WO2005085801A1 - 近接場光を用いた生体分子の相互作用の検出方法および検出装置 - Google Patents

近接場光を用いた生体分子の相互作用の検出方法および検出装置 Download PDF

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Katsutoshi Takahashi
Satomi Yoshino
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    • G01Q60/20—Fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a method and an apparatus for detecting an interaction between a biomolecule and a specimen in a liquid.
  • the above-described method using evanescent light is a method in which light is totally reflected from the back side of a substrate to which a biomolecule is fixed to generate evanescent light on the surface of the substrate. Stay at a distance of a few lOOnm. For this reason, it is necessary to fix the biomolecules flat within this several 100 nm, but it is not easy to fix them with precise control. Further, when a liquid such as water is present on the upper surface of the substrate, it is difficult to totally reflect light, and it is difficult to generate evanescent light.
  • the above-described gene analysis method using the SNOM probe is used for analyzing a gene map for a DNA chain exhibiting strong interaction as described above, and is weak due to a protein or the like. It does not detect interactions.
  • An object of the present invention is to provide a method and an apparatus capable of detecting a weak interaction between a biomolecule and a specimen.
  • the present invention is a method for detecting the interaction between a biomolecule immobilized on a substrate and a fluorescently-labeled sample using near-field light. Contacting a specimen with a specimen, irradiating the surface of the biomolecule in a liquid with near-field light using a SNOM probe, and detecting fluorescence excited by the near-field light. It is the said method.
  • the present invention provides the above method, wherein the biomolecule is a protein and Z or a sugar chain. It is.
  • the present invention is the above method, wherein the specimen is a protein and Z or a sugar chain.
  • the present invention is the above method, characterized by using a substrate on which one or more kinds of biomolecules are immobilized.
  • the present invention is an apparatus for detecting the interaction between a biomolecule immobilized on a substrate and a fluorescently labeled specimen using near-field light, wherein the specimen comes into contact with the specimen in a liquid.
  • the above device comprising: irradiation means for irradiating near-field light to a surface of a biomolecule; and detection means for detecting fluorescence excited by the near-field light.
  • the present invention is the above device, wherein the biomolecule is a protein and Z or a sugar chain.
  • the present invention is the above device, wherein the specimen is a protein and Z or a sugar chain.
  • the present invention is the above device, characterized by using a substrate on which one or more kinds of biomolecules are immobilized.
  • the present invention it is possible to detect a weak interaction between a biomolecule and a specimen. Further, according to the present invention, it is possible to detect the interaction of a plurality of biomolecules with a specimen on one substrate.
  • FIG. 1 is a schematic diagram schematically showing a detection method and a detection device of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a method and a device for detecting fluorescence used in the present invention.
  • FIG. 3 is an example of a substrate on which two or more types of biomolecules are immobilized.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a detection method and a detection device of the present invention.
  • a biomolecule 5 is immobilized on a substrate 1.
  • the substrate 1 is placed in a liquid 8 containing a specimen 10 labeled with a fluorescent label 12.
  • the biomolecule 5 comes into contact with the specimen 10.
  • near-field light 30 is generated at the tip of the SNOM probe 20, and the substrate surface (biomolecule surface) is run by the SNOM probe 20 in the AFM mode (Fig. L (a)).
  • the SNOM probe reaches the place where the sample 10 and the biomolecule 5 interact, the fluorescent label 12 is excited by the near-field light 30 and the fluorescence 40 is generated (FIG. L (b)).
  • the SNOM probe is used in the vicinity of the present invention. Irradiation means for irradiating the in-field light is configured.
  • the means for detecting the generated fluorescence is not particularly limited as long as it can detect the fluorescence.
  • the fluorescence can be detected. Can be used.
  • a means for detecting fluorescence using a SNOM probe may be used. That is, in FIG. 2, the laser light 52 generated by the laser generator 50 is incident on the SNOM probe 20 via the dichroic mirror 55, and near-field light is generated at the tip portion thereof, not shown. The near-field light is applied to the fluorescent label 12 that has labeled the specimen 10, and fluorescence 40 is generated. Part of the generated fluorescence 40 reaches the optical sensor 60 via the SNOM probe 20 and the dichroic mirror 55, and the fluorescence is detected.
