JP2003238592A - 組織及び血管の再生のための医薬及びその方法 - Google Patents

組織及び血管の再生のための医薬及びその方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 種々組織における線維症（肝線維症、肺線維
症及び腎線維症など）、種々の肝臓疾患（肝線維症、肝
硬変、ウイルス性肝炎など）及び閉塞性動脈硬化症など
の難治性疾患の症状の進行の抑制または治療をする方法
及び薬剤、並びに該薬剤を同定する方法を提供する。 【解決手段】 肝臓増殖因子（HGF）の受容体が新規ム
チン様蛋白質と結合することによりHGF/HGF受容体の機
能発現が抑制され、HGF依存的な細胞増殖並びに組織及
び血管の再生／新生が阻害されることを見出した。さら
に、HGF受容体と該ムチン様蛋白質との結合を阻害する
ことにより肝臓疾患などの種々の疾患の治療が可能とな
ることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、MERMUC（c-Met Re
gulatory Mucin）の生物活性を阻害する活性を有する物
質、具体的にはMERMUCとc-Metとの結合を阻害する活性
を有する物質またはMERMUCの発現を阻害する活性を有す
る物質を含んでなる医薬組成物に関する。さらに具体的
には、MERMUCとc-Metとの結合を阻害する活性を有する
物質またはMERMUCの発現を阻害する活性を有する物質を
含んでなり、HGFによる細胞の増殖または組織、器官、
血管、粘膜、骨格若しくは神経の形成、修復、再生若し
くは新生の維持または増強に用いるための医薬組成物に
関する。
【０００２】
【従来の技術】哺乳動物をはじめとした生物の生体は、
組織や器官の正常に機能するように生体の組織や器官に
生じた傷害あるいは欠損を速やかに修復または新生する
再生能力を有している。換言すれば、生体の疾患状態か
ら治療回復へはこの再生能力が不可欠である。この組織
や器官の再生能力に大きく貢献する因子の一つとして肝
細胞増殖因子(hepatocyte growth factor；HGF)が非常
によく研究されおり、このHGFは再生医学療法の分野に
おいて種々の難治性疾患の治療を可能とするものとして
大きな期待が寄せられており、その臨床応用のための研
究開発が目下精力的に進められている。
【０００３】HGFは、1984年に中村らによりラット血中
より部分精製された初代培養肝細胞の強力な増殖因子と
して同定され（特許文献１参照。)、その５年後の1989
年にヒト及びラットのHGFをコードするcDNAがクローニ
ングされ、HGFの一次構造が明らかとされた（非特許文
献２参照。）。ヒトのHGFは、728アミノ酸残基からなる
一本鎖不活性型のプレプロ体として合成された後、HGF
変換酵素またはHGFアクチベーターと呼ばれるセリンプ
ロテーゼによりプロセッシングされα鎖（分子量69kD
a）とβ鎖(分子量34kDa)からなるヘテロダイマーの活性
型となり、この活性型ヘテロダイマーがHGF受容体に結
合することによりHGFの様々な生物活性が発揮される。
【０００４】一方、HGFの受容体に関しては、当初ヒト
骨肉腫細胞から癌遺伝子として同定されたc-met遺伝子
の産物である受容体型チロシンキナーゼc-Metに対する
リガンドがHGFであること判明しc-MetがHGFの受容体で
あることが明らかとされた（非特許文献３及び非特許文
献４参照。）。HGF受容体であるc-Metは、α鎖（分子量
50kDa）とβ鎖（分子量145kDa）がジスルフィド結合で
結合したヘテロダイマーである。c-Metのβ鎖は細胞外
領域、細胞膜貫通領域及び細胞質領域から構成され、細
胞質領域にはチロシンキナーゼドメインが存在する。HG
Fが受容体c-Metに結合することにより受容体の二量体化
が起こり、続いて細胞質領域に存在するチロシン残基の
自己リン酸化が引き起こされる。
【０００５】またこのc-Metβ鎖のC末端側には、多機能
結合部位（multifunctional docking site）呼ばれる３
つのリン酸化チロシン残基からなる部位が存在し、この
部位にSH2ドメインを有するPI3キナーゼ、PLC-γ、SH
C、Grb-1、Grb-2及びpp60c-SRCなどの各種のシグナル伝
達分子が結合することにより、HGFの多彩な生物活性を
担うシグナルの発信源となっている（例えば、非特許文
献５及び非特許文献６参照。）。これまでの研究から、
HGFは、その受容体c-Metへの結合による細胞内へのシグ
ナル伝達を通じて、下記のように非常に多彩な生物活性
及び疾患の治療・改善効果を発揮することが明らかとさ
れている。
【０００６】(1)肝細胞のみならず、ほとんどの上皮系
細胞（腎尿細管上皮細胞、皮膚ケラチノサイト、メラノ
サイト、肺胞II型上皮細胞、胃粘膜上皮細胞など）及び
一部の間葉系細胞（血管内皮細胞、軟骨細胞、破骨細
胞、筋衛星細胞など）の増殖促進因子として作用する
（例えば、非特許文献７及び非特許文献８参照。）。 (2)哺乳動物や両生類の生体の発生過程における、上皮
系細胞及び間葉系組織の間の相互作用のメディエーター
分子としての作用を有し肝臓、腎臓及び肺などの内臓臓
器並びに肢芽や体節などの種々の組織器官の形成を誘導
する（非特許文献７乃至非特許文献１４参照。）。
【０００７】(3)一方、成熟個体においては、HGFはパラ
クリン（paracrine）及びエンドクリン（endocrine）的
に作用することにより肝臓、腎臓及び肺などの器官やそ
の組織を修復、再生及び新生を促す因子として機能する
（例えば、非特許文献７乃至非特許文献９並びに非特許
文献１５乃至非特許文献２２参照。）。
【０００８】(4)HGFは、上述の上皮細胞や一部の間葉系
細胞（血管内皮細胞、筋細胞など）の増殖並びに肝臓、
腎臓及び肺などの臓器の損傷の修復再生を担うだけでな
く、それ以外の細胞、例えば、胃粘膜上皮細胞、心筋細
胞、骨格筋細胞及び神経細胞などの増殖及び修復を強力
に促し、胃粘膜、心臓、骨格系及び神経系の組織の破壊
の予防並びに組織の再生修復を担う（例えば、非特許文
献２３参照。）。 (5)HGFは、高血糖や虚血などの原因による血管内皮細胞
のアポトーシスを抑制する（例えば、非特許文献２４及
び非特許文献２５参照。）。
【０００９】(6)心筋線維芽細胞をHGFで刺激することに
よりuPA、MMP-1及びMMP-9などの発現が誘導されること
から、HGFは種々組織に対する抗線維化作用を有してい
ることが示唆されている（例えば、非特許文献２６参
照。）。 (7)HGFまたはHGF遺伝子をウサギやラットに投与するこ
とにより、HGFによる血管新生作用が確認されている
（例えば、非特許文献２６及び非特許文献２７参
照。）。
【００１０】(8)上述のようなHGFの多彩な生理活性によ
り、HGFは現在も根本的な治療方法のない肝線維症、肝
硬変、劇症肝炎、ウイルス性肝炎、急性肝炎、慢性腎不
全、腎線維症及び肺線維症などの難治性臓器疾患に対し
劇的な治療効果を発揮することが動物試験において示さ
れている（例えば、非特許文献２８乃至非特許文献３７
参照。）。 さらに、最近ではHGF遺伝子を用いた遺伝子治療による
閉塞性動脈硬化症の治療が試みられている。
【００１１】上述のような種々難治性疾患の治療に有効
なHGFの多彩な生物活性及びその治療効果が明らかにさ
れる一方で、HGFやHGF遺伝子を用いる該疾患の治療にお
いては、患者の体内への過剰なHGFの供給に起因する発
癌の可能性も懸念されていることから、HGFやHGF遺伝子
の生体への投与のみに頼ることなく当該疾患の治療可能
な新たな方法の開発が求められている。そのような新た
な治療方法の開発の一つのアプローチとして、HGFの受
容体であるc-Metと相互作用することによりHGF/c-Metの
シグナル伝達を制御する新たな分子を特定し、該新たな
分子とc-Metとの相互作用または該新たな分子の機能を
制御する方法が有望視される。
【００１２】
【非特許文献１】Biochem. Biophys. Res. Commun., 19
84, Vol.122, p.1450-1459
【非特許文献２】Nature, 1989, Vol.342, p.440-443
【非特許文献３】Science, 1991, Vol.251, p.801-804
【非特許文献４】Oncogene, 1991, Vol.6, p.501-504
【非特許文献５】Cell, 1994, Vol.77, p.261-271, 199
4
【非特許文献６】実験医学, 1997, Vol.15, p.1033-103
9
【非特許文献７】J. Biochem., 1996, Vol.119, p.591-
600
【非特許文献８】Biochem. Biophys. Res. Commum., 19
97, Vol.239, p.639-644
【非特許文献９】J. Cell. Biol., 1993, Vol.123, p.2
23-236
【非特許文献１０】Development, 1998, Vol.125, p.13
15-1324
【非特許文献１１】Nature, 1995, Vol.373, p.699-70
2
【非特許文献１２】Nature, 1995, Vol.373, p.702-705
【非特許文献１３】Nature, 1995, Vol.376, p.768-771
【非特許文献１４】Biochem. Biophys. Res. Commun.,
1997, Vol.234, p.8-14
【非特許文献１５】Biochem. Biophys. Res. Commum.,
1990, Vol.173, p.42-47
【非特許文献１６】Biochem. Biophys. Res. Commum.,
1991, Vol.177, p.330-335
【非特許文献１７】Hepatology, 1992, Vol.16, p.122
7-1235
【非特許文献１８】J. Boil. Chem., 1991, Vol.266,
p.22781-22784
【非特許文献１９】Am. J. Physiol., 1993, Vol.265,
p.61-69
【非特許文献２０】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 199
4, Vol.91, p.4357-4361
【非特許文献２１】Am. J. Physiol., 1996, Vol.270,
p.1031-1039
【非特許文献２２】蛋白質・核酸・酵素, 2000, Vol.4
5, No.13, p.2100-2108
【非特許文献２３】蛋白質・核酸・酵素, 2000, Vol.4
5, No.13, p.2100-2108
【非特許文献２４】Diabetologia, 1997, Vol.40, p.10
53-1061
【非特許文献２５】Diabetes, 1997, Vol.46, p.138-14
2
【非特許文献２６】日本臨床, 2000, Vol.58, Suppl.
p.168-172
【非特許文献２７】Hypertension, 1999, Vol.33, p.13
79-1384
【非特許文献２８】実験医学, 1997, Vol.15, p.90-97
【非特許文献２９】J. Biochem., 1995, Vol.118, p.64
3-649
【非特許文献３０】Nature Med., 1999, Vol.5, p.226-
230
【非特許文献３１】Hepatology, 1997, Vol.26, p.81-8
9
【非特許文献３２】Hepatology, 1999, Vol.30, p.151-
159
【非特許文献３３】Biochem. Biophys. Res. Commun.,
1998, Vol.244, p.683-690
【非特許文献３４】J. Clin. Invest., 1999, Vol.103,
p.313-320
【非特許文献３５】Kidney Int., 2000, Vol.57, p.937
-948
【非特許文献３６】J. Clin. Invest., 1998, Vol.101,
p.1827-1834
【非特許文献３７】Am. J. Repair. Crit. Care Med.,
1997, Vol.156, p.1937-1944
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明は、
（１）HGFの受容体であるc-Metと相互作用することによ
りHGF/c-Metのシグナル伝達を制御する新たな分子を特
定し、（２）該新たな分子とc-Metとの相互作用または
該新たな分子の機能を制御することによってHGF/c-Met
のシグナル伝達を制御する方法、物質及び医薬組成物を
提供し、（３）当該方法、物質及び医薬組成物を用い
て、HGF医薬（HGF蛋白医薬、HGF遺伝子治療など）によ
る治療が適応される種々の疾患、特に、肝線維症、肝硬
変、劇症肝炎、ウイルス性肝炎、急性肝炎、慢性腎不
全、腎線維症及び肺線維症などの難治性臓器疾患を治療
することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、後述する
最近報告された腎炎患者の腎臓組織からクローニングさ
れたムチン様蛋白質（国際出願公開：WO01/05803）に関
して、特には該ムチン様蛋白質と結合する分子について
鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、(1)HGFの
受容体であるc-Metが当該ムチン様蛋白質に結合するこ
と、(2)該両分子の結合により、HGF／c-Metを介するシ
グナル伝達により発揮されるHGFの生物活性が抑制的に
制御されること（ダウンレギュレーション）、さらには
(3)該ムチン様蛋白質のc-Metへの結合親和性は、該ムチ
ン様蛋白質が多量体化（自己会合）することにより増大
されるとを見出し以下に詳述するような本発明を完成す
るに到った。一方、本発明者らは、上記のムチン様蛋白
質のそのような特徴に基づき、この分子をMERMUC（c-Me
t Regulatory Mucin）と命名した。
【００１５】HGFの生物活性の発現が、その受容体であ
るc-MetとMERMUC（MERMUC分子の自己会合物を含む）と
の結合によりダウンレギュレートされるというこの新た
な知見は、未だ全く報告されていない新たな知見である
ことは言うまでもないが、とりわけ重要なことは、この
全く新たな知見に基づき以下に述べるような医療及び製
薬業において極めて有用な本発明が完成されたことであ
る。具体的には、本発明により、種々の疾患の予防・治
療に必須である組織及び器官など修復、再生若しくは新
生、より具体的には、現在もその治療が困難とされてい
る種々の難治性疾患（例えば、肝線維症、肝硬変、劇症
肝炎、ウイルス性肝炎、急性肝炎、慢性腎不全、腎線維
症及び肺線維症など）の治療が、必要最小限の用量のHG
F医薬（HGF蛋白やHGF遺伝子など）により、または該HGF
医薬を用いることなく可能となることである。
【００１６】これは、本発明の一つである医薬組成物、
即ち、(1)HGFの受容体であるc-MetとMERMUCとの結合を
阻害する活性を有する物質からなる医薬組成物、(2)MER
MUC分子の多量体化（自己会合）を阻害する活性を有す
る物質からなる医薬組成物、または(3)MERMUCの発現を
抑制若しくは阻害する物質からなる医薬組成物を用い
て、c-MetとMERMUCとの結合により起こるHGF活性のダウ
ンレギュレーションを取り除くことにより、患者の生体
に内在するHGFあるいは該患者に外来的に供給されたHGF
（HGF蛋白製剤またはHGF遺伝子治療）が潜在的に有して
いる生物活性を最大限に引き出すことが可能となること
によるものである。
【００１７】従って、HGF医薬を用いた疾患の治療にお
いては、上述のような本発明の医薬組成物を併用するこ
とにより、患者に投与されるHGF医薬の用量、投与頻度
及び投与期間などを大幅に減少させることが可能とな
る。また、これにより、患者の心身の苦痛を減じること
が可能であると同時に、種々のコスト（患者、医療現
場、医薬品メーカー、政府機関の各々が負担するコス
ト）の削減も可能となる。
【００１８】本発明は、上述の医薬組成物だけでなく、
当該医薬組成物の活性成分である(1)c-MetとMERMUCとの
結合を阻害する活性を有する物質、(2)MERMUCの多量体
化（自己会合）を阻害する活性を有する物質、または
(3)MERMUCの発現を抑制若しくは阻害する物質を同定す
る方法、任意の物質の各種活性（(1)c-MetとMERMUCとの
結合を阻害する活性、(2)MERMUCの多量体化（自己会
合）を阻害する活性、MERMUCの発現を抑制若しくは阻害
する活性など）を試験する方法、並びに当該方法に用い
られる各種ツール（各種ポリペプチドや融合ポリペプチ
ドなど）を提供するものであり、これらの方法やツール
の発明により上述の本発明の医薬組成物の提供を可能と
される。
【００１９】本発明は、即ち、下記(1)乃至(78)に記載
されるとおりの発明である。 (1) c-MetとMERMUCとの結合若しくはMERMUCの多量体化
を阻害する活性を有する物質及び薬学的に許容され得る
担体を含んでなり、細胞の増殖または組織、器官、血
管、粘膜、骨格若しくは神経の形成、修復、再生若しく
は新生の維持または増強に用いるための医薬組成物。 (2) c-MetとMERMUCとの結合若しくはMERMUCの大量体化
を阻害する活性を有する物質及び薬学的に許容され得る
担体を含んでなり、HGFによる細胞の増殖または組織、
器官、血管、粘膜、骨格若しくは神経の形成、修復、再
生若しくは新生の維持または増強に用いるための医薬組
成物。 (3) 該HGFが、生体に内在するHGFである前記(2)に記載
の医薬組成物。 (4) 該HGFが、生体に外来的にHGFを供給可能なHGF医薬
である前記(2)に記載の医薬組成物。 (5) 該HGF医薬が、HGF蛋白質を含む蛋白医薬である前
記(4)に記載の医薬組成物。 (6) 該HGF医薬が、HGF蛋白質をコードするDNAを含むDN
A医薬である前記(4)に記載の医薬組成物。 (7) 該医薬組成物が、線維症の予防または治療に用い
られるための前記(1)または前記(2)に記載の医薬組成
物。 (8) 該線維症が、肝臓、腎臓または肺における線維症
である前記(7)に記載の医薬組成物。 (9) 該医薬組成物が、肝硬変、肝線維症または肝炎の
予防または治療に用いられるための前記(1)または前記
(2)に記載の医薬組成物。 (10) 該肝炎が、劇症肝炎、急性肝炎またはウイルス性
肝炎の予防または治療に用いられるための前記(1)また
は前記(2)に記載の医薬組成物。 (11) 該医薬組成物が、慢性腎不全の予防または治療に
用いられるための前記(1)または前記(2)に記載の医薬組
成物。 (12) 該医薬組成物が、閉塞性動脈硬化症の予防または
治療に用いられるための前記(1)または前記(2)に記載の
医薬組成物。 (13) 該物質が、c-MetとMERMUCとの結合を阻害する活
性を有する物質である前記(1)または前記(2)に記載の医
薬組成物。 (14) 該物質が、c-Metのβ鎖のＣ末端領域とMERMUCの
Ｃ末端領域との結合を阻害する活性を有する物質である
前記(13)に記載の医薬組成物。 (15) 該物質が、MERMUCの多量体化を阻害する活性を有
する物質である前記(1)または前記(2)に記載の医薬組成
物。 (16) 該物質が、MERMUCに結合する物質である前記(1)
または前記(2)に記載の医薬組成物。 (17) MERUMUCの発現を抑制または阻害する物質及び薬
学的に許容され得る担体を含んでなり、細胞の増殖また
は組織、器官、血管、粘膜、骨格若しくは神経の形成、
修復、再生若しくは新生の維持または増強に用いるため
の医薬組成物。 (18) 該物質が、MERMUCをコードする遺伝子のmRNAへの
転写を阻害する物質である前記(17)に記載の医薬組成
物。 (19) 該物質が、MERMUCをコードするmRNAの蛋白質への
翻訳を阻害する物質である前記(17)に記載の医薬組成
物。 (20) MERUMUCの発現を抑制または阻害する物質及び薬
学的に許容され得る担体を含んでなり、HGFによる細胞
の増殖または組織、器官、血管、粘膜、骨格若しくは神
経の形成、修復、再生若しくは新生の維持または増強に
用いるための医薬組成物。 (21) 該物質が、MERMUCをコードする遺伝子のmRNAへの
転写を阻害する物質である前記(20)に記載の医薬組成
物。 (22) 該物質が、MERMUCをコードするmRNAの蛋白質への
翻訳を阻害する物質である前記(20)に記載の医薬組成
物。 (23) 該HGFが、生体に内在するHGFである前記(20)に記
載の医薬組成物。 (24) 該HGFが、生体に外来的にHGFを供給可能なHGF医
薬である前記(20)に記載の医薬組成物。 (25) 該HGF医薬が、HGF蛋白質を含む蛋白医薬である前
記(24)に記載の医薬組成物。 (26) 該HGF医薬が、HGF蛋白質をコードするDNAを含むD
NA医薬である前記(24)に記載の医薬組成物。 (27) 該医薬組成物が、線維症の予防または治療に用い
られるための前記(17)または前記(20)に記載の医薬組成
物。 (28) 該線維症が、肝臓、腎臓または肺における線維症
である前記(27)に記載の医薬組成物。 (29) 該医薬組成物が、肝硬変、肝線維症または肝炎の
予防または治療に用いられるための前記(17)または前記
(20)に記載の医薬組成物。 (30) 該肝炎が、劇症肝炎、急性肝炎またはウイルス性
肝炎の予防または治療に用いられるための前記(17)また
は前記(20)に記載の医薬組成物。 (31) 該医薬組成物が、慢性腎不全の予防または治療に
用いられるための前記(17)または前記(20)に記載の医薬
組成物。 (32) 該医薬組成物が、閉塞性動脈硬化症の予防または
治療に用いられるための前記(17)または前記(20)に記載
の医薬組成物。 (33) MERMUCの全長アミノ酸配列の一部のアミノ酸配列
を有し、c-Metと結合する活性を有するポリペプチド。 (34) 該一部のアミノ酸配列が、MERMUCの細胞質領域の
全部または一部に対応する前記(33)に記載のポリペプチ
ド。 (35) 該細胞質領域の全部または一部が、MERMUCのＣ末
端領域のロイシン繰返し領域の全部または一部を含む前
記(35)に記載のポリペプチド。 (36) 該MERMUCが、ヒトのMERMUCである前記(33)に記載
のポリペプチド。 (37) 該ポリペプチドが、配列番号15に示されるアミノ
酸配列を含む前記(33)に記載のポリペプチド。 (38) c-Metの全長アミノ酸配列の一部のアミノ酸配列
を有し、MERMUCと結合する活性を有するポリペプチド。 (39) 該一部のアミノ酸配列が、c-Metのβ鎖の細胞質
領域の全部または一部に対応する前記(38)に記載のポリ
ペプチド。 (40) 該細胞質領域の全部または一部が、自己リン酸化
を受ける１または複数のチロシン残基を含むc-MetのＣ
末端領域の全部または一部を含む前記(39)に記載のポリ
ペプチド。 (41) 該c-Metが、ヒトのc-Metである前記(38)に記載の
ポリペプチド。 (42) 該ポリペプチドが、配列番号５に示されるアミノ
酸配列を含む前記(38)に記載のポリペプチド。 (43) MERMUCの全長アミノ酸配列の一部のアミノ酸配列
を有し、MERMUCと結合する活性を有するポリペプチド。 (44) 該一部のアミノ酸配列が、MERMUCの細胞質領域の
全部または一部に対応する前記(43)に記載のポリペプチ
ド。 (45) 該MERMUCが、ヒトのMERMUCである前記(33)に記載
のポリペプチド。 (46) 一般式Ｗ−Ｘ−Ｙ（Ｗは存在しないかまたはMERM
UC以外の他の蛋白質の全長アミノ酸配列若しくはその一
部、ＸはMERMUCの全長アミノ酸配列またはその一部であ
り、ＹはMERMUC以外の他の蛋白質の全長アミノ酸配列ま
たはその一部である。）で表される融合ポリペプチド。 (47) 該Ｙの他の蛋白質が、β-galΔαまたはβ-galΔ
ωである前記(46)に記載の融合ポリペプチド。 (48) 該β-galΔαが、配列番号16に示されるアミノ酸
配列を有する前記(47)に記載の融合ポリペプチド。 (49) 該β-galΔωが、配列番号17に示されるアミノ酸
配列を有する前記(47)に記載の融合ポリペプチド。 (50) 該MERMUCの全長アミノ酸配列の一部が、c-Metと
結合する活性を有する前記(46)に記載の融合ポリペプチ
ド。 (51) 該MERMUCの全長アミノ酸配列の一部が、MERMUCの
細胞質領域の全部または一部を含む前記(46)に記載の融
合ポリペプチド。 (52) 該MERMUCの全長アミノ酸配列の一部が、MERMUCの
Ｃ末端領域のロイシン繰返し領域の全部または一部を含
む前記(51)に記載の融合ポリペプチド。 (53) 該MERMUCが、ヒトのMERMUCである前記(46)に記載
の融合ポリペプチド。 (54) 該Ｘが、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含
む前記(46)に記載のポリペプチド。 (55) 該Ｗの他の蛋白質が、Fasの細胞外領域を含む前
記(46)に記載のポリペプチド。 (56) 一般式Ｚ−Ｙ（Ｚはc-Metの全長アミノ酸配列ま
たはその一部であり、Ｙはc-Met以外の他の蛋白質の全
長アミノ酸配列またはその一部である。）で表される融
合ポリペプチド。 (57) 該他の蛋白質が、β-galΔαまたはβ-galΔωで
ある前記(52)に記載の融合ポリペプチド。 (58) 該β-galΔαが、配列番号16に示されるアミノ酸
配列を有する前記(57)に記載の融合ポリペプチド。 (59) 該β-galΔωが、配列番号17に示されるアミノ酸
配列を有する前記(57)に記載の融合ポリペプチド。 (60) 該c-Metの全長アミノ酸配列の一部が、MERMUCと
結合する活性を有する前記(56)に記載の融合ポリペプチ
ド。 (61) 該c-Metの全長アミノ酸配列の一部が、c-Metのβ
鎖の細胞質領域の全部または一部を含む前記(56)に記載
の融合ポリペプチド。 (62) 該c-Metの全長アミノ酸配列の一部が、自己リン
酸化を受ける１または複数のチロシン残基を含むc-Met
のＣ末端領域の全部または一部を含む前記(56)に記載の
融合ポリペプチド。 (63) 該c-Metが、ヒトのc-Metである前記(56)に記載の
融合ポリペプチド。 (64) 該Ｚが、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含
む前記(56)に記載の融合ポリペプチド。 (65) ある物質のc-MetとMERMUCとの結合を阻害する活
性の有無または程度を試験する方法であって、被験物質
の存在下でのc-MetとMERMUCとの結合の有無または程度
を、被験物質の不存在下でのc-MetとMERMUCとの結合の
程度と比較する工程を含む方法。 (66) c-MetとMERMUCとの結合を阻害する活性を有する
物質を同定する方法であって、被験物質の存在下でのc-
MetとMERMUCとの結合の有無または程度を、被験物質の
不存在下でのc-MetとMERMUCとの結合の程度と比較する
工程を含む方法。 (67) ある物質のc-MetとMERMUCとの結合を阻害する活
性の有無または程度を試験する方法であって： （ａ）c-Met及びMERMUCを共に発現し、該c-Met及びMERM
UCが結合した場合に該結合を検出可能なように設計され
た細胞を調製する工程； （ｂ）工程(a)で得た細胞をHGFの存在下で且つ被験物質
の不存在下で培養した後、該細胞におけるc-Met及びMER
MUCの結合の程度を測定する工程； （ｃ）工程(b)で得た細胞をHGF及び被験物質の存在下で
培養した後、該細胞におけるc-Met及びMERMUCの結合の
程度を測定する工程； （ｄ）工程(b)の測定結果と工程(c)の測定結果を比較す
る工程。 (68) 該MERMUCが、前記(46)乃至前記(54)のいずれかに
記載の融合ポリペプチドである前記(67)に記載の方法。 (69) 該MERMUCが、前記(47)乃至前記(49)のいずれかに
記載の融合ポリペプチドである前記(67)に記載の方法。 (70) 該c-Metが、前記(56)乃至前記(64)のいずれかに
記載の融合ポリペプチドである前記(67)に記載の方法。 (71) 該c-Metが、前記(57)乃至前記(59)のいずれかに
記載の融合ポリペプチドである前記(67)に記載の方法。 (72) c-MetとMERMUCとの結合を阻害する活性を有する
物質を同定する方法であって： （ａ）c-Met及びMERMUCを共に発現し、該c-Met及びMERM
UCが結合した場合に該結合を検出可能なように設計され
た細胞を調製する工程； （ｂ）工程(a)で得た細胞をHGFの存在下で且つ被験物質
の不存在下で培養した後、該細胞におけるc-Met及びMER
MUCの結合の程度を測定する工程； （ｃ）工程(b)で得た細胞をHGF及び被験物質の存在下で
培養した後、該細胞におけるc-Met及びMERMUCの結合の
程度を測定する工程； （ｄ）工程(b)の測定結果と工程(c)の測定結果を比較す
る工程。 (73) 該MERMUCが、前記(46)乃至前記(54)のいずれかに
記載の融合ポリペプチドである前記(72)に記載の方法。 (74) 該MERMUCが、前記(47)乃至前記(49)のいずれかに
記載の融合ポリペプチドである前記(72)に記載の方法。 (75) 該c-Metが、前記(56)乃至前記(64)のいずれかに
記載の融合ポリペプチドである前記(72)に記載の方法。 (76) 該c-Metが、前記(57)乃至前記(59)のいずれかに
記載の融合ポリペプチドである前記(72)に記載の方法。 (77) ある物質のMERMUCの多量体化を阻害する活性の有
無または程度を試験する方法であって、被験物質の存在
下でMERMUCの多量体化の有無または程度を、被験物質の
不存在下でのMERMUCの多量体化の程度と比較する工程を
含む方法。 (78) MERMUCの多量体化を阻害する活性を有する物質を
同定する方法であって、被験物質の存在下でのMERMUCの
多量体化の有無または程度を、被験物質の不存在下での
MERMUCの多量体化の程度と比較する工程を含む方法。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下、本発明で用いられる語句の
意味、並びに物質の製造方法を明らかにすることによ
り、本発明を詳細に説明する。本発明において「哺乳動
物」とは、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラッ
ト、ハムスター、及びモルモット等を意味し、好ましく
は、ヒト、ウシ、ラット、マウスまたはハムスターであ
り、特に好ましくは、ヒトである。
【００２１】本発明において「c-Met」とは、上記哺乳
動物のc-Metであり、好ましくは、ヒト、マウスまたは
ラットのc-Metであり、特に好ましくはヒトのc-Metであ
る。該c-Metは、以下に定義する肝細胞増殖因子（hepat
ocyte growth factor; HGF）の受容体であり、該c-Met
は既報に報告されるとおりの構造及び生物学的機能を有
する。該c-Metは、細胞外領域のみからなるα鎖（分子
量：約50kDa）と細胞膜貫通蛋白であるβ鎖（分子量：
約145kDa）がジスルフィド結合で結合したヘテロダイマ
ーである。本発明における好ましい態様であるヒトc-Me
tには、異性体（異性体１、異性体２など）が存在する
が、本発明におけるヒトc-Metにはそれらいずれもが包
含される。異性体１及び異性体２は互いにスプライシン
グ変異体であると考えられている。
【００２２】異性体１及び異性体２として報告されてい
るヒトc-Metの一次構造（ヘテロダイマーになる前の前
駆体）は、各々1390アミノ酸残基（配列番号２及びGenB
ankAccession Nos.:P08581, TVHUME, CAB56793。対応す
るcDNAの塩基配列は、配列番号１に示した。)及び1408
アミノ酸残基（GenBank Accession No.:4557747。対応
する。）からなる。異性体１及び異性体２の差違は、異
性体１におけるアミノ酸番号754（Ile）と755（Ser）の
間に存在する18アミノ酸残基のみであり他の部分のアミ
ノ酸配列は同一である。以下、c-Metについて、異性体
１を例に挙げて説明及び定義するが、本発明においては
同様の構造を有する異性体２も包含されることは言うま
でもない。ヒトc-Metは、シグナルペプチド（配列番号
２のアミノ酸番号1-24）、α鎖（配列番号２のアミノ酸
番号25-303）及びβ鎖（配列番号２のアミノ酸番号308-
1390。配列番号４の全長配列に同じ。配列番号３は、対
応するcDNA配列。）から構成される（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA., Vol.84, No.8, p.6379-6383, 1987;Onco
gene, Vol.1, No.2, p.229-233, 1987; Oncogene, Vol.
