JP5303448B2 - 親和性が減少した酵素の相補性レポーター系を用いた分子相互作用の検出 - Google Patents
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Description
本発明は、National Instituetes of Healthにより与えられた連邦政府の補助金番号T32 GM09412;T32 AG0259;AF051678;HD018179;AG009521;AG024987;AG020961;DAMD17−00−1−0442の下の政府の支援を受けて成された。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
米国特許法§119(e)に従って、本願は、2006年3月13日に出願された、米国仮特許出願第60/782,054号(この出願の開示は、本明細書中に参考として援用される)の出願日の優先権を主張する。
タンパク質−タンパク質相互作用などの分子相互作用は、生細胞におけるほとんど全ての細胞過程に関与する。したがって、タンパク質機能の解明は、生物学的経路の基礎をなす機構を理解するための重要なステップである。さらに、人の疾患および障害を治療するための療法の開発は、疾患または障害に関連する生物過程におけるタンパク質機能の理解に依存する。さらに、ヒトゲノム計画の完了に伴い、同定された未知の機能を有するタンパク質の数が劇的に増加した。タンパク質の機能を解明するために、タンパク質の他のタンパク質との相互作用を同定することが有用である。
分子相互作用を検出するための方法および組成物を提供する。本発明の態様は、親和性が減少した酵素相補性レポーター系の使用を含む。一定の実施形態では、親和性が減少した酵素相補性レポーター系は、親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ相補性レポーター系である。本方法の実施形態を実施するために使用される系およびキットも提供する。
本発明によれば、当業者の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、組換えDNA技術を使用することができる。かかる技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Maniatis,Fritsch & Sambrook,”Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);”DNA Cloning:A Practical Approach,” Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985);”Oligoヌクレオチド Synthesis”(M.J.Gait ed.1984);”Nucleic Acid Hybridization”(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985));”Transcription and Translation”(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984));”Animal Cell Culture”(R.I.Freshney,ed.(1986));”Immobilized Cells and Enzymes”(IRL Press,(1986));B.Perbal,”A Practical Guide To Molecular Cloning”(1984)を参照のこと。
分子相互作用を検出するための方法および組成物を提供する。本発明の態様は、親和性が減少した酵素相補性レポーター系(親和性が減少したβ−ガラクトシダーゼ相補性レポーター系など)の使用を含む。本方法の実施形態を実施するために使用される系およびキットも提供する。
上記でまとめているように、本発明の実施形態は、第1の分子と第2の分子との間の分子相互作用(例えば、タンパク質−タンパク質相互作用など)を検出する方法を提供する。そのようなものとして、本発明の実施形態は、第1の分子および第2の分子が相互に結合する(すなわち、相互作用する)かどうかを決定する方法を提供する。本方法を使用して検出することができる分子相互作用には、種々の異なる分子型が含まれ得、分子は、同一または異なる種類の分子であり得る。そのようなものとして、一定の実施形態では、目的の分子相互作用は、同一の分子型(例えば、第1の分子および第2の分子はポリペプチド(例えば、タンパク質)である)である第1の分子と第2の分子との間の相互作用である。さらに他の実施形態では、第1の分子および第2の分子は、異なる分子型(例えば、第1の分子がポリペプチドであり、第2の分子が核酸である場合)であり得る。一定の実施形態では、第1の分子および第2の分子は、ポリペプチド(例えば、タンパク質)であり、その結果、本方法は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する方法である。
配列番号1(H31R)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAARPPFASWRNSEEARTDRPSQQL
配列番号2(F34Y)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRCAAHPPYASWRNSEEARTDRPSQQL
配列番号3(E41Q)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSQEARTDRPSQQL
配列番号4(N39D)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRDSEEARTDRPSQQL
