 하기 위하여 동결 건조된 알파1산 당단백질 샘플 5 g을 0.05 N 황산을 이용하여 녹인 후 75℃에서 2시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난 샘플은 1 N 수산화나트륨으로 중성화 시켜준 후 1 PBS 용액에서 투석하였고 마지막으로 Sephadex G-200 컬럼을 이용하여 아사이알로 알파1산 당단백질을 분리하였다.

사람 혈액으로부터 분리 및 정제된 알파1산 당단백질 및 아사이알로 알파1산 당단백질은 SDS(sodium dodecyl sulfate), non-SDS 겔 전기영동법(도 1에서 A)과 웨스턴블랏(도 1에서 B)을 통해 분리 정도를 확인하였고, 분리된 AGP 및 AsAGP의 농도는 Bradford 분석법을 이용하여 측정하였다.

실시예 2 : 아사이알로 알파 1산 당단백질에 대한 단일클론항체 As16.89 제조

단일클론항체 As16.89의 정제는 protein G (Sigma Co, 미국) 컬럼을 이용하여 정제하였다. 컬럼에 protein G를 충진한 후 PBS 용액으로 2시간 동안 안정화 시켜준 후 시료를 넣어 2시간 동안 반응시켰다. 반응하지 않고 남은 항체들을 1 PBS 용액을 이용하여 씻어준 후 0.1M glycine을 첨가하여서 1 ㎖씩 분취한 후 280 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 흡광도 값이 0.5 이상인 분취된 시료들을 취하여 투석한 후 SDS 젤 전기영동법에 의해 정제 유무를 확인하였다. 도 2는 As16.89 항체가 정제되었음을 보여주는 SDS 전기영동 결과의 사진이다.

실시예 3 : 알파1산 당단백질의 biotinylation

알파1산 당단백질 5 mg을 PBS 1㎖에 녹인 후 sulfo-NHS-LC-Biotin 200㎕ (=10㎍/㎕)를 가하고 냉장에서 2시간 동안 방치한 후 desalting column을 통과시켜 분리해 내었다.

실시예 4 : 경쟁효소면역측정법에 의한 알파1산 당단백질 측정

Goat anti-mouse IgG (1 ㎍/㎖)를 4℃에서 96-well microtiter plate에 밤새워 코팅한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 2% BSA 용액으로 상온에서 2시간 동안 blocking 해 준 후 3번 세척하였다. 알파1산 당단백질 표준 시료 25 ㎕, biotin-AGP 50㎕, 알파1산 당단백질에 대한 항체 As16.89 25㎕를 섞어준 후 상온에서 2시간 동안 반응한 후 3번 세척하였다. 1000배 희석된 streptavidin-HRP을 상온에서 1시간 동안 반응한 후 3번 세척하였고 마지막으로 OPD를 이용하여 발색하였다. 발색된 시료의 흡광도는 ELISA reader (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 490 nm 파장에서 측정하였다.

도 3은 알파1산 당단백질에 대한 특이도를 나타내는 그림이며 도 4는 알파1산 당단백질에 대한 표준곡선을 나타내는 그림이며 도 5는 각 혈청의 희석비율에 따른 알파1산 당단백질의 반응성을 나타낸 그림이다. 재현성(recovery)은 표 2와 같다.

실시예 5 : 경쟁효소면역측정법에 의한 알파1산 당단백질 측정 Kit 제작

다음의 구성요소들을 사용하여 알파1산 당단백질 농도 측정용 킷트를 제조하였다.

상기 킷트를 이용하여 정상인, 간경화 환자, 간암 환자 및 만성 간염 환자의 혈청 중 알파1산 당단백질의 혈청희석 반응을 다음과 같이 검사하였다.

고상형 항체(A), 즉 마이크로타이터 플레이트에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(E)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 25 ㎕씩 가한 후, B, C, D, F, G의 구성요소들을 사용하여 실시예 5와 같은 경쟁반응 측정방법으로 알파1산 당단백질 농도를 검사하였다.

도 6은 알파1산 당단백질에 대한 실험결과를 나타낸 혈청내 농도이다.

실시예 6 : 항체-렉틴 샌드위치형 측정방법에 의한 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도측정

효소면역측정법을 이용하여 혈청으로부터의 아사이알로 알파1산 당단백질 측정은 선행연구에서 서술된 방법과 유사하다 [PCT/KR00/00840, US pendinding # 09/662,363]. 알파1산 당단백질에 대한 항체 As16.89 (1 ㎍/㎖)를 4℃에서 96-well microtiter plate에 밤새워 코팅한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 1% BSA 용액으로 상온에서 2시간 동안 blocking 해 준 후 3번 세척하였고 아사이알로 알파1산 당단백질 표준 시료와 20배 희석된 혈청은 상온에서 2시간 동안 반응한 후 3번 세척하였다. 100배 희석된 RCA-HRP을 상온에서 2시간 동안 반응한 후 3번 세척하였고 마지막으로 OPD를 이용하여 발색한 후 흡광도를 측정하였다.

실시예 7 : 알파1산 당단백질/ 아사이알로 알파1산 당단백질비율에 의한 환자혈청 검사

실시예 7에서 사용한 킷트로 환자 혈 중 아사이알로당단백질 농도를 측정하였다.