8, N.12, p.3403-3410, 1993; Nature, Vol.318, No.60
44, p.385-388, 1985; Science, Vol.251, No.4995, p.
802-804, 1991; J. Biol. Chem., Vol.266, No.29, p.1
9558-19564,1991; Nature Genetics, Vol.16, No.1, p.
68-73, 1997; Mol. Cell. Biol., Vol.7, No.2, p.921-
924, 1987; J. Biol. Chem., Vol.269, No.17, p.12852
-12857, 1994）。
【００２３】マウス及びラットの各々のc-Metの構造及
び生物学的性状もヒトc-Metと類似している（［マウスc
-Met］GenBank Accession Nos.:S01254, NP 032617, P1
6056,CAA68680／Oncogene, Vol.2, No.6, p.593-599, 1
988; Gene, Vol.85, No.1, p.67-74, 1989; J. Cell Bi
ol., Vol.121, No.1, p.145-154, 1993; ［ラット］Gen
Bank Accession Nos.: NP 113705, AAB19189／Am. J. P
hysiol. Vol.271, No.3 Pt 2, p.F679-F688, 1996）。
【００２４】c-Metのβ鎖（ヒトにおいては配列番号２
のアミノ酸番号308-1390。配列番号４の全長配列に同
じ。）は、細胞外領域（ヒトにおいては配列番号２のア
ミノ酸番号308-932。配列番号４のアミノ酸番号1-625に
同じ。）、細胞膜貫通領域（ヒトにおいては配列番号２
のアミノ酸番号933-955。配列番号４のアミノ酸番号626
-648に同じ。）及び細胞質領域（ヒトにおいては配列番
号２のアミノ酸番号956-1390。配列番号４のアミノ酸番
号649-1083に同じ。）から構成され、細胞質領域にはチ
ロシンキナーゼドメイン（ヒトにおいては配列番号２の
アミノ酸番号1078-1345。配列番号４のアミノ酸番号771
-1038に同じ。）が存在する。HGFが受容体c-Metに結合
することにより受容体の二量体化が起こり、続いて細胞
質領域に存在するチロシン残基の自己リン酸化が引き起
こされる（ヒトにおいては配列番号２のアミノ酸番号13
49、1356及び1365のチロシン残基。配列番号４のアミノ
酸番号1042、1049及び1058に同じ。）。
【００２５】特に、c-Metβ鎖のC末端側には、多機能結
合部位（multifunctional dockingsite）呼ばれる３つ
のリン酸化チロシン残基（ヒトにおいては配列番号２の
アミノ酸番号1349、1356及び1365。配列番号４のアミノ
酸番号1042、1049及び1058に同じ。）からなる部位が存
在し、この部位にSH2ドメインを有するPI3キナーゼ、PL
C-γ、SHC、Grb-1、Grb-2及びpp60c-SRCなどの各種のシ
グナル伝達分子が結合することにより、HGFの多彩な生
物活性を担うシグナルの発信源となっている（Cell, Vo
l.77, p.261-271, 1994及び実験医学, Vol.15, p.1033-
1039, 1997）。
【００２６】本発明における「c-Metのβ鎖の細胞質領
域」とは、好ましくはヒト、マウスまたはラットのc-Me
tのβ鎖の細胞質領域であり、特に好ましくはヒトのc-M
etのβ鎖の細胞質領域（配列番号２のアミノ酸番号956-
1390。配列番号４のアミノ酸番号649-1083に同じ。）で
ある。本発明における「c-Metのβ鎖の細胞質領域の一
部」は、上記細胞質領域の任意の一部を意味するが、好
ましくは該β鎖のＣ末端領域であり、特に好ましくは自
己リン酸化を受けるチロシン残基（ヒトにおいては配列
番号２のアミノ酸番号1349、1356及び1365。配列番号４
のアミノ酸番号1042、1049及び1058に同じ。）の１また
は複数を含み、以下に定義するMERMUCのＣ末端領域と結
合する領域である。さらに具体的には、後述の実施例に
おいて示されるMERMUCとの結合に必要な最少のアミノ酸
配列（配列番号５）を含む領域である。但し、該最少ア
ミノ酸配列とは、後述の実施例において開示される限定
された実験結果のみに基づく場合の最少配列であり、本
願における最少単位なる用語は、該配列（配列番号５）
よりもさらに短いアミノ酸配列をも意味する。
【００２７】本発明のヒトc-Metには上述した一次構造
を有するヒトc-Metの異性体（その一つである異性体２
は1408アミノ酸を有する。Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., Vol.84, No.18, p.6379-6383, 1987; Nature, Vol.
318, No.6044, p.385-388, 1985; Mol. Cell. Biol., V
ol.7, No.2, p.921-924, 1987; Science, Vol.251, No.
4995, p.802-804, 1991; Cytogenet. Cell Genet., Vo
l.60, No.2, p.114-116, 1992; Cell. Mol. Biol. Re
s., Vol.40, No.4, p.337-350, 1994; Cell Mol. Biol.
Res., Vol.40, No.7-8, p.7-7, 1994）が包含される
が、両者の一次構造は、細胞外領域中間の一部のアミノ
酸配列のみであり、細胞外領域のＣ末端側から細胞質領
域を経たＣ末端までのアミノ酸配列は同一である。即
ち、両形態のヒトc-Metβ鎖とも後述の実施例で示され
るMERMUCとの結合に必要な領域の構造は保存されている
ことを示すものである。
【００２８】本発明において「HGF」とは、上記に定義
したc-Metのリガンドである哺乳動物由来の肝細胞増殖
因子（hapatocyte growth factor; HGF）であり、好ま
しくはヒト、マウスまたはラットのHGFであり、特に好
ましくはヒトのHGFである。HGFは、一本鎖不活性型のプ
レプロ体として合成された後、HGF変換酵素またはHGFア
クチベーターと呼ばれるセリンプロテーゼによりプロセ
ッシングされα鎖（分子量約69kDa）とβ鎖(分子量約34
kDa)からなるヘテロダイマーの活性型となり、この活性
型ヘテロダイマーがHGF受容体に結合することによりHGF
の様々な生物活性が発揮される（上記の既報に同じ）。
【００２９】ヒトHGFのプレプロ体は、728アミノ酸から
構成される（アミノ酸配列：配列番号７。対応cDNA配
列：配列番号６）（GenBank Accession Nos.:JH0579, P
14210,XP 052257, XP 052258, XP 052260, AAA52648, B
AA14348, AAA52650, AAA64239／Biochem. Biophys. Re
s. Commun., Vol.163 No.2, p.967-973, 1989; Nature,
Vol.342, No.6248, p.440-443, 1989; Biochem. Biophy
s. Res. Commun., Vol.172, No.1, p.321-327, 1990;
J. Cell Boil., Vol.111, No.5 Pt.1, p.2097-2108, 19
90; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.88, No.2, p.4
15-419, 1991; Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.
175, No.2, p.660-667, 1991; Eur. J. Biochem., Vol.
197, No.1, p.15-22, 1991; Gene, Vol.102, No.2, p.2
13-219, 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.88,
No.16, p.7001-7005, 1991; Biochem. Biophys. Res.
Commun., Vol.180, No.2, p.1151-1158, 1991; Proc. N
atl.Acad. Sci. USA., Vol.89, No.23, p.11574-11578,
1992; Biochem. Biophys.Res. Commun., Vol.189, No.
3, p.1329-1335, 1992; EMBO J., Vol.11, No.7, p.250
3-2510, 1992; Structure, Vol.6, No.1, p.109-116, 1
998; Structure, Vol.6, No.11, p.1383-1393, 199
8）。
【００３０】ラットHGF及びマウスHGFのプレプロ体も、
ヒトHGFと同様にともに728アミノ酸から構成され既報の
とおりの構造及び生物学的性状を有する（［ラット］Ge
nBank Accession Nos.:NP 058713, P17945, A35644, BA
A14133, CAA38266／Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vo
l.87, No.8, p.3200-3204, 1990; Eur. J. Biochem.,Vo
l.193, No.2, p.375-381, 1990;。［マウス］GenBank A
ccession Nos.:A60185, Q08048, BAA01064, CAA58865／
Nature, Vol.346, No.6281, p.228, 1990; Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., Vol.195, No.1, p.34-43, 1990; Bi
ochem. J., Vol.278, Pt.1, p.35-41, 1991; Biochem.
Biophys. Acta., Vol.1216, No.2, p.299-303, 1993; B
iochem. Biophys. Res. Commun., Vol.199, No.2, p.77
2-779, 1994; J. Biol. Chem., Vol.270, No.2, p.830-
836, 1995; Cell Adhes. Commun., Vol.1, No.2, p.101
-111, 1993）。
【００３１】本発明において「MERMUC」とは、国際出願
公開WO01/05803に記載された新規な哺乳動物のムチン様
分子を意味する。本発明においては当該ムチン様分子を
c-Met Regulatory Mucin（MERMUC）と呼ぶ。本発明にお
いて好ましい態様はヒト、マウスまたはラットのMERMUC
であり、特に好ましくはヒトのMERMUCである。本発明者
らは、MERMUCについて鋭意研究し、MERMUCが少なくとも
下記及び後述の実施例に記載されるような構造的特徴を
有することを特定した。
【００３２】(1)哺乳動物のMERMUCの一次構造は、細胞
外領域、１つの膜貫通領域及び細胞質領域から構成され
る。 (2)該細胞外領域には、潜在的なＯ結合型糖鎖付加部位
（O-linked glycosylation site）として知られるムチ
ン特異的ドメインが存在し、該ドメインは、糖鎖付加可
能なセリン/スレオニン残基に富む特定のアミノ酸配列
の繰返し構造（ヒトMERMUCにおいては配列番号８の１９
アミノ酸残基）からなる。 (3)該ムチン特異的ドメインにおける繰返し単位の数は
可変的であり、該繰返し単位の数に依存してMERMUCには
多型（polymorphism）が存在する。 (4)MERMUCの細胞質領域の末端でもあるＣ末端領域には
ロイシン繰返し領域が存在し、この繰返し構造はヒト、
マウス及びラットにおいて良く保存されている。 (5)MERMUCは、上記の一次構造を有する分子の単体（モ
ノマー）としても、また該分子の２以上が会合若しくは
結合してなる多量体（ダイマーやトリマーなどのオリゴ
マー）としても存在し得る。
【００３３】従って、本発明においてMERMUCとは、上述
のような構造的特徴（国際出願公開WO01/05803に既報の
特徴も含む）を備える分子を意味し、任意の多型並びに
単体（モノマー）及び多量体（ダイマー及びオリゴマー
など）のいずれの形態をも本発明に包含される。そのよ
うな多型が存在する本発明におけるヒトのMERMUCの一次
構造としては、例えば、配列番号10（細胞外領域：アミ
ノ酸番号1-199；膜貫通領域：アミノ酸番号200-220また
は221；細胞質領域：221または222乃至503。cDNA配列：
配列番号９）が挙げられる。上述のとおりヒトMERMUCに
は細胞外領域のムチン特異的ドメインの繰返し構造が異
なる多型が存在するものの細胞質領域は同一の構造であ
る。マウスのMERMUCの一次構造としては、配列番号12
（cDNA配列：配列番号11）が例示される。ラットのMERM
UCの一次構造（Ｎ末端を欠く）としては、配列番号14
（cDNA配列：配列番号13）が例示される。
【００３４】本発明における「MERMUCのＣ末端領域」と
は、MERMUCの細胞質領域のカルボキシル末端側のアミノ
酸配列であって、好ましくはロイシン繰返し構造を含む
領域である。ヒトのMERMUCにおいては、具体的には、Ｃ
末端の５３アミノ酸（配列番号15）を含む領域が挙げら
れる。
【００３５】本発明における「β-gal」、「β-galΔ
α」及び「β-galΔω」とは、各々下記に定義するとお
りの意味を有する。「β-gal」は、β-galactosidase
（lactase）の略称であり、乳糖（ラクトース；glucose
-β-D-galactoside）の分解及び合成を行う酵素であ
る。この酵素は、細菌から高等動植物まで幅広く分布し
ているが、構造及び最適pHなどは種により異なる。本発
明のβ-galは、いずれの種のβ-galも包含するが、特に
好ましくは大腸菌のβ-galである。
【００３６】大腸菌のβ-galをコードする構造遺伝子は
lacZと呼ばれる。大腸菌β-galの前駆体の一次構造は、
1024アミノ酸からなる（GenBank Accession Nos.:P0072
2；GBEC／J. Biol. Chem., Vol.253, No.15, p.5521-55
25, 1978; Bioorg. Khim., Vol.6, p.1735-1736, 1980;
Nature, Vol.285, No.5759, p.38-41, 1980; EMBO J.,
Vol.2, No.4, p.593-597, 1983; J. Mol. Biol., Vol.
208, No.1, p.23-43,1989; Gene, Vol.122, No.1, p.23
1-232, 1992; Nature, Vol.369, No.6483, p.761-766,
1994, Science, Vol.277, No.5331, p.1453-1474, 199
7）。該β-galの生物活性は、該一次構造を有する単量
体の４分子が集まったホモ四量体により発現される（な
お、大腸菌β-galの立体構造の解析により、各々のモノ
マー分子の一次構造は、N末の3アミノ酸が欠落した1021
アミノ酸からなることが報告されている。GenBanK Acce
ssion Nos.:13399708／Nature, Vol.369, No.6483, p.7
61-766, 1994; Protein Sci., Vol.8, No.1, p.122-13
6, 1999; Protein Sci., Vol.9, No.9, p.1685-1699, 2
000）。
【００３７】一方、大腸菌のβ-galについては、ある種
の大腸菌株において３種類の変異体、β-galΔα、β-g
alΔμ及びβ-galΔωが報告されている（Δは、欠落を
意味する。Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.93, p.1
2423-12427, 1996；Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vo
l.94, p.8405-8410, 1997）。該β-galΔαは、野性型
のβ-galの活性部位であるＮ末端配列の一部（GenBank
Accession Nos.:P00722のアミノ酸番号12−42）を欠落
している。該β-galΔμは、野性型β-galの中央部配列
の一部（GenBank Accession Nos.:P00722のアミノ酸番
号50−602）を欠落している。また、該β-galΔωは、
野性型β-galのモノマー分子がホモ四量体を形成するた
めの部位であるＣ末端配列の一部（GenBank Accession
Nos.:P00722のアミノ酸番号790-1024）が欠落してい
る。
【００３８】本発明における「β-galΔα」とは、野性
型のβ-gal（特に好ましくは大腸菌のβ-gal）の活性部
位であるＮ末端配列の一部を欠く任意の変異体（自然発
生物及び人工調製物を含む）を意味し、特に好ましくは
上述の既報の変異体β-galΔα（配列番号16）である。
本発明における「β-galΔω」とは、野性型β-galのモ
ノマー分子がホモ四量体を形成するための部位であるＣ
末端配列の一部を欠く任意の変異体（自然発生物及び人
工調製物を含む）を意味し、特に好ましくは上述の既報
の変異体β-galΔω（配列番号17）である。
【００３９】本発明の「一般式Ｗ−Ｘ−Ｙで表される融
合ポリペプチド」の定義における「c-Met」並びに「一
般式Ｚ−Ｙで表される融合ポリペプチド」の定義におけ
る「MEUMUC」は、各々上述したc-Met及びMERMUCと同様
の意味を有する。上記一般式Ｗ−Ｘ−Ｙで表される融合
ポリペプチドにおけるＹは、MERMUC以外の他の蛋白質の
全ポリペプチドの全長アミノ酸配列またはその一部を意
味する。ここで、該「他の蛋白質」とは、任意の蛋白質
を包含するが、好ましくはc-MetとMERMUCの結合の有無
または程度を測定可能たらしめる特性を有する蛋白質で
あり、特に好ましくは、上述のβ-galΔαまたはβ-gal
Δωを挙げることができる。上記一般式Ｗ−Ｘ−Ｙで表
される融合ポリペプチドにおけるＷは、MERMUC以外の他
の蛋白質の全ポリペプチドの全長アミノ酸配列またはそ
の一部を意味する。ここで、該「他の蛋白質」とは、任
意の蛋白質を包含するが、好ましくはMERMUCの多量体化
の有無または程度を測定可能たらしめる特性を有する蛋
白質であり、特に好ましくは、マウス、ラットまたはヒ
トのFasを挙げることができる（<マウス>GenBank Acces
sion No.P25446及びNP 032013； <ヒト>GenBank Acces
sionNo.P25445; NP 000034）。上記一般式Ｚ−Ｙで表さ
れる融合ポリペプチドにおけるＹは、c-Met以外の他の
蛋白質の全ポリペプチドの全長アミノ酸配列またはその
一部を意味する。ここで、該「他の蛋白質」とは、任意
の蛋白質を包含するが、好ましくはc-MetとMERMUCの結
合の有無または程度を測定可能たらしめる特性を有する
蛋白質であり、特に好ましくは、上述のβ-galΔαまた
はβ-galΔωを挙げることができる。
【００４０】なお、本発明に係るポリペプチドあるいは
融合ポリペプチドにおいては、所望の性質を有するかま
たは所望の目的を達成する限り、アミノ酸配列中の複数
個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特
に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が置換、欠失及び／
または修飾されていてもよく、または該アミノ酸配列
に、複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミ
ノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が付加され
ていてもよい。
【００４１】本発明における「HGF医薬」とは、上記に
定義した肝細胞増殖因子（hepatocyto growth factor;
HGF）、特に好ましくはヒトのHGFを生体（特に好ましく
はヒト）に供給するための医薬であって、「蛋白医薬」
または「DNA医薬」が挙げられる。該蛋白医薬とは、HGF
（特に好ましくはヒトHGF。細胞培養物からの精製HGFま
たは組換えHGFのいずれであってもよい。)の蛋白質と薬
学上許容される担体とからなる医薬品である。
【００４２】該DNA医薬とは、HGF（特に好ましくはヒト
のHGF)をコードする遺伝子（cDNAまたはgenimic DNA）
を含む「DNA構造体」と薬学上許容される担体とからな
る医薬品であり、いわゆる遺伝子治療に用いられる医薬
を意味する。ここで、該DNA構造体は、該HGFをコードす
る遺伝子が宿主（即ち、本DNA医薬が投与される生
体。）の細胞内（特に好ましくは筋肉細胞）において発
現可能なように挿入されているものを意味し、例えば、
該HGF遺伝子を含むプラスミドベクター及びウイルスベ
クターなどが挙げられる。本発明においては、該ベクタ
ーは、遺伝子治療の分野において用いられている任意の
プラスミドベクター及びウイルスベクターを包含する。
【００４３】本発明を構成する「物質」または「被験物
質」とは、自然界に存在する天然の物質あるいは人工的
に調製される任意の物質を意味し、具体的には、化学合
成物（低分子化合物など）、ポリペプチド（天然体、組
換え体、培養物など）、抗体、ＤＮＡ及びＲＮＡが包含
される。
【００４４】本発明における「c-MetとMERMUCとの結合
を阻害する活性を有する物質」とは、c-MetとMERMUCの
結合を阻害する活性を有する物質である限り任意の物質
が包含される。従って、本発明においては、該物質がc-
MetとMERMUCとの結合の阻害活性を発揮するためのメカ
ニズム（阻害機序）も何ら限定されるものではない。具
体的には、該物質には、例えば、下記のような阻害メカ
ニズムによる物質を挙げることができる。しかしながら
本発明の該物質が、下記のような物質に限定されるもの
ではないことは言うまでもない。
【００４５】(1)c-Met上のMERMUCとの結合部位またはそ
の近傍（立体的な空間を含む）に直接的に結合すること
によりc-MetとMERMUCとの結合を阻害する物質。 (2)MERMUC上のc-Metとの結合部位またはその近傍（立体
的な空間を含む）に直接的に結合することによりc-Met
とMERMUCとの結合を阻害する物質。 (3)MERMUCの任意の領域（例えば、細胞外領域）に結合
することによりMERMUCの立体構造を変化させるかあるい
はMERMUCの多量体化を阻害する結果としてc-MetとMERMU
Cとの結合を阻害する物質（例えば、MERMUCに結合する
抗体。）。 (4)既に結合しているc-MetとMERMUCとの結合を解離させ
ることにより結果としてc-MetとMERMUCとの結合を阻害
する物質。
【００４６】本発明における「MERMUCの多量体化を阻害
する活性を有する物質」とは、MERMUC分子の自己会合や
結合による多量体化を阻害する活性を有する物質である
限り任意の物質が包含される。従って、本発明において
は、該物質がMERMUC分子の多量体化の阻害活性を発揮す
るためのメカニズム（阻害機序）も何ら限定されるもの
ではない。具体的には、該物質には、例えば、下記のよ
うな阻害メカニズムによる物質を挙げることができる。
しかしながら本発明の該物質が、下記のような物質に限
定されるものではないことは言うまでもない。
【００４７】(1)2以上のMERMUC分子が自己会合するため
に結合する部位（特には細胞質領域）またはその近傍
（立体的な空間を含む）に直接的に結合することにより
MERMUCの自己会合（多量体化）を阻害する物質。 (2)MERMUCの任意の領域（例えば、細胞外領域）に結合
することによりMERMUCの立体構造を変化させるかあるい
はMERMUCの多量体化を阻害する結果として2以上のMERMU
C分子の自己会合（多量体化）を阻害する物質（例え
ば、MERMUCに結合する抗体。）。
【００４８】本発明における「MERMUCの発現を抑制また
は阻害する物質」とは、MERMUC分子の細胞膜上での発現
を抑制または阻害する活性を有する物質である限り任意
の物質が包含される。従って、本発明においては、該物
質が該阻害活性を発揮するためのメカニズム（阻害機
序）も何ら限定されるものではない。具体的には、該物
質には、例えば、下記のような阻害メカニズムによる物
質を挙げることができる。しかしながら本発明の該物質
が、下記のような物質に限定されるものではないことは
言うまでもない。
【００４９】(1)MERMUCをコードする遺伝子のmRNAへの
転写を抑制または阻害する物質。 (2)MERMUCをコードするmRNAの蛋白質への翻訳を阻害ま
たは抑制する物質。 上記(1)には、後述のアンチセンスDNAだけでなく、MERM
UCをコードする遺伝子のmRNAへの転写を制御するプロモ
ーター及び／または転写因子の活性を制御する活性を有
する物質も包含される。本発明の「医薬組成物」を構成
する上述の「物質」に包含される化学合成物（低分子化
合物など）、ポリペプチド、抗体、ＤＮＡ及びＲＮＡの
各々は下記のように定義される。
【００５０】該「抗体」としては、MERMUC（特に好まし
くはヒトのMERMUC）に結合するポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の一部が
挙げられる。好ましくはモノクローナル抗体またはその
一部である。該モノクローナル抗体には、非ヒト哺乳動
物由来のモノクローナル抗体だけでなく、組換えキメラ
モノクローナル抗体（実験医学（臨時増刊号）、第1.6
巻、第10号、1988年及び特公平3-73280号公報等）、組
換えヒト型モノクローナル抗体及びヒトモノクローナル
抗体（Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Natur
e Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特表平4-50436
5号公報；特表平7-509137号公報；日経サイエンス、６
月号、第40〜第50頁、1995年；国際出願公開WO94/25585
号公報；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994；及び特表
平6-500233号公報；日系サイエンス、1997年４月号、第
78頁乃至84頁など）が包含される。
【００５１】該「ポリペプチド」（ここでは、本発明の
医薬組成物の構成要素としてのポリペプチドを意味し、
他の発明としてのポリペプチド自体を意味するものでは
ない。）は、オリゴペプチド、融合ポリペプチド、及び
それらの化学修飾体が包含される。オリゴペプチドとし
ては、５乃至30個のアミノ酸、好ましくは５乃至20個の
アミノ酸からなるペプチドを挙げることができる。該化
学修飾は、生体に投与された場合の血中半減期の増大あ
るいは経口投与時における消化管での分解に対する耐性
若しくは吸収性の増大の目的等の種々の目的に応じて設
計することができる。
【００５２】該「DNA」とは、MERMUCをコードするDNA
（cDNA及びゲノミックDNAを含む）の塩基配列を基に設
計されるアンチセンスDNA医薬として有用な「該DNAの部
分塩基配列を含むDNAあるいはそれらを化学修飾した化
学修飾DNA」を意味する。即ち、該アンチセンスDNAは、
MERMUCをコードする遺伝子またはRNAにハイブリダイズ
することにより、該MERMUCをコードする遺伝子のmRNAへ
の転写あるいは該mRNAの蛋白への翻訳を阻害することが
できる。
【００５３】該「RNA」とは、前述のMERMUCをコードす
るRNAの塩基配列を基に設計されるアンチセンスRNA医薬
として有用な「該RNAの部分塩基配列を含むRNAあるいは
それらを化学修飾した化学修飾RNA」を意味する。該ア
ンチセンスRNAは、該MERMUCをコードする遺伝子またはR
NAにハイブリダイズすることにより、該MERMUCをコード
する遺伝子のmRNAへの転写あるいは該mRNAの蛋白への翻
訳を阻害することができる。
【００５４】ここで、「部分塩基配列」とは、任意の部
位における任意の数の塩基からなる部分塩基配列を意味
する。該部分塩基配列としては、連続した５乃至100塩
基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した５
乃至70塩基の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した
５乃至50塩基の部分塩基配列、より好ましくは連続した
５乃至30塩基の部分塩基配列が挙げられる。
【００５５】また、該DNAまたはRNAをアンチセンス医薬
として用いる場合には、該DNAまたはRNAが患者の体内に
投与された場合の血中半減期の増大（安定性）、細胞内
膜の透過性の増大、あるいは経口投与の場合の消化器官
での分解耐性の増大若しくは吸収の増大などの目的のた
めに、該DNAまたはRNAの塩基配列の一部に化学修飾を施
すことが可能である。化学修飾としては、例えば、オリ
ゴヌクレオチドの構造中のリン酸結合、リボース、核酸
塩基、糖部位、3’及び／または5’末端等の化学修飾が
挙げられる。
【００５６】リン酸結合の修飾としては、１以上の該結
合を、ホスホジエステル結合（D-オリゴ）、ホスホロチ
オエート結合、ホスホロジチオエート結合（S-オリ
ゴ）、メチルホスホネート結合（MP-オリゴ）、ホスホ
ロアミデート結合、非リン酸結合及びメチルホスホノチ
オエート結合のいずれかまたはそれらの組み合わせへの
変更を挙げることができる。リボースの修飾としては、
2'-フルオロリボースあるいは2'-O-メチルリボースへな
どへの変更を挙げることができる。核酸塩基の修飾とし
ては、5-プロピニルウラシルまたは2-アミノアデニンな
どへの変更が挙げられる。
【００５７】「化学合成物」または「低分子化合物」と
は、上述の抗体、ポリペプチド、DNA及びRNAを除く任意
の化合物であって、分子量約100乃至約1000以下の化合
物、好ましくは分子量約100乃至約800の化合物であり、
より好ましくは分子量約100乃至約600の化合物を挙げる
ことができる。上述したポリペプチド、該ポリペプチド
の一部（断片）及び融合ポリペプチドは、後述するよう
な遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方
法等のような当該技術的分野において知られる公知の方
法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造す
ることができる。
【００５８】本発明における「MERMUCに結合する抗体」
は、MERMUC（特に好ましくはヒトMERMUC）を発現する細
胞（天然の細胞、株化細胞、腫瘍細胞など）、MERMUC
（特に好ましくはヒトMERMUC）をその細胞表面に高発現
するように遺伝子組換技術を用いて作製された形質転換
体、MERMUC特に好ましくはヒトMERMUC）を構成するポリ
ペプチド（特に好ましくは細胞外領域を構成するポリペ
プチド）、または該MERMUCの細胞外領域の全部または一
部と他の蛋白質の全部若しくは一部（ヒトIgFc、グルタ
チオン-S-トランスフェラーゼ、Hisタグ、β-galactosi
daseなど）とからなる融合ポリペプチドを抗原として用
い、該抗原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット
あるいはウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型
抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体
及びヒト型抗体（CDR-grafted抗体）、並びにヒト抗体
産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒ
ト抗体も包含する。
【００５９】モノクローナル抗体には、IgG、IgM、Ig
A、IgDあるいはIgEのいずれのアイソタイプを有するモ
ノクローナル抗体もが包含される。好ましくは、IgGま
たはIgMである。ポリクローナル抗体（抗血清）あるい
はモノクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法によ
って製造することができる。即ち、例えば、前述のよう
な抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freu
nd's Adjuvant）と ともに、哺乳動物、好ましくは、マ
ウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネ
コ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好まし
くはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウ
サギに免疫する。ポリクローナル抗体は、該免疫感作動
物から得た血清から取得することができる。またモノク
ローナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細
胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細
胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマを
クローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特
異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクロー
ンを選択することによって製造される。
【００６０】モノクローナル抗体は、具体的には下記の
ようにして製造することができる。即ち、前述のような
抗原を免疫原とし、該免疫原を、必要に応じてフロイン
トアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、非ヒ
ト哺乳動物、具体的には、マウス、ラット、ハムスタ
