JPH09269325A - 凸状領域を用いた分析方法 - Google Patents

凸状領域を用いた分析方法

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JPH09269325A
JPH09269325A JP8103948A JP10394896A JPH09269325A JP H09269325 A JPH09269325 A JP H09269325A JP 8103948 A JP8103948 A JP 8103948A JP 10394896 A JP10394896 A JP 10394896A JP H09269325 A JPH09269325 A JP H09269325A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 基板の分析部上で分析対象物の定量分析又は
定量分析を行うに当たり、基板の非分析部の影響を抑制
し、分析対象物の高精度な分析を可能とする。また、簡
素な装置構成で多試料同時分析あるいは多項目同時分析
を可能とする。 【解決手段】 基板１の分析部Ａ上で、分析対象物と該
分析対象物と直接的又は間接的に反応する反応物質３と
を反応させ、この反応に由来して発生する信号を検出す
る分析方法において、少なくとも信号検出段階におい
て、基板１に対向する対向部に信号発生関与部４ｘ又は
検出器を設け、基板の分析部Ａと対向部との距離が、基
板の非分析部Ｂと対向部に比して短くなるように、基板
１及び対向部の少なくとも一方に凹凸を形成し、分析部
Ａでの反応に由来する信号が非分析部Ｂ上での反応に由
来する信号に比して強い信号強度で検出されるようにす
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、基板の分析部上で
分析対象物と該分析対象物と直接的又は間接的に反応す
る反応物質とを反応させ、その反応に由来する信号を検
出することにより定性分析又は定量分析を行うに際し、
基板の分析部上での反応に由来する信号が、非分析部上
での由来する信号に対して強く検出されるようにし、そ
れにより分析対象物の高精度な分析を可能とする分析方
法に関する。更に詳しくは、本発明は、化学センサ、酵
素センサなどのバイオセンサ、特異結合分析センサなど
を用いる分析方法において、分析対象物を基板上の凸状
分析部に担持させること等により、簡素な装置構成で精
密分析を可能とする分析方法であり、微小で高精度なマ
イクロセンサの製造を可能とする分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】カラムクロマト分析法、酵素化学反応
法、免疫測定法などの液相中あるいは気相中の分析対象
物を定量する従来の分析方法には、分析に大量の試料を
必要とする、分析に大型の装置を要する、分析に時間が
かかる、などの問題点があった。特に、多くの試料につ
いて同時に分析する必要性がある場合（多試料同時分
析）や、１つの試料について多項目の分析を行う必要性
がある場合（多項目同時分析）には、これらの問題点は
重大な障害となっていた。
【０００３】これに対し、最近、化学センサ、バイオセ
ンサあるいは特異結合分析センサなどの多くのセンサ技
術が開発され、分析手法の簡素化と小型化が図られてい
る。しかし、未だ十分とは言い難い。特に、微小なセン
サで多試料同時分析あるいは多項目同時分析を可能と
し、かつ高精度の分析も可能とする技術は開発されてい
ない。
【０００４】例えば、S.P.Fodor らは、Science,Vol.25
1,p767-773 (1991) で、フォトリソグラフィーの手法と
光感受性保護基とを組み合わせて、微小な複数領域（二
次元平面上のマトリクス）に異なる配列のぺプチドある
いはオリゴヌクレオチドを合成して分析に用いる手法を
紹介している。また、P.Connollyは、Trends Biotechno
l.,Vol.12,p123-127 (1994) の総説で、リフトオフの手
法を用いて基板表面に親水性領域と疎水性領域をパター
ニングするフォトファブリケーションを紹介している。
C.R.Loweら（ＵＳＰ４５６２１５７号明細書）、S.Naka
motoら（Sensors and Actuators,vol.13,165-172(198
8)）、C.S.Dulceyら（Science,Vol.252,551-554,199
1）、S.K.Bhatiaら（Anal.Biochem.,Vol.208,197-205(1
993) ）も同様の表面加工技術及び分析方法を報告して
いる。
【０００５】また、W.T.Mullerらは、Science,Vol.268,
p272-273 (1995) で、基板上に自己会合させた単分子層
の表面官能基を走査型プローブ装置で微小加工して、基
板上の微小領域に物質を共有結合させる手法を紹介して
いる。
【０００６】走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）を用いた
表面加工技術は、Y.Utsugi（NATURE,Vol.347,747-749(1
990)）や、P.Connolly（Nanotechnology,Vol.2,160-163
(1991)）も報告している。
【０００７】D.J.Pritchard らは、Anal.Chim.Acta.Vo
l.310,p251-256 (1995)でシリコンウェハ基板の複数の
アビジン不溶化金電極部にフォトマスクをかけながら光
感受性フォトビオチンと２種類の抗体をそれぞれ反応さ
せ、多項目同時測定用の特異結合センサを作製する方法
を報告している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】これらの微小加工技術
は、いずれも基板上の所定の領域に異なる物質を固定す
ることを可能としている。しかしながら、その製造工程
は数段階以上から構成され複雑である。また、加工領域
が微小であるにも関わらず、各センサ部の特性を決める
特異結合物質（抗体）などの高価な試薬類あるいは貴重
な分子識別素子を基板全体に反応させることを前提とし
ており、必ずしも経済的ではない。また、電極などの検
出部領域と固定化領域とを正確に一致させる必要があ
り、微小なセンサを製造するには高精度の位置決め技術
が必須となる。さらに、検出部である電極などは、同一
平面上の周囲の非特異的結合などに起因する信号も同時
に検出してしまうため、高精度な分析には不向きとなっ
ている。
【０００９】また、化学センサ、酵素センサなどのバイ
オセンサ、免疫センサなどの特異結合分析に代表される
分析方法においては、化学感応物質、生体触媒物質、分
子識別素子、特異結合物質などの分析試薬成分を担持す
る分析部と、担持物質が関与して発生する信号を検出す
る検出部とが必要である。そして分析精度を向上させる
には、分析部に担持させる物質量の精度と検出部での信
号検出精度の両方を向上させる必要がある。ここで、分
析部に担持させる物質量の精度は、担持方法（化学的に
結合せず遊離状態のまま担持させる、共有結合で担持さ
せる、非共有結合で担持させる、特異結合物質を介して
担持させるなど）や、担持させるための反応液量精度、
点着液量精度、分析部の担持面積精度などに依存する。
特に、微量な試料の分析を可能とするために分析装置の
サイズを小さくすると、反応液量精度あるいは分析部担
持面積精度を保証することが困難となる。従来、このよ
うな課題を解決するために、フォトリソグラフィー的手
法により基板上の微小な領域に物質結合能を付与し、基
板全体を担持物質と接触させるという手法が採用されて
いる。しかし、このような方法は、製造工程が複雑化
し、担持させる試薬類も余分に必要となり、経済的でな
いという問題があり、しかも、担持すべきでない領域あ
るいは結合すべきでない領域への非特異的吸着の影響も
免れない。
【００１０】本発明はこのような従来技術の課題を解決
しようとするものであり、基板の分析部上で分析対象物
と該分析対象物と直接的又は間接的に反応する反応物質
とを反応させ、その反応に由来する信号を検出すること
により、試料中の分析対象物の定性分析又は定量分析を
行うに際し、基板の分析部上での反応に由来する信号
が、非分析部上での由来する信号に対して強く検出され
るようにし、それにより試料中の分析対象物の高精度な
分析を可能とすることを目的とする。
【００１１】また、本発明は、簡素な装置構成で精密分
析を可能とすることにより、微小で高精度なマイクロセ
ンサの製造を容易にし、また、微量の試料で多試料同時
分析あるいは多項目同時分析を可能とすることを目的と
する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、分析対象
とする試薬成分を微小な領域に固定化し、その領域に固
定化されている成分を精密に分析できるようにする手法
について鋭意検討した結果、基板の分析部上に、分析対
象物と直接的又は間接的に反応する反応物質を固定化
し、その上に分析対象物の分析を行う試料を導入してそ
れらを反応させるか、あるいは基板の分析部上に分析対
象物を固定化し、その上に分析対象物と直接的又は間接
的に反応する反応物質を導入してそれらを反応させ、こ