  • the detection device of the present invention may further include a liquid storage means for performing each processing in the liquid.
  • the biomolecule used in the present invention is not particularly limited as long as it interacts with a specimen, and examples thereof include a protein and a sugar chain.
  • the sample used in the present invention is not particularly limited as long as it interacts with a biomolecule, and examples thereof include sugar chains and proteins.
  • specific examples of the combination of a biomolecule and a specimen include, for example, lectin and sugar chains. It is known that the binding between these lectins and sugar chains is very weak, and such weak interactions can be detected by the present invention.
  • the fluorescent label on the specimen used in the present invention is not particularly limited as long as it generates fluorescence, and examples thereof include GFP (Green Fluorescence Protein) and canolesome indicator protein reagent (cameleon). Fluorescent protein.
  • the substrate used in the present invention is not particularly limited as long as it can immobilize biomolecules.
  • nitrocellulose membranes, PVDE membranes, metals, glasses, and the like can be used. I can make it.
  • fluorescence can be detected from the back surface of the substrate.
  • the method for immobilizing the biomolecule on the substrate is not particularly limited as long as the biomolecule can be immobilized on the substrate.
  • a method of performing an amino bond a method of performing physical adsorption, and a method of performing a thiol bond And a method of causing an antigen-antibody reaction.
  • the liquid used in the present invention is not particularly limited as long as it can detect the interaction between the biomolecule and the sample, and examples thereof include a buffer solution and the like.
  • a buffer solution and the like examples thereof include a buffer solution and the like.
  • the method of contacting a biomolecule with a specimen according to the present invention is not particularly limited as long as the biomolecule and the specimen can be contacted.
  • a method in which a biomolecule is immobilized in a liquid containing the specimen is used.
  • a method of immersing the substrate can be used.
  • the SNOM probe used in the present invention is not particularly limited as long as it can generate near-field light.
  • near-field light can be generated within a radius of approximately several lOnm, and the interaction with the analyte can be detected only in a small area near the target biomolecule. It becomes.