ー、モルモ ットあるいはウサギ、好ましくは マウス、
ラットあるいはハムスター（後述するヒト抗体産生トラ
ンスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産
生するように作出されたトランスジェニック動物を含
む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるい
は腹腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植すること
により免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１
４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃
至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞
が取得される。免疫を施す回数及び時間的インターバル
は、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更するこ
とができる。
【００６１】モノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法
（ネイチャー(Nature)、第２５６巻、第４９５〜第４９
７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾方法に従って
行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された非
ヒト哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄ある
いは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞
と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスタ
ー、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマ
ウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミ
エローマ細胞との細胞融合させることにより調製され
る。
【００６２】細胞融合に用いられるミエローマ細胞とし
ては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（65
3）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.U1（P3U
1）、SP2/0-Ag14（Sp2/O、Sp2）、PAI、F0あるいはBW51
47、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来
ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-
AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用することができる。
【００６３】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、
例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見
られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫
抗原に対する反応性を、例えばRIAやELISA等の酵素免疫
測定法によって測定することにより行なうことができ
る。
【００６４】ハイブリドーマからのモノクローナル抗体
の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウ
ス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、
好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウス
の腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、ま
たは哺乳動物の腹水から単離することにより行うことが
できる。
【００６５】インビトロで培養する場合には、培養する
細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条
件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存さ
せ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるため
に用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培
地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施す
ることが可能である。
【００６６】基本培地としては、例えば、Ham'F12培
地、MCDB153培地あるいは低カルシウムMEM培地等の低カ
ルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D-MEM培地、R
PMI1640培地、ASF104培地あるいはRD培地等の高カルシ
ウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、
例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々
無機あるいは有機物質等を含有することができる。
【００６７】モノクローナル抗体の単離、精製は、上述
の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユ
ーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、
イオン交換クロマトグラフィー（DEAEまたはDE52等）、
抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム
等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供するこ
と等により行うことができる。
【００６８】本発明における「抗体の一部」とは、前述
のようなモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、
具体的にはF(ab')２、Fab'、Fab、Fv（variable fragme
nt of antibody）、sFv、dsFv（disulphide stabilised
Fv）あるいはdAb（single domain antibody）などを意
味する（Exp. Opin. Ther. Patents，Vol.6, No.5, p.4
41-456, 1996）。
【００６９】本発明において「薬学的に許容され得る担
体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、
保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘
稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等で
ある。そのような担体の一つ以上を用いることにより、
錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル
剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいは
シロップ剤等の形態の本発明の医薬組成物を調製するこ
とができる。本発明の医薬組成物は、経口あるいは非経
口的に投与することができる。非経口投与のためのその
他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含
み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のため
の坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
【００７０】本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年
齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時
間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分（前記
の本発明に係る「物質」など）の種類などにより異なる
が、通常成人一人当たり、一回につき10μgから1000mg
（あるいは10μgから500mg）の範囲で投与することがで
きる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動す
るため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、
また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
【００７１】とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食
塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に
許容され得る担体中に0.1μｇ抗体／ml担体乃至10mg抗
体／ml担体の濃度となるように溶解または懸濁すること
により製造することができる。このようにして製造され
た注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の
投与において１kg体重あたり、１μｇ乃至100mgの割合
で、好ましくは50μｇ乃至50mgの割合で、１日あたり１
回乃至数回投与することができる。投与の形態として
は、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射ある
いは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示で
きる。好ましくは静脈内注射である。
【００７２】また、注射剤は、場合により、非水性の希
釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、オリーブ油のような植物油、エタノールのよう
なアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調
製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バ
クテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合
または照射により行うことができる。注射剤は、用時調
製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥
法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の
注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することが
できる。
【００７３】本発明の医薬組成物は、単独または上述の
HGF医薬との併用により、種々の疾患の予防・治療に必
須である組織及び器官など修復、再生若しくは新生の維
持または増強を達成することが可能である。従って、本
発明の医薬組成物を単独または上述のHGF医薬と併用す
ることにより、現在もその治療が困難とされている種々
の難治性疾患（例えば、肝線維症、肝硬変、劇症肝炎、
ウイルス性肝炎、急性肝炎、慢性腎不全、腎線維症及び
肺線維症など）の治療が可能となる。本発明の医薬組成
物（医薬A）のHGF医薬（医薬B）との併用においては、
治療の目的により、医薬A及び医薬Bを、任意の順序でま
た任意の投与形態で患者に投与することが可能である。
【００７４】本発明の医薬組成物を単独で用いる場合に
は、該医薬組成物に含まれる活性成分がHGF受容体であ
るc-MetとMERMUCとの結合により起こるHGF活性のダウン
レギュレーションを取り除くことにより、患者の生体に
内在するHGFが元々有する生物活性が引き出されること
により当該治療効果が達成され得る。一方、本発明の医
薬組成物を上述のHGF医薬と併用する場合には、該医薬
組成物に含まれる活性成分がHGF受容体であるc-MetとME
RMUCとの結合により起こるHGF活性のダウンレギュレー
ションを取り除くことにより、上述のような疾患の治療
に用いられるHGF医薬の用量は必要最小限に抑えること
が可能となる。
【００７５】本発明において「線維症」とは、任意の器
官における組織線維症が包含され、特に好ましくは、例
えば肺線維症、肝線維症または腎線維症が挙げられる。
本発明において肝炎とは、任意の原因によって惹起され
る肝臓における任意の炎症が包含されるが、特に好まし
くは、劇症肝炎、急性肝炎（ウイルスや薬剤による肝臓
毒等により惹起される炎症）またはウイルス性肝炎（種
々のウイルス、特にはＣ型肝炎などの肝炎ウイルスによ
り惹起される炎症）が挙げられる。本発明の医薬組成物
は、その治療のために組織の再生や新生が必要とされる
任意の疾患の治療（予防を含む）に用いることができる
が、特に好ましくは、種々の肝臓疾患（例えば、肝線維
症、肝硬変、劇症肝炎、ウイルス性肝炎、急性肝炎な
ど）、腎臓疾患（例えば、慢性腎不全、腎線維症など）
及び肺疾患（例えば、肺線維症など）である。このよう
な疾患は、いずれも難治性疾患の代表的なものであり、
換言すれば、本発明の医薬組成物はそのような難治性疾
患の治療または予防に有用である。
【００７６】本発明はまた、「c-MetとMERMUCとの結合
を阻害する活性を有する物質（上記定義に同じ。）を同
定する方法」並びに「ある物質のc-MetとMERMUCとの結
合を阻害する活性の有無または程度を試験する方法」に
関し、該方法は例えば下記の工程を包含する。 （ａ）c-Met及びMERMUCを共に発現し、該c-Met及びMERM
UCが結合した場合に該結合を検出可能なように設計され
た細胞を調製する工程； （ｂ）工程(a)で得た細胞をHGFの存在下で且つ被験物質
の不存在下で培養した後、該細胞におけるc-Met及びMER
MUCの結合の程度を測定する工程； （ｃ）工程(b)で得た細胞をHGF及び被験物質の存在下で
培養した後、該細胞におけるc-Met及びMERMUCの結合の
程度を測定する工程； （ｄ）工程(b)の測定結果と工程(c)の測定結果を比較す
る工程。
【００７７】ここで、工程（ａ）に係る細胞の作製にし
ようされる宿主細胞としては、組換え蛋白質の製造にお
いて通常用いられ細胞であれば特に限定されず、天然細
胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞
（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、
酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞
または昆虫細胞などのいずれをも包含する。さらに具体
的には、大腸菌（DH5α、TB1、HB101等）、マウス由来
細胞（COP、L、C127、Sp2/0、NS-1またはNIH3T3等）、
ラット由来細胞（PC12,PC12h)、ハムスター由来細胞（B
HK及びCHO等）、サル由来細胞（COS1、COS3、COS7、CV1
及びVelo等）およびヒト由来細胞（Hela、２倍体線維芽
細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびHepG2等）
などのいずれであっても良い。特に好ましくは上記のよ
うな動物細胞である。
【００７８】工程（ａ）に係るc-Met（全長またはその
一部）としては、好ましい例として、上記に定義したヒ
トc-Metの全部または一部（特に好ましくは少なくとも
ヒトMERMUCとの結合部位を含む）とβ-galΔα若しくは
β-galΔωとの融合ポリペプチドが挙げられる。工程
（ａ）に係るMERMUC（全長またはその一部）としては、
好ましい例として、上記に定義したヒトMERMUCの全部ま
たは一部（特に好ましくは少なくともヒトc-Metとの結
合部位を含む）とβ-galΔα若しくはβ-galΔωとの融
合ポリペプチドが挙げられる。上記の融合ポリペプチド
を用いることにより、MERMUCとの結合の有無、程度また
は増減を細胞試料中で発現されるβ-ガラクトシダーゼ
活性として検出可能となる（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA., Vol.94, p.8405-8410, 1997）。
【００７９】上記本発明の方法を用いる化合物の同定ま
たは試験は、マニュアル作業でも可能であるが、機械
（ロボット）を用いて自動で行う所謂ハイスループット
スクリーニング（High Throughput Screening）（組織
培養工学, Vol.23, No.13, p.521-524；米国特許第5,67
0,113号）を用いることによりより迅速、簡便に行うこ
とができる。該本発明の方法により同定された物質は、
上述の本発明の医薬組成物の活性成分として用いられ
る。
【００８０】以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに
限定されるものではないことは言うまでもない。
【００８１】実施例１ ヒトMERMUCと結合する分子の同
定 ヒトのゲノムを解析した結果、ヒトMERMUCをコードする
遺伝子は、第３染色体上に存在し、３つのエクソン(Ex.
-1、Ex.-2、Ex.-3)より構成されることが明らかとなっ
た。ヒト及びマウスの各々のMERMUCポリペプチドの一次
構造（アミノ酸配列）を、該エクソン毎に比較したとこ
ろ、Ex.-1に対応する領域での相同性は約30%と低いもの
の、Ex.-2及びEx.-3に対応する領域（各々約５０アミノ
酸からなる）では各々71％及び60％と非常に高い相同性
が認められた。このことから、MERMUCポリペプチドの一
次構造に基づく限り、MERMUCの細胞質領域のC末端領域
に相当するこの領域にMERMUCの機能の発現における何ら
かの重要性が存在する可能性が推測された。
【００８２】そこで、MERMUCの機能を明らかにする目的
で、MERMUCの細胞質領域内のＣ末端領域に結合する分子
の有無を明らかにするとともに、当該分子の同定を試み
た。当該試験は、酵母２−ハイブリッド法（yeast 2-hy
brid system；Proc. Natl.Acad. Sci. USA., Vol.88,
p.9578-9582, 1991)により、ベイト（bait；即ち、釣り
餌。）としてのヒトMERMUCのＣ末端領域に対応するcDNA
を用いてヒト腎臓cDNAライブラリーをスクリーニングす
ることにより行った。Ex.-2及びEx.-3の各々をコアとし
て２種類のベイト（ベイト-2及びベイト-3）をデザイン
した。ベイト-2はＣ末端の123アミノ酸部分（ベイト-
2）に対応し、ベイト-3はＣ末端の65アミノ酸（ベイト-
3）に対応する。
【００８３】両ベイトは、これらをヒトMERMUCの全長を
コードするcDNA（配列番号９）を鋳型として常法に従っ
てPCR（polymerase chain reaction）により調製した。
該PCRに用いた該２種類の正方向（forward）プライマー
（<ベイト-2>配列番号18；<ベイト-3>配列番号19）はと
もに5'末端にEcoRIサイトを有し、両ベイトに共通な逆
方向（reverse）プライマー（配列番号20）は5'末端にS
alIサイトを有する。
【００８４】各々のPCR産物を制限酵素EcoRIとSalIで消
化して得られたDNA断片の各々を、pGBKT7ベクター（ロ
イシン合成系遺伝子をマーカーとする。CLONTECH製）の
EcoRI/SalIサイトへ挿入してベイトベクターの各々を得
た。これらのベイトベクター内の遺伝子が酵母内で発現
して産生される蛋白は、酵母転写因子GAL4のDNA結合領
域（GAL4-DB）との融合蛋白質（「融合蛋白質Ａ」）と
して産生される。一方、該ベイトベクターでスクリーニ
ングするヒト腎臓由来cDNAライブラリー（CLONTECH製）
の各々のcDNAは、pADKベクター（トリプトファン合成系
遺伝子をマーカーとする）に挿入されており、各cDNAが
酵母内で発現して産生される蛋白は、GAL4の転写活性化
領域（GAL4-AD）との融合蛋白質（「融合蛋白質Ｂ」）
として産生される。
【００８５】宿主としての酵母は、AH109株（ロイシン、
トリプトファン、ヒスチジン、アデニン要求性酵母；CLON
TECH製）を使用した。該酵母は、GALプロモーター制御
下にある３種類の遺伝子、即ちヒスチジン合成系遺伝
子、アデニン合成系遺伝子及びβ-ガラクトシダーゼ遺
伝子を染色体上に有する。ベイト蛋白質（該融合蛋白質
Ａ）プレイ蛋白質(該融合蛋白質Ｂ)が結合する結果、GA
L4-DBとGAL4-ADが融合し転写因子としての機能を回復す
る。この結果、３種の遺伝子の発現が誘導され、宿主酵
母ではヒスチジン及びアデニン要求性を解消されると同
時に、β-ガラクトシダーゼ（β-galactosidase; β-ga
l）活性が出現する。
【００８６】該スクリーニングのために、各々のベイト
ベクターを、上記cDNAライブラリープラスミド（１プー
ルあたり、50,000クローン。）と共に酵母AH109株へポ
リエチレングリコール/酢酸リチウム法により導入した
（J. Bacteriol., Vol.153, p.163-168, 1983; Curr. G
enet., Vol.16, p.339-346, 1989; Nucleic Acids Re
s., Vol.19, p.5791, 1991; Nucleic Acids Res.,Vol.2
0, p.1425, 1992)。
【００８７】本スクリーニングにおいては、目的の形質
転換がされた酵母の第一次選抜の指標をヒスチジン合成
系遺伝子の発現によるヒスチジン非要求性の獲得とし
た。従って、プラスミドを導入した後の酵母は、ロイシ
ン、トリプトファン及びヒスチジンを欠除させた形質転
換体選抜用の酵母最小培地(SD/-Leu,-Trp,-His)上で30
℃で５日間培養した。該培養によりプレート上に生育し
た形質転換酵母を爪楊枝で拾い上げ、目的クローンの第
二次選抜を行うための下記３種類のプレートの各々に接
種し30℃で５日間の培養した。 <A> ロイシン、トリプトファン及びヒスチジンを欠除さ
せた酵母最小培地(SD/-Leu,-Trp,-His)を含むプレー
ト。 <B> ロイシン、トリプトファン及びアデニンを欠除させ
た酵母最小培地(SD/-Leu,-Trp,-Ade)を含むプレート。 <C> ロイシン及びトリプトファンを欠除させ、のα-X-
gal（20μg/ml）を添加した酵母最小培地(SD/-Leu,-Tr
p,+X-gal)を含むプレート。
【００８８】上記<A>及び<B>のプレートのいずれもで成
育し（ヒスチジン及びアデニン非要求性の獲得）、且つ
<C>(α-X-gal添加分)のプレート上でコロニーが青色を
呈する（β-ガラクトシダーゼ活性が出現）を陽性クロ
ーンとし、４つのプレイcDNAクローン（クローンNo.3-3
09; No.3-312; No.2-22; 及びNo.2-211）を選出した。
該陽性酵母クローンが有するプレイcDNA断片を保持する
プラスミドは、マーシルとヒギンスら（Marcil,R. ＆ H
iggins,D.R.）の方法（Nucleic Acids Res., Vol.20,
p.917, 1992）で酵母から大腸菌へ転移させた。該大腸
菌からプラスミドDNAを回収後、プレイcDNAに相当する
部分のDNA断片の塩基配列をジデオキシ法による塩基配
列決定作業で解読した。決定されたプレイcDNAの塩基配
列を基に、汎用されている遺伝子データベースを用いて
検索及びデータ解析を行った。
【００８９】その結果、該４つの陽性クローンの内の２
つのクローン（No.3-309及び3-312）に由来する蛋白
は、いずれもベイト-2及びベイト-3に由来する蛋白の両
方に結合能を有し、ヒトHGFの受容体であるc-Metのβ鎖
のＣ末端領域に対応するものであった。クローンNo.3-3
09は、ヒトc-Metのβ鎖のＣ末端の91アミノ酸（配列番
号４のアミノ酸番号993-1083）に対応し、クローンNo.3
-312は、該Ｃ末端の89アミノ酸（配列番号４のアミノ酸
番号995-1083）に対応する。また他の２つの陽性クロー
ン（No.2-22及び2-211）に由来する蛋白は、ベイト-２
に由来する蛋白に結合能を有し、ヒトMERMUC自身のＣ末
端領域に対応するものであった。クローンNo.2-22は、
ヒトMERMUCのＣ末端の93アミノ酸（配列番号10のアミノ
酸番号411-503）に対応し、クローンNo.2-211は、該Ｃ
末端の56アミノ酸（配列番号10のアミノ酸番号448-50
3）に対応する。
【００９０】実施例２ MERMUC全長蛋白とHGF受容体c-M
et全長蛋白との結合 <2-1> 薬剤で発現調節可能なMERMUC発現組換え細胞の
作製 既報のテトラサイリン調節性発現システム（Tetracycli
ne-controllable expression system; Tet System）を
利用して、ドキシサイクリン（Dox; Doxicycline）によ
りヒトMERMUC遺伝子の発現を調節できる組換え細胞を調
製した。具体的には、該組換え細胞は、MERMUC遺伝子の
発現が培養系に存在するDoxの濃度に依存して抑制され
るという特徴（Tet-Offシステム）を有するものであ
る。該細胞の調製には、市販のpBI-Lベクター、pTK-Hyg
ベクター及びHEK293 Tet-Off細胞（全てCLONTECH製）を
用い、実験操作は該実験ツールに添付の実験操作説明書
に従って行った。
【００９１】即ち、ヒトMERMUCの全長をコードするcDNA
（配列番号９）をpBI-Lベクターのマルチクローニング
サイトに挿入してMERMUC発現ベクターを調製した。次い
で、該MERMUC発現ベクターとpTK-HygベクターによりHEK
293 Tet-Off細胞を共形質転換した（ヒト腎臓由来のHEK
293細胞株はヒトHGF受容体c-Metを発現している。）。
細胞のハイグロマイシン耐性の有無を指標として該MERM
UC発現ベクターが安定的に導入された細胞株を選択し
た。さらに、該選別細胞群の中からMERMUC遺伝子の発現
効率が高く、且つ該発現がDoxにより正確に制御可能な
特性を有する細胞株（MERMUC/293細胞命名。）を選別し
た。なお、該選別は、発現したMERMUC蛋白を抗ヒトMERM
UCポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティン
グで解析して行った。
【００９２】<2-2> 免疫沈降試験によるヒトMERMUCと
ヒトHGF受容体c-Metとの結合の解析前記のとおり作製し
たMERMUC/293細胞から調製される細胞可溶化物（cell l
ysate）に抗ヒトc-Met抗体を加えて免疫沈降処理を行
い、MERMUC全長蛋白がHGF受容体c-Met全長蛋白と共に免
疫沈降されるかで両者の結合を評価した。本試験で用い
るヒトMERMUCに対するポリクローナル抗体は、常法に従
って、Ｎ末近傍の１７アミノ酸（配列番号21）に相当す
るペプチドをウサギに免疫して調製した。一方、ヒトc-
Metに対する抗体は市販のポリクローナル抗体h-Met(C-2
8)（sc-161；Santa Cruz Biotechnology製）を用いた。
【００９３】MERMUC/293細胞から調製される細胞可溶化
物に該抗ヒトc-Metポリクローナル抗体を加えて反応さ
せた。該反応溶液を、マイクロビーズを結合させたprot
ein-G Sepharoseと反応させた後、遠心分離に供し、c-M
etと抗c-Metポリクローナル抗体との複合体を免疫沈降
させた。次いで、該沈殿物を電気泳動用バッファーに溶
解し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAG
E）により、該バッファー中に溶解した試料を分離した
後、常法に従って抗ヒトMERMUCポリクローナル抗体を用
いてウェスターンブロッティングを行った。その結果、
抗ヒトc-Metポリクローナル抗体で免疫沈降した蛋白質
中にヒトMERMUCの存在が認められた（図１）。この結果
は、MERMUC（全長）とHGF受容体c-Met（全長）との結合
を実際の細胞において再現するものであり、MERMUCが、
c-Metと結合することによりHGF/HGF受容体を介したシグ
ナル伝達を制御している可能性が示唆される。
【００９４】実施例３ 免疫共沈試験によるヒトMERMUC
の分子間の結合（多量体化）の解析 実施例１の結果から、MERMUC分子の分子間での結合活性
が推察されたことから、MERMUCの全長蛋白の分子間結合
の有無を解析した。
【００９５】<3-1> ヒトMERMUC全長発現ベクターの構
築 下記のようにして２種類のタグ（tag）付きヒトMERMUC
全長を発現する発現ベクターを構築した。一方はMERMUC
のＣ末端にFLAG-tagが付加したMERMUCの発現用であり、
他方は、polyHIS-tagが付加したMERMUCの発現用であ
る。各tag付きMERMUC蛋白の全長をコードするcDNAを、
ヒトMERMUC全長をコードするcDNA（配列番号９）鋳型と
して、常法に従ってＰＣＲにより調製した。該PCRに用
いるプライマーセットは下記を用いた。 ＜FLAG-tag付きMERMUC＞ 正方向プライマー ： 配列番号22 逆方向プライマー ： 配列番号23 ＜polyHIS-tag付きMERMUC＞ 正方向プライマー ： 配列番号22 逆方向プライマー ： 配列番号24
【００９６】得られた各々のPCR産物は、制限酵素HindI
II及びXhoIで消化後、pcDNA3ベクターのHindIII及びXho
Iサイトに挿入した後、大腸菌へ導入した。本試験で用
いる動物細胞発現用プラスミドの各々をこれらの形質転
換大腸菌より調製した。GeneJammer Transfection Reag
ent（STRATAGENE製）を用い該試薬に添付の実験操作説
明書に従って、上記で調製した２種類の発現プラスミド
の各々の等量ずつの混合物をHEK293細胞（ヒト腎臓由来
細胞株）に加え、37℃で48時間培養して共形質転換し
た。
【００９７】得られた形質転換細胞から調製した細胞可
溶化物（cell lysate）を、抗polyHISポリクローナル抗
体（Santa Cruz Biotechnology製）、抗FLAGモノクロー
ナル抗体（Anti-FLAG M2 monoclonal antibody; #F316
5; Sigma製）または対照モノクローナル抗体で免疫沈降
のための処理を施した。次いで免疫沈降した蛋白中での
FLAG-tag付きMERMUC及びpolyHIS-tag付きMERMUCの各々
の存在を、常法に従って、抗FLAGモノクローナル抗体及
び抗polyHISポリクローナル抗体を用いたウェスターン
ブロッティングで解析した。結果を図２に示す。その結
果、抗FLAGモノクローナル抗体で免疫沈降した場合に
は、FLAG-tag付きMERMUC及びpolyHIS-tag付きMERMUCの
両方が同定された。また、抗polyHISポリクローナル抗
体で免疫沈降した場合にも該両方のタグ付きMERMUCが同
定された。このことから、MERMUCは、細胞膜上でモノマ
ー分子が分子間結合して、多量体を形成し得ること（多
量体化）が示唆される。
【００９８】実施例４ ヒトMERMUCの組織発現分布 ヒトHGF受容体c-Metの発現は、肝臓、腎臓及び前立腺だ
けでなく小腸及び大腸などの消化器官で特に高いことが
報告されている（Int. J. Cancer, Vol.49, p.323-328,
1991； Oncogene, Vol.6, p.1997-2003, 1991）。 <4-1> ノーザンブロッティング法による解析 そこで、MERMUCとHGF受容体c-Metとの結合の生理学的意
義を解析するために、MERMUCの組織発現分布を常法に従
ってノーザンブロッティングにより解析した。
【００９９】本試験においては、ヒト組織由来のmRNA
（2μg/lane）をブロッティングした市販の３種類のメ
ンブレン(Human 12-lane MTN Blot、Human MTN Blot II
及びHuman Digestive MTN Blot。いずれもCLONTECH製）
を用いた。なお、プローブには、PCRで増幅して調製し
たヒトMERMUCの全長をコードするcDNA領域を含むDNA断
片（約1.5kpb）を用いた。ハイブリダイゼーションは、
65℃で一晩行った。ハイブリダイゼーション後のメンブ
レンの洗浄は、4×SSC（0.1% SDS）で15分及び2×SSC
（0.1% SDS）で15分間行った。結果を図３に示す。MERM
UCのmRNAに対応する約2.4kbのバンドは、腎臓、前立
腺、肝臓、肺及び胎盤、並びに小腸及び大腸などの消化
器官で認められ、この発現分布はHGF受容体c-Metの発現
分布と一致した。
【０１００】<4-2> PCR法による解析 さらに、一部の器官でのMERMUC遺伝子の発現について
は、PCRを用いる方法によっても解析した。即ち、ヒト
の脳、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、胎盤及び骨格筋の
各々に由来するcDNA（各0.2ng；Human Multiple Tissue
cDNA Panel I,CLONTECH製)を鋳型とし、正方向プライ
マー（配列番号25；Ex.-2の一部に対応する）及び逆方
向プライマー（配列番号26；Ex.-3の一部に対応する）
を用いたPCR（アニーリング温度：55℃で35サイクル）
により実施した。結果を図４に示す。その結果、腎臓、
肝臓、肺、胎盤及び膵臓においてMERMUC遺伝子の発現を
示す約400bpの増幅DNAバンドが検出され、当該臓器にて
MERMUC遺伝子の有意な発現が確認された。
【０１０１】<4-3> in situ ハイブリダイゼーション
による解析 HGF受容体c-Met遺伝子の腎臓組織内での発現について
は、腎尿細管の上皮細胞に存在し、細胞増殖や管腔形成
に関与することが報告されている（Biochem. Biophys.
