JP2694809B2 - 酵素免疫測定方法及び酵素免疫センサ - Google Patents
酵素免疫測定方法及び酵素免疫センサInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料溶液中に微量に含
まれる物質の濃度を測定する方法に関し、特に酵素免疫
測定方法及び酵素免疫センサに関する。
まれる物質の濃度を測定する方法に関し、特に酵素免疫
測定方法及び酵素免疫センサに関する。
【０００２】
【従来の技術】抗原と抗体の特異的な反応を利用した微
量成分の測定方法として免疫測定法が知られている。免
疫測定法の中には酵素標識した抗原もしくは抗体を用い
る方法があり、酵素免疫測定法と呼ばれている。酵素免
疫測定法には競争法と非競争法（サンドイッチ法）があ
るが原理を以下に示す。
量成分の測定方法として免疫測定法が知られている。免
疫測定法の中には酵素標識した抗原もしくは抗体を用い
る方法があり、酵素免疫測定法と呼ばれている。酵素免
疫測定法には競争法と非競争法（サンドイッチ法）があ
るが原理を以下に示す。
【０００３】競争反応法ではまず試料（測定対象抗原を
含む）に、測定対象と同じ抗原に標識として酵素をあら
かじめつけた一定量の酵素標識抗原を添加し、両者の抗
原と一定量の抗体とを反応させる。次に適当な方法によ
り抗原抗体複合体を未反応な抗原あるいは抗体から分離
する。最後に抗原抗体複合体中の標識酵素の活性を測定
することにより、測定対象抗原の濃度を求める。
含む）に、測定対象と同じ抗原に標識として酵素をあら
かじめつけた一定量の酵素標識抗原を添加し、両者の抗
原と一定量の抗体とを反応させる。次に適当な方法によ
り抗原抗体複合体を未反応な抗原あるいは抗体から分離
する。最後に抗原抗体複合体中の標識酵素の活性を測定
することにより、測定対象抗原の濃度を求める。
【０００４】非競争反応法では２段階の抗原抗体反応が
行われる。まず測定対象抗原と第１次抗体を反応させ
る。続いて次に酵素標識された第２次抗体を反応させ
る。その後、未反応物質を除去する。最後に免疫複合体
の標識酵素の活性を定量し測定対象抗原の濃度を求め
る。
行われる。まず測定対象抗原と第１次抗体を反応させ
る。続いて次に酵素標識された第２次抗体を反応させ
る。その後、未反応物質を除去する。最後に免疫複合体
の標識酵素の活性を定量し測定対象抗原の濃度を求め
る。
【０００５】このように酵素免疫測定法は酵素活性の測
定に基づくため、他の方法（例えばラジオアイソトー
プ）に比べて使用が簡単でありかつ感度が高く、臨床検
査などの分野で広く応用されている。
定に基づくため、他の方法（例えばラジオアイソトー
プ）に比べて使用が簡単でありかつ感度が高く、臨床検
査などの分野で広く応用されている。
【０００６】酵素免疫測定法において酵素活性の測定が
重要であるが、従来は酵素の作用を受ける基質や生成物
の吸光度、蛍光強度の測定及びｐＨ、酸素濃度を測定す
ることにより、酵素活性の測定が行われてきた。これら
の方法に基づく装置は大型であり、また測定に必要な試
料の量も少なくはなかった。このため特開昭６４−５９
０５７号公報及び特開昭６４−５９０５８号公報に、微
量試料が測定可能かつ小型の酵素免疫測定法及びセンサ
が提案されている。さらに詳しく従来技術を明らかにす
るために、図を用いて具体的に説明する。図３は特開昭
６４−５９０５７号公報に示された測定方法が競争反応
である場合を模式的に示している。溶液のｐＨ変化を検
知するｐＨセンサ１上に抗体２が固定化されている
（１）。このセンサ１を酵素ウレアーゼ標識抗原４を一
定量添加した試料（測定対象抗原３を含む）と反応させ
る（２）。次にセンサ１を洗浄し試料を除くと抗体２に
は標識抗原４と測定対象抗原３が試料に含まれていたと
きの濃度比に対応して結合している（３）。次にセンサ
１を酵素ウレアーゼの基質である尿素５を含む溶液に浸