  • the AFM mode is preferred as the method for scanning the SNOM probe. According to the AFM mode, even when the spot of the biomolecule fixed to the substrate is not flat, the SNOM probe and the biomolecule or the specimen can be kept at the same distance according to the unevenness, and the specimen can be accurately separated from the specimen. It is possible to detect an interaction with a biomolecule.
  • Examples of the substrate on which the biomolecules used in the present invention are immobilized include, in addition to those on which one type of biomolecule is immobilized, those on which two or more types of biomolecules are immobilized, as shown in FIG. Can be That is, in FIG. 3, the plurality of biomolecules 5 are of different types. Fixed to board 1. By immersing the substrate 1 in a liquid containing a specimen and scanning the SNOM probe, it is possible to detect the interaction of the biomolecule in each spot with the specimen. This makes it possible to detect the interaction of one specimen with a plurality of types of biological molecules by using one substrate.

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Abstract

【課題】　生体分子と検体との弱い相互作用を検出することができる方法および装置を提供する。 【解決手段】　基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接場光を用いて検出する方法であって、液体中において前記生体分子と前記検体とを接触させる工程と、液体中において前記生体分子表面にＳＮＯＭプローブを用いて近接場光を照射する工程と、前記近接場光により励起された蛍光を検出する工程と、を含む方法を用いる。また、基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接場光を用いて検出する装置であって、前記検体と液体中において接触した前記生体分子の表面に、近接場光を照射する照射手段と、前記近接場光により励起された蛍光を検出する検出手段と、を備えることを特徴とする、前記装置を用いる。さらに、１種または２種以上の生体分子を固定した基板を用いることもできる。  

Description

明 細 書
近接場光を用いた生体分子の相互作用の検出方法および検出装置 技術分野
[0001] 本発明は、生体分子と検体との、液体中における相互作用を検出する方法および 装置に関する。
背景技術
[0002] ポストゲノム時代を迎えた今日、タンパク質、糖鎖などの生体分子の機能解明につ いての研究が盛んに行われている。そして、これらの生体分子と検体との相互作用を 検出することは、生体分子の機能解明に重要なことである。特に、癌や糖尿病などの 疾患については、タンパク質への糖鎖の付加が関与すると報告されており、糖鎖の 付カロによるタンパク質の機能解明が重要視されている。そして、タンパク質への糖鎖 の付加による生体機能解明には、どのようなタンパク質にどのような糖鎖が付加する のかの糖鎖解析をする必要がある。しかし、糖鎖については、 DNAやタンパク質の 解析に用いられるシークェンサ一や合成機などのデバイスが開発途上にあり、糖鎖 の配列決定や試料の増幅を簡易に行えないのが現状である。このため、微量の試料 を用いた解析が必要となる。
[0003] さらに、 DNA同士や DNAと検体との相互作用は一般に強いものである一方、タン ノ ク質と検体との相互作用には非常に弱いものがある。例えば、レクチンと糖鎖は、 その解離定数力 SlO— 6M程度であり、生体内で最も弱い結合であるとされている。この ように弱 、相互作用を検出するためには、タンパク質および検体の双方が活性を維 持しており、且つノインデイングフリーでな 、液体中で測定する必要がある。
[0004] ここで、微量の生体分子と検体との相互作用を検出する方法としては、表面プラズ モン共鳴を用いた検出方法が知られて 、る。
[0005] また、微量の生体分子と検体との相互作用を検出する他の方法としては、光の全反 射により発生するエバネッセント光を用いるものが知られている（特開平 10— 2860号 公報参照)。
[0006] 一方、近接場光顕微鏡 (SNOM)プローブを用いた遺伝子解析方法が、知られて いる（特開 2001— 165840号公報参照）。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] しかし、上記の表面プラズモン共鳴を用いた方法では、通常分子量の小さ ヽ基質 を基板に固定しておき、これに分子量の大きいタンパク質等を結合させ、それによる 屈折率の変化を捉えることにより、タンパク質等と基質との相互作用を検出している。 従って、例えば、分子量の大きなタンパク質を基板に固定しておいて、これに分子量 の小さな糖鎖が相互作用したときには、その屈折率の変化が小さぐ検出が難しくな るという問題がある。このため、既知の特定のタンパク質と相互作用する糖鎖をスクリ 一-ングする目的には、表面プラズモン共鳴を用いることは難しい。