配列番号5(短縮)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRDSEEA。
MGVITDSLAVVARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATRFNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKLWSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAEACDVGFREVRIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDILLMKQNNFNAVRCSHYPNHPLWYTLCDRYGLYVVDEANIETHGMVPMNRLTDDPRWLPAMSERVTRMVQRDRNHPSVIIWSLGNESGHGANHDALYRWIKSVDPSRPVQYEGGGADTTATDIICPMYARVDEDQPFPAVPKWSIKKWLSLPGETRPLILCEYAHAMGNSLGGFAKYWQAFRQYPRLQGGFVWDWVDQSLIKYDENGNPWSAYGGDFGDTPNDRQFCMNGLVFADRTPHPALTEAKHQQQFFQFRLSGQTIEVTSEYLFRHSDNELLHWMVALDGKPLASGEVPLDVAPQGKQLIELPELPQPESAGQLWLTVRVVQPNATAWSEAGHISAWQQWRLAENLSVTLPAASHAIPHLTTSEMDFCIELGNKRWQFNRQSGFLSQMWIGDKKQLLTPLRDQFTRAPLDNDIGVSEATRIDPNAWVERWKAAGHYQAEAALLQCTADTLADAVLITTAHAWQHQGKTLFISRKTYRIDGSGQMAITVDVEVASDTPHPARIGLNCQLAQVAERVNWLGLGPQENYPDRLTAACFDRWDLPLSDMYTPYVFPSENGLRCGTRELNYGPHQWRGDFQFNISRYSQQQLMETSHRHLLHAEEGTWLNIDGFHMGIGGDDSWSPSVSAEFQLSAGRYHYQLVWCQK。
本発明の実施形態を、生細胞中で定量的または定性的に行うべき多タンパク質および他の多分子相互作用型の広範な研究で使用することができる。以下では、本発明の方法の異なる適用の非限定的な例を示す。
1つまたは複数の上記適用を実施するために使用されるキットも本発明によって提供される。一定の実施形態では、上記で概説するように、キットは、少なくとも、結合メンバーおよびレポーターサブユニットを含む1つまたは複数の融合タンパク質を構成性または誘導性に発現する細胞を含む。一定の実施形態では、上記で概説するように、キットは、かかる細胞を作製するためのエレメント(例えば、同一または異なるベクター上に存在する第1および第2の融合タンパク質をコードする第1および第2の核酸ならびに/または標準的な分子生物学技術を使用して目的のタンパク質を融合することができるレポーターサブユニットをコードする核酸)を含む。キットは、さらに、本発明の実施形態の実施に使用する1つまたは複数のさらなる成分(酵素基質、細胞成長培地などが含まれるが、これらに限定されない)を含む。
本発明者らは、最近、β−galを使用してタンパク質翻訳をモニタリングするための近接ベースの低親和性酵素相補系を説明している。低親和性酵素相補性系を達成するために、Jacob and Monod(1961)によって最初に記載された古典的αペプチドを、結晶構造に基づいて特定の残基を短縮して変異させ、オメガ(ω)フラグメントに弱く相補するαペプチド(α*)を駆動した。タンパク質の移動をアッセイするために、1つの酵素フラグメント(ω)を、特定の細胞内領域に局在させ、小さな相補α*ペプチドを目的のタンパク質に融合した。ωのすぐ周辺のα*の濃度は、用量および時間依存様式で得た酵素活性量と相関し、局在タンパク質濃度についての遺伝学的にコードされたバイオセンサーとして役立った(T.S.Wehrman,C.L.Casipit,N.M.Gewertz,H.M.Blau,Nat Methods 2,521(July,2005))。その低親和性のために、α*とωβ−galフラグメントとの間の相互作用は、相補した酵素を維持するのに十分に強くない。結果として、任意の所与の時間に得たβ−gal活性は、2つのフラグメントの動的相互作用の基準であり、その局所濃度を反映する。この親和性が減少した系は、2005年5月18日出願の米国特許出願公開11/132,764号(この出願の実験の部に記載の系およびその生成方法の開示は、本明細書中で参考として援用される)にさらに記載されている。
ErbB2(HER2/Neu)(受容体値ロイシンキナーゼのErbBファミリーのメンバー)は、30%の乳癌で過剰発現し、特に、上皮成長因子受容体(EGFR)と同時発現した場合に、悪性表現型および不良な予後に最も明確に関連する(D.J.Slamon et al.,Science 235,177(Jan.9,1987);D.Gschwantler−Kaulich et al.,Oncol Rep 14,305(August,2005):M.P.DiGiovanna et al.,J Clin Oncol 23,1152(Feb.20,2005))。その腫瘍がErbB2を過剰発現する乳癌患者について、モノクローナル抗体であるハーセプチンは、前例のない様式での延命および再発率の減少によって治療を激変させた(M.J.Piccart−Gebhart et al.,N Engl J Med 353,1659(Oct.20,2005);M.A.Cobleigh et al.,J Clin Oncol 17,2639(September,1999);E.H.Romond et al.,N Engl J Med 353,1673(Oct.20,2005))。