Bres. Commun., Vol.174, p.831-838, 1991； Cell, Vo
l.67, p.901-908,1991）。そこで、マウスMERMUC遺伝子
の腎臓組織での発現分布をin situハイブリダイゼーシ
ョンにより解析した。市販のMRL-lpr/lprマウス（5週齢
または23週齢）及びC57BL/6マウス（23週齢）の各々の
腎臓組織から常法に従ってRNAハイブリダイゼーション
用の組織切片を作製した。in situハイブリダイゼーシ
ョンには、マウスMERMUCの全長（アミノ酸／配列番号1
1；cDNA／配列番号12）のＮ末端をコードする約500bpを
鋳型としたアンチセンスcRNAプローブまたはセンスcRNA
プローブを用いた。結果を図５に示す。その結果、マウ
スMERMUC遺伝子の腎臓組織での発現は、近位尿細管及び
遠位尿細管の上皮細胞に限局して認められ、既報のHGF
受容体c-Metの腎臓組織内での発現分布と一致すること
が明らかとなった。
【０１０２】実施例５ ヒトHGF受容体c-Met分子内のヒ
トMERMUC分子との結合領域の同定 本試験は、既報の酵母２−ハイブリッド法（yeast 2-hy
brid system；Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.88,
p.9578-9582, 1991)を用いて常法及び試薬に添付の実験
操作説明書に従い行った。前記実施例で同定したヒトME
RMUCの細胞質領域と結合能を有するヒトHGF受容体c-Met
のβ鎖のＣ末端領域の91アミノ酸（配列番号４のアミノ
酸番号993-1083）に対応するDNA（クローンNo.3-309）
を鋳型としたPCRにより、該91アミノ酸のＮ末端または
Ｃ末端のアミノ酸が様々な長さで欠失した種々の長さの
c-Metβ鎖のＣ末端領域に対応する下記７種類のDNA断片
を常法に従って作製した。
【０１０３】Ａ．ヒトc−Metβ鎖のＣ末端の91アミノ酸
のＮ末端の10アミノ酸を欠く領域（配列番号４のアミノ
酸番号1003-1083）に対応するＤＮＡ。 Ｂ．ヒトc−Metβ鎖のＣ末端の91アミノ酸のＮ末端の20
アミノ酸を欠く領域（配列番号４のアミノ酸番号1013-1
083）に対応するＤＮＡ。 Ｃ．ヒトc−Metβ鎖のＣ末端の91アミノ酸のＮ末端の30
アミノ酸を欠く領域（配列番号４のアミノ酸番号1023-1
083）に対応するＤＮＡ。 Ｄ．ヒトc−Metβ鎖のＣ末端の91アミノ酸のＣ末端10ア
ミノ酸を欠く領域（配列番号４のアミノ酸番号993-107
3）に対応するＤＮＡ。 Ｅ．ヒトc−Metβ鎖のＣ末端の91アミノ酸のＣ末端20ア
ミノ酸を欠く領域（配列番号４のアミノ酸番号993-106
3）に対応するＤＮＡ。 Ｆ．ヒトc−Metβ鎖のＣ末端の91アミノ酸のＣ末端30ア
ミノ酸を欠く領域（配列番号４のアミノ酸番号993-105
3）に対応するＤＮＡ。 Ｇ．ヒトc−Metβ鎖のＣ末端の91アミノ酸のＣ末端40ア
ミノ酸を欠く領域（配列番号４のアミノ酸番号993-104
3）に対応するＤＮＡ。
【０１０４】なお、該PCRに使用した正方向側プライマ
ーの5'末端にはEcoRIサイトを、また逆方向側プライマ
ーの5'末端にはSalIサイトを付加すべく設計した。PCR
により調製した各DNA断片を、pADKT7ベクター（トリプ
トファン合成系遺伝子をマーカーとして持つプレイ蛋白
用ベクター；CLONTECH製）のEcoRI/SalIサイトにGAL4-A
Dとin-frameとなるように挿入し、上記７種類にDNAの各
々が挿入されたプレイベクターを作製した。該７種類の
プレイベクターの各々を、実施例１で調製したヒトMERM
UCベイト-2ベクターと共に酵母AH109株に導入した。該
７種類のDNA断片に由来するc-Metプレイ蛋白とMERMUCベ
イト蛋白との結合能は、実施例１と同様の酵母2-ハイブ
リッド法で解析した。即ち、該ベクターを導入した酵母
の、2種類の酵母最小培地、即ち、(1)SD/-Leu,-Trp,-Hi
s培地及び(2)SD/-Leu,-Trp,-Ade培地の各々での生育の
有無に基づき判定した。
【０１０５】その結果、各c-Metプレイ蛋白（上記Ａ乃
至ＧのDNAに由来する）下記のとおりであった。 ＜プレイＤＮＡ＞ ＜MERMUCベイト蛋白との結合能＞ Ａ ＋ （結合する） Ｂ ＋ （結合する） Ｃ − （結合しない） Ｄ ＋ （結合する） Ｅ ＋ （結合する） Ｆ ＋ （結合する） Ｇ − （結合しない） 上記は即ち、MERMUCのＣ末端領域と結合することが判明
しているヒトc−Metβ鎖のＣ末端の91アミノ酸（実施例
１）のＮ末端から30アミノ酸残基またはＣ末端から40ア
ミノ酸残基が欠失されるとMERMUCとの結合能が消失する
ことを示している。
【０１０６】この結果から、MERMUCとの結合能を有する
c-Met分子上の領域（結合部位）は、上記各プレイペプ
チド間の共通部分であるc-MetのＣ末端から約30番目の
アミノ酸よりさらにＮ末端側の約40アミノ酸からなる領
域内（配列番号４のアミノ酸番号約1013-約1052。配列
番号５に同じ。）に存在することが明らかとなった。当
該領域には、HGFがHGF受容体c-Met結合して活性化され
た場合に自己リン酸化されるチロシン残基が2ヶ所含ま
れている（配列番号２のアミノ酸番号1349及び1356。配
列番号４のアミノ酸番号1042及び1049。）。
【０１０７】実施例６ ヒトMERMUC分子内のHGF受容体c
-Metβ鎖との結合領域の同定（その１） 本試験は、既報の酵母２−ハイブリッド法（前述の文献
に同じ。)を用いて常法及び試薬に添付の実験操作説明
書に従い行った。ヒトMERMUCの細胞質領域のＣ末端側の
領域がヒトc-MetのＣ末端領域と結合するという新知見
（実施例１）に基づき、下記3種類のMERMUCベイト蛋白
に対応するDNAを含むベイトベクターをPCRにより調製し
た。 Ａ．ヒトMERMUCの細胞質領域の全部、正確にはヒトMERM
UCの細胞質領域内に存するＣ末端から260アミノ酸（「C
260」と命名。配列番号10のアミノ酸番号244-503。）に
対応するDNA。 Ｂ．該C260のＣ末端の53アミノ酸が欠失した領域（「C2
60Δ53」と命名。配列番号10のアミノ酸番号244-45
0。）に対応するDNA。 Ｃ．該C260のＣ末端の53アミノ酸（「C53」と命名。配
列番号10のアミノ酸番号451-503。）に対応するDNA。
【０１０８】該PCRは、ヒトMERMUC全長をコードするcDN
A（配列番号９）を鋳型として、下記プライマーセット
を用いて実施した。 C260用プライマー ：配列番号27及び配列番号28の
各々に記載のDNA。 C260ΔC53用プライマー：配列番号29及び配列番号30の
各々に記載のDNA。 C53用プライマー ：配列番号31及び配列番号32の
各々に記載のDNA。 得られた各々のPCR産物であるDNAを、プラスミドpGBKT7
へ挿入してベイトベクターとした。各ベイトベクター
を、実施例１で同定したヒトHGF受容体c-Metプレイベク
ター（ヒトc-MetのC末端の91アミノ酸に対応するDNAを
含む。クローンNo.3-309）と共に酵母AH109株へ導入し
た。各ベイトベクター由来のMERMUCベイト蛋白のHGF受
容体c-Metβ鎖への結合能を、既述の酵母2-ハイブリッ
ド試験により解析した。
【０１０９】その結果、C260（MERMUCの細胞質領域のほ
ぼ全部を含む）及びC53（MERMUCの細胞質領域のＣ末端
の53アミノ酸）がともに、HGF受容体c-Metβ鎖との結合
活性を有していた。一方、C260からはC末端の53アミノ
酸を欠失させたC260ΔC53では、HGF受容体c-Metβ鎖と
の結合活性が完全に消失した。この結果から、MERMUCの
HGF受容体c-Metへの結合にはMERMUCのC末端部分、特に
Ｃ末端から約53アミノ酸を含む領域（配列番号10のアミ
ノ酸番号451-503。）が寄与することが明らかとなっ
た。
【０１１０】上記と同様にして酵母2-ハイブリッド法を
用いて、マウスMERMUC（アミノ酸／配列番号１２；cDNA
／配列番号１１）とマウスHGF受容体との結合の有無及
び両者の結合部位を解析した。マウスMERMUC及びマウス
HGF受容体の各々をコードするcDNAは、マウス腎臓由来R
NAからRT-PCR法でクローニングして調製した。その結
果、ヒトMERMUCとヒトc-Metとの間の結合と同様に、マ
ウスMERMUCのＣ末端の約53アミノ酸を含む領域でマウス
HGF受容体β鎖のＣ末端領域を結合することが明らかと
なった。この知見は、MERMUCのＣ末端の53アミノ酸を含
む領域のアミノ酸配列がヒト及びマウスの間で高い相同
性を有することに対する理由付けをするものであり、ま
た該Ｃ末端領域がHGF受容体との結合に動物種を超えて
重要であることが示すものである。
【０１１１】実施例７ ヒトMERMUC分子内のHGF受容体c
-Metβ鎖との結合領域の同定（その２） 前記実施例で明らかとなったヒトMERMUCのＣ末端領域に
存するHGF受容体c-Metとの結合領域（Ｃ末端から53アミ
ノ酸を含む領域）をさらに詳細に解析した。該解析は、
前記実施例と同様に酵母2-ハイブリッド法を用いて行っ
た。ベイト蛋白は、下記のヒトMERMUCのＣ末端領域の一
部（任意の連続する10アミノ酸）に対応させた。 Ａ．配列番号10のアミノ酸番号429-438（Ｂと５アミノ
酸重複） Ｂ．配列番号10のアミノ酸番号434-443（Ａ及びＣと各
々５アミノ酸重複） Ｃ．配列番号10のアミノ酸番号439-448（Ｂ及びＤと各
々５アミノ酸重複） Ｄ．配列番号10のアミノ酸番号444-453（Ｃ及びＥと各
々５アミノ酸重複） Ｅ．配列番号10のアミノ酸番号449-458（Ｄ及びＦと各
々５アミノ酸重複） Ｆ．配列番号10のアミノ酸番号454-463（Ｅ及びＧと各
々５アミノ酸重複） Ｇ．配列番号10のアミノ酸番号459-468（Ｆ及びＨと各
々５アミノ酸重複） Ｈ．配列番号10のアミノ酸番号464-473（Ｇ及びＩと各
々５アミノ酸重複） Ｉ．配列番号10のアミノ酸番号469-478（Ｈ及びＪと各
々５アミノ酸重複） Ｊ．配列番号10のアミノ酸番号474-483（Ｉ及びＫと各
々５アミノ酸重複） Ｋ．配列番号10のアミノ酸番号479-488（Ｊ及びＬと各
々５アミノ酸重複） Ｌ．配列番号10のアミノ酸番号484-493（Ｋ及びＭと各
々５アミノ酸重複） Ｍ．配列番号10のアミノ酸番号489-498（Ｌ及びＮと各
々５アミノ酸重複） Ｎ．配列番号10のアミノ酸番号494-503（Ｍと５アミノ
酸重複）
【０１１２】上記の各々のベイト蛋白（10アミノ酸）に
ついて、該蛋白をコードするセンス側DNA（5’末端にEc
oRIサイトを付加）及びアンチセンス側DNA（5’末端にS
alIサイトを付加）を合成し、アニーリングした後、各
々をプラスミドpGBKT7のEcoRI/SalIサイトへ挿入してベ
イトベクターを作製した。各ベイトベクターを、ヒトHG
F受容体c-Metプレイベクター（c-MetのＣ末端の91アミ
ノ酸をコードするDNAを含む。実施例１）と共に酵母AH1
09株に導入し、前記実施例と同様にして酵母2-ハイブリ
ッド判定法で各ベイト蛋白（ヒトMERMUCのＣ末端領域の
任意の10アミノ酸）のヒトc-Metβ鎖のＣ末端領域への
結合能を解析した。
【０１１３】その結果、前記実施例にて明らかにされた
c-Metβ鎖への結合活性に重要な領域であるＣ末端の53
アミノ酸の配列に属するベイト蛋白のみが、ヒトc-Met
β鎖のＣ末端領域への結合活性を有していた。この試験
結果からもヒトMERMUCのＣ末端の53アミノ酸領域がヒト
HGF受容体c-Metとの結合において極めて重要な役割を有
することが示された。さらに、当該Ｃ末端領域のアミノ
酸配列内でヒト/マウス/ラット間でよく保存されている
部分には、4アミノ酸残基ごとのロイシンが繰り返して
現れるロイシン繰返し構造が存在し、このロイシン繰返
し構造が、MERMUCとc-Metとの結合に重要な働きをして
いることが推察される。
【０１１４】実施例８ MERMUCとHGF受容体c-Metとの結
合を評価可能なアッセイ系の構築 β-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase; β-gal)は、
細菌から高等動植物まで幅広く分布する乳糖の分解／合
成酵素である。該β-galの生物活性は、該一次構造を有
する単量体の４分子が集まったホモ四量体により発現さ
れる。とくに、大腸菌のβ-gal（遺伝子はlacZ）は、よ
く研究されるとともに、試験研究のツールとして応用さ
れている。ある種の大腸菌株において３種類の変異体、
β-galΔα、β-galΔμ及びβ-galΔωが報告されてい
る（Δは、欠落を意味する。Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA., Vol.93, p.12423-12427, 1996；Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA., Vol.94, p.8405-8410, 1997）。
【０１１５】該β-galΔαは、野性型のβ-galの活性部
位であるＮ末端配列の一部（GenBank Accession Nos.:P
00722のアミノ酸番号12−42）を欠落している。該β-ga
lΔμは、野性型β-galの中央部配列の一部（GenBank A
ccession Nos.:P00722のアミノ酸番号50−602）を欠落
している。また、該β-galΔωは、野性型β-galのモノ
マー分子がホモ四量体を形成するための部位であるＣ末
端配列の一部（GenBank Accession Nos.:P00722のアミ
ノ酸番号790-1024）が欠落している。従って、β-galΔ
α単独またはβ-galΔω単独では、酵素活性が発現され
ないのは勿論であるが、β-galΔαとβ-galΔωが結合
（接近を含む）せず単に共存している状態でもβ-gal活
性を出現させることはできない。
【０１１６】しかしながら、互いに親和性を有する他の
２つのの蛋白、「Ｘ」と「Ｙ」、の各々に、β-galΔα
及びβ-galΔωの各々を融合してなる「Ｘ-β-galΔ
α」及び「Ｙ-β-galΔω」を共存させた場合には、Ｘ
とＹの親和力により該２つの融合蛋白が互いに接近する
結果β-gal活性を出現させることができる（Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA., Vol.94, p.8405-8410, 1997）。
この原理を応用して、MERMUCとHGF受容体c-Metとの結合
を評価可能なアッセイ系を構築するとともに、両分子の
結合能を評価した。具体的には、融合蛋白Ｘ-β-galΔ
α及びＹ-β-galΔωのＸ及びＹの各々に、ヒトHGF受容
体c-Metの全部またはそのＣ末端領域、ヒトMERMUCの全
部またはそのＣ末端領域などを適用し、該２つの融合蛋
白を、遺伝子組換え技術を用いて例えばCHO細胞などの
動物細胞内で共発現させ、該組換え細胞が発現するβ-
ガラクトシダーゼ活性を指標とすることでMERMUCとc-Me
tとの結合を評価するものである。
【０１１７】本評価系の構築のためプラスミドpcDNA3を
用いて、下記の融合ポリペプチド（融合蛋白）の各々を
発現させるための発現ベクターを調製した。各ベクター
の調製方法については、以下に詳述する。 Ａ．ヒトMERMUC（全長；full）／β-galΔω Ｂ．ヒトMERMUC（全長；full）／β-galΔα Ｃ．ヒトMERMUC（Ｃ末端53アミノ酸欠失；ΔC53）／β-
galΔω Ｄ．ヒトMERMUC（Ｃ末端53アミノ酸欠失；ΔC53）／β-
galΔα Ｅ．ヒトc-Met（Ｃ末端91アミノ酸のみ；C91）／β-gal
Δα
【０１１８】<8-1> β-galΔα遺伝子の単離 β-galΔαは、野性型β-galのＮ末端側のアミノ酸（Ge
nBank Accession Nos.:P00722のアミノ酸番号12−42）
を欠落しており、大腸菌DH5α株がこの変異体を産生す
ることが知られている。(Gene, Vol.122, p.231-232, 1
992)。そこで野性型β-galのＮ末端メチオニンを含む領
域とＣ末端ストップコドンを含む領域に対応する塩基配
列を基に、PCR用の正方向プライマー（配列番号33；5’
側にXhoIサイトを付加。）及び逆方向プライマー（配列
番号34；5’側にはSalIサイトを付加。）を設計し、大
腸菌DH5α株のDNAを鋳型として目的のβ-galΔαをコー
ドするDNAをクローニングした。PCRにより増幅したβ-g
alΔα遺伝子断片を、制限酵素XhoI及びSalIで消化後、
pBluescript KSのXhoI及びSalIサイトに挿入して大腸菌
へ導入した。以下の試験で用いるβ-galΔα遺伝子を含
むプラスミドをこの形質転換株より調製した。なお、β
-galΔαのアミノ酸配列を配列番号16に示す。
【０１１９】<8-2> β-galΔω遺伝子の単離 β-galΔωは、野性型β-galのモノマー分子がホモ四量
体を形成するための部位であるＣ末端配列の一部（GenB
ank Accession Nos.:P00722のアミノ酸番号790-1024）
を欠落している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.9
3, p.12423-12427, 1996）。そこで大腸菌株DH5の野性
型β-gal遺伝子を鋳型とし、Ｎ末端メチオニンから789
番目のアミノ酸までをPCRで増幅することでβ-galΔω
をコードするDNAを作製した。なお、PCR用のプライマー
には、下記を用いた。 １．正方向プライマー ： 配列番号35（ATGの5’側に
XhoIサイトを付加） ２．逆方向プライマー ： 配列番号36（CGGの5'側にT
AAとSalIサイトを付加） PCR産物を制限酵素XhoI及びSalIで消化してβ-galΔω
遺伝子断片を調製し、これをpBluescript KSのXhoI及び
SalIサイトに挿入し大腸菌へ導入した。以下で用いるβ
-galΔω遺伝子を含むプラスミドはこの形質転換株から
調製した。
【０１２０】<8-3> β-gal変異体との融合用のMERMUC
(full)及びMERMUC（ΔC53）をコードするDNAの調製 前記のヒトMERMUC(full)またはヒトMERMUC(ΔC53)をコ
ードするDNAにβ-gal変異体をコードするDNAをin-frame
で融合させるため、ヒトMERMUC(full)DNAのストップコ
ドン及びヒトMERMUC(ΔC53)DNAのＣ末端コドンの各々
を、下記のプライマーセットを用いたPCRによりXhoIサ
イトに改変させた。なお、ヒトMERMUC全長をコードする
DNAを鋳型とした。 ＜ヒトMERMUC(full)＞ （N末端Metから503番目のアミ
ノ酸までを増幅） 正方向プライマー ： 配列番号37（ATGの5’側にHind
IIIサイトを付加） 逆方向プライマー ： 配列番号38（GCCの5’側にXhoI
サイトを付加。） ＜ヒトMERMUC(ΔC53)＞ （N末端Metから450番目のアミ
ノ酸までを増幅） 正方向プライマー ： 配列番号39（ATGの5’側にHind
IIIサイトを付加。） 逆方向プライマー ： 配列番号40（TGCの5’側にXhoI
サイトを付加。） 各々のPCR産物を、制限酵素HindIII及びXhoIで消化後、
pBluescript KSのHindIII及びXhoIサイトに挿入して大
腸菌へ導入した。上記Ａ乃至Ｄのいずれかの融合タンパ
クをコードするDNAを有する各プラスミドは、当該形質
転換大腸菌株より調製した。
【０１２１】<8-4> ヒトc-Met（C91）をコードするDNA
の調製 ヒトc-Met(C91)をコードするDNAにβ-galΔαをコード
するDNAをin-frameで融合させるため、ヒトHGF受容体c-
MetのC末端91アミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸番号
993-1083）に対応するDNAを下記プライマーセットを用
いてPCRにより調製した。なお、ヒトHGF受容体c-Metの
全長をコードするDNAを鋳型とした。 正方向プライマー ： 配列番号41（AGAの5’側にATG
とHindIIIサイトを付加。） 逆方向プライマー ： 配列番号42（TCAの5’側にXhoI
サイト付加。） 得られたPCR産物の各々を、制限酵素HindIII及びXhoIで
消化後、pBluescriptKSのHindIII及びXhoIサイトに挿入
して大腸菌へ導入した。上記Ｅの融合タンパクをコード
するDNAを有するプラスミドは、当該形質転換大腸菌株
より調製した。
【０１２２】<8-5> 融合蛋白（A, B, C, D, E）発現用
ベクターの作製； Ａ）ヒトMERMUC(full)／β-galΔω発現用ベクターの調
製 上記で作製したプラスミドの各々を制限酵素HindIII及
びXhoI、またはXhoI及びSalIで消化して、ヒトMERMUC(f
ull)及びβ-galΔωの各々をコードするDNAを切り出し
た。得られた２つのDNA断片をXhoIサイトで結合させた
後、pcDNA3ベクターのHindIII／SalIサイトへ挿入し、
目的とするヒトMERMUC(full)／β-galΔω発現ベクター
を構築した。
【０１２３】Ｂ）ヒトMERMUC(full)／β-galΔα発現用
ベクターの調製 上記で作製したプラスミドの各々を制限酵素HindIII及
びXhoI、またはXhoI及びSalI消化して、ヒトMERMUC(ful
l)及びβ-galΔαの各々をコードするDNAを切り出し
た。得られた２つのDNA断片をXhoIサイトで結合させた
後、pcDNA3ベクターのHindIII／SalIサイトへ挿入し、
目的とするMERMUC(full)／β-galΔα発現ベクターを構
築した。
【０１２４】Ｃ）ヒトMERMUC(ΔC53)／β-galΔω発現
用ベクターの調製 上記で作製したプラスミドの各々を制限酵素HindIII及
びXhoI、またはXhoI及びSalIで消化して、ヒトMERMUC
(ΔC53)及びβ-galΔωの各々をコードするDNAを切り出
した。得られた２つのDNA断片をXhoIサイトで結合させ
た後、pcDNA3ベクターのHindIII／SalIサイトへ挿入
し、目的とするヒトMERMUC(ΔC53)／β-galΔω発現ベ
クターを構築した。
【０１２５】Ｄ）ヒトMERMUC(ΔC53)／β-galΔα発現
用ベクターの調製 上記で作製したプラスミドの各々を制限酵素HindIII及
びXhoI、またはXhoI及びSalIで消化して、ヒトMERMUC
(ΔC53)及びβ-galΔαの各々をコードするDNAを切り出
した。得られた２つのDNA断片をXhoIサイトで結合させ
た後、pcDNA3ベクターのHindIII／SalIサイトへ挿入
し、目的とするヒトMERMUC(ΔC53)／β-galΔα発現ベ
クターを構築した。
【０１２６】Ｅ）ヒトc-Met(C91)／β-galΔα発現用ベ
クターの調製 上記で作製したプラスミドの各々を制限酵素HindIII及
びXhoI、またはXhoI及びSalIで消化して、ヒトc-Met(C9
1)及びβ-galΔαの各々をコードするDNAを切り出し
た。得られた２つのDNA断片をXhoIサイトで結合させた
後、pcDNA3ベクターのHindIII／SalIサイトへ挿入し、
目的とするヒトc-Met(C91)／β-galΔα発現ベクターを
構築した。
【０１２７】<8-6> MERMUCとHGF受容体c-Metとの結合
評価のためのアッセイ 実験操作説明書に従って市販の形質転換試薬（GeneJamm
er Transfection Reagent；STRATAGENE製）を用いて、
以下の組合せによる上記の5種類の融合蛋白発現ベクタ
ー（A, B, C, D, E）の等量混合で、CHO細胞を共形質転
換した。 Ｉ） Ａ ＋ Ｅ 即ち、MERMUC(full)/β-galΔω ＋ c-Met(C91)/β-g
alΔα II） Ａ ＋ Ｂ 即ち、MERMUC(full)/β-galΔω ＋ MERMUC(full)/β
-galΔα III） Ｃ ＋ Ｅ 即ち、MERMUC(ΔC53)/β-galΔω ＋ c-Met(C91)/β-
galΔα IV） Ｃ ＋ Ｄ 即ち、MERMUC(ΔC53)/β-galΔω ＋ MERMUC(ΔC53)/
β-galΔα 細胞を37℃で48時間培養後、GAL-SCREEN SYSTEM（Appli
ed Biosystems製）を用い、実験操作説明書に従って各
細胞内のβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【０１２８】結果を図６及び図７に示す。その結果、
（I）、（II）及び（IV）の組合せでは、対照（mock-co
ntrol）ベクターのみで形質転換した細胞に比較して、
顕著に高値のβ-ガラクトシダーゼ活性が検出された。
一方、（III）の組合せでは当該活性は見出されなかっ
た。これらの結果は、上述の実施例で明らかにされた下
記の知見を実証するものであった。 １．MERMUCとHGF受容体c-Metが結合する。 ２．MERMUCのc-Metとの結合領域は、MERMUCの細胞質領
域のC末端の約53アミノ酸を含む領域に存在する。 ３．c-MetのMERMUCとの結合領域は、c-Metのβ鎖の細胞
質領域のC末端の約91アミノ酸の内部に存する。 また、上記（IV）の組合わせによる試験結果から、MERM
UC分子同志の結合に貢献する部位は、MERMUCのc-Metと
の結合領域であるC末端53アミノ酸よりもさらにN末端側
にあることが示唆された。
【０１２９】さらに、上記結果から、本試験で構築され
たアッセイ系を用いれば、MERMUCとc-Metの結合を阻害
する物質や、MERMUCの分子間結合を阻害する物質を同定
することが可能であることが示された。同様にまた、該
アッセイ系を用いれば、ある物質のMERMUCとc-Metとの
結合を阻害活性の有無または程度や、ある物質のMERMUC
分子間での結合の抑制あるいは阻害の活性の有無または
程度を測定評価することができることが示された。
【０１３０】実施例９ HGF受容体c-MetとMERMUCとの結
合の生化学的解析 MERMUCが結合するHGF受容体c-Metのβ鎖のC末端領域
は、multifunctional docking siteと呼ばれる自己リン
酸化チロシン残基を含む部分である。この領域はHGFがH
GF受容体c-Metに結合して発生するシグナルの細胞内へ
の伝達において極めて重要な領域であることから、該HG
Fシグナリングが、MERMUC分子の当該領域への結合によ
り生理学的に制御されているものと推察された。そこ
で、MERMUCとHGF受容体c-Metとの結合の生理学的意義を
検証するため、前記実施例で作製したDoxにより遺伝子
発現制御可能にしたMERMUC発現組換え細胞：MERMUC/293
細胞を利用して以下の試験を行った。
【０１３１】<9-1> HGF受容体を介するMAPキナーゼ活
性化の制御 これまでの研究から、HGFシグナル伝達により惹起され
るMAPキナーゼの活性化は、次のようなステップを経て
達成されることが明らかにされている（Cell., Vol.77,
p.261-271, 1994; 実験医学, Vol.15, p.1033-1039, 1
997; Nature, Vol.391, p.285-288, 1998）。 (1)HGFのHGF受容体c-Metへの結合に伴うHGF受容体c-Met
のホモ2量体化。 (2)c-Metβ鎖のC末端領域内のチロシン残基の自己リン
酸化。 (3)該リン酸化部位へのGrb2（growth factor receptor-
bound protein-2）のリクルート。 (4)Ras活性化。 (5)MAP（mitogen-activated protein）キナーゼ活性
化。
【０１３２】そこで、HGFの刺激により誘導される細胞
内MAPキナーゼの活性化に対してMERMUCの発現が与える
生理学的影響の有無を解析した。具体的には、上記MERM
UC/293細胞株をDox存在下と非存在下の各々で培養する
ことによりMERMUC非産生系とMERMUC産生系を調製し、該
各々の細胞系へのHGFの添加直後に惹起されるMAPキナー
ゼの活性化の程度を比較した。Dox存在下で培養してMER
MUCの発現を抑制した細胞（MERMUC非産生系）及びDox非
存在下で培養してMERMUCの発現を誘導した細胞（MERMUC
産生系）の各々を、ヒト組換えHGF（#375228, CALBIOCH
EM製)で刺激し、直後に細胞可溶化物を調製してMAPキナ
ーゼ活性の評価に供した。
【０１３３】該細胞可溶化物をSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離後、常法に従って抗MA
Pキナーゼポリクローナル抗体（p44/42 MAP kinase ant
ibody, #9102；Cell Signaling Technology製）及び抗
リン酸化MAPキナーゼポリクローナル抗体（Phospho-p44
/42 MAP kinase (Thr202/Thr204) antibody, # 9101L；
Cell Signaling Technology製)を用いたウェスタンブロ
ッティングを行った。前者の抗体で両試料の各々のMAP
キナーゼ蛋白量に差異がないことを確認した後、後者の
抗体で検出されるリン酸化MAPキナーゼのシグナル強度
を比較した。結果を図８に示す。その結果、MERMUC産生
細胞でのMAPキナーゼ活性は、MERMUC非産生細胞のそれ
に比べ有意に低下していた。また、Dox濃度を下げてMER
MUCの産生量を増加させていくと、MAPキナーゼ活性が次
第に減少した。この結果から、MERMUCの産生量に依存し
て、HGFのシグナル伝達が抑制されること、並びに、MER
MUCは、HGF受容体と結合することによりHGFシグナルの
伝達をダウンレギュレートすることが明らかとなった。
【０１３４】<9-2> HGF受容体c-Metの細胞質領域の自
己リン酸化の制御 前記実施例で明らかとなったMERMUC産生依存的なMAPキ
ナーゼ活性の減弱化は、HGFシグナル伝達プロセスにお
けるHGF受容体c-Metの細胞質領域の自己リン酸化低下に
よるものと推察された。そこで、MERMUCを過剰生産細胞
及びMERMUC非生産細胞にHGFを加えて誘導されるHGF受容
体の自己リン酸化の程度を解析することにより、MERMUC
の産生が与えるHGFシグナル伝達に与える影響を検討し
た。
【０１３５】前記実施例と同様にして、MERMUC/293細胞
をDox非存在下または存在下で培養することにより得たM
ERMUC過剰発現細胞及びMERMUC非産生細胞の各々から、
細胞可溶化物を調製した。該各々の細胞可溶化物に抗HG
F受容体ポリクローナル抗体を加えて免疫沈降処理を行
った。次いで、SDS-PAGEにより該沈降蛋白を分離した
後、抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体(Phospho-T
yrosine monoclonal antibody (P-Tyr-100),#9411, Cel
l Signaling Technology製）を用いてウェスタンブロッ
ティングを行った。前者の抗体により両細胞可溶化物の
各々に含まれるHGF受容体蛋白量に差異がないことを確
認した後、後者の抗体で検出されるシグナル強度を比較
することでHGF受容体c-Metβ鎖の細胞内領域のチロシン
残基の自己リン酸化の程度を解析した。結果を図９に示
す。この結果、両細胞の間に該チロシン残基のリン酸化
の差異は認められなかった。この結果は、MERMUCの産生
及びMERMUCのHGF受容体c-Metへの結合は、HGF刺激によ
り誘導されるHGF受容体の細胞内領域のチロシン残基の
自己リン酸化には特に影響を与えるものではないことを
示唆するものであった。
【０１３６】<9-3> Grb2のHGF受容体細胞質領域内リン
酸化チロシンへの結合の制御 HGFシグナルの伝達のプロセスにおける１つのステップ
であるGrb2分子のHGF受容体c-Metβ鎖の細胞質領域内の
リン酸化チロシンへの結合に対するMERMUCの産生（即
ち、MERMUCとc-Metとの結合）が与える影響の有無を検
討した。該リン酸化チロシンへのGrb2の結合量は、Grb2
を抗Grb2抗体で免疫沈降させることにより共沈するHGF
受容体蛋白の量を以って評価した。前記実施例と同様に
して、MERMUC/293細胞をDox非存在下または存在下で培
養することにより得たMERMUC過剰発現細胞及びMERMUC非
産生細胞の各々から、細胞可溶化物を調製した。
【０１３７】該各々の細胞可溶化物に抗Grb2ポリクロー
ナル抗体（GRB2(C-23): sc-255, Santa Cruz Biotechno
logy製）を加え、常法に従って、Grb2蛋白を免疫沈降さ
せた。次いで、Grb2蛋白と共に沈降するHGF受容体蛋白
をSDS-PAGEによる分離した後、抗HGF受容体ポリクロー
ナル抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
検出されるHGF受容体のシグナル強度に基づいて、Grb2
と共沈したHGF受容体の蛋白量を評価した。
【０１３８】また対照実験として、Grb2と同様に、HGF
受容体c-Metの細胞質領域のリン酸化チロシン部位にリ
クルートされることが知られているGab1に関しても前記
と同様にして解析した。なお、該対照試験では、抗Gab1
ポリクローナル抗体（Gab1(H-198): sc-9049, Santa Cr
uz Biotechnology製)を用いた。結果を図10に示す。こ
の結果、MERMUC産生細胞においてGrb2と共に免疫沈降す
るHGF受容体c-Metの量は、MERMUC非産生細胞におけるそ
れに比べ有意に減少した。一方、Gab1と共に免疫沈降す
るc-Metの量は、MERMUC非産生細胞及びMERMUC産生細胞
において有意な差は認められなかった。この結果は、ME
RMUCの産生により、HGF受容体c-Metβ鎖の細胞質領域の
リン酸化チロシンへのGrb2の結合が阻害されることを示
すものである。
【０１３９】<9-4> MMP-1遺伝子及びMMP-9遺伝子発現
の制御 マトリックスメタロプロテアーゼ-１（matrix metallop
rotease-1;MMP-1）及びマトリックスメタロプロテアー
ゼ-９（MMP-9）は、培養細胞株や腎臓組織においてHGF
の刺激に伴い発現誘導されることが知られている（Kidn
ey Int. Vol.58,p.2028-2043, 2000； Carcinogenesis,
Vol.21, p.1079-1085, 2000）。そこで、ヒト腎臓由来
細胞から樹立したHEK293細胞を宿主として作製したヒト
MERMUC発現組換え細胞（MERMUC/293細胞；前記実施例の
とおり）を用いて、HGFの刺激で誘導される該細胞にお
けるMMP-1及びMMP-9の発現に対してMERMUCの産生が与え
る影響の有無をRT-PCRにより解析した。
【０１４０】前記実施例と同様にして、MERMUC/293細胞
をDox非存在下または存在下で培養することによりMERMU
C過剰発現細胞及びMERMUC非産生細胞の各々を調製し
た。各々の細胞にヒトHGFを加え、HGF添加直後（０時
間）、３、６及び24時間後に各々細胞から常法に従って
RNAを調製した。各々のRNA試料を鋳型とし、下記プライ
マーセットを用いて常法に従ってRT-PCRを行い、各試料
中における、MMP-1、MMP-9及びGAPDH（対照）のmRNAの
発現量を求めた。 MMP-1用プライマー ： 配列番号43及び配列番号44 MMP-9用プライマー ： 配列番号45及び配列番号46 GAPDH用プライマー ： 配列番号47及び配列番号47
【０１４１】結果を図11に示す。MMP-1のmRNAの発現
は、MERMUC非産生細胞においては経時的な上昇が認めら
れたが、MERMUC産生細胞では該発現誘導が顕著に抑制さ
れていた。また、MMP-9のmRNAの発現は、MERMUC非産生
細胞ではHGFの刺激後3時間後に発現誘導のピークが観察
されたが、MERMUC産生細胞ではMMP-9のmRNAの発現誘導
は殆ど認められなかった。この結果から、HGFの刺激に
より誘導されるMMP-1及びMMP-9の各遺伝子の発現は、ME
RMUC蛋白の過剰産生により低下すること、並びに該両遺
伝子の発現の低下は、MERMUC蛋白によるHGFシグナリン
グのダウンレギュレーションにより起こるMAPキナーゼ
活性化の減弱に起因することが示唆された。
【０１４２】以上の試験結果から、MERMUCの機能及びHG
Fシグナリングのダウンレギュレーションのメカニズム
に関し、下記が明らかとなった。 １）MERMUCは、HGF受容体c-Metβ鎖の細胞質領域の自己
リン酸化チロシンの付近に結合することでこの部位にリ
クルートされるGrb2蛋白の結合を阻害する。 ２）その結果、HGF／HGF受容体c-Metに結合によるシグ
ナル伝達により惹起されるべきMAPキナーゼ活性が減弱
化される。 ３）MAPキナーゼ活性の減弱化の結果、それ以降の生物
学的反応（例えば、MMP-1やMMP-9等の発現）が阻害され
る。 ４）以上の結果、HGF／HGF受容体c-Metシグナリングが
ダウンレギュレーションされる。
【０１４３】実施例10 MERMUC過剰発現トランスジェニ
ックマウスの作製及び解析 <10-1> マウスMERMUC-Tgの作製 肝臓より調製した初代培養細胞は、HGFの刺激により増
殖が促進することが報告されている（Proc. Natl. Aca
d. Sci.USA., Vol.83, p.6489-6493, 1986）。この現象
を利用して、肝臓細胞内でのMERMUC蛋白の産生の増加が
HGF刺激依存的な細胞増殖能に影響を及ぼすか否かを、M
ERMUC過剰発現トランスジェニック(Tg)マウス（以下、
単に、MERMUC-Tgマウス、MERMUC-TgあるいはTgという）
の肝臓細胞を用いることにより解析した。
【０１４４】MERMUC-Tgマウスは、常法に従って作製し
た（「マウス胚の操作マニュアル」,Chap.2-4, p.77-20
3, 1989, 近代出版；「最新動物細胞実験マニュアル」,
Chap.7, p.361-408, 1990; LIC Press.）。マウスMERM
UC全長をコードするcDNA（配列番号11）を、ニワトリβ
アクチンプローモーターを有する発現ベクターpCAGGS
（Gene, Vol.108, p.193-200, 1991）に、DNA末端平滑
化キット（TAKARA製）を用いて挿入し、マウスMERMUC発
現ベクターを得た。このベクターを制限酵素で切断して
線状化したものをTg作製用マウスMERMUC遺伝子として用
いた。
【０１４５】仮親マウスには、白色ICRマウス（雌、日
本チャールズリバー製）と精管結紮した白色ICRマウス
（雄、日本チャールズリバー製）とを交配して得られた
プラグ（または腟栓）を有する雌ICRマウスを用いた。
また、マウスMERMUC発現ベクターを導入するための受精
卵を得るための採卵用マウスは、PMS（５ユニット、Sig
ma製）及びｈCG（５ユニット、Sigma製）を投与するこ
とにより過剰排卵させたICRマウス（雌、日本チャール
ズリバー製）をICRマウス（雄、日本チャールズリバー
製）と交配させて作製した。交配後、ICRマウス（雌）
から卵管部を摘出し、ヒアルロニダーゼ処理により受精
卵のみを得、培地中で保存した。
【０１４６】受精卵へのマウスMERMUC遺伝子の導入は、
顕微鏡下でマニピュレーターを用いて常法により行っ
た。受精卵を保定針で固定し、37℃条件下、Tris-EDTA
緩衝液で希釈したマウスMERMUC遺伝子を含有する溶液
を、DNA導入針を用いて受精卵の雄性前核内に注入し
た。遺伝子導入後、正常な状態を保持する受精卵のみを
選別し、仮親マウス（白色ICRマウス）の卵巣内にある
卵管采に、マウスMERMUC遺伝子導入受精卵を挿入した。
仮親から生まれた子マウス（キメラマウス）をMERMUC-T
gマウスとして得た。作製したMERMUC-Tg及び正常マウス
（非Tgマウス（non-Tg mouse）；前記の仮親から生まれ
た正常マウス）の各々の各種臓器（肝臓、腎臓、心臓、
肺及び脳など）から抽出したmRNAを用いて常法に従っ
て、ノーザンブロッティングを行い、マウスMERMUCのmR
NAの発現量を解析した。その結果、Tgマウスでのマウス
MERMUCのmRNAの発現は、何れの臓器においてもnon-Tgマ
ウスのそれよりも有意に高いものであり、作製したMERM
UC-TgマウスがマウスMERMUCを過剰発現するマウスであ
ることが確認された。
【０１４７】<10-2> MERMUC産生の増加がHGF刺激依存
的な肝臓細胞の増殖に与える影響の解析 ベリー及びフレンドら（Berry & Friend et al）並びに
セグレン（Seglen etal）らの方法（J. Cell. Biol, Vo
l.43, p.506-520, 1969; Methods in Cell Biol., Vol.
13, p.29-83, 1976）に従ってコラゲナーゼ処理によ
り、MERMUC-Tgマウス（８週齢、４匹）及びnon-Tgマウ
ス（８週齢、４匹）の各々の肝臓から取得した肝臓細胞
から肝実質細胞の初代培養を調製した。得られた肝実質
細胞（2×103個）の各々を無血清培地で15時間培養後、
HGF依存的な細胞増殖を誘導するためにHGF（0、1または
3 ng/ml）を培地に添加してさらに培養した。なお、対
照としてHGFの代わりにEGF（epidermal growth factor;
0、1または10 ng/ml）を加えて同様にして培養を行っ
た。HGFの添加から24時間後、生細胞数測定試薬SF（ナ
カライテスク製）を用い、該試薬に添付の実験操作マニ
ュアルに従って、細胞数を計数し、HGF（またはEGF）添
加後の相対的な細胞増殖率を求めた。試験は、各３回行
った。
【０１４８】結果を図12に示す。対照であるEGF刺激に
よる肝実質細胞の増殖は、MERMUC-Tg及びnon-Tgいずれ
においても差異はなく用量依存的な細胞増殖を示した
（図12-B）。一方、HGF刺激による肝実質細胞の増殖
は、MERMUC-Tgマウス由来の細胞の増殖は、non-Tgマウ
スのぞれと比較して明らかに有意な増殖（反応性）の低
下が認められた（図12-A）。
【０１４９】<10-3> MERMUCの産生増加が細胞内MAPキ
ナーゼの活性化に与える影響の解析 実施例９と同様にして、MERMUC-Tgマウス及びnon-Tgマ
ウスの各々に由来する肝実質細胞のHGF刺激後の細胞内M
APキナーゼの活性化の変化を解析した。結果を図13に示
す。この結果、MERMUC-Tg由来の細胞において、MAPキナ
ーゼ活性化の有意な減弱化が認められた。この結果は、
MERMUCがHGF受容体に結合することでHGF/HGF受容体の機
能発現が抑制され、肝臓細胞をはじめとする種々の細胞
の増殖が抑制されることを示すとともに、MERMUCが、HG
F/HGF受容体の機能発現を抑制することにより、細胞の
増殖並びに組織、器官及び血管等のの再生及び新生を同
様にダウンレギュレートしていることを示すものであ
る。
【０１５０】実施例１１ MERMUCの自己会合によるMERM
UCとHGF受容体との結合親和性の増大の解析 前記の酵母2-ハイブリッド法および免疫沈降法により、
MERMUCは自身の会合で多量体を形成することが示され
た。本試験では、刺激に応じたMERMUCの自己会合を再現
可能な評価系を確立することによりMERMUCの自己会合と
MERMUCとHGF受容体結合との結合との関連性を解析し
た。
【０１５１】<11-1> 刺激に応じたMERMUCの自己会合を
再現可能な評価系の確立 後述の方法により以下の3つの発現ベクターを作製し
た。 (1) マウスのFas(CD95)の一部（細胞外領域及び細胞膜
貫通領域とからなる）及びヒトのMERMUCの細胞質領域と
からなる融合キメラ蛋白を発現するプラスミド（以下
「mFas-MERMUC」と称する。)。 (2)マウスのFasの一部（細胞外領域及び細胞膜貫通領域
とからなる）、ヒトのMERMUCの細胞質領域、及び前述の
β-galΔωとからなる融合キメラ蛋白を発現プラスミド
（以下「mFas-MERMUC-β-galΔω」と称する。)。 (3)マウスのFasの一部（細胞外領域及び細胞膜貫通領域
とからなる）、ヒトのMERMUCの細胞質領域、及び前述の
β-galΔαとからなる融合キメラ蛋白を発現するプラス
ミド(以下「mFas-MERMUC-β-galΔα」と称する。）。 なお、上述のマウスのFasは、既報のとおりである（Gen
Bank Accession No.P25446及びNP 032013；J. Immuno
l., Vol.148, No.4, p.1274-1279, 1992など）。
【０１５２】マウスFasの一部（細胞外領域及び細胞膜
貫通領域とからなる）をコードするcDNAは、、マウス脾
臓cDNAライブラリー（Clontech製）を鋳型として下記の
プライマーセットを用いてPCRにより調製した。 正方向プライマー： 配列番号49 逆方向プライマー： 配列番号50 ヒトMERMUCの細胞質領域をコードするcDNAは、前述のヒ
トMERMUCの全長cDNA（該列番号９）を鋳型として、下記
のプライマーセットを用いてPCRにより調製した。 正方向プライマー： 配列番号51 逆方向プライマー： 配列番号52 得られた各々のcDNAをpTargeTベクター（Promega製）に
サブクローニングした後、両断片を再び制限酵素XbaI及
びNotIで切り出してXbaIサイトでライゲーションし、こ
の結合断片をpcDNA3ベクターに挿入して、mFas-MERMUC
発現プラスミドを得た。mFas-MERMUC-β-galΔω発現プ
ラスミド及びmFas-MERMUC-β-galΔα発現プラスミドは
以下のようにして作製した。前記で作製したヒトMERMUC
(全長)/β-galΔα及びヒトMERMUC(全長)/β-galΔω各
々をApaIで消化し、MERMUC（細胞質領域）-β-galΔα
及びMERMUC（細胞質領域）-β-galΔωの各々をコード
するcDNAを調製した。得られた各々のcDNAを前記で構築
したmFas-MERMUCのApaI部位の下流に挿入してmFas-MERM
UC-β-galΔω発現プラスミド及びmFas-MERMUC-β-gal
Δα発現プラスミドを得た。
【０１５３】次に、GeneJammer Transfection Reagent
(STRATAGENE社製)を用い、添付プロトコールに従って、
mFas-MERMUC-β-galΔω発現プラスミド及びmFas-MERMU
C-β-galΔα発現プラスミドをHEK293細胞に加え、37℃
で培養して共形質転換しmFas-MERMUC-β-galΔω及びmF
as-MERMUC-β-galΔαを細胞膜上に共発現する組換え細
胞を得た。この組換え細胞をFas分子の会合を誘導する
活性を有する抗Fas抗体または会合誘導活性を有さない
抗Fas抗体で処理することにより細胞外に存するFas領域
の会合及び非会合の各々状態を作り出すことが可能とな