すと、酵素ウレアーゼによりアンモニア６が生成する
（４）。アンモニアによるｐＨ変化をｐＨセンサにより
測定することにより、測定対象抗原濃度を決定すること
が可能となる。このように微小なｐＨセンサ上に抗体を
固定化することにより、微量試料が測定可能で、かつ小
型の酵素免疫センサが実現している。しかしセンサを洗
浄したり基質を含む溶液と交換したりする操作を必要と
している。
重要であるが、従来は酵素の作用を受ける基質や生成物
の吸光度、蛍光強度の測定及びｐＨ、酸素濃度を測定す
ることにより、酵素活性の測定が行われてきた。これら
の方法に基づく装置は大型であり、また測定に必要な試
料の量も少なくはなかった。このため特開昭６４−５９
０５７号公報及び特開昭６４−５９０５８号公報に、微
量試料が測定可能かつ小型の酵素免疫測定法及びセンサ
が提案されている。さらに詳しく従来技術を明らかにす
るために、図を用いて具体的に説明する。図３は特開昭
６４−５９０５７号公報に示された測定方法が競争反応
である場合を模式的に示している。溶液のｐＨ変化を検
知するｐＨセンサ１上に抗体２が固定化されている
（１）。このセンサ１を酵素ウレアーゼ標識抗原４を一
定量添加した試料（測定対象抗原３を含む）と反応させ
る（２）。次にセンサ１を洗浄し試料を除くと抗体２に
は標識抗原４と測定対象抗原３が試料に含まれていたと
きの濃度比に対応して結合している（３）。次にセンサ
１を酵素ウレアーゼの基質である尿素５を含む溶液に浸
すと、酵素ウレアーゼによりアンモニア６が生成する
（４）。アンモニアによるｐＨ変化をｐＨセンサにより
測定することにより、測定対象抗原濃度を決定すること
が可能となる。このように微小なｐＨセンサ上に抗体を
固定化することにより、微量試料が測定可能で、かつ小
型の酵素免疫センサが実現している。しかしセンサを洗
浄したり基質を含む溶液と交換したりする操作を必要と
している。
【０００７】図４は特開昭６４−５９０５８号公報に示
された免疫センサの概略断面図である。基板１６上にｎ
型シリコン９及びｐ型シリコン１０、ゲート酸化膜１
１、窒化シリコン膜１２からなるｐＨ感受性半導体セン
サが２個形成されている。また疑似参照電極１３が基板
１６上に形成されている。一方のｐＨ感受性半導体セン
サのｐＨ感受部上に抗体２が固定化されている。他方の
ｐＨ感受部及び疑似参照電極１３上にはタンパク質架橋
膜１４が形成されている。このセンサ基板１６と微小な
間隙を保持して平板１５が対向して配置されている。平
板１５上にはウレアーゼ標識抗原４が塗布されている。
このセンサによる抗原の測定方法は前記特開昭６４−５
９０５７号公報のものとほぼ同様である。まずセンサを
試料に浸すと一定量の試料が毛細管現象により基板１６
と平板１５の間の空間に吸い上げられる。このときウレ
アーゼ標識抗原４が試料中に溶解し、試料中の測定対象
抗原と競合して抗体２と結合する。次にセンサを洗浄
し、尿素を含む溶液に浸して酵素反応を行わせる。この
ときの酵素（ウレアーゼ）と基質（尿素）の反応により
生成されるアンモニアによるｐＨ変化を、抗体２が固定
化されたｐＨ感受性反応センサで測定する。あらかじめ
酵素、抗原濃度が既知の酵素標識抗原が塗布された平板
１５を設けることにより、試料の定量が不要となった
が、この酵素免疫センサにおいても前記特開昭６４−５
９０５７号公報と同様にセンサの洗浄及び尿素溶液との
交換操作が必要である。
された免疫センサの概略断面図である。基板１６上にｎ
型シリコン９及びｐ型シリコン１０、ゲート酸化膜１
１、窒化シリコン膜１２からなるｐＨ感受性半導体セン
サが２個形成されている。また疑似参照電極１３が基板
１６上に形成されている。一方のｐＨ感受性半導体セン
サのｐＨ感受部上に抗体２が固定化されている。他方の
ｐＨ感受部及び疑似参照電極１３上にはタンパク質架橋