しかし、ハーセプチンは、使用される症例の一部しか有効でなく、今日まで、どのErbB2陽性腫瘍が治療に応答するかを予想するための根拠として認められていない。これは、ハーセプチンが作用する機構の理解が不十分であることに一部起因する。ハーセプチンが免疫系による破壊のために腫瘍細胞を標的にするといういくつかの証拠が存在するにもかかわらず(R.A.Clynes,T.L.Towers,L.G.Presta,J.V.Ravetch,Nat Med 6,443(April,2000))、免疫応答と無関係にin vitroで腫瘍細胞成長のインヒビターとして抗体を最初に選択した(R.M.Hudziak et al.,Mol Cell Biol 9,1165(March,1989))。ハーセプチンは、ErbB2のヘテロ二量体形成を遮断することは知られていないが、細胞増殖に及ぼすその阻害効果により、ハーセプチンがチロシンキナーゼのErbBファミリーによるシグナル伝達を妨害すると示唆される。ハーセプチンの作用機構の理解が困難であり続けている1つの理由は、利用可能な生化学的方法(精製または同時免疫沈降した受容体が含まれる)を使用した定量的様式でのErbB受容体の相互作用のモニタリングの難しさにある(K.M.Ferguson,P.J.Darling,M.J.Mohan,T.L.Macatee,M.A.Lemmon,Embo J 19,4632(Sep.1,2000);T.Horan et al.,J Biol Chem 270,24604(Oct.13,1995);D.Karunagaran et al.,Embo J 15,254(Jan.15,1996)。
A.β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の生成
EGFRの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン(aa1〜679)、ErbB2(aa1〜686)、およびErbB3(aa1〜693)、ならびに全長B2AR(全ヒト)を、5’Mfelおよび3’XhoI部位を使用してcDNAクローンからPCR増幅した。PCR産物を、WZLレトロウイルス構築物およびYFPH31Rα(α*)レトロウイルス構築物中のωフラグメントのアミノ末端に融合した。ヒトβ−アレスチン2の全コード配列を、cDNAクローンからPCR増幅し、EcoRIおよびXhoI部位を含むプライマーを使用して、ωおよびα*ベクターのMfeI−XhoI部位に挿入した。FKBP12の完全なコード配列およびヒトFRAPのaa2025〜2114をPCR増幅し、Mfel−XhoIフラグメントしてωおよびα*ベクターに挿入した。全長ErbB2およびEGFRもcDNAクローンからPCR増幅し、Mfel−XhoI制限酵素を使用して、MFGレトロウイルスベクターに挿入した。
製造者の説明書にしたがって、6ウェル皿中で、リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬(Invitrogen,Carlsbad Calif.)を使用して、φnx−パッケージング細胞株(P.L.Achacoso and G.P.Nolan)にレトロウイルスベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、C2C12細胞上の0.45μmのシリンジフィルターによってウイルスの上清を濾過した。最終濃度4μg/mlでポリブレンを添加し、Beckman卓上遠心分離機において1900RPMで30分間プレートをスピンした。細胞を、37℃、5%CO2の加湿インキュベーターに12時間戻し、培地を新鮮な培地と交換した。C2C12細胞を、pen/stepを含む20%FBS DMEM中で成長させた。適切な細胞を、1μg/ml G418(Invitrogen)を使用して選択するか、FL1チャネルを使用したFACSTARフローサイトメーターによってYFP発現について分取した。ATCCからSKBR3細胞株を入手した。SKBR3細胞を、10%FBS、pen/strep、およびグルタミンを補足したMcCoy’s 5A培地中で培養した。
ハーセプチンおよび2C4は、Genentech(Sliwkowski,MX)から厚意的に贈与された。全ての他の抗体は、Neomarkers(Labvision)から入手した。組換えヒトhEGF、hHRGβ1、およびhTGF−αをPeprotechから入手し、水に再懸濁し、その直後に等分して凍結した。イソプロテレノール、プロプラノロール、およびラパマイシンは、Sigmaから入手した。イソプロテレノールを、各実験前に水に再懸濁した。β−ガラクトシダーゼ活性の測定のために、細胞を、96ウェル皿に20,000細胞/ウェルで一晩播種した。適切な処理後、細胞から培地を除去し、Galacton−Star(Gal−screen kit,Applied Biosystems)の20倍希釈物と混合した50μl緩衝液Bを添加した。細胞を、室温で45分間インキュベートし、その後、1秒間の積分時間を使用してTropix TR717照度計で発光を測定した。内在化アッセイのために、アッセイの少なくとも24時間前に細胞を12ウェル皿に播種した。細胞は、血清を含まない適切な培地中で4時間血清を枯渇させ、次いで、100ng/ml EGFで処理した。ウェルをトリプシン処理し、氷上に置いてさらなるエンドサイトーシスを防止した。細胞を氷冷培地中でリンスし、Alexa647(molecular probes)に抱合した抗EGFR Ab−11(Neomarkers)を使用して、5%BSA/PBS溶液中で20分間染色し、5%BSA/PBSで再度洗浄した。製造者の説明書にしたがって抗体抱合を行い、最適な用量設定で使用した。
Claims (21)
- 第1のタンパク質および第2のタンパク質が相互に結合するかどうかを決定する方法であって、
(a)以下:
(i)該第1のタンパク質と第1のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第1の融合タンパク質であって、該第1のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが配列番号1(H31R)のN末端β−ガラクトシダーゼペプチドである、第1の融合タンパク質、および
(ii)該第2のタンパク質と第2のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第2の融合タンパク質
を含む細胞を提供する工程であって、
ここで、該第1のβ−ガラクトシダーゼフラグメントおよび第2のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが相互に結合親和性を有し、該第1のタンパク質と該第2のタンパク質との間の該結合の非存在下で検出可能なレベルのβ−ガラクトシダーゼ活性の欠如が得られる、提供する工程、および
(b)該細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性について評価して、該第1のタンパク質および第2のタンパク質が相互に結合するかどうかを決定する工程
を含む、方法。 - 前記提供する工程が、前記第1の融合タンパク質および第2の融合タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸が前記細胞に連続的に導入される、請求項2に記載の方法。
- 前記核酸が前記細胞に同時に導入される、請求項2に記載の方法。
- 前記方法が、前記評価の前に前記細胞を候補相互作用調整剤と接触させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記評価が、認められたβ−ガラクトシダーゼ活性を前記検出可能なレベルのβ−ガラクトシダーゼ活性の欠如と比較する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が酵母細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記結合が細胞内部位で起こる、請求項1に記載の方法。
- 前記結合が原形質膜部位で起こる、請求項1に記載の方法。
- 第1のタンパク質および第2のタンパク質が結合するかどうかの決定に使用するための細胞であって、
(a)該第1のタンパク質と第1のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第1の融合タンパク質であって、該第1のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが配列番号1(H31R)のβ−ガラクトシダーゼペプチドである、第1の融合タンパク質、および
(b)該第2のタンパク質と第2のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第2の融合タンパク質
を含み、該第1のβ−ガラクトシダーゼフラグメントおよび第2のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが相互に低い親和性を有し、該第1のタンパク質と該第2のタンパク質との間の結合の非存在下で検出可能なレベルのβ−ガラクトシダーゼ活性の欠如が得られ、該活性は該第1のタンパク質と該第2のタンパク質との間の結合の存在下で認められる活性よりも低い、細胞。 - 前記第1の融合タンパク質および第2の融合タンパク質が細胞内タンパク質である、請求項11に記載の細胞。
- 前記第1の融合タンパク質および第2の融合タンパク質の少なくとも1つが膜結合タンパク質である、請求項11に記載の細胞。
- 前記第1の融合タンパク質および第2の融合タンパク質の両方が膜結合タンパク質である、請求項11に記載の細胞。
- 第1のタンパク質および第2のタンパク質が結合するかどうかの決定に使用するためのキットであって、
(a)細胞であって、
(i)該第1のタンパク質と第1のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第1の融合タンパク質であって、該第1のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが配列番号1(H31R)のペプチドである、第1の融合タンパク質、および
(ii)該第2のタンパク質と第2のβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの第2の融合タンパク質
を含む、細胞、ならびに
(b)β−ガラクトシダーゼ基質
を含む、キット。 - 第1のタンパク質と第2のタンパク質の間の誘導性かつ可逆的な相互作用の定量的な様式での決定に使用するためのキットであって、
(a)第1のβ−ガラクトシダーゼフラグメントをコードする第1の核酸、および
(b)第2のβ−ガラクトシダーゼフラグメントをコードする第2の核酸
を含み、
該第1のβ−ガラクトシダーゼフラグメントが配列番号1からなるβ−ガラクトシダーゼフラグメントである、キット。 - 前記第1の核酸および第2の核酸がベクター上に存在する、請求項16に記載のキット。
- 前記ベクターが制限部位を含み、該制限部位は、タンパク質コード配列を該制限部位を使用してベクターに挿入する場合に該ベクターが該タンパク質とβ−ガラクトシダーゼフラグメントとの融合タンパク質をコードするように該ベクター上に配置される、請求項17に記載のキット。
- 前記キットが細胞をさらに含む、請求項17に記載のキット。
- 前記キットがβ−ガラクトシダーゼ基質をさらに含む、請求項17に記載のキット。
- 前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する、請求項1に記載の方法。
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