る。さらに、Fas領域の会合に伴って生ずる細胞内に存
するMERMUC蛋白部分の会合（結合）をβ-ガラクトシダ
ーゼ活性の測定することにより評価可能である。
【０１５４】該組換え細胞を両発現プラスミドの導入か
ら48時間後に、抗Fas抗体または陰性対照抗体（各々1ま
たは10μg/ml）で3時間処理した後、Gal-Screen System
(Applied Biosystems社製)を用いて添付プロトコール
に従って各細胞内のβ-ガラクトシダーゼ活性を測定し
た。なお、抗Fas抗体として、Fas分子の会合を誘導する
活性を有するハムスター抗マウスFas抗体（RK-8；医学
生物学研究所製）または該活性を有さないラット抗体マ
ウスFas抗体（RMF6；医学生物学研究所製）を用いた。
一方、陰性対象抗体には、mFasに反応しないハムスター
抗体またはラット抗体を用いた。結果を図１４に示す。
【０１５５】その結果、mFas-MERMUC-β-galΔω及びmF
as-MERMUC-β-galΔαを共発現する組換え細胞を、Fas
分子会合誘導活性を有しない抗Fas抗体で処理した場合
にはβ−ガラクトシダーゼ活性に変動は見られないが、
Fas分子会合誘導活性を有する抗Fas抗体で処理した場合
には抗体濃度に依存したβガラクトシダーゼ活性の上昇
が認められた。この結果から、本試験で作製したmFas-M
ERMUC-β-galΔω及びmFas-MERMUC-β-galΔαを共発現
する組換え細胞を用いれば、抗Fas抗体を用いて細胞外
のFas蛋白領域の会合を調節することにより、細胞内のM
ERMUC領域の会合を再現し自在に調節することが可能で
あることが示された。
【０１５６】<11-2> MERMUCの自己会合がMERMUCとHGF
受容体との結合親和性に与える影響の解析 上記で作製し組換え細胞を用いて、MERMUC分子の自己会
合がMERMUCとHGF受容体c-Metとの結合親和性に与える影
響の有無をMERMUCとHGF受容体の免疫沈降法（免疫共沈
試験）によって解析した。上記で作製したmFas-MERMUC
発現プラスミドでHEK293細胞を形質転換することにより
作製したmFas-MERMUC発現組換え細胞を上述の各種抗Fas
抗体で処理した後、常法に従って細胞を溶解し細胞溶解
物を調製した。該細胞溶解物に、前述の市販の抗HGF受
容体c-Metポリクローナル抗体h-Met（C-28）（sc-161;
Santa CruzBiotechnology製）を加え、protein-G Sepha
roseと反応後、遠心分離にてHGF受容体蛋白/抗c-Met抗
体との複合体及び該複合体にに結合した蛋白成分を沈降
させた。この沈降物を電気泳動用バッファーに溶解し、
SDS-PAGEにて分離後、常法に従って抗マウスFas抗体（R
&D社製）を用いたウェスターンブロッティングによりmF
as-MERMUC蛋白の共沈量を評価した。結果を図１５に示
す。
【０１５７】その結果、Fas分子会合誘導活性を有する
抗Fas抗体（RK-8）で処理した細胞では、共沈したmFas-
MERMUCの量に顕著な増加が認められたが、該会合誘導活
性を有さない抗Fas抗体（RMF6）や対照抗体（マウスFas
に反応しない。前述。）で処理した細胞では、mFas-MER
MUCの有意な共沈は認められなかった。この結果から、M
ERMUCの自己会合（細胞質領域内）はMERMUCとHGF受容体
との結合能を亢進することが示された。
【０１５８】実施例１２ MERMUCの自己会合の抑制によ
るMERMUCとHGF受容体との結合の減弱の解析 前記実施例で詳述したとおり、MERMUCの自己会合能はそ
のC末端の53アミノ酸を欠失した場合でも保持されてい
ることから、MERMUCの自己会合の責任領域は、MERMUCが
HGF受容体c-Metとの結合する領域（MERMUCのC末端53ア
ミノ酸残基）よりもN末端側に存在すると予想された。
このことを検証するとともにMERMUCの自己会合領域に結
合することによりMERMUCの自己会合を抑制することが可
能なMERMUCMERMUCペプチドを作成するために、後述する
方法により各々MERMUC細胞質領域の一部に対応する以下
の4種類のペプチドを作製した。 del-1：配列番号10のアミノ酸番号244乃至345番目のア
ミノ酸配列 del-2：配列番号10のアミノ酸番号244乃至380番目のア
ミノ酸配列 del-3：配列番号10のアミノ酸番号244乃至415番目のア
ミノ酸配列 del-4：配列番号10のアミノ酸番号244乃至450番目のア
ミノ酸配列
【０１５９】ヒトMERMUC細胞質領域断片（del-1乃至del
-4)の各々をコードするcDNA断片は、ヒトMERMUC全長cDN
A（配列番号９）を鋳型として以下のプライマーセット
を用いてPCRにより調製した。 (1) del-1 正方向プライマー：配列番号53 逆方向プライマー：配列番号54 (2) del-2 正方向プライマー：配列番号53 逆方向プライマー：配列番号55 (3) del-3 正方向プライマー：配列番号53 逆方向プライマー：配列番号56 (4) del-4 正方向プライマー：配列番号53 逆方向プライマー：配列番号57 なお、該正方向プライマー（配列番号53）の5’側には
メチオニンコドンに相当するATGと、さらにその5’側に
はHindIIIサイトをデザインした。また、各々の逆方向
プライマーの5’側にはストップコドンのアンチセンス
に相当するTTAと、さらにその5’側にはXhoIサイトをデ
ザインした。PCRにより得た各々のcDNAを、HindIII及び
XhoIで消化後、pcDNA3ベクターのHindIII/XhoIサイトへ
挿入し上述のヒトMERMUC細胞質領域断片(del-1〜-4)の
各々を発現する発現ベクターを得た。
【０１６０】次いで、GeneJammer Transfection Reagen
t (STRATAGENE社製)を用いCHO-K1細胞に下記の組み合わ
せの組換え蛋白発現ベクターを加え、37℃で48時間培養
して共形質転換した。 １） MERMUC(full)/β-galΔωを発現するベクター
（実施例８）； c-Met（C91）/β-galΔαを発現するベクター（実施例
８）；及び del-1乃至del-4のいずれかを発現するベクター（上
記）。 ２） MERMUC(full)/β-galΔωを発現するベクター
（実施例８）； MERMUC(full)/β-galΔαを発現するベクター（実施例
８）；及び del-1乃至del-4のいずれかを発現するベクター（上
記）。 プラスミド導入から48時間後、Gal-Screen System (App
lied Biosystems社製)を用い、添付プロトコールに従っ
て各組換え細胞の細胞内のβ-ガラクトシダーゼ活性を
測定した。なお、対照には、上記(1)及び(2)の各々にお
いてdel-1乃至del-4発現ベクターの代わりにpcDNA3ベク
ター（「mock」と称する。）で形質転換して得た組換え
細胞を用いた。結果を図16乃至図18に示す。
【０１６１】図16に示されるように、del-4が最も強くM
ERMUCの自己会合を抑制した。また、図17に示されるよ
うに、MERMUCとHGF受容体c-Metとの結合も、del-4によ
って最も大きな減弱化が認められた。さらに図１８に示
されるように、del-4によるMERMUCの自己会合の抑制並
びにMERMUCとHGF受容体c-Metとの結合の抑制は、そのい
ずれもがdel-4の用量に依存し増大した。
【０１６２】実施例１３ MERMUCとHGF受容体との結合
の抑制によるMAPキナーゼ活性化の回復の解析 前記実施例で詳述したとおり、MERMUCのHGF受容体への
結合により、HGF刺激によるHGF受容体を介するMAPキナ
ーゼ活性化が減弱することが示された。そこで、当該MA
Pキナーゼ活性の減弱が、上述のMERMUC細胞質領域断片d
el-4で抑制されるか否かを検討した。上記で作製したde
l-4蛋白発現ベクターを、GeneJammer Transfection Rea
gent（STRATAGENE社製）を用い添付プロトコールに従っ
て、実施例２で作製したTet-Off/MERMUC発現組換え細胞
（MERMUC/293細胞）に加え、37℃で48時間培養すること
により形質転換した。なお、対照として、del-4発現ベ
クターの代わりにdel-4をコードするcDNAを含まないpcD
NAベクター（mock）を用いて同様にして形質転換した。
【０１６３】この細胞をヒト組換えHGF（CALBIOCHEM社
製）で刺激し、その直後に常法に従って細胞溶解物を調
製し、MAPキナーゼ（Erkとも称する。）活性化度の評価
に供した。細胞溶解物をSDS-PAGEで分離後、常法に従っ
て、抗リン酸化MAPキナーゼポリクローナル抗体（Phosp
ho-p44/42 MAP kinase (Thr202/Thr204) antibody；Cel
lSignaling Technology社製）でのウェスタンブロッテ
ィングに供し、得られるシグナル強度に基づきMAKキナ
ーゼの活性化度を判断した。結果を図19に示す。
【０１６４】その結果、期待したとおり、mockベクター
(pcDNA3)を導入した対照細胞では、MERMUC蛋白の発現に
よりHGF刺激後のリン酸化MAPキナーゼ量は減少していた
が、del-4を産生させた細胞ではその抑制が解除され有
意なリン酸化MAPキナーゼ量が認められた。以上の結果
から、MERMUCの自己会合（多量体化）と、MERMUCとHGF
受容体との結合能には密接な関係が存在し、MERMUCの自
己会合の増加がMERMUCとHGF受容体との結合能（結合親
和性）を高め、結果的にHGFによるHGF受容体を介するMA
Pキナーゼ活性化の抑制能を向上させていることが示唆
された。
【０１６５】実施例１４ HGF刺激によるMERMUC蛋白の
リン酸化誘導の解析 MERMUCがHGF受容体c-Metと結合し、この結合により、HG
F刺激後のHGF受容体を介する細胞内シグナル伝達が制御
されているという事実から、MERMUC自身もHGF/HGF受容
体シグナリングの下流で何らかの修飾/制御（例えばフ
ィードバック制御）を受けていることも予想された。ヒ
トMERMUCの細胞質領域にはリン酸化修飾を受けうるスレ
オニン、セリン及びチロシン残基がそれぞれ45、37及び
1残基と多数存在することから、これらの何れかの残基
のリン酸化の有無を以下のとおり解析した。
【０１６６】前記で作製したTet-Off/MERMUC発現組換え
細胞（MERMUC/293細胞）を[32P] orthophosphateで標識
した後、ヒト組換えHGF（20 ng/ml；5分間）で刺激し
た。次いで、細胞を常法により溶解し細胞溶解物を調製
した。得られた細胞溶解物に前記のとおり調製した抗ヒ
トMERMUCポリクローナル抗体（実施例２）を加えて反応
させ、protein-G Sepharoseと結合後、遠心分離にてMER
MUC蛋白と抗MERMUCポリクローナル抗体の複合体を沈降
させた。この沈降物を１％SDSにて溶出し、バックグラ
ンドを抑えるために、再度、同様の免疫沈降操作を行っ
た。この作業で調製したサンプルをSDS-PAGEにて分離
後、オートラジオグラフィー解析に供した。また、常法
に従って、抗ヒトMERMUCポリクローナル抗体を用いたウ
ェスターンブロッティングを行い、上記組換え細胞での
MERMUCの発現は、HGFの有無によらず一定であることを
確認した。結果を図20に示した。その結果、Doxを加え
ないで培養することによりMERMUCを過剰発現させた細胞
では、HGF刺激のよりリン酸化MERMUC蛋白を示す強いシ
グナルバンドが検出された。
【０１６７】上述の方法と同様にして、下記の試験を行
った。 1)HGFの代わりにEGF（Epidermal growth factor）を使
用。 2)MERMUC発現細胞をHGFで刺激する前にHGFシグナリング
抑制剤であるPI3キナーゼ阻害剤（LY294002；10μM；CA
LBIOCHEM製）で処理。 3) MERMUC発現細胞をHGFで刺激する前にHGFシグナリン
グ抑制剤であるMEK 1/2阻害剤（U0126；10μM；CALBIOC
HEM製）で処理。 4) MERMUC発現細胞をEGFで刺激する前にPI3キナーゼ阻
害剤（LY294002；10μM）で処理。 5) MERMUC発現細胞をEGFで刺激する前にMEK 1/2阻害剤
（U0126；10μM）で処理。 結果を図21に示す。
【０１６８】その結果、MERMUCのリン酸化の増強効果が
EGF等の他の増殖因子の刺激では認められないこと、ま
た、細胞をHGFで刺激する前にPI3キナーゼ阻害剤または
MEK1/2阻害剤で処理した場合には、PI3キナーゼ阻害剤
で処理した場合のみMERMUCのリン酸化の増強が抑制され
た。この結果から、MERMUCのリン酸化はPI3キナーゼ及
びAktキナーゼ経路を介していることが推察された。
【０１６９】実施例１５ MERMUC過剰発現トランスジェ
ニックマウスにおけるHGF依存的な肝肥大の抑制の解析 正常マウスにHGF発現プラスミドDNAを尾静注投与すると
生体内でHGFが一過的に過剰産生され、それによる肝細
胞増殖促進で結果的に肝肥大化が起こることが報告され
ている（Hepatology, Vol.33, p.848-859, 2001）。そ
こで同報告の方法を前記実施例で作製したMERMUCを過剰
発現するトランスジェニックマウス(MERMUC-Tg；7週
齢；雄；23乃至33ｇ)に適用し、HGF過剰産生が誘導する
肝肥大に対するMERMUCの発現が与える影響有無を検討す
ることにより、MERMUCが、HGF受容体を介するシグナリ
ングの負の制御活性を有することを検証した。
【０１７０】MERMUC-Tgマウス及び同腹由来のnon-Tgマ
ウスの各々にヒトHGF発現プラスミド(ヒトHGF-cDNA in
pcDNA3、Invitrogen社製)またはプラスミドpcDNA3（moc
k)を、28μg/匹の濃度（2.3 ml生理食塩水）で5乃至10
秒以内で尾静注投与した。各プラスミドの投与2日後、
各マウスの血清中のHGF量をhuman HGF ELISA Kit (Genz
yme Techne社製)を用いて測定した。各個体における投
与ベクター由来のHGF産生量を評価すると同時に、開腹
して肝重量変化を調べた。結果を図22に示す。
【０１７１】その結果、non-Tgマウスにおいては、HGF
の一過的過剰産生により体重あたりの肝重量比がおよそ
1.6倍にまで増加したが、MERMUC-Tgマウスでは、その増
加は1.2倍程度に抑えられ、HGF依存的な肝肥大化におい
てTg/non-Tgマウス間に有意な差が認められた。これま
での知見から、HGF依存的な肝肥大化は、肝組織での肝
細胞過増殖に起因することが予想され、これにはHGF-シ
グナリング経路の内、MAPキナーゼ経路の活性化が大き
く寄与していることが推察されている。本試験の結果
は、in vivo においてもMERMUCがHGF受容体に結合し、H
GF刺激後のMAPキナーゼの活性化を減弱していることを
示唆すると言える。
【０１７２】
【発明の効果】本発明の医薬組成物は、c-MetとMERMUC
との結合（MERMUC分子の多量体化を含む）により起こる
HGF活性のダウンレギュレーションを取り除き、患者の
生体に内在するHGFあるいは該患者に外来的に供給され
たHGF（HGF蛋白製剤またはHGF遺伝子治療）が潜在的に
有している生物活性を最大限に引き出すことが可能とな
る。従って、本発明の医薬組成物は、これを単独で用い
るか、またはHGF医薬を用いた疾患の治療においてを併
用することにより、種々の疾患の予防・治療に必須であ
る組織及び器官など修復、再生若しくは新生、より具体
的には、現在もその治療が困難とされている種々の難治
性疾患（例えば、肝線維症、肝硬変、劇症肝炎、ウイル
ス性肝炎、急性肝炎、慢性腎不全、腎線維症及び肺線維
症など）の治療が、必要最小限の用量のHGF医薬（HGF蛋
白やHGF遺伝子など）可能となる。また、本発明の医薬
組成物をHGF医薬と併用する場合には、患者に投与され
るHGF医薬の用量、投与頻度及び投与期間などを大幅に
減少させることが可能となる。これにより、患者の心身
の苦痛を減じることが可能であると同時に、種々のコス
ト（患者、医療現場、医薬品メーカー、政府機関の各々
が負担するコスト）の削減も可能となる。
【０１７３】本発明はまた、当該医薬組成物の活性成分
である(1)c-MetとMERMUCとの結合を阻害する活性を有す
る物質、(2)MERMUC分子の多量体化（自己会合）を阻害
する活性を有する物質、または(3)MERMUCの発現を抑制
若しくは阻害する物質を同定する方法、任意の物質の各
種活性（c-MetとMERMUCとの結合を阻害する活性、MERMU
Cの多量体化を阻害する活性、MERMUCの発現を抑制若し
くは阻害する活性など）を試験する方法、並びに当該方
法に用いられる各種ツール（各種ポリペプチドや融合ポ
リペプチドなど）を提供するものであり、これらの方法
やツールを用いれば、上述の本発明の医薬組成物を簡便
に見出すことが可能である。
【０１７４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Tobacco, Inc. <120> Phrmaceutical Composition For Tisue Regeneration And Vasculization <130> J-355 <140> <141> <150> JP P2001-380158 <151> 2001-12-13 <160> 57 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 4173 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(4173) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(72) <220> <221> mat_peptide <222> (73)..(4170) <400> 1 atg aag gcc ccc gct gtg ctt gca cct ggc atc ctc gtg ctc ctg ttt 48 Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe -20 -15 -10 acc ttg gtg cag agg agc aat ggg gag tgt aaa gag gca cta gca aag 96 Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys -5 -1 1 5 tcc gag atg aat gtg aat atg aag tat cag ctt ccc aac ttc acc gcg 144 Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala 10 15 20 gaa aca ccc atc cag aat gtc att cta cat gag cat cac att ttc ctt 192 Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu 25 30 35 40 ggt gcc act aac tac att tat gtt tta aat gag gaa gac ctt cag aag 240 Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys 45 50 55 gtt gct gag tac aag act ggg cct gtg ctg gaa cac cca gat tgt ttc 288 Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe 60 65 70 cca tgt cag gac tgc agc agc aaa gcc aat tta tca gga ggt gtt tgg 336 Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp 75 80 85 aaa gat aac atc aac atg gct cta gtt gtc gac acc tac tat gat gat 384 Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp 90 95 100 caa ctc att agc tgt ggc agc gtc aac aga ggg acc tgc cag cga cat 432 Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His 105 110 115 120 gtc ttt ccc cac aat cat act gct gac ata cag tcg gag gtt cac tgc 480 Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys 125 130 135 ata ttc tcc cca cag ata gaa gag ccc agc cag tgt cct gac tgt gtg 528 Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val 140 145 150 gtg agc gcc ctg gga gcc aaa gtc ctt tca tct gta aag gac cgg ttc 576 Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe 155 160 165 atc aac ttc ttt gta ggc aat acc ata aat tct tct tat ttc cca gat 624 Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp 170 175 180 cat cca ttg cat tcg ata tca gtg aga agg cta aag gaa acg aaa gat 672 His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp 185 190 195 200 ggt ttt atg ttt ttg acg gac cag tcc tac att gat gtt tta cct gag 720 Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu 205 210 215 ttc aga gat tct tac ccc att aag tat gtc cat gcc ttt gaa agc aac 768 Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn 220 225 230 aat ttt att tac ttc ttg acg gtc caa agg gaa act cta gat gct cag 816 Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln 235 240 245 act ttt cac aca aga ata atc agg ttc tgt tcc ata aac tct gga ttg 864 Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu 250 255 260 cat tcc tac atg gaa atg cct ctg gag tgt att ctc aca gaa aag aga 912 His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg 265 270 275 280 aaa aag aga tcc aca aag aag gaa gtg ttt aat ata ctt cag gct gcg 960 Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala 285 290 295 tat gtc agc aag cct ggg gcc cag ctt gct aga caa ata gga gcc agc 1008 Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser 300 305 310 ctg aat gat gac att ctt ttc ggg gtg ttc gca caa agc aag cca gat 1056 Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp 315 320 325 tct gcc gaa cca atg gat cga tct gcc atg tgt gca ttc cct atc aaa 1104 Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys 330 335 340 tat gtc aac gac ttc ttc aac aag atc gtc aac aaa aac aat gtg aga 1152 Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg 345 350 355 360 tgt ctc cag cat ttt tac gga ccc aat cat gag cac tgc ttt aat agg 1200 Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg 365 370 375 aca ctt ctg aga aat tca tca ggc tgt gaa gcg cgc cgt gat gaa tat 1248 Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr 380 385 390 cga aca gag ttt acc aca gct ttg cag cgc gtt gac tta ttc atg ggt 1296 Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly 395 400 405 caa ttc agc gaa gtc ctc tta aca tct ata tcc acc ttc att aaa gga 1344 Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly 410 415 420 gac ctc acc ata gct aat ctt ggg aca tca gag ggt cgc ttc atg cag 1392 Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln 425 430 435 440 gtt gtg gtt tct cga tca gga cca tca acc cct cat gtg aat ttt ctc 1440 Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu 445 450 455 ctg gac tcc cat cca gtg tct cca gaa gtg att gtg gag cat aca tta 1488 Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu 460 465 470 aac caa aat ggc tac aca ctg gtt atc act ggg aag aag atc acg aag 1536 Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys 475 480 485 atc cca ttg aat ggc ttg ggc tgc aga cat ttc cag tcc tgc agt caa 1584 Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln 490 495 500 tgc ctc tct gcc cca ccc ttt gtt cag tgt ggc tgg tgc cac gac aaa 1632 Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys 505 510 515 520 tgt gtg cga tcg gag gaa tgc ctg agc ggg aca tgg act caa cag atc 1680 Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile 525 530 535 tgt ctg cct gca atc tac aag gtt ttc cca aat agt gca ccc ctt gaa 1728 Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu 540 545 550 gga ggg aca agg ctg acc ata tgt ggc tgg gac ttt gga ttt cgg agg 1776 Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg 555 560 565 aat aat aaa ttt gat tta aag aaa act aga gtt ctc ctt gga aat gag 1824 Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu 570 575 580 agc tgc acc ttg act tta agt gag agc acg atg aat aca ttg aaa tgc 1872 Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys 585 590 595 600 aca gtt ggt cct gcc atg aat aag cat ttc aat atg tcc ata att att 1920 Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile 605 610 615 tca aat ggc cac ggg aca aca caa tac agt aca ttc tcc tat gtg gat 1968 Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp 620 625 630 cct gta ata aca agt att tcg ccg aaa tac ggt cct atg gct ggt ggc 2016 Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly 635 640 645 act tta ctt act tta act gga aat tac cta aac agt ggg aat tct aga 2064 Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg 650 655 660 cac att tca att ggt gga aaa aca tgt act tta aaa agt gtg tca aac 2112 His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn 665 670 675 680 agt att ctt gaa tgt tat acc cca gcc caa acc att tca act gag ttt 2160 Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe 685 690 695 gct gtt aaa ttg aaa att gac tta gcc aac cga gag aca agc atc ttc 2208 Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe 700 705 710 agt tac cgt gaa gat ccc att gtc tat gaa att cat cca acc aaa tct 2256 Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser 715 720 725 ttt att agt ggt ggg agc aca ata aca ggt gtt ggg aaa aac ctg aat 2304 Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn 730 735 740 tca gtt agt gtc ccg aga atg gtc ata aat gtg cat gaa gca gga agg 2352 Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg 745 750 755 760 aac ttt aca gtg gca tgt caa cat cgc tct aat tca gag ata atc tgt 2400 Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys 765 770 775 tgt acc act cct tcc ctg caa cag ctg aat ctg caa ctc ccc ctg aaa 2448 Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys 780 785 790 acc aaa gcc ttt ttc atg tta gat ggg atc ctt tcc aaa tac ttt gat 2496 Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp 795 800 805 ctc att tat gta cat aat cct gtg ttt aag cct ttt gaa aag cca gtg 2544 Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val 810 815 820 atg atc tca atg ggc aat gaa aat gta ctg gaa att aag gga aat gat 2592 Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp 825 830 835 840 att gac cct gaa gca gtt aaa ggt gaa gtg tta aaa gtt gga aat aag 2640 Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys 845 850 855 agc tgt gag aat ata cac tta cat tct gaa gcc gtt tta tgc acg gtc 2688 Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val 860 865 870 ccc aat gac ctg ctg aaa ttg aac agc gag cta aat ata gag tgg aag 2736 Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys 875 880 885 caa gca att tct tca acc gtc ctt gga aaa gta ata gtt caa cca gat 2784 Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp 890 895 900 cag aat ttc aca gga ttg att gct ggt gtt gtc tca ata tca aca gca 2832 Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala 905 910 915 920 ctg tta tta cta ctt ggg ttt ttc ctg tgg ctg aaa aag aga aag caa 2880 Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln 925 930 935 att aaa gat ctg ggc agt gaa tta gtt cgc tac gat gca aga gta cac 2928 Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His 940 945 950 act cct cat ttg gat agg ctt gta agt gcc cga agt gta agc cca act 2976 Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr 955 960 965 aca gaa atg gtt tca aat gaa tct gta gac tac cga gct act ttt cca 3024 Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro 970 975 980 gaa gat cag ttt cct aat tca tct cag aac ggt tca tgc cga caa gtg 3072 Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln Val 985 990 995 1000 cag tat cct ctg aca gac atg tcc ccc atc cta act agt ggg gac tct 3120 Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser 1005 1010 1015 gat ata tcc agt cca tta ctg caa aat act gtc cac att gac ctc agt 3168 Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu Ser 1020 1025 1030 gct cta aat cca gag ctg gtc cag gca gtg cag cat gta gtg att ggg 3216 Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly 1035 1040 1045 ccc agt agc ctg att gtg cat ttc aat gaa gtc ata gga aga ggg cat 3264 Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His 1050 1055 1060 ttt ggt tgt gta tat cat ggg act ttg ttg gac aat gat ggc aag aaa 3312 Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys 1065 1070 1075 1080 att cac tgt gct gtg aaa tcc ttg aac aga atc act gac ata gga gaa 3360 Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu 1085 1090 1095 gtt tcc caa ttt ctg acc gag gga atc atc atg aaa gat ttt agt cat 3408 Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His 1100 1105 1110 ccc aat gtc ctc tcg ctc ctg gga atc tgc ctg cga agt gaa ggg tct 3456 Pro Asn Val Leu Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser 1115 1120 1125 ccg ctg gtg gtc cta cca tac atg aaa cat gga gat ctt cga aat ttc 3504 Pro Leu Val Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe 1130 1135 1140 att cga aat gag act cat aat cca act gta aaa gat ctt att ggc ttt 3552 Ile Arg Asn Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe 1145 1150 1155 1160 ggt ctt caa gta gcc aaa ggc atg aaa tat ctt gca agc aaa aag ttt 3600 Gly Leu Gln Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe 1165 1170 1175 gtc cac aga gac ttg gct gca aga aac tgt atg ctg gat gaa aaa ttc 3648 Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe 1180 1185 1190 aca gtc aag gtt gct gat ttt ggt ctt gcc aga gac atg tat gat aaa 3696 Thr Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys 1195 1200 1205 gaa tac tat agt gta cac aac aaa aca ggt gca aag ctg cca gtg aag 3744 Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys 1210 1215 1220 tgg atg gct ttg gaa agt ctg caa act caa aag ttt acc acc aag tca 3792 Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys Ser 1225 1230 1235 1240 gat gtg tgg tcc ttt ggc gtc gtc ctc tgg gag ctg atg aca aga gga 3840 Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Leu Met Thr Arg Gly 1245 1250 1255 gcc cca cct tat cct gac gta aac acc ttt gat ata act gtt tac ttg 3888 Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr Val Tyr Leu 1260 1265 1270 ttg caa ggg aga aga ctc cta caa ccc gaa tac tgc cca gac ccc tta 3936 Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu 1275 1280 1285 tat gaa gta atg cta aaa tgc tgg cac cct aaa gcc gaa atg cgc cca 3984 Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro 1290 1295 1300 tcc ttt tct gaa ctg gtg tcc cgg ata tca gcg atc ttc tct act ttc 4032 Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe 1305 1310 1315 1320 att ggg gag cac tat gtc cat gtg aac gct act tat gtg aac gta aaa 4080 Ile Gly Glu His Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys 1325 1330 1335 tgt gtc gct ccg tat cct tct ctg ttg tca tca gaa gat aac gct gat 4128 Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp 1340 1345 1350 gat gag gtg gac aca cga cca gcc tcc ttc tgg gag aca tca tag 4173 Asp Glu Val Asp Thr Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser 1355 1360 1365 <210> 2 <211> 1390 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys 20 25 30 Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala 35 40 45 Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu 50 55 60 Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys 65 70 75 80 Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe 85 90 95 Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp 100 105 110 Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp 115 120 125 Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His 130 135 140 Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys 145 150 155 160 Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val 165 170 175 Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe 180 185 190 Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp 195 200 205 His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp 210 215 220 Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu 225 230 235 240 Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn 245 250 255 Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln 260 265 270 Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu 275 280 285 His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg 290 295 300 Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala 305 310 315 320 Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser 325 330 335 Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp 340 345 350 Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys 355 360 365 Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg 370 375 380 Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg 385 390 395 400 Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr 405 410 415 Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly 420 425 430 Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly 435 440 445 Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln 450 455 460 Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu 465 470 475 480 Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu 485 490 495 Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys 500 505 510 Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln 515 520 525 Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys 530 535 540 Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile 545 550 555 560 Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu 565 570 575 Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg 580 585 590 Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu 595 600 605 Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys 610 615 620 Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile 625 630 635 640 Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp 645 650 655 Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly 660 665 670 Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg 675 680 685 His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn 690 695 700 Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe 705 710 715 720 Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe 725 730 735 Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser 740 745 750 Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn 755 760 765 Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg 770 775 780 Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys 785 790 795 800 Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys 805 810 815 Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp 820 825 830 Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val 835 840 845 Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp 850 855 860 Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys 865 870 875 880 Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val 885 890 895 Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys 900 905 910 Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp 915 920 925 Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala 930 935 940 Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln 945 950 955 960 Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His 965 970 975 Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr 980 985 990 Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro 995 1000 1005 Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln Val 1010 1015 1020 Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser 1025 1030 1035 1040 Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu Ser 1045 1050 1055 Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly 1060 1065 1070 Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His 1075 1080 1085 Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys 1090 1095 1100 Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu 1105 1110 1115 1120 Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His 1125 1130 1135 Pro Asn Val Leu Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser 1140 1145 1150 Pro Leu Val Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe 1155 1160 1165 Ile Arg Asn Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe 1170 1175 1180 Gly Leu Gln Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe 1185 1190 1195 1200 Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp 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aag gaa gtg ttt aat ata ctt cag gct gcg tat gtc agc 48 Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser 1 5 10 15 aag cct ggg gcc cag ctt gct aga caa ata gga gcc agc ctg aat gat 96 Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp 20 25 30 gac att ctt ttc ggg gtg ttc gca caa agc aag cca gat tct gcc gaa 144 Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu 35 40 45 cca atg gat cga tct gcc atg tgt gca ttc cct atc aaa tat gtc aac 192 Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn 50 55 60 gac ttc ttc aac aag atc gtc aac aaa aac aat gtg aga tgt ctc cag 240 Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln 65 70 75 80 cat ttt tac gga ccc aat cat gag cac tgc ttt aat agg aca ctt ctg 288 His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu 85 90 95 aga aat tca tca ggc tgt gaa gcg cgc cgt gat gaa tat cga aca gag 336 Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu 100 105 110 ttt acc aca gct ttg cag cgc gtt gac tta ttc atg ggt caa ttc agc 384 Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser 115 120 125 gaa gtc ctc tta aca tct ata tcc acc ttc att aaa gga gac ctc acc 432 Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr 130 135 140 ata gct aat ctt ggg aca tca gag ggt cgc ttc atg cag gtt gtg gtt 480 Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val 145 150 155 160 tct cga tca gga cca tca acc cct cat gtg aat ttt ctc ctg gac tcc 528 Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser 165 170 175 cat cca gtg tct cca gaa gtg att gtg gag cat aca tta aac caa aat 576 His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn 180 185 190 ggc tac aca ctg gtt atc act ggg aag aag atc acg aag atc cca ttg 624 Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu 195 200 205 aat ggc ttg ggc tgc aga cat ttc cag tcc tgc agt caa tgc ctc tct 672 Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser 210 215 220 gcc cca ccc ttt gtt cag tgt ggc tgg tgc cac gac aaa tgt gtg cga 720 Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg 225 230 235 240 tcg gag gaa tgc ctg agc ggg aca tgg act caa cag atc tgt ctg cct 768 Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro 245 250 255 gca atc tac aag gtt ttc cca aat agt gca ccc ctt gaa gga ggg aca 816 Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr 260 265 270 agg ctg acc ata tgt ggc tgg gac ttt gga ttt cgg agg aat aat aaa 864 Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys 275 280 285 ttt gat tta aag aaa act aga gtt ctc ctt gga aat gag agc tgc acc 912 Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr 290 295 300 ttg act tta agt gag agc acg atg aat aca ttg aaa tgc aca gtt ggt 960 Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly 305 310 315 320 cct gcc atg aat aag cat ttc aat atg tcc ata att att tca aat ggc 1008 Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly 325 330 335 cac ggg aca aca caa tac agt aca ttc tcc tat gtg gat cct gta ata 1056 His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile 340 345 350 aca agt att tcg ccg aaa tac ggt cct atg gct ggt ggc act tta ctt 1104 Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu 355 360 365 act tta act gga aat tac cta aac agt ggg aat tct aga cac att tca 1152 Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser 370 375 380 att ggt gga aaa aca tgt act tta aaa agt gtg tca aac agt att ctt 1200 Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu 385 390 395 400 gaa tgt tat acc cca gcc caa acc att tca act gag ttt gct gtt aaa 1248 Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys 405 410 415 ttg aaa att gac tta gcc aac cga gag aca agc atc ttc agt tac cgt 1296 Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg 420 425 430 gaa gat ccc att gtc tat gaa att cat cca acc aaa tct ttt att agt 1344 Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser 435 440 445 ggt ggg agc aca ata aca ggt gtt ggg aaa aac ctg aat tca gtt agt 1392 Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val Ser 450 455 460 gtc ccg aga atg gtc ata aat gtg cat gaa gca gga agg aac ttt aca 1440 Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn Phe Thr 465 470 475 480 gtg gca tgt caa cat cgc tct aat tca gag ata atc tgt tgt acc act 1488 Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr Thr 485 490 495 cct tcc ctg caa cag ctg aat ctg caa ctc ccc ctg aaa acc aaa gcc 1536 Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys Ala 500 505 510 ttt ttc atg tta gat ggg atc ctt tcc aaa tac ttt gat ctc att tat 1584 Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr 515 520 525 gta cat aat cct gtg ttt aag cct ttt gaa aag cca gtg atg atc tca 1632 Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val Met Ile Ser 530 535 540 atg ggc aat gaa aat gta ctg gaa att aag gga aat gat att gac cct 1680 Met Gly Asn Glu Asn Val Leu 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Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His Thr Pro His 660 665 670 ttg gat agg ctt gta agt gcc cga agt gta agc cca act aca gaa atg 2064 Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu Met 675 680 685 gtt tca aat gaa tct gta gac tac cga gct act ttt cca gaa gat cag 2112 Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro Glu Asp Gln 690 695 700 ttt cct aat tca tct cag aac ggt tca tgc cga caa gtg cag tat cct 2160 Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro 705 710 715 720 ctg aca gac atg tcc ccc atc cta act agt ggg gac tct gat ata tcc 2208 Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser 725 730 735 agt cca tta ctg caa aat act gtc cac att gac ctc agt gct cta aat 2256 Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn 740 745 750 cca gag ctg gtc cag gca gtg cag cat gta gtg att ggg ccc agt agc 2304 Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser 755 760 765 ctg att gtg cat ttc aat gaa gtc ata gga aga ggg cat ttt ggt tgt 2352 Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys 770 775 780 gta tat cat ggg act ttg ttg gac aat gat ggc aag aaa att cac tgt 2400 Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys 785 790 795 800 gct gtg aaa tcc ttg aac aga atc act gac ata gga gaa gtt tcc caa 2448 Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln 805 810 815 ttt ctg acc gag gga atc atc atg aaa gat ttt agt cat ccc aat gtc 2496 Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val 820 825 830 ctc tcg ctc ctg gga atc tgc ctg cga agt gaa ggg tct ccg ctg gtg 2544 Leu Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val 835 840 845 gtc cta cca tac atg aaa cat gga gat ctt cga aat ttc att cga aat 2592 Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn 850 855 860 gag act cat aat cca act gta aaa gat ctt att ggc ttt ggt ctt caa 2640 Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln 865 870 875 880 gta gcc aaa ggc atg aaa tat ctt gca agc aaa aag ttt gtc cac aga 2688 Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His Arg 885 890 895 gac ttg gct gca aga aac tgt atg ctg gat gaa aaa ttc aca gtc aag 2736 Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val Lys 900 905 910 gtt gct gat ttt ggt ctt gcc aga gac atg tat gat aaa gaa tac tat 2784 Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr 915 920 925 agt gta cac aac aaa aca ggt gca aag ctg cca gtg aag tgg atg gct 2832 Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys Trp Met Ala 930 935 940 ttg gaa agt ctg caa act caa aag ttt acc acc aag tca gat gtg tgg 2880 Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys Ser Asp Val Trp 945 950 955 960 tcc ttt ggc gtc gtc ctc tgg gag ctg atg aca aga gga gcc cca cct 2928 Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Leu Met Thr Arg Gly Ala Pro Pro 965 970 975 tat cct gac gta aac acc ttt gat ata act gtt tac ttg ttg caa ggg 2976 Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly 980 985 990 aga aga ctc cta caa ccc gaa tac tgc cca gac ccc tta tat gaa gta 3024 Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val 995 1000 1005 atg cta aaa tgc tgg cac cct aaa gcc gaa atg cgc cca tcc ttt tct 3072 Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser 1010 1015 1020 gaa ctg gtg tcc cgg ata tca gcg atc ttc tct act ttc att ggg gag 3120 Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu 1025 1030 1035 1040 cac tat gtc cat gtg aac gct act tat gtg aac gta aaa tgt gtc gct 3168 His Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala 1045 1050 1055 ccg tat cct tct ctg ttg tca tca gaa gat aac gct gat gat gag gtg 3216 Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val 1060 1065 1070 gac aca cga cca gcc tcc ttc tgg gag aca tca tag 3252 Asp Thr Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser 1075 1080 <210> 4 <211> 1083 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser 1 5 10 15 Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp 20 25 30 Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu 35 40 45 Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn 50 55 60 Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln 65 70 75 80 His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu 85 90 95 Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu 100 105 110 Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser 115 120 125 Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr 130 135 140 Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val 145 150 155 160 Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser 165 170 175 His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn 180 185 190 Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu 195 200 205 Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser 210 215 220 Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg 225 230 235 240 Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro 245 250 255 Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr 260 265 270 Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys 275 280 285 Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr 290 295 300 Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly 305 310 315 320 Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly 325 330 335 His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile 340 345 350 Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu 355 360 365 Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser 370 375 380 Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu 385 390 395 400 Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys 405 410 415 Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg 420 425 430 Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser 435 440 445 Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val Ser 450 455 460 Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn Phe Thr 465 470 475 480 Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr Thr 485 490 495 Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys Ala 500 505 510 Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr 515 520 525 Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val Met Ile Ser 530 535 540 Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro 545 550 555 560 Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu 565 570 575 Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp 580 585 590 Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile 595 600 605 Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe 610 615 620 Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala Leu Leu Leu 625 630 635 640 Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln Ile Lys Asp 645 650 655 Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His Thr Pro His 660 665 670 Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu Met 675 680 685 Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro Glu Asp Gln 690 695 700 Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro 705 710 715 720 Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser 725 730 735 Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn 740 745 750 Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser 755 760 765 Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys 770 775 780 Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys 785 790 795 800 Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln 805 810 815 Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val 820 825 830 Leu Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val 835 840 845 Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn 850 855 860 Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln 865 870 875 880 Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His Arg 885 890 895 Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val Lys 900 905 910 Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr 915 920 925 Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys Trp Met Ala 930 935 940 Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys Ser Asp Val Trp 945 950 955 960 Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Leu Met Thr Arg Gly Ala Pro Pro 965 970 975 Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly 980 985 990 Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val 995 1000 1005 Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser 1010 1015 1020 Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu 1025 1030 1035 1040 His Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala 1045 1050 1055 Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val 1060 1065 1070 Asp Thr Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser 1075 1080 <210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser 1 5 10 15 Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val His 20 25 30 Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val 35 40 <210> 6 <211> 2187 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2187) <400> 6 atg tgg gtg acc aaa ctc ctg cca gcc ctg ctg ctg cag cat gtc ctc 48 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 ctg cat ctc ctc ctg ctc ccc atc gcc atc ccc tat gca gag gga caa 96 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 agg aaa aga aga aat aca att cat gaa ttc aaa aaa tca gca aag act 144 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 acc cta atc aaa ata gat cca gca ctg aag ata aaa acc aaa aaa gtg 192 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 aat act gca gac caa tgt gct aat aga tgt act agg aat aaa gga ctt 240 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 cca ttc act tgc aag gct ttt gtt ttt gat aaa gca aga aaa caa tgc 288 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 ctc tgg ttc ccc ttc aat agc atg tca agt gga gtg aaa aaa gaa ttt 336 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 ggc cat gaa ttt gac ctc tat gaa aac aaa gac tac att aga aac tgc 384 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 atc att ggt aaa gga cgc agc tac aag gga aca gta tct atc act aag 432 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 agt ggc atc aaa tgt cag ccc tgg agt tcc atg ata cca cac gaa cac 480 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 agc ttt ttg cct tcg agc tat cgg ggt aaa gac cta cag gaa aac tac 528 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 tgt cga aat cct cga ggg gaa gaa ggg gga ccc tgg tgt ttc aca agc 576 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 aat cca gag gta cgc tac gaa gtc tgt gac att cct cag tgt tca gaa 624 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 gtt gaa tgc atg acc tgc aat ggg gag agt tat cga ggt ctc atg gat 672 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 cat aca gaa tca ggc aag att tgt cag cgc tgg gat cat cag aca cca 720 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 cac cgg cac aaa ttc ttg cct gaa aga tat ccc gac aag ggc ttt gat 768 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 gat aat tat tgc cgc aat ccc gat ggc cag ccg agg cca tgg tgc tat 816 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 act ctt gac cct cac acc cgc tgg gag tac tgt gca att aaa aca tgc 864 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 gct gac aat act atg aat gac act gat gtt cct ttg gaa aca act gaa 912 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 tgc atc caa ggt caa gga gaa ggc tac agg ggc act gtc aat acc att 960 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320 tgg aat gga att cca tgt cag cgt tgg gat tct cag tat cct cac gag 1008 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335 cat gac atg act cct gaa aat ttc aag tgc aag gac cta cga gaa aat 1056 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 tac tgc cga aat cca gat ggg tct gaa tca ccc tgg tgt ttt acc act 1104 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 gat cca aac atc cga gtt ggc tac tgc tcc caa att cca aac tgt gat 1152 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 atg