膜１４が形成されている。このセンサ基板１６と微小な
間隙を保持して平板１５が対向して配置されている。平
板１５上にはウレアーゼ標識抗原４が塗布されている。
このセンサによる抗原の測定方法は前記特開昭６４−５
９０５７号公報のものとほぼ同様である。まずセンサを
試料に浸すと一定量の試料が毛細管現象により基板１６
と平板１５の間の空間に吸い上げられる。このときウレ
アーゼ標識抗原４が試料中に溶解し、試料中の測定対象
抗原と競合して抗体２と結合する。次にセンサを洗浄
し、尿素を含む溶液に浸して酵素反応を行わせる。この
ときの酵素（ウレアーゼ）と基質（尿素）の反応により
生成されるアンモニアによるｐＨ変化を、抗体２が固定
化されたｐＨ感受性反応センサで測定する。あらかじめ
酵素、抗原濃度が既知の酵素標識抗原が塗布された平板
１５を設けることにより、試料の定量が不要となった
が、この酵素免疫センサにおいても前記特開昭６４−５
９０５７号公報と同様にセンサの洗浄及び尿素溶液との
交換操作が必要である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上述したように従来の
酵素免疫センサにおいては、センサを洗浄する操作及び
酵素の基質溶液を添加する操作が必要であった。このた
め使用者自身が煩わしいばかりでなく、誤差を生じると
いう問題があった。
酵素免疫センサにおいては、センサを洗浄する操作及び
酵素の基質溶液を添加する操作が必要であった。このた
め使用者自身が煩わしいばかりでなく、誤差を生じると
いう問題があった。
【０００９】従って本発明の目的は、使用者がセンサを
試料に浸す以外の操作を必要としない、酵素免疫測定方
法及び酵素免疫センサを提供することである。
試料に浸す以外の操作を必要としない、酵素免疫測定方
法及び酵素免疫センサを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明の酵素免疫測定方法では、ｐＨ緩衝物質及び
酵素基質を酵素標識抗原と共に試料中に溶解させること
により、上記目的を達成している。
め、本発明の酵素免疫測定方法では、ｐＨ緩衝物質及び
酵素基質を酵素標識抗原と共に試料中に溶解させること
により、上記目的を達成している。
【００１１】本発明の第１の発明は、測定対象である抗
原を含む試料に、基質を酸もしくは塩基性物質に変換す
る酵素が前記抗原にあらかじめ標識された酵素標識抗原
と、前記酵素の基質と、ｐＨ緩衝物質を添加し、前記添
加された試料に、抗原に対して特異的に反応する抗体が
ｐＨセンシング部上に固定化されたｐＨセンサを浸し、
前記添加されたｐＨ緩衝物質の作用により、前記ｐＨセ
ンシング部上に固定化された前記抗体と抗原−抗体反応
によって結合しなかった酵素標識抗原の酵素によるｐＨ
変化は打ち消され、ｐＨセンシング部上に固定化された
前記抗体と抗原−抗体反応によって結合した酵素標識抗
原の酵素によるｐＨ変化を検知することによって、抗原
と抗体の反応工程と酵素と基質の反応工程を同時に行
い、試料中の抗原濃度を測定することを特徴とする酵素
免疫測定方法である。
原を含む試料に、基質を酸もしくは塩基性物質に変換す
る酵素が前記抗原にあらかじめ標識された酵素標識抗原
と、前記酵素の基質と、ｐＨ緩衝物質を添加し、前記添
加された試料に、抗原に対して特異的に反応する抗体が
ｐＨセンシング部上に固定化されたｐＨセンサを浸し、
前記添加されたｐＨ緩衝物質の作用により、前記ｐＨセ
ンシング部上に固定化された前記抗体と抗原−抗体反応
によって結合しなかった酵素標識抗原の酵素によるｐＨ
変化は打ち消され、ｐＨセンシング部上に固定化された
前記抗体と抗原−抗体反応によって結合した酵素標識抗
原の酵素によるｐＨ変化を検知することによって、抗原
と抗体の反応工程と酵素と基質の反応工程を同時に行
い、試料中の抗原濃度を測定することを特徴とする酵素
免疫測定方法である。