の反応に由来する信号を検出することにより分析対象物
の分析を行う場合であって、この反応が、反応物質の供
給あるいは反応エネルギーの供給という点から、基板に
対向する位置に配設した対向部が密接に関与する場合
に、基板の分析部と対向部との距離を、基板の非分析部
と対向部との距離に比して短くすることにより、分析部
上での反応に由来する信号を特異的に強い強度で検出で
きること、そしてこのように分析部上での反応を特異的
に強い信号強度で検出するためには、基板及び対向部の
少なくとも一方に凹凸を形成することが有効であること
を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】即ち、本発明は、基板の分析部上で、分析
対象物と、該分析対象物と直接的又は間接的に反応する
反応物質とを反応させ、この反応に由来して発生する信
号を検出する分析方法であって、少なくとも信号検出段
階において、基板に対向する位置としての対向部に、前
記信号の発生に関与する信号発生関与部及び前記信号の
検出器の少なくとも一方を設け、基板の分析部と対向部
との距離が、基板の非分析部と対向部との距離に比して
短くなるように、基板及び対向部の少なくとも一方に凹
凸を形成し、基板の分析部上での前記反応に由来する信
号が基板の非分析部上での反応に由来する信号に比して
強い信号強度で検出されるようにしたことを特徴とする
分析方法を提供する。
【００１４】また、本発明は、このような分析方法の実
施に有用な分析用基板として、表面に複数の凸状分析部
が形成されていることを特徴とする分析用基板を提供す
る。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。
【００１６】本発明の分析方法は、基板の分析部上で、
分析対象物と、該分析対象物と直接的又は間接的に反応
する反応物質とを反応させ、この反応に由来して発生す
る信号を検出する分析方法であって、少なくとも信号検
出段階において、基板に対向する位置としての対向部
に、前記信号の発生に関与する信号発生関与部及び前記
信号の検出器の少なくとも一方が設けられていることを
前提としている。この分析方法において、分析対象物の
種類や、該分析対象物に対する反応物質の種類について
は、以下に詳述するように種々の物質が含まれ、これら
の反応に由来して発生する信号の発生機序、信号の種
類、信号の発生に対する信号発生関与部の関与態様、信
号を検出する検出器の種類や部位などについても、この
前記反応に由来して発生する信号が、対向部と分析部と
の距離に応じて特異的に強まるようにする限り特に制限
はなく、種々の態様が包含される。
【００１７】すなわち、本発明において分析対象物と反
応させる物質のうち、分析対象物と直接的に反応する反
応物質としては、(i) 分析対象物と直接的に結合し、そ
れ自体は化学的変化を起こさない物質と、(ii)分析対象
物と直接的に結合し、分析対象物、当該反応物自体ある
いはその他の物質に化学的変化を引き起こす物質との双
方が含まれる。
【００１８】より具体的には、(i) の物質として、分析
対象物が抗原である場合に、その分析対象物に対する抗
体をあげることができる。分析対象物が抗原であれば、
抗分析対象物抗体は、直接的に分析対象物と結合できる
からである。
【００１９】また、分析対象物が特定の配列を有する核
酸である場合に、そのＤＮＡあるいはＲＮＡと相補的に
ハイブリダイゼーションするポリ又はオリゴヌクレオチ
ドなどや、後述する分析対象物に対する特異結合物質
や、分析対象物をインヒビターなどとする酵素分子等を
例示することができる。また、カルボン酸基、アミノ基
等の解離基を有するイオン結合性物質、シリコン等の疎
水結合性物質も例示することができる。
【００２０】(ii)の物質としては、共有結合形成性ある
いは架橋形成性の物質、例えば、グルタルアルデヒド、
カルボジイミド、Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍ
ｉｄ（ＮＨＳ）、Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｄｙｌ ｔａｒｔ
ａｒａｔｅ（ＤＳＴ）、Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ
−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｉｏ）ｐｒｏｐｉｏ
ｎａｔｅ（ＳＰＤＰ）など、あるいはＳ−Ｓ結合交換反
応を引き起こすスルフヒドリル基を有する物質などを例
示することができる。さらに、分析対象物を酵素基質、
補酵素、補因子、インヒビター等とする酵素分子も例示
することができる。例えば、分析対象物が、酵素基質で
あるグルコースのとき、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ
Ｄ）などの酵素は、グルコースと直接的に結合し、別の
酵素基質である酸素の存在下、Ｄ−グルコノ−δ−ラク
トンと過酸化水素を生成する。
【００２１】一方、本発明において、分析対象物と間接
的に反応する反応物質とは、分析対象物が関与する反応
と間接的に関係した反応を生起する物質をいう。このよ
うな物質には、(a) 分析対象物に対する直接的結合物質
を介して分析対象物に間接的に結合する物質や、(b) 分
析対象物とは間接的にも結合しないが、分析対象物が結
合する物質と結合する物質が含まれる。
【００２２】このうち(a) の物質としては、分析対象物
の直接的結合物質に対する特異結合物質、例えば、抗分
析対象物抗体に対する抗体をあげることができ、より具
体的には、抗分析対象物抗体がビオチン標識されている
場合に、これと特異結合するアビジンなどをあげること
ができる。
【００２３】また、(b) の物質としては、分析対象物と
同一の物質あるいは分析対象物の類縁体を例示すること
ができる。この場合、抗分析対象物抗体が、分析対象物
と(b) の物質との双方と結合し得るため、(b) の物質は
抗分析対象物抗体に対して分析対象物と競合反応するこ
ととなる。他の(b) の物質の例としては、分析対象物と
直接的に反応し得る酵素が触媒する反応と連鎖する別の
反応を触媒する酵素等をあげることができる。より具体
的には、分析対象物がグルコースで、直接的に反応し得
る酵素がＧＯＤである場合に、ＧＯＤ反応で生成する過
酸化水素を基質とするパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）など
を例示することができる。
【００２４】本発明においては、以上のような分析対象
物と直接的又は間接的に反応する反応物質と分析対象物
とを基板の分析部上で反応させるが、その際、一方を予
め基板の分析部に担持させ、他方をその上に導入するこ
とができる。この場合、分析対象物と該分析対象物と直
接的又は間接的に反応する反応物質とのいずれを予め基
板に担持させてもよいが、特に、基板の分析部上に、分
析対象物と直接的又は間接的に反応する反応物質を担持
させ、分析対象物の定量又は定性分析を行う試料を基板
の分析部上に導入し、これらを反応させることが多試料
同時分析あるいは多項目同時分析の実際的な分析手法と
して有用となる。
【００２５】ここで、反応物質を担持させるとは、反応
が生じる様式で分析部に保持されていればその態様に限
定はない。したがって、例えば多試料同時分析の場合の
ように、微小なキャピラリーなどの分注手段あるいは吸
引手段で各分析部に対して個々に試料液あるいは試薬液
が導入され、基板上の各分析部の試料液あるいは試薬液
同士が連通していない場合には、反応物質は各分析部に
遊離状態で担持させることができる。一方、多項目同時
分析の場合のように、一つの試料液を複数の分析部に同
時に導入して異なる複数の分析を行う場合には、一般的
に反応物質を分析部に不溶化することが好ましい。この
ような不溶化の態様としては、反応物質を分析部表面へ
物理吸着させる、あるいは分析部表面の吸着物質に共有
結合させるなどして反応物質を不溶化する態様をあげる
ことができる。また、不溶化のための手法としては、ガ
ラス試験管、プラスチック試験管、多孔質メンブレイ
ン、マイクロプレート、ポリスチレンビーズ、ラテック
ス粒子、磁性粒子等の各種固相単体を用いた特異結合分
析に用いられている手法を好適に利用することができ
る。
【００２６】本発明において、分析対象物と該分析対象
物と直接的又は間接的に反応する反応物質との反応に由
来して発生する信号とは、分析対象物と該分析対象物と
直接的又は間接的に反応する反応物質との直接的又は間
接的反応の結果として発生する信号であって、試料中の
分析対象物の量あるいは濃度に依存して変化する信号を
意味する。例えば、反応物質が特異結合物質であり、標
識特異結合物質が信号発生に関与する場合に、その標識
から発生する信号；反応物質がＤＮＡあるいはＲＮＡな
どの核酸とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチ
ド配列の特異結合物質であり、ハイブリダイゼーション
反応の産物に結合する標識特異結合物質、あるいはイン
ターカレート物質が発生する信号；反応物質が酵素の場
