CN116735893A - Cd177和mmp8抗原联合检测试纸条和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CD177和MMP8抗原联合检测试纸条和试剂盒，所述试纸条包括：底板，粘合在所述底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、层析基质和吸水垫；所述结合垫上涂有CD177单克隆抗体包被的胶体金复合物和MMP8单克隆抗体包被的胶体金复合物；所述层析基质上靠近所述吸水垫的一侧设有质控线C，所述质控线C上包被有抗鼠IgG二抗；所述层析基质上靠近所述结合垫的一侧设有检测线T；所述检测线T包括：包被有CD177单克隆抗体的检测线T1和包被有MMP8单克隆抗体的检测线T2。用于脓毒症AKI的早期诊断、危险分层和预后判断，具有很强的特异性且灵敏度高。

Description

CD177和MMP8抗原联合检测试纸条和试剂盒

技术领域

本发明属于医学诊断技术领域，涉及一种CD177和MMP8抗原联合检测试纸条和试剂盒。

背景技术

脓毒症是ICU最常见的急危重症疾病，全球年发病例数近5000万，肾脏是脓毒症最常累及的靶器官，40-70％的脓毒症患者合并急性肾损伤，即脓毒症相关急性肾损伤(SepsisAssociated Acute Kidney Injury,SA-AKI)。近年来SA-AKI的发病率和病死率逐年升高，已经成为全球重大的公共卫生问题。尽管目前SA-AKI患者可以通过抗感染、调整容量负荷和肾脏替代治疗等进行对症支持治疗，但仍有高达50％患者死亡，15-20％的幸存者最终发展为慢性肾脏病。因此，深入研究SA-AKI的分子机制，探索靶向性干预措施具有重要的科学意义和临床价值。

脓毒症患者常伴随导致肾功能损伤的基础疾病，如高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等。在疾病过程中，循环波动、脱水剂的使用进一步加大了罹患AKI的风险。因此，AKI是脓毒症患者最常见的并发症，使患者的病情和预后显著恶化。目前诊断AKI的主要手段是血肌酐和尿量，但该诊断方法存在明显的时间延误、敏感性及特异性均较低。因此在脓毒症患者诊疗中，探索新的早期诊断AKI的方法，对改善患者预后具有重要意义。

鉴于脓毒症中AKI的高发病率、高病死率和高医疗资源消耗，迫切需要开发一种简便快速、灵敏、准确地评估脓毒症相关急性肾损伤的产品。

发明内容

为了解决所述技术问题，本发明提供了一种CD177和MMP8抗原联合检测试纸条和试剂盒，用于脓毒症AKI的早期诊断、危险分层和预后判断，具有很强的特异性且灵敏度高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了CD177单克隆抗体或/和MMP8单克隆抗体在制备用于诊断早期脓毒症急性肾损伤产品中的应用。

本申请发明人通过实验发现[CD177]·[MMP8]在脓毒症诱导的急性肾损伤组尿液中有差异表达；表明[CD177]·[MMP8]可以作为分子标志物用于制备脓毒症肾损伤检测试纸。

在本发明的第二方面，提供了一种CD177和MMP8抗原联合检测试纸条，包括：

底板，

粘合在所述底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、层析基质和吸水垫；

所述结合垫上涂有CD177单克隆抗体包被的胶体金复合物和MMP8单克隆抗体包被的胶体金复合物；

所述层析基质上靠近所述吸水垫的一侧设有质控线C，所述质控线C上包被有抗鼠IgG二抗；所述层析基质上靠近所述结合垫的一侧设有检测线T；所述检测线T包括：包被有CD177单克隆抗体的检测线T1和包被有MMP8单克隆抗体的检测线T2。