【００１２】第２の発明は、測定対象である抗原に対し
て特異的に反応する抗体がｐＨセンシング部上に固定化
されたｐＨセンサと、基質を酸もしくは塩基性物質に変
換する酵素が前記抗原にあらかじめ標識された酵素標識
抗原と、前記酵素の基質と、ｐＨ緩衝物質が、試料に接
したときに溶解するように板面に塗布され、その塗布面
が微小な間隔を保持してｐＨセンシング部面に対向して
設置された平板とから構成され、塗布されたｐＨ緩衝物
質の作用により、前記ｐＨセンシング部上に固定化され
た前記抗体と抗原−抗体反応によって結合しなかった酵
素標識抗原の酵素によるｐＨ変化は打ち消され、ｐＨセ
ンシング部上に固定化された前記抗体と抗原−抗体反応
によって結合した酵素標識抗原の酵素によるｐＨ変化を
検知することによって、抗原と抗体の反応工程と酵素と
基質の反応工程を同時に行い、試料中の抗原濃度を測定
することを特徴とする酵素免疫センサである。
て特異的に反応する抗体がｐＨセンシング部上に固定化
されたｐＨセンサと、基質を酸もしくは塩基性物質に変
換する酵素が前記抗原にあらかじめ標識された酵素標識
抗原と、前記酵素の基質と、ｐＨ緩衝物質が、試料に接
したときに溶解するように板面に塗布され、その塗布面
が微小な間隔を保持してｐＨセンシング部面に対向して
設置された平板とから構成され、塗布されたｐＨ緩衝物
質の作用により、前記ｐＨセンシング部上に固定化され
た前記抗体と抗原−抗体反応によって結合しなかった酵
素標識抗原の酵素によるｐＨ変化は打ち消され、ｐＨセ
ンシング部上に固定化された前記抗体と抗原−抗体反応
によって結合した酵素標識抗原の酵素によるｐＨ変化を
検知することによって、抗原と抗体の反応工程と酵素と
基質の反応工程を同時に行い、試料中の抗原濃度を測定
することを特徴とする酵素免疫センサである。
【００１３】
【実施例】本発明の一実施例について図面を参照して説
明する。図１は本発明の一実施例であるｐＨセンサを使
用した酵素免疫測定方法を示す図である。酵素としてウ
レアーゼを用いた場合を示す。ｐＨセンサのｐＨ感受部
１上に抗体２が固定化されている。試料中の測定対象抗
原３及び添加されたウレアーゼ標識抗原４が競合して、
添加混合された時の測定対象抗原３とウレアーゼ標識抗
原４の濃度比に応じて抗体２に結合する。標識酵素ウレ
アーゼは抗体２と結合するしないに関わらず、添加され
た基質（尿素）５をその酵素の働きにより塩基性の生成
物（アンモニア）６に変換する。抗体と結合していない
ウレアーゼ標識抗原７のウレアーゼによって生成した生
成物６（アンモニア）は、試料中のｐＨ緩衝物質８の作
用により消費されるため、ｐＨセンサ表面１のｐＨ変化
に寄与することはできない。一方、抗体２に結合したウ
レアーゼ標識抗原４のウレアーゼによって生成した生成
物６（アンモニア）は、ｐＨセンサ表面１近傍に位置し
かつ固定化された抗体２が制限透過膜の作用を示してｐ
Ｈ緩衝物質８の透過を妨げているため、ｐＨ緩衝を受け
ずにすみ、ｐＨセンサ表面１のｐＨを変化させる。よっ
て、抗体２と結合したウレアーゼ標識抗原のみを、ｐＨ
変化から測定することができるため、その値から測定対
象抗原３の濃度を求めることができる。
明する。図１は本発明の一実施例であるｐＨセンサを使
用した酵素免疫測定方法を示す図である。酵素としてウ
レアーゼを用いた場合を示す。ｐＨセンサのｐＨ感受部
１上に抗体２が固定化されている。試料中の測定対象抗
原３及び添加されたウレアーゼ標識抗原４が競合して、
添加混合された時の測定対象抗原３とウレアーゼ標識抗
原４の濃度比に応じて抗体２に結合する。標識酵素ウレ
アーゼは抗体２と結合するしないに関わらず、添加され
た基質（尿素）５をその酵素の働きにより塩基性の生成
物（アンモニア）６に変換する。抗体と結合していない
ウレアーゼ標識抗原７のウレアーゼによって生成した生
成物６（アンモニア）は、試料中のｐＨ緩衝物質８の作