合に、酵素反応生成物が発生する信号等をあげることが
できる。
【００２７】また、ここで信号とは、酵素反応法、光学
的あるいは電気化学的酵素センサ法、蛍光免疫測定法、
酵素免疫測定法、化学発光あるいは生物発光免疫測定法
等に代表され、均質法あるいは不均質法として知られる
各種免疫分析法、標識抗２本鎖抗体あるいは蛍光インタ
ーカレーターを用いた核酸ハイブリダイゼーション定量
法に代表される核酸増幅分析法等の各種分析法における
検出信号として当業者が利用している呈色、蛍光等の発
光、電流、電位等の各種信号である。これらの各種分析
法における信号発生機序は、本発明においても好ましい
ものとして利用することができる。また、本発明におい
ても、前述した各種測定方法と同様に、信号強度は試料
中の分析対象物の量あるいは濃度に依存する。したがっ
て、検出器で検出される信号強度から未知検体中の分析
対象物量あるいは濃度を定性あるいは定量分析すること
が可能となる。
【００２８】本発明において、上述のような信号を検出
する検出器としては、その信号が電気化学反応による場
合に、例えば、基板上に蒸着により形成した金電極を使
用することができるが、この他、スクリーン印刷などで
形成したカーボンインクあるいは銀ペースト電極、カー
ボンファイバー電極、白金電極などを好適なものとして
例示できる。このような電極としては、露出させたくな
い部分をレジストパターン等で覆ったものも使用するこ
とができる。
【００２９】これらの電極は、基板上の分析部側又は分
析部に対向する対向部側に配置して、電流又は電位の検
出器として使用できるが、補助電極としても使用でき
る。なお、電極を対向部に設ける場合、基板と電極との
距離を一定に維持するためにスペーサーなどを挿入し、
スぺーサーを介して基板と電極とを対向させ、それらを
貼り合わせればよい。
【００３０】また、本発明において信号の検出器として
は、後述する実施例で詳述するような極細い白金フィラ
メントからなるプローブ電極を使用してもよい。この場
合、プローブ電極が、分析部が配置された基板に対して
一定距離を維持したまま基板上を走査するように、プロ
ーブ電極を精密なモーター駆動で動かして信号検出する
方法が好ましい。この走査はプローブ電極に対して基板
側を動かすことにより行ってもよい。
【００３１】このようにプローブ電極を使用する電気化
学的検出方法は、走査型電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）と
して知られており(C.Lee,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. Vo
l.87,p1740-1743 (1990) 、A.J.Bard et al,Science. V
ol.254,p68-74 (1991) 、H.Shiku et al.Anal.Chem.,Vo
l.67,p312-317 (1995) など）、本発明の分析方法に好
適に応用できる。
【００３２】また、本発明において信号の検出器として
は、信号が、蛍光、化学発光、生物発光等による光であ
る場合に、ＣＣＤ、光電子増倍管等の光検出器を使用す
ることができる。
【００３３】以上説明した信号の検出器は、本発明の態
様の例示であり、本発明における信号の検出方法が電気
化学的検出や光学的検出に限定されることを意味するも
のではない。分析部あるいは分析部に対向する反応関与
部の少なくとも一方の凹凸により、分析部の特異的な信
号とその周囲の非特異的な信号との間に信号強度差をつ
けて信号を検出することができる限り、種々の信号検出
法を本発明は利用できる。
【００３４】一方、本発明において信号発生関与部と
は、分析対象物と該分析対象物と直接的又は間接的に反
応する物質との反応を進行させ、その反応に由来する信
号を発生させるにあたり、何等かの寄与を行う物質の供
給を制御する部位あるいは、そのような信号の発生に関
与するエネルギーの供給を制御する部位を含む。
【００３５】ここで、エネルギーの供給を制御すると
は、信号発生に必要な外部エネルギーの供給、あるいは
信号発生を促進又は抑制する外部エネルギーの供給を制
御的に行うことを意味する。そして信号発生に関与する
エネルギーとしては、光エネルギーや熱エネルギーを例
示することができる。
【００３６】また、信号発生関与部からエネルギーを供
給するに際しては、これらのエネルギーが、基板上の分
析部には十分に到達するが、非分析部には反応の促進に
有効な量が到達しないようにエネルギーの供給領域を信
号発生関与部の表面近傍に制御できることが好ましい。
このように供給領域を制御できるエネルギーの例として
は、光エネルギーについては、例えば、プリズム板ある
いは光ファイバー等の光導波路の表面に生じるエバネッ
セント波をあげることができる。エバネッセント波を用
いると薄層領域内の蛍光物質の検出を行なうことができ
る。さらに光エネルギーを使用すると、金属蒸着光導波
路表面での誘導率変化による表面プラズモン共鳴（ＳＰ
Ｒ）分析を行うこともできる。
【００３７】したがって、本発明においてエバネッセン
ト波を利用する場合、信号発生関与部を構成する対向部
は、平面プリズム板等の光導波路からなり、分析部ある
いは対向部の少なくとも一方を凸状領域とし、分析部は
光エネルギーが供給される領域に入るが、非分析部は光
エネルギーが供給される領域から外れるようにする。そ
して、基板側あるいは対向部側に集光器を設置し、これ
と光電増幅器あるいはＣＣＤ等の検出器を組み合わせて
使用することにより、分析部に起因する信号を精度よく
分析することが可能となる。
【００３８】また、本発明において信号発生関与部から
の供給領域を制御できるエネルギーとしては、サーマル
サイクラー（例えば、ＤＮＡ増幅装置等で使用されてい
るもの）で制御された熱エネルギーもあげることができ
る。サーマルサイクラーを本発明に使用すると、熱源近
傍は所定の温度に温度制御できるが、離れた領域までは
温度制御できない状況を作り出すことができる。一方、
ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅反
応は、サーマルサイクラーによる温度循環によって引き
起こされる。したがって、本発明においてサーマルサイ
クラーを利用する場合、分析部だけが必要な温度制御を
受ける領域に入るように凸状領域を形成し、ＰＣＲが引
き起こされるようにすればよい。なお、この領域の内外
の温度差を増強するために、基板側を一定温度に維持し
てもよい。
【００３９】サーマルサイクラーを利用した本発明の態
様をより具体的に説明すると、例えは、分析部に配列特
異的な核酸プローブを担持し、試料とプライマー及びポ
リメラーゼ等のＰＣＲに必要な試薬を分析部と対向部と
の間に導入し、対向部からサーマルサイクラーで温度制
御する。すると、試料中に分析対象物である核酸配列が
存在する場合、分析部に限局して核酸増幅が引き起こさ
れる。そこで、例えば、２本鎖核酸にインターカレート
する蛍光標識物質、あるいは電気化学標識モノヌクレオ
チド等を共存させることにより核酸増幅産物に標識を取
り込ませることができる。そしてその結果、核酸増幅反
応の産物量に応じた蛍光信号あるいは電気化学信号を検
出器で検出することが可能となる。この場合、核酸プロ
ーブなどの成分が凸状の分析部以外に担持されていても
温度制御されない限りは核酸増幅反応自体が生じない。
したがって、分析部での測定を精度よく行うことが可能
となる。
【００４０】本発明においては、前述したように、分析
対象物と直接的又は間接的に反応する反応物質と分析対
象物とを基板の分析部上で反応させるにあたり、それら
のいずれか一方を予め基板の分析部に担持させ、他方を
その上に導入することができるが、基板の分析部にいず
れを予め担持させておく場合であっても、信号発生関与
部の関与態様や、検出器の種類や配設部位については種
々の態様が含まれる。すなわち、基板に対向する対向部
には信号発生関与部を設け、検出器は基板側に設けても
よく、あるいは対向部に信号発生関与部を設けることな
く検出器を設けてもよく、対向部に信号発生関与部と検
出器との双方を設けてもよい。また、信号発生関与部を
対向部に設ける場合に、信号発生関与部は、信号の発生
に関与する物質を供給するものでもよく、エネルギーを
供給するものでもよい。以下、これらの点を図面を参照
しつつ詳細に説明する。
【００４１】図１（ａ）は、本発明の分析方法の一態様
の説明図である。同図に示した態様においては、表面に
凹凸を有するシリコンウェハ、ガラスなどの絶縁性基板
１の凸状領域に、半導体、金属、カーボンインク等で形
成された複数の導電層からなる信号検出電極部２が形成
されている。この分析方法の態様においては、絶縁性基
板１の凸状領域に形成された信号検出電極部２上が分析
部Ａとなり、絶縁性基板１の凹状領域が非分析部Ｂとな
る。そこで、分析部Ａとなる信号検出電極部２上には、
分析対象物と反応する反応物質３が担持されている。
【００４２】また、絶縁性基板１と対向する位置には信
号発生関与部４ｘが配されている。信号発生関与部４ｘ
は、分析対象物と反応物質３との反応に由来する信号発
生に関与する分析試薬を基材５に担持させたものとして
もよく、あるいは信号発生関与部４ｘが電極として機能