作为一种可选的实施方式，所述层析基质上靠近所述结合垫的一侧沿层析的方向依次设置所述CD177单克隆抗体的检测线T1、包被有MMP8单克隆抗体的检测线T2。

在其他实施方式中，所述层析基质上靠近所述结合垫的一侧沿层析的方向依次设置所述包被有MMP8单克隆抗体的检测线T2、CD177单克隆抗体的检测线T1。

进一步地，所述CD177单克隆抗体包被的胶体金复合物的pH为7.0～7.5，标记量为14～16μg/mL胶体金溶液。

进一步地，所述MMP8单克隆抗体包被的胶体金复合物的pH为7.0～7.5，标记量为14～16μg/mL胶体金溶液。

进一步地，所述包被有CD177单克隆抗体的检测线T1中，所述CD177单克隆抗体的浓度为0.3～0.7mg/mL，包被量为0.7～1.5μL/cm。

进一步地，所述包被有MMP8单克隆抗体的检测线T2中，所述MMP8单克隆抗体的浓度为0.3～0.7mg/mL，包被量为0.7～1.5μL/cm。

在本发明的第三方面，提供了所述CD177和MMP8抗原联合检测试纸条的制备方法，所述方法包括：

获得样品垫；

将CD177单克隆抗体包被的胶体金复合物、和MMP8单克隆抗体包被的胶体金复合物经稳定剂处理后喷涂于结合垫上，获得处理后结合垫；

将抗鼠IgG二抗喷于层析基质上的质控线C上，将CD177单克隆抗体喷于层析基质上的检测线T1，将MMP8单克隆抗体喷于层析基质上的检测线T2上，获得含有检测线T和对质控线C的层析基质；

在底板上依次相互搭接粘贴所述样品垫、所述处理后结合垫、所述含有检测线T和对照线质控C的层析基质和吸水垫，获得CD177和MMP8抗原联合检测试纸条。

在本发明的第四方面，提供了一种CD177和MMP8抗原联合检测试剂盒，所述试剂盒包括所述CD177和MMP8抗原联合检测试纸条。

进一步地，所述试剂盒还包括检测卡、样品抽提液和采样样品管中的至少一种。

在本发明的第五方面，提供了所述CD177和MMP8抗原联合检测试纸条或所述的CD177和MMP8抗原联合检测试剂盒在制备用于诊断早期脓毒症急性肾损伤的产品中的应用。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1，本申请发明人发现[CD177]·[MMP8]在脓毒症诱导的急性肾损伤组尿液中有差异表达，[CD177]和[MMP8]在脓毒症休克患者中明显增高；表明[CD177]·[MMP8]可以作为分子标志物用于制备脓毒症肾损伤检测试纸，CD177单克隆抗体或/和MMP8单克隆抗体可以在制备用于诊断早期脓毒症急性肾损伤产品中应用。

2、本发明提供的CD177和MMP8抗原联合检测试纸条，具有很强的特异性。且灵敏度高：CD177的最低检测限：50ng/mL；MMP8的最低检测限：50ng/mL。试纸条操作简便，15min可得到结果，能够快速的对疾病进行诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为测序方法筛选脓毒症患者和健康志愿者对比的差异基因；

图2为差异基因参与的生物过程；

图3为差异基因参与的信号通路；

图4为[CD177]·[MMP8]在脓毒症休克患者中明显增高；[CD177]·[MMP8]代表CD177和MMP8的乘积，CD177和MMP8均高表达；

图5为[CD177]·[MMP8]诊断脓毒症休克的ROC曲线；

图6为[CD177]·[MMP8]诊断试纸模式图；图中附图标记为：1-底板，2-样品垫，3-结合垫，4-层析基质和5-吸水垫。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例所用到的CD177单克隆抗体、MMP8单克隆抗体、IgG二抗均为购买的商用产品。作为一种可选的实施方式，CD177单克隆抗体：品牌AbD Serotec，货号MCA2045，鼠源；MMP8单克隆抗体：品牌abcam，货号ab81286，兔源。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的CD177和MMP8抗原联合检测试纸条进行详细说明。

实施例1、[CD177]·[MMP8]在脓毒症诱导的急性肾损伤组尿液中有差异表达

(1)测序方法筛选脓毒症患者和健康志愿者对比的差异基因

与正常样本相比，基于GSE100927数据集脓毒症AKI样本共鉴定出1155个差异表达基因。其中，包括678个上调基因和477个下调基因。对上述1155个差异表达基因和Genecard进行交叉分析，共得到129个重叠基因如图1所示。

(2)差异基因参与的生物过程与信号通路

我们对上述129个差异表达基因进行了GO和KEGG富集分析。KEGG通路包括细胞凋亡、自噬、趋化因子和脂质和动脉粥样硬化信号通路，前10条通路如图3所示。GO富集显示(如图2所示)，在生物学过程方面，涉及白细胞迁移与黏附、氧化应激、炎症反应调节、响应刺激、代谢和免疫等生物学过程，图2和图3中富集最显著的10项GO项。

(4)[CD177]和[MMP8]在脓毒症休克患者中明显增高

我们收集了重症监护病房12例脓毒症和诊断脓毒症后发生AKI患者的血液标本，检测2组患者中CD177和MMP8的含量，由图4可知，血清中[CD177]·[MMP8]显著高表达。