정상인(16), 만성간염환자(16), 간경변환자(16), 간암(16)환자의 혈청을 20배씩 희석한 후 실시예 5와 6의 방법에 의해 혈청 중 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질을 측정 비율을 계산하였다.

실험결과에 따르면 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도는 간경변과 간암의 경우 정상치보다 통계적으로 상승된 농도를 보였다(도 6, 표 4). 이 결과는 혈청내 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도 상승이 간경변 또는 간암 발생과 연관이 있음을 뜻한다.

이상과 같이 본 발명에 의하여 혈 중 알파1산 당단백질의 농도를 측정하기 위해 항체를 이용한 경쟁반응 방법 및 측정용 킷트가 제공된다. 또한 이렇게 측정된 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 비율을 이용하여 간경화, 간암 등 간 질환의 조기진단과 치료성과의 평가에 유용하게 사용할 수 있으며, 다량의 시료를 동시에 재현성있고 정확하게 측정할 수 있으므로 의료진단 및 치료상태 평가에 매우 유용할 것이다.

Claims

(A) 혈청 시료의 알파1산 당단백질의 농도를 측정하는 단계;

(B) 혈청 시료의 아사이알로 알파1산 당단백질의 농도를 측정하는 단계;

(C) [(알파1산 당단백질의 농도)/(아사이알로 알파1산 당단백질의 농도)]값이 10% 이상이면 간질환인 것으로 판단하는 단계;

를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (A)는

(a) 알파1산 당단백질의 1차 항체에 대한 2차 항체를 고상체에 흡착시키는 소단계;

(b) 상기 고상체에 ① 1차 항체, ② 표지화된 알파1산 당단백질 및 ③ 알파1산 당단백질이 함유된 혈청 시료를 가하여 항체에 대해 경쟁반응을 시키는 소단계;

(c) 상기 경쟁반응 이후에, 결합된 [(고상체)-(2차 항체)-(1차 항체)-(표지화된 또는 표지화되지 않은 알파1산 당단백질)] 복합체 이외의 물질을 세척하는 소단계;

(d) 상기 표지화된 알파1산 당단백질을 검출하여 알파1산 당단백질의 상대적 농도를 측정하는 소단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별방법.
제 2 항에 있어서,

상기 표지화된 알파1산 당단백질은 효소, 형광물질 또는 방사선 물질로 표지화된 것을 특징으로 하는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (A)는

(a) 알파1산 당단백질의 1차 항체에 대한 2차 항체를 고상체에 흡착시키는 소단계;

(b) 상기 고상체에 ① 1차 항체, ② 표지화된 알파1산 당단백질 및 ③ 알파1산 당단백질이 함유된 혈청 시료를 가하여 항체에 대해 경쟁반응을 시키는 소단계;

(c) 상기 경쟁반응 이후에, 결합된 [(고상체)-(2차 항체)-(1차 항체)-(표지화된 또는 표지화되지 않은 알파1산 당단백질)] 복합체 이외의 물질을 세척하는 소단계;

(d) 상기 고상체에 표지화된 알파1산 당단백질과 특이결합하는 제2표지물질을 가하여 충분히 반응시키는 소단계;

(e) 상기 제2표지물질을 검출하여 알파1산 당단백질의 상대적 농도를 측정하는 소단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별방법.
제 4 항에 있어서,

상기 표지화된 알파1산 당단백질은 바이오티닐회된 알파1산 당단백질이며, 상기 제2표지물질은 streptavidin-HRP인 것을 특징으로 하는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (B)는

(a) 아사이알로 알파1산 당단백질의 1차 항체에 대한 2차 항체를 고상체에 흡착시키는 소단계;

(b) 상기 고상체에 아사이알로 알파1산 당단백질이 함유된 혈청 시료를 가하여 항체와 결합시키는 소단계;

(c) 상기 결합 소단계 이후에 아사이알로 알파1산 당단백질과 특이적으로 결합하는 표지물질을 가하여 반응시키는 소단계;

(d) 결합된 [(고상체)-(항체)-(아사이알로 알파1산 당단백질)-(표지물질)] 복합체 이외의 물질을 세척한 후 상기 표지물질을 검출하여 아사이알로 알파1산 당단백질의 상대적 농도를 측정하는 소단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별방법.
제 6 항에 있어서,

상기 표지물질은 효소, 형광물질 또는 방사선 물질로 표지된 렉틴인 것을 특징으로 하는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별방법.
(A) 알파1산 당단백질에 대한 항체가 흡착된 고상체 , 바이오티닐화된 알파1산 당단백질, 효소와 결합된 strepavidine 용액, 혈청시료 희석용액, 효소 기질용액, 세척액, 및 알파1산 당단백질 표준용액을 포함하는 제1킷트;

(B) 아사이알로 알파1산 당단백질에 대한 항체가 흡착된 고상체, 서양고추냉이 퍼옥시다제-RCA 결합체 용액, 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 기질용액, 혈청 희석용액 및 아사이알로당단백질 표준용액을 포함하는 제2킷트;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청검사를 통한 간질환 여부 판별용 키트.