用により消費されるため、ｐＨセンサ表面１のｐＨ変化
に寄与することはできない。一方、抗体２に結合したウ
レアーゼ標識抗原４のウレアーゼによって生成した生成
物６（アンモニア）は、ｐＨセンサ表面１近傍に位置し
かつ固定化された抗体２が制限透過膜の作用を示してｐ
Ｈ緩衝物質８の透過を妨げているため、ｐＨ緩衝を受け
ずにすみ、ｐＨセンサ表面１のｐＨを変化させる。よっ
て、抗体２と結合したウレアーゼ標識抗原のみを、ｐＨ
変化から測定することができるため、その値から測定対
象抗原３の濃度を求めることができる。
【００１４】さらに本発明の一実施例である酵素免疫セ
ンサの構造（断面図）について図２に示す。
ンサの構造（断面図）について図２に示す。
【００１５】基板上にｎ型シリコン９（ソース及びドレ
イン）及びｐ型シリコン１０（チャンネル）、ゲート酸
化膜１１、窒化シリコン膜１２からなるｐＨ感受性半導
体センサが計２個基板１６上に形成されている。また疑
似参照電極１３が基板１６上に形成されている。一方の
ｐＨ感受性半導体センサのｐＨ感受部上には抗体２が固
定化されている。他方のｐＨ感受性半導体センサのｐＨ
感受部及び疑似参照電極上にはタンパク質架橋膜１４が
形成されている。このセンサ基板と微小な間隙を保持し
て平板１５が対向している。平板１５上にはウレアーゼ
標識抗原４、基質（尿素）５、ｐＨ緩衝物質８が塗布さ
れている。ｐＨ感受性半導体センサの動作方法は、ソー
スとドレイン間に一定の電圧を印加し一定の電流が流れ
るようにソースと疑似参照電極１３間の電圧を変化させ
る。この電圧値が溶液のｐＨ値と比例関係があることか
ら溶液のｐＨを検知することができる。実際には試料に
よるバックグラウンドの出力の影響を除くため、抗体の
固定化されたｐＨセンサの出力から抗体の固定化されて
いないｐＨセンサの出力を差し引いた値を応答とする。
イン）及びｐ型シリコン１０（チャンネル）、ゲート酸
化膜１１、窒化シリコン膜１２からなるｐＨ感受性半導
体センサが計２個基板１６上に形成されている。また疑
似参照電極１３が基板１６上に形成されている。一方の
ｐＨ感受性半導体センサのｐＨ感受部上には抗体２が固
定化されている。他方のｐＨ感受性半導体センサのｐＨ
感受部及び疑似参照電極上にはタンパク質架橋膜１４が
形成されている。このセンサ基板と微小な間隙を保持し
て平板１５が対向している。平板１５上にはウレアーゼ
標識抗原４、基質（尿素）５、ｐＨ緩衝物質８が塗布さ
れている。ｐＨ感受性半導体センサの動作方法は、ソー
スとドレイン間に一定の電圧を印加し一定の電流が流れ
るようにソースと疑似参照電極１３間の電圧を変化させ
る。この電圧値が溶液のｐＨ値と比例関係があることか
ら溶液のｐＨを検知することができる。実際には試料に
よるバックグラウンドの出力の影響を除くため、抗体の
固定化されたｐＨセンサの出力から抗体の固定化されて
いないｐＨセンサの出力を差し引いた値を応答とする。
【００１６】酵素免疫センサによる酵素免疫測定方法は
次の通りである。まずセンサを試料に浸すと一定量の試
料が毛細管現象により基板１６と平板１５の間の空隙に
吸い上げられる。このとき平板１５上のウレアーゼ標識
抗原４、基質５、ｐＨ緩衝物質８が試料中に溶解する。
ウレアーゼ標識抗原４は試料中の測定対象抗原と競合し
て抗体２と結合する。抗体２に結合したウレアーゼ標識
抗原４のウレアーゼは、ｐＨ感受部近傍に位置しかつ固
定化された抗体２が制限透過膜のように作用しｐＨ緩衝
物質８の透過を妨げるため、基質５との酵素活性により
生成物（アンモニア）を生成し、これによりｐＨ感受部
表面のｐＨが変化する。一方、抗体２と結合していない
ウレアーゼ標識抗原４のウレアーゼによって生成した生
成物は、試料中のｐＨ緩衝物質８の作用により消費され
るためｐＨ感受部のｐＨ変化に寄与することはできな
い。従って抗体２と結合したウレアーゼ標識抗原４のみ