[0008] また、上記のエバネッセント光を用いた方法は、生体分子を固定した基板の裏側か ら光を全反射させて基板表面にエバネッセント光を発生させるものであり、その照射 範囲は基板上の数 lOOnmの距離にとどまる。このため、生体分子をこの数 lOOnm 以内に平らに固定することが必要となるが、これを精密に制御して固定することは容 易ではない。さらに、基板上面に水などの液体が存在する場合は、光を全反射させ ることが難しく、エバネッセント光を発生させにくいと!/、う問題がある。
[0009] さらに、上記の SNOMプローブを用いた遺伝子解析方法は、上述のように強い相 互作用を示す DNA鎖を対象として、遺伝子地図を解析するために用いられるもので あり、タンパク質等による弱い相互作用を検出するものではない。
[0010] 本発明の課題は、生体分子と検体との弱い相互作用を検出することができる方法 および装置を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明は、基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接 場光を用いて検出する方法であって、液体中にお!、て前記生体分子と前記検体とを 接触させる工程と、液体中において前記生体分子表面に SNOMプローブを用いて 近接場光を照射する工程と、前記近接場光により励起された蛍光を検出する工程と 、を含むことを特徴とする、前記方法である。
また、本発明は、生体分子が、タンパク質および Zまたは糖鎖である、上記の方法 である。
さらに、本発明は、検体が、タンパク質および Zまたは糖鎖である、上記の方法であ る。
これらの発明により、生体分子と検体との弱い相互作用を検出することが可能となる
[0012] また、本発明は、 1種または 2種以上の生体分子を固定した基板を用いることを特 徴とする、上記の方法である。
この発明により、一つの基板において複数の生体分子について、検体との相互作 用を検出することが可能となる。
[0013] さらに、本発明は、基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を 、近接場光を用いて検出する装置であって、前記検体と液体中において接触した前 記生体分子の表面に、近接場光を照射する照射手段と、前記近接場光により励起さ れた蛍光を検出する検出手段と、を備えることを特徴とする、前記装置である。
また、本発明は、前記生体分子が、タンパク質および Zまたは糖鎖である、上記の 装置である。
さらに、本発明は、前記検体が、タンパク質および Zまたは糖鎖である、上記の装 置である。
これらの発明により、生体分子と検体との弱い相互作用を検出することが可能となる
[0014] また、本発明は、 1種または 2種以上の生体分子を固定した基板を用いることを特 徴とする、上記の装置である。
この発明により、一つの基板において複数の生体分子について、検体との相互作 用を検出することが可能となる。
発明の効果
[0015] 本発明により、生体分子と検体との弱い相互作用を検出することが可能となる。また 、本発明により、一つの基板において複数の生体分子について、検体との相互作用 を検出することが可能となる。
図面の簡単な説明 [0016] [図 1]図 1は、本発明の検出方法および検出装置の概略を示す模式図である。
[図 2]図 2は、本発明に用いる蛍光の検出方法および検出装置の 1例を示す図である
[図 3]図 3は、 2種以上の生体分子を固定した基板の例である。
符号の説明
1 基板
5 生体分子
8 液体
10 検体
12 蛍光標識
20 SNOMプローブ
30 近接場光
40 蛍光
50 レーザ発生器
52 レーザ光
55 ダイクロイツクミラ
60 光センサ
発明を実施するための最良の形態
[0018] 以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して説明する。
図 1は、本発明の検出方法および検出装置を模式的に示す図である。 図 1において、生体分子 5は、基板 1に固定されている。この基板 1は、蛍光標識 12 により標識された検体 10を含む液体 8の中におかれて 、る。これにより生体分子 5と 検体 10とが接触することとなる。そして、 SNOMプローブ 20の先端に近接場光 30を 発生させ、 SNOMプローブ 20により AFMモードで基板表面（生体分子表面）を走 查する（図 l (a) )。検体 10と生体分子 5が相互作用している箇所に SNOMプローブ が到達すると、蛍光標識 12が近接場光 30により励起され、蛍光 40が発生することと なる（図 l (b) )。この発生した蛍光 40を検出することにより、生体分子 5と検体 10との 相互作用を検出することが可能となる。なお、ここで SNOMプローブは、本発明の近 接場光を照射する照射手段を構成する。
[0019] このとき、生体分子 5と相互作用していない検体については、近接場光 30が照射さ れないため、蛍光を発生することがなぐ目的の生体分子 5と相互作用している検体 のみを検出することが可能となる。
[0020] 発生した蛍光を検出する手段としては、蛍光を検出できるものであれば特に制限は ないが、例えば、光センサを基板 1の上部若しくは基板 1の裏側に設置することにより 、蛍光を検出するものを用いることができる。
[0021] また、蛍光を検出する他の手段としては、例えば、図 2に示すように、 SNOMプロ一 ブにより、蛍光を検出するものでもよい。即ち、図 2において、レーザ発生器 50で発 生したレーザ光 52は、ダイクロイツクミラー 55を介して SNOMプローブ 20に入射し、 その先端部分で図示しな 、近接場光が発生する。この近接場光が検体 10を標識し た蛍光標識 12に照射され、蛍光 40が発生する。発生した蛍光 40の一部は、 SNO Mプローブ 20、ダイクロイツクミラー 55を介して、光センサ 60に到達し、蛍光が検出さ れる。