(5)[CD177]·[MMP8]作为早期诊断脑血管重症患者急性肾损伤的尿液标志物浓度

分析血液标志物对根据时间变化的浓度曲线寻找出能够早期诊断脑血管重症患者急性肾损伤的血液标志物。用多因素回归分析这些标志物与急性肾损伤的关系。用ROC曲线得出尿液标志物预测急性肾损伤的能力根据ROC曲线，计算出[CD177]·[MMP8]早期诊断急性肾损伤(包括不同程度)的参考值，如图5所示，[CD177]和[MMP8]诊断脓毒症休克的AUC值为0.93。

实施例2、CD177和MMP8抗原联合检测试剂盒的制备

1、胶体金制备

将氯金酸溶液用纯水稀释至0.1-1.0mL/L，油浴加热沸腾后吗，边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，持续加热半小时，溶液颜色呈透明的葡萄酒色时，即制得所需的胶体金；应置于4℃冰箱避光保存，使用时用K₂CO₃调胶体金液的pH值为7.5-10.0。

2、抗[CD177]或[MMP8]抗体溶液的准备

待标记蛋白装于透析袋(MW：4000-6000)中pH5.5-7.8NaC1溶液透析，每隔4h换液1次，至少换液3次，最后一次4℃透析过夜，然后4℃条件下1.0×10⁵RPM离心1小时，去除多余的聚合物，得到透析好的[CD177]或[MMP8]单抗溶液。

3、胶体金与抗[CD177]或[MMP8]单抗的结合

将胶体金溶液好pH(7.5-10.0)之后，分别加入透析好的[CD177]或[MMP8]单抗溶液，漩涡混合器混匀，反应10min后，加入稳定剂以防止胶体金聚合发生沉淀。胶体金标记抗体复合物在4℃条件下1.0×10³RPM离心30分钟，仔细吸出上清，金标复溶液复溶。离心洗涤两次，置于4℃冰箱避光保存。金标复溶液：0.01M Tris-HCl pH8.5、1％ BSA与10％蔗糖。

4、制备早期脓毒症AKI的[CD177]·[MMP8]诊断试纸

图6是脓毒症AKI的[CD177]·[MMP8]试纸的结构示意图。该试纸设有：底板1，底板上依次覆盖样品垫2，金胶垫3，硝酸纤维膜层4和吸水纸层5。

所述底板1是PVC底板,样品垫2的材料是吸唾液玻璃纤维金胶垫3的制作：将所制备得到的金标抗体溶液喷点在1cm宽的玻璃纤维膜上，点样量约为2ul/cm，37℃干燥。硝酸纤维膜层4的制作：将二抗喷点在硝酸纤维膜上，作为质控线(C线)。将抗CD177抗体与抗MMP8抗体分别喷点在质控线下方作为测试线(T1与T2线)，点样量约为1ul/cm。所述的测试线(T1与T2线)的检测阅值分别为50ng/m1。37℃干燥。将上述的样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层、吸水纸层依次组装在底板上，切成4mm宽的试纸条装入检测卡中。

5、[CD177]·[MMP8]诊断试纸的检测方法与结果判断

取待检样品滴加于加样区S中，在10-20分钟内可观察并记录实验结果，超出20分钟结果无效。

本发明所述试纸条原理为：检测时，在加样孔加入待测样本，样本中的待测物质可首先与玻璃纤维膜上预包被的胶体金标记抗体反应，形成抗原-抗体复合物，然后，复合物在毛细效应下进行层析，最后与预包被在硝酸纤维素膜检测线(T1/T2/C)处的抗体结合，形成紫红色条带，根据条带显色情况检测结果的判定如下：

阳性结果：在试纸条的测试区T1与T2和质控区位置上各出现一条紫红色条带，请参考附图6。

阴性结果：仅试纸条的质控区或测试区T1与T2位置上出现一条紫红色条带，请参考附图6。

无效结果：在试纸条的检测线和质控线位置上均未出现紫红色条带，请参考附图6。

在检测时应注意以下事项:

(1)被检样品在室温(20℃左右)平衡并在该条件下检测。要求被检样品为新鲜样品。样品收集后应1小时测定保证结果的可靠性。

(2)本试纸条仅供体外检测粗筛，不能作为确认试剂，阳性结果必须进行确证实验。

(3)30分钟后观察结果无效。

(4)试纸条应避光保存。

应用例1

取上述实施例制作的检测的胶体金试纸条。将CD177与MMP-8抗原梯度溶解于标准稀释液中，浓度分别为200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，每个样品浓度测试5条,测试时间为15分钟。表1所示为目测判读结果。