し、分析対象物と反応物質３との反応に由来する信号発
生に関与する物質が信号発生関与部４ｘにおける電極反
応で生成されるようにしてもよく、あるいはまた分析対
象物と反応物質３との反応に由来する信号発生に関与す
るエネルギーを供給するものとしてもよい。
【００４３】反応物質３を担持している信号検出電極部
２は、ポテンシオスタットなどの外部検出器に接続され
ており、各信号検出電極部２の上に担持されている物質
の酸化電流あるいは還元電流を検出する電極として機能
している。このような信号検出電極部２は、例えば、金
等の金属の蒸着や、カーボンインクなどのスクリーン印
刷等により構成することができる。
【００４４】この図１の態様の具体的な分析方法として
は、例えば、凸状分析部Ａに予め反応物質３として特異
結合物質を担持させておき、ついで試料液と西洋ワサビ
パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識特異結合物質とを反応
させ、試料液中の分析対象物の量に応じて分析部Ａ上に
特異結合物質−分析対象物−ＨＲＰ標識特異結合物質か
らなる三元複合体を形成する。そしてこの三元複合体の
ＨＲＰ活性を、検出電極として機能する信号検出電極部
２とＨＲＰとの直接的な電子移動で、あるいは、電子メ
ディエータを媒介にして、信号検出電極部２で検出す
る。この場合、信号発生関与部４ｘでは、ＨＲＰの酵素
基質である過酸化水素が生成されるようにする。信号発
生関与部４ｘで過酸化水素を生成させる方法としては、
例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）のようなオ
キシダーゼ酵素を分析試薬成分として反応関与部４ｘに
担持し、ＧＯＤの酵素基質であるグルコースと溶存酸素
を導入する方法をあげることができる。あるいは、信号
発生関与部４ｘを電極として機能させ、信号発生関与部
４ｘにおける電気化学反応で過酸化水素を発生させる方
法を用いてもよい。
【００４５】このように構成することにより、試料中の
分析対象物の量に応じて分析部Ａに生成した三元複合体
中のＨＲＰ活性に起因する信号（即ち、信号検出電極２
で検出される還元電流）は、信号発生関与部４ｘから供
給されるＨＲＰの酵素基質の拡散に依存することにな
り、信号発生関与部４ｘから離れるに従い信号強度は小
さくなる。従って、信号発生関与部４ｘへの距離が短い
分析部Ａに担持されている分析対象物に由来する検出信
号強度が、分析部以外の領域、例えば、非分析部Ｂへの
ＨＲＰの非特異吸着などから受ける影響を小さくでき、
精度の高い特異結合分析が可能となる。
【００４６】図１（ａ）の態様は、絶縁性基板１の表面
に凹凸を付与して、その凸部に信号検出電極部２を設
け、その信号検出電極部２上を凸状の分析部Ａとし、そ
の周囲の凹状領域を非分析部Ｂとしたが、本発明の態様
としては、図１（ｂ）に示したように、信号発生関与部
４ｘに凹凸を付与し、分析部Ａに対向する部位の信号発
生関与部４ｘが分析部Ａに近付くようにしてもよい。
【００４７】図１（ａ）あるいは図１（ｂ）に示した態
様の分析基板を用いた分析手順は、例えば、次のように
行うことができる。
【００４８】まず、反応物質３として、抗分析対象物抗
体を担持させた分析部Ａに未知濃度の分析対象物を含有
する試料と、ＨＲＰ標識抗分析対象物抗体を導入し、特
異結合反応を行わせて前述の三元複合体を形成させる。
この場合、試料とＨＲＰ標識抗分析対象物抗体の導入
は、同時であっても別々でもよい。また、試料の導入と
ＨＲＰ標識抗分析対象物抗体の導入の間に、あるいは三
元複合体の形成後に、必要に応じて、基板１上に、例え
ば界面活性剤を含有する緩衝液等の洗浄液を導入し、排
出するという洗浄操作を加えてもよい。
【００４９】次いで、信号発生に必要な試薬液、例え
ば、信号発生関与部４ｘにＧＯＤを担持させている場合
に必要とされる溶存酸素とグルコースとを含む電解質溶
液等を基板１と信号発生関与部４ｘとの間に導入し、電
解質溶液で液絡した対極あるいは参照極に対して還元電
位を印加した信号検出電極部２で標識酵素ＨＲＰが発生
する還元電流を信号として検出する。こうして検出され
る信号強度は、試薬中の分析対象物の量に応じて分析部
Ａ上に形成された三元複合体中のＨＲＰ量に依存する。
したがって、分析対象物濃度既知の試料に対する信号強
度から求められる標準応答から、試料中の分析対象物濃
度を分析することが可能となる。
【００５０】以上の分析手順において、試料、洗浄液あ
るいは試薬液を導入する際の具体的態様は、試料、洗浄
液あるいは試薬液が基板１上の分析部Ａに接する限り特
に限定はない。例えば、基板１をこれらの液中に浸漬し
てもよく、互いに対向部する信号発生関与部４ｘと基板
１との間隙にポンプあるいは毛細管現象等で液を注入し
てもよい。ただし、多試料同時分析等の場合には、後述
するキャピラリーなどの分注手段を用いて所定の分析部
Ａに液を滴下あるいは点着することが好ましい。
【００５１】また、以上の分析手順において、分析開始
時に信号発生関与部４ｘが分析部Ａに対向している必要
なない。信号発生関与部４ｘは、信号発生段階で分析部
Ａに対向していればよい。したがって、信号発生関与部
４ｘあるいは分注手段がモーター駆動などで基板１上を
Ｘ、Ｙ、Ｚあるいはφ軸方向に移動可能としたり、試薬
液等の導入及び排出を、シリンジ制御機構で行えるよう
にすることができる。これにより、試薬液等の導入を外
部のコンピュータ等で制御して行うことができ、分析の
自由度と精度とを高めることができるので、分析の自動
化を図ることができるので好ましい。
【００５２】図２は、さらに異なる本発明の態様を表し
たものである。同図においては、表面に凹凸を有するシ
リコンウェハ、ガラスなどの絶縁性基板１の凸状領域に
分析試薬成分６を担持し、その部分が分析部Ａとされて
いる。また分析部Ａの周囲の凹状領域に非分析部Ｂがあ
り、基板１に対向する対向部に、分析対象物に由来する
信号の検出電極部４ｙが設けられている。
【００５３】この図２の態様の具体的分析手順として
は、例えば、特異結合物質を分析部Ａに担持させてお
き、分析対象物を分析する試料液と西洋ワサビパーオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）標識特異結合物質とを反応させ、試
料液中の分析対象物の量に応じた、特異結合物質−分析
対象物−ＨＲＰ標識特異結合物質から成る三元複合体を
分析部Ａ上に形成させる特異結合反応を行なわせる。そ
してこの分析部Ａの三元複合体中のＨＲＰ活性を、対向
部の信号検出電極部４ｙで検出する。
【００５４】図１に示した態様と同様に、この場合もＨ
ＲＰの酵素基質である過酸化水素は、電気化学的に発生
させてもよく、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）のよ
うなオキシダーゼを用いて発生させてもよく、単に反応
溶液中に存在させてもかまわない。なお、分析部ＡのＨ
ＲＰ活性と、検出部電極として機能させる対向部４ｙと
を媒介する電子メディエータが反応溶液中に必要であ
る。
【００５５】このように構成することにより、試料中の
分析対象物の量に応じて分析部Ａに生成した三元複合体
中のＨＲＰ活性に起因する信号（例えば、信号検出部電
極で観測される還元電流値）は、電子メディエータの拡
散距離が大きくなるに従って小さくなり、それ故に、対
向部にある信号検出電極部４ｙでの信号強度は、分析部
Ａと信号検出電極部４ｙとの距離が離れるに従い小さく
なる。したがって、凸状領域となっている分析部Ａに形
成された三元複合体中のＨＲＰ活性の信号の検出に際し
て、分析部Ａ以外の領域、即ち、分析部Ａの周辺の凹状
の非分析部Ｂへ非特異吸着したＨＲＰの影響を小さくで
き、分析部Ａにおける精度の高い特異結合分析が可能と
なる。
【００５６】図２の態様は、絶縁性基板１に凹凸を付与
して、凸状の分析部Ａとその周囲の凹状の非分析部Ｂと
を形成したが、本発明の態様としては、対向部に凹凸を
付与し、信号検出電極部４ｙとして機能する部位の対向
部を分析部Ａに近付けてもよい。さらに本発明の態様と
しては、図２の態様において、分析部Ａを電極から構成
してもよく、対向部に信号の発生に関与する試薬成分を
担持させてもよい。
【００５７】図３はさらに異なる本発明の態様を表した
ものである。同図においては、表面に凹凸を有する透明
基板１の凸状領域である分析部Ａに、分析対象物に対す
る特異結合物質等の反応物質３を担持させ、基板１の対
向部４ｚには、光エネルギーを供給する信号発生関与部
として、エバネッセント波を発生する光導波路を設け、
また基板１の裏面にはＣＣＤを配したものである。
【００５８】この態様の分析手順としては、まず、分析
対象物を分析する試料と蛍光物質標識抗分析対象物抗体
とを分析部Ａに導入し、分析部Ａ上に三元複合体を形成
する。ここで、蛍光物質としては、フルオレセイン、テ
キサスレッド、フィコビリプロテインなどを例示するこ
とができる。次いで、対向部４ｚからエバネッセント波
を発生させる。このエバネッセント波の及ぶ範囲は、波
長、屈折率、光の入射角に依存するが、通常１００ｎｍ
以下程度である。したがって、図３の態様においては、
エバネッセント波の進行方向の分析部Ａと非分析部Ｂと