をｐＨ変化として検知することができるため、その値か
ら測定対象抗原の濃度を求めることが可能となる。
次の通りである。まずセンサを試料に浸すと一定量の試
料が毛細管現象により基板１６と平板１５の間の空隙に
吸い上げられる。このとき平板１５上のウレアーゼ標識
抗原４、基質５、ｐＨ緩衝物質８が試料中に溶解する。
ウレアーゼ標識抗原４は試料中の測定対象抗原と競合し
て抗体２と結合する。抗体２に結合したウレアーゼ標識
抗原４のウレアーゼは、ｐＨ感受部近傍に位置しかつ固
定化された抗体２が制限透過膜のように作用しｐＨ緩衝
物質８の透過を妨げるため、基質５との酵素活性により
生成物（アンモニア）を生成し、これによりｐＨ感受部
表面のｐＨが変化する。一方、抗体２と結合していない
ウレアーゼ標識抗原４のウレアーゼによって生成した生
成物は、試料中のｐＨ緩衝物質８の作用により消費され
るためｐＨ感受部のｐＨ変化に寄与することはできな
い。従って抗体２と結合したウレアーゼ標識抗原４のみ
をｐＨ変化として検知することができるため、その値か
ら測定対象抗原の濃度を求めることが可能となる。
【００１７】次に実際に本発明による酵素免疫センサを
使用して、試料中のヒトイムノグログリンＧ（以下、ヒ
トＩｇＧと略す）抗原の濃度を測定した結果について説
明する。酵素免疫センサは以下のようにして作成した。
まず、一方の感受性半導体センサのｐＨ感受部上に１５
％ウシ血清アルブミンと１％グルタルアルデヒドの混合
溶液をスピン塗布してタンパク質架橋膜を形成した。次
に１０％抗ヒトＩｇＧ抗体を含む１５％ウシ血清アルブ
ミン、１％グルタルアルデヒド混合液をスピン塗布する
ことにより、抗体をｐＨ感受部上に固定化した。また平
板上に１％ウレアーゼ（酵素）標識ヒトＩｇＧ抗原溶液
４μｌ、０．５％ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ緩衝液４μ
ｌ、０．１％尿素（基質）４μｌを個別に塗布して付着
させ、平板を０．１mmの間隔でｐＨセンサ基板に対向さ
せて配置し装着した。約２μｌの血清試料をｐＨセンサ
基板と平板の間に吸引させて５分間応答出力を測定し
た。その結果得られたセンサ応答出力と試料中のヒトＩ
ｇＧ濃度の関係を示したのが図５である。本発明による
センサの応答出力は従来型センサに比べてやや小さい
が、ほぼ同等の測定可能範囲を示した。
使用して、試料中のヒトイムノグログリンＧ（以下、ヒ
トＩｇＧと略す）抗原の濃度を測定した結果について説
明する。酵素免疫センサは以下のようにして作成した。
まず、一方の感受性半導体センサのｐＨ感受部上に１５
％ウシ血清アルブミンと１％グルタルアルデヒドの混合
溶液をスピン塗布してタンパク質架橋膜を形成した。次
に１０％抗ヒトＩｇＧ抗体を含む１５％ウシ血清アルブ
ミン、１％グルタルアルデヒド混合液をスピン塗布する
ことにより、抗体をｐＨ感受部上に固定化した。また平
板上に１％ウレアーゼ（酵素）標識ヒトＩｇＧ抗原溶液
４μｌ、０．５％ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨｐＨ緩衝液４μ
ｌ、０．１％尿素（基質）４μｌを個別に塗布して付着
させ、平板を０．１mmの間隔でｐＨセンサ基板に対向さ
せて配置し装着した。約２μｌの血清試料をｐＨセンサ
基板と平板の間に吸引させて５分間応答出力を測定し
た。その結果得られたセンサ応答出力と試料中のヒトＩ
ｇＧ濃度の関係を示したのが図５である。本発明による
センサの応答出力は従来型センサに比べてやや小さい
が、ほぼ同等の測定可能範囲を示した。
【００１８】以上本実施例では測定対象抗原としてヒト
ＩｇＧを例にして説明したが、他の抗原についても対応
する抗体を使用することにより、全く同様にして本発明
の酵素免疫センサにより測定することが可能である。例