[0022] なお、本発明の検出装置において、液体中で各々の処理を行うための液体貯留手 段をさらに備えてもよい。
[0023] 本発明に用いる生体分子としては、検体と相互作用するものであれば特に制限は ないが、例えば、タンパク質、糖鎖等を挙げることができる。また、本発明に用いる検 体としては、生体分子と相互作用するものであれば特に制限はないが、例えば、糖 鎖、タンパク質等を挙げることができる。さらに、生体分子と検体との組み合わせの具 体例としては、例えば、レクチンと糖鎖等を挙げることができる。これらのレクチンと糖 鎖との結合は非常に弱いことが知られており、このような弱い相互作用も、本発明に よって検出することが可能となる。
[0024] 本発明に用いられる、検体への蛍光標識としては、蛍光を発生するものであれば特 に制限はないが、例えば、 GFP (Green Fluorescence Protein)やカノレシゥム指 示タンパク質試薬 (cameleon)などの蛍光タンパク質を挙げることができる。
[0025] 本発明に用いられる基板としては、生体分子を固定できるものであれば特に制限は ないが、例えば、ニトロセルロース膜、 PVDE膜、金属、ガラスなど力も成るものを挙 げることができる。特に、ガラス等の透明の材料を用いた場合には、基板の裏面から 蛍光を検出することが可能となる。
[0026] 基板に生体分子を固定する方法としては、基板に生体分子を固定できるものであ れば特に制限はないが、例えば、ァミノ結合させる方法、物理的吸着をさせる方法、 チオール結合させる方法、抗原抗体反応をさせる方法等を挙げることができる。
[0027] 本発明に用いられる液体としては、生体分子と検体との相互作用を検出できるもの であれば特に制限はないが、例えば、緩衝液等を挙げることができる。緩衝液を用い ることにより、生体分子および検体の活性を失うことなぐこれらの相互作用を検出す ることが可能となる。
[0028] 本発明における生体分子と検体とを接触させる方法としては、生体分子と検体が接 触できるものであれば特に制限はないが、例えば、検体を含む液体中に、生体分子 を固定した基板を浸漬する方法を挙げることができる。これにより、検体が生体分子と 接触し、相互作用が比較的強い場合は、より多くの検体が生体分子に吸着または結 合することとなる。また、これらの相互作用が比較的弱い場合は、より少ない検体が生 体分子に吸着または結合することとなる。
[0029] 本発明に用いられる SNOMプローブとしては、近接場光を発生させることができる ものであれば特に制限はない。 SNOMプローブ先端では、半径約数 lOnmの範囲 にお!、て近接場光を発生させることができ、標的とする生体分子付近の微小領域の みにおいて、検体との相互作用を検出することが可能となる。
[0030] この場合、生体分子を固定したスポットについて、 SNOMプローブを走査させて、 検出することが好ましい。なお、生体分子を基板に平坦に固定することは容易ではな いため、 SNOMプローブを走査させる方法としては、 AFMモードによることが好まし い。 AFMモードによれば、基板に固定した生体分子のスポットが平坦でない場合で も、その凹凸に応じて、 SNOMプローブと、生体分子または検体とを等距離に保つこ とができ、精度よく検体と生体分子との相互作用を検出することが可能となる。
[0031] 本発明に用いられる生体分子を固定した基板としては、 1種類の生体分子を固定し たもののほか、例えば、図 3に示すような、 2種以上の生体分子を固定したものを挙げ ることができる。即ち、図 3において、複数の生体分子 5は、各々異なる種類のものが 基板 1に固定されている。この基板 1を、検体を含む液体中に浸漬し、 SNOMプロ一 ブを走査させることにより、各々のスポットの生体分子について、検体との相互作用を 検出することが可能となる。これによつて、 1つの検体について、複数種類の生体分 子との相互作用を 1つの基板を用いることにより、検出することが可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] 基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接場光を用いて 検出する方法であって、
液体中にお 1ヽて前記生体分子と前記検体とを接触させる工程と、
液体中にお!、て前記生体分子表面に SNOMプローブを用いて近接場光を照射 する工程と、
前記近接場光により励起された蛍光を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、前記方法。
[2] 前記生体分子が、タンパク質および Zまたは糖鎖である、第 1項に記載の方法。
[3] 前記検体が、タンパク質および Zまたは糖鎖である、第 1項または第 2項に記載の方 法。
[4] 1種または 2種以上の生体分子を固定した基板を用いることを特徴とする、第 1項な
V、し第 3項の 、ずれかに記載の方法。
[5] 基板に固定した生体分子と、蛍光標識した検体との相互作用を、近接場光を用いて 検出する装置であって、
前記検体と液体中にお!、て接触した前記生体分子の表面に、近接場光を照射す る照射手段と、
前記近接場光により励起された蛍光を検出する検出手段と、
を備えることを特徴とする、前記装置。
[6] 前記生体分子が、タンパク質および Zまたは糖鎖である、第 5項に記載の装置。
[7] 前記検体が、タンパク質および Zまたは糖鎖である、第 5項または第 6項に記載の装 置。
[8] 1種または 2種以上の生体分子を固定した基板を用いることを特徴とする、第 5項な
V、し第 7項の 、ずれかに記載の装置。
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