の距離を１００ｎｍ以上離すことにより、分析部Ａの表
面に結合している標識蛍光物質にはエバネッセント波が
到達し、その標識蛍光物質は蛍光を発するが、非分析部
Ｂの表面に結合している標識蛍光物質には、エバネッセ
ント波が及ばず、蛍光も発しない。したがって、ＣＣＤ
では、分析部Ａの表面に結合している標識蛍光物質から
の蛍光を特異的に検出することが可能となる。
【００５９】なお、図３には、基板の対向部に光エネル
ギー供給する信号発生関与部を設け、基板の裏面に検出
器としてＣＣＤを設けた例を示したが、発明において
は、対向部の信号発生関与部からエネルギーを供給する
場合でも、検出器を対向部側に設けることができる。例
えば、基板の対向部に設けた光導波路が光エネルギーを
供給すると共に分析部からの蛍光を検出器に導光するよ
うにしてもよい。また、基板の対向部にサーマルサイク
ラーを設けた場合に、そのサーマルサイクラーに接する
電極を検出器として対向部に設けることができる。
【００６０】以上、本発明の態様を図面に基づいて具体
的に説明したが、本発明の分析方法は、上述した特定の
分析手法に限定されるものではない。例えば、図１及び
図２の具体的態様として説明したような、三元複合体中
のＨＲＰ活性を利用する分析法は（所謂サンドイッチ型
特異結合分析法）は、本発明が使用することのできる分
析手法の一例であり、この他、本発明は、競合型特異結
合反応にも好適に応用可能である。また、洗浄分離操作
の必要な非均質法のみならず、均質法にも好適に応用で
きる。さらに、特異結合分析のみならず、化学センサ、
酵素センサなどのバイオセンサにも応用可能である。
【００６１】ここで、化学センサとしては、イオン選択
性電極、ガスセンサ、固体電解質センサ、半導体セン
サ、湿度センサ、臭いセンサ、その他の試料中の化学物
質に感応するセンサ類をあげることができ、化学物質に
感応する物質を担持した分析部と、電極、光電素子など
のトランスジューサーから構成される検出部を組み合わ
せて、分析部に担持した物質が感応する化学物質を検出
する分析方法が含まれる。
【００６２】バイオセンサとしては、生体組織、微生
物、細胞、細胞内小器官などの生物体、あるいは、酵素
などの生体触媒物質などを分子識別素子として担持させ
た分析部と、電極、光電素子などのトランスジューサー
から構成される検出部を組み合わせたセンサ等が含まれ
る。代表的なバイオセンサは酵素センサであり、酵素と
してグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用いたグルコ
ースセンサなどが知られる。
【００６３】本発明が利用できる特異結合分析について
も、図１及び図２であげた例に限られず、種々の態様を
あげることができる。したがって、特異結合物質として
は、抗体、抗原、オリゴヌクレオチドなどの核酸類など
の特異結合物質を分析部に担持させ、電極、光電素子な
どのトランスジューサーから構成される検出部を組み合
わせて、分析部に担持した特異結合物質に関連する特異
結合反応を検出する分析方法が含まれる。
【００６４】すなわち、特異結合分析は、分析対象物
と、それに特異的に結合する特異結合物質との少なくと
も１つの特異結合反応に関連して試料中の分析対象物を
定性もしくは定量する分析方法である。この特異結合分
析としては、抗原抗体反応を応用したイムノアッセイ、
受容体を用いたレセプターアッセイ、相補的核酸配列の
ハイブリダイゼーションを用いた核酸プローブアッセイ
などの多くの方法が知られており、その特異性の高さか
ら、臨床検査をはじめとする広い分野で繁用されてい
る。
【００６５】そして特異結合分析における分析対象物と
しては、具体的には抗体分子や抗原として機能する各種
蛋白質、ポリぺプチド、糖蛋白質、多糖類、複合糖脂
質、低分子化合物など、あるいは核酸、エフェクター分
子、レセプター分子、酵素、インヒビター等が例示され
る。さらに具体的には、α−フェトプロテイン、癌胎児
性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９等の腫瘍
マーカーや、β2 −ミクログロブリン（β2 ｍ）、フェ
リチンなどの各種蛋白質；エストラジオール（Ｅ2 ）、
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホル
モン（ＬＨ）、ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）などの各
種ホルモン；カビ、細菌などの各種微生物あるいは微生
物生産物質；ＨＢs 抗原、ＨＢs 抗体、ＨＢe 抗原、Ｈ
Ｂe 抗体、ＨＢc 抗体、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体などの
各種ウイルス関連抗原あるいはウイルス関連抗体；各種
アレルゲンおよびこれに特異的なＩg Ｅ抗体；麻薬性薬
物、医療用薬物およびこれらの代謝産物；環境汚染物
質、有害物質、危険物質などの環境指標物質；ウイルス
および疾患関連ポリヌクレオチド配列の核酸等が例示さ
れる。
【００６６】また、特異結合分析における特異結合物質
としては、分析対象物等のある特定の物質に特異的に結
合する、すなわち、特定の物質に特異結合反応しうる物
質が包含される。
【００６７】したがって、分析対象物とそれに対する特
異結合物質との組み合わせとしては、抗原とそれに対す
る抗体、相補的核酸配列、エフェクター分子とレセプタ
ー分子、酵素とインヒビター、酵素と補因子、酵素と基
質、糖鎖を有する化合物とレクチン、ある抗体とその抗
体に対する抗体、レセプター分子とそれに対する抗体等
が例示される。また、これらの組み合わせにおいて、ど
ちらの物質も相手方の物質に対する特異結合物質となり
うる。
【００６８】また、特異結合物質として、特異結合活性
が消失しない程度に化学修飾されたもの、あるいは、他
の成分と結合してなる複合性物質もあげられる。このよ
うな特異結合物質としては、ビオチンで化学修飾された
抗体もしくはポリヌクレオチド、アビジン共有結合抗体
等が例示される。また、遺伝子組換え法で作成した抗体
と酵素、あるいは抗体とレセプターとの融合蛋白質など
も例示される。
【００６９】特異結合分析を実施するセンサの一例とし
て、液体試料中の分析対象物と特異結合物質との特異結
合反応によって標識剤の電極部からの距離分布を形成さ
せ、電子伝達物質の拡散に律速された液体試料中の分析
対象物の濃度に対応する電流値を計測し、これによって
分析対象物濃度を測定するＭＥＤＩＡ法(Mediator Diff
usion-Controlled Immunoassay) として知られる特異結
合分析方法（特開平５−２６４５５２号公報（欧州特許
公開公報0525 723 A2 号）参照）があるが、本発明にお
いては、このＭＥＤＩＡ法も好ましく利用することがで
きる。
【００７０】以上のような本発明の分析方法において、
分析対象物を担持する基板側に凹凸を設けておく態様を
実施する場合、使用する基板としては、表面に複数の凸
状分析部と各凸状分析部の周囲に凹状の非分析部を形成
したものが有用である。特に、その凸状分析部に、分析
対象物に対する特異結合物質を担持させたものは、本発
明で特異結合分析を利用する場合に有用である。
【００７１】このような基板において、凸状分析部の表
面積や、凸状分析部の非分析部からの高さや、隣接する
凸状分析部の間隔は、分析対象物の種類等に応じて適宜
定めることができるが、例えば、凸状分析部の非分析部
からの高さ０．１μｍ〜１ｍｍとし、隣接する凸状分析
部の間隔を２μｍ〜２０ｍｍとすることにより、通常の
多項目同時分析や多試料同時分析を、高い分析精度で行
うことが可能となる。
【００７２】また、このような凹凸を有する基板は、フ
ォトリソグラフィー法、エッチング法、切削法、蒸着
法、貼合わせ法、印刷法などの表面加工法あるいは表面
処理法を用いて容易に作製することができる。したがっ
て、本発明の方法によれば、それを実施する装置も容易
に製造できるようになる。
【００７３】一方、本発明の方法を実施するにあたり、
基板上の分析部等の所定の領域に分析試薬を担持させる
場合には、分析精度を向上させるため、所定の領域に正
確な量を担持させることが好ましいが、従来の微量分析
装置に比して担持量や位置精度に許容範囲をもたせるこ
とができる。即ち、分析試薬成分の担持時の反応液が所
定領域をはみ出しても、前述のように基板上の分析部上
の分析対象物に由来する信号強度は、その周辺部からの
信号強度に比して強いので、分析試薬成分の担持量や担
持位置の測定精度への影響を小さくできる。したがっ
て、本発明の方法を実施する分析装置は、精密なマイク
ロセンサとして製造することが可能となる。
【００７４】また、本発明の方法によれば、従来例のよ
うに分析試薬成分を基板全体に反応させて、基板上の特
定領域（結合官能基を導入した領域など）に分析試薬成
分を担持させる方法を採用する必要がなくなる。したが
って、マイクロキャピラリーで凸状分析部に分析試薬成
分を点着して担持させることが可能となり、それゆえ
に、分析試薬の無駄を抑制することができる。また、マ
イクロキャピラリーを用いて分析試薬成分を点着させる
場合には、プローブ電極を用いて信号を検出する場合と