表1胶体金试纸条的灵敏度分析

注：有条带：+，无条带：-

由表1的结果可知，当检测样品溶液中CD177与MMP-8的含量低于50ng/mL时，本发明试纸条不显色，即检出率为0。当检测样品溶液中CD177与MMP-8的含量≥50ng/ml时，试纸条能正常检测判读，检出率为100％。结果表明，本发明提供的CD177与MMP-8的胶体金试纸条大大提高了检测的方便性，且准确率高，具有重要的临床应用价值。

2、检测血液中CD177与MMP-8：取上述实施制备的胶体金试纸条，在室温平衡10分钟，用吸管吸取2-3滴待测样品滴于样品垫上，检测结果在5-20分钟后读取。临床检测验证：我们随机检测了5例脓毒症急性肾损伤患者和5例健康人的血液，结果如表2所示。

表2胶体金试纸条的对实际临床样本检测的测试

注：有条带：+，无条带：-，是：1，否：0

由表2可知，本试纸条对于肌酐结果>150μmol/L的样品的检出率为100％，表明本发明实施例2制备的胶体金试纸条的准确性好、灵敏度高，对脓毒症急性肾损伤具有较好的预测性。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.CD177单克隆抗体或/和MMP8单克隆抗体在制备用于诊断早期脓毒症急性肾损伤产品中的应用。

2.一种CD177和MMP8抗原联合检测试纸条，其特征在于，包括：

底板，

粘合在所述底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、层析基质和吸水垫；

所述结合垫上涂有CD177单克隆抗体包被的胶体金复合物和MMP8单克隆抗体包被的胶体金复合物；

所述层析基质上靠近所述吸水垫的一侧设有质控线C，所述质控线C上包被有抗鼠IgG二抗；所述层析基质上靠近所述结合垫的一侧设有检测线T；所述检测线T包括：包被有CD177单克隆抗体的检测线T1和包被有MMP8单克隆抗体的检测线T2。

3.根据权利要求2所述CD177和MMP8抗原联合检测试纸条，其特征在于，所述CD177单克隆抗体包被的胶体金复合物的pH为7.0～7.5，标记量为14～16μg/mL胶体金溶液。

4.根据权利要求2所述CD177和MMP8抗原联合检测试纸条，其特征在于，所述MMP8单克隆抗体包被的胶体金复合物的pH为7.0～7.5，标记量为14～16μg/mL胶体金溶液。

5.根据权利要求2所述CD177和MMP8抗原联合检测试纸条，其特征在于，所述包被有CD177单克隆抗体的检测线T1中，所述CD177单克隆抗体的浓度为0.3～0.7mg/mL，包被量为0.7～1.5μL/cm。

6.根据权利要求2所述CD177和MMP8抗原联合检测试纸条，其特征在于，所述包被有MMP8单克隆抗体的检测线T2中，所述MMP8单克隆抗体的浓度为0.3～0.7mg/mL，包被量为0.7～1.5μL/cm。

7.一种采用权利要求2-6任一所述CD177和MMP8抗原联合检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

获得样品垫；

将CD177单克隆抗体包被的胶体金复合物、和MMP8单克隆抗体包被的胶体金复合物经稳定剂处理后喷涂于结合垫上，获得处理后结合垫；

将抗鼠IgG二抗喷于层析基质上的质控线C上，将CD177单克隆抗体喷于层析基质上的检测线T1，将MMP8单克隆抗体喷于层析基质上的检测线T2上，获得含有检测线T和对质控线C的层析基质；

在底板上依次相互搭接粘贴所述样品垫、所述处理后结合垫、所述含有检测线T和对照线质控C的层析基质和吸水垫，获得CD177和MMP8抗原联合检测试纸条。

8.一种CD177和MMP8抗原联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5任一所述CD177和MMP8抗原联合检测试纸条。

9.根据权利要求8所述的一种CD177和MMP8抗原联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测卡、样品抽提液和采样样品管中的至少一种。

10.权利要求2-6任一所述CD177和MMP8抗原联合检测试纸条或权利要求8-9任一所述的CD177和MMP8抗原联合检测试剂盒在制备用于诊断早期脓毒症急性肾损伤的产品中的应用。