tca cat gga caa gat tgt tat cgt ggg aat ggc aaa aat tat atg 1200 Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 ggc aac tta tcc caa aca aga tct gga cta aca tgt tca atg tgg gac 1248 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 aag aac atg gaa gac tta cat cgt cat atc ttc tgg gaa cca gat gca 1296 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 agt aag ctg aat gag aat tac tgc cga aat cca gat gat gat gct cat 1344 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 gga ccc tgg tgc tac acg gga aat cca ctc att cct tgg gat tat tgc 1392 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 cct att tct cgt tgt gaa ggt gat acc aca cct aca ata gtc aat tta 1440 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 gac cat ccc gta ata tct tgt gcc aaa acg aaa caa ttg cga gtt gta 1488 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 aat ggg att cca aca cga aca aac ata gga tgg atg gtt agt ttg aga 1536 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 tac aga aat aaa cat atc tgc gga gga tca ttg ata aag gag agt tgg 1584 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 gtt ctt act gca cga cag tgt ttc cct tct cga gac ttg aaa gat tat 1632 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 gaa gct tgg ctt gga att cat gat gtc cac gga aga gga gat gag aaa 1680 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 tgc aaa cag gtt ctc aat gtt tcc cag ctg gta tat ggc cct gaa gga 1728 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 tca gat ctg gtt tta atg aag ctt gcc agg cct gct gtc ctg gat gat 1776 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 ttt gtt agt acg att gat tta cct aat tat gga tgc aca att cct gaa 1824 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 aag acc agt tgc agt gtt tat ggc tgg ggc tac act gga ttg atc aac 1872 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 tat gat ggc cta tta cga gtg gca cat ctc tat ata atg gga aat gag 1920 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 aaa tgc agc cag cat cat cga ggg aag gtg act ctg aat gag tct gaa 1968 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 ata tgt gct ggg gct gaa aag att gga tca gga cca tgt gag ggg gat 2016 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 tat ggt ggc cca ctt gtt tgt gag caa cat aaa atg aga atg gtt ctt 2064 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 ggt gtc att gtt cct ggt cgt gga tgt gcc att cca aat cgt cct ggt 2112 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 att ttt gtc cga gta gca tat tat gca aaa tgg ata cac aaa att att 2160 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 tta aca tat aag gta cca cag tca tag 2187 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725 <210> 7 <211> 728 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 Asn Pro Glu Val Arg Tyr 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Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> Xaa means Ser, Ala or other amino acid. <220> <221> UNSURE <222> (10) <223> Xaa means Ser, Gly or other amino acid. <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> Xaa means Pro, Leu or other amino acd. <220> <221> UNSURE <222> (19) <223> Xaa means Arg, Trp or other amino acid. <400> 8 Xaa Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Xaa Xaa His Pro Val Ile Thr 1 5 10 15 Pro Ser Xaa <210> 9 <211> 1512 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1512) <400> 9 atg aca acg gac gac aca gaa gtg ccc gct atg act cta gca ccg ggc 48 Met Thr Thr Asp Asp Thr Glu Val Pro Ala Met Thr Leu Ala Pro Gly 1 5 10 15 cac gcc gct ctg gaa act caa acg ctg agc gct gag acc tct tct agg 96 His Ala Ala Leu Glu Thr Gln Thr Leu Ser Ala Glu Thr Ser Ser Arg 20 25 30 gcc tca acc cca gcc ggc ccc att cca gaa gca gag acc agg gga gcc 144 Ala Ser Thr Pro Ala Gly Pro Ile Pro Glu Ala Glu Thr Arg Gly Ala 35 40 45 aag aga att tcc cct gca aga gag acc agg agt ttc aca aaa aca tct 192 Lys Arg Ile Ser Pro Ala Arg Glu Thr Arg Ser Phe Thr Lys Thr Ser 50 55 60 ccc aac ttc atg gtg ctg atc gcc acc tcc gtg gag aca tca gcc gcc 240 Pro Asn Phe Met Val Leu Ile Ala Thr Ser Val Glu Thr Ser Ala Ala 65 70 75 80 agt ggc agc ccc gag gga gct gga atg acc aca gtt cag acc atc aca 288 Ser Gly Ser Pro Glu Gly Ala Gly Met Thr Thr Val Gln Thr Ile Thr 85 90 95 ggc agt gat ccc gag gaa gcc atc ttt gac acc ctt tgc acc gat gac 336 Gly Ser Asp Pro Glu Glu Ala Ile Phe Asp Thr Leu Cys Thr Asp Asp 100 105 110 agc tct gaa gag gca aag aca ctc aca atg gac ata ttg aca ttg gct 384 Ser Ser Glu Glu Ala Lys Thr Leu Thr Met Asp Ile Leu Thr Leu Ala 115 120 125 cac acc tcc aca gaa gct aag ggc ctg tcc tca gag agc agt gcc tct 432 His Thr Ser Thr Glu Ala Lys Gly Leu Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser 130 135 140 tcc gac ggc ccc cat cca gtc atc acc ccg tca cgg gcc tca gag agc 480 Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro Ser Arg Ala Ser Glu Ser 145 150 155 160 agc gcc tct tcc gac ggc ccc cat cca gtc atc acc ccg tca cgg gcc 528 Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro Ser Arg Ala 165 170 175 tca gag agc agc gcc tct tcc gac ggc ccc cat cca gtc atc acc ccc 576 Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro 180 185 190 tca tgg tcc ccg gga tct gat gtc act ctc ctc gct gaa gcc ctg gtg 624 Ser Trp Ser Pro Gly Ser Asp Val Thr Leu Leu Ala Glu Ala Leu Val 195 200 205 act gtc aca aac atc gag gtt att aat tgc agc atc aca gaa ata gaa 672 Thr Val Thr Asn Ile Glu Val Ile Asn Cys Ser Ile Thr Glu Ile Glu 210 215 220 aca aca act tcc agc atc cct ggg gcc tca gac ata gat ctc atc ccc 720 Thr Thr Thr Ser Ser Ile Pro Gly Ala Ser Asp Ile Asp Leu Ile Pro 225 230 235 240 acg gaa ggg gtg aag gcc tcg tcc acc tcc gat cca cca gct ctg cct 768 Thr Glu Gly Val Lys Ala Ser Ser Thr Ser Asp Pro Pro Ala Leu Pro 245 250 255 gac tcc act gaa gca aaa cca cac atc act gag gtc aca gcc tct gcc 816 Asp Ser Thr Glu Ala Lys Pro His Ile Thr Glu Val Thr Ala Ser Ala 260 265 270 gag acc ctg tcc aca gcc ggc acc aca gag tca gct gca cct cat gcc 864 Glu Thr Leu Ser Thr Ala Gly Thr Thr Glu Ser Ala Ala Pro His Ala 275 280 285 acg gtt ggg acc cca ctc ccc act aac agc gcc aca gaa aga gaa gtg 912 Thr Val Gly Thr Pro Leu Pro Thr Asn Ser Ala Thr Glu Arg Glu Val 290 295 300 aca gca ccc ggg gcc acg acc ctc agt gga gct ctg gtc aca gtt agc 960 Thr Ala Pro Gly Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Leu Val Thr Val Ser 305 310 315 320 agg aat ccc ctg gaa gaa acc tca gcc ctc tct gtt gag aca cca agt 1008 Arg Asn Pro Leu Glu Glu Thr Ser Ala Leu Ser Val Glu Thr Pro Ser 325 330 335 tac gtc aaa gtc tca gga gca gct ccg gtc tcc ata gag gct ggg tca 1056 Tyr Val Lys Val Ser Gly Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu Ala Gly Ser 340 345 350 gca gtg ggc aaa aca act tcc ttt gct ggg agc tct gct tcc tcc tac 1104 Ala Val Gly Lys Thr Thr Ser Phe Ala Gly Ser Ser Ala Ser Ser Tyr 355 360 365 agc ccc tcg gaa gcc gcc ctc aag aac ttc acc cct tca gag aca ccg 1152 Ser Pro Ser Glu Ala Ala Leu Lys Asn Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro 370 375 380 acc atg gac atc gca acc aag ggg ccc ttc ccc acc agc agg gac cct 1200 Thr Met Asp Ile Ala Thr Lys Gly Pro Phe Pro Thr Ser Arg Asp Pro 385 390 395 400 ctt cct tct gtc cct ccg act aca acc aac agc agc cga ggg acg aac 1248 Leu Pro Ser Val Pro Pro Thr Thr Thr Asn Ser Ser Arg Gly Thr Asn 405 410 415 agc acc tta gcc aag atc aca acc tca gcg aag acc acg atg aag ccc 1296 Ser Thr Leu Ala Lys Ile Thr Thr Ser Ala Lys Thr Thr Met Lys Pro 420 425 430 cca aca gcc acg ccc acg act gcc cgg acg agg ccg acc aca gac gtg 1344 Pro Thr Ala Thr Pro Thr Thr Ala Arg Thr Arg Pro Thr Thr Asp Val 435 440 445 agt gca ggt gaa aat gga ggt ttc ctc ctc ctg cgg ctg agt gtg gct 1392 Ser Ala Gly Glu Asn Gly Gly Phe Leu Leu Leu Arg Leu Ser Val Ala 450 455 460 tcc ccg gaa gac ctc act gac ccc aga gtg gca gaa agg ctg atg cag 1440 Ser Pro Glu Asp Leu Thr Asp Pro Arg Val Ala Glu Arg Leu Met Gln 465 470 475 480 cag ctc cac cgg gaa ctc cac gcc cac gcg cct cac ttc cag gtc tcc 1488 Gln Leu His Arg Glu Leu His Ala His Ala Pro His Phe Gln Val Ser 485 490 495 tta ctg cgt gtc agg aga ggc taa 1512 Leu Leu Arg Val Arg Arg Gly 500 <210> 10 <211> 503 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Thr Thr Asp Asp Thr Glu Val Pro Ala Met Thr Leu Ala Pro Gly 1 5 10 15 His Ala Ala Leu Glu Thr Gln Thr Leu Ser Ala Glu Thr Ser Ser Arg 20 25 30 Ala Ser Thr Pro Ala Gly Pro Ile Pro Glu Ala Glu Thr Arg Gly Ala 35 40 45 Lys Arg Ile Ser Pro Ala Arg Glu Thr Arg Ser Phe Thr Lys Thr Ser 50 55 60 Pro Asn Phe Met Val Leu Ile Ala Thr Ser Val Glu Thr Ser Ala Ala 65 70 75 80 Ser Gly Ser Pro Glu Gly Ala Gly Met Thr Thr Val Gln Thr Ile Thr 85 90 95 Gly Ser Asp Pro Glu Glu Ala Ile Phe Asp Thr Leu Cys Thr Asp Asp 100 105 110 Ser Ser Glu Glu Ala Lys Thr Leu Thr Met Asp Ile Leu Thr Leu Ala 115 120 125 His Thr Ser Thr Glu Ala Lys Gly Leu Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro Ser Arg Ala Ser Glu Ser 145 150 155 160 Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro Ser Arg Ala 165 170 175 Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro 180 185 190 Ser Trp Ser Pro Gly Ser Asp Val Thr Leu Leu Ala Glu Ala Leu Val 195 200 205 Thr Val Thr Asn Ile Glu Val Ile Asn Cys Ser Ile Thr Glu Ile Glu 210 215 220 Thr Thr Thr Ser Ser Ile Pro Gly Ala Ser Asp Ile Asp Leu Ile Pro 225 230 235 240 Thr Glu Gly Val Lys Ala Ser Ser Thr Ser Asp Pro Pro Ala Leu Pro 245 250 255 Asp Ser Thr Glu Ala Lys Pro His Ile Thr Glu Val Thr Ala Ser Ala 260 265 270 Glu Thr Leu Ser Thr Ala Gly Thr Thr Glu Ser Ala Ala Pro His Ala 275 280 285 Thr Val Gly Thr Pro Leu Pro Thr Asn Ser Ala Thr Glu Arg Glu Val 290 295 300 Thr Ala Pro Gly Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Leu Val Thr Val Ser 305 310 315 320 Arg Asn Pro Leu Glu Glu Thr Ser Ala Leu Ser Val Glu Thr Pro Ser 325 330 335 Tyr Val Lys Val Ser Gly Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu Ala Gly Ser 340 345 350 Ala Val Gly Lys Thr Thr Ser Phe Ala Gly Ser Ser Ala Ser Ser Tyr 355 360 365 Ser Pro Ser Glu Ala Ala Leu Lys Asn Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro 370 375 380 Thr Met Asp Ile Ala Thr Lys Gly Pro Phe Pro Thr Ser Arg Asp Pro 385 390 395 400 Leu Pro Ser Val Pro Pro Thr Thr Thr Asn Ser Ser Arg Gly Thr Asn 405 410 415 Ser Thr Leu Ala Lys Ile Thr Thr Ser Ala Lys Thr Thr Met Lys Pro 420 425 430 Pro Thr Ala Thr Pro Thr Thr Ala Arg Thr Arg Pro Thr Thr Asp Val 435 440 445 Ser Ala Gly Glu Asn Gly Gly Phe Leu Leu Leu Arg Leu Ser Val Ala 450 455 460 Ser Pro Glu Asp Leu Thr Asp Pro Arg Val Ala Glu Arg Leu Met Gln 465 470 475 480 Gln Leu His Arg Glu Leu His Ala His Ala Pro His Phe Gln Val Ser 485 490 495 Leu Leu Arg Val Arg Arg Gly 500 <210> 11 <211> 1971 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1971) <400> 11 atg ggc tct gtc tgg ggc ctg gct gtg ccc ctc ctt gtc ttc tgc tgg 48 Met Gly Ser Val Trp Gly Leu Ala Val Pro Leu Leu Val Phe Cys Trp 1 5 10 15 aag gtt ggc gtc agt gtg agc tct cca ggt ctc gac att agc aga tca 96 Lys Val Gly Val Ser Val Ser Ser Pro Gly Leu Asp Ile Ser Arg Ser 20 25 30 gtt cct ttg gtg aca acc aac aac atg gaa gtg tcc acc ttc act caa 144 Val Pro Leu Val Thr Thr Asn Asn Met Glu Val Ser Thr Phe Thr Gln 35 40 45 agg gac agg ccc agc tca gag aga gct ttc cag acc acc aac ctg att 192 Arg Asp Arg Pro Ser Ser Glu Arg Ala Phe Gln Thr Thr Asn Leu Ile 50 55 60 cag tat gta cct cta gac aca caa act ctc agc act gaa tct gct tct 240 Gln Tyr Val Pro Leu Asp Thr Gln Thr Leu Ser Thr Glu Ser Ala Ser 65 70 75 80 aat gct tta agt gca act agt atc agt tca gag gtc aat tcc aga gac 288 Asn Ala Leu Ser Ala Thr Ser Ile Ser Ser Glu Val Asn Ser Arg Asp 85 90 95 act cag gcc acc tct ttt gta aca aag acc agg aag aca cat act acc 336 Thr Gln Ala Thr Ser Phe Val Thr Lys Thr Arg Lys Thr His Thr Thr 100 105 110 act cct gca gca tca tcc cta gag gcc cag acc acc tct cct aat ttg 384 Thr Pro Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ser Pro Asn Leu 115 120 125 tca acc ctg aat att cag att acc tcc cca ata gca tcg tcc ctg gat 432 Ser Thr Leu Asn Ile Gln Ile Thr Ser Pro Ile Ala Ser Ser Leu Asp 130 135 140 gct cag acc att ttt cct gta tca tta tcc ctg agt acc cag acc act 480 Ala Gln Thr Ile Phe Pro Val Ser Leu Ser Leu Ser Thr Gln Thr Thr 145 150 155 160 tct cct gca cca tca ttc ctg gat acc caa acc act tcc cct gaa cca 528 Ser Pro Ala Pro Ser Phe Leu Asp Thr Gln Thr Thr Ser Pro Glu Pro 165 170 175 tca tct ctg acc act tcc cct gca cca tca tct ctg atc act tct cct 576 Ser Ser Leu Thr Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ser Leu Ile Thr Ser Pro 180 185 190 act cca tca tct cta act ata tcc cct gca ccg tca ttc ctg gat acc 624 Thr Pro Ser Ser Leu Thr Ile Ser Pro Ala Pro Ser Phe Leu Asp Thr 195 200 205 cag acc act tcc cct gca cta tca tct ctg gct act tcc cct gca cca 672 Gln Thr Thr Ser Pro Ala Leu Ser Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Pro 210 215 220 tca tcc cta gat acc cag acc atc tcg cct att gaa ttg acc cta aag 720 Ser Ser Leu Asp Thr Gln Thr Ile Ser Pro Ile Glu Leu Thr Leu Lys 225 230 235 240 acc caa acc att tcc act gta acg gag acc aga acg gtt tca ata aga 768 Thr Gln Thr Ile Ser Thr Val Thr Glu Thr Arg Thr Val Ser Ile Arg 245 250 255 ata cct tct gac ctc aag gtt atg cac acc atc cct aca gag aca ttg 816 Ile Pro Ser Asp Leu Lys Val Met His Thr Ile Pro Thr Glu Thr Leu 260 265 270 aca cca agc aac agc ccc aga act ggg atg agc act gtc caa act ggc 864 Thr Pro Ser Asn Ser Pro Arg Thr Gly Met Ser Thr Val Gln Thr Gly 275 280 285 aca gtg tgg gac ccc ata gaa gcc atc ttt gac acc ctt tgt acc gat 912 Thr Val Trp Asp Pro Ile Glu Ala Ile Phe Asp Thr Leu Cys Thr Asp 290 295 300 gac agc tct gaa gag gca agg aag atc aca gtt gac ctc ctg acg ttg 960 Asp Ser Ser Glu Glu Ala Arg Lys Ile Thr Val Asp Leu Leu Thr Leu 305 310 315 320 gca cac acc tcc acg gaa gtg gag cac ctg tct tca gag agc agc tct 1008 Ala His Thr Ser Thr Glu Val Glu His Leu Ser Ser Glu Ser Ser Ser 325 330 335 tcc tct gac agt tca gct ggg gtc ctc agc agc tca cga gtc ctg gga 1056 Ser Ser Asp Ser Ser Ala Gly Val Leu Ser Ser Ser Arg Val Leu Gly 340 345 350 ccc gac agt gca act cca gcc aag ggg ttg gtt gcc ttc aac atc act 1104 Pro Asp Ser Ala Thr Pro Ala Lys Gly Leu Val Ala Phe Asn Ile Thr 355 360 365 cat att aaa ctc agc acc tgc atc aca gaa ata gaa aca acc atc acc 1152 His Ile Lys Leu Ser Thr Cys Ile Thr Glu Ile Glu Thr Thr Ile Thr 370 375 380 atc tct ggg gcc cca ggc gtg agc ctc agc cct aca gaa gcg acg gca 1200 Ile Ser Gly Ala Pro Gly Val Ser Leu Ser Pro Thr Glu Ala Thr Ala 385 390 395 400 gct ttg ttc act tct gag ata tta act ttg cct cca ccc act gag gca 1248 Ala Leu Phe Thr Ser Glu Ile Leu Thr Leu Pro Pro Pro Thr Glu Ala 405 410 415 aaa cca att ttc ccc gag acc aca agc tta tct ggg atc ctg tca act 1296 Lys Pro Ile Phe Pro Glu Thr Thr Ser Leu Ser Gly Ile Leu Ser Thr 420 425 430 gcc ggc acc ccg gcc ctt gcc acc acc ctt gag ggg aca gtc tcc act 1344 Ala Gly Thr Pro Ala Leu Ala Thr Thr Leu Glu Gly Thr Val Ser Thr 435 440 445 agt gca atc aca gaa agc gaa aca gca gtg gcc cag act ctt acc tct 1392 Ser Ala Ile Thr Glu Ser Glu Thr Ala Val Ala Gln Thr Leu Thr Ser 450 455 460 gtt gga act tcg gtg aca gtt aga agg aac ccc ctg gaa aac act tca 1440 Val Gly Thr Ser Val Thr Val Arg Arg Asn Pro Leu Glu Asn Thr Ser 465 470 475 480 aca ctc tct att gag aca caa agc cac act gag gtc ttg ggc acc atc 1488 Thr Leu Ser Ile Glu Thr Gln Ser His Thr Glu Val Leu Gly Thr Ile 485 490 495 aca gtc ccc atg gtt gct gga tca aca atg gga gaa aca gcc tcc ttc 1536 Thr Val Pro Met Val Ala Gly Ser Thr Met Gly Glu Thr Ala Ser Phe 500 505 510 gtg agt ttc acg gct ctc gac agc agc agt ctc tca gtg gtg gtc acc 1584 Val Ser Phe Thr Ala Leu Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Val Val Thr 515 520 525 acc gag agc tct gct acc tca gag act tta acc aca ggc aat aca acc 1632 Thr Glu Ser Ser Ala Thr Ser Glu Thr Leu Thr Thr Gly Asn Thr Thr 530 535 540 aac agc tcc ttc ctc aca gaa agc cac cct cct ttt tct atc tat tca 1680 Asn Ser Ser Phe Leu Thr Glu Ser His Pro Pro Phe Ser Ile Tyr Ser 545 550 555 560 act aca gct agc acc agc aaa aac cca aac atc acc tta acc aag acc 1728 Thr Thr Ala Ser Thr Ser Lys Asn Pro Asn Ile Thr Leu Thr Lys Thr 565 570 575 aca gcc tca cca aag ccc ccg acg cat cct aca aca tct gca tcc act 1776 Thr Ala Ser Pro Lys Pro Pro Thr His Pro Thr Thr Ser Ala Ser Thr 580 585 590 gct tgg ata agg aaa acc aca aaa cat gat cca ggt gaa gat gga ggc 1824 Ala Trp Ile Arg Lys Thr Thr Lys His Asp Pro Gly Glu Asp Gly Gly 595 600 605 ttc ctc ctt gta cgg ctg acc gtg gcc tcc cct aag gac ctc act gag 1872 Phe Leu Leu Val Arg Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Asp Leu Thr Glu 610 615 620 cac aac gcc aga gag aag ctg atg aac cag ctc cgc cgt gaa ctg cac 1920 His Asn Ala Arg Glu Lys Leu Met Asn Gln Leu Arg Arg Glu Leu His 625 630 635 640 gcc cgc atg cca ctt gtc cac atg tcc ttc ctg agc atc agg agg ggt 1968 Ala Arg Met Pro Leu Val His Met Ser Phe Leu Ser Ile Arg Arg Gly 645 650 655 tga 1971 <210> 12 <211> 656 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Gly Ser Val Trp Gly Leu Ala Val Pro Leu Leu Val Phe Cys Trp 1 5 10 15 Lys Val Gly Val Ser Val Ser Ser Pro Gly Leu Asp Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Val Pro Leu Val Thr Thr Asn Asn Met Glu Val Ser Thr Phe Thr Gln 35 40 45 Arg Asp Arg Pro Ser Ser Glu Arg Ala Phe Gln Thr Thr Asn Leu Ile 50 55 60 Gln Tyr Val Pro Leu Asp Thr Gln Thr Leu Ser Thr Glu Ser Ala Ser 65 70 75 80 Asn Ala Leu Ser Ala Thr Ser Ile Ser Ser Glu Val Asn Ser Arg Asp 85 90 95 Thr Gln Ala Thr Ser Phe Val Thr Lys Thr Arg Lys Thr His Thr Thr 100 105 110 Thr Pro Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ser Pro Asn Leu 115 120 125 Ser Thr Leu Asn Ile Gln Ile Thr Ser Pro Ile Ala Ser Ser Leu Asp 130 135 140 Ala Gln Thr Ile Phe Pro Val Ser Leu Ser Leu Ser Thr Gln Thr Thr 145 150 155 160 Ser Pro Ala Pro Ser Phe Leu Asp Thr Gln Thr Thr Ser Pro Glu Pro 165 170 175 Ser Ser Leu Thr Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ser Leu Ile Thr Ser Pro 180 185 190 Thr Pro Ser Ser Leu Thr Ile Ser Pro Ala Pro Ser Phe Leu Asp Thr 195 200 205 Gln Thr Thr Ser Pro Ala Leu Ser Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Pro 210 215 220 Ser Ser Leu Asp Thr Gln Thr Ile Ser Pro Ile Glu Leu Thr Leu Lys 225 230 235 240 Thr Gln Thr Ile Ser Thr Val Thr Glu Thr Arg Thr Val Ser Ile Arg 245 250 255 Ile Pro Ser Asp Leu Lys Val Met His Thr Ile Pro Thr Glu Thr Leu 260 265 270 Thr Pro Ser Asn Ser Pro Arg Thr Gly Met Ser Thr Val Gln Thr Gly 275 280 285 Thr Val Trp Asp Pro Ile Glu Ala Ile Phe Asp Thr Leu Cys Thr Asp 290 295 300 Asp Ser Ser Glu Glu Ala Arg Lys Ile Thr Val Asp Leu Leu Thr Leu 305 310 315 320 Ala His Thr Ser Thr Glu Val Glu His Leu Ser Ser Glu Ser Ser Ser 325 330 335 Ser Ser Asp Ser Ser Ala Gly Val Leu Ser Ser Ser Arg Val Leu Gly 340 345 350 Pro Asp Ser Ala Thr Pro Ala Lys Gly Leu Val Ala Phe Asn Ile Thr 355 360 365 His Ile Lys Leu Ser Thr Cys Ile Thr Glu Ile Glu Thr Thr Ile Thr 370 375 380 Ile Ser Gly Ala Pro Gly Val Ser Leu Ser Pro Thr Glu Ala Thr Ala 385 390 395 400 Ala Leu Phe Thr Ser Glu Ile Leu Thr Leu Pro Pro Pro Thr Glu Ala 405 410 415 Lys Pro Ile Phe Pro Glu Thr Thr Ser Leu Ser Gly Ile Leu Ser Thr 420 425 430 Ala Gly Thr Pro Ala Leu Ala Thr Thr Leu Glu Gly Thr Val Ser Thr 435 440 445 Ser Ala Ile Thr Glu Ser Glu Thr Ala Val Ala Gln Thr Leu Thr Ser 450 455 460 Val Gly Thr Ser Val Thr Val Arg Arg Asn Pro Leu Glu Asn Thr Ser 465 470 475 480 Thr Leu Ser Ile Glu Thr Gln Ser His Thr Glu Val Leu Gly Thr Ile 485 490 495 Thr Val Pro Met Val Ala Gly Ser Thr Met Gly Glu Thr Ala Ser Phe 500 505 510 Val Ser Phe Thr Ala Leu Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Val Val Thr 515 520 525 Thr Glu Ser Ser Ala Thr Ser Glu Thr Leu Thr Thr Gly Asn Thr Thr 530 535 540 Asn Ser Ser Phe Leu Thr Glu Ser His Pro Pro Phe Ser Ile Tyr Ser 545 550 555 560 Thr Thr Ala Ser Thr Ser Lys Asn Pro Asn Ile Thr Leu Thr Lys Thr 565 570 575 Thr Ala Ser Pro Lys Pro Pro Thr His Pro Thr Thr Ser Ala Ser Thr 580 585 590 Ala Trp Ile Arg Lys Thr Thr Lys His Asp Pro Gly Glu Asp Gly Gly 595 600 605 Phe Leu Leu Val Arg Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Asp Leu Thr Glu 610 615 620 His Asn Ala Arg Glu Lys Leu Met Asn Gln Leu Arg Arg Glu Leu His 625 630 635 640 Ala Arg Met Pro Leu Val His Met Ser Phe Leu Ser Ile Arg Arg Gly 645 650 655 <210> 13 <211> 491 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (3)..