同様に、マイクロキャピラリーを、基板上を走査させる
ことでき、これにより効率的に点着作業を行えるように
なるので好ましい。
【００７５】さらに、マイクロキャピラリーによる点着
方式は、多項目同時分析や多試料同時分析のための微小
な分析部の形成を可能にするため、本発明によれば多項
目同時分析や多試料同時分析も容易に行えるようにな
る。即ち、多項目同時分析や多試料同時分析を行うため
には、基板上の微量な領域に、複数の異なる分析試薬を
担持させた分析部を形成したり、多試料あるいは標準試
料（濃度既知の試料、陽性試料、陰性試料、対照試料
等）を点着させるための複数の分析部を形成することが
必要となるが、本発明によればこのような分析部の形成
をマイクロキャピラリーを用いて容易に行うことが可能
となる。また、点着する内容に応じて、使用するマイク
ロキャピラリーを交換する、あるいは複数のマイクロキ
ャピラリーを用いて点着する等の操作も容易となる。
【００７６】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説
明する。
【００７７】実施例１：特異結合基板を用いたｈＣＧ
（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）及びｈＰＬ（ヒト胎盤性
ラクトゲン）の多項目同時特異結合分析
【００７８】(1) 溶液の調製 １０％ＨＦ溶液は、４６％フッ化水素酸（森田化学工業
社製）を蒸留水で希釈して調製した。オクタデシルトリ
クロロシラン（関東化学社製）は、ベンゼン（和光純薬
工業社製）で希釈して１０ｍＭ濃度に調製した。
【００７９】フェロセニルメタノ−ル（ＦＭＡ）は、フ
ェロセニルアルデヒド（アルドリッチ社）を還元して合
成した。すなわち、フェロセニルアルデヒド（アルドリ
ッチ社）のエタノール溶液２０ｍＬと、０．１ｇＮａＯ
Ｈ、１．０ｇＮａＢＨ4 を含有するエタノール溶液３０
ｍＬとを混合し、１日間還流した。その後、５０ｍＬの
クロロホルムで抽出し、溶媒のクロロホルムをエバポレ
ートして粗ＦＭＡを得、これをｎ−ヘキサンで３回再結
晶させて精製した。
【００８０】マウス単クローン性抗ヒト絨毛性ゴナドト
ロピン（ｈＣＧ）抗体、および、マウス単クローン性抗
ヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）抗体は、持田製薬株式
会社製を用いた。抗体溶液は、いずれも０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して調製した。
【００８１】(2) 凸状分析部を有する分析用基板の作製 図４（同図（ａ）上面図、同図（ｂ）断面図）に示すよ
うに、方形（５０μｍ×５０μｍ）の凸状分析部１ａを
２カ所に内包する長方形（１５０μｍ×３００μｍ）の
凹状非分析部１ｂ、及び、その位置決めのための凹状位
置決め部７を有する分析用基板１０を次のように作製し
た。
【００８２】まず、レジスト（ＯＦＰＲ−５０００、東
京応化社製）をスライドガラス基板（長さ７６mm×幅２
６mm×厚さ０．８〜１．０mm、松浪社製）上にスピンコ
ートした。次いで、オーブン中で６０℃３０分間プリベ
ークし、その上に予め作製したマスクパターンを密着さ
せ、Ｈｇランプ（５００Ｗ）で３秒間光照射した。現像
液に３０秒間浸漬した後、よく水洗することによりレジ
ストマスクがパターニングされたガラス基板を得た。次
のこの基板を１０％ＨＦ溶液に５分間浸すことによって
マスクされていない露出ガラス部分を深さ２μｍエッチ
ングした。このエッチングにより、深さ２μｍの凹状非
分析部１ｂと凹状位置決め部７を形成すると共に、凹状
非分析部１ｂ内に凸状分析部１ａを残存させた。次に、
この基板を蒸留水で洗浄後、メタノールで洗浄してレジ
ストを除去し、再度蒸留水で洗浄して乾燥し、凸状分析
部１ａを有する分析用基板１０を得た。
【００８３】(3) 分析用基板の走査型電気化学顕微鏡
（ＳＥＣＭ）による観察 基板１０に形成した凸状分析部１ａのパターンを確認す
ると共に、後述するようにこの基板１０で行う特異結合
反応の位置決めのために、走査型電気化学顕微鏡（ＳＥ
ＣＭ）で基板１０の観察を行った。
【００８４】この場合、走査型電気化学顕微鏡の観察系
の構成は、図５に示すように二電極法とし、探針２０と
して、微小プローブ電極（白金電極部の直径５μｍ，ガ
ラス絶縁部を含むプローブ全体の直径６０μｍ）を使用
し、対極２１として、飽和塩化カリウム中に浸されたＡ
ｇ／ＡｇＣ１からなる電極を使用した。
【００８５】ここで、微小プローブ電極は、次のように
作製したものを用いた。即ち、直径１５μｍの白金線を
ＨａＮＯ3 飽和溶液中でエッチングして白金フィラメン
トを得、これを軟ガラスキャピラリーに挿入し、真空中
３２０℃に加熱封入してガラスコートした。その先端を
ターンテーブル（成茂科学器械研究所、モデルＥＧ−
６）で研磨し、さらに０．０５μｍアルミナ粒子で研磨
することにより、円形断面を有する微小ブローブ電極
（白金電極部直径５μｍ，ガラス絶縁部を含むプローブ
全体の直径６０μｍ）を得た。
【００８６】図５の走査型電気化学顕微鏡による観察方
法としては、ＳＥＣＭステ−ジ２２上に上記(2) で作製
した凸状分折部１を有する基板１０を載置し、その凸状
分折部１ａ側表面に以下の組成のＳＥＣＭ測定溶液２３
を滴下することにより、この凸状分折部１ａ側表面をＳ
ＥＣＭ測定溶液に浸した。
【００８７】［ＳＥＣＭ測定溶液組成］ １．０ｍＭ フェロセニルメタノール（ＦＭＡ） ０．１Ｍ 塩化カリウム ０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） そして、微小プローブ電極２０に＋４００ｍＶ ｖｓ．
Ａｇ／ＡｇＣ１の電位を印加し、微小プローブ電極と基
板１０との距離ｄを７μｍに保持し、９．８μｍ／秒の
走査速度でＳＥＣＭ観察を行った。
【００８８】なお、微小プローブ電極の走査は、サーボ
モーター駆動のＸＹＺ自動ステ−ジ（以下、モーター駆
動アクチュエータと称する）上で行った。自動ステ−ジ
のサーボモーターを制御するサーボモーターコントロー
ラー（中央精機株式会社製、Ｍ９１０３）は、ＧＰＩＢ
バス接続を通じてコンピュータからプログラム制御し
た。電流は、電流増幅器２４（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ社製、
モデル４２７）で増幅し、デジタル変換してコンピュー
タ２５に取り込み計測した。
【００８９】観察されたＳＥＣＭ像、即ち、ＳＥＣＭ測
定溶液中のＦＭＡの酸化電流の二次元プロファイルを図
６に示した。このＳＥＣＭ像は、ドットの濃淡で観測さ
れた電流を表現しており、ドットの濃い領域が、観測さ
れた電流の大きい部分である。この基板１０では分析部
１ａが凸状に突き出しているため、その上を電極が走査
するときに電極と分析部との間の距離が狭くなり、ＦＭ
Ａの電極への供給が妨げられるので、図示したようにこ
の部分の電流が小さくなっている。したがって、この図
６のＳＥＣＭ像から、基板１０には所期の凸状分析部１
ａと凹状非分析部１ｂとが形成されていることが確認で
き、さらに走査の位置決めをすることができた。
【００９０】(4) 特異結合基板の作製 凸状分折部１を有する分析用基板１０を用いて、特異結
合分析に使用する特異結合基板を次のように作製した。
まず、基板１０をオクタデシルトリクロロシランのベン
ゼン溶液中に１日間浸漬して疎水化処理した。乾燥後、
モーター駆動アクチュエータ装置に接続されたガラスキ
ャピラリーにより基板１０上の２つの凸状分析部１ａの
それぞれに、７６０μｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ抗体溶液、あ
るいは、５４０μｇ／ｍＬの抗ｈＰＬ抗体溶液を約１７
ｐＬずつ点着した。基板は一晩静置して乾燥後、０．１
％Ｔｗｅｅｎ２０（関東化学社製）水溶液で洗浄後、さ
らに蒸留水で洗浄した。次に、基板１０を１０ｍｇ／ｍ
Ｌウシ血清アルブミン（和光純薬工業社製）水溶液に２
時間浸漬してブロッキングを行った後、蒸留水で洗浄し
た。このようにして凸状分折部１に抗ｈＣＧ抗体８又は
抗ｈＰＬ抗体９を不溶化した基板１０を特異結合基板１
０ａとし、後述する特異結合分析に用いた。この特異結
合基板１０ａの断面模式図を図７に示す。
【００９１】なお、特異結合基板１０ａを保存する場
合、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬して冷
蔵保存した。
【００９２】(5) 特異結合基板を用いたｈＣＧ（ヒト絨
毛性ゴナドトロピン）およびｈＰＬ（ヒト胎盤性ラクト
ゲン）の多項目同時特異結合分析
【００９３】(5-1) 溶液の調製 西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識マウス単ク
ローン性抗ｈＣＧ抗体、ＨＲＰ標識マウス単クローン性
抗ｈＰＬ抗体は、持田製薬株式会社製を用いた。また、
ｈＣＧ試料液とｈＰＬ試料液は、それぞれ０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して調製した。
【００９４】(5-2) 特異結合反応 上記(4) で作製した特異結合基板１０ａに、２０ＩＵ／