えば免疫グロブリンや酵素のようなタンパク質、ヒト絨
毛性ゴナドトロピンやα−フェトプロテインのようなペ
プチド、ジコキシンやテオフェリンのような薬物、肝炎
などのウイルス、アトラジンやトリアジンなどの農薬に
ついて対応する抗体をｐＨセンシング部上に作成すれば
本発明による測定が適用できる。また、測定に使用する
酵素についても、基質を酸もしくは塩基性物質に変換す
るものであればよい。
ＩｇＧを例にして説明したが、他の抗原についても対応
する抗体を使用することにより、全く同様にして本発明
の酵素免疫センサにより測定することが可能である。例
えば免疫グロブリンや酵素のようなタンパク質、ヒト絨
毛性ゴナドトロピンやα−フェトプロテインのようなペ
プチド、ジコキシンやテオフェリンのような薬物、肝炎
などのウイルス、アトラジンやトリアジンなどの農薬に
ついて対応する抗体をｐＨセンシング部上に作成すれば
本発明による測定が適用できる。また、測定に使用する
酵素についても、基質を酸もしくは塩基性物質に変換す
るものであればよい。
【００１９】以上本実施例では競争反応法に基づく例を
説明したが、非競争反応法においても全く同様にして本
発明の方法により測定が可能である。すなわちｐＨセン
サ表面に第１次抗体を固定化し、ウレアーゼ標識抗原の
代わりにウレアーゼ標識第２次抗体を用いることにより
適用することができる。
説明したが、非競争反応法においても全く同様にして本
発明の方法により測定が可能である。すなわちｐＨセン
サ表面に第１次抗体を固定化し、ウレアーゼ標識抗原の
代わりにウレアーゼ標識第２次抗体を用いることにより
適用することができる。
【００２０】
【発明の効果】以上説明したように、本発明による酵素
免疫センサ及びその測定方法は、酵素標識抗原と共に基
質及びｐＨ緩衝物質を試料中に溶解させることにより、
センサを試料に浸す以外に測定時に洗浄や試薬の添加と
いった操作を一切必要とせずに測定することができ、操
作が簡便であるという効果がある。
免疫センサ及びその測定方法は、酵素標識抗原と共に基
質及びｐＨ緩衝物質を試料中に溶解させることにより、
センサを試料に浸す以外に測定時に洗浄や試薬の添加と
いった操作を一切必要とせずに測定することができ、操
作が簡便であるという効果がある。
【図１】本発明による酵素免疫センサの測定方法を示す
説明図である。
説明図である。
【図２】本発明による酵素免疫センサの断面を示す概略
図である。
図である。
【図３】従来の酵素免疫センサの測定方法を示す説明図
である。
である。
【図４】従来の酵素免疫センサの断面を示す概略図であ
る。
る。
【図５】本発明による酵素免疫センサと従来のセンサに
よるヒトイムノグログリンＧを測定した結果を示した図
である。
よるヒトイムノグログリンＧを測定した結果を示した図
である。
１ ｐＨセンサ ２ 抗体 ３ 測定対象抗原 ４ 酵素（ウレアーゼ）標識抗原 ５ 基質（尿素） ６ 生成物（アンモニア） ７ 抗体と結合しなかった酵素（ウレアーゼ）標識抗原 ８ ｐＨ緩衝物質 ９ ｎ型シリコン １０ ｐ型シリコン １１ ゲート酸化膜 １２ 窒化シリコン膜 １３ 疑似参照電極 １４ タンパク質架橋膜 １５ 平板 １６ 基板
Claims (2)
- 【請求項１】 測定対象である抗原を含む試料に、基質
を酸もしくは塩基性物質に変換する酵素が前記抗原にあ
らかじめ標識された酵素標識抗原と、前記酵素の基質
と、ｐＨ緩衝物質を添加し、 前記添加された試料に、前記抗原に対して特異的に反応
する抗体がｐＨセンシング部上に固定化されたｐＨセン
サを浸し、前記添加されたｐＨ緩衝物質の作用により、前記ｐＨセ
ンシング部上に固定化された前記抗体と抗原−抗体反応
によって結合しなかった前記酵素標識抗原の酵素による
ｐＨ変化は打ち消され、 前記ｐＨセンシング部上に固定
化された前記抗体と抗原−抗体反応によって結合した前
記酵素標識抗原の酵素によるｐＨ変化を検知することに