(491) <400> 13 ct gag gtt ttt ggt acc atc aca gtc ccc acg gtt gct gga tca aca 47 Glu Val Phe Gly Thr Ile Thr Val Pro Thr Val Ala Gly Ser Thr 1 5 10 15 gta gga gaa gca acc tct ctt gtg agt tcc aca gct cta gac agc agt 95 Val Gly Glu Ala Thr Ser Leu Val Ser Ser Thr Ala Leu Asp Ser Ser 20 25 30 ctc tca gca gtg gtc acc acc aag ggc tct gct tcc tca gag act tta 143 Leu Ser Ala Val Val Thr Thr Lys Gly Ser Ala Ser Ser Glu Thr Leu 35 40 45 acc aca gac aat aca acc aac agc tcc ttc ctc aca ggg agt cgc cct 191 Thr Thr Asp Asn Thr Thr Asn Ser Ser Phe Leu Thr Gly Ser Arg Pro 50 55 60 cct tct tta atc tat tcg aca aca gct agc acc agt gaa aga aca aac 239 Pro Ser Leu Ile Tyr Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ser Glu Arg Thr Asn 65 70 75 gtc act tta acc aag acc aca gcc tca ccg aag acc ccg atg aat ccc 287 Val Thr Leu Thr Lys Thr Thr Ala Ser Pro Lys Thr Pro Met Asn Pro 80 85 90 95 gca ccc act gct tgg aca agg aaa acc aca gag cac gat cca ggt ata 335 Ala Pro Thr Ala Trp Thr Arg Lys Thr Thr Glu His Asp Pro Gly Ile 100 105 110 aat gga ggc ttc ctc ctt gta cgg ctg acc gtg gcc tcc cct aag gac 383 Asn Gly Gly Phe Leu Leu Val Arg Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Asp 115 120 125 ctc act gag cac gtc acc aga gag aag ctg atg cac cag ctc cgc cgt 431 Leu Thr Glu His Val Thr Arg Glu Lys Leu Met His Gln Leu Arg Arg 130 135 140 gaa ctg cac acc cat atg cca ctt gtc caa gtg tcc tta ctg agc atc 479 Glu Leu His Thr His Met Pro Leu Val Gln Val Ser Leu Leu Ser Ile 145 150 155 agg agg agc tga 491 Arg Arg Ser 160 <210> 14 <211> 162 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 14 Glu Val Phe Gly Thr Ile Thr Val Pro Thr Val Ala Gly Ser Thr Val 1 5 10 15 Gly Glu Ala Thr Ser Leu Val Ser Ser Thr Ala Leu Asp Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Val Val Thr Thr Lys Gly Ser Ala Ser Ser Glu Thr Leu Thr 35 40 45 Thr Asp Asn Thr Thr Asn Ser Ser Phe Leu Thr Gly Ser Arg Pro Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Tyr Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ser Glu Arg Thr Asn Val 65 70 75 80 Thr Leu Thr Lys Thr Thr Ala Ser Pro Lys Thr Pro Met Asn Pro Ala 85 90 95 Pro Thr Ala Trp Thr Arg Lys Thr Thr Glu His Asp Pro Gly Ile Asn 100 105 110 Gly Gly Phe Leu Leu Val Arg Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Asp Leu 115 120 125 Thr Glu His Val Thr Arg Glu Lys Leu Met His Gln Leu Arg Arg Glu 130 135 140 Leu His Thr His Met Pro Leu Val Gln Val Ser Leu Leu Ser Ile Arg 145 150 155 160 Arg Ser <210> 15 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gly Glu Asn Gly Gly Phe Leu Leu Leu Arg Leu Ser Val Ala Ser Pro 1 5 10 15 Glu Asp Leu Thr Asp Pro Arg Val Ala Glu Arg Leu Met Gln Gln Leu 20 25 30 His Arg Glu Leu His Ala His Ala Pro His Phe Gln Val Ser Leu Leu 35 40 45 Arg Val Arg Arg Gly 50 <210> 16 <211> 993 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 16 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Ala Arg Thr Asp Arg 1 5 10 15 Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp 20 25 30 Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Trp Leu Glu Cys Asp Leu 35 40 45 Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly 50 55 60 Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn 65 70 75 80 Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Asn Pro Thr Gly Cys Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 Phe Asn Val Asp Glu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr Arg Ile Ile 100 105 110 Phe Asp Gly Val Asn Ser Ala Phe His Leu Trp Cys Asn Gly Arg Trp 115 120 125 Val Gly Tyr Gly Gln Asp Ser Arg Leu Pro Ser Glu Phe Asp Leu Ser 130 135 140 Ala Phe Leu Arg Ala Gly Glu Asn Arg Leu Ala Val Met Val Leu Arg 145 150 155 160 Trp Ser Asp Gly Ser Tyr Leu Glu Asp Gln Asp Met Trp Arg Met Ser 165 170 175 Gly Ile Phe Arg Asp Val Ser Leu Leu His Lys Pro Thr Thr Gln Ile 180 185 190 Ser Asp Phe His Val Ala Thr Arg Phe Asn Asp Asp Phe Ser 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Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Trp Leu Glu Cys Asp Leu Pro 65 70 75 80 Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro 100 105 110 Pro Phe Val Pro Thr Glu Asn Pro Thr Gly Cys Tyr Ser Leu Thr Phe 115 120 125 Asn Val Asp Glu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr Arg Ile Ile Phe 130 135 140 Asp Gly Val Asn Ser Ala Phe His Leu Trp Cys Asn Gly Arg Trp Val 145 150 155 160 Gly Tyr Gly Gln Asp Ser Arg Leu Pro Ser Glu Phe Asp Leu Ser Ala 165 170 175 Phe Leu Arg Ala Gly Glu Asn Arg Leu Ala Val Met Val Leu Arg Trp 180 185 190 Ser Asp Gly Ser Tyr Leu Glu Asp Gln Asp Met Trp Arg Met Ser Gly 195 200 205 Ile Phe Arg Asp Val Ser Leu Leu His Lys Pro Thr Thr Gln Ile Ser 210 215 220 Asp Phe His Val Ala Thr Arg Phe Asn Asp Asp Phe Ser Arg Ala Val 225 230 235 240 Leu Glu Ala Glu 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cacggaattc actgcccgga cgaggccg 28 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(31) <400> 20 gggggtcgac ttagcctctc ctgacacgca g 31 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Arg Gly Ala Lys Arg Ile Ser Pro Ala Arg Glu Thr Arg Ser Phe Thr 1 5 10 15 Lys <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(32) <400> 22 ggggaagctt atgacaacgg acgacacaga ag 32 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(60) <400> 23 aaaactcgag tcacttgtcg tcatcgtctt tgtagtcgcc tctcctgaca cgcagtaagg 60 <210> 24 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(54) <400> 24 aaaactcgag tcaatggtga tggtgatgat ggcctctcct gacacgcagt aagg 54 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <400> 25 cagagtggca gaaaggctga t 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 26 ggaagcacac agatgggtga 20 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(30) <400> 27 aaaagaattc gtgaaggcct cgtccacctc 30 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(31) <400> 28 aaaagtcgac ttagcctctc ctgacacgca g 31 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> 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Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(35) <400> 34 gggggtcgac ttatttttga caccagacca actgg 35 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(37) <400> 35 ggggctcgag atgaccatga ttacggattc actggcc 37 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(35) <400> 36 gggggtcgac ttacggtgca cgggtgaact gatcg 35 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(32) <400> 37 ggggaagctt atgacaacgg acgacacaga ag 32 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(33) <400> 38 aaaactcgag gcctctcctg acacgcagta agg 33 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(32) <400> 39 ggggaagctt atgacaacgg acgacacaga ag 32 <210> 40 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(31) <400> 40 cattctcgag tgcactcacg tctgtggtcg g 31 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(37) <400> 41 gtttaagctt atgagaagac tcctacaacc cgaatac 37 <210> 42 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(31) <400> 42 actactcgag tgatgtctcc cagaaggagg c 31 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <400> 43 catccaagcc atatatggac gttcc 25 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <400> 44 tctggagagt caaaattctc ttcgt 25 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(23) <400> 45 ggcatccggc acctctatgg tcc 23 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <400> 46 gccacttgtc ggcgataagg aagg 24 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(26) <400> 47 tgaaggtcgg agtcaacgga tttggt 26 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <400> 48 catgtgggcc atgaggtcca ccac 24 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <400> 49 atgctgtgga tctgggctgt c 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <400> 50 ggttctagat tcagggtcat c 21 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(29) <400> 51 gcatctagaa tcgaggttat taattgcag 29 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <400> 52 ttagcctctc ctgacacgca g 21 <210> 53 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(39) <400> 53 aaaaaagctt ggcaccatgc tgaaggcctc gtccacctc 39 <210> 54 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(31) <400> 54 aaaactcgag ttacggagct gctcctgaga c 31 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(33) <400> 55 aaaactcgag ttaaggggtg aagttcttga ggg 33 <210> 56 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(32) <400> 56 aaaactcgag ttacgtccct cggctgctgt tg 32 <210> 57 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(32) <400> 57 aaaactcgag ttatgcactc acgtctgtgg tc 32
【０１７５】「配列表フリーテキスト」 配列番号：８ ・Xaaは、Ser、Alaまたは他のアミノ酸を意味する。 ・Xaaは、Ser、Glyまたは他のアミノ酸を意味する。 ・Xaaは、Pro、Leuまたは他のアミノ酸を意味する。 ・Xaaは、Arg、Trpまたは他のアミノ酸を意味する。 配列番号18 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号19 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号20 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号22 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号23 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号24 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号25 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号26 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号27 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号28 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号29 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号30 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号31 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号32 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号33 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号34 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号35 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号36 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号37 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号38 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号39 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号40 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号41 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号42 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号43 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号44 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号45 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号46 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号47 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号48 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号49 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号50 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号51 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号52 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号53 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号54 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号55 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号56 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。 配列番号57 ・人工配列についての記載：PCRプライマー配列。
【０１７６】
【図面の簡単な説明】
【図１】ウェスタンブロッティングで解析した組換えヒ
トMERMUC発現HEK293細胞でのヒトMERMUC及び／またはヒ
トc-Metの産生を示す図。分図Ａは、抗MERMUC抗体を用
いるウェスタンブロッティングで解析した、Doxの存在
下及び非存在下の各々で培養した組換え細胞でのヒトME
RMUCの産生を示す図。分図Ｂは、抗c-Met抗体または抗M
ERMUC抗体を用いるウェスタンブロッティングで解析し
た、Doxの存在下及び非存在下の各々で培養した組換え
細胞でのヒトc-Met及びMERMUC（該c-Metと共沈降した）
の各々の産生を示す図。分図Ｃは、コントロール抗体を
用いるウェスタンブロッティングで解析した、Doxの存
在下及び非存在下の各々で培養した組換え細胞でのヒト
c-Met及びMERMUC（該c-Metと共沈降した）の各々の産生
を示す図。
【図２】ウェスタンブロッティングで解析した組換えヒ
トMERMUC発現HEK293細胞でのヒトMERMUCの多量体での産
生を示す図。分図Ａは、抗FLAG-tag抗体を用いたウェス
タンブロッティングにより解析した、各種試料でのFLAG
-tag付きヒトMERMUCの産生を示す図。分図Ｂは、抗poly
His-tag抗体を用いたウェスタンブロッティングにより
解析した、各種試料でのpolyHis-tag付きヒトMERMUCの
産生を示す図。
【図３】ノーザンブロッティングで解析したヒトの各種
組織におけるヒトMERMUCのmRNAの発現を示す図。
【図４】PCRで解析したヒトの各種組織におけるヒトMER
MUC遺伝子の発現を示す図。
【図５】in situ hybridizationにより解析した各種の
マウス腎臓組織でのマウスMERMUC遺伝子の発現分布を示
す図。分図ａは、アンチセンスcRNAプローブを用いた解
析におけるMRL-lpr/lprマウス（5週齢）の腎臓組織での
MERMUC遺伝子の発現分布を示す。分図ｂは、センスcRNA
プローブを用いた解析におけるMRL-lpr/lprマウス（5週
齢）の腎臓組織でのMERMUC遺伝子の発現分布を示す。分
図ｃは、アンチセンスcRNAプローブを用いた解析におけ
るMRL-lpr/lprマウス（23週齢）の腎臓組織でのMERMUC
遺伝子の発現分布を示す。分図ｄは、アンチセンスcRNA
プローブを用いた解析におけるC57BL/6マウス（23週
齢）の腎臓組織でのMERMUC遺伝子の発現分布を示す。分
図ｅは、センスcRNAプローブを用いた解析におけるC57B
L/6マウス（23週齢）の腎臓組織でのMERMUC遺伝子の発
現分布を示す。
【図６】MERMUCとHGF受容体c-Metとの結合をβ-gal活性
の出現を指標として評価した結果を示す図。
【図７】MERMUCの分子間の結合をβ-gal活性の出現を指
標として評価した結果を示す図。
【図８】ウェスタンブロッティングで解析した、MERMUC
の産生量の増加に依存したHGF誘導性細胞内MAPキナーゼ
活性の減弱を示す図。
【図９】ウェスタンブロッティングで解析した、HGF刺
激を与えたMERMUC産生細胞または非産生細胞の各々での
リン酸化されたHGF受容体c-Metの量的差違を示す図。
【図１０】ウェスタンブロッティングで解析した、HGF
刺激を与えたMERMUC産生細胞または非産生細胞の各々で
のHGF受容体c-Metと結合したGrb2及びGab1各々の量的差
違を示す図。
【図１１】RT-PCRで解析した、HGF刺激を与えたMERMUC
の産生細胞または非産生細胞の各々におけるMMP-1及びM
MP-9の各々のmRNAの発現の差違を示す図。
【図１２】MERMUC過剰発現トランスジェニックマウス及
び正常マウスの各々に由来する肝実質細胞のHGFまたはE
GF応答性の細胞増殖の程度を示す図。分図Ａは、HGF応
答性の細胞増殖の程度を示す。分図Ｂは、EGF応答性の
細胞増殖の程度を示す。
【図１３】ウェスタンブロッティングで解析した、MERM
UC過剰発現トランスジェニックマウス及び正常マウスの
各々の肝実質細胞内でのHGF誘導性細胞内MAPキナーゼ活
性の強弱を示す図。
【図１４】mFas-MERMUC融合蛋白のMERMUC領域での自己
会合の有無をβ-gal活性の出現を指標として評価した結
果を示す図。
【図１５】ウェスタンブロッティングで解析した、HGF
受容体とともに免疫沈降する自己会合したMERMUCの量を
示す図。
【図１６】各種MERMUC細胞質領域ペプチドによるMERMUC
の自己会合の抑制の程度をβ-gal活性の出現を指標とし
て評価した結果を示す図。
【図１７】各種MERMUC細胞質領域ペプチドによるMERMUC
とHGF受容体c-Metとの結合の抑制の程度をβ-gal活性の
出現を指標として評価した結果を示す図。
【図１８】各種濃度のMERMUC細胞質領域ペプチド（del-
4）によるMERMUCの自己会合及びMERMUCとHGF受容体c-Me
tとの結合の各々の抑制の程度をβ-gal活性の出現を指
標として評価した結果を示す図。
【図１９】ウェスタンブロッティングで解析した、Dox
の存否によるMERMUCの発現の有無並びにMERMUC細胞質領
域ペプチド（del-4）によるMERMUC自己会合の抑制の有
無に依存したリン酸化MAPキナーゼ（p-Erk）の産生の強
弱を示す図。
【図２０】免疫沈降法で解析した、Doxの存否によるMER
MUCの発現の有無及び／またはHGF刺激の有無によるリン
酸化されたMERMUCの産生の有無を示す図。
【図２１】免疫沈降法で解析した、HGFの有無及び／ま
たはHGFシグナリング抑制剤の有無によるリン酸化され
たMERMUCの産生の差異を示す図。
【図２２】マウスMERMUC過剰産生Tg及び正常マウスにお
けるHGF依存的な肝肥大の程度を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ ４Ｈ０４５ 9/10 １０１ 11/00 11/00 13/12 13/12 17/00 17/00 19/00 19/00 25/00 25/00 31/12 31/12 43/00 １０１ 43/00 １０１ １０７ １０７ １１１ １１１ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 山崎 善紀 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−２ 日 本たばこ産業株式会社医薬探索研究所内 (72)発明者 折田 匠哉 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−２ 日 本たばこ産業株式会社医薬探索研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB20 CB01 DA13 DA36 FB02 FB03 FB05 JA01 4B024 AA01 AA11 BA80 CA02 DA03 HA11 HA17 4B050 CC04 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ79 QR48 QR77 QS16 QS33 QX01 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 DB62 NA14 ZA012 ZA362 ZA452 ZA592 ZA752 ZA812 ZA892 ZA962 ZB222 ZC422 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA89 EA20 EA50 FA74

Claims (78)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 c-MetとMERMUCとの結合若しくはMERMUC
    の多量体化を阻害する活性を有する物質及び薬学的に許
    容され得る担体を含んでなり、細胞の増殖または組織、
    器官、血管、粘膜、骨格若しくは神経の形成、修復、再
    生若しくは新生の維持または増強に用いるための医薬組
    成物。
  2. 【請求項２】 c-MetとMERMUCとの結合若しくはMERMUC
    の大量体化を阻害する活性を有する物質及び薬学的に許
    容され得る担体を含んでなり、HGFによる細胞の増殖ま
    たは組織、器官、血管、粘膜、骨格若しくは神経の形
    成、修復、再生若しくは新生の維持または増強に用いる
    ための医薬組成物。
  3. 【請求項３】 該HGFが、生体に内在するHGFである請求
    項２に記載の医薬組成物。
  4. 【請求項４】 該HGFが、生体に外来的にHGFを供給可能
    なHGF医薬である請求項２に記載の医薬組成物。
  5. 【請求項５】 該HGF医薬が、HGF蛋白質を含む蛋白医薬
    である請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 【請求項６】 該HGF医薬が、HGF蛋白質をコードするDN
    Aを含むDNA医薬である請求項４に記載の医薬組成物。
  7. 【請求項７】 該医薬組成物が、線維症の予防または治
    療に用いられるための請求項１または請求項２に記載の
    医薬組成物。
  8. 【請求項８】 該線維症が、肝臓、腎臓または肺におけ
    る線維症である請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 【請求項９】 該医薬組成物が、肝硬変、肝線維症また
    は肝炎の予防または治療に用いられるための請求項１ま
    たは請求項２に記載の医薬組成物。
  10. 【請求項１０】 該肝炎が、劇症肝炎、急性肝炎または
    ウイルス性肝炎の予防または治療に用いられるための請
    求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
  11. 【請求項１１】 該医薬組成物が、慢性腎不全の予防ま
    たは治療に用いられるための請求項１または請求項２に
    記載の医薬組成物。
  12. 【請求項１２】 該医薬組成物が、閉塞性動脈硬化症の
    予防または治療に用いられるための請求項１または請求
    項２に記載の医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 該物質が、c-MetとMERMUCとの結合を
    阻害する活性を有する物質である請求項１または請求項
    ２に記載の医薬組成物。
  14. 【請求項１４】 該物質が、c-Metのβ鎖のＣ末端領域
    とMERMUCのＣ末端領域との結合を阻害する活性を有する
    物質である請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 【請求項１５】 該物質が、MERMUCの多量体化を阻害す
    る活性を有する物質である請求項１または請求項２に記
    載の医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 該物質が、MERMUCに結合する物質であ
    る請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
  17. 【請求項１７】 MERUMUCの発現を抑制または阻害する
    物質及び薬学的に許容され得る担体を含んでなり、細胞
    の増殖または組織、器官、血管、粘膜、骨格若しくは神
    経の形成、修復、再生若しくは新生の維持または増強に
    用いるための医薬組成物。
  18. 【請求項１８】 該物質が、MERMUCをコードする遺伝子
    のmRNAへの転写を阻害する物質である請求項１７に記載
    の医薬組成物。
  19. 【請求項１９】 該物質が、MERMUCをコードするmRNAの
    蛋白質への翻訳を阻害する物質である請求項１７に記載
    の医薬組成物。
  20. 【請求項２０】 MERUMUCの発現を抑制または阻害する
    物質及び薬学的に許容され得る担体を含んでなり、HGF
    による細胞の増殖または組織、器官、血管、粘膜、骨格
    若しくは神経の形成、修復、再生若しくは新生の維持ま
    たは増強に用いるための医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 該物質が、MERMUCをコードする遺伝子
    のmRNAへの転写を阻害する物質である請求項２０に記載
    の医薬組成物。
  22. 【請求項２２】 該物質が、MERMUCをコードするmRNAの
    蛋白質への翻訳を阻害する物質である請求項２０に記載
    の医薬組成物。
  23. 【請求項２３】 該HGFが、生体に内在するHGFである請
    求項２０に記載の医薬組成物。
  24. 【請求項２４】 該HGFが、生体に外来的にHGFを供給可
    能なHGF医薬である請求項２０に記載の医薬組成物。
  25. 【請求項２５】 該HGF医薬が、HGF蛋白質を含む蛋白医
    薬である請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 【請求項２６】 該HGF医薬が、HGF蛋白質をコードする
    DNAを含むDNA医薬である請求項２４に記載の医薬組成
    物。
  27. 【請求項２７】 該医薬組成物が、線維症の予防または
    治療に用いられるための請求項１７または請求項２０に
    記載の医薬組成物。
  28. 【請求項２８】 該線維症が、肝臓、腎臓または肺にお
    ける線維症である請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 【請求項２９】 該医薬組成物が、肝硬変、肝線維症ま
    たは肝炎の予防または治療に用いられるための請求項１
    ７または請求項２０に記載の医薬組成物。
  30. 【請求項３０】 該肝炎が、劇症肝炎、急性肝炎または
    ウイルス性肝炎の予防または治療に用いられるための請
    求項１７または請求項２０に記載の医薬組成物。
  31. 【請求項３１】 該医薬組成物が、慢性腎不全の予防ま
    たは治療に用いられるための請求項１７または請求項２
    ０に記載の医薬組成物。
  32. 【請求項３２】 該医薬組成物が、閉塞性動脈硬化症の
    予防または治療に用いられるための請求項１７または請
    求項２０に記載の医薬組成物。
  33. 【請求項３３】 MERMUCの全長アミノ酸配列の一部のア
    ミノ酸配列を有し、c-Metと結合する活性を有するポリ
    ペプチド。
  34. 【請求項３４】 該一部のアミノ酸配列が、MERMUCの細
    胞質領域の全部または一部に対応する請求項３３に記載
    のポリペプチド。
  35. 【請求項３５】 該細胞質領域の全部または一部が、ME
    RMUCのＣ末端領域のロイシン繰返し領域の全部または一
    部を含む請求項３４に記載のポリペプチド。
  36. 【請求項３６】 該MERMUCが、ヒトのMERMUCである請求
    項３３に記載のポリペプチド。
  37. 【請求項３７】 該ポリペプチドが、配列番号15に示さ
    れるアミノ酸配列を含む請求項３３に記載のポリペプチ
    ド。
  38. 【請求項３８】 c-Metの全長アミノ酸配列の一部のア
    ミノ酸配列を有し、MERMUCと結合する活性を有するポリ
    ペプチド。
  39. 【請求項３９】 該一部のアミノ酸配列が、c-Metのβ
    鎖の細胞質領域の全部または一部に対応する請求項３８
    に記載のポリペプチド。
  40. 【請求項４０】 該細胞質領域の全部または一部が、自
    己リン酸化を受ける１または複数のチロシン残基を含む
    c-MetのＣ末端領域の全部または一部を含む請求項３９
    に記載のポリペプチド。
  41. 【請求項４１】 該c-Metが、ヒトのc-Metである請求項
    ３８に記載のポリペプチド。
  42. 【請求項４２】 該ポリペプチドが、配列番号５に示さ
    れるアミノ酸配列を含む請求項３８に記載のポリペプチ
    ド。
  43. 【請求項４３】 MERMUCの全長アミノ酸配列の一部のア
    ミノ酸配列を有し、MERMUCと結合する活性を有するポリ
    ペプチド。
  44. 【請求項４４】 該一部のアミノ酸配列が、MERMUCの細
    胞質領域の全部または一部に対応する請求項４３に記載
    のポリペプチド。
  45. 【請求項４５】 該MERMUCが、ヒトのMERMUCである請求
    項３３に記載のポリペプチド。
  46. 【請求項４６】 一般式Ｗ−Ｘ−Ｙ（Ｗは存在しないか
    またはMERMUC以外の他の蛋白質の全長アミノ酸配列若し
    くはその一部、ＸはMERMUCの全長アミノ酸配列またはそ
    の一部であり、ＹはMERMUC以外の他の蛋白質の全長アミ
    ノ酸配列またはその一部である。）で表される融合ポリ
    ペプチド。
  47. 【請求項４７】 該Ｙの他の蛋白質が、β-galΔαまた
    はβ-galΔωである請求項４６に記載の融合ポリペプチ
    ド。
  48. 【請求項４８】 該β-galΔαが、配列番号16に示され
    るアミノ酸配列を有する請求項４７に記載の融合ポリペ
    プチド。
  49. 【請求項４９】 該β-galΔωが、配列番号17に示され
    るアミノ酸配列を有する請求項４７に記載の融合ポリペ
    プチド。
  50. 【請求項５０】 該MERMUCの全長アミノ酸配列の一部
    が、c-Metと結合する活性を有する請求項４６に記載の
    融合ポリペプチド。
  51. 【請求項５１】 該MERMUCの全長アミノ酸配列の一部
    が、MERMUCの細胞質領域の全部または一部を含む請求項
    ４６に記載の融合ポリペプチド。
  52. 【請求項５２】 該MERMUCの全長アミノ酸配列の一部
    が、MERMUCのＣ末端領域のロイシン繰返し領域の全部ま
    たは一部を含む請求項５１に記載の融合ポリペプチド。
  53. 【請求項５３】 該MERMUCが、ヒトのMERMUCである請求
    項４６に記載の融合ポリペプチド。
  54. 【請求項５４】 該Ｘが、配列番号15に示されるアミノ
    酸配列を含む請求項４６に記載のポリペプチド。
  55. 【請求項５５】 該Ｗの他の蛋白質が、Fasの細胞外領
    域を含む請求項４６に記載のポリペプチド。
  56. 【請求項５６】 一般式Ｚ−Ｙ（Ｚはc-Metの全長アミ
    ノ酸配列またはその一部であり、Ｙはc-Met以外の他の
    蛋白質の全長アミノ酸配列またはその一部である。）で
    表される融合ポリペプチド。
  57. 【請求項５７】 該他の蛋白質が、β-galΔαまたはβ
    -galΔωである請求項５２に記載の融合ポリペプチド。
  58. 【請求項５８】 該β-galΔαが、配列番号16に示され
    るアミノ酸配列を有する請求項５７に記載の融合ポリペ
    プチド。
  59. 【請求項５９】 該β-galΔωが、配列番号17に示され
    るアミノ酸配列を有する請求項５７に記載の融合ポリペ
    プチド。
  60. 【請求項６０】 該c-Metの全長アミノ酸配列の一部
    が、MERMUCと結合する活性を有する請求項５６に記載の
    融合ポリペプチド。
  61. 【請求項６１】 該c-Metの全長アミノ酸配列の一部
    が、c-Metのβ鎖の細胞質領域の全部または一部を含む
    請求項５６に記載の融合ポリペプチド。
  62. 【請求項６２】 該c-Metの全長アミノ酸配列の一部
    が、自己リン酸化を受ける１または複数のチロシン残基
    を含むc-MetのＣ末端領域の全部または一部を含む請求
    項５６に記載の融合ポリペプチド。
  63. 【請求項６３】 該c-Metが、ヒトのc-Metである請求項
    ５６に記載の融合ポリペプチド。
  64. 【請求項６４】 該Ｚが、配列番号５に示されるアミノ
    酸配列を含む請求項５６に記載の融合ポリペプチド。
  65. 【請求項６５】 ある物質のc-MetとMERMUCとの結合を
    阻害する活性の有無または程度を試験する方法であっ
    て、被験物質の存在下でのc-MetとMERMUCとの結合の有
    無または程度を、被験物質の不存在下でのc-MetとMERMU
    Cとの結合の程度と比較する工程を含む方法。
  66. 【請求項６６】 c-MetとMERMUCとの結合を阻害する活
    性を有する物質を同定する方法であって、被験物質の存
    在下でのc-MetとMERMUCとの結合の有無または程度を、
    被験物質の不存在下でのc-MetとMERMUCとの結合の程度
    と比較する工程を含む方法。
  67. 【請求項６７】 ある物質のc-MetとMERMUCとの結合を
    阻害する活性の有無または程度を試験する方法であっ
    て： （ａ）c-Met及びMERMUCを共に発現し、該c-Met及びMERM
    UCが結合した場合に該結合を検出可能なように設計され
    た細胞を調製する工程； （ｂ）工程(a)で得た細胞をHGFの存在下で且つ被験物質
    の不存在下で培養した後、該細胞におけるc-Met及びMER
    MUCの結合の程度を測定する工程； （ｃ）工程(b)で得た細胞をHGF及び被験物質の存在下で
    培養した後、該細胞におけるc-Met及びMERMUCの結合の
    程度を測定する工程； （ｄ）工程(b)の測定結果と工程(c)の測定結果を比較す
    る工程。
  68. 【請求項６８】 該MERMUCが、請求項４６乃至請求項５
    ４のいずれかに記載の融合ポリペプチドである請求項６
    ７に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 該MERMUCが、請求項４７乃至請求項４
    ９のいずれかに記載の融合ポリペプチドである請求項６
    ７に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 該c-Metが、請求項５６乃至請求項６
    ４のいずれかに記載の融合ポリペプチドである請求項６
    ７に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 該c-Metが、請求項５７乃至請求項５
    ９のいずれかに記載の融合ポリペプチドである請求項６
    ７に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 c-MetとMERMUCとの結合を阻害する活
    性を有する物質を同定する方法であって： （ａ）c-Met及びMERMUCを共に発現し、該c-Met及びMERM
    UCが結合した場合に該結合を検出可能なように設計され
    た細胞を調製する工程； （ｂ）工程(a)で得た細胞をHGFの存在下で且つ被験物質
    の不存在下で培養した後、該細胞におけるc-Met及びMER
    MUCの結合の程度を測定する工程； （ｃ）工程(b)で得た細胞をHGF及び被験物質の存在下で
    培養した後、該細胞におけるc-Met及びMERMUCの結合の
    程度を測定する工程； （ｄ）工程(b)の測定結果と工程(c)の測定結果を比較す
    る工程。
  73. 【請求項７３】 該MERMUCが、請求項４６乃至請求項５
    ４のいずれかに記載の融合ポリペプチドである請求項７
    ２に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 該MERMUCが、請求項４７乃至請求項４
    ９のいずれかに記載の融合ポリペプチドである請求項７
    ２に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 該c-Metが、請求項５６乃至請求項６
    ４のいずれかに記載の融合ポリペプチドである請求項７
    ２に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 該c-Metが、請求項５７乃至請求項５
    ９のいずれかに記載の融合ポリペプチドである請求項７
    ２に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 ある物質のMERMUCの多量体化を阻害す
    る活性の有無または程度を試験する方法であって、被験
    物質の存在下でMERMUCの多量体化の有無または程度を、
    被験物質の不存在下でのMERMUCの多量体化の程度と比較
    する工程を含む方法。
  78. 【請求項７８】 MERMUCの多量体化を阻害する活性を有
    する物質を同定する方法であって、被験物質の存在下で
    のMERMUCの多量体化の有無または程度を、被験物質の不
    存在下でのMERMUCの多量体化の程度と比較する工程を含
    む方法。
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