ｍＬ濃度のｈＣＧ試料液あるいは１．０μｇ／ｍＬ濃度
のｈＰＬ試料液を５μＬずつ点着することにより、特異
結合基板１０ａの凸状分析部１ａおよび凹状非分析部１
ｂを上記(5-1)の試料液中に浸漬した。蒸留水で洗浄
後、２０μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識杭ｈＣＧ抗体および７
μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識杭ｈＰＬ抗体を含有する標識杭
体溶液に２０分間浸漬し、その後、蒸留水で洗浄した。
【００９５】(6) 特異結合基板の走査型電気化学顕微鏡
（ＳＥＣＭ）測定 走査型電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）を用いて、上記(5-
2) の特異結合反応をさせた後の特異結合基板１０ａの
観察を行った。この観察は、上記(3) の分析用基板１０
の走査型電気化学顕微鏡による観察と略同様に行った
が、ＳＥＣＭ測定溶液としては、ＨＲＰ酵素基質である
Ｈ2 Ｏ2 を添加した下記の組成の溶液を使用し、プロー
ブ電極に印加する電位は＋５０ｍＶ ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ
ＣＩに変更した以外は、上記(3) の方法と同様とした。
【００９６】［ＳＥＣＭ測定溶液組成］ １．０ｍＭ フェロセニルメタノール（ＦＭＡ） ０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2 ０．１Ｍ 塩化カリウム ０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
【００９７】上記(5-1) の試料液として、ｈＰＬ試料液
を用いて特異結合分析を行った場合のＳＥＣＭ像を図８
（ａ）に、また、ｈＣＧ試料液を用いて特異結合分析を
行った場合のＳＥＣＭ像を図９（ａ）に示した。さら
に、図８（ａ）及び図９（ａ）のそれぞれのｘ−ｘ線の
切片での電流プロファイルを図８（ｂ）と図９（ｂ）に
示した。
【００９８】この結果、抗ｈＣＧ抗体を不溶化した凸状
分析部１ａではｈＣＧ試料液の場合にのみ標識酵素ＨＲ
Ｐに起因する酵素触媒還元電流が観測され、逆に、抗ｈ
ＰＬ抗体を不溶化した凸状分析部ではｈＰＬ試料液の場
合にのみ標識酵素ＨＲＰに起因する酵素触媒還元電流が
観測された。したがって、特異結合基板１０ａにおい
て、凹状非分析部１ｂの微小領域内で、凸状分析部に抗
ｈＣＧ抗体８を不溶化した部分と抗ｈＰＬ抗体９を不溶
化した部分とで交差反応がおきていないことがわかる。
【００９９】また、ｈＰＬ試料液とｈＣＧ試料液につい
て、それぞれｈＰＬ又はｈＣＧ濃度を変える以外は同様
に特異結合分析を行い、ｈＰＬ濃度又はｈＣＧ濃度の凸
状分析部での電流との関係を求めた。これらの結果を図
１０及び図１１に示す。これにより、試料液中の抗原濃
度に対応した電流値が得られることがわかる。したがっ
て、本発明の特異結合基板を用いると、試料中の分析対
象物を高精度に定量分析できることがわかる。
【０１００】実施例２：特異結合基板を用いたＣＥＡ
（ヒト癌胎児性抗原）およびＡＦＰ（ヒトαフェトプロ
テイン）の多項目同時特異結合分析 (1) 溶液の調製 マウス単クローン性抗ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗
体、マウス単クローン性抗ヒトαフェトプロテイン（Ａ
ＦＰ）抗体、ＨＲＰ標識マウス単クローン性抗ＣＥＡ抗
体、ＨＲＰ標識マウス単クローン性抗ＡＦＰ抗体は、持
田製薬株式会社製を用いた。
【０１０１】ＣＥＡ試料液とＡＦＰ試料液は、いずれも
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して調製し
た。
【０１０２】(2) 特異結合基板の作製 実施例１(2) で作製した凸状分析部を有する分析用基板
を用いて特異結合基板を次のように作製した。まず、凸
状分析部を有する分析用基板をｎ−オクタデジルトリク
ロロシランのベンゼン溶液中に１日間浸漬して疎水化処
理した。乾燥後、モーター駆動アクチュエータ装置に接
続されたガラスキャピラリーにより基板上の２つの方形
の凸状分析部のそれぞれに、６３５μｇ／ｍＬの抗ＡＦ
Ｐ抗体溶液、あるいは、５１２μｇ／ｍＬの抗ＣＥＡ抗
体溶液を２０ｐＬずつ点着した。基板は一晩静置して乾
燥後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（関東化学社製）水溶液
で洗浄後、さらに蒸留水で洗浄した。次に、基板を１０
ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（和光純薬工業社製）水
溶液に２時間浸漬してブロッキングを行った後、蒸留水
で洗浄した。この凸状分析部に抗ＡＦＰ抗体あるいは抗
ＣＥＡ抗体を不溶化した基板を特異結合基板として、後
述する特異結合分析に用いた。
【０１０３】特異結合基板を保存する場合は、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬して冷蔵保存した。
【０１０４】(3) 特異結合反応 上記(2) で、作製した特異結合基板に５０μｇ／ｍＬ濃
度のＡＦＰ試料液あるいは２×１０-9、２×１０-8、２
×１０-7、２×１０-6、２×１０-5、２×１０-4ｇ／ｍ
Ｌ濃度のＣＥＡ試料液を１０μＬずつ点着し、特異結合
基板の凸状分析部および凹状非分析部を試料液中に１時
間浸漬した。蒸留水で洗浄後、３．５μｇ／ｍＬのＨＲ
Ｐ標識抗ＡＦＰ抗体および５１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識
抗ＣＥＡ抗体を含有する標識抗体溶液に２０分間浸漬
し、蒸留水で洗浄した。
【０１０５】(4) 特異結合基板の走査型電気化学顕微鏡
（ＳＥＣＭ）測定 実施例１と同一の走査型電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）を
用いて、上記(3) で特異結合反応させた特異結合基板の
観察を行った。この場合、ＳＥＣＭ測定溶液としては、
ＨＲＰ酵素基質であるＨ2Ｏ2 を添加した下記の組成の
溶液を使用し、プローブ電極に印加する電位は＋５０ｍ
Ｖ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣＩに変更した以外は、実施例１
(3) の方法と同様とした。
【０１０６】［ＳＥＣＭ測定溶液組成］ １．０ｍＭ フェロセニルメタノール（ＦＭＡ） ０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2 ０．１Ｍ 塩化カリウム ０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
【０１０７】上記(3) の試料液としてＡＦＰ試料液を用
いて特異結合分析を行った場合のＳＥＣＭ像を図１２に
示した。また、各種濃度のＣＥＡ試料液を用いて特異結
合分析を行った場合の還元電流と試料液中のＣＥＡ濃度
の関係を、図１３に示した。
【０１０８】この結果から、抗ＡＦＰ抗体を不溶化した
凸状分析部ではＡＦＰ試料液の場合にのみ標識酵素ＨＲ
Ｐに起因する酵素触媒還元電流が観測されたことがわか
る（図１２）。また、試料液中のＣＥＡ濃度に対応した
還元電流強度変化が得られた（図１３）。したがって、
本発明の特異結合基板を用いると、試料中の分析対象物
を高精度に定量分析できることが確認できた。
【０１０９】比較例１：凸状分析部を有さない特異結合
基板を用いたＣＥＡ（ヒト癌胎児性抗原）特異結合分析 (1) 溶液の調製 抗体およびＨＲＰ標識抗体は、実施例２と同様のものを
用いた。
【０１１０】ＣＥＡ試料液は、それぞれ０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して調製した。
【０１１１】(2) 凸状分析部を有さない基板の作製 スライドガラス基板を１０ｍＭ濃度のｎ−オクタデシル
トリクロロシランのベンゼン溶液中に８時間浸漬して疎
水化処理した。次いで、５００μｇ／ｍＬ濃度の単クロ
ーン性抗ＣＥＡ抗体を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に２時間浸漬して、スライドガラス表面
全体に抗体を不溶化した。蒸留水で洗浄し乾燥して、凸
状分析部を有さない分析用基板を作製した。そしてこの
基板の表面全体に抗体を不溶化し、比較例の特異結合基
板とした。
【０１１２】(3) 特異結合反応 モーター駆動アクチュエータ装置に接続したガラスキャ
ピラリーにより、上記(2) で作製した特異結合基板上に
１００μｍの間隔で，２×１０-7、２×１０-6、５×１
０-6、１×１０-5ｇ／ｍＬ濃度のＣＥＡ試料液を点着し
た。その点着スポットのサイズは光学顕微鏡下の観察で
ほぼ均一（半径約２０μｍ、スポット液量約１７ｐＬ）
であることを確認した。試料液を点着した基板は一晩静
置して乾燥後、蒸留水で洗浄した。洗浄後、１５μｇ／
ｍＬのＨＲＰ標識抗ＣＥＡ抗体を含有する標識抗体溶液
に２０分間浸漬し、蒸留水で洗浄した。