よって、抗原と抗体の反応工程と酵素と基質の反応工程
を同時に行い、前記試料中の抗原濃度を測定することを
特徴とする酵素免疫測定方法。 - 【請求項２】 測定対象である抗原に対して特異的に反
応する抗体がｐＨセンシング部上に固定化されたｐＨセ
ンサと、 基質を酸もしくは塩基性物質に変換する酵素が前記抗原
にあらかじめ標識された酵素標識抗原と、前記酵素の基
質と、ｐＨ緩衝物質が、試料に接したときに溶解するよ
うに板面に塗布され、塗布面が微小な間隔を保持して前
記ｐＨセンシング部面に対向して設置された平板とから
構成され、 前記塗布されたｐＨ緩衝物質の作用により、前記ｐＨセ
ンシング部上に固定化された前記抗体と抗原−抗体反応
によって結合しなかった前記酵素標識抗原の酵素による
ｐＨ変化は打ち消され、前記ｐＨセンシング部上に固定
化された前記抗体と抗原−抗体反応によって結合した前
記酵素標識抗原の酵素によるｐＨ変化を検知することに
よって、抗原と抗体の反応工程と酵素と基質の反応工程
を同時に行い、試料中の抗原濃度を測定することを特徴
とする酵素免疫センサ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6309365A JP2694809B2 (ja) | 1994-12-14 | 1994-12-14 | 酵素免疫測定方法及び酵素免疫センサ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6309365A JP2694809B2 (ja) | 1994-12-14 | 1994-12-14 | 酵素免疫測定方法及び酵素免疫センサ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08166388A JPH08166388A (ja) | 1996-06-25 |
| JP2694809B2 true JP2694809B2 (ja) | 1997-12-24 |
Family
ID=17992130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6309365A Expired - Fee Related JP2694809B2 (ja) | 1994-12-14 | 1994-12-14 | 酵素免疫測定方法及び酵素免疫センサ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2694809B2 (ja) |
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Family Cites Families (4)
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| JPS6459058A (en) * | 1987-08-31 | 1989-03-06 | Nec Corp | Enzyme immune sensor and enzyme immunoassay using said sensor |
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| GB9018195D0 (en) * | 1990-08-18 | 1990-10-03 | Fisons Plc | Analytical device |
-
1994
- 1994-12-14 JP JP6309365A patent/JP2694809B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08166388A (ja) | 1996-06-25 |
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