【０１１３】(4) 特異結合基板の走査型電気化学顕微鏡
（ＳＥＣＭ）測定 実施例１と同一の走査型電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）を
用いて、上記(3) で特異結合反応させた特異結合基板の
観察を行った。この場合、ＳＥＣＭ測定溶液としては、
ＨＲＰ酵素基質であるＨ2Ｏ2 を添加した下記の組成の
溶液を使用し、プロープ電極に印加する電位は＋５０ｍ
Ｖ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣＩに変更した以外は、実施例１
(3) の方法と同様とした。
【０１１４】［ＳＥＣＭ測定溶液組成］ １．０ｍＭ フェロセニルメタノール（ＦＭＡ） ０．５ｍＭ Ｈ2Ｏ2 ０．１Ｍ 塩化カリウム ０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
【０１１５】試料液として、各種濃度のＣＥＡ試料液を
用いて特異結合分析を行った場合のＳＥＣＭ像を図１４
に示した。さらに、ＳＥＣＭにおける還元電流と試料液
中のＣＥＡ濃度との関係を図１５に示した。
【０１１６】この結果、試料液が点着された部分での
み、標識酵素ＨＲＰに起因するＳＥＣＭ像が観測された
（図１４）。さらに、試料液中のＣＥＡ濃度に対応した
還元電流強度変化が得られた（図１５）。しかし、図１
４に示したように、各ＣＥＡ濃度のＳＥＣＭ像の径が異
なり、また各像が完全には分離されていなかった。これ
は、比較例では、検出部である微小プローブ電極が同一
平面上の全ての標識酵素活性を検出してしまうため、分
析部の位置及び境界が不鮮明となり、キャピラリーでの
試料点着部の面積の誤差の影響などが現れるためと考え
られる。したがって、比較例の基板では分析精度を高め
られないことがわかる。
【０１１７】以上により、凸状分析部を有する実施例の
特異結合基板を用いると、凸状分析部をもたない比較例
の特異結合基板に比して、より精度の高い分析を容易に
行えること、特に隣接する凸状分析部で異なる抗体を同
時に分析する多項目同時分析を高精度で行えることがわ
かる。また、実施例の特異結合基板は、基板上の微小領
域に微量の抗体を不溶化させることにより作製できるの
で、分析に使用する抗体量を減少させられることがわか
る。
【０１１８】
【発明の効果】本発明の分析方法によれば、基板の分析
部上で分析対象物と、その分析対象物に直接的又は間接
的に反応する反応物質とを反応させ、この反応に由来し
て発生する信号を検出することにより分析対象物の定性
又は定量分析を行うに当たり、分析部上に担持されてい
る物質に由来する信号が、非分析部に担持されている物
質に由来する信号に比して強く検出されるので、試料中
の分析対象物の高精度な分析が可能となる。
【０１１９】また、簡素な装置構成で精密分析を行うこ
とが可能となり、さらに微量の試料で多試料同時分析あ
るいは多項目同時分析を行うことも可能なる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の分析方法の一態様の説明図である。
【図２】本発明の分析方法の他の態様の説明図である。
【図３】本発明の分析方法の他の態様の説明図である。
【図４】実施例で使用した基板の上面図（同図（ａ））
及び断面図（同図（ｂ））である。
【図５】実施例の分析方法の説明図である。
【図６】基板のＳＥＣＭ像を表した図である。
【図７】実施例で使用した特異結合基板の断面図であ
る。
【図８】特異結合基板を用いてｈＰＬ試料液を分析した
場合のＳＥＣＭ像を表した図（同図（ａ））及びその電
流プロファイル（同図（ｂ））である。
【図９】特異結合基板を用いてｈＣＧ試料液を分析した
場合のＳＥＣＭ像を表した図（同図（ａ））及びその電
流プロファイル（同図（ｂ））である。
【図１０】特異結合基板を用いてｈＰＬ試料液を分析し
た場合の試料液中のｈＰＬ濃度と還元電流値との関係図
である。
【図１１】特異結合基板を用いてｈＣＧ試料液を分析し
た場合の試料液中のｈＣＧ濃度と還元電流値との関係図
である。
【図１２】特異結合基板を用いてＡＦＰ試料液を分析し
た場合のＳＥＣＭ像を表した図である。
【図１３】ＣＥＡ濃度とＳＥＣＭ還元電流との関係図で
ある。
【図１４】平坦な基板を用いた比較例のＳＥＣＭ像を表
した図である。
【図１５】平坦な基板を用いた比較例におけるＣＥＡ濃
度とＳＥＣＭ還元電流との関係図である。
【符号の説明】
１ 基板 １ａ 分析部 １ｂ 非分析部 ２ 信号検出電極部 ３ 分析対象物 ４ｘ 信号発生関与部（対向部） ４ｙ 信号検出電極部（対向部） ４ｚ 対向部 ６ 分析試薬成分 ８ 抗ｈＣＧ抗体 ９ 抗ｈＰＬ抗体 １０ 分析用基板 １０ａ 特異結合基板
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｇ０１Ｎ 37/00 Ａ 27/416 27/30 ３５７ // Ｇ０１Ｎ 37/00 27/46 ３３６Ｂ

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 基板の分析部上で、分析対象物と、該分
    析対象物と直接的又は間接的に反応する反応物質とを反
    応させ、この反応に由来して発生する信号を検出する分
    析方法であって、少なくとも信号検出段階において、基
    板に対向する位置としての対向部に、前記信号の発生に
    関与する信号発生関与部及び前記信号の検出器の少なく
    とも一方を設け、基板の分析部と対向部との距離が、基
    板の非分析部と対向部との距離に比して短くなるよう
    に、基板及び対向部の少なくとも一方に凹凸を形成し、
    基板の分析部上での前記反応に由来する信号が基板の非
    分析部上での反応に由来する信号に比して強い信号強度
    で検出されるようにしたことを特徴とする分析方法。
  2. 【請求項２】 基板の分析部上に、分析対象物と直接的
    又は間接的に反応する反応物質を担持させ、分析対象物
    の定量又は定性分析を行う試料を基板の分析部上に導入
    し、前記反応物質と反応させる請求項１記載の分析方
    法。
  3. 【請求項３】 分析対象物と直接的又は間接的に反応す
    る反応物質が、特異結合物質である請求項１又は２記載
    の分析方法。
  4. 【請求項４】 対向部が、検出器と、前記信号の発生に
    関与する信号発生関与物質の供給を制御する信号発生関
    与部とからなる請求項１〜３のいずれかに記載の分析方
    法。
  5. 【請求項５】 対向部が、検出器と、前記信号の発生に
    関与するエネルギーの供給を制御する信号発生関与部と
    からなる請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。
  6. 【請求項６】 信号発生関与部が、該信号発生関与部の
    表面近傍に光エネルギーを供給する請求項５記載の分析
    方法。
  7. 【請求項７】 信号発生関与部が、該信号発生関与部の
    表面近傍に熱エネルギーを供給する請求項５記載の分析
    方法。
  8. 【請求項８】 検出器が光検出器からなり、光検出器が
    前記反応に由来して発生する蛍光、化学発光又は生物発
    光を検出する請求項１〜７のいずれかに記載の分析方
    法。
  9. 【請求項９】 検出器が電極板又はプローブ電極からな
    り、電極板又はプローブ電極が前記反応に由来して発生
    する電流又は電位を検出する請求項１〜７のいずれかに
    記載の分析方法。
  10. 【請求項１０】 プローブ電極を、基板表面を走査させ
    て信号を検出する請求項９記載の分析方法。
  11. 【請求項１１】 基板の分析部上への反応物質の担持操
    作、分析対象物の定量又は定性分析を行う試料の導入操
    作、前記反応に関与する物質の導入操作、基板上の洗浄
    操作及び基板上に結合していない物質の除去操作の少な
    くとも１つを、基板表面上を走査する分注手段又は吸引
    手段によって行う請求項１〜１０のいずれかに記載の分
    析方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれかに記載の分
    析方法に使用する基板であって、表面に複数の凸状分析
    部が形成されていることを特徴とする分析用基板。
  13. 【請求項１３】 凸状分析部の周囲に凹状領域が非分析
    部として形成されている請求項１２記載の分析用基板。
  14. 【請求項１４】 凸状分析部に、特異結合物質が担持さ
    れている請求項１２又は１３記載の分析用基板。
  15. 【請求項１５】 凸状分析部に酸化還元酵素が担持され
    ている請求項１２〜１４のいずれかに記載の分析用基
    板。
  16. 【請求項１６】 各凸状分析部の非分析部からの高さが
    ０．１μｍ〜１ｍｍであり、隣接する凸状分析部の間隔
    が２μｍ〜２０ｍｍである請求項１２〜１５のいずれか
    に記載